CN114375332A - 谷氨酰胺合成酶的修饰多肽及使用其生产l-谷氨酰胺的方法 - Google Patents

谷氨酰胺合成酶的修饰多肽及使用其生产l-谷氨酰胺的方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及具有增强活性的谷氨酰胺合成酶的修饰多肽以及使用其生产L‑谷氨酰胺的方法。由于与具有谷氨酰胺合成酶活性的野生型菌株相比，通过使用新型修饰多肽可以增加L‑谷氨酰胺的产量而不降低生长速率，因此修饰多肽可以广泛用于L‑谷氨酰胺的大规模生产。

Description

谷氨酰胺合成酶的修饰多肽及使用其生产L-谷氨酰胺的方法
技术领域
本公开涉及具有增强活性的谷氨酰胺合成酶的修饰多肽以及使用其生产L-谷氨酰胺的方法。
背景技术
L-谷氨酰胺是一种广泛用于药物、化妆品和保健功能食品的氨基酸，例如用于消化问题的治疗剂、肝功能增强剂、脑功能增强剂、免疫增强剂、用于胃溃疡的药物、用于酒精中毒的药物、美容保湿剂、针对运动员的营养补充剂以及针对患者的营养补充剂。
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(Escherichiacoli)已被用作生产L-谷氨酰胺的代表性微生物。在L-谷氨酰胺生物合成途径中，由谷氨酸脱氢酶使用通过糖酵解和三羧酸循环(TCA)产生的α-酮基谷氨酸作为前体产生L-谷氨酸，最终通过谷氨酰胺合成酶的反应产生L-谷氨酰胺。
为了生产高浓度的L-谷氨酰胺，优化谷氨酰胺合成酶的表达并提高其活性是非常重要的。谷氨酰胺合成酶的激活需要二价金属离子，该活性受到甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、组氨酸、6-磷酸葡萄糖胺、3-磷酸胞苷等的抑制。该活性也受到第405个氨基酸的腺苷酸化的抑制。根据之前的研究，已经报道了通过用苯丙氨酸取代第405位的酪氨酸，恢复被腺苷酸化抑制的活性(EP 1229121B1)。然而，仍然需要开发一种高效产生L-谷氨酰胺的方法。
发明内容
技术问题
在此背景下，作为大量努力以开发具有增强的L-谷氨酰胺生产能力的微生物的结果，本发明人发现了能够增加L-谷氨酰胺生产的谷氨酰胺合成酶的修饰多肽，从而完成了本公开。
技术方案
本公开提供一种具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽，其中对应于SEQ ID No：1的氨基酸序列的第401位、第402位、或第404位氨基酸被不同的氨基酸取代。
本公开提供了一种编码所述修饰多肽的多核苷酸。
本公开提供了一种微生物，其包含所述修饰多肽或编码所述修饰多肽的多核苷酸。
本公开提供了一种生产L-谷氨酰胺的方法，所述方法包括在培养基中培养本公开的微生物。
有益效果
当使用根据本公开的具有增强的谷氨酰胺合成酶活性的新的修饰多肽时，与具有谷氨酰胺合成酶活性的野生型菌株相比，可以增加谷氨酰胺的产量而不降低生长速率，因此所述修饰多肽可以是广泛用于大量生产谷氨酰胺。
具体实施方案
将详细描述本公开。同时，本公开中公开的每个描述和实施方案可以应用于本文的不同描述和实施方案中。换言之，本公开中公开的各种成分的所有组合都包括在本公开的范围内。此外，本公开的范围不应受到以下提供的描述的限制。
本领域技术人员将认识到、或能够仅使用常规实验来确定本公开的特定实施方案的许多等同实施方案。此类等同实施方案旨在包括在以下权利要求的范围内。
本公开的一个方面提供了谷氨酰胺合成酶的变体，其是通过用不同氨基酸取代对应于谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列的第401位、第402位、或第404位的氨基酸制备的。
具体而言，本公开的该方面提供一种具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽，其中对应于SEQ ID No：1的氨基酸序列的第401位、第402位、或第404位氨基酸被不同的氨基酸取代。
如本文所用，术语“变体”、“修饰多肽”或“修饰蛋白质(酶)”可互换使用。
如本文所用，术语“谷氨酰胺合成酶”是指在微生物中在ATP存在下将谷氨酸和氨转化为谷氨酰胺的酶。例如，谷氨酰胺合成酶可由glnA基因编码，但不限于此。考虑到本公开的目的，可以使用任何具有将谷氨酸和氨转化为谷氨酰胺的活性的蛋白质，而不考虑其来源，并且可以使用源自任何生物体(植物、微生物等)的酶，但不限于此。谷氨酰胺合成酶可以是源自棒状杆菌(Corynebacterium)属或其变体的微生物的酶，例如，酶源自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、产热棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)或静止棒状杆菌(Corynebacterium stationis)，或其变体，但不限于此。
具体地，谷氨酰胺合成酶可以具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或与其具有80％或更高且小于100％同源性或同一性的氨基酸序列，但氨基酸序列不限于此，只要由此获得谷氨酰胺合成酶活性即可。更具体地，本公开的谷氨酰胺合成酶可以包括具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或同一性。此外，显然在氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸的缺失、修饰、取代或添加的任何辅助蛋白都在本公开的范围内，只要该氨基酸序列保持上述同源性或同一性，并且与蛋白质具有等同的效果。
如本文所用，术语“具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽”或“谷氨酰胺合成酶变体”是指通过用不同的氨基酸取代具有谷氨酰胺合成酶活性的多肽的一部分氨基酸序列，而具有改变的谷氨酰胺合成酶活性的多肽。具体而言，所述修饰多肽可以是具有谷氨酰胺合成酶活性的具有各种序列的修饰多肽，其通过用不同氨基酸取代对应于SEQ ID No：1的氨基酸序列的第401位、第402位、或第404位氨基酸来制备。
第“第N位”可包括第N位和对应于所述第N位的氨基酸位置。具体地，第N位可以包括与靶蛋白具有相同活性的多肽的相应氨基酸位置。更具体地，与靶蛋白具有相同活性的多肽的氨基酸序列可以是SEQ ID No：1的氨基酸序列、或与其具有至少98％同一性的氨基酸序列，SEQ ID No：1的氨基酸序列的第401位、第402位、或第404位可以包括对应于与SEQID No：1的氨基酸序列具有80％或更高并且小于100％的同源性或同一性的氨基酸序列中的第401位、第402位、或第404位的氨基酸位置。
可以使用Needleman-Wunsch算法(文献：Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)，特别是5.0.0或更高版本，如在EMBOSS包的Needleman程序中实施(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,document:[Rice等人,2000,Trends Genet.16:276–277])，确定对应于与靶蛋白具有相同活性的多肽的第N位或者相应氨基酸位置的氨基酸位置。为此使用的参数可以为：空位开放罚分为10、空位延伸罚分为0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62版本的EMBOSS)取代矩阵。
可以通过使用几种计算机程序比对多个多肽序列，来确定对应于与靶蛋白具有相同活性的多肽的第N位或相应氨基酸位置的氨基酸位置上的氨基酸残基，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较；3.5或更高版本；文献[Edgar,2004,Nucleic Acids Research 32:1792–1797]),MAFFT(6.857或更高版本；文献：[Katoh andKuma,2002,Nucleic Acids Research 30:3059–3066]；文献:[Katoh等人,2005,NucleicAcids Research 33:511–518]；文献:[Katoh and Toh,2007,Bioinformatics 23:372–374]；文献:[Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology 537:39–64]；文献:[Katohand Toh,2010,Bioinformatics 26:1899–1900]),和使用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更高；文献:[Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research 22:4673–4680]),使用其各自的默认参数。
当常规的基于序列的比较不能检测多肽之间的关系时(文献：[Lindahl andElofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613–615]),也可以使用其他成对序列比较算法。使用搜索程序在搜索数据库中使用多肽家族(谱)的概率表示，可以获得更高的基于序列搜索的灵敏度。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程生成配置文件，并且能够检测远程同源物(文献：[Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389–3402])。当多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表时，甚至可以获得高灵敏度。例如GenTHREADER(文献：[Jones,1999,J.Mol.Biol.287:797–815]；和文献[McGuffin andJones,2003,Bioinformatics 19:874–881])的程序利用来自各种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱和溶剂化潜力)的信息作为神经网络的输入，预测查询序列的结构折叠。类似地，文献[Gough等人,2000,J.Mol.Biol.313:903–919]中公开的方法可用于将未知结构的序列与SCOP数据库中存在的超家族模型进行比对。这些比对又可用于生成多肽的同源性、相似性或同一性模型，并且可以使用为此目的开发的多种工具来评估此类模型的准确性。
“不同的氨基酸”没有特别限制，只要该氨基酸与取代前的每个位置的氨基酸不同即可。具体地，氨基酸可以包括选自甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸中的至少一个氨基酸，但不限于此。
“氨基酸”根据侧链的性质分为四种类型：酸性、碱性、极性(亲水)和非极性(疏水)氨基酸。
变体可以是这样的蛋白质，其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列的每个位置上的氨基酸可以被至少一个选自以下的氨基酸取代：非极性氨基酸，例如，甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和脯氨酸(P)；极性氨基酸，例如，丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬氨酸(D)和谷氨酰胺(Q)；酸性氨基酸，例如，天冬酰胺(N)和谷氨酸(E)；和碱性氨基酸，例如，赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)，但不限于此。
具体而言，对应于第401位的氨基酸可以被酸性氨基酸或极性氨基酸取代，对应于第402位的氨基酸可以被碱性氨基酸取代，对应于第404位的氨基酸可以被非极性氨基酸取代，但不限于此。
更具体地，对应于第401位的氨基酸可以被天冬酰胺、谷氨酸或丝氨酸取代，对应于第402位的氨基酸可以被组氨酸取代，对应于第404位的氨基酸可以被缬氨酸取代，但不限于此。
在本公开中，对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第401位、第402位、或第404位的氨基酸被不同的氨基酸取代的修饰多肽可具有SEQ ID NO：2至6的氨基酸序列之一。
具体而言，对应于第401位的氨基酸被天冬酰胺取代的修饰多肽可具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列，对应于第401位的氨基酸被谷氨酸取代的修饰多肽可具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，对应于第401位的氨基酸被丝氨酸取代的修饰多肽可具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
此外，对应于第402位的氨基酸被组氨酸取代的修饰多肽可具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，对应于第404位的氨基酸被缬氨酸取代的修饰多肽可具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
所述修饰多肽可以是具有谷氨酰胺合成酶活性并且与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有80％或更高且小于100％的序列同源性的修饰多肽，但不限于此。具体地，本公开的修饰多肽可以是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的修饰多肽，并且显而易见的是，除了第401、第402或第404位的取代以外，在氨基酸序列中包括一个或几个氨基酸的缺失、修饰、取代或添加的任何蛋白都在本公开的范围内，只要该氨基酸序列保持上述同源性，并且与蛋白质具有等同的效果。
在本公开中，虽然表述为“具有如预定SEQ ID No所示的氨基酸序列的蛋白”，但显然包括一个或几个氨基酸的缺失、修饰、取代、保守取代或添加的任何蛋白都可用于本公开，只要该蛋白与SEQ ID No的氨基酸序列所组成的蛋白具有相同或等同的活性。例如，不改变蛋白功能的在氨基酸序列的正向或反向方向上序列的添加、天然发生的突变、其沉默突变或其保守取代均不排除，只要获得与该蛋白相同或等同的活性，并且显然这种序列的添加或突变在本公开的范围内。
除了在特定位置的氨基酸被不同氨基酸取代外，修饰多肽可以包括通过保守取代和/或修饰至少一个氨基酸而获得，同时保留蛋白的功能或特性的多肽，所述至少一个氨基酸与序列所示的氨基酸不同。
如本文所用，术语“保守取代”是指一个氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代。这种氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性而发生。一般而言，保守取代对蛋白或多肽的活性影响很小或没有影响。
此外，除了上述位置的氨基酸之外，还具有至少一个修饰氨基酸的变体可以具有对多肽的性质和二级结构影响最小的氨基酸的缺失或添加。例如，多肽可以与蛋白N-末端的信号(或前导)序列缀合，其与翻译同时或翻译后指导蛋白质的转移。此外，多肽可以与另一序列或接头缀合，以鉴定、纯化或合成多肽。
此外，修饰多肽可以包含具有上述SEQ ID NO:1的修饰的氨基酸序列，和/或具有上述SEQ ID NO:1的修饰，并且除该修饰位置以外，具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同源性或同一性。即，多肽可以包括与SEQ ID NO：2至6的序列之一具有80％或更高并且小于100％的同源性的氨基酸序列，但不限于此。具体地，本公开的修饰多肽可以包括与SEQ ID NO：2至6的序列之一具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同源性或同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO：1的修饰如上所述，其同源性或同一性可以是上述修饰以外的位置的同源性或同一性。
鉴于本公开的目的，具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽的活性与野生型相比，可以被增强。具体而言，与SEQ ID NO:1的野生型相比，谷氨酰胺合成酶活性可以增加和增强。
如本文所用，术语多肽活性的“增强”是指与固有活性相比，多肽的活性增加。增强可以与激活、上调、过表达、增加等互换使用。在这方面，激活、增强、上调、过表达和增加可以包括所有表现出最初不具有的活性或表现出与固有活性或修饰前的活性相比改善的活性的那些。“固有活性”是指在转化前的亲本菌株或未修饰微生物初始所具有的特定多肽的活性，所述转化是当通过自然或人工因素引起的遗传修饰转化微生物时。该术语可与“转化前的活性”互换使用。与固有活性相比，多肽活性的“增强”、“上调”、“过表达”或“增加”是指特定多肽的活性和/或浓度(表达水平)与转化前的亲本菌株或未修饰微生物初始所具有的那些相比，得到改善。
可以通过引入外源多肽或增强固有多肽的活性和/或浓度(表达水平)实现增强。多肽活性的增强可以基于活性程度、多肽的表达水平或从多肽释放的产物的量的增加来确定。
可以通过应用本领域公知的各种方法来获得多肽的增强，只要靶多肽的活性与修饰前的微生物的活性相比增强了，所述方法就没有限制。具体而言，可以使用本领域众所周知的作为分子生物学常规方法的任何基因工程和/或蛋白工程方法，但不限于此(例如，Sitnicka等人，Functional Analysis of Genes.Advances in Cell Biology.2010,Vol.2.1–16,Sambrook等人Molecular Cloning 2012,等等)。
具体地，本公开多肽的增强可以通过以下实现：
1)增加细胞中编码多肽的多核苷酸的拷贝数；
2)用具有更高活性的序列替换染色体上编码多肽的基因表达调控区；
3)修饰编码多肽的基因转录本的起始密码子或5'-UTR区的编码核苷酸序列；
4)修饰多肽的氨基酸序列以增强多肽的活性；
5)修饰编码多肽的核苷酸序列以增强多肽的活性(例如，修饰多肽基因的核苷酸序列，以编码具有增强的多肽活性的修饰多肽)；
6)引入表现出多肽活性的外源多肽或编码该多肽的外源多核苷酸；
7)密码子优化编码多肽的多核苷酸；
8)修饰或化学修饰通过分析多肽的三维结构选择的暴露区；或者
9)选自上述1)至8)中的至少两种的任意组合，但不限于此。
更具体地，可以通过向宿主细胞中引入载体实现在1)中的增加细胞中编码多肽的多核苷酸的拷贝数，所述载体可以不依赖宿主复制和发挥作用，并且与编码多肽的多核苷酸可操作地连接。或者，这可以通过将一个拷贝或两个或更多个拷贝的编码多肽的多核苷酸引入宿主细胞的染色体中来实现。可以通过将能够将多核苷酸插入宿主染色体的载体引入宿主细胞来进行染色体的引入，但不限于此。载体如上所述。
在2)中的用具有更高活性的序列替换染色体上编码多肽的基因表达调控区(或表达调控序列)可以是，例如，通过缺失、插入、非保守取代、保守取代、或其任何组合对序列进行突变，以进一步增强表达调控区的活性或用具有更高活性的序列取代。表达调控区可以包括但不限于启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、以及调控转录和翻译终止的序列。例如，替换可以是用更强的启动子替换固有启动子，但不限于此。
本领域已知的更强启动子的示例可以包括CJ1至CJ7启动子(美国专利号7662943B2)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、gapA启动子、SPL7启动子、SPL13(sm3)启动子(美国专利号10584338B2)、O2启动子(美国专利号10273491B2)、tkt启动子和yccA启动子，但不限于此。
在3)中的修饰编码多肽的基因转录本的起始密码子或5'-UTR区的编码核苷酸序列可以是，例如，用编码另一种起始密码子的核苷酸序列取代，该起始密码子的多肽表达水平高于固有起始密码子，但不限于此。
在4)和5)的氨基酸序列或多核苷酸序列的修饰可以是，通过缺失、插入、非保守取代、保守取代或其任何组合对多肽的氨基酸序列或编码多肽的多核苷酸序列的修饰，以增强多肽的活性，或用修饰的氨基酸序列或多核苷酸序列替换以具有更高的活性，或用修饰的氨基酸序列或多核苷酸序列替换以增加活性，但不限于此。可以通过将多核苷酸插入染色体来进行替换，具体地通过同源重组进行，但不限于此。在这种情况下使用的载体可以进一步包含选择标记物以鉴定插入到染色体中。选择标记物如上所述。
在6)中的引入表现出多肽活性的外源多肽可以是将编码表现出与多肽相同/相似活性的多肽的外源多核苷酸引入宿主细胞。外源多核苷酸的来源和序列没有特别限制，只要多核苷酸表现出与多肽相同/相似的活性即可。本领域技术人员适当选择的任何转化方法都可用于引入。随着引入的多核苷酸在宿主细胞中表达，产生多肽，从而增加多肽的活性。
在7)中的密码子优化编码多肽的多核苷酸可以是密码子优化固有多核苷酸，以增加在宿主细胞中的转录或翻译，或密码子优化外源多核苷酸，以优化其在宿主细胞中的转录和翻译。
在8)中的修饰或化学修饰通过分析多肽的三维结构选择的暴露区可以是，例如，通过比较待分析多肽的序列信息与存储现有蛋白序列信息的数据库、根据序列的相似性确定模板蛋白候选、并在此基础上鉴定结构，对待修饰或化学修饰的暴露区进行修饰或化学修饰。
这种多肽活性的活性增强可以是，与野生型微生物或转化前的微生物菌株中表达的多肽的活性或浓度相比，表达的多肽的活性或浓度增加，或从该多肽获得的产物的量增加，但不限于此。
例如，证实了与野生型相比，本公开的修饰多肽的谷氨酰胺生产能力增加，表明谷氨酰胺合成酶活性增强(表1至3)。
在本公开的微生物中，多核苷酸作为一个整体或部分的修饰可以通过以下诱导：(a)使用用于插入微生物染色体的载体的同源重组，或使用工程化的核酸酶的基因组编辑(例如，CRISPR-Cas9)，和/或(b)用光如紫外线和放射线和/或化学物质处理，但不限于此。基因作为一个整体或部分的修饰方法可包括DNA重组技术。例如，可以通过将核苷酸序列或包含核苷酸序列的载体注射到微生物中来诱导同源重组，从而使部分或整个基因缺失，所述核苷酸序列与靶基因具有同源性。注射的核苷酸序列或载体可包括显性选择标记物，但不限于此。
本公开的另一方面提供了编码修饰多肽的多核苷酸，或包含该多核苷酸的载体。
SEQ ID NO：1的氨基酸序列、谷氨酰胺合成酶和具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽如上所述。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指作为核苷酸聚合物的具有特定最小长度的DNA或RNA链，其中核苷酸单体通过共价键以长链的形式彼此连接，更具体地是指编码修饰蛋白的多核苷酸片段。
本公开的多核苷酸可以包括编码本公开的具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽的任何多核苷酸序列，但不限于此。具体而言，本公开的多核苷酸可以包含编码具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽的任何序列，其中所述多肽对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第401位、第402位、或第404位的氨基酸被不同的氨基酸取代，但不限于此。例如，多核苷酸可以具有编码SEQ ID NO：2至6的氨基酸序列之一的多核苷酸序列，但不限于此。由于密码子简并或考虑到在待表达蛋白质的生物体中的优选密码子，在不改变蛋白质氨基酸序列的范围内，可以在多核苷酸的编码区中进行各种修饰。因此，显然多核苷酸可包括由于密码子简并的如下多核苷酸核酸，其可翻译成由氨基酸序列组成的多肽、或与所述氨基酸序列具有同源性或同一性的多肽，更具体地，具有80％或更高并且小于100％的同源性或同一性的多肽。
此外，多核苷酸可以包括与使用已知基因序列构建的探针杂交的任何序列，例如，在严格条件下与多核苷酸完全或部分互补的核苷酸序列，以编码具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽，但不限于此。
术语“严格条件”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。此类条件在已知文献中详细公开(J.Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York 9.50–9.51,11.7–11.8)。
例如，严格条件可以包括在具有高的同源性或同一性的多核苷酸之间进行杂交(例如,70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高的同源性或同一性)，而在具有低于上述同源性或同一性的同源性或同一性的多核苷酸之间不进行杂交的条件，或者在用于Southern杂交的一般洗涤条件下、在盐浓度和温度为60℃、1×SSC、0.1％SDS(特别是60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，更特别是68℃、0.1×SSC、0.1％SDS)下洗涤一次，特别是洗涤两次或三次。
杂交要求两个多核苷酸具有互补序列，尽管根据杂交的严格程度，碱基可以错配。术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开的多核苷酸不仅可以包括基本上相似的核酸序列，还可以包括分离的但与整个序列互补的核酸片段。
具体地，可以使用上述杂交条件检测与本公开的多核苷酸具有同源性或同一性的多核苷酸，所述杂交条件包括在55℃的Tm值下进行的杂交过程。此外，Tm值可以是但不限于60℃、63℃或65℃，并且可以由本领域技术人员根据预期目的适当调整。
多核苷酸杂交的适当的严格程度可取决于长度，并且多核苷酸的互补程度和其参数是本领域中公知的(例如，Sambrook等人，上述)。
如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定的氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度，并且可以表示为百分比。术语同源性和同一性通常可以互换使用。
保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以使用标准比对算法来确定，并且可以与其一起使用由程序建立的默认空位罚分。基本上，同源或相同的序列通常可以在中等或高度严格的条件下作为整体或部分彼此杂交。显然，杂交包括与多核苷酸的杂交，所述多核苷酸包含共同密码子或考虑到多核苷酸中的密码子简并的密码子。
两个多核苷酸或多肽序列之间的序列同源性、相似性或同一性可以使用本领域已知的任何计算机算法确定，例如“FASTA”程序，其使用Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444公开的默认参数。或者，同源性、相似性或同一性可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)确定，如在EMBOSS包的Needleman程序中实施(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276–277)(5.0.0或更高版本)(包括GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research 12:387(1984)),BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.等人,J MOLEC BIOL 215:403(1990)；Guide to HugeComputers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994,and CARILLO etal.(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，同源性、相似性或同一性可以使用国家生物技术信息中心数据库的BLAST或ClustalW确定。
多核苷酸或多肽之间的同源性、相似性或同一性可以通过使用例如由Needleman等人(1970),J Mol Biol.48:443(如Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482公开的)介绍的GAP计算机程序比较序列信息来确定。简而言之，GAP程序将相似性定义为相似的比对符号(即，核苷酸或氨基酸)数除以两个序列中较短序列的符号总数。GAP程序的默认参数可包括：(1)二进制比较矩阵(包含表示相同的值1和表示不同的0)和加权比较矩阵，Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14:6745，公开在Schwartz and Dayhoff,编辑,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical ResearchFoundation,第353–358页(1979)(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵)中；(2)每个空位罚分为3.0，每个空位中每个符号附加0.10罚分(或空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5)；以及(3)末端空位无罚分。
本公开的另一方面提供了一种微生物，其包含：本公开的具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽；编码本公开的修饰多肽的多核苷酸；或本公开的载体。
本公开的载体可以是用于在宿主细胞中表达多核苷酸的表达载体，但不限于此。
本公开的载体可以包括DNA构建体，其包含编码靶多肽的多核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接至适合于在合适的宿主中表达靶多肽的表达调控区(或表达调控序列)。表达调控区可以包括能够启动转录的启动子、用于调控转录的任何操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及用于调控转录和翻译终止的序列。一旦转化到合适的宿主细胞中，载体就可以独立于宿主基因组进行复制或发挥功能，或者可以整合到基因组中。
本公开中使用的载体没有特别限制，可以使用本领域已知的任何载体。常规载体的示例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A可以用作噬菌体载体或粘粒载体。作为质粒载体，可以使用pDZ型、pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型和pET型。具体而言，可以使用pDZ、pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC载体。
例如，可以使用用于染色体插入的载体将编码靶多肽的多核苷酸插入到染色体中。可以通过本领域已知的任何方法将多核苷酸插入到染色体中，例如同源重组，但不限于此。多核苷酸还可包括选择标记物，以确认染色体插入。选择标记物用于选择被载体转化的细胞，即，确认所需核酸分子的插入，选择标记物的示例可包括提供可选择表型的标记物，例如药物抗性、营养需求、细胞毒性剂抗性、或表面多肽的表达。只有表达选择标记物的细胞才能在选择试剂处理的环境下存活或表现出不同的表型，因此可以选择转化的细胞。
微生物可以是具有L-谷氨酰胺生产能力的微生物。
如本文所用，“微生物(或菌株)”包括野生型微生物和包括天然或人工遗传修饰的微生物，例如通过引入外源基因或增强或灭活内源基因而具有减弱或增强的特定机制的微生物，所述微生物包含遗传修饰以产生靶多肽、蛋白质或产物。
具体地，本公开的包含具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽的微生物可以是具有L-谷氨酰胺生产能力的天然微生物、或通过向不能生产L-谷氨酰胺的亲本菌株提供L-谷氨酰胺生产能力而制备的微生物。
如本文所用，术语“包含具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽的微生物”可以指表达本公开的修饰多肽的重组微生物。
例如，微生物是指包含编码具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽的多核苷酸的微生物、或用编码修饰多肽的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体转化，以能够表达所述修饰多肽的宿主细胞或微生物。
如本文所用，术语“谷氨酰胺”是一种广泛用于药物、化妆品和保健食品的氨基酸，例如用于消化问题的治疗剂、肝功能增强剂、脑功能增强剂、免疫增强剂、用于胃溃疡的药物、用于酒精中毒的药物、美容保湿剂、针对运动员的营养补充剂以及针对患者的营养补充剂。谷氨酰胺可以在ATP存在下通过谷氨酰胺合成酶从谷氨酸和氨产生。即，在本公开中，由于通过包括具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽增强了谷氨酰胺合成酶的活性，因此可以增强包含该修饰多肽的微生物的谷氨酰胺生产能力。
具体地，在本公开中，谷氨酰胺可以是L-谷氨酰胺。在整个说明书中，术语“谷氨酰胺”可以与“L-谷氨酰胺”互换使用。
如本文所用，术语“转化”是指将包含编码靶多肽的多核苷酸的载体引入宿主细胞或微生物的过程，使得所述多核苷酸编码的多肽在所述宿主细胞中表达。转化的多核苷酸可以是插入宿主细胞染色体的形式，也可以是位于染色体外的形式，只要蛋白在宿主细胞中表达即可。此外，多核苷酸包括编码靶多肽的DNA和/或RNA。多核苷酸可以以任何形式引入宿主细胞，只要所述多核苷酸被引入宿主细胞中，并且在其中表达多肽即可。例如，可以将多核苷酸以表达盒的形式引入宿主细胞中，该表达盒是包括自我复制所需的所有必需元件的基因构建体。表达盒通常可以包含与多核苷酸可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是可自我复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可以以其原始形式引入宿主细胞中，并与在宿主细胞中表达所需的序列可操作地连接，但不限于此。
此外，如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动子序列与多核苷酸序列之间的可操作的连接，所述启动子序列能够启动和介导编码本公开的靶变体的多核苷酸的转录。
鉴于本公开的目的，所述微生物可以具体为表达具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽的微生物，其中对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第401位、第402位、或第404位的氨基酸被不同的氨基酸取代。具体地，通过用天冬酰胺、谷氨酸或丝氨酸取代对应于从SEQ IDNO：1的氨基酸序列N-末端的第401位的氨基酸，用组氨酸取代对应于第402位的氨基酸，用缬氨酸取代对应于第404位的氨基酸，所述微生物可以是表达具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽的微生物。更具体地，通过用天冬酰胺、谷氨酸或丝氨酸取代从SEQ ID NO：1的氨基酸序列N-末端的第401位的氨基酸，用组氨酸取代第402位的氨基酸，用缬氨酸取代第404位的氨基酸，所述微生物可以是表达具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽的微生物，但其不限于此。例如，所述微生物可以是表达修饰多肽的微生物，所述修饰多肽包括第401位、第402位、或第405位的修饰，并且与SEQ ID NO：1的序列具有80％或更高并且小于100％的同源性或同一性；或者所述微生物可以是表达修饰多肽的微生物，所述修饰多肽具有SEQ IDNO：2至6的氨基酸序列之一。由于微生物包含具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽，其中在上述位置的氨基酸被取代，所以谷氨酰胺合成酶的活性增强，从而增加谷氨酰胺的生产而不抑制生长。
在本公开中，包含修饰多肽的微生物可以是属于肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、普罗维登斯菌属(Providencia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和短杆菌属(Brevibacterium)的微生物，但其类型并不特别限于此。更具体地，微生物可以是属于棒状杆菌属的微生物。
在本公开中，“属于棒状杆菌属的微生物”可以是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、产热棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)或有效棒状杆菌(Corynebacteriumefficiens)，但不限于此。在一个实施方案中，属于棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌。
本公开的微生物可以包括通过各种已知方法以及多核苷酸或载体的引入，能够表达本公开的具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽的任何微生物。
本公开的另一个方面提供了生产L-谷氨酰胺的方法，所述方法包括在培养基中培养包含具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽或编码所述修饰多肽的多核苷酸的微生物(本公开的微生物)，在所述修饰多肽中对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第401位、第402位、或第404位的氨基酸被不同的氨基酸取代。
此外，在本公开的实施方案中，所述微生物可以是属于棒状杆菌属的微生物，属于棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌。
在本公开中，术语“培养”是指在适当调整的环境中使微生物生长。在本公开中，培养过程可以在本领域公知的合适的培养基和培养条件下进行。本领域普通技术人员根据选择的菌株进行调整后，可以容易地使用培养过程。具体地，微生物的培养可以以分批过程、连续过程和/或分批补料过程进行，但不限于此。
如本文所用，术语“培养基”是指含有培养本公开的微生物所需的营养物质作为主要成分的混合物，其提供生存和生长所必需的营养物质和生长因子，包括水。具体地，虽然用于培养根据本公开的谷氨酸棒状杆菌菌株的培养基和其他培养条件没有特别限制，只要培养基是通常用于培养微生物的培养基即可，然而，本公开的微生物可以在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的普通培养基中、在有氧条件下同时调节温度、pH等情况下培养。
具体地，用于属于棒状杆菌属的菌株的培养基在文献[美国细菌学学会的“Manualof Methods for General Bacteriology”(Washington D.C.,U.S.A.,1981)]中公开。
在本公开中，碳源的示例可以包括：碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖和麦芽糖；糖醇，如甘露醇和山梨醇；有机酸，如丙酮酸、乳酸和柠檬酸；和氨基酸，如谷氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸。另外，也可以使用天然有机营养物，如淀粉水解物、糖蜜、赤糖糊、米糠、木薯、甘蔗渣和玉米浆，具体地，可以使用碳水化合物，例如葡萄糖和无菌预处理的糖蜜(即，转化为还原糖的糖蜜)，并且也可以使用合适量的任何其他碳源而没有限制。这些碳源可单独使用或以其至少两种的组合使用，但不限于此。
作为氮源，可以使用无机氮源，例如氨、硫酸铵、氯化铵、醋酸铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵；和有机氮源，例如氨基酸，例如，谷氨酸、甲硫氨酸和谷氨酰胺、蛋白胨、NZ-胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼或其降解产物以及脱脂豆饼或其降解产物。这些氮源可以单独使用或以其至少两种的组合使用，但不限于此。
作为磷源，可以使用磷酸一钾、磷酸二钾或与其对应的含钠盐。作为无机化合物，可以使用氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。培养基还可包含氨基酸、维生素和/或合适的前体。这些组分或前体可以分批或连续过程添加到培养基中。然而，本公开不限于此。
此外，在本公开微生物的培养过程中，可以适当的方式向培养基中加入化合物，例如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸，来调节培养基的pH。此外，可以在培养过程中加入消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯，以抑制泡沫的产生。此外，可向培养基中注入氧气或含氧气体以维持培养基的需氧条件，或可注入氮、氢或二氧化碳气体或不注入气体以维持厌氧和微需氧条件，但不限于此。
培养可以在20℃至40℃，具体地25℃至40℃的温度下进行约10小时至160小时，但不限于此。
在本公开的培养期间，产生的L-谷氨酰胺可以释放到培养基中或保留在细胞中。
根据本公开的生产L-谷氨酰胺的方法可以进一步包括制备本公开的微生物、制备用于培养菌株的培养基，或其任意组合(不考虑顺序，以任意顺序)，例如，在培养步骤之前。
根据本公开的生产L-谷氨酰胺的方法还可包括从培养后的培养基(进行培养的培养基)或本公开的微生物中回收L-谷氨酰胺。在培养步骤之后还可以包括回收步骤。
回收可以是收集所需的使用本公开的培养方法产生的L-谷氨酰胺，例如，使用本领域已知的适当方法，例如分批、连续或补料分批方法。例如，可以使用离心、过滤、用蛋白沉淀剂处理(盐析)、提取、超声破碎、超滤、透析、各种色谱方法如分子筛色谱法(凝胶渗透)、吸附色谱法、离子交换色谱法和亲和色谱法、高效液相色谱法(HPLC)、其任何组合，并且使用本领域公知的适当方法从培养基或微生物中回收所需的L-谷氨酰胺。
此外，本公开的生产L-谷氨酰胺的方法还可包括纯化L-谷氨酰胺。纯化步骤可以使用本领域公知的适当方法进行。在一个实施方案中，当本公开的生产L-谷氨酰胺的方法包括回收和纯化步骤时，回收和纯化步骤可以不考虑顺序地连续或不连续地进行，或者可以同时进行或作为一个整合步骤进行，不限于此。
在本公开的方法中，变体、多核苷酸、载体、微生物、L-谷氨酰胺等如上所述。
本公开的另一个方面提供了增加L-谷氨酰胺生产能力的方法，包括修饰微生物以表达具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽，其中对应于氨基酸序列SEQ ID NO：1的第401位的氨基酸、对应于第402位的氨基酸、或对应于第404位的氨基酸被不同的氨基酸取代。
本公开的另一方面提供了用于增加微生物的L-谷氨酰胺生产能力的用途，所述微生物表达：修饰多肽；编码修饰多肽的多核苷酸；包含多核苷酸的载体；或至少其中之一。
修饰多肽、不同的氨基酸、多核苷酸、载体、微生物和L-谷氨酰胺如上所述。
本公开的另一方面提供了一种用于生产L-谷氨酰胺的组合物，其包含：具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽；编码修饰多肽的多核苷酸；包含多核苷酸的载体；或表达其中至少一种的微生物或其培养液。
修饰多肽、多核苷酸、载体、微生物和L-谷氨酰胺如上所述。
用于生产L-谷氨酰胺的组合物可以是指能够使用本公开的具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽生产L-谷氨酰胺的组合物。该组合物可以包括具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽或能够使具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽发挥作用的任何成分，但不限于此。具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽可以是包含在载体中的形式，使得与载体可操作地连接的基因在引入载体的宿主细胞中表达。
该组合物还可包括冷冻保护剂或赋形剂。冷冻保护剂或赋形剂可以是非天然存在的物质或天然存在的物质，但不限于此。
作为另一个示例，冷冻保护剂或赋形剂可以是微生物不会天然接触的物质，或者不是与微生物同时天然包含的物质，但不限于此。
发明方式
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本公开。然而，以下实施例仅用于举例说明本公开，并且本公开的范围不限于此。
实施例1构建用于将突变引入glnA基因ORF的载体文库
在以下方法中构建文库，以发现具有增加的glnA基因表达水平或活性的变体，所述glnA基因编码谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的谷氨酰胺合成酶。
首先，使用GenemorphII随机诱变试剂盒(Stratagene)将突变引入包含glnA基因(1,434bp)的DNA片段(1,434bp)，每kb引入0到4.5个突变。使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(WT)的染色体作为模板并使用SEQ ID NO：7和8的引物组进行易错PCR。具体地，使用包含WT菌株的染色体(500ng)、引物7和8(各具有125ng)、Mutazyme II反应缓冲液(1Y)、dNTP混合物(40mM)和Mutazyme II DNA聚合酶(2.5U)的反应溶液，在以下条件下进行PCR：94℃变性2分钟；94℃变性1分钟、56℃退火1分钟、72℃聚合2分钟，25个循环；然后在72℃聚合10分钟。
使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)将扩增的基因片段连接至pCRII载体，用其转化大肠杆菌DH5α并铺板在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。选择20个转化菌落，从中获得质粒。作为分析核苷酸序列的结果，确认了以0.5个突变/kb的频率在不同位置引入了突变。最终获得约10,000个转化的大肠杆菌菌落，从中提取质粒并命名为pTOPO-glnA(mt)文库。
实施例2：glnA缺失菌株的制备及glnA突变菌株的筛选
为了构建从野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中缺失glnA基因的菌株，如下制备glnA基因缺失的pDZ-ΔglnA载体。具体地，构建以下形式的载体，其中将位于glnA基因的5'和3'末端的DNA片段(每个具有1000bp)连接到pDZ载体(韩国专利No.2009-0094433)。
基于SEQ ID NO：29的glnA基因的核苷酸序列，分别合成通过向5'片段和3'片段插入限制酶Sall识别位点而制备的SEQ ID NO：10和11的引物，以及在与其间隔1000bp的位置上的引物SEQ ID NO：9和12。
使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体作为模板，使用引物组SEQ ID NO：9和10，通过PCR制备5’末端基因片段。以相同方式，使用引物组SEQ ID NO：11和12，通过PCR制备glnA基因的3'末端基因片段。PCR在以下条件下进行：94℃变性2分钟；94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃聚合40秒，30个循环；然后72℃聚合10分钟。
同时，用限制酶SalI处理后，使用Infusion Cloning试剂盒将在65℃热处理20分钟的pDZ载体与通过PCR扩增的待插入DNA片段连接，用其转化大肠杆菌DH5α，然后铺板在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。使用SEQ ID NO：13和14的引物组，通过PCR选择用载体(载体中插入了靶基因)转化的菌落，然后使用本领域已知的质粒提取方法获得质粒并命名为pDZ-ΔglnA。
通过电脉冲方法(Van der Rest等人,Appl.Microbial.Biotechnol.52:541–545,1999)用制备的pDZ-ΔglnA载体转化谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，通过同源染色体重组制备glnA基因缺失的菌株。其中glnA基因缺失的菌株被命名为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032::ΔglnA。
另外，通过电脉冲方法用pTOPO-glnA(mt)文库转化ATCC13032::ΔglnA菌株，铺板在含有卡那霉素(25mg/L)的复合平板培养基上，得到约100个菌落。对100个菌株进行L-谷氨酰胺生产能力测试。将获得的100个菌株中的每一个接种到含有25mL谷氨酰胺生产培养基的250mL转角挡板烧瓶中，并在32℃以200rpm振荡培养48小时。将1mL种子培养物接种到含有24mL L-谷氨酰胺生产培养基的250mL转角挡板烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养48小时。
谷氨酸棒状杆菌ATCC13032和ATCC13032::ΔglnA菌株用作对照。培养完成后，使用YSI 7100多参数生物分析系统(YSI Inc.)测量无细胞培养基上清液中存在的L-谷氨酰胺。选择L-谷氨酰胺生产能力优于ATCC13032::ΔglnA菌株且L-谷氨酰胺浓度高于ATCC13032的菌株，培养液中谷氨酰胺的浓度如表1所示。所选菌株命名为ATCC13032::glnA(mt)-1至3。与用作对照的ATCC13032相比，其他97个菌落的L-谷氨酰胺浓度较低。
表1
ATCC13032衍生的ATCC13032::glnA(mt)的L-谷氨酰胺生产能力分析
Figure BDA0003498253430000231
如表1所示，证实与对照相比，ATCC13032::glnA(mt)-1具有改善了约40％的L-谷氨酰胺生产能力，ATCC13032::glnA(mt)-2具有改善了约11％的L-谷氨酰胺生产能力，ATCC13032::glnA(mt)-3具有改善了约18％的L-谷氨酰胺生产能力。
实施例3：三个glnA突变株核苷酸序列的鉴定
为了鉴定三个选定菌株ATCC13032::glnA(mt)-1至3的glnA基因核苷酸序列，使用实施例1中的SEQ ID NO：7和8的引物组，通过PCR扩增染色体中包括glnA基因的DNA片段。PCR在以下条件下进行：94℃变性2分钟；94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃聚合40秒，30个循环；然后72℃聚合10分钟。
根据分析扩增基因的核苷酸序列的结果，确认了这三个菌株是变体：ATCC13032::glnA(mt)-1是变体，其中SEQ ID NO：5的核苷酸序列的第1201位至第1203位从GAC变成ACC，使得N-末端的第401位氨基酸天冬氨酸被天冬酰胺取代，ATCC13032::glnA(mt)-2是变体，其中SEQ ID NO：5的核苷酸序列的第1204位至第1206位从AAG变成CAC，使得N-末端的第402位氨基酸赖氨酸被组氨酸取代，ATCC13032::glnA(mt)-3是变体，其中SEQ ID NO：5的核苷酸序列的第1210位至第1212位从CTC变成GTC，使得第404位氨基酸亮氨酸被缬氨酸取代。在这三个菌株中，选择与ATCC13032相比，表现出更高的L-谷氨酰胺产量和相似的生长速率的ATCC13032::glnA(mt)-1菌株作为谷氨酰胺合成酶活性增强菌株。
实施例4：构建第401位氨基酸(天冬氨酸)被不同氨基酸取代的各种菌株
由于在实施例3中确认了第401位氨基酸为酶活性的重要位置，尝试用野生型天冬氨酸以外的氨基酸来取代如SEQ ID NO：1所示的第401位的氨基酸。
为了引入实施例3中确认的包括D401N在内的四种类型的异源取代，通过以下方法构建了各重组载体。
首先，使用从WT菌株中提取的基因组DNA作为模板，分别合成SEQ ID NO：15和16的引物，将限制酶SalI识别位点插入5'片段和3'片段，其位置从glnA基因的第1201位至第1203位间隔开约600bp。为了引入四种类型的异源取代，合成SEQ ID NO：17到26的引物，用于取代glnA基因的核苷酸序列的第1202位至第1203位。
此外，关于先前已知的用于glnA基因脱腺苷酸化的突变Y405F，合成引物SEQ IDNO：27和28以比较谷氨酰胺生产能力。
具体地，构建以下形式的pDZ-glnA(D401N)质粒，其中将位于glnA基因的5'和3'末端的DNA片段(每个具有600bp)连接到pDZ载体(韩国专利No.2009-0094433)。使用WT菌株的染色体作为模板，使用引物组SEQ ID NO：15和18，通过PCR构建glnA基因的5'末端基因片段。PCR在以下条件下进行：94℃变性2分钟；94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃聚合40秒，30个循环；然后72℃聚合10分钟。以相同方式，使用引物组SEQ ID NO：16和17，通过PCR构建位于glnA基因的3'末端的基因片段。使用Quiagen的PCR纯化试剂盒纯化扩增的DNA片段，用作待插入的DNA片段用于构建载体。
同时，使用Infusion Cloning试剂盒，将用限制性酶SalI处理并在65℃加热处理20分钟的pDZ载体与通过PCR扩增的用于插入的DNA片段连接后，用其转化大肠杆菌DH5α。将菌株铺板在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。使用引物组SEQ ID NO：13和14，通过PCR选择用插入了所需基因的载体转化的菌落，并使用本领域公知的质粒提取方法获得质粒。该质粒命名为pDZ-glnA(D401N)。
以相同方式，使用引物组SEQ ID NO：15和20和引物组SEQ ID NO：16和19构建pDZ-glnA(D401E)，使用引物组SEQ ID NO：15和24和引物组SEQ ID NO：16和23构建pDZ-glnA(D401S)。此外，使用引物组SEQ ID NO：15和28和引物组SEQ ID NO：16和27构建pDZ-glnA(Y405F)。
为了根据glnA基因的引入更清楚地确定谷氨酰胺的浓度和生长速度，使用电脉冲方法用每个构建的载体转化生产谷氨酰胺的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，并通过同源染色体重组通过将异源取代引入到glnA基因中制备了四个菌株，即，构建了ATCC13032::glnA(D401N)、ATCC13032::glnA(D401E)、ATCC13032::glnA(D401S)、和ATCC13032::glnA(Y405F)。其中，ATCC13032::glnA(D401N)被命名为CA11-4021，并于2019年12月19日以保藏号KCCM12645P保藏于韩国微生物培养中心(KCCM)，该中心被认定为布达佩斯条约下的国际保藏机构。
实施例5：分析glnA突变菌株生产谷氨酰胺的能力
按照以下方法培养上述实施例4中构建的四种菌株，以测定其葡萄糖消耗率和谷氨酰胺生产能力，使用ATCC13032菌株作为对照。
首先，将各菌株接种到含有25mL种子培养基的250mL转角挡板烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养20小时。然后，将1mL种子培养物接种到含有24mL生产培养基的250mL转角挡板烧瓶中，并在32℃以200rpm振荡培养48小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。培养完成后，使用HPLC(Waters 2478)测量L-谷氨酰胺的浓度。谷氨酰胺生产能力和葡萄糖消耗率的测量结果如下表2所示。
种子培养基(pH 7.0)
20G葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8g K2HPO4、0.5gMgSO47H2O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺素、2000μg泛酸钙和2000μg烟酰胺(基于1L蒸馏水)。
谷氨酰胺生产培养基(pH 8.0)
60G原糖、45g(NH4)2SO4、0.48g大豆蛋白、50g CaCO3、0.4g MgSO4·7H2O、1g KH2PO4、0.2mg硫胺素盐酸盐、0.3mg生物素、60mg烟酰胺、10mg FeSO4·7H2O和10mg MnSO4·H2O(基于1L蒸馏水)。
表2
分析ATCC13032衍生的ATCC13032::glnA(mt)的L-谷氨酰胺生产能力和葡萄糖消耗率
Figure BDA0003498253430000261
Figure BDA0003498253430000271
在菌株包含修饰多肽的情况下，在所述修饰多肽中SEQ ID NO：1的第401位氨基酸被不同的氨基酸取代，当取代氨基酸是天冬酰胺(ATCC13032::glnA(D401N))和谷氨酸(ATCC13032::glnA(D401E))时，证实了谷氨酰胺生产能力分别增加了40％和33％。这些结果表明，与引入了glnA脱腺苷酸化突变的ATCC13032::glnA(Y405F)菌株相比，谷氨酰胺生产能力得到改善。
实施例6：基于谷氨酰胺生产菌株构建glnA突变菌株
谷氨酸棒状杆菌KFCC-10680(韩国专利号10-0048440)菌株是一种现有的谷氨酰胺生产菌株，以与实施例4相同的方式通过电脉冲方法分别用pDZ-glnA(D401N)、pDZ-glnA(D401E)和pDZ-glnA(Y405F)转化该菌株。通过将异源取代引入glnA基因制备的三种菌株分别命名为KFCC-10680::glnA(D401N)、KFCC-10680::glnA(D401E)和KFCC-10680::glnA(Y405F)。
实施例7：分析基于谷氨酰胺生产菌株的glnA突变菌株的生产谷氨酰胺的能力
使用KFCC-10680菌株作为对照，如下培养三个选择的菌株以测量其葡萄糖消耗率和谷氨酰胺生产能力。
首先，将各菌株接种到含有25mL种子培养基的250mL转角挡板烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养20小时。然后，将1mL种子培养物接种到含有24mL生产培养基的250mL转角挡板烧瓶中，并在32℃以200rpm振荡培养48小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。培养完成后，使用HPLC(Waters 2478)测量L-谷氨酰胺的浓度。谷氨酰胺生产能力和葡萄糖消耗率的测量结果如下表3所示。
种子培养基(pH 7.0)
20G葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8g K2HPO4、0.5gMgSO47H2O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺素、2000μg泛酸钙和2000μg烟酰胺(基于1L蒸馏水)。
谷氨酰胺生产培养基(pH 8.0)
60G原糖、45g(NH4)2SO4、0.48g大豆蛋白、50g CaCO3、0.4g MgSO4·7H2O、1g KH2PO4、0.2mg硫胺素盐酸盐、0.3mg生物素、60mg烟酰胺、10mg FeSO4·7H2O和10mg MnSO4·H2O(基于1L蒸馏水)。
表3
分析KFCC-10680衍生的KFCC-10680::glnA(mt)的L-谷氨酰胺生产能力和葡萄糖消耗率
Figure BDA0003498253430000281
在菌株包含修饰多肽的情况下，在所述修饰多肽中SEQ ID NO：1的第401位氨基酸被不同的氨基酸取代，当取代氨基酸是天冬酰胺(KFCC-10680::glnA(D401N))和谷氨酸(KFCC-10680::glnA(D401E))时，证实了谷氨酰胺生产能力分别增加了21％和9％。
这些结果表明，与引入了glnA基因脱腺苷酸化突变的KFCC-10680::glnA(Y405F)菌株相比，谷氨酰胺生产能力得到改善。
提供本公开的以上描述是为了说明的目的，本领域技术人员将理解，在不改变本公开的技术构思和本质特征的情况下，可以进行各种变化和修改。因此，很明显上述实施方案在所有方面都是示例性的，并不限制本公开。本文公开的各种实施方案不旨在限制，真实范围和精神由以下权利要求所示。本公开仅受所附权利要求的条款以及这些权利要求所赋予的等效物的全部范围的限制。
保藏单位：韩国微生物培养中心(国际)
登录号：KCCM12645P
保藏日期：2019年12月19
Figure BDA0003498253430000301
Figure IDA0003498253500000011
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Figure IDA0003498253500000221

Claims (15)

1.一种具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽，其中对应于SEQ ID No：1的氨基酸序列的第401位、第402位、或第404位氨基酸被不同的氨基酸取代。
2.如权利要求1所述的修饰多肽，其中对应于第401位的氨基酸被天冬酰胺、谷氨酸或丝氨酸取代。
3.如权利要求1所述的修饰多肽，其中对应于第402位的氨基酸被组氨酸取代。
4.如权利要求1所述的修饰多肽，其中对应于第404位的氨基酸被缬氨酸取代。
5.如权利要求1所述的修饰多肽，其中所述修饰多肽与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有80％或更高并且小于100％的序列同源性。
6.如权利要求1所述的修饰多肽，其中所述修饰多肽由如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成。
7.一种多核苷酸，其编码权利要求1至6中任一项所述的修饰多肽。
8.一种微生物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的修饰多肽或编码所述修饰多肽的多核苷酸。
9.如权利要求8所述的微生物，其中所述微生物具有L-谷氨酰胺生产能力。
10.如权利要求8所述的微生物，其中所述微生物属于棒状杆菌(Corynebacterium)属。
11.如权利要求10所述的微生物，其中属于棒状杆菌属的微生物是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
12.一种生产L-谷氨酰胺的方法，所述方法包括在培养基中培养微生物，所述微生物包含具有谷氨酰胺合成酶活性的修饰多肽或编码所述修饰多肽的多核苷酸，其中对应于SEQID No：1的氨基酸序列的第401位、第402位、或第404位氨基酸被不同的氨基酸取代。
13.如权利要求12所述的方法，还包括从培养基或微生物中回收或分离L-谷氨酰胺。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述微生物是属于棒状杆菌属的微生物。
15.如权利要求14所述的方法，其中属于棒状杆菌属的微生物是谷氨酸棒状杆菌。
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