CN100381569C

CN100381569C - 微生物转谷氨酰胺酶的生产方法

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Publication number: CN100381569C
Application number: CNB2004800062248A
Authority: CN
Inventors: 梅泽有希子; 横山敬一; 菊池庆实; 伊达雅代; 大西几正
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2003-03-07
Filing date: 2004-03-05
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2024-03-05
Also published as: KR20050106502A; RU2005127869A; US20100159560A1; BRPI0407911A; US8105802B2; ATE496995T1; JPWO2004078973A1; JP4482938B2; DK1602722T3; RU2316594C2; DE602004031198D1; US20060019367A1; CN1759180A; ES2356149T3; US7704707B2; EP1602722A4; EP1602722A1; WO2004078973A1; CA2518049C; EP1602722B1

Abstract

本发明提供一种来自放线菌的中性金属蛋白酶，其可选择性地切割微生物原转谷氨酰氨酶(protransglutaminase)的原结构部分，及所述中性金属蛋白酶的编码基因。通过下述方法可以制备原结构部分已被切除的活性型微生物转谷氨酰胺酶，通过培养在其中导入了编码本发明的来自放线菌的中性金属蛋白酶的基因的微生物，生产上述来自放线菌的中性金属蛋白酶，使其与微生物的原转谷氨酰胺酶反应。

Description

微生物转谷氨酰胺酶的生产方法

发明领域

本发明涉及一种新的蛋白酶以及编码所述蛋白酶的核酸分子，该蛋白酶能有效地切割放线菌产生的原转谷氨酰胺酶(pro-transglutaminase)的原结构部分并将其转化成活性型转谷氨酰胺酶。

另外，本发明还涉及利用所述的蛋白酶生产活性型微生物转谷氨酰胺酶的方法。

本发明还涉及生产中性金属蛋白酶的方法。

发明背景

转谷氨酰胺酶是一种催化蛋白质肽链内的γ-羧基酰胺基发生酰基转移反应的酶。当该酶作用于蛋白质时，可以引起ε-(γ-Glu)-Lys交联形成反应，Gln脱酰胺基转化成Glu残基的转化反应。转谷氨酰胺酶已被用于制造果冻等凝胶食品、酸奶酪、乳酪或凝胶化妆品等并且用于肉类食品的肉质改善等(特公平1-50382)。此外，还可以用于制备热稳定的微胶囊材料，以及固定化酶载体等，是一种在工业上具有高利用价值的酶。

已知有表达活性具有钙依赖性的来自动物的转谷氨酰胺酶和表达活性为非钙依赖性的来自微生物的转谷氨酰胺酶(微生物的转谷氨酰胺酶：以下称作″MTG″)。对于MTG，已发现有来自链轮丝菌属(Streptoverticillium)细菌的转谷氨酰胺酶。所述链轮丝菌属的微生物，例如灰肉链轮丝菌(Streptoverticillium griseocarneum)IFO 12776，肉桂链轮丝菌肉桂亚种(Streptoverticillium cinnamoneum sub sp.cinnamoneum)IFO 12852，茂原链轮丝菌(Streptoverticilliummobaraense，此后，有时略作S.mobaraense)IFO 13819等(特开昭64-27471)。

但是由于转谷氨酰胺酶经过从上述微生物等的培养物中纯化生产，存在供给量和效率等问题。因此，作为有效分泌异源蛋白质的方法，建立了以棒杆菌型细菌作为宿主，产生将转谷氨酰胺酶连接在棒杆菌型细菌信号肽的下游的融合蛋白，并使其高效率地分泌到菌体外，由此获得高产量的转谷氨酰胺酶的方法(WO 01/23591)。其中公开了以MTG上附加有原结构部分的非活性型的原转谷氨酰胺酶(以下称作“原-MTG”)的形式分泌，分泌后通过蛋白酶将原-MTG的原结构部分切除，使之转变成具有活性的转谷氨酰胺酶的方法，以及通过在生产原-MTG的棒杆菌型细菌中以所需足够量共表达来自放线菌的丝氨酸蛋白酶SAM-P45，在培养液中直接产生活性型的转谷氨酰胺酶的方法。

虽然，在棒杆菌型细菌中使原-MTG和可将其原结构切除的蛋白酶共表达于培养液中直接产生活性型的转谷氨酰胺酶的方法被认定为一种非常有效的转谷氨酰胺酶的生产方法，但由于SAM-P45的底物特异性不严格，不仅是原-MTG的原结构部分被切除，对转谷氨酰胺酶本身也存在某种程度上的消化分解，操作并不能说简单。因此，在使用SAM-P45的情况下，为不使在培养液中生成的转谷氨酰胺酶分解，转谷氨酰胺酶的生产过程需要进行严格地管理。

所以，为了有利于活性型转谷氨酰胺酶的生产，仍然需要仅选择性地分解原-MTG的原结构部分，尽量不引起对转谷氨酰胺酶本身进行过度分解的蛋白酶。

作为切除原-MTG的原结构的酶，除SAM-P45之外已知还有来自多粘芽胞杆菌(Bacillus polymyxa)的分散酶(Eur.J.Biochem.，vol.257，p.570-576(1998))。但是切除原结构需要大量的酶，还是存在转谷氨酰胺酶本身过度分解的风险。另外，分散酶是细胞培养用试剂，因此作为工业酶太过昂贵。

发明简述

所以，为了有利于生产活性型的转谷氨酰胺酶，仍然需要仅选择性地分解原-MTG的原结构部分，尽量不引起对转谷氨酰胺酶本身过度分解的蛋白酶。若是可以使用仅选择性地分解原-MTG的原结构部分，而尽可能不引起转谷氨酰胺酶本身过度分解的蛋白酶，对活性型转谷氨酰胺酶的生产是有利的。此外，假如选择性的分解原-MTG的原结构部分的、有利于生产转谷氨酰胺酶的酶在应用棒杆菌型细菌生产时，可以容易地分泌到菌体之外，则可以通过与原-MTG共表达，在培养液中直接产生活性型转谷氨酰胺酶，则更为优选。

因此，本发明的目的在于提供选择性地切除原-MTG的原结构部分，且对生产转谷氨酰胺酶有利的蛋白酶。

具体说来，本发明的目的在于提供一种蛋白酶，其是选择性切除原MGT的原结构的蛋白酶，可以以棒杆菌型细菌作为宿主进行生产，且可以容易地分泌到菌体之外。

本发明的目的还在于提供编码所述蛋白酶的核酸分子。

本发明的另一个目的在于提供利用所述蛋白酶高效生产MTG的方法。

此外，本发明还提供制备上述蛋白酶的方法。

本发明人对可以选择性地切除原-MTG的原结构部分，同时尽量不引起转谷氨酰胺酶本身分解的蛋白酶进行了研究，从放线菌中分离并纯化出了具有此种性质的中性金属蛋白酶。本发明人也获得了编码上述蛋白酶的DNA，将其引入棒杆菌型细菌，以棒杆菌型细菌作为宿主成功地进行分泌表达。另外，使该酶实际地作用于原-MTG，切除了原-MTG的原结构部分，可以回收到活性型转谷氨酰胺酶。本发明人还发现来自其他微生物的具有同等功能的中性金属蛋白酶，其可同样地用于活性型MTG的生产，由此完成了本发明。

即，本发明是来自放线菌的，对切除原-MTG的原结构部分具有高选择性的中性金属蛋白酶及其编码基因。

本发明还涉及以利用中性金属蛋白酶切除原-MTG的原结构部分为特征的活性型MTG的生产方法。

本发明还涉及上述金属蛋白酶的生产方法，其特征在于，将编码上述中性金属蛋白酶的核酸分子引入棒杆菌型细菌，培养导入了上述核酸分子的棒杆菌型细菌，使之表达上述的中性金属蛋白酶，并回收分泌到菌体外的上述金属蛋白酶。

更具体地说，本发明涉及来自放线菌的具有以下性质的金属蛋白酶SVP35：

1)分子量：约35,000(由SDS-PAGE测定)

2)最适pH：6.0-pH8.0，更具体地，pH6.5-pH7.5，特别是pH7.0左右

3)pH稳定性：pH4-pH10

4)最适温度：约45℃

5)温度稳定性：在约50℃以下稳定

6)它被金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸、1，10-二氮杂菲和磷酸阿米酮，以及来自放线菌的链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂(SSI)强烈地抑制。

本发明还涉及具有以下性质的中性金属蛋白酶SVP70：

1)分子量：约71,000(由SDS-PAGE测定)

2)最适pH：pH6.0-pH8.0的范围，具体地是pH6.5-pH7.5，特别是在pH7.0左右

3)pH稳定性：pH5-10

4)最适温度：范围在50℃-55℃，特别是55℃左右

5)它被金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸、1，10-二氮杂菲和磷酸阿米酮，SH-还原剂二硫苏糖醇以及源自放线菌的链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂(SSI)强烈地抑制。

本发明还涉及编码所述SVP35或SVP70的核酸分子。

本发明还涉及以利用SVP35或SVP70切除原-MTG的原结构部分为特征的活性型MTG的生产方法。

本发明还涉及上述SVP35或SVP70的生产方法，其特征在于，将编码上述的SVP35或SVP70的核酸分子引入棒杆菌型细菌，培养导入了上述核酸分子的棒杆菌型细菌，并回收分泌到菌体外的上述SVP35或SVP70。

附图的简要说明

图1是表示SVP35和SVP70活性的pH依赖性的图。

图2是表示SVP35和SVP70的pH稳定性的图。

图3是表示SVP35和SVP70活性的温度依赖性的图。

图4是表示SVP35的温度稳定性的图。

图5是表示多种化合物对SVP35和SVP70活性的抑制活性的图。

图6是以各蛋白质的量的变化分别表示的由SVP35和SVP70引起的原-MTG到活性型MTG随时间的变化。

图7(A)和(B)是表示使SVP70和SAM-P45作用于原-MTG时，转谷氨酰胺酶活性随时间的变化的图。(A)：添加SVP70，●：相对于底物的1/200的添加量，■：相对于底物的1/500的添加量；(B)：添加SAM-P45，●：相对于底物的1/10的添加量，■：相对于底物的1/50的添加量。

图8(A)和(B)是表示SVP70和SAM-P45作用于原-MTG时，MTG蛋白质的量随时间的变化。(A)：添加SVP70，●：相对于底物的1/20的添加量，■：相对于底物的1/500的添加量；(B)：添加SAM-P45，●：相对于底物的1/10的添加量，■：相对于底物的1/50的添加量。

优选实施方案的描述

通常，分泌型蛋白质作为前肽或前原肽翻译后，切除信号肽部分(前-部分)转变为成熟的肽或原肽，原肽通过蛋白酶进一步切除被称作原结构部分的区域转变为成熟肽。本说明书中，分泌型蛋白质的原结构部分有时简称作“原结构”。另外，本说明书中，所谓“信号序列”可以是存在于分泌型蛋白质前体的N末端，且在天然的成熟蛋白质中不存在的序列，信号肽指从所述蛋白质前体上切除下来的肽。通常，伴随着向体外分泌，信号序列即通过蛋白酶切除。

在本说明书中，没有信号肽但包含原结构部分的蛋白质有时被称作“原蛋白(proprotein)”，例如“原转谷氨酰胺酶”或“原-MTG”。本说明书中分泌型蛋白质的原结构部分简称为“原结构”或“原结构部分”，这些用语可互换使用。

本发明人设想首先在易于在棒杆菌型细菌中表达的蛋白酶中，对如下所述的蛋白酶进行研究，即所述蛋白酶对目标底物具有高特异选择性，选择性地分解原-MTG的原结构部分，而尽可能不引起转谷氨酸蛋白酶本身的过度分解。

当放线菌将MTG分泌到菌体外时，首先作为原-MTG分泌，分泌后其原结构部分被切除形成活性型的MTG(Eur.J.Biochem.，vol.257，p.570-576(1998))。因此，本发明人设想在产生MTG的放线菌中存在将原-MTG的原结构部分切除的蛋白酶。由于该蛋白酶是切除原结构部分的蛋白酶，因此设想该蛋白酶具有高底物选择性，只切除原结构部分而对MTG的作用很小。

此外，来自放线菌的原MTG的结构基因以及蛋白酶SAM-P45的结构基因均可以在棒杆菌型细菌中很好地表达，并可以分泌到菌体外。根据上述信息，首先从产生MTG的放线菌中寻找目标的蛋白酶，研究结果表明，MTG产生菌茂原链轮丝菌对切除原-MTG的原结构部分具有高选择性，并且可以产生对生产活性型的MTG有用的新的中性金属蛋白酶。本发明人分离纯化了该中性金属蛋白酶，并表征了其酶学特性。此外，本发明人还确定了该金属蛋白酶N末端的部分氨基酸序列，获得了编码该金属蛋白酶的基因。

另外，本发明人还将该酶基因引入棒杆菌型细菌，使其在以棒杆菌型细菌为宿主的体系中表达，该酶可分泌到菌体外。该酶可以实际地作用于原-MTG的原结构部分，切除原结构部分获得活性型的转谷氨酰胺酶。此外，还在其他来源的微生物中发现了具有等同功能的中性金属蛋白酶，其同样可用于制造活性型的MTG。

下面通过具体的实施例说明本发明。

本发明的中性金属蛋白酶可以从茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolors)等放线菌培养物表面和培养物上清液中制备。

下面，首先介绍在茂原链轮丝菌IFO13819中新发现的中性蛋白酶。

对于可以获得本发明的中性蛋白酶的细菌，例如上述放线菌的培养，可以按照公知的培养放线菌的方法进行。即用于培养的培养基可以利用包含常规的碳源、氮源、无机离子等的培养基。作为碳源有葡萄糖、淀粉、蔗糖，也可以使用其他的碳源。作为氮源，可根据需要选用胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、铵盐以及其他的氮源。所述培养可以控制在有氧条件下、pH5.0-pH8.5温度范围15-37℃的适当条件下进行。为制造本发明的中性蛋白酶，优选持续培养直到最大限度地产生目标中性金属蛋白酶之后停止。虽然适当的培养期取决于温度，pH和培养基，但通常优选大约1-12天左右。培养后，通过离心分离等操作将培养物分离成菌体和上清液。

本发明的新的中性金属蛋白酶可以从培养上清液和回收的菌体中获得，特别是可以从菌体表面获得。对于该酶的纯化可以使用任何公知的纯化酶的方法，例如硫酸铵盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、疏水层析法等。该蛋白酶可以通过高效液相层析(HPLC)等得以更有效地纯化。测定所得的中性金属蛋白酶的酶活性可以通过下述方式进行，以含有原转谷氨酰胺酶的原结构部分和成熟的转谷氨酰胺酶的连接区域的肽，例如合成肽Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser(SEQ ID NO：11)(肽研究所制)为底物，使之与酶反应，通过计算底物减少量来进行测定。

如上所述，回收菌体，特别是从菌体表面或培养物上清液中纯化本发明的中性金属蛋白酶，然后，利用气相蛋白质测序仪分析该酶的N-末端氨基酸序列，由此确定部分氨基酸序列。此外，可以检测上述经分离纯化的中性金属蛋白酶的性质(最适pH、pH稳定性、最适温度、温度的稳定性、抑制剂的作用等)。

在本发明的一个实施方案中得到以下的蛋白酶：将自茂原链轮丝菌表面分离的中性金属蛋白酶命名为SVP35，从培养物上清液中获得的中性金属蛋白酶命名为SVP70。

在本发明的一个实施方案中，本发明的中性金属蛋白酶是具有下述性质的中性金属蛋白酶SVP35：

1)分子量：约35,000(由SDS-PAGE测定)

2)最适pH：pH6.0-pH8.0，具体地是pH6.5-pH7.5，特别是pH7.0左右

3)pH稳定性：pH4-pH10

4)最适温度：约45℃

5)温度稳定性：在约50℃以下稳定

6)抑制剂：它被金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸、1，10-二氮杂菲和磷酸阿米酮，以及来自放线菌的链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂(SSI)强烈地抑制。

在本发明的另一个实施方案中，本发明的中性金属蛋白酶是具有下述性质的中性金属蛋白酶SVP70：

1)分子量：约71,000(由SDS-PAGE测定)

3)pH稳定性：pH5-pH10

4)最适温度：范围在50℃-55℃，特别是55℃左右

5)抑制剂：它被金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸、1，10-二氮杂菲和磷酸阿米酮，SH-还原剂二硫苏糖醇以及来自放线菌的链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂(SSI)强烈地抑制。

当SVP35或SVP70中的任何一方作用于原-MTG时，都对MTG的原结构表现出高选择性切割活性。即，两种酶都具有将原-MTG高效地转化为活性型的MTG，而对生成的活性型的MTG本身的分解活性低的特征，因此都是适宜以原-MTG为原料生产活性型的MTG的酶。另一方面，这两种新的金属蛋白酶的N-末端氨基酸序列为：对于SVP35如SEQ ID NO：1所示，对于SVP70如SEQ IDNO：2所示，两者之间具备同源性。因此，检索与这些蛋白酶的N-末端氨基酸序列具备同源性的序列，发现了来自灰色链霉菌的金属蛋白酶SGMP II(J.Biochem.Vol.110，p.339-344(1991))和来自天蓝色链霉菌的三种金属蛋白酶(GenBank/EMBL/DDBJ CAB76000，CAB76001，CAB69762)。这些蛋白酶也可以与SVP35和SVP70相同的方式用于选择性地切除原-MTG的原结构部分，也可被用作原-MTG原料来生产活性型的MTG。

下面说明通过重组DNA技术生产本发明的中性金属蛋白酶的方法。

已知有很多利用重组DNA技术生产酶、生理活性物质等有用蛋白质的实例。重组DNA技术的优势在于可以大量生产在自然界中极少量存在的有用蛋白质。

利用重组DNA技术生产本发明的中性金属蛋白酶首先要制备下述的遗传构建体，该构建体包含处于可以行使其功能的适当位置的启动子、编码适当的信号肽的序列、编码本发明的中性金属蛋白酶的核酸片段和为所述中性金属蛋白酶在棒杆菌型细菌中的表达所必需的调节序列(操纵子或终止子等)。本发明的中性金属蛋白酶可以具有N-末端原结构部分。用于制备上述遗传构建体的载体没有特别的限制，只要能在宿主微生物，优选棒杆菌型细菌中行使功能即可，例如可以是质粒之类染色体外自主复制的载体，也可以整合到细菌的染色体DNA中的载体。当以棒杆菌型细菌作为宿主时，特别优选来自棒杆菌型细菌的质粒作为载体。这些包括，例如：pHM1519(Agric.Biol.Chem.，48.2901-2903(1984))，pAM330(Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984))，和具有抗药基因的经修饰的质粒。

作为可在本发明中用作宿主菌的棒杆菌型细菌的实例包括通过诱导下述野生型菌株或其突变株所得的突变株，所述野生型菌株或其突变株包括以L-谷氨酸产生菌为代表的解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)ATCC14066、Brevibacterium immariophilumATCC14068、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)ATCC13869、绣球花短杆菌(Brevibacterium roseum)ATCC13825、黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)(Brevibacterium flavum(Corynebacterium glutamicum))ATCC14067、嗜醋酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、百合棒杆菌(谷氨酸棒杆菌)(Corynebacterium lilium(Corynebacterium glutamicum))ATCC15990、产氨短杆菌(产氨棒杆菌)(Brevibacteriumammoniagenes(Corynebacterium ammoniagenes))ATCC6871等等。

本发明中所用的突变株包括，例如丧失了谷氨酸生产能力的突变株，用于生产赖氨酸等氨基酸的突变株，和用于生产其他物质例如肌苷等核酸的突变株。上述的突变株可以通过下述方法获得，即紫外线照射或N-甲基-N’亚硝基胍等化学诱变剂处理后，筛选蛋白质分泌生产能力提高的菌株。

特别是，由野生型菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13869作为链霉素(Sm)抗性突变株筛选得到的谷氨酸棒杆菌AJ12036(FERM BP-734)(最初于1984年3月26日保藏)(现保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心日本筑波市东1-1-1中央6号，邮编305-8566)与其亲株(野生型菌株)相比，推测该突变株中与蛋白质分泌相关的功能基因中存在突变，其分泌生产异源蛋白质的能力比亲株高出大约2-3倍的累积量，因此适宜作为宿主菌株(参见WO02/081694)。另外如果利用诱变该菌株获得的不产生细胞表面蛋白的突变株作为宿主，则可以使从培养基中分离外源蛋白更加容易，所以特别优选。上述修饰可以通过突变或遗传重组技术向染色体上的细胞表面蛋白质或其表达调节区域中导入突变来获得。

来自棒杆菌型细菌的启动子实例包括细胞表面蛋白质的PS1、PS2和SlpA基因的启动子，各种氨基酸生物合成体系中的基因，例如，谷氨酰胺合成酶基因、赖氨酸生物合成体系中的天冬氨酸激酶基因的启动子等。

用于本发明的信号肽可以是宿主棒杆菌型细菌的分泌型蛋白质的信号肽，优选来自棒杆菌型细菌细胞表面蛋白的信号肽。棒杆菌型细菌的细胞表面蛋白包括，例如，来自谷氨酸棒杆菌的PS1和PS2(特表平6-502548)，和来自产氨棒杆菌的SlpA(C.ammoniagenes)(特开平10-108675)。

为了通过重组DNA技术生产选择性切除原-MTG的原结构的活性强的中性金属蛋白酶，编码这种中性金属蛋白酶的DNA是必需的。

在本发明的一个实施方案中，中性金属蛋白酶SVP35是重组DNA技术制备的。可以通过下述方式获得编码SVP35的DNA。

首先，确定经纯化的SVP35的氨基酸序列。Edman方法(Edman，P.，Acta Chem.Scand.4，227(1950))可用于确定该氨基酸序列。也可以用岛津制作所等制的气相蛋白测序仪来确定所述氨基酸序列。

对于本发明的中性金属蛋白酶SVP35，确定了其N-末端的20个氨基酸残基，如SEQ ID NO：1所示。

利用这些信息合成适当的PCR引物并制备用于获得本发明的中性金属蛋白酶的探针。例如：利用Saito和Miura的方法[Biochem.Biophys.Acta 72，619(1963)]基于N-末端氨基酸序列同源性的检索结果，制备预计具备同源性的来自放线菌的蛋白酶基因，例如来自天蓝色链霉菌的金属蛋白酶基因(GenBank/EMBL/DDBJ CAB76001)作为模板，进行PCR，可以扩增编码所述蛋白酶的基因片段。该扩增片段可用作探针。

然后，用适当的各种限制酶(例如识别6碱基序列的各种限制酶)消化由Saito和Miura的方法制备的来自放线菌的DNA，例如茂原链轮丝菌IFO13819的染色体DNA。以上述PCR所得产物的³²P-标记物为探针，利用本领域技术人员所公知的技术，例如《分子克隆》第二版[J.Sambrook E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，p9.31(1989)]中所述的Southern印迹杂交技术等分析消化的放线菌染色体DNA。回收通过Southern印迹确认与所用探针具有高同源性的片段，并将其克隆到适当的载体中，由此克隆编码本发明的中性金属蛋白酶的核酸分子或其部分。这是一种本领域技术人员熟知的基因克隆的必备技术(参见，例如《分子克隆》第二版J.Sambrook E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，p1.90(1989))。

在本发明的一个实施方案中，以天蓝色链霉菌A3(2)的染色体DNA作为模板进行PCR制备探针。进而，在茂原链轮丝菌IFO13819染色体DNA的SphI消化产物中，检测出可与³²P-标记探针杂交的约8kb的单一条带。由此，用SphI消化上述方法制备的茂原链轮丝菌IFO13819的染色体DNA，由琼脂糖凝胶电泳回收约8kb的片段，再将回收的片段插入pUC18的SphI位点后导入大肠杆菌JM109的感受态细胞，制备基因文库。用合成的寡核苷酸作为探针，按照《分子克隆》第二版中描述的菌落杂交技术筛选上述制备的文库，筛选保有已克隆了SVP35的基因片段的质粒的菌株，由此获得目的克隆。由上述菌株中回收的质粒命名为pVSV1。分析克隆入pVSV1的片段的核苷酸序列，通过由此推定的一级氨基酸序列，确认为先前确定的编码N-末端氨基酸序列的片段。由此确认了所得的基因是编码SVP35的基因。

然后，将包含编码获得的金属蛋白酶的DNA的构建体与适宜于所用宿主的性质的载体连接构建重组核酸分子，用以表达本发明的中性金属蛋白酶。用该重组核酸分子转化宿主棒杆菌型细菌细胞。在适当的培养基中培养转化细胞，可以回收分泌或积累在培养基中和/或细胞中的本发明的中性金属蛋白酶。

下面描述用该中性金属蛋白酶由原-MTG制备活性型的MTG的方法。用于生产活性型的MTG的中性金属蛋白酶可以作为由所述中性金属蛋白酶生产菌的培养液制备的含有中性金属蛋白酶的组分与原-MTG作用。此外，也可以应用高度纯化的高比活性中性金属蛋白酶。此外，如下述也可以通过培养已转化了重组核酸分子的细胞所获得的中性金属蛋白酶，所述重组核酸分子是将编码对原-MTG的原结构部分具有强选择性切除活性的中性金属蛋白酶的DNA与载体相连所得的。

用于生产MTG的原-MTG，可以是由原-MTG生产菌的培养液制备的含有原-MTG组分。也可以使用进一步纯化的原-MTG。反应条件为，相对于原-MTG的中性金属蛋白酶的添加量为，按重量计1/10到1/500，适当调节反应温度在15℃～50℃ pH5.0～pH9的范围。

另外，如上所述利用含有编码本发明的中性金属蛋白酶的DNA的遗传构建体，导入含有编码原-MTG的遗传构建体的微生物，特别是棒杆菌型细菌中，在同一菌体中生产原-MTG和本发明的中性金属蛋白酶，由此在上述条件下原-MTG可以转变为成熟的MTG。利用棒杆菌型细菌高效生产原-MTG的详细的方法，该方法中使用的遗传构建体，导入了所述遗传构建体的棒杆菌型细菌在例如WO01/23591中都有详细说明。更具体地说，例如将下述遗传构建体导入棒杆菌型细菌可以获得向胞外高效分泌原-MTG的棒杆菌型细菌，所述遗传构建体通过将处于来自棒杆菌型细菌的信号肽序列，特别是细胞表面蛋白的信号肽序列下游的编码原-MTG的序列连接到适当的启动子的下游所获得。用于上述目的的信号肽、启动子和宿主选自适于表达本发明的金属蛋白酶的上述信号肽、启动子和宿主。组合可共存于同一菌体中的载体是本领域技术人员所公知的。由此，含有上述编码本发明的中性金属蛋白酶的DNA的遗传构建体导入到生产原-MTG的棒杆菌型细菌中，或者反之，将编码原-MTG的适当的遗传构建体导入生产本发明的中性金属蛋白酶的棒杆菌型细菌中，使得表达原-MTG和本发明的中性金属蛋白酶的遗传构建体共存同一菌体内，培养所述细菌，设置上述使本发明的中性金属蛋白酶具有活性的适当条件，由此获得成熟的MTG。

通过本发明的方法制备的转谷氨酰胺酶可以按照本领域技术人员所公知的方法从反应液中分离纯化出来。例如：在通过离心等去除菌体后，利用盐析、乙醇沉淀、超滤、凝胶过滤层析法、离子交换柱层析法、亲和层析、中高压液相层析、反相分配层析法、疏水的层析法等或上述方法的组合等已知方法进行分离纯化。

下面，通过实施例进一步说明本发明，但本发明并不局限于实施例所记载的内容。

实施例

实施例1：由茂原链轮丝菌IFO13819生产的中性金属蛋白酶

(1)纯化由茂原链轮丝菌IFO13819生产的中性金属蛋白酶(SVP70)

在5L的Sakaguchi摇瓶中装入800mL ISP2液体培养基(每升水4g酵母提取物，10g麦芽提取物，4g葡萄糖，调节pH7.3)，由平板中接种茂原链轮丝菌IFO13819，在30℃下120rpm振荡培养9天。离心分离培养液，回收上清。用Depth过滤器(3μm孔径大小Saltorius公司制)过滤，然后用10,000Da孔径大小的Sartocon Slice膜(Saltorius公司制)浓缩。将浓缩液用20nM的Tris-HCl缓冲液/5mM氯化钙(pH7.5)10-倍稀释，用FPLC(Amersham Pharmacia公司制)通过用相同缓冲液平衡过的DEAE-Sepharose FF柱(2.6φ×10cm，Amersham Pharmacia公司制)，用0-0.5M线性梯度的氯化钠洗脱。回收含有活性成分的组分，通过用1.5M硫酸铵20mM MES缓冲液/5mM氯化钙(pH6.0)，平衡过的苯基Sepharose HP柱(1.6φ×10cm，Amersham Pharmacia公司制)用1.5-0M线性梯度的硫酸铵洗脱，收集活性组分。所得的活性组分用20mM MES缓冲液/5mM氯化钙(pH6.0)在4℃透析过夜，以获得纯化的酶溶液。

酶活性的测定按如下步骤进行：

将酶添加到20mM包含肽GPSFRAPDS(肽研究所制)(SEQ IDNO：11)的磷酸钠缓冲液中，总体积170μl，在30℃下反应10分钟，然后在95℃下加热5分钟终止反应。取80μl按如下条件进行HPLC分析，根据底物数量的减小计算活性。

装置：HPLC L-6300系统(日立公司制)。

柱：YMC-PACK ODS 120A 4.6×150mm(YMC)

洗脱液：(A)0.1％TFA (B)80％乙腈/0.1％TFA

洗脱条件：12-16％线性浓度梯度的乙腈(15分钟)

流速：1.0ml/min

检测波长：220nm

在这一条件下，肽GPSFRAPDS在13到14分钟的保留时间洗脱，降解产物FRAPDS在7.5到8.5分钟的保留时间洗脱。

1分钟催化1nmol原-MTG分解的酶数量定义为1酶活单位。

(2)纯化由茂原链轮丝菌IFO13819生产的中性金属蛋白酶(SVP35)

在5L的Sakaguchi摇瓶中装入800mL ISP2液体培养基，由平板中接种茂原链轮丝菌IFO13819，在30℃下120rpm振荡培养48小时。离心分离培养液，弃上清，回收细胞。将细胞悬浮于20mM Tris-HCl缓冲液/30mM氯化钠(pH7.5)，在冰上振荡4小时，离心收集上清。所得上清液用Depth过滤器(孔径0.22μm Saltorius公司制)过虑除菌，然后用FPLC(Amersham Pharmacia公司制)通过用包含5mM氯化钙和0.01mM氯化锌的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的CM-Sepharose FF(Amersham Pharmacia Co.Ltd.)柱(1.6φ×10cm)，在相同的缓冲液中用0-0.5M线性浓度梯度的氯化钠洗脱。回收含有活性成分的组分，经过用含有1.5M硫酸铵，5mM氯化钙和0.01mM氯化锌的20mM Tris-HCl缓冲液平衡过的苯基Sepharose HP柱(1mL，Amersham Pharmacia公司制)用1.5-0M线性浓度梯度的硫酸铵洗脱。收集活性组分，利用PD-10柱(Amersham Pharmacia)用含5mM氯化钙和0.01mM氯化锌的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，脱盐得到部分纯化的酶液。

各步骤的酶活性以肽GPSFRAPDS作为底物，利用与(1)中同样的方法测定。

(3)评估由茂原链轮丝菌IFO13819生产的中性金属蛋白酶(SVP35)的性质

i)底物特异性

用20mM包含5mM氯化钙和0.01mM氯化锌的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)制备的1mg/ml的胰岛素B溶液和原-MTG溶液用作底物，加入酶溶液，在30℃下反应2小时，然后通过HPLC于下述条件下分离肽片段：

装置：L-7100/7200/7405/D-7600(日立)

柱：VYDAC C18 4.6mm I.D.×250mm(VYDAC)

洗脱液：(A)0.1％TFA (B)80％乙腈/0.1％ TFA

洗脱条件：4-44％线性浓度梯度的乙腈

流速：0.5ml/min

检测波长：UV 220nm

获得肽片段的氨基酸序列经PPSQ-10(岛津制作所公司制)分析以表征SVP35的切除位点序列。结果表明在特别是Phe，常常是Leu，有时是Tyr、Trp、Ile、Val前(N-末端侧)进行切除，SVP识别切除位点P′1位的芳香族氨基酸和带有大侧链疏水的氨基酸。

ii)最适pH

在pH3～pH10的0.15M GTA缓冲液(3，3-二甲基戊二酸，Tris(羟基甲基)氨基甲烷、2-氨基2-甲基-1，3-丙二醇缓冲液)中，使SVP35在30℃下与底物Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser作用10分钟。结果表明SVP35的最适pH在7.0左右，以pH7.0处的活性为100％，SVP35在pH6.0-pH8.0具有70％的活性或更高，在pH6.5-pH7.5具有80％的活性或更高(参见图1)。

iii)pH稳定性

分别向10μl SVP35纯化酶溶液中分别添加40μl pH3～pH10的0.15M GTA缓冲液，置于4℃下过夜，然后添加0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)将液体体积调节至400μl，将pH调节到pH7.0。向这些酶溶液中加入作为底物的Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser在pH7.0，30℃下反应10分钟。结果表明SVP35在pH4～pH10的范围稳定(将其在pH4.0下的活性作为100％，则其在pH4-pH10下具有90％或更高的活性)(参见图2)。

iv)最适温度

将纯化的酶溶液用含5mM氯化钙和0.01mM氯化锌的20mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)稀释，加入Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser，在pH7.0，5℃～65℃的条件下反应10分钟。结果表明SVP35的最适温度为约45℃，其在40℃～50℃的范围具有高活性(其在45℃下具有80％或更高的活性)(参见图3)。

v)温度稳定性

向10μl纯化的酶溶液中加入含5mM氯化钙和0.01mM氯化锌的40μl 20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，在4℃或30℃～70℃条件下反应15分钟，置于冰上冷却，加入250μl 20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)。向所述酶溶液中加入作为底物的Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser，在30℃下反应5分钟。把在4℃下处理的活性作为100％测定各温度下的残留活性。结果表明SVP35在50℃下保留了80％的活性，但在60℃下丧失了活性(参见图4)。

vi)抑制剂

向含有如图5所示浓度的各种化合物的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中加入纯化的酶溶液于室温下放置60分钟。然后加入作为底物的Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser在30℃下反应10分钟。以不添加任何化合物的情况下酶对Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser的切割活性作为100％，计算添加了各化合物的情况下的相对活性。结果表明SVP35被金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸、1，10-二氮杂菲和磷酸阿米酮，以及来自放线菌的链霉菌枯草菌素抑制剂(SSI)所强烈抑制(参见图5)。

(4)表征由茂原链轮丝菌IFO13819生产的中性金属蛋白酶(SVP70)的性质

i)底物特异性

所述的底物特异性可以利用与(3)-i)中描述的同样的方法检测。结果显示所述的底物在特别是Phe，常常是Leu有时是Tyr、Trp、Ile、Val前(N-末端侧)进行切除，SVP70识别切除位点P′1位的芳香族胺基酸和带有大侧链疏水的氨基酸。

ii)最适pH

所述SVP70的最适pH可以利用与(3)-ii)中描述的同样的方法检测。结果表明，SVP70的最适pH在7.0左右，以pH7.0处的活性作为100％，则SVP70在pH6.0-pH8.0下具有90％或更高的活性，在pH6.5-pH7.5具有95％或更高的活性(参见图1)。

iii)pH稳定性

所述的pH稳定性可以利用与(3)-iii)中描述的同样的方法检测。结果表明SVP70在pH5～pH10是稳定的，但在弱碱性条件下不如SVP35稳定(参见图2)。具体说来，加入以pH5.0的活性作为100％，其在pH5～pH7下具有90％或更高的活性，在pH7～pH10的范围具有80％或更高的活性。

iv)最适温度

所述SVP70的最适温度可以利用与(3)-iv)中描述的同样的方法检测。结果表明SVP70的最适温度在50℃～55℃，尤其是55℃附近(参见图3)。

v)抑制剂

各种的化合物对SVP70的抑制活性可以按照类似于(3)-vi)中同样的方法检测。结果表明SVP70被金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸、1，10-二氮杂菲和磷酸阿米酮、还原剂二硫苏糖醇、尿素，以及来自放线菌的链霉菌枯草菌素抑制剂(SSI)所强烈抑制(参见图5)。

(5)SVP35和SVP70N-末端氨基酸序列的测定

(1)和(2)中得到的SVP35和SVP70的纯化酶用MembraneCartridge(Perkin Elmer公司制)转移到的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用气相蛋白质测序仪PPSQ-10(岛津制作所公司制)分析N-末端氨基酸序列。SVP35的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，SVP70的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。可以确认这些序列之间具备同源性。

由此，检索与所述蛋白酶N-末端氨基酸序列具备同源性的来自放线菌的序列，得到来自灰色链霉菌的金属蛋白酶SGMP II(J.Biochem.，Vol.110，p.339-344，1991)和来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的三种蛋白酶，(GenBank/EMBL/DDBJCAB76000，CAB76001、和CAB69762)等等。这些蛋白酶也可用于选择性地切割原-MTG的原结构部分，因此它们也可以用于生产本发明的活性型MTG。

(6)克隆SVP35基因及其在棒杆菌型细菌中的分泌

利用Saito和Miura的方法制备天蓝色链霉菌A3(2)的染色体DNA[Biochem.Biohhys.Acta，72，619(1963)]。参照具备N-末端同源性的来自天蓝色链霉菌的金属蛋白酶(GenBank/EMBL/DDBJCAB76001)基因序列，合成如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物。以天蓝色链霉菌A3(2)的染色体DNA为模板，用如SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4所示的引物进行PCR扩增金属蛋白酶基因中的该基因区域。上述PCR反应利用PyrobestDNA聚合酶(宝酒造公司制)按照制造商推荐的反应条件进行。利用³²P-标记的PCR产物为探针，用各种识别6-碱基序列的限制酶消化由Saito和Miura的方法制备的茂原链轮丝菌IFO13819的染色体的DNA样品经《分子克隆》第二版所描述的Southern印迹分析[J.Sambrook E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷来港实验室出版社，p9.31(1989)]，检测出由SphI切割出约8kb的单一条带。由此，用SphI消化上述制备的茂原链轮丝菌IFO13819的染色体DNA，利用EASYTRAP Ver.2(宝酒造公司制)通过琼脂糖凝胶电泳回收约8kb的片段。将回收的片断插入到pUC18的SphI位点后，导入大肠杆菌JM109感受态细胞(宝酒造公司制)制备基因文库。对于所制备的文库，以合成的寡核苷酸为探针，利用《分子克隆》第二版[J.Sambrook E.F.Fritsch和T.Maniatis、冷泉港实验室出版社p1.90(1989)]所记载的克隆杂交方法，筛选带有克隆了SVP35基因片段的质粒的菌株。

将由上述筛选所得的菌株中回收的质粒命名为pVSV1。确定克隆到pVSV1中的片段的核苷酸序列。该克隆片段的核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示。推定由该基因编码的氨基酸的一级序列，确定了包括上述确定的N-末端氨基酸序列和推定为原结构部分的区域的SVP35的全部一级氨基酸序列，其中该一级氨基酸序列包含SVP35的信号序列。所述SVP35的全部氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。推定SEQID NO：6所示氨基酸序列的1-36位氨基酸是信号序列，37-216位氨基酸是原结构部分，217-537位氨基酸是成熟的SVP35。

参照SEQ ID NO：5序列，以pVSV1为模板合成如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物，通过PCR技术扩增包含SVP35的原结构部分和成熟的SVP35的基因区域。上述PCR反应利用PyrobestDNA聚合酶(宝酒造公司制)按照制造商推荐的反应条件进行。

接下来，利用WO 01/23591中描述的pPKSPTG1为模板，利用如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的寡核苷酸的组合通过PCR技术扩增包含谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白PS2基因启动子区域的5’-上游区域和产氨棒杆菌的细胞表面蛋白SlpA的信号序列。如SEQID NO：10所示的引物包含编码具有原结构部分的SVP35的N-末端氨基酸的序列。

接下来，各种扩增的PCR溶液各1μl相混合作为模板，利用SEQID NO：8和SEQ ID NO：9所示序列进行交换PCR扩增异源融合的前原SVP35基因片段，该基因片段是连接含有PS2基因启动子区域的5’-上游区域与产氨棒杆菌的细胞表面蛋白SlpA的信号序列的部分。

通过琼脂糖凝胶电泳检测约2.3kb的扩增片段。将该PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳回收约2.3kb的片段，然后利用DNA Blunting试剂盒(宝酒造公司制)使其末端钝化，将所得片段插入到特开平9-070291中所描述的pCV7的SmaI位点，以获得pVSV1。插入片段的核苷酸序列按照常规方法确定，证实该融合基因的构建与预期的相同。

用构建的质粒pVSV1转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，筛选生长在包含5mg/l氯霉素的CM2S(每升蒸馏水10g的酵母提取物，10g的胰蛋白胨，5g的蔗糖，5g NaCl，15g的琼脂)琼脂培养基上的菌株。然后，将所选择的带有pVSV1的谷氨酸棒杆菌ATCC13869在包含5mg/l氯霉素的MMTG液体培养基(每升蒸馏水60g的葡萄糖，0.4g的七水硫酸镁，30g的硫酸铵，1g的磷酸二氢钾，0.01g的七水硫酸亚铁，0.01g的五水硫酸锰，450μg的盐酸硫胺，450μg的生物素，0.15g的消旋蛋氨酸，50g的碳酸钙)上30℃下培养30小时。将1ml的培养液离心分离成培养物上清液和菌体。在培养上清液中检出SVP35的活性，按照Laemmli的方法的SDS-PAGE电泳(Nature，227，680-685(1970))结果证明分泌表达了约200mg/L的SVP35。

实施例2：由茂原链轮丝菌IFO13819生产的转谷氨酰胺酶前体(原-MTG)向活性型的转变

以谷氨酸棒杆菌表达的原-MTG(1mg/ml)作为纯化底物，将其与来自茂原链轮丝菌的中性蛋白酶(SVP35，SVP70)或来自灰色链霉菌的中性金属蛋白酶SGMP II以底物∶酶＝200∶1的比率混合，在30℃下反应。0，1，2，4，7，20小时后，分别提取反应混合物，将小份的反应混合物与SDS-PAGE样品缓冲液混合，在95℃加热3分钟，然后按Laemmli的方法(Nature 227，680-685(1970))进行SDS-PAGE。结果如图6所示。由图6可知，通过与上述的蛋白酶反应原-MTG转变为成熟的形式，所产生的MTG即使在长时间反应后也未减少。所提取组分的转谷氨酰胺酶(TG)活性通过Hydroxamate方法测定，充分确认了其活性。此外，按照文献中所述的方法由actinase(科研制药公司制)纯化SGMP II(J.Biocem.，Vol.110，p.339-344，1991)。

然后，将作为对照的丝氨酸蛋白酶SAM-P45白浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseolus)和来自茂原链轮丝菌的中性金属蛋白酶SVP70以酶量逐渐增加的方式加入到原-MTG中，在30℃、pH7.0的条件下反应。1，4，7和24小时后，依次提取反应混合物通过Hydroxamate方法确定TG活性(参见图7)。通过反相层析法测定TG的蛋白质浓缩(参见图8)。结果表明仅底物1/500的SVP即可将原-MTG高效地转变为活性型的MTG。也表明，即使达到1/50底物量的SAM-P45也不能提高转谷氨酰胺酶的活性，不能完全转化成活性型的转谷氨酰胺酶。另一方面，当以1/10底物量添加SAM-P45时，可以观察到向活性型MTG的转换，但同时也观察到MTG-蛋白质量的减少和活性的降低。这样表明SAM-P45引起成熟的MTG的过度分解。

本发明提供一种新的来自放线菌茂原链轮丝菌的蛋白酶及其基因，该蛋白酶选择性地切割转谷氨酰胺酶前体的原结构部分将其活化。本发明的新的蛋白酶可以在棒杆菌型细菌中大量表达，由此，本发明提供了一种高效生产微生物转谷氨酰胺酶的方法。

利用本发明的来自放线菌的中性金属蛋白酶生产活性型的MTG的优势在于，这些酶具有强的选择性切割原-MTG的原结构部分的活性，并且这些酶可以通过棒杆菌型细菌进行表达分泌。

已表明来自放线菌的原-MTG可以在棒杆菌型细菌中高效表达并分泌，通过在棒杆菌型细菌中共表达并分泌原-MTG和中性金属蛋白酶，可以在同一菌体内更高效地生产活性型的MTG这种情况下，只需要表达切割原-MTG的原结构部分所需量的中性金属蛋白酶即可。

参考文献

1.特公平1-50382号公报

2.特开昭64-27471号公报

3.WO 01/23591小册子

4.特表平6-502548号公报

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序列表

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<130>0P04093

<150>JP 2003-61623

<151>2003-03-07

<160>11

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>20

<212>PRT

<213>茂原链轮丝菌

<400>1

Gly Thr Gly Thr Ser Thr Tyr Ser Gly Thr Val Pro Leu Thr Thr Thr

1 5 10 15

Lys Ser Gly Ser

20

<210>2

<211>11

<212>PRT

<213>茂原链轮丝菌

<400>2

Gly Thr Gly Asn Ser Gln Gly Ser Gly Gln Val

1 5 10

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>3

ggctccggca agagcctcta ctcgggcacg 30

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>4

tcagctcacg ttgatcgcgg tccaggaggc 30

<210>5

<211>1614

<212>DNA

<213>茂原链轮丝菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1611)

<400>5

gtg ttg aga ctc acc gcc acc ccc cgc acc acg gcc ctg cgt gcc gcc 48

Val Leu Arg Leu Thr Ala Thr Pro Arg Thr Thr Ala Leu Arg Ala Ala

1 5 10 15

gcc ctc gtc gcc tcc gcg gcc atg gtc gtc gtc ggc gtg cag acg ggc 96

Ala Leu Val Ala Ser Ala Ala Met Val Val Val Gly Val Gln Thr Gly

20 25 30

agc gcg agc gcc tcg ggt gac cgt gac agc gga ggg ctg cca ctg acg 144

Ser Ala Ser Ala Ser Gly Asp Arg Asp Ser Gly Gly Leu Pro Leu Thr

35 40 45

ctc tcc gcg agc cag cgc acc gcc gcc atc cag gag gcc cag agc ggc 192

Leu Ser Ala Ser Gln Arg Thr Ala Ala Ile Gln Glu Ala Gln Ser Gly

50 55 60

gcg tcg gcg acc gcc gcc aag atc ggc ctg agc ggc aag gag aag ctg 240

Ala Ser Ala Thr Ala Ala Lys Ile Gly Leu Ser Gly Lys Glu Lys Leu

65 70 75 80

atc gcc cgc gac gtc gtc aag gac gcc gac ggc acc gtc cac acg cgc 288

Ile Ala Arg Asp Val Val Lys Asp Ala Asp Gly Thr Val His Thr Arg

85 90 95

tac gag cgc acc tac gac ggg ctg ccc gtg ctc ggc ggc gac ctg atc 336

Tyr Glu Arg Thr Tyr Asp Gly Leu Pro Val Leu Gly Gly Asp Leu Ile

100 105 110

gtc cac gag gcg aag gcc gga cgc tcg gtc acc aag gcg aac gac gcg 384

Val His Glu Ala Lys Ala Gly Arg Ser Val Thr Lys Ala Asn Asp Ala

115 120 125

acc ata gcc ctg ccc tcg acc gac gcc tcc ctg gcc ccg gcc gcg gcg 432

Thr Ile Ala Leu Pro Ser Thr Asp Ala Ser Leu Ala Pro Ala Ala Ala

130 135 140

aag aag tcg gcg ctg agc gcc gcc gcc gac cag aag acc gcc aag gcg 480

Lys Lys Ser Ala Leu Ser Ala Ala Ala Asp Gln Lys Thr Ala Lys Ala

145 150 155 160

gac ggc cag gcg ccg cgc aag gtc gtc tgg gcc gcg cag ggc aag ccg 528

Asp Gly Gln Ala Pro Arg Lys Val Val Trp Ala Ala Gln Gly Lys Pro

165 170 175

gtc ctg gcg tac gag acc gtg gtc acg ggc gtg cag aag gac ggc acc 576

Val Leu Ala Tyr Glu Thr Val Val Thr Gly Val Gln Lys Asp Gly Thr

180 185 190

ccg agc gag ctg cac gtg atc acc gac gcg gcg tcc ggc aag aag ctg 624

Pro Ser Glu Leu His Val Ile Thr Asp Ala Ala Ser Gly Lys Lys Leu

195 200 205

tac cag tac gag gcc atc gag acc ggt acc ggc acc agc acc tac agc 672

Tyr Gln Tyr Glu Ala Ile Glu Thr Gly Thr Gly Thr Ser Thr Tyr Ser

210 215 220

ggc acc gtg ccg ctg acc acc acc aag tcg ggc tcc cag tac cag ctc 720

Gly Thr Val Pro Leu Thr Thr Thr Lys Ser Gly Ser Gln Tyr Gln Leu

225 230 235 240

aac gac ggc gcg cgc ggc ggc cac aag acg tac gac ctc aac cag ggg 768

Asn Asp Gly Ala Arg Gly Gly His Lys Thr Tyr Asp Leu Asn Gln Gly

245 250 255

acg tcc ggc acc ggt tcg ctg ttc acc aac agc acc gac acc tgg ggc 816

Thr Ser Gly Thr Gly Ser Leu Phe Thr Asn Ser Thr Asp Thr Trp Gly

260 265 270

ggc ggc cgg cag acg gcc ggt gtc gac gcg cac tac ggc gcg gcc gtg 864

Gly Gly Arg Gln Thr Ala Gly Val Asp Ala His Tyr Gly Ala Ala Val

275 280 285

acc tgg gac ttc tac aag aac gtc ttc ggc cgc aac ggc atc cgc aac 912

Thr Trp Asp Phe Tyr Lys Asn Val Phe Gly Arg Asn Gly Ile Arg Asn

290 295 300

gac ggc aag gcc gcc tac tcc cgc gtc cac tac ggc aac agc tac gtg 960

Asp Gly Lys Ala Ala Tyr Ser Arg Val His Tyr Gly Asn Ser Tyr Val

305 310 315 320

aac gcc ttc tgg tcc gac tcc tgc ttc tgc atg acc tac ggc gac ggc 1008

Asn Ala Phe Trp Ser Asp Ser Cys Phe Cys Met Thr Tyr Gly Asp Gly

325 330 335

cag aac aac aag aac ccg ctc acc gcc ctc gac gtg gcg gcc cac gag 1056

Gln Asn Asn Lys Asn Pro Leu Thr Ala Leu Asp Val Ala Ala His Glu

340 345 350

atg agc cac ggc gtc acc gcc gcc acg gcc aag ctc gtg tac agc ggc 1104

Met Ser His Gly Val Thr Ala Ala Thr Ala Lys Leu Val Tyr Ser Gly

355 360 365

gag tcg ggc ggc ctc aac gag gcg acc agc gac atc ttc ggc acc gcc 1152

Glu Ser Gly Gly Leu Asn Glu Ala Thr Ser Asp Ile Phe Gly Thr Ala

370 375 380

gtc gag ttc tac gcc aac aac aag acc gac gtg ggc gac tac ctc atc 1200

Val Glu Phe Tyr Ala Asn Asn Lys Thr Asp Val Gly Asp Tyr Leu Ile

385 390 395 400

ggc gag aag atc aac atc tac ggc gac ggc aag ccg ctg cgc tac atg 1248

Gly Glu Lys Ile Asn Ile Tyr Gly Asp Gly Lys Pro Leu Arg Tyr Met

405 410 415

gac aag ccg agc aag gac ggc aag tcc aag gac agc tgg tac tcc ggc 1296

Asp Lys Pro Ser Lys Asp Gly Lys Ser Lys Asp Ser Trp Tyr Ser Gly

420 425 430

atc ggc ggg gtg gac gtc cac tac tcg tcc ggc ccg gcc aac cac ttc 1344

Ile Gly Gly Val Asp Val His Tyr Ser Ser Gly Pro Ala Asn His Phe

435 440 445

ttc tac ctg ctc tcc gag ggc agc ggg aag aag acg atc aac ggc gtg 1392

Phe Tyr Leu Leu Ser Glu Gly Ser Gly Lys Lys Thr Ile Asn Gly Val

450 455 460

gac tac gac agc ccg acc gcc gac ggg tcc aag gtc acc ggc atc ggc 1440

Asp Tyr Asp Ser Pro Thr Ala Asp Gly Ser Lys Val Thr Gly Ile Gly

465 470 475 480

cgg gac aag gcc cag aag atc tgg tac aag gcg ctg acc acg cag ttc 1488

Arg Asp Lys Ala Gln Lys Ile Trp Tyr Lys Ala Leu Thr Thr Gln Phe

485 490 495

acc tcg aac acc aac tac gcc aag gcg cgc acc ggc acc ctg aac gcc 1536

Thr Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Ala Arg Thr Gly Thr Leu Asn Ala

500 505 510

gcc gcg tcg ctc tac ggc aac aac agc gcg gag tac aag gcg gtg gcg 1584

Ala Ala Ser Leu Tyr Gly Asn Asn Ser Ala Glu Tyr Lys Ala Val Ala

515 520 525

gcg gcc tgg tcc gcc atc aac gtc aag tag 1614

Ala Ala Trp Ser Ala Ile Asn Val Lys

530 535

<210>6

<211>537

<212>PRT

<213>茂原链轮丝菌

<400>6

Val Leu Arg Leu Thr Ala Thr Pro Arg Thr Thr Ala Leu Arg Ala Ala

1 5 10 15

Ala Leu Val Ala Ser Ala Ala Met Val Val Val Gly Val Gln Thr Gly

20 25 30

Ser Ala Ser Ala Ser Gly Asp Arg Asp Ser Gly Gly Leu Pro Leu Thr

35 40 45

Leu Ser Ala Ser Gln Arg Thr Ala Ala Ile Gln Glu Ala Gln Ser Gly

50 55 60

Ala Ser Ala Thr Ala Ala Lys Ile Gly Leu Ser Gly Lys Glu Lys Leu

65 70 75 80

Ile Ala Arg Asp Val Val Lys Asp Ala Asp Gly Thr Val His Thr Arg

85 90 95

Tyr Glu Arg Thr Tyr Asp Gly Leu Pro Val Leu Gly Gly Asp Leu Ile

100 105 110

Val His Glu Ala Lys Ala Gly Arg Ser Val Thr Lys Ala Asn Asp Ala

115 120 125

Thr Ile Ala Leu Pro Ser Thr Asp Ala Ser Leu Ala Pro Ala Ala Ala

130 135 140

Lys Lys Ser Ala Leu Ser Ala Ala Ala Asp Gln Lys Thr Ala Lys Ala

145 150 155 160

Asp Gly Gln Ala Pro Arg Lys Val Val Trp Ala Ala Gln Gly Lys Pro

165 170 175

Val Leu Ala Tyr Glu Thr Val Val Thr Gly Val Gln Lys Asp Gly Thr

180 185 190

Pro Ser Glu Leu His Val Ile Thr Asp Ala Ala Ser Gly Lys Lys Leu

195 200 205

Tyr Gln Tyr Glu Ala Ile Glu Thr Gly Thr Gly Thr Ser Thr Tyr Ser

210 215 220

Gly Thr Val Pro Leu Thr Thr Thr Lys Ser Gly Ser Gln Tyr Gln Leu

225 230 235 240

Asn Asp Gly Ala Arg Gly Gly His Lys Thr Tyr Asp Leu Asn Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Gly Thr Gly Ser Leu Phe Thr Asn Ser Thr Asp Thr Trp Gly

260 265 270

Gly Gly Arg Gln Thr Ala Gly Val Asp Ala His Tyr Gly Ala Ala Val

275 280 285

Thr Trp Asp Phe Tyr Lys Asn Val Phe Gly Arg Asn Gly Ile Arg Asn

290 295 300

Asp Gly Lys Ala Ala Tyr Ser Arg Val His Tyr Gly Asn Ser Tyr Val

305 310 315 320

Asn Ala Phe Trp Ser Asp Ser Cys Phe Cys Met Thr Tyr Gly Asp Gly

325 330 335

Gln Asn Asn Lys Asn Pro Leu Thr Ala Leu Asp Val Ala Ala His Glu

340 345 350

Met Ser His Gly Val Thr Ala Ala Thr Ala Lys Leu Val Tyr Ser Gly

355 360 365

Glu Ser Gly Gly Leu Asn Glu Ala Thr Ser Asp Ile Phe Gly Thr Ala

370 375 380

Val Glu Phe Tyr Ala Asn Asn Lys Thr Asp Val Gly Asp Tyr Leu Ile

385 390 395 400

Gly Glu Lys Ile Asn Ile Tyr Gly Asp Gly Lys Pro Leu Arg Tyr Met

405 410 415

Asp Lys Pro Ser Lys Asp Gly Lys Ser Lys Asp Ser Trp Tyr Ser Gly

420 425 430

Ile Gly Gly Val Asp Val His Tyr Ser Ser Gly Pro Ala Asn His Phe

435 440 445

Phe Tyr Leu Leu Ser Glu Gly Ser Gly Lys Lys Thr Ile Asn Gly Val

450 455 460

Asp Tyr Asp Ser Pro Thr Ala Asp Gly Ser Lys Val Thr Gly Ile Gly

465 470 475 480

Arg Asp Lys Ala Gln Lys Ile Trp Tyr Lys Ala Leu Thr Thr Gln Phe

485 490 495

Thr Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Ala Arg Thr Gly Thr Leu Asn Ala

500 505 510

Ala Ala Ser Leu Tyr Gly Asn Asn Ser Ala Glu Tyr Lys Ala Val Ala

515 520 525

Ala Ala Trp Ser Ala Ile Asn Val Lys

530 535

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>7

tcgggtgacc gtgacagcgg agggc 25

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>8

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<210>9

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>9

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<210>10

<211>44

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>10

ctccgctgtc acggtcaccc gatgccgttg ccacaggtgc ggcc 44

<210>11

<211>9

<212>PRT

<213>茂原链轮丝菌

<400>11

Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Ser

1 5

Claims

1.一种由来自微生物的原转谷氨酰胺酶生产来自微生物的活性型的转谷氨酰胺酶的方法，其特征在于，培养已导入了编码来自放线菌的中性金属蛋白酶的基因的微生物，由此生产上述来自放线菌的中性金属蛋白酶，用上述微生物生产的来自放线菌的中性金属蛋白酶切割微生物原转谷氨酰胺酶的原结构部分。

2.如权利要求1所述的方法，其中导入了编码来自放线菌的中性金属蛋白酶基因的微生物是棒杆菌型细菌。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述来自放线菌的中性金属蛋白酶具有：

1)由SDS-PAGE测定的分子量为35,000；

2)其具有如SEQ ID NO：1所示的N末端氨基酸序列。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述来自放线菌的中性金属蛋白酶还具有如下性质：

1)最适pH为pH6.0-8.0；

2)在pH4-pH10稳定；

3)最适温度在40℃-45℃的范围；

4)50℃以下的条件下稳定；

5)它被金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸、1，10-二氮杂菲和磷酸阿米酮，以及来自放线菌的链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂，即SSI所抑制。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述来自放线菌的中性金属蛋白酶具有：

1)由SDS-PAGE测定的分子量为71,000；

2)其具有如SEQ ID NO：2所示的N末端氨基酸序列。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述来自放线菌的中性金属蛋白酶还具有如下性质：

1)在pH为6.0-8.0的范围具有最适活性；

2)在pH5-pH10稳定；

3)最适温度为50℃-55℃的范围；和

4)它被金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸、1，10-二氮杂菲和磷酸阿米酮，SH-还原剂二硫苏糖醇以及来自放线菌的链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂，即SSI所抑制。