CN104487586B - 基于沉淀的蛋白质制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供以融合蛋白质的形式、高回收率地制造目标蛋白质的方法。本发明涉及一种融合蛋白质的制造方法,所述融合蛋白质是具有自组装能力的蛋白质与目标蛋白质形成的融合蛋白质,所述制造方法包括下述(1)~(4)的步骤:(1)制备包含融合蛋白质的溶液的步骤;(2)将步骤(1)中得到的溶液的pH调节至使回收率达到10%以上的pH的步骤,其中,回收率通过下述计算公式计算:回收率(%)=[步骤(4)中得到的溶液中融合蛋白质的量/{步骤(4)中得到的溶液中的融合蛋白质的量+步骤(3)的固体分离后的溶液中融合蛋白质的量}]×100;(3)从步骤(2)中得到的溶液分离固体的步骤;以及(4)将步骤(3)中分离出的固体溶解在溶液中的步骤,所述溶液具有12以下且比步骤(2)中得到的溶液的pH高0.1以上的pH。
Description
技术领域
本发明涉及基于沉淀的蛋白质制造方法。更具体地,本发明涉及通过对包含具有自组装能力的蛋白质与目标蛋白质形成的融合蛋白质的溶液的pH进行调节从而制造融合蛋白质及目标蛋白质的方法。
背景技术
具有多种多样功能的蛋白质被广泛用于医药品、产业用酶这样的商业用途乃至解明各种生命现象的研究用途,是提高生活、科学进步不可缺少的物质。作为用于廉价、大量且重现性好地制造所述各种蛋白的方法,开发了基于重组生物的蛋白质生产技术和蛋白质纯化技术。
基于重组生物的蛋白质生产技术利用了动物细胞(非专利文献1)、微生物(非专利文献1),动物细胞使用了CHO细胞(非专利文献2)、微生物使用了大肠杆菌、酵母(非专利文献3)等。例如,使用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)(以下简称为C.glutamicum)作为微生物的蛋白分泌生产系统(专利文献1)。
作为对重组生物生产的蛋白质进行纯化的主要方法有利用蛋白本身的性质的方法、对蛋白质附加纯化用序列并利用添加序列的性质的方法。
作为利用蛋白本身的性质的方法,可以列举出色谱法及固液分离法。
色谱法中使用具有各种性质的色谱用基体材料。色谱法中利用蛋白与色谱用基体材料的相互作用、色谱基体材料所具有的分子筛效果(非专利文献4)。作为蛋白与色谱用基体材料的相互作用,可以列举出静电相互作用、氢键、疏水性相互作用、特异性相互作用等(非专利文献4以及5)。
固液分离是通过改变溶液条件使处于可溶化状态的蛋白不溶化(即固体化),然后通过离心分离等简便方法获得固体部分,并使其再次形成可溶化状态,从而进行分离的方法。作为使蛋白不溶化的方法的具体例子,可以列举出:等电点沉淀(非专利文献6)、盐析(非专利文献7)、利用有机溶剂进行沉淀(非专利文献8)、利用水溶性高分子进行沉淀(非专利文献9)等。
等电点沉淀利用了蛋白质在其等电点溶解度最低的性质。盐析、利用有机溶剂进行的沉淀以及利用水溶性高分子进行的沉淀是利用了蛋白的溶解度分别因高浓度的盐、有机溶剂和水溶性高分子的存在而降低的性质。作为其他不溶化方法,可以列举出蛋白质凝集(非专利文献10以及非专利文献11)。蛋白凝集在能够选择出使要纯化的蛋白处于可溶化状态、而要纯化的蛋白以外的蛋白处于发生凝集的条件的情况下,是特别有效的方法。
作为对蛋白质附加纯化用序列并利用该添加序列的性质的方法,可以列举出利用添加序列自身性质的方法、利用添加序列与添加序列以外的物质发生的相互作用的方法。
作为利用添加序列本身的性质的方法,有利用因温度变化而引起相转移、并发生不溶化的弹性蛋白的方法(非专利文献12),利用因pH变化而形成可溶性汇合体的MISTIC的方法(专利文献2)等。
在利用添加序列与添加序列以外的物质发生的相互作用的方法中,多将添加序列以外的物质设置在色谱用基体材料上(非专利文献13)。作为添加序列与添加序列以外的物质发生的相互作用,可以列举出静电相互作用、氢键、疏水性相互作用、特异性相互作用等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2005/103278号
专利文献2:欧洲专利申请公开第2423217号
非专利文献
非专利文献1:Demain AL,Vaishnav P.,Production of recombinant proteinsby microbes and higher organisms.Biotechnol Adv.2009 May-Jun;27(3):297-306.Epub 2009 Jan 31.Review.
非专利文献2:Omasa T,Onitsuka M,Kim WD.,Cell engineering andcultivation of chinese hamster ovary(CHO)cells.Curr Pharm Biotechnol.2010Apr;11(3):233-40.Review.
非专利文献3:Mattanovich D,Branduardi P,Dato L,Gasser B,Sauer M,PorroD.,Recombinant protein production in yeasts.Methods Mol Biol.2012;824:329-58.Review.
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非专利文献13:Smyth DR,Mrozkiewicz MK,McGrath WJ,Listwan P,Kobe B.,Crystal structures of fusion proteins with large-affinity tags.ProteinSci.2003 Jul;12(7):1313-22.
发明内容
发明要解决的问题
就利用蛋白质本身的性质的方法而言,与目标蛋白质的性质相应的纯化方法是个别构建的,因此,一般是不可能将某蛋白的纯化方法直接应用于其他蛋白的纯化方法。
另一方面,就给蛋白附加纯化用序列并利用添加序列的性质的方法而言,如果利用相同的添加序列,大多可以对多种蛋白的纯化采用相同或类似的纯化方法,可以说是通用性高的方法。
但是,即使在利用添加序列的性质的方法中也会存在如下问题:例如,利用弹性蛋白的方法不能适用于易因热而失活的目标蛋白质;利用MISTIC的方法难以对产生的汇合体进行分离等。
解决问题的方法
本发明人为解决上述问题进行了深入研究,结果意外地发现了下述性质:在使用具有自组装能力的蛋白作为添加序列的情况下,该添加序列与目标蛋白质形成的融合蛋白质在溶液中pH依赖性地在可溶化状态与不溶化状态之间可逆地变化。本发明正是基于上述认识而完成的。
即,本发明涉及下述的[1]~[33]。
[1].一种融合蛋白质的制造方法,其是具有自组装能力的蛋白与目标蛋白质形成的融合蛋白质的制造方法,所述制造方法包括下述(1)~(4)的步骤:
(1)制备包含融合蛋白质的溶液的步骤;
(2)将步骤(1)中得到的溶液的pH调节至使回收率达到10%以上的pH的步骤,其中,回收率通过下述计算公式计算:
回收率(%)=[步骤(4)中得到的溶液中融合蛋白质的量/{步骤(4)中得到的溶液中融合蛋白质的量+步骤(3)的固体分离后的溶液中的融合蛋白质的量}]×100;
(3)从步骤(2)中得到的溶液分离固体的步骤;以及
(4)将步骤(3)中分离出的固体溶解在溶液中的步骤,所述溶液具有12以下且比步骤(2)中得到的溶液的pH高0.1以上的pH。
[2].根据[1]所述的方法,其中,具有自组装能力的蛋白质是细胞表层蛋白质。
[3].根据[2]所述的方法,其中,细胞表层蛋白质为CspB成熟蛋白质或其一部分。
[4].根据[3]所述的方法,其中,CspB成熟蛋白质或其一部分为下述(a)或(b):
(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列构成的蛋白质;
(b)与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有95%以上的同源性蛋白质。
[5].根据[3]所述的方法,其中,其中,CspB成熟蛋白质的一部分是由从CspB成熟蛋白质的N末端起的6~250个氨基酸残基构成的序列。
[6].根据[5]所述的方法,其中,其中,CspB成熟蛋白质的一部分是由从CspB成熟蛋白质的N末端起的6、17、50或250个氨基酸残基构成的序列。
[7].根据[1]~[6]中任一项所述的方法,其中,目标蛋白质的氨基酸残基数为10~1000个。
[8].根据[1]~[7]中任一项所述的方法,其中,具有自组装能力的蛋白质与目标蛋白质之间还包含用于酶切或化学切割的氨基酸序列。
[9].根据[8]所述的方法,其中,具有自组装能力的蛋白质与目标蛋白质之间存在的用于酶切的氨基酸序列是ProTEV蛋白酶识别序列、胰蛋白酶的识别序列或Factor Xa蛋白酶的识别序列。
[10].根据[1]~[9]中任一项所述的方法,其中,其中,步骤(2)的pH为9以下。
[11].根据[1]~[10]中任一项所述的方法,其中,步骤(2)的pH调节使用选自硫酸、盐酸、乙酸、磷酸以及三氟乙酸中的酸进行。
[12].根据[1]~[11]中任一项所述的方法,其中,步骤(3)的分离利用离心分离和/或膜过滤进行。
[13].根据[1]~[12]中任一项所述的方法,其中,步骤(1)中得到的溶液是具有表达融合蛋白质的基因构建物的棒状杆菌型细菌的培养液的上清。
[14].根据[1]~[13]中任一项所述的方法,其中,步骤(2)中指定的回收率为30%以上。
[15].一种目标蛋白质的制造方法,其包括下述(1)~(5)的步骤:
(1)制备包含具有自组装能力的蛋白质与目标蛋白质形成的融合蛋白质的溶液的步骤,该融合蛋白质中,在具有自组装能力的蛋白质与目标蛋白质之间包含用于酶切或化学切割的氨基酸序列;
(2)将步骤(1)中得到的溶液的pH调节至使回收率为10%以上的pH的步骤,其中,回收率通过下述计算公式计算:
回收率(%)=[步骤(4)中得到的溶液中融合蛋白质的量/{步骤(4)中得到的溶液中融合蛋白质的量+步骤(3)的固体分离后的溶液中融合蛋白质的量}]×100;
(3)从步骤(2)中得到的溶液分离固体的步骤;以及
(4)将步骤(3)中分离出的固体溶解在溶液中的步骤,所述溶液具有12以下且比步骤(2)中得到的溶液的pH高0.1以上的pH;
(5)与步骤(4)同时、或在步骤(4)中途、或在步骤(4)之后,位于具有自组装能力的蛋白质与目标蛋白质之间的氨基酸序列部位对融合蛋白质进行酶切或化学切割的处理的步骤。
[16].根据[15]所述的方法,其中,对所述融合蛋白质进行切割处理的步骤是进行酶切处理的步骤。
[17].根据[15]所述的方法,其中,具有自组装能力的蛋白是细胞表层蛋白质。
[18].根据[17]所述的方法,其中,细胞表层蛋白质是CspB成熟蛋白质或其一部分。
[19].根据[18]所述的方法,其中,CspB成熟蛋白质或其一部分是下述(a)或(b):
(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列构成的蛋白质
(b)与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有95%以上的同源性蛋白质。
[20].根据[18]所述的方法,其中,CspB成熟蛋白质的一部分是由从CspB成熟蛋白质的N末端起的6~250个氨基酸残基构成的序列。
[21].根据[20]所述的方法,其中,CspB成熟蛋白质的一部分是由从CspB成熟蛋白质的N末端起的6、17、50或250个氨基酸残基中的任意残基构成的序列。
[22].根据[15]~[21]中任一项所述的方法,其中,其中,目标蛋白质的氨基酸残基数为10~1000个。
[23].根据[15]~[22]中任一项所述的方法,其中,目标蛋白质是特立帕肽。
[24].根据[15]~[22]中任一项所述的方法,其中,目标蛋白质是SEQ ID NO:93所示的比伐卢定中间体。
[25].根据[15]~[24]中任一项所述的方法,其中,具有自组装能力的蛋白与目标蛋白质之间存在的用于酶切的氨基酸序列是ProTEV蛋白酶识别序列、胰蛋白酶的识别序列或Factor Xa蛋白酶的识别序列。
[26].根据[15]~[25]中任一项所述的方法,其中,步骤(2)的pH为9以下。
[27].根据[15]~[26]中任一项所述的方法,其中,步骤(2)的pH调节使用选自硫酸、盐酸、乙酸、磷酸以及三氟乙酸中的酸来进行。
[28].根据[15]~[27]中任一项所述的方法,其中,步骤(3)的分离利用离心分离和/或膜过滤来进行。
[29].根据[15]~[28]中任一项所述的方法,其中,步骤(1)中得到的溶液是具有表达融合蛋白质的基因构建物的棒状杆菌型细菌培养液的上清。
[30].根据[15]~[29]中任一项所述的方法,其包括在步骤(4)和/或步骤(5)之后进行(6)对融合蛋白质或目标蛋白质进行纯化的步骤。
[31].根据[30]所述的方法,其中,步骤(6)利用柱色谱来进行。
[32].根据[15]~[31]中任一项所述的方法,其中,步骤(2)中指定的回收率为30%以上。
[33].一种产生融合蛋白质的固体、并将其分离的方法,其包括将包含具有自组装能力的蛋白与目标蛋白质形成的融合蛋白质的溶液的pH调节至9以下,从而产生固体,然后,对该固体进行分离。
发明效果
如后述的实施例所示,通过本发明,能够从包含该融合蛋白质的溶液中,简便且高回收率地得到包含目标蛋白质的融合蛋白质或目标蛋白质。
附图说明
【图1-A】图1-A显示实施例1中“完成pH调节的培养液”的pH与融合蛋白质CspB50TEV-特立帕肽(Proinsulin)(简称50-Teri)的回收率之间的关系。
【图1-B】图1-B显示实施例1中“完成pH调节的培养液”的pH、“完成pH调节的培养液上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中的融合蛋白质50-Teri的条带部分的照片、以及回收率。
【图1-2A】图1-2A显示实施例1-2中“完成pH调节的培养液”的pH与融合蛋白质50-Teri的回收率之间的关系。
【图1-2B】图1-2B显示实施例1-2中“完成pH调节的培养液”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图、对融合蛋白质50-Teri的条带部分进行抽提的照片。
【图1-2C】图1-2C显示对实施例1-2中调节至pH4.9的“完成pH调节的培养液的上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”进行反相HPLC而得到的色谱。
【图1-2D】图1-2D显示对由实施例1-2中调节至pH4.9的“完成pH调节的培养液”得到的“沉淀溶解溶液”、“酶切溶液”以及“标准品特立帕肽”进行反相HPLC而得到的色谱。
【图1-2E】图1-2E显示对由实施例1-2中调节至pH4.9的“完成pH调节的培养液”纯化得到的“纯化物质”以及“标准品特立帕肽”进行质谱分析而得到的质谱图。
【图2-A】图2-A显示实施例2中“完成pH调节的培养液”的pH与融合蛋白质CspB50Lys-比伐卢定18(Bivalirudin18)(简称50-Biva18)的回收率之间的关系。
【图2-B】图2-B显示实施例2中“完成pH调节的培养液”的pH、“完成pH调节的培养液的上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中的融合蛋白质50-Biva18的条带部分的照片、以及回收率。
【图2-C】图2-C显示对实施例2中调节至pH2.9的“完成pH调节的培养液上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”进行反相HPLC而得到的色谱。
【图2-D】图2-D显示对实施例2中由调节至pH2.9的“完成pH调节的培养液”得到的“沉淀溶解溶液”以及“酶切溶液”进行反相HPLC而得到的色谱。
【图2-E】图2-E显示根据Biva18的氨基酸序列计算的质量(上左)以及对该计算值进行图示而得到的理论质谱(上右),以及,对由实施例2中调节至pH2.9的“完成pH调节的培养液”纯化的得到“纯化物质”进行质谱分析而得到的质谱图(下)。
【图2-F】图2-F显示将由实施例2中调节至pH2.9的“完成pH调节的培养液”得到的“酶切溶液”进行强阴离子交换树脂色谱而得到的色谱。
【图2-G】图2-G显示对由实施例2中调节至pH2.9的“完成pH调节的培养液”得到的“酶切溶液”进行强阴离子交换树脂色谱而得到的洗脱液(95%B附近)进行反相HPLC而得到的色谱。
【图3-A】图3-A显示实施例3中“完成pH调节的培养液”的pH与融合蛋白质CspB50TEV-特立帕肽(Proinsulin)(简称50-PIns)的回收率之间的关系。
【图3-B】图3-B显示实施例3中“完成pH调节的培养液”的pH、“完成pH调节的培养液的上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中的融合蛋白质50-Pins的条带部分的照片、以及回收率。
【图4-A】图4-A显示比较例1中“完成pH调节的培养液”的pH与胰岛素原(简称PIns)的回收率之间的关系显示。
【图4-B】图4-B显示比较例1中“完成pH调节的培养液”的pH、“完成pH调节的培养液的上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中的Pins的条带部分的照片、以及回收率。
【图5-A】图5-A显示实施例4中“完成pH调节的培养液”的pH与融合蛋白质CspB250TEV-特立帕肽(Proinsulin)(简称250-PIns)的回收率之间的关系。
【图5-B】图5-B显示实施例4中“完成pH调节的培养液”的pH、“完成pH调节的培养液的上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中的融合蛋白质250-Pins的条带部分的照片、以及回收率。
【图6-A】图6-A显示实施例5中“完成pH调节的培养液”的pH与融合蛋白质CspB17TEV-特立帕肽(Proinsulin)(简称17-PIns)的回收率之间的关系。
【图6-B】图6-B显示实施例5中“完成pH调节的培养液”的pH、“完成pH调节的培养液的上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中的融合蛋白质17-Pins的条带部分的照片、以及回收率。
【图7-A】图7-A显示实施例6中“完成pH调节的培养液”的pH与融合蛋白质CspB6TEV-特立帕肽(Proinsulin)(简称6-PIns)的回收率之间的关系。
【图7-B】图7-B显示实施例6中“完成pH调节的培养液”的pH、“完成pH调节的培养液的上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中的融合蛋白质6-Pins的条带部分的照片、以及回收率。
【图8-A】图8-A显示实施例7中“完成pH调节的培养液”的pH与融合蛋白质CspB50TEV-特立帕肽(简称50-Teri)的回收率之间的关系显示。
【图8-B】图8-B显示实施例7中“完成pH调节的培养液”的pH、“完成pH调节的培养液的上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中的融合蛋白质50-Teri的条带部分的照片、以及回收率。
【图9-A】图9-A显示实施例8中“完成pH调节的培养液”的pH与融合蛋白质CspB50TEV-特立帕肽(Proinsulin)(简称50-Teri)的回收率之间的关系。
【图9-B】图9-B显示实施例8中“完成pH调节的培养液”的pH、“完成pH调节的培养液的上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中的融合蛋白质50-Teri的条带部分的照片、以及回收率。
【图10-A】图10-A显示对实施例9中“除去菌体的培养液”(相当于“步骤(1)中获得的溶液”)以及沉淀溶解溶液(相当于“步骤(4)中获得的溶液”)进行反相HPLC(测定波长:280nm)而得到的色谱。
【图10-B】图10-B显示对实施例9中“除去菌体的培养液”(相当于“步骤(1)中得到的溶液”)以及沉淀溶解溶液(相当于“步骤(4)中得到的溶液”)进行反相HPLC(测定波长:220nm)而得到的色谱。
发明的具体实施方式
本发明的制造方法是在蛋白质上附加用于进行纯化的序列(以下,也称作“添加序列”)、并在利用该添加序列性质的方法中属于利用添加序列本身的性质的方法。本发明中,使用具有自组装能力的蛋白质序列作为添加序列。
本发明涉及一种融合蛋白质的制造方法,其是具有自组装能力的蛋白质与目标蛋白质形成的融合蛋白质的制造方法,其包括下述(1)~(4)的步骤:
(1)制备包含融合蛋白质的溶液的步骤;
(2)将步骤(1)中得到的溶液的pH调节至使回收率达到10%以上的pH的步骤,其中,回收率通过下述计算公式来计算:
回收率(%)=[步骤(4)中得到的溶液中的融合蛋白质的量/{步骤(4)中得到的溶液中的融合蛋白质的量+步骤(3)的固体分离后的溶液中的融合蛋白质的量}]×100;
(3)从步骤(2)中得到的溶液分离固体的步骤;以及、
(4)将步骤(3)中分离出的固体溶解在溶液中的步骤,所述溶液具有12以下且比步骤(2)中得到的溶液的pH高0.1以上的pH。
在本发明的制造方法的步骤(1)中,制备包含具有自组装能力的蛋白质与目标蛋白质形成的融合蛋白质的溶液。
“融合蛋白质”包含“具有自组装能力的蛋白”及“目标蛋白质”。“具有自组装能力的蛋白质”可以在“目标蛋白质的”上游(N末端侧),也可以在下游(C末端侧)。而且,如后所述,融合蛋白质中,在“具有自组装能力的蛋白质”的氨基酸序列与“目标蛋白质”的氨基酸序列之间可以包含“用于切割的氨基酸序列”。
“自组装能力”是指:在适当的环境条件下蛋白质自身发生集合,形成生理上有意义的某种高级结构的能力。
“具有自组装能力的蛋白”只要保持自组装能力即可,可以是完整长序列,也可以是部分序列。
“具有自组装能力的蛋白”只要保持自组装能力即可,对其大小(氨基酸残基数)没有特殊限制,氨基酸残基数优选5~1000个氨基酸、更优选5~700个氨基酸、更优选5~500个氨基酸。
“具有自组装能力的蛋白”只要保持自组装能力即可,可以是天然蛋白质的变体。例如,可以是在天然蛋白的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸而得到的蛋白质。所述“一个或多个”,虽然因氨基酸残基在蛋白的立体结构中的位置或氨基酸残基的种类而异,但优选1~20个、更优选1~10个、进一步优选1~5个。
氨基酸的取代、缺失、插入或添加可以是能够维持正常蛋白的自组装能力的保守突变。典型的保守突变是保守取代。保守取代是指在下述氨基酸之间进行相互取代的突变:当取代部位为芳族氨基酸时,是指在Phe、Trp、Tyr之间相互取代的突变;当取代部位为疏水性氨基酸时,是指在Leu、Ile、Val之间相互取代的突变;当取代部位为极性氨基酸时,是指在Gln、Asn之间相互取代的突变;当取代部位为碱性氨基酸时,是指在Lys、Arg、His之间相互取代的突变;当取代部位为酸性氨基酸时,是指在Asp、Glu之间相互取代的突变;当取代部位为带有羟基的氨基酸时,是指在Ser、Thr之间相互取代的突变。作为可视作保守取代的取代,具体地可以列举:从Ala取代为Ser或Thr,从Arg取代为Gln、His或Lys,从Asn取代为Glu、Gln、Lys、His或Asp,从Asp取代为Asn、Glu或Gln,从Cys取代为Ser或Ala,从Gln取代为Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg,从Glu取代为Gly、Asn、Gln、Lys或Asp,从Gly取代为Pro,从His取代为Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr,从Ile取代为Leu、Met、Val或Phe,从Leu取代为Ile、Met、Val或Phe,从Lys取代为Asn、Glu、Gln、His或Arg,从Met取代为Ile、Leu、Val或Phe,从Phe取代为Trp、Tyr、Met、Ile或Leu,从Ser取代为Thr或Ala,从Thr取代为Ser或Ala,从Trp取代为Phe或Tyr,从Tyr取代为His、Phe或Trp,以及从Val取代为Met、Ile或Leu。此外,氨基酸的取代、缺失、插入、或添加还包括通过基于编码该蛋白质的基因所来源的微生物的个体差异、种间差异等情形等而天然产生的变体所产生的氨基酸的取代、缺失、插入、或添加。
天然蛋白的变体只要该变体具有自组装能力即可,相对于天然蛋白质的氨基酸序列整体,可以具有95%以上的同源性,更优选97%以上,特别优选99%以上。而且,在本说明书中,“同源性”(homology)是指“同一性”(identity)。
此外,编码“具有自组装能力的蛋白质”的基因只要所编码的蛋白具有自组装能力即可,所述基因可以是与由公知的基因序列制备得到的探针,例如与上述碱基序列的整体或一部分互补的序列在严谨条件下进行杂交的DNA。“严谨条件”,是指形成所谓特异性杂交体,但不形成非特异性杂交体的条件。举例说明为下述条件:在具有高同源性的DNA之间、例如具有80%以上同源性的DNA之间发生杂交,优选具有90%以上,更优选具有95%以上,进一步优选具有97%以上,特别优选99%以上,而同源性低于上述的DNA之间则为不发生杂交的条件;或者在与常规DNA印迹杂交(SouthernHybridization)的洗涤条件60℃、1×SSC、0.1%SDS相当的盐浓度及温度下,优选在60℃、0.1×SSC、0.1%SDS下,更优选在68℃、0.1×SSC、0.1%SDS下,洗涤1次更优选2~3次的条件。
用于上述杂交的探针可以是基因的互补序列的一部分。这样的探针可以通过PCR制备,其中PCR以基于公知的基因序列制备的寡聚核苷酸为引物,以包含这些碱基序列的DNA片段为模板。例如,当使用300bp左右长度的DNA片段作为探针时,杂交的洗涤条件可以是例如50℃、2×SSC、0.1%SDS。
编码“具有自组装能力的蛋白质”的基因可以直接使用天然型的基因,也可以对其进行改造,使得所述编码“具有自组装能力的蛋白质”的基因具有与所使用的宿主的密码子的使用频率相应的最适密码子。
作为“具有自组装能力的蛋白质”的具体例子,可以列举出细胞表层蛋白质、病毒外壳蛋白质、各种马达蛋白质等。
细胞表层蛋白是细菌中常见的称作S-layer(S层)的细胞表层结构的结构蛋白质,已知其在生理条件下自组装形成层状的结构(Ilk N,Egelseer EM,Sleytr UB.S-layerfusion proteins-construction principles and applications.Curr OpinBiotechnol.2011 Dec;22(6):824-31.Epub 2011 Jun 21.)。
作为细胞表层蛋白的具体例子,可以列举出:作为源自棒状杆菌型细菌的谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的PS1以及CspB(PS2)(日本特表平6-502548号公报)、源自产氨棒杆菌的SlpA(CspA)(特开平10-108675号公报)等。
这其中,优选CspB(PS2)(499个氨基酸残基)。另外,CspB与PS2意义相同。
CspB是在谷氨酸棒杆菌中发现的细胞表层蛋白(Peyret JL,Bayan N,Joliff G,Gulik-Krzywicki T,Mathieu L,Schechter E,Leblon G.,Characterization of thecspB gene encoding PS2,an ordered surface-layer protein in Corynebacteriumglutamicum.Mol Microbiol.1993 Jul;9(1):97-109.)。
关于CspB,在各种谷氨酸棒杆菌中发现当使含表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)的溶液作用于菌体时,自组装的层状结构被破坏,从而CspB被提取到SDS溶液中(HansmeierN,Bartels FW,Ros R,Anselmetti D,Tauch A,Puhler A,Kalinowski J.Classificationof hyper-variable Corynebacterium glutamicum surface-layer proteins bysequence analyses and atomic force microscopy.J Biotechnol.2004 Aug 26;112(1-2):177-93.)。
作为CspB的具体例子,可以列举出例如,谷氨酸棒杆菌ATCC13869的CspB。谷氨酸棒杆菌ATCC13869的CspB基因的碱基序列示于SEQ ID NO:1,CspB蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2。SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中,1~30位的氨基酸残基相当于信号肽,31~499位的氨基酸残基相当于CspB成熟蛋白质(以下也称作“成熟CspB”或“CspB成熟蛋白质”)。除去了信号肽部分30个氨基酸残基的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的CspB成熟蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:3。
SEQ ID NO:3
Gln Glu Thr Asn Pro Thr Phe Asn Ile Asn Asn Gly Phe Asn Asp Ala AspGly Ser Thr Ile Gln Pro Val Glu Pro Val Asn His Thr Glu Glu Thr Leu Arg AspLeu Thr Asp Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Glu Glu Phe Gln Tyr Gly Asn Val Glu GluIle Val Glu Ala Tyr Leu Gln Val Gln Ala Ser Ala Asp Gly Phe Asp Pro Ser GluGln Ala Ala Tyr Glu Ala Phe Glu Ala Ala Arg Val Arg Ala Ser Gln Glu Leu AlaAla Ser Ala Glu Thr Ile Thr Lys Thr Arg Glu Ser Val Ala Tyr Ala Leu Lys AlaAsp Arg Glu Ala Thr Ala Ala Phe Glu Ala Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Gln Val SerVal Ile Asn Asp Leu Ile Ala Asp Ala Asn Ala Lys Asn Lys Thr Asp Phe Ala GluIle Glu Leu Tyr Asp Val Leu Tyr Thr Asp Ala Asp Ile Ser Gly Asp Ala Pro LeuLeu Ala Pro Ala Tyr Lys Glu Leu Lys Asp Leu Gln Ala Glu Val Asp Ala Asp PheGlu Trp Leu Gly Glu Phe Ala Ile Asp Asn Asn Glu Asp Asn Tyr Val Ile Arg ThrHis Ile Pro Ala Val Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ile Asp Ser Leu Val Asp Thr ValGlu Pro Leu Arg Ala Asp Ala Ile Ala Lys Asn Ile Glu Ala Gln Lys Ser Asp ValLeu Val Pro Gln Leu Phe Leu Glu Arg Ala Thr Ala Gln Arg Asp Thr Leu Arg ValVal Glu Ala Ile Phe Ser Thr Ser Ala Arg Tyr Val Glu Leu Tyr Glu Asn Val GluAsn Val Asn Val Glu Asn Lys Thr Leu Arg Gln His Tyr Ser Ser Leu Ile Pro AsnLeu Phe Ile Ala Ala Val Gly Asn Ile Asn Glu Leu Asn Asn Ala Asp Gln Ala AlaArg Glu Leu Phe Leu Asp Trp Asp Thr Asp Leu Thr Thr Asn Asp Glu Asp Glu AlaTyr Tyr Gln Ala Lys Leu Asp Phe Ala Ile Glu Thr Tyr Ala Lys Ile Leu Ile AsnGly Glu Val Trp Gln Glu Pro Leu Ala Tyr Val Gln Asn Leu Asp Ala Gly Ala ArgGln Glu Ala Ala Asp Arg Glu Ala Glu Arg Ala Ala Asp Ala Ala Tyr Arg Ala GluGln Leu Arg Ile Ala Gln Glu Ala Ala Asp Ala Gln Lys Ala Leu Ala Glu Ala LeuAla Asn Ala Gly Asn Asn Asp Asn Gly Gly Asp Asn Ser Ser Asp Asp Lys Gly ThrGly Ser Ser Asp Ile Gly Thr Trp Gly Pro Phe Ala Ala Ile Ala Ala Ile Ile AlaAla Ile Ala Ala Ile Phe Pro Phe Leu Ser Gly Ile Val Lys Phe
本发明中所使用的CspB优选CspB成熟蛋白质、更优选CspB成熟蛋白质的一部分。特别是,从融合蛋白质的回收率方面出发,优选由从CspB成熟蛋白质的N末端起的6~250个氨基酸残基构成的序列。“由N末端起的6~250氨基酸残基构成的序列”是指:从N末端的第1位的氨基酸残基开始到第6~250位(该N末端起第6~250位)的氨基酸残基为止的氨基酸序列。
例如,在CspB成熟蛋白质为由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列构成的蛋白质的情况下,“由N末端起的6~250氨基酸残基构成的序列”是指:从SEQ ID NO:3的第1位(N末端)的氨基酸残基开始到第6~250位(该N末端起第6~250位)的氨基酸残基为止的氨基酸序列。
更优选地是由CspB成熟蛋白质的N末端起的6、17、50或250个氨基酸残基中的任意残基构成的序列。
而且,氨基酸序列中的“X位(X例如为6、17、50或250)”是指:从该氨基酸序列的N末端起到第X位止,N末端的氨基酸残基为第1位的氨基酸残基。即,上述各氨基酸残基的位置表示相对位置,因氨基酸的缺失、插入、添加等,其位置有时前后变化。
例如,在CspB成熟蛋白质为由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列构成的蛋白质的情况下,“N末端起的50位氨基酸残基”是指:相当于SEQ ID NO:3中的第50位的氨基酸残基,在比第50位更接近N末端的1个氨基酸残基发生缺失的情况下,将从N末端起到第49位止的氨基酸残基作为“N末端起的50位的氨基酸残基”。此外,在比50位更接近N末端插入1个氨基酸残基的情况下,将从N末端起到第51位止的氨基酸残基作为“N末端起的50位的氨基酸残基”。
因棒状杆菌型细菌所属的种或菌株,cspB基因的核酸序列有时存在差异。因此,cspB基因只要所编码的蛋白具有自组装能力即可,可以是上述核酸序列的变体。cspB基因的变体包括该基因的同源物。cspB基因的同源物,例如可以通过使用上述的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的cspB基因(SEQ ID NO:1)作为查询序列(query sequence)的BLAST检索、FASTA检索容易从公开数据库中获得,此外,cspB基因的同源物也可以通过以棒状杆菌型细菌的染色体作为模板、使用基于这些公知基因序列制作的寡聚核苷酸作为引物的PCR来获取。
“目标蛋白质”没有特殊限制,包含源自微生物、植物、动物或病毒的所有天然蛋白、人工设计的氨基酸序列的蛋白质。
此外,“目标蛋白质”在与产生该蛋白的宿主的关系方面,可以是同种蛋白质,也可以是异种蛋白质。
目标蛋白质可以是单体蛋白,也可以是多聚体(multimer)蛋白。
多聚体蛋白是指能够以由2个或2个以上的亚基构成的多聚体的形式存在的蛋白。在多聚体中,各亚基可以通过二硫键等共价键连接,也可以通过氢键、疏水性相互作用等非共价键连接,还可以通过上述连接的组合进行连接。多聚体可以是由单一种类的亚基构成的同型多聚体,也可以是由2种或2种以上的亚基构成的异源多聚体。而且,在多聚体蛋白为异源多聚体的情况下,构成多聚体的亚基中,可以至少1个亚基是异种蛋白。即,可以是全部亚基源自异种,也可以是仅一部分的亚基源自异种。
目标蛋白质可以是天然分泌性的蛋白,也可以是天然非分泌性的蛋白,优选天然分泌性的蛋白。
通过本发明制造的目标蛋白质可以仅为1种,也可以为2种以上。此外,目标蛋白质为异源多聚体的情况下,可以仅生产1种亚基,也可以生产2种类以上的亚基。
目标蛋白质只要在使用的宿主中能够表达即可,对其大小(氨基酸残基数)没有特殊限制,氨基酸残基数优选10~1000、更优选10~500、进一步优选10~300。
目标蛋白质可以是天然蛋白质的变体。上述的关于“具有自组装能力的蛋白质”的变体的记载也适用于目标蛋白质和编码它的基因。
此外,编码目标蛋白质的基因根据需要可以变换成适于宿主的密码子使用频率的最适密码子。
作为目标蛋白质,可以列举出例如,生理活性蛋白质、受体蛋白质、作为疫苗使用的抗原蛋白质、酶。
作为生理活性蛋白,可以列举出例如,生长因子(增殖因子)、激素、细胞因子、抗体关联分子。
作为生长因子(增殖因子),具体例如表皮生长因子(Epidermal growth factor;EGF)可以列举出,胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1;IGF-1)、转化生长因子(Transforming growth factor;TGF)、神经生长因子(Nerve growth factor;NGF)、脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor;BDNF)、血管内皮细胞增殖因子(Vesicular endothelial growth factor;VEGF)、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte-colony stimulating factor;G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor;GM-CSF)、血小板来源生长因子(Platelet-derived growth factor;PDGF)、促红细胞生成素(Erythropoietin;EPO)、血小板生成素(Thrombopoietin;TPO)、酸性成纤维细胞增殖因子(acidic fibroblast growth factor;aFGF或FGF1)、碱性成纤维细胞增殖因子(basic fibroblast growth factor;bFGF或FGF2)、角质细胞增殖因子(keratinocyto growth factor;KGF-1或FGF7,KGF-2或FGF10)、肝细胞增殖因子(Hepatocyte growth factor;HGF)。
作为激素,具体可以列举出例如,胰岛素、胰高血糖素、生长激素抑制素(somatostatin)、人生长激素(human growth hormone;hGH)、甲状旁腺素(parathyroidhormone;PTH)、降血钙素(calcitonin)。
作为细胞因子,具体可以列举出例如,白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子(TumorNecrosis Factor;TNF)。
而且,生长因子(增殖因子)、激素、及细胞因子之间也可以不进行严谨地区分。例如,生理活性蛋白质可以属于选自生长因子(增殖因子)、激素、和细胞因子中任何一个组,也可以属于选自它们中的多个组。
此外,生理活性蛋白可以是蛋白质全长,也可以是其一部分。作为蛋白质的一部分,可以列举出例如,具有生理活性的部分。作为具有生理活性的部分,具体可以列举出例如,由甲状旁腺素(parathyroid hormone;PTH)成熟体的N末端34个氨基酸残基构成的特立帕肽(特立帕肽)。
而且,目标蛋白质可以是生理活性蛋白的一部分,但可以不具有生理活性。该情况下,在获得目标蛋白质后,通过进行必要的修饰(例如,氨基酸序列的添加),能够使其成为生理活性蛋白。作为具体例子可以列举出,生理活性蛋白比伐卢定(Bivalirudin)(20个氨基酸)的一部分(18个氨基酸残基)的肽(Biva18)(SEQ ID NO:93:Arg Pro Gly Gly GlyGly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu)。
作为抗体关联分子,具体可以列举出例如,完整抗体、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fc、由重链(H链)和轻链(L链)构成的二聚体、Fc融合蛋白质、重链(H链)、轻链(L链)。
对于受体蛋白质没有特殊限制,可以是例如,生理活性蛋白、其他生理活性物质的受体蛋白质。作为其他生理活性物质,可以列举出例如,多巴胺等神经传导物质。此外,受体蛋白可以是对应配基未知的孤儿受体。
可作为疫苗使用的抗原蛋白质能够激起免疫应答即可,没有特殊限制,可以根据假想的免疫应答的对象进行适宜选择。
作为酶,可以列举出例如,转谷氨酰胺酶、蛋白酶、内肽酶、外肽酶、氨基肽酶、羧基肽酶、胶原酶、几丁质酶等。
目标蛋白质可以是添加了前体结构部分的蛋白(前蛋白)。在目标蛋白质为前蛋白的情况下,通过切割其前体结构部分可以成为成熟蛋白。
前体结构部分的切割可以与本发明的制造方法中的步骤(4)同时、在步骤(4)中途、或在步骤(4)之后进行。
“与步骤(4)同时”是指:在步骤(4)使用的“具有12以下且比步骤(2)中得到的溶液的pH高0.1以上的pH的溶液”中预先添加用于前体结构部分的切割的试剂(例如,后述的蛋白酶),使用该溶液同时进行步骤(4)及前体结构部分的切割。
“在步骤(4)中途”是指:不在步骤(4)使用的“具有12以下且比步骤(2)中得到的溶液的pH高0.1以上的pH的溶液”中添加用于前体结构部分的切割的试剂而开始步骤(4),而在步骤(4)的中途添加所述试剂,进行前体结构部分的切割。
“在步骤(4)之后”是指:在步骤(4)结束后,使用用于前体结构部分的切割试剂,进行前体结构部分的切割。
前体结构部分的切割可以利用例如蛋白酶来进行。在使用蛋白酶的情况下,从最终得到的蛋白的活性的观点出发,通常优选前蛋白在与天然蛋白基本相同的位置进行切割,更优选在与天然蛋白完全相同的位置进行切割而得到与天然相同的成熟蛋白。因此,一般地,最优选在产生与天然产生的成熟蛋白相同蛋白质的位置上用于对前蛋白进行切割的特异性蛋白酶。
除了proTEVprotease(Promega公司制造)这样的可商业性地购入的产品之外,蛋白酶还包括从微生物的培养液、例如由放线菌的培养液等得到的那些蛋白酶。那样的蛋白酶可以以未纯化的状态使用,也可以根据需要纯化到适当纯度后使用。
具有自组装能力的蛋白与目标蛋白质的融合蛋白质可以通过将该融合蛋白质的表达用基因构建物在宿主中表达来获得。
作为“宿主”只要能够表达融合蛋白质,就没有特殊限制,可以使用所有种类的细菌、细菌以外的微生物、昆虫细胞、动物细胞等。
在使用在菌体内蓄积融合蛋白质的宿主的情况下,为了制备步骤(1)的溶液,进行破碎菌体的处理。能够将融合蛋白质分泌至细胞外的宿主无需进行相关破碎处理,故优选。
作为细菌,可以使用例如,棒状杆菌型细菌、大肠杆菌等。
作为细菌以外的微生物,可以使用例如酵母等。
作为昆虫细胞,可以使用家蚕等,作为动物细胞可以使用CHO细胞等。
这其中,优选棒状杆菌型细菌。
“棒状杆菌型细菌”是指需氧性戈兰氏阳性杆菌。作为具体例子,可以列举出棒杆菌属细菌、短杆菌属细菌、和微杆菌属细菌等。而且,棒状杆菌型细菌还包括目前被分类在短杆菌属、现在被整合到棒杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991))。
作为使用棒状杆菌型细菌的优点,可以列举出:与目前用于分泌生产目标蛋白质的丝状真菌、酵母、芽孢杆菌属(Bacillus)细菌等相比,本来分泌至菌体外的杂质蛋白极少,可以期待分泌生产融合蛋白质时的纯化步骤的简略化、省略化;此外,在含有糖、氨和无机盐等的简单培养基中即可良好地生长繁育,在培养基费用、培养方法、培养生产率方面优越;等等。
作为棒状杆菌型细菌,具体可以列举出如下述的菌种。
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)
醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)
解烷棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)
美棒杆菌(Corynebacterium callunae)
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)
栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)
热产氨棒杆菌(有效棒杆菌)(Corynebacterium thermoaminogenes(Corynebacterium efficiens))
力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)
叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum)
黄短杆菌(Brevibacterium flavum)
未成熟短杆菌(Brevibacterium immariophilum)
乳糖发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)(Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium Glutamicum))
玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)
解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)
硫殖短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)
产氨短杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)
白色杆菌(Brevibacterium album)
蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)
嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)
作为棒状杆菌型细菌,具体可以列举出如下菌株。
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870(Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870)
醋谷棒杆菌ATCC15806(Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806)
解烷棒杆菌ATCC21511(Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511)
美棒杆菌ATCC15991(Corynebacterium callunae ATCC15991)
谷氨酸棒杆菌ATCC13020,ATCC13032,ATCC13060(CorynebacteriumglutamicumATCC13020,ATCC13032,ATCC13060)
百合花棒杆菌ATCC15990(Corynebacterium lilium ATCC15990)
栖糖蜜棒杆菌ATCC17965(Corynebacterium melassecola ATCC17965)
嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539(Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539)
力士棒杆菌ATCC13868(Corynebacterium herculis ATCC13868)
叉开短杆菌ATCC14020(Brevibacterium divaricatum ATCC14020)
黄色短杆菌ATCC13826,ATCC14067,FERM BP-2205(Brevibacterium flavumATCC13826,ATCC14067,FERM BP-2205)
未成熟短杆菌ATCC14068(Brevibacterium immariophilum ATCC14068)
乳糖发酵短杆菌ATCC13869(Brevibacterium lactofermentum ATCC13869)
玫瑰色短杆菌ATCC13825(Brevibacterium roseum ATCC13825)
解糖短杆菌ATCC14066(Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066)
硫殖短杆菌ATCC19240(Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240)
产氨短杆菌ATCC6871,ATCC6872(Corynebacterium ammoniagenes ATCC6871,ATCC6872)
白色棒杆菌ATCC15111(Brevibacterium album ATCC15111)
蜡状短杆菌ATCC15112(Brevibacterium cerinum ATCC15112)
嗜氨微杆菌ATCC15354(Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354)
从野生株谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC13869作为链霉素(Sm)抗性突变株分离得到的谷氨酸棒杆菌FERM BP-734与其亲本株(野生株)相比,推测参与蛋白的分泌的功能基因中存在突变,异种蛋白的分泌生产能力极高,在最适培养条件下的蓄积量为约2~3倍,适合作为宿主菌。
将上述的棒状杆菌型细菌作为亲本株,利用突变法、基因重组法选择蛋白的分泌生产能力提高的株,可以用作宿主。例如,可以在用紫外线照射或N-甲基-N'-亚硝基胍等化学突变剂进行处理后,选择蛋白的分泌生产能力提高的株。
而且,如果将进行了改造的菌株用作宿主,所述改造使得所述菌株不产生细胞表层蛋白,则容易对分泌至培养基中或菌体表层的异种蛋白质进行纯化,故特别优选。所述改造可以通过采用突变法或基因重组法在染色体上的细胞表层蛋白的编码区域或其表达调节区域导入突变来进行。作为进行了改造而使得菌株不生产细胞表层蛋白的棒状杆菌型细菌,可以列举出谷氨酸棒杆菌AJ12036(FERM BP-734)的细胞表层蛋白CspB(PS2)缺损株谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)YDK010株(WO2004/029254)。
在将具有自组装能力的蛋白质配置在目标蛋白质的上游的情况下,“融合蛋白质的表达用基因构建物”包括:在宿主中发挥功能的启动子序列、连接于该启动子序列下游的对在宿主中发挥功能的信号肽进行编码的核酸序列、连接于该编码信号肽的核酸序列下游的对具有自组装能力的蛋白质进行编码的核酸序列及连接于该编码具有自组装能力的蛋白质的核酸序列下游的对目标蛋白质进行编码的核酸序列。此外,在将具有自组装能力的蛋白质配置在目标蛋白质下游的情况下,“融合蛋白质的表达用基因构建物”包括:在宿主中发挥功能的启动子序列、连接于该启动子序列下游的对在宿主中发挥功能的信号肽进行编码的核酸序列、连接于该编码信号肽的核酸序列下游的对目标蛋白质进行编码的核酸序列及连接于该编码目标蛋白质的核酸序列下游的对具有自组装能力的蛋白质进行编码的核酸序列。而且,在使融合蛋白质蓄积于菌体内的情况下,不需要编码信号肽的核酸序列。
编码信号肽的核酸序列可以连接在启动子序列的下游,并使得信号肽的表达受该启动子的调控。
在将具有自组装能力的蛋白配置在目标蛋白质的上游的情况下,编码具有自组装能力的蛋白质的核酸序列可以连接在编码信号肽的核酸序列的下游,使得该具有自组装能力的蛋白与该信号肽连续地表达即可。而且,编码目标蛋白质的核酸序列可以连接在编码具有自组装能力的蛋白的核酸序列的下游,使得该目标蛋白质与该具有自组装能力的蛋白连续地表达即可。
在将具有自组装能力的蛋白配置在目标蛋白质的下游的情况下,编码目标蛋白质的核酸序列可以连接在编码信号肽的核酸序列的下游,并使得该目标蛋白质与该信号肽连续地表达即可。而且,编码具有自组装能力的蛋白的核酸序列可以连接在编码目标蛋白质的核酸序列的下游,使得该具有自组装能力的蛋白与该目标蛋白质连续地表达即可。
为了使融合蛋白质基因在宿主中表达基因构建物可以具有有效的调控序列(操纵子、终止子等),并位于它们能够发挥功能的合适位置上。
“启动子”只要能够在所使用的宿主中发挥功能,就没有特殊限制,可以是宿主来源的启动子,也可以是异种来源的启动子。
例如,在使用棒状杆菌型细菌作为宿主的情况下,启动子是在棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子。
“在棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子”是指在棒状杆菌型细菌中具有启动子活性的启动子。
作为棒状杆菌型细菌来源的启动子,可以列举出例如,细胞表层蛋白质的PS1、CspB(也称PS2)、SlpA(也称CspA)基因的启动子、或各种氨基酸生物合成系基因的启动子。
作为各种氨基酸生物合成系基因的启动子,具体可以列举出例如,谷氨酸生物合成系的谷氨酸脱氢酶基因、谷氨酰胺合成系的谷氨酰胺合成酶基因、赖氨酸生物合成系的天冬氨酸激酶基因、苏氨酸生物合成系的高丝氨酸脱氢酶基因、异亮氨酸及缬氨酸生物合成系的乙酰羟酸合成酶基因、亮氨酸生物合成系的2-异丙基苹果酸合成酶基因、脯氨酸和精氨酸生物合成系的谷氨酸激酶基因、组氨酸生物合成系的磷酸核糖基-ATP焦磷酸化酶基因、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸生物合成系的脱氧阿拉伯庚酮糖磷酸(DAHP)合成酶基因、肌苷酸和鸟苷酸这样的核酸生物合成系中的磷酸核糖基焦磷酸酯(PRPP)酰胺转移酶基因、肌苷酸脱氢酶基因、和鸟苷酸合成酶基因的启动子。
作为棒状杆菌型细菌的异种的启动子,具体可以列举出例如,tac启动子、lac启动子、trp启动子、及araBAD启动子等E.coli来源的启动子。这其中,优选tac启动子等强力启动子,也优选araBAD启动子等诱导型启动子。
通过使用各种报告基因,可以获得通常的启动子的高活性型并加以利用。例如,通过使启动子区域内的-35、-10区域靠近共有序列,能够提高启动子的活性(国际公开第00/18935号)。启动子的强度评价方法以及强力启动子的例子记载于Goldstein等的论文(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))等中。而且,已知核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔区域、特别是起始密码子临近上游的序列(5'-UTR)中多个核苷酸的取代或插入或缺失对mRNA的稳定性和翻译效率有非常大的影响,可以对其进行修饰。
在本发明中,优选宿主以分泌性蛋白质(secretory protein)的形式产生融合蛋白质。
已知分泌性蛋白质一般以前蛋白(也称前肽)或前蛋白原(也称前肽原)的形式被翻译,然后通过加工而成为成熟蛋白(mature protein)。具体而言,分泌性蛋白一般以前蛋白或前蛋白原的形式被翻译后,作为前体部分的信号肽被蛋白酶(一般称为信号肽酶)切割而转化为成熟蛋白或前蛋白被分泌,前蛋白原进一步被蛋白酶切割除去前体部分而成为成熟蛋白。
因此,本发明中为了利用宿主进行融合蛋白质的分泌生产而利用信号肽。需要说明的是,在本说明书中,有时将分泌性蛋白的前蛋白和前蛋白原统称为“分泌性蛋白前体”。
“信号肽”(以下也称为“信号序列”)是指:存在于分泌性蛋白质前体的N末端,且通常在天然成熟蛋白中不存在的氨基酸序列。
对本发明中使用的信号肽没有特殊限制,只要是在宿主中发挥功能的信号肽即可,可以是宿主来源的信号肽,也可以是异种来源的信号肽。
例如,在使用棒状杆菌型细菌作为宿主的情况下,信号肽是在棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽。
“在棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽”是指:连接于融合蛋白质的N末端时,使棒状杆菌型细菌能够分泌融合蛋白质的肽。
作为在棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽,优选宿主棒状杆菌型细菌的分泌性蛋白质的信号肽,更优选棒状杆菌型细菌的细胞表层蛋白质的信号肽。作为棒状杆菌型细菌的细胞表层蛋白质,可以列举出源自谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的PS1以及CspB(PS2)(日本特表平6-502548号公报)、以及源自C.ammoniagenes的SlpA(CspA)(日本特开平10-108675号公报)。PS1的信号肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO:4,CspB(PS2)的信号肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO:5,SlpA(CspA)的信号肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO:6。此外,根据美国专利第4965197号说明书,提到源自棒状杆菌型细菌的DNase也有信号肽,这样的信号肽也可以在本发明中利用。
信号肽具有跨越生物种的一定的共有序列上的特征,但并不是说某生物种中显示分泌功能的信号肽一定能够在其他生物种中发挥分泌功能。因而,在利用异种来源的信号肽的情况下,可以适宜地选择在使用宿主中发挥功能的那些信号肽。某种信号肽是否在使用的宿主中发挥功能,可以例如通过使目标蛋白质与该信号肽融合并表达、并考察该蛋白是否分泌来确认。
一般在翻译产物被分泌至菌体外时,信号序列被信号肽酶切割。信号肽酶可以利用宿主本来具有的那些信号肽酶,也可以将编码能够在所使用的宿主中发挥功能的信号肽酶的基因导入宿主中。
编码信号肽的基因可以直接使用天然型的,也可以根据所使用的宿主的密码子使用频率对所述基因进行改造,使得所述基因具有最适密码子。
在分泌表达融合蛋白质的基因构建物中,在将具有自组装能力的蛋白质配置在目标蛋白质的上游的情况下,在编码信号肽的核酸序列与编码目标蛋白质的核酸序列之间插入编码具有自组装能力的蛋白质的核酸序列(添加序列)。在将具有自组装能力的蛋白质配置在目标蛋白质下游的情况下,编码具有自组装能力的蛋白质的核酸序列(添加序列)插入编码目标蛋白质的核酸序列的下游。
需要说明的是,编码添加序列的核酸序列与编码目标蛋白质的核酸序列之间,还可以包含编码用于酶切割或化学切割的氨基酸序列的核酸序列。通过将用于酶的或化学的切割的氨基酸序列插入融合蛋白质,可以对表达后的融合蛋白质进行酶切割或化学切割,从而得到目标蛋白质。
切割可以按照常规方法采用酶法或化学法进行。
切割步骤可以与步骤(4)同时进行、或在步骤(4)中途进行、或在步骤(4)之后进行。
“与步骤(4)同时”是指:在步骤(4)使用的“具有12以下且比步骤(2)中得到的溶液的pH高0.1以上的pH的溶液”中预先添加切割试剂(例如,后述的用于酶切的蛋白酶),使用该溶液同时进行步骤(4)与切割步骤。
“在步骤(4)期间中途”是指:不在步骤(4)使用的“具有12以下且比步骤(2)中得到的溶液的pH高0.1以上的pH的溶液”中添加切割试剂而开始步骤(4),在步骤(4)中途添加所述试剂来进行切割步骤。
“在步骤(4)之后”是指:步骤(4)结束后,使用切割试剂来进行切割步骤。
切割步骤后,通过采用该技术领域公知惯用的方法,可以容易地从具有自组装能力的蛋白分离目标蛋白质。此时,可以与步骤(2)同样地进行,对经过切割步骤后的溶液的pH进行调节,仅使具有自组装能力的蛋白质沉淀,与步骤(3)同样地仅将具有自组装能力的蛋白质以固体的形式分离。
对用于酶切的氨基酸序列没有特殊限制,只要是被水解肽键的酶识别并切割的序列即可,可以根据目标蛋白质的氨基酸序列适宜选择可使用的序列。编码用于酶切的氨基酸序列的核酸序列基于该氨基酸序列适宜设定即可,此外,可以例如根据宿主的密码子使用频率使用最适密码子。
用于酶切的氨基酸序列优选是底物特异性高的蛋白酶的识别序列。作为这样的氨基酸序列,具体可以列举出例如,Factor Xa蛋白酶的识别序列、proTEV蛋白酶的识别序列、胰蛋白酶的识别序列。Factor Xa蛋白酶识别蛋白中的Ile-Glu-Gly-Arg(=IEGR)(SEQ IDNO:7)的氨基酸序列,proTEV蛋白酶识别蛋白中的Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln(=ENLYFQ)(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列,特异性地对各序列的C末端进行切割。胰蛋白酶对蛋白中的Lys和Arg进行识别,特异性对Lys和Arg的C末端进行切割。
对用于化学切割的氨基酸序列没有特殊限制,只要采用能够在化学反应条件下被切割的序列即可,可以根据目标蛋白质的氨基酸序列适宜选择能够使用的序列。编码用于化学切割的氨基酸序列的核酸序列可以基于该氨基酸序列适宜设定,此外,例如可以根据宿主的密码子使用频率来使用最适密码子。
用于化学切割的氨基酸序列优选发生高特异性切割的序列。作为这样的氨基酸序列的切割部位,具体地可以列举出例如Met。若利用溴化氰分解法,则在Met的C末端侧发生切割。
“融合蛋白质的表达用基因构建物”可以采用该技术领域公知惯用的方法来构建。
对将基因构建物导入宿主的方法没有特殊限制,可以使用一般使用的方法,例如原生质体法(Gene,39,281-286(1985))、电穿孔法(Bio/Technology,7,1067-1070)(1989))等。
在宿主为细菌的情况下,基因构建物可以存在于像质粒那样地在染色体外自主增殖的载体上,也可以整合在染色体上。
例如,在将基因构建物用载体导入作为宿主的棒状杆菌型细菌的情况下,对载体没有特殊限制,只要载体能够在棒状杆菌型细菌中自主复制即可,例如,源自细菌质粒的载体、源自酵母质粒的载体、源自噬菌体的载体、粘粒、噬菌粒等。作为载体,优选源自棒状杆菌型细菌的质粒。作为在棒状杆菌型细菌中可自主复制的载体,具体地可以列举出,pHM1519(Agric,Biol.Chem.,48,2901-2903(1984));pAM330(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984));对其进行改造而得到的具有药剂抗性基因的质粒;日本特开平3-210184号公报所述的质粒pCRY30;日本特开平2-72876号公报以及美国专利5185262号说明书公报所述的质粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE以及pCRY3KX;日本特开平1-191686号公报所述的质粒pCRY2和pCRY3;特开昭58-192900号公报所述的pAJ655、pAJ611以及pAJ1844;日本特开昭57-134500号公报所述的pCG1;特开昭58-35197号公报所述的pCG2;特开昭57-183799号公报所述的pCG4和pCG11等。
基因构建物的导入也可以利用人工转座子等。在使用转座子的情况下,基因构建物通过同源重组或其自身的转移能力被导入到染色体上。此外,作为利用同源重组的导入法,可以列举出例如,使用直链状DNA、含温度敏感型复制起点的质粒、可接合转导的质粒、在宿主内不具有发挥功能的复制起点的自杀载体等的方法。而且,在融合蛋白质基因被导入染色体上的情况下,只要染色体上构成基因构建物即可,选自该基因构建物中所包含的启动子序列、编码信号肽的核酸序列、以及编码添加序列的核酸序列中的1个以上的序列可以原本就存在于宿主的染色体上。例如,可以通过直接利用宿主的染色体上本来存在的启动子序列以及连接于该启动子序列的下游的编码信号肽的核酸序列,用编码添加序列与目标蛋白质形成的融合蛋白质的核酸序列仅对连接于编码该信号肽的核酸序列下游的基因进行取代,能够在染色体上构成基因构建物。
在制造2种以上的目标蛋白质的情况下,用于表达各蛋白质的基因构建物可以保持在宿主中,使得各蛋白的表达能够实现。例如,用于表达各蛋白质的基因构建物可以全部保持在单一表达载体上,也可以全部保持在染色体上。此外,各蛋白的表达用基因构建物可以分别保持在多个表达载体上,也可以分别保持在单一或多个表达载体上以及染色体上。而且,2种以上的目标蛋白质包括异源多聚体蛋白。
通过对导入了基因构建物的宿主进行培养、使之表达融合蛋白质、并分泌至菌体外或在菌体内蓄积,能够制备含融合蛋白质的培养液。
宿主可以按照通常采用的方法和条件进行培养。例如,在使用细菌作为宿主的情况下,可以用含有碳源、氮源以及无机离子的通常的培养基进行培养。而且,为了获得高增殖,视需要还可添加维生素、氨基酸等有机微量营养素。
作为碳源,可以使用葡萄糖和蔗糖这样的碳水化合物、乙酸这样的有机酸、醇类、或其他。作为氮源,可以使用氨气、氨水、铵盐、或其他。作为无机离子,视需要可以适宜使用钙离子、镁离子、磷酸离子、钾离子、铁离子等。
培养可以采用适合所使用的宿主的条件进行。例如,在棒状杆菌型细菌的的情况下,可以在pH5.0~8.5、15℃~37℃的适合范围内在需氧条件下进行,培养1~7天左右。此外,可以采用棒状杆菌型细菌的L-氨基酸生产中的培养条件,还可以采用使用了Sec系、Tat系的信号肽的蛋白的制造方法中记载的条件(参照WO01/23591、WO2005/103278)。
在为了进行融合蛋白质的表达而使用诱导型启动子的情况下,也可以在培养基中添加启动子诱导剂来进行培养。
可以如下对生产了融合蛋白质的事实进行确认:将含培养上清(融合蛋白质在菌体内蓄积的情况下也包括细胞破碎物)的级分作为试样,进行SDS-PAGE,从分离出的蛋白条带的分子量。此外,可以将含培养上清(也包括所述的细胞破碎物)的级分作为试样,通过使用抗体的蛋白质印迹来确认(Molecular cloning(Cold spring Harbor LaboratoryPress,Cold spring Harbor (USA),2001))。此外,也可以通过使用蛋白质测序仪对产生蛋白的N末端氨基酸序列进行测定来确认。而且,也可以通过使用质谱仪产生蛋白质的质量进行测定来确认。
此外,根据情况,还可使用反相HPLC对融合蛋白质(甚至目标蛋白质)进行浓度测定、纯度测定。
在融合蛋白质被分泌至宿主菌体外的情况下,“包含融合蛋白质的溶液”可以是前述含融合蛋白质的培养液本身(含菌体的培养液),也可以是从所述培养液分离出宿主菌体后的培养上清(除菌培养液)。即,“包含融合蛋白质的溶液”(以下也称“步骤(1)中得到的溶液”)不仅包括从含融合蛋白质的培养液除去菌体后得到的培养上清,也包括含融合蛋白质的培养液本身。本发明中优选使用培养上清。
从培养液分离菌体可以采用该技术领域中公知惯用的方法例如,离心分离、膜过滤等来实施。菌体分离步骤从提高融合蛋白质(或目标蛋白质)的回收率以及纯度的观点出发,通常在步骤(1)中实施。但是,根据其他事项而优选在其他步骤中进行的情况下,可以在步骤(1)以外的任意步骤中进行。
融合蛋白质在宿主菌体内以可溶性蛋白的形式蓄积的情况下,通过对菌体进行破碎、并从破碎物分离出固形物,可以制备“步骤(1)中得到的溶液”。菌体的破碎可以采用该技术领域的公知惯用的方法、例如匀浆法来实施。
融合蛋白质在宿主菌体内以不溶性蛋白的形式蓄积的情况下,通过对菌体进行破碎、从破碎物收集固形物、对该固形物采用公知惯用的方法例如使用尿素、嘎胍等蛋白质变性剂、SDS等表面活性剂进行可溶化处理后分离出固形物,可以得到“步骤(1)中得到的溶液”。菌体的破碎可以采用该技术领域公知惯用的方法、例如匀浆法来实施。
在本发明的制造方法的步骤(2)中,调节步骤(1)中得到的溶液的pH至按下述计算公式计算的回收率为10%以上的pH:
回收率(%)=[步骤(4)中得到的溶液中的融合蛋白质的量/{步骤(4)中得到的溶液中的融合蛋白质的量+步骤(3)的固体分离后的溶液中的融合蛋白质的量}]×100。
需要说明的是,以下说明中使用的涉及“沉淀”的术语(例如“沉淀物”、“沉淀溶解溶液”等)如无特殊说明,是以融合蛋白质作为对象的。在沉淀以宿主菌体作为对象的情况下,将做出说明。
此外,涉及融合蛋白质或目标蛋白质的分析的描述针对的是除菌后的样品。
回收率的计算公式中的“步骤(4)中得到的溶液中的融合蛋白质的量”以及“步骤(3)中固体分离后的溶液中融合蛋白质的量”,可以采用该技术领域公知惯用的蛋白定量方法,例如还原SDS-PAGE、反相HPLC等来测定。
利用还原SDS-PAGE进行融合蛋白质的定量可以采用该技术领域公知惯用的方法,例如实施例1记载的以还原SDS-PAGE后的融合蛋白质的条带浓度作为指标来进行。该情况下,回收率的计算公式如下所述。
回收率(%)=[步骤(4)中得到的溶液中的融合蛋白质的条带浓度/{步骤(4)中得到的溶液中的融合蛋白质的条带浓度+步骤(3)的固体分离后溶液中的融合蛋白质的条带浓度}]×100
利用反相HPLC进行融合蛋白质的定量,可以采用该技术领域公知惯用的方法,例如实施例1-2记载的基于反相HPLC所获得色谱的融合蛋白质的峰面积的定量方法来进行。
回收率可能因目标蛋白质的种类、用途、必要的量等而发生改变,可以是10%以上、优选20%以上、更优选30%以上。
需要说明的是,对用于实现10%以上回收率的pH上限值进行确定,可以如后述实施例1所示,改变实施步骤(2)的pH而进行多个试验(各试验均包含步骤(1)~(4)),从而计算出各试验的回收率,通过制作计算出的回收率与pH之间的关系图,能够容易地进行确定。
根据上述计算公式确定的pH值是步骤(2)中可使用的pH(使回收率为10%以上的pH)的上限值。因此,步骤(2)可以在上述确定的pH上限值以下的pH下实施。此外,对pH的下限值没有特殊限制,不引起融合蛋白质的不可逆酸变性即可,可以在考虑pH调节操作的成本及希望的回收率的基础上决定。
步骤(2)中采用的pH值可能因目标蛋白质的种类、用途、必要的量等而变动,优选9以下。例如-0.5~9,优选1.5~9。
对用于pH调节的物质没有特殊限制,可以使用任何种类的酸、碱。作为酸,可以列举出例如硫酸、盐酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸(TFA)等。这其中,优选硫酸、盐酸以及乙酸。酸可以单独使用1种,也可以组合使用2种以上。作为碱基,可以列举出例如,氢氧化钠、氨、三羟基甲基氨基甲烷(Tris)等。碱基可以单独使用1种,也可以组合使用2种以上。
在步骤(2)中,对pH进行调节后,溶液中产生固体。固体主要由融合蛋白质构成。该融合蛋白质实质上未发生酸变性。为了促进固体生成,优选对pH调节后的溶液进行搅拌或静置。
而且,在步骤(1)中得到的溶液的pH已达到通过步骤(2)的pH调节操作应该实现的值的情况下,可以不进行步骤(2)的pH调节操作,而对步骤(1)中得到的溶液进行适宜搅拌或静置,然后用于步骤(3)。
即,本发明的融合蛋白质的制造方法变为包含下述(A)~(C)的步骤:
(A)制备包含融合蛋白质的溶液的步骤,该步骤中该溶液的pH为使按照下述计算公式计算的回收率达到10%以上的pH:
回收率(%)=[步骤(C)中得到的溶液中融合蛋白质的量/{步骤(C)中得到的溶液中融合蛋白质的量+步骤(B)的固体分离后的溶液中融合蛋白质的量}]×100;
(B)从步骤(A)中得到的溶液分离固体的步骤;以及
(C)将步骤(B)分离出的固体溶解在具有12以下、且比步骤(A)中得到的溶液的pH高0.1以上的pH的溶液中的步骤。
需要说明的是,关于上述的步骤(1)和(2)的说明适用于步骤(A)。此外,关于后述的步骤(3)以及(4)的说明适用于步骤(B)以及(C)。
在本发明的制造方法的步骤(3)中,从步骤(2)中得到的溶液分离固体。
步骤(2)中得到的溶液中残存有源自融合蛋白质以外的各种菌体的成分(例如色素、脂质、杂质蛋白)、源自培养基的成分(例如色素、无机盐类),通过步骤(3)可以将这些除去,结果是能够简便地提高融合蛋白质的纯度。
分离可以采用该技术领域公知惯用的方法来实施。例如,可以使用离心分离、膜过滤等。也可以对多个方法进行组合(例如离心分离与膜过滤的组合)来实施。
有些情况下,步骤(3)中得到的固体会附着有未除尽的液体(杂质)。如果向该附着有杂质的固体添加具有能够在步骤(2)中使用的pH的上限值(即,使融合蛋白质的回收率为10%的pH)以下的pH的溶液,则得到固体与溶液(含液体(杂质))的混合物(悬浊液)。通过从该悬浊液再次分离固体,能够得到杂质的附着量减少的固体。步骤(3)之后可以对该操作进行一次或多次。
本发明的制造方法的步骤(4)中,将步骤(3)中分离出的固体溶解在具有12以下且比步骤(2)中得到的溶液的pH高0.1以上的pH的溶液中。
步骤(4)使用的溶液的更优选pH比使作为对象的融合蛋白质的回收率为10%的pH(即,步骤(2)中能够使用的pH的上限值)高0.1以上的pH、更优选高0.2以上的pH、进一步优选高1以上的pH。若采用这些优选的pH,则融合蛋白质能够充分地溶解在该溶液中。
该优选的pH可以根据具有自组装能力的蛋白的种类与目标蛋白质的种类而变动,例如,在具有自组装能力的蛋白为CspB成熟蛋白或其一部分的情况下,是优选12以下、更优选11以下、进一步与优选10以下。
对用于溶解步骤(3)中分离出的固体的溶液没有特殊限制,只要具有上述的pH即可,可以使用任何种类的物质。作为具体例子,可以列举出缓冲液。缓冲液优选不易发生pH的变化。作为缓冲液,可以列举出使用Tris、HEPES、磷酸钠、柠檬酸等的缓冲液,优选Tris。
通过实施步骤(4),可以以溶液形式得到融合蛋白质。通过对该步骤中使用的溶液的量进行增减,可以任意调节融合蛋白质的浓度。此外,步骤(4)使用的溶液的构成可以考虑下面实施的步骤来确定。因此,通过进行步骤(2)至步骤(4),能够简便地提高融合蛋白质的纯度、和/或实施融合蛋白质溶液的浓缩、和/或更换溶剂。
而且,有些情况下,当步骤(2)的固体产生时,融合蛋白质以外的物质会作为杂质卷入固体中,并夹带至步骤(4)得到的溶液中。这样的的情况下,通过将步骤(4)中得到的溶液作为步骤(1)中得到的溶液进行操作,再次实施步骤(2)至步骤(4),能够减少该杂质的量。在步骤(4)之后实施的该操作可进行一次也可进行多次。
步骤(4)中得到的溶液中溶解有融合蛋白质。
通过从融合蛋白质对具有自组装能力的蛋白进行切割,可以得到目标蛋白质。
切割可以按照该技术领域公知惯用的方法来实施。作为切割方法,可以列举出例如,酶切、化学切割等。从切割的特异性优异这点出发,优选酶切。切割步骤可以针对步骤(4)中得到的包含融合蛋白质的溶液进行,也可以在从步骤(4)中得到的溶液分离出融合蛋白质后进行。在对步骤(4)中得到的包含融合蛋白质的溶液进行的情况下,切割步骤可以与步骤(4)同时、在步骤(4)中途、或在步骤(4)之后进行。
酶切可以通过预先使具有自组装能力的蛋白与目标蛋白质之间包含底物特异性高的蛋白酶的识别序列(例如,所述Factor Xa蛋白酶的识别序列、proTEV蛋白酶的识别序列、胰蛋白酶识别序列)适宜实施。
步骤(4)中得到的融合蛋白质或通过融合蛋白质的切割而得到的目标蛋白质可以按照该技术领域公知惯用的方法从溶液中纯化。
例如,通过对含融合蛋白质或目标蛋白质的溶液采用柱色谱(例如,高效液相色谱(HPLC)、反相色谱(例如反相HPLC)、中高压液相色谱、离子交换柱色谱、疏水色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱)、醇沉淀法、超滤膜法等已知的适合方法、或这些方法的组合,能够对融合蛋白质或目标蛋白质进行纯化。
而且,若对融合蛋白质的切割步骤后得到的溶液进行与步骤(2)同样的步骤,则具有自组装能力的蛋白沉淀。通过进行该步骤,能够更有效地进行目标蛋白质的纯化。
获得了目标蛋白质这一事实可以按照该技术领域公知惯用的分析方法来确认。例如,可以通过将试样进行SDS-PAGE,并对分离的蛋白条带的分子量进行确认来确认。此外,通过使用抗体的蛋白质印迹也能确认(Molecular cloning(Cold spring HarborLaboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001))。此外,通过使用蛋白质测序仪对目标蛋白质的N末端氨基酸序列进行测定也能确认。此外,通过使用质谱仪对目标蛋白质的质量进行测定也能确认。而且,在目标蛋白质是酶、或具有某种可测定的生理活性的情况下,以该酶活性或生理活性作为指标也能进行确认。
按照本发明所获得的目标蛋白质可以直接使用,也可以进一步进行修饰。作为修饰,可以列举出通过化学合成法进行的氨基酸添加、PEG化(Biotechnol J.,Jan;5(1):113(2010))等。例如,在制造了Biva18(从生理活性蛋白比伐卢定(20个氨基酸)去掉N末端侧的2个氨基酸残基(D-Phe-L-Pro)而得到的肽)作为目标蛋白质的情况下,通过在Biva18的N末端采用化学合成法添加2个氨基酸残基(D-Phe-L-Pro),能够得到具有生理活性的全长比伐卢定。具体而言,通过进行使进行了活化的特定氨基酸残基对Biva18的N末端发挥作用的化学合成反应,能够得到全长比伐卢定。
经修饰的目标蛋白质可以采用该技术领域公知惯用的方法、例如离子交换色谱、反相HPLC、疏水色谱等进行纯化。
实施例
以下通过实施例和比较例对本发明进行更具体地说明,但本发明不限于这些实施例。
〔实施例1〕
具有生理活性肽特立帕肽(teriparatide)的融合蛋白质的制造
实施例1中,使用生理活性肽特立帕肽(34个氨基酸残基)(Teri)作为目标蛋白质,使用由从CspB成熟蛋白的N末端起的50个氨基酸残基构成的序列(CspB50)作为具有自组装能力的蛋白,使用proTEV蛋白酶识别序列作为用于酶切的氨基酸序列,使用棒状杆菌型细菌谷氨酸棒杆菌作为宿主。
(1)特立帕肽分泌表达质粒pPKK50TEV-Teri的构建
(i)胰岛素原的全基因合成、以及使用了谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC13869的细胞表层蛋白质CspB的信号序列的胰岛素原分泌表达质粒pPKPIns的构建
胰岛素原(以下记作PIns)的氨基酸序列已经被确定(Genbank Accession No.NP_000198.1)。考虑该序列以及谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的密码子使用频率,合成了<SEQID NO:9>~<SEQ ID NO:16>所示的DNA。以这些DNA作为模板,以<SEQ ID NO:17>及<SEQ IDNO:18>所示的DNA作为引物,采用PCR法对编码Pins的基因进行了扩增,得到了<SEQ ID NO:19>所示的DNA片段约0.3kbp。
通过将该DNA片段插入至克隆载体pHSG398(TAKARABio公司制造)的Sma I部位而得到了pHSG-PIns。以该pHSG-Pins作为模板,以<SEQ ID NO:17>及<SEQ ID NO:18>所示的DNA作为引物,采用PCR法对PIns基因区域进行了扩增,得到了PIns基因片段约0.3kbp。
另一方面,编码谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的细胞表层蛋白质CspB的基因的碱基序列已经被确定(Mol.Microbiol.,9,97-109(1993))。参考该序列,以WO01/23591所述的pPKPTG1为模板,使用<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:21>所示的引物,采用PCR法对编码源自谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的启动子区域和信号肽的区域进行了扩增,得到了DNA片段约0.7kbp,所述pPKPTG1是转谷氨酰胺酶原(带前体结构部分的转谷氨酰胺酶)的分泌表达用载体,其具有下述基因:源自谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子;连接于该启动子的下游的编码来自谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC13869株的可表达的CspB的信号肽30个氨基酸残基的DNA;以及为了使与该信号肽该编码信号肽一起以融合蛋白质的形式表达而连接于编码该信号肽DNA下游的转谷氨酰胺酶原基因,所述转谷氨酰胺酶原基因来自放线菌茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)。
而且,以进行了扩增的两DNA片段(PIns基因片段、以及编码启动子的区域与信号肽的区域的片段)作为模板,通过使用<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:18>所述的DNA作为引物的PCR法,得到了两DNA片段进行了融合的DNA片段约0.9kbp。需要说明的是,<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:18>的引物中设计有限制酶Kpn I的识别序列。PCR反应中使用PyrobestDNA polymerase(TAKARABio公司制造),反应条件按业者推荐的方案进行。通过用限制酶Kpn I对该DNA片段进行处理后插入至特开平9-322774所述的pPK4的KpnI部位,得到了pPKPIns。
从插入片段的碱基序列测定的结果,确认了构建了如预想的融合基因。需要说明的是,碱基序列的测定使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司制造)以及3130基因测序仪(Applied Biosystems公司制造)进行。
(ii)融合了谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC13869的细胞表层蛋白质CspB的成熟蛋白N末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、20、50、100、150、200、250、300、350、400、440个氨基酸残基的胰岛素原的分泌表达质粒的构建
如上所述,编码谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的细胞表层蛋白质CspB的基因碱基序列已经被确定(Mol.Microbiol.,9,97-109(1993))。在谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)中,CspB局限于细胞表层,并形成称作S-layer的层,已知该局限与C末端侧富含疏水性的氨基酸残基区相关联(Mol.Microbiol.,9,97-109(1993))。参考该序列,合成<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:22>所述的引物,将按常规方法(齐藤、三浦的方法[Biochem.Biophys.Act.,72,619(1963)])制备的谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC13869的染色体DNA作为模板,采用PCR法对以下区域进行了扩增:包含CspB的基因的启动子的5'-上游区域(以下也称CspB启动子区域)、以及编码CspB的N末端的信号肽30个氨基酸残基以及编码CspB成熟蛋白的N末端440个氨基酸残基的区域。需要说明的是,所谓CspB成熟蛋白的N末端440个氨基酸残基是从谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC13869的全长469个氨基酸(SEQ ID NO:3)的CspB成熟蛋白除去C末端侧的疏水性区域的29个氨基酸而得到的。PCR反应使用Pyobest DNApolymerase(TAKARABio公司制造),反应条件按业者推荐的方案进行。
然后,出于下述目的,即,构建使分别融合了谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的细胞表层蛋白质CspB的成熟蛋白N末端的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,17,20,50,100,150,200,250,300,350,400,440个氨基酸残基的胰岛素原分泌表达的质粒的目的,以上述扩增得到的PCR反应产物作为模板,分别以<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:23>、<SEQID NO:20>及<SEQ ID NO:24>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:25>、<SEQ ID NO:20>及<SEQID NO:26>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:27>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:28>、<SEQID NO:20>及<SEQ ID NO:29>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:30>、<SEQ ID NO:20>及<SEQID NO:31>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:32>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:33>、<SEQID NO:20>及<SEQ ID NO:34>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:35>、<SEQ ID NO:20>及<SEQID NO:36>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:37>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:38>、<SEQID NO:20>及<SEQ ID NO:39>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:40>、<SEQ ID NO:20>及<SEQID NO:41>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:42>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:43>、<SEQID NO:20>及<SEQ ID NO:44>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:45>、<SEQ ID NO:20>及<SEQID NO:46>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:47>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:48>所示的各合成DNA作为引物,采用PCR法分别对编码CspB启动子区域、以及CspB的N末端的信号肽30个氨基酸残基及CspB成熟蛋白的N末端的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,17,20,50,100,150,200,250,300,350,400,440个氨基酸残基的区域进行了扩增。另一方面,以所述(i)中构建的质粒pPKPIns作为模板,以<SEQ ID NO:17>及<SEQ ID NO:49>所示的合成DNA作为引物,采用PCR法对PIns基因区域进行了扩增,得到了PIns基因片段。
而且,进行了扩增的两DNA片段(编码CspB启动子区域、CspB信号肽、成熟CspB的N末端的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,17,20,50,100,150,200,250,300,350,400,440个氨基酸残基的区域的片段,以及PIns基因片段)作为模板,通过使用<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:49>所述的DNA作为引物的PCR法,得到了两DNA片段融合而成的DNA片段。而且,<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:49>的引物中设计有限制酶Kpn I的识别序列,<SEQID NO:23>~<SEQ ID NO:48>的引物为了构建编码CspB成熟蛋白质N末端的区域与编码CspB与PIns基因形成的融合基因而包含编码Pins的N末端侧的氨基酸序列的基因。PCR反应使用Pyrobest DNA polymerase(TAKARABio公司制造),反应条件按业者推荐的方案进行。通过将这些DNA片段用限制酶Kpn I处理后,插入至特开平9-322774所述的pPK4的Kpn I部位,分别得到了pPKK1PIns、pPKK2PIns、pPKK3PIns、pPKK4PIns、pPKK5PIns、pPKK6PIns、pPKK7PIns、pPKK8PIns、pPKK9PIns、pPKK10PIns、pPKK11PIns、pPKK12PIns、pPKK13PIns、pPKK14PIns、pPKK15PIns、pPKK17PIns、pPKK20PIns、pPKK50PIns、pPKK100PIns、pPKK150PIns、pPKK200PIns、pPKK250PIns、pPKK300PIns、pPKK350PIns、pPKK400PIns、pPKK440PIns。由插入片段的碱基序列测定的结果,确认了构建了如预想的融合基因。需要说明的是,碱基序列的测定使用了BigDye(注册商标)Terminator v3.1Cycle SequencingKit(Applied Biosystems公司制造)以及3130基因测序仪(Applied Biosystems公司制造)进行。
(iii)质粒pPKK17Xa-Pins以及pPKK50Xa-PIns的构建
以所述(ii)中构建的pPKK17PIns以及pPKK50PIns作为模板,以<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:50>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:51>所示的各合成DNA作为引物,采用PCR法分别对CspB启动子区域、以及在CspB的N末端的信号肽30个氨基酸残基及CspB成熟蛋白的N末端的17或50个氨基酸残基的区域上再添加编码能够被Factor Xa蛋白酶识别的IEGR的区域而成的片段进行了扩增。另一方面,以所述(i)中构建的质粒pPKPIns作为模板,以<SEQ ID NO:52>及<SEQ ID NO:49>、<SEQ ID NO:53>及<SEQ ID NO:49>所示的各合成DNA作为引物,采用PCR法对PIns基因区域进行了扩增而得到了PIns基因片段。而且,以扩增得到的两DNA片段(CspB启动子区域、以及编码CspB信号肽、成熟CspB的N末端17或50个氨基酸残基(QETNPT)、IEGR的区域构成的片段,以及PIns基因片段)作为模板,通过使用<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:49>所述的DNA作为引物的PCR法,得到了两DNA片段融合而成的DNA片段。需要说明的是,<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:49>的引物中设计有限制酶Kpn I的识别序列,<SEQ ID NO:50>及<SEQ ID NO:51>的引物中设计有编码PIns的N末端侧的氨基酸序列的序列,其用于构建IEGR的碱基序列与PIns基因形成的融合基因。PCR反应使用PyrobestDNA polymerase(TAKARABio公司制造),反应条件按业者推荐的方案进行。通过用限制酶Kpn I对这些DNA片段进行处理后插入至特开平9-322774所述的pPK4的Kpn I部位,分别得到了pPKK17Xa-PIns、pPKK50Xa-PIns。从插入片段的碱基序列测定的结果确认了构建了如预想的融合基因。需要说明的是,碱基序列的测定使用BigDye(注册商标)Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司制造)和3130基因测序仪(AppliedBiosystems公司制造)进行。
(iv)在CspB成熟蛋白的N末端氨基酸序列与胰岛素原序列之间插入了Factor Xa蛋白酶或ProTEV蛋白酶的识别序列形成的融合胰岛素原的分泌表达质粒的构建
已知在将某目标蛋白质以与该目标蛋白质以外的氨基酸序列融合的形式表达的情况下简便地获得目标蛋白质的方法,即,通过在目标蛋白质的氨基酸序列与融合的氨基酸序列之间配置特定的底物特异性高的蛋白酶识别序列,用特定的蛋白酶对表达的融合蛋白质进行切割。另一方面,作为底物特异性高的蛋白酶,已知Factor Xa蛋白酶、ProTEV蛋白酶等,其分别识别蛋白中的Ile-Glu-Gly-Arg(=IEGR)(SEQ ID NO:7)及Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln(=ENLYFQ)(SEQ ID NO:8)的序列,特异性地切割各序列的C末端侧。因而,例如,对于CspB融合Pins,构建在编码CspB成熟蛋白质的N末端氨基酸残基的碱基序列与编码胰岛素原的碱基序列之间插入编码Factor Xa蛋白酶的识别序列(IEGR)或编码ProTEV蛋白酶的识别序列(ENLYFQ)的碱基序列而成的融合PIns基因、并使融合Pins分泌表达,通过使用这些蛋白酶可以简便地由融合Pins得到PIns。
以所述(ii)中构建的pPKK6PIns作为模板,以<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:54>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:55>所示的各合成DNA作为引物,采用PCR法分别对编码CspB启动子区域、以及编码CspB的N末端的信号肽30个氨基酸残基以及在CspB成熟蛋白的N末端6个氨基酸残基(QETNPT)的区域上再添加编码能够被Factor Xa蛋白酶识别的IEGR或能够被ProTEV蛋白酶识别的ENLYFQ的区域而成的片段进行了扩增。另一方面,以所述(i)中构建的质粒pPKPIns作为模板,以<SEQ ID NO:52>及<SEQ ID NO:49>、<SEQ ID NO:53>及<SEQID NO:49>所示的各合成DNA作为引物,采用PCR法对PIns基因区域进行了扩增,得到了PIns基因片段。而且,以扩增的两DNA片段(CspB启动子区域、编码CspB信号肽、成熟CspB的N末端6个氨基酸残基(QETNPT)、以及编码IEGR或ENLYFQ的区域的片段,PIns基因片段)作为模板,通过使用<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:49>所述的DNA作为引物的PCR法,得到了两DNA片段融合而成的DNA片段。需要说明的是,<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:49>的引物中设计有限制酶Kpn I的识别序列,<SEQ ID NO:54>的引物设计有编码PIns的N末端侧的氨基酸序列的序列,其用于构建编码IEGR的碱基序列与PIns基因形成的融合基因,<SEQ ID NO:55>的引物中设计有编码PIns的N末端侧的氨基酸序列的序列,其用于构建编码ENLYFQ的碱基序列与PIns基因形成的融合基因。PCR反应使用Pyrobest DNA polymerase(TAKARABio公司制造),反应条件按业者推荐的方案进行。用限制酶Kpn I对这些DNA片段进行处理后,插入至特开平9-322774所述的pPK4的Kpn I部位,分别得到了pPKK6Xa-PIns、pPKK6TEV-PIns。
同样地,以所述(ii)中构建的pPKK17Pins及pPKK50PIns作为模板,以<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:50>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:51>所示的各合成DNA作为引物,采用PCR法分别对编码CspB启动子区域、以及在编码CspB的N末端的信号肽30个氨基酸残基和CspB成熟蛋白的N末端17或50个氨基酸残基的区域上再添加编码能够被Factor Xa蛋白酶识别的IEGR的区域而成的片段进行了扩增。另一方面,以所述(i)中构建的质粒pPKPIns作为模板,以<SEQ ID NO:52>及<SEQ ID NO:49>、<SEQ ID NO:53>及<SEQ ID NO:49>所示的各合成DNA作为引物,采用PCR法对PIns基因区域进行了扩增,得到了PIns基因片段。而且,以扩增的两DNA片段(CspB启动子区域、以及编码CspB信号肽、成熟CspB的N末端17或50个氨基酸残基(QETNPT)、IEGR的区域的片段,PIns基因片段)作为模板,通过使用<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:49>所述的DNA作为引物的PCR法,得到了两DNA片段融合而成的DNA片段。而且,<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:49>的引物中设计有限制酶Kpn I的识别序列,<SEQ IDNO:50>及<SEQ ID NO:51>的引物设计有编码Pins的N末端侧的氨基酸序列的序列,其用于构建编码IEGR的碱基序列与PIns基因的融合基因。PCR反应使用Pyrobest DNA polymerase(TAKARABio公司制造),反应条件按业者推荐的方案进行。用限制酶Kpn I对这些DNA片段进行处理后,插入至特开平9-322774所述的pPK4的Kpn I部位,分别得到了pPKK17Xa-PIns、pPKK50Xa-PIns。从插入片段的碱基序列测定的结果确认了构建了如预想的融合基因。需要说明的是,碱基序列的测定使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1Cycle SequencingKit(Applied Biosystems公司制造)和3130基因测序仪(Applied Biosystems公司制造)来进行。
(v)人生长激素hGH的全基因合成及谷氨酸棒杆菌中的人生长激素hGH分泌表达质粒的构建
人生长激素(human growth hormone;hGH)的氨基酸序列已经被确定(GenbankAccession No.CAA23779.1)。考虑了在该序列中除去N末端的信号序列26个残基而成的成熟型hGH的氨基酸序列以及谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的密码子使用频率,合成了<SEQID NO:56>~<SEQ ID NO:69>所示的DNA。以这些DNA作为模板,使用另行合成的<SEQ IDNO:70>及<SEQ ID NO:71>所示的DNA作为引物,采用PCR法对hGH基因进行进了扩增,得到了<SEQ ID NO:72>所示的约0.6kbp的DNA片段。通过将该DNA片段插入至克隆载体pHSG398(TAKARABio公司制造)的SmaI部位,得到了pHSG-hGH。以该pHSG-hGH作为模板,以<SEQ IDNO:70>及<SEQ ID NO:71>所示的DNA作为引物,采用PCR法对hGH基因区域进行了扩增,得到了约0.6kbp的hGH基因片段。然后,以WO01/23591所述的pPKSPTG1以及WO01/23591所述的pPKPTG1作为模板,使用<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:73>、或<SEQ ID NO:20>及<SEQ IDNO:74>所示的引物,采用PCR法对源自谷氨酸棒杆菌ATCC13869的CspB的启动子区域、以及编码源自产氨棒杆菌(C.ammoniagenes)ATCC6872株的CspA或编码源自谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB信号肽的区域进行了扩增,分别得到了约0.7kbp的DNA片段,所述pPKSPTG1是具有下述基因的转谷氨酰胺酶原(带前体结构部分的转谷氨酰胺酶)的分泌表达用载体,所述基因为:源自谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子;连接于该启动子下游的可表达的编码源自编码产氨棒杆菌(C.ammoniagenes)ATCC6872株的CspA(SlpA)<Genbank Accession No.BAB62413.1>的信号肽25个氨基酸残基的DNA;以及为了使与该信号肽一起以融合蛋白质的形式表达而连接于编码该信号肽DNA下游的转谷氨酰胺酶原基因,所述转谷氨酰胺酶原基因来自茂源链轮丝菌(S.mobaraense),所述pPKPTG1包含源自编码谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的启动子区域以及编码信号肽的DNA)。而且,以进行了扩增的两DNA片段(hGH基因片段,CspB启动子区域以及编码各信号肽的区域的片段)作为模板,通过使用<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:71>所述的DNA作为引物的PCR法,分别得到了两DNA片段融合而成的DNA片段约1.2kbp。需要说明的是,<SEQ ID NO:20>及<SEQ IDNO:71>的引物中设计有限制酶Kpn I的识别序列,<SEQ ID NO:73>、<SEQ ID NO:74>的各引物中设计有编码hGH的N末端氨基酸残基的序列,其用于构建编码各信号肽的区域与hGH基因形成的融合基因。PCR反应使用Pyrobest DNA polymerase(TAKARABio公司制造),反应条件按业者推荐的方案进行。用限制酶Kpn I对这些DNA片段进行处理后,插入至特开平9-322774所述的pPK4的Kpn I部位,分别得到了pPS-hGH,pPK-hGH。从插入片段的碱基序列测定的结果,确认了构建了如预想的融合基因。而且,碱基全序列测定使用了BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司制造)和3130基因测序仪(Applied Biosystems公司制造)。
(vi)融合了谷氨酸棒杆菌(C.ammoniagenes)ATCC13869的细胞表层蛋白质CspB的信号肽及成熟蛋白N末端氨基酸残基、以及Factor Xa蛋白酶识别序列的人生长激素hGH的分泌表达质粒的构建
以分别所述(iv)中构建的pPKK6Xa-PIns、pPKK17Xa-PIns、pPKK50Xa-PIns作为模板,以<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:75>、<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:76>、<SEQ IDNO:20>及<SEQ ID NO:77>分别所示的各合成DNA作为引物,采用PCR法扩增了CspB启动子区域、编码CspB的N末端的信号肽30个氨基酸残基、CspB成熟蛋白的N末端氨基酸残基(6、17、50个残基)、以及编码Factor Xa蛋白酶识别序列(IEGR)的区域。另一方面,以所述(v)中构建的质粒pPS-hGH作为模板,以<SEQ ID NO:70>及<SEQ ID NO:71>所示的合成DNA作为引物,采用PCR法扩增了hGH基因区域。而且,以进行了扩增的两DNA片段(CspB启动子区域、以及编码CspB信号肽、成熟CspB的N末端氨基酸残基、以及IEGR的区域的各片段;hGH基因片段)作为模板,通过使用<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:71>所述的DNA作为引物的PCR法,得到了两DNA片段融合而成的DNA片段。需要说明的是,<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:71>的引物中设计有限制酶Kpn I的识别序列,<SEQ ID NO:75>、<SEQ ID NO:76>、<SEQ ID NO:77>的各引物中设计有编码hGH的N末端氨基酸残基的序列,其用于构建编码Factor Xa蛋白酶识别序列(IEGR)的区域与hGH基因形成的融合基因。PCR反应使用Pyrobest DNApolymerase(TAKARABio公司制造),反应条件按业者推荐的方案进行。用限制酶Kpn I对这些DNA片段进行处理后,插入特开平9-322774所述的pPK4的Kpn I部位,分别得到了pPKK6Xa-hGH,pPKK17Xa-hGH,pPKK50Xa-hGH。
(vii)特立帕肽分泌表达质粒pPKK6Xa-Teri的构建
人甲状旁腺激素PTH的成熟体的氨基酸序列已经被确定(Genbank AccessionNo.AAA60215.1)。已知该人的甲状旁腺激素PTH的N末端的第1个残基至第34个残基形成的肽即肽特立帕肽作为骨质疏松症药物具有生理活性。考虑该特立帕肽的氨基酸序列与谷氨酸棒杆菌(C.ammoniagenes)的密码子使用频率,合成了<SEQ ID NO:78>及<SEQ ID NO:79>所示的DNA。以该DNA作为模板,以另行合成的<SEQ ID NO:80>及<SEQ ID NO:81>所示的DNA作为引物,采用PCR法对<SEQ ID NO:82>所示的特立帕肽基因进行了扩增。通过将该DNA片段插入至克隆载体pHSG398(TAKARABio公司制造)的Sma I部位,得到了pHSG-Teri。以该pHSG-Teri作为模板,使用<SEQ ID NO:80>及<SEQ ID NO:81>所示的DNA作为引物,采用PCR法对特立帕肽基因区域进行了扩增。然后,以WO01-23591所述的pPKSPTG1(包含源自谷氨酸棒杆菌(C.ammoniagenes)ATCC13869株的CspB的启动子区域、以及编码源自产氨短杆菌(C.ammoniagenes)ATCC6872株的CspA(SlpA)信号肽的DNA)、以及WO01/23591所述的pPKPTG1(包含源自谷氨酸棒杆菌ATCC13869株来源的CspB的启动子区域、以及编码信号肽的DNA)作为模板,使用<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:83>、或者<SEQ ID NO:20>及<SEQ IDNO:84>所示的引物,采用PCR法对源自谷氨酸棒杆菌(C.ammoniagenes)ATCC13869的CspB的启动子区域、以及编码源自产氨短杆菌(C.ammoniagenes)ATCC6872株的CspA或编码源自谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽的区域进行了扩增。而且,以扩增的两DNA片段(特立帕肽基因片段、以及CspB启动子区域、编码各信号肽的区域的片段)作为模板,通过使用<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:81>所述的DNA作为引物的PCR法,分别得到了两DNA片段融合而成的DNA片段约0.8kbp。而且,<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:81>的引物中设计有限制酶Kpn I的识别序列,<SEQ ID NO:83>及<SEQ ID NO:84>的各引物中设计有N末端氨基酸残基的序列,其用于构建编码各信号肽的区域与特立帕肽基因形成的融合基因的编码特立帕肽。PCR反应使用Pyrobest DNA polymerase(TAKARABio公司制造),反应条件按业者推荐的方案进行。用限制酶Kpn I对这些DNA片段进行处理后,插入至特开平9-322774所述的pPK4的Kpn I部位,分别得到了pPS-Teri,pPK-Teri。
然后,以上述pHSG-Teri作为模板,使用<SEQ ID NO:85>及<SEQ ID NO:81>所示的DNA作为引物,采用PCR法对特立帕肽基因区域进行了扩增。此外,以所述(vi)中构建的pPKK6Xa-hGH作为模板,使用<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:86>所示的引物,采用PCR法对CspB启动子区域、编码CspB的N末端的信号肽30个氨基酸残基、CspB成熟蛋白的N末端6个氨基酸残基、以及Factor Xa蛋白酶识别序列(IEGR)的区域进行了扩增。而且,以扩增的两DNA片段(特立帕肽基因片段;编码CspB启动子区域、以及CspB信号肽、CspB成熟蛋白的N末端6个氨基酸残基、和IEGR的区域的片段)作为模板,通过使用了<SEQ ID NO:20>及<SEQ IDNO:81>所述的DNA作为引物的PCR法,得到了两DNA片段融合而成的DNA片段约0.8kbp。需要说明的是,<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:81>的引物中设计有限制酶Kpn I的识别序列,<SEQ ID NO:85>的引物中设计有编码Factor Xa蛋白酶识别序列(IEGR)的序列,其用于构建编码Factor Xa蛋白酶识别序列(IEGR)的区域与特立帕肽基因形成的融合基因。PCR反应使用Pyrobest DNA polymerase(TAKARABio公司制造),反应条件按业者推荐的方案进行。用限制酶Kpn I对这些DNA片段进行处理后,插入至特开平9-322774所述的pPK4的Kpn I部位,得到了pPKK6Xa-Teri。从插入片段的碱基序列测定的结果,确认了构建了如预想的融合基因。而且,碱基全序列测定使用了BigDyeR Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司制造)和3130基因测序仪(Applied Biosystems公司制造)。
(viii)特立帕肽分泌表达质粒pPKK50TEV-Teri的构建
以所述(iii)中构建的质粒pPKK50Xa-PIns作为模板,以<SEQ ID NO:20>及<SEQID NO:87>所示的各合成DNA作为引物,采用PCR法对含CspB的启动子区域的5’-上游区域、编码N末端的信号肽30个氨基酸残基的区域、编码成熟细胞表层蛋白的N末端侧50个残基的区域、以及编码proTEV蛋白酶所识别的氨基酸序列ENLYFQ的区域进行了扩增。另一方面,以所述(vii)中构建的质粒pPKK6Xa-Teri作为模板,以<SEQ ID NO:88>及<SEQ ID NO:89>所示的合成DNA作为引物,采用PCR法对特立帕肽基因区域进行了扩增。而且,以进行了扩增的各DNA片段(CspB启动子、编码CspB信号肽、CspB的N末端氨基酸序列50个残基、氨基酸序列ENLYFQ的区域的片段;特立帕肽基因片段)作为模板,通过使用<SEQ ID NO:20>及<SEQ IDNO:89>所述的DNA作为引物的PCR法,得到了各DNA片段融合而成的DNA片段。而且,<SEQ IDNO:20>及<SEQ ID NO:89>的引物中设计有限制酶Kpn I的识别序列,<SEQ ID NO:88>的引物中设计有编码特立帕肽的N末端侧的氨基酸序列的序列,其用于构建编码ENLYFQ的碱基序列与特立帕肽的融合基因。PCR反应使用Pyrobest DNA polymerase(TAKARABio公司制造),反应条件按业者推荐的方案进行。通过用限制酶Kpn I对这些DNA片段进行了处理后,插入至特开平9-322774所述的pPK4的Kpn I部位,得到了质粒pPKK50TEV-Teri。从插入片段的碱基序列测定的结果,确认了构建了如预想的融合基因。而且,碱基序列的测定使用了BigDye(注册商标)Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司制造)和3130基因测序仪(Applied Biosystems公司制造)。
(2)使用pPKK50TEV-Teri的融合蛋白质CspB50TEV-特立帕肽(Teriparatide)(简称50-Teri)的分泌表达
使用(1)中构建的pPKK50TEV-Teri,转化了WO01/23591所述的谷氨酸棒杆菌(C.ammoniagenes)YDK010株。用含25mg/l的卡那霉素的MM液体培养基(葡萄糖120g、七水硫酸镁0.4g、硫酸铵30g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸铁0.01g、五水硫酸锰0.01g、硫胺盐酸盐200μg、生物素500μg、DL-甲硫氨酸0.15g、碳酸钙50g、用水1L调节至pH7.5)分别对得到的转化株在30℃下培养72小时。培养结束后,将对各培养液进行了离心分离而得到的培养上清进行还原SDS-PAGE后,用CBB R-250(Bio-Rad公司制造)进行染色,确认了目标融合蛋白质50-Teri的条带。
另一方面,将含25mg/l的卡那霉素的300mL MMTG液体培养基(葡萄糖120g、氯化钙2g、七水硫酸镁3g、硫酸铵3g、磷酸二氢钾1.5g、七水硫酸铁0.03g、五水硫酸锰0.03g、硫胺盐酸盐450μg、生物素450μg、DL-甲硫氨酸0.15g、碳酸钙50g、用水调整成1L调节至pH6.7)装入到1L容量的发酵罐中,添加氨气,保持pH6.7,在30℃下对所得转化株进行通气搅拌培养3天。
(3)从培养液除去菌体、以及除去菌体的培养液的保存
培养结束后,将培养液转移至微型管中,使用离心机以12000G离心分离菌体10分钟。用微孔径0.22μm的除菌滤膜对得到的离心上清进行过滤,将所得滤液作为“除去菌体的培养液”(相当于“步骤(1)中得到的溶液”),在-80℃下冷冻保存。
(4)伴随pH变化的融合蛋白质(50-Teri)的沉淀以及可溶化
将冷冻保存的除去菌体的培养液在25℃下解冻,用离心机以12000G离心1分钟,对冷冻保存中生成的主要由无机盐构成的沉淀进行了分离。在4支微型管中分别添加0、5、10、30μL的0.5M硫酸水溶液及30、25、20、0μL的MilliQ水并使之均匀,然后,分别注入所得离心上清100μL,制备成容量均为130μL。
对其进行搅拌后,静置10分钟,得到了pH7.4、pH6.6、pH3.8、pH1.7的“完成pH调节完的培养液”(“相当于步骤(2)中得到的溶液”)。pH6.6、pH3.8以及pH1.7的“完成pH调节的培养液”出现白浊,确认了沉淀的生成。将这些“完成pH调节的培养液”,用离心机以12000G离心5分钟,分离出因pH变化而生成的沉淀(相当于“步骤(3)中分离出的固体”)。将得到的离心上清分别转移至其他微型管中,作为“完成pH调节的培养液上清”(相当于“步骤(3)的固体分离后的溶液”)。向残留的沉淀添加与除去的离心上清相同容量的缓冲液(100mMTris-HCl,pH8.5),进行搅拌,沉淀迅速溶解,得到了“沉淀溶解溶液”(相当于“步骤(4)中得到的溶液”)。沉淀溶解溶液的pH均在中性附近,分别为pH8.3、pH8.3、pH8.1、pH7.8。考虑到上述沉淀发生的pH范围、以及生成的沉淀在中性附近可逆地迅速再溶解,可知步骤(2)中观察到的沉淀现象是与一般不可逆的蛋白质的酸变性现象全然不同的现象。
对通过上述操作得到的pH7.4、pH6.6、pH3.8、pH1.7的“完成pH调节的培养液上清”以及“沉淀溶解溶液”进行还原SDS-PAGE,通过确认50-Teri的条带,对伴随pH变化的50-Teri的沉淀以及可溶化进行了分析评价。需要说明的是,还原SDS-PAGE使用了AnykDTMMini-PROTEAN(注册商标)TGXTM预铸凝胶(Bio-Rad Laboratories株式会社)进行,通过用SYPRO(注册商标)Ruby(Life Technologies Japan株式会社)进行了染色,检测出了融合蛋白质50-Teri的条带。然后,将各pH下的条带浓度用软件Multi Gauge(FUJIFILM公司制造)进行了数值化,按照以下的计算公式计算出了各pH下的50-Teri的回收率。
回收率(%)=[步骤(4)中得到的溶液中融合蛋白质的条带浓度/{步骤(4)中得到的溶液中融合蛋白质的条带浓度+步骤(3)的固体分离后的溶液中的融合蛋白质的条带浓度}]×100
而且,在后述的实施例以及比较例中通过还原SDS-PAGE进行回收率计算的情况下,也与实施例1同样地实施。
计算出的pH7.4、pH6.6、pH3.8、pH1.7的“完成pH调节的培养液”的50-Teri回收率分别为1%、95%、99%、99%。图1-A示出了计算出的回收率与“完成pH调节的培养液”的pH之间的关系。由该图可知,步骤(2)中观察到的沉淀现象是与蛋白质的溶解度在其等电点变得最小的等电点沉淀现象完全不同的现象。
图1-B中示出了“完成pH调节的培养液”的pH与“pH完成调节的培养液上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中融合蛋白质50-Teri的条带部分,以及回收率。
pH7.4的“完成pH调节的培养液上清”中存在的50-Teri在pH6.6、pH3.8以及pH1.7下未检测出,而在“沉淀溶解溶液”中被检测出。
〔实施例1-2〕
具有生理活性肽特立帕肽的融合蛋白质50-Teri的制造和目标蛋白质特立帕肽的制造
就实施例1-2而言,与实施例1同样地进行实施,使用了生理活性肽特立帕肽(34个氨基酸残基)(Teri)作为目标蛋白质;使用了由从CspB成熟蛋白的N末端起的50个氨基酸残基构成的序列(CspB50)作为具有自组装能力的蛋白;使用了proTEV蛋白酶识别序列作为用于酶切的氨基酸序列;使用了棒状杆菌型细菌的谷氨酸棒杆菌作为宿主。
(1)特立帕肽分泌表达质粒pPKK50TEV-Teri的构建
按照实施例1的(1)中所述的操作流程进行了构建。
(2)使用pPKK50TEV-Teri融合蛋白质的分泌表达
按照实施例1的(2)中所述的操作流程,对用pPKK50TEV-Teri进行了转化的谷氨酸棒杆菌YDK010株进行了培养。
(3)从培养液除去菌体、以及除去了菌体的培养液的保存
按照实施例1的(3)中所述的操作流程实施。
(4)伴随pH变化的融合蛋白质50-Teri的沉淀及可溶化
将冷冻保存的除去了菌体的培养液在25℃下解冻,用离心机以12000G离心1分钟,对冷冻保存中生成的主要由无机盐构成的沉淀进行分离。在8根微型管中分别添加0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、30μL、40μL、50μL的0.5M硫酸水溶液、以及50μL、45μL、40μL、25μL、30μL、20μL、10μL、0μL的MilliQ水并使之均匀,然后,分别注入得到的离心上清600μL,制备成容量均为650μL。
对其进行搅拌后,静置10分钟,得到了pH7.9、pH7.6、pH7.3、pH7.1、pH6.6、pH4.9、pH4.1、pH3.7的“完成pH调节的培养液”(“相当于步骤(2)中得到的溶液”)。pH7.1、pH6.6、pH4.9、pH4.1、pH3.7的“完成pH调节的培养液”出现白浊,确认了沉淀的生成。对这些“完成pH调节的培养液”,用离心机以12000G离心5分钟,分离出因pH变化而生成的沉淀(相当于“步骤(3)中分离出的固体”)。将所得离心上清分别转移至其他微型管中,作为“完成pH调节的培养液上清”(相当于“步骤(3)中固体分离后的溶液”)。向残留的沉淀添加与除去了的离心上清相同容量的缓冲液(100mM Tris-HCl,pH8.5),进行搅拌,沉淀迅速溶解,得到了“沉淀溶解溶液”(相当于“步骤(4)中得到的溶液”)。“沉淀溶解溶液”的pH均在中性附近,分别为pH8.0、pH8.0、pH8.0、pH8.0、pH8.0、pH7.9、pH7.7、pH7.6。
对通过上述操作得到的pH7.9、pH7.6、pH7.3、pH7.1、pH6.6、pH4.9、pH4.1、pH3.7的“完成pH调节的培养液上清”及“沉淀溶解溶液”进行还原SDS-PAGE以及反相HPLC,对伴随pH变化的50-Teri的沉淀和可溶化进行了分析评价。需要说明的是,50-Teri回收率的计算使用反相HPLC按以下的计算公式进行。
回收率(%)=[步骤(4)中得到的溶液中融合蛋白质的量/{步骤(4)中得到的溶液中融合蛋白质的量+步骤(3)的固体分离后的溶液中融合蛋白质的量}]×100
对各融合蛋白质的量根据反相HPLC中的相应峰面积进行了定量。具体而言,通过使用已知物质(IGF-1)制作了标准曲线,将各测定样品的相应峰面积套用该标准曲线,计算出融合蛋白质的量。反相HPLC条件如下所示。
系统:Waters Alliance PDA系统一套
柱:YMC-Triart C18φ4.6×100mm,粒径5μm,微孔径12nm
柱温:30℃
流动相A:10mM乙酸铵水溶液,10%乙腈水溶液,pH7.0
流动相B:10mM乙酸铵水溶液,80%乙腈水溶液,pH7.0
流速:1.0mL/min
检测:220nm
注射体积:30Μl
梯度:时间(分钟) | A(%) | B%) |
0 | 100 | 0 |
25 | 50 | 50 |
28 | 0 | 100 |
pH7.9、pH7.6、pH7.3、pH7.1、pH6.6、pH4.9、pH4.1、pH3.7的“完成pH调节的培养液”的50-Teri回收率分别为0%、0%、0%、63%、95%、96%、98%、100%。计算出的回收率与“完成pH调节的培养液”的pH之间的关系图如图1-2A所示。
图1-2B示出了各“完成pH调节的培养液”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图,以及对融合蛋白质50-Teri的条带部分进行了提取的图。
pH7.9、pH7.6、pH7.3、pH7.1的“完成pH调节的培养液上清”中存在的50-Teri在pH6.6、pH4.9、pH4.1、pH3.7中未检测出,另一方面,在对应的“沉淀溶解溶液”中明显检测出。
此外,对pH4.9的“完成pH调节的培养液上清”及“沉淀溶解溶液”进行反相HPLC分析,对各自所含的融合蛋白质50-Teri以及杂质等进行比较,结果如下:在“完成pH调节的培养液上清”中大量检测出来自培养液的杂质(例如保留时间0分钟至5分钟的峰群),而与此相对,“沉淀溶解溶液”中基本未检测出目标融合蛋白质50-Teri以外的杂质峰(图1-2C)。由此可知,本发明中的利用沉淀的融合蛋白质的固液分离可用作粗纯化工艺。
(5)融合蛋白质50-Teri的酶切以及目标蛋白质特立帕肽的获得
用20mM Tris HCl缓冲液(pH5.0)对上述(4)中由调节至pH4.9的“完成pH调节的培养液”得到的沉淀物融合蛋白质50-Teri进行洗涤,从而除去了沉淀物上附着的培养液。然后,用6M尿素+20mM TrisHCl缓冲液(pH8.0)对沉淀物进行溶解而制备了“沉淀溶解溶液”。通过向该“沉淀溶解溶液”加入超纯水而进行了10倍稀释,然后,通过添加ProTEV蛋白酶(识别融合蛋白质中的氨基酸序列:ENLYFQ,Promega公司,V6102),将融合蛋白质酶切成含具有自组装能力的蛋白的CspB50TEV与目标蛋白质特立帕肽,得到了酶切溶液。
将该酶切溶液进行反相HPLC分析,检测出了可能是特立帕肽的峰(图1-2D)。
然后,为了确认酶切溶液中产生的物质是特立帕肽,对“酶切溶液”进行反相HPLC,在如上所示的反相HPLC条件下,获得保留时间18.6分钟附近的洗脱液,对可能是特立帕肽的物质进行了纯化。对该纯化物质进行N末端氨基酸序列分析以及质量分析,与标准品特立帕肽(BACHEM,cat#H-4835)进行了对比。
N末端氨基酸序列分析使用基于Edman降解法的蛋白质测序仪PPSQ-10(岛津制作所制),按岛津制作所推荐的方法(操作说明书)进行。
质量分析使用基于MALDI-TOF-MS法的AXIMA-TOF2(岛津制作所制),按岛津制作所推荐的方法(操作说明书)进行。
关于N末端氨基酸分析结果,纯化物质的N末端侧10个氨基酸残基与标准品特立帕肽的N末端侧10个氨基酸残基一致。
关于质量分析的结果,在用纯化物质进行的测定中检测出了4118.9的测定质量(测定误差±0.1%),在用标准品特立帕肽进行的测定中检测出了4118.1的测定质量(测定误差±0.1%)(图1-2E)。即,纯化物质与标准品特立帕肽的测定质量一致,可知纯化物质是目标蛋白质特立帕肽。基于用反相HPLC检测出的峰面积,对本实施例中得到的特立帕肽的纯度用下式进行了计算,为94%。
纯度(%)=(特立帕肽的峰面积/全部的峰面积的总计)×100
而且,反相HPLC按照以下条件实施。
系统:Waters Alliance PDA系统一套
柱:YMC-Pack C8φ4.6×100mm,粒径5μm,微孔径30nm
柱温:30℃
流动相A:10mM乙酸铵水溶液,10%乙腈水溶液,pH7.0
流动相B:10mM乙酸铵水溶液,80%乙腈水溶液,pH7.0
流速:1.0mL/min
检测:220nm
注射体积:30μL
梯度:时间(分钟) | A(%) | B%) |
0 | 100 | 0 |
60 | 0 | 100 |
从这些结果确认了:纯化物质是特立帕肽,以及、由融合蛋白质能够获得目标蛋白质。
〔实施例2〕
具有生理活性肽比伐卢定(Bivalirudin)的一部分的融合蛋白质(CspB50Lys-比伐卢定18(Bivalirudin18)(简称50-Biva18)的制造和目标蛋白质比伐卢定18(Bivalirudin18)(简称Biva18)的制造
在实施例2中,使用了作为生理活性肽的Bivalirudin(比伐卢定)的一部分(18个氨基酸残基)(Biva18)作为目标蛋白质,使用了由从CspB成熟蛋白的N末端起的50个氨基酸残基构成的序列(CspB50)作为具有自组装能力的蛋白,使用了棒状杆菌型细菌谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)作为宿主。
(1)谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)中Biva18分泌表达质粒pPKK50Lys-Biva18的构建
作为具有凝血酶抑制活性的抗血液凝固药已知有生理活性肽比伐卢定(Bivalirudin),其是N末端具有D型苯丙氨酸残基的由全长20个残基构成的肽。
考虑除去了该N末端的D-苯丙氨酸残基及L-脯氨酸残基而成的18个残基的肽(=Biva18)的氨基酸序列以及谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率,合成了含Biva18基因的全基因<SEQ ID NO:90>。
然后,以实施例1(1)(iii)所述的质粒pPKK50Xa-PIns作为模板,以<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:91>所示的各合成DNA作为引物,采用PCR法对含CspB的启动子区域的5’-上游区域、编码N末端的信号肽30个氨基酸残基、编码成熟细胞表层蛋白的N末端侧50个残基以及赖氨酸残基的区域进行了扩增。而且,以进行了扩增的DNA片段(CspB启动子、编码CspB信号肽以及CspB的N末端氨基酸序列50残基以及赖氨酸残基的区域的片段)和Biva18基因片段<SEQ ID NO:90>作为模板,通过使用<SEQ ID NO:20>及<SEQ ID NO:92>所述的DNA作为引物的PCR法得到了各DNA片段融合而成的DNA片段。而且,<SEQ ID NO:20>及<SEQ IDNO:92>的引物中设计有限制酶Kpn I的识别序列,<SEQ ID NO:91>的引物中设计有编码Biva18的N末端侧的氨基酸序列的序列,其用于构建编码CspB的N末端氨基酸序列50个残基以及赖氨酸残基的碱基序列与Biva18形成的融合基因。PCR反应使用Pyrobest DNApolymerase(TAKARABio公司制造),反应条件按业者推荐的方案进行。通过用限制酶Kpn I处理后对这些DNA片段进行处理,插入至特开平9-322774所述的pPK4的Kpn I部位,得到了质粒pPKK50Lys-Biva18。从插入片段的碱基序列测定的结果,确认了构建了如预想的融合基因。而且,碱基序列的测定使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle SequencingKit(Applied Biosystems公司制造)和3130基因测序仪(Applied Biosystems公司制造)来进行。
(2)使用了pPKK50Lys-Biva18的融合蛋白质CspB50Lys-比伐卢定18(Bivalirudin18)(简称50-Biva18)的分泌表达
使用(1)中构建的pPKK50Lys-Biva18,对WO01/23591所述的谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)YDK010株进行了转化。用含25mg/l的卡那霉素的MM液体培养基(葡萄糖120g、七水硫酸镁0.4g、硫酸铵30g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸铁0.01g、五水硫酸锰0.01g、硫胺盐酸盐200μg、生物素500μg、DL-甲硫氨酸0.15g、碳酸钙50g、用水1L调节至pH7.5)对得到的转化株进行培养,分别在30℃下培养72小时。培养结束后,将对各培养液进行离心分离而得到的培养上清进行还原SDS-PAGE后,用CBB R-250(Bio-Rad公司制造)进行染色,确认了目标蛋白质比伐卢定18(Bivalirudin18)的条带。
另一方面,在1L容量的发酵罐中装入300mL含25mg/l的卡那霉素的MMTG液体培养基(葡萄糖120g、氯化钙2g、七水硫酸镁3g、硫酸铵3g、磷酸二氢钾1.5g、七水硫酸铁0.03g、五水硫酸锰0.03g、硫胺盐酸盐450μg、生物素450μg、DL-甲硫氨酸0.15g、碳酸钙50g、用水调整成1L调节至pH6.7),添加氨气,保持pH6.7,并且在上述培养基中,在30℃下对所得转化株通气搅拌培养3天。培养结束后,将对各培养液进行离心分离得到的培养上清进行还原SDS-PAGE后,用CBB R-250(Bio-Rad公司制造)进行染色,确认了目标蛋白质条带。
(3)从培养液除去菌体、以及除去菌体的培养液的保存
与实施例1同样地实施。
(4)伴随pH变化的融合蛋白质50-Biva18的沉淀以及可溶化
将冷冻保存的除去了菌体的培养液在25℃下解冻,用离心机以12000G离心1分钟,对冷冻保存中生成的主要由无机盐构成的沉淀进行分离。在4支微型管中分别添加0、5、10、30μL的0.5M硫酸水溶液及30、25、20、0μL的MilliQ水并使之均匀,然后,分别注入得到的离心上清100μL,制备成容量均为130μL。
对其进行搅拌后,静置10分钟,得到了pH7.8、pH4.7、pH2.9、pH1.6的“完成pH调节的培养液”(“相当于步骤(2)中得到的溶液”)。pH2.9、pH1.6的”完成pH调节的培养液”出现白浊,确认了沉淀生成。将这些“完成pH调节的培养液”,用离心机以12000G离心5分钟,分离出因pH变化而生成的沉淀(相当于“步骤(3)中分离出的固体”)。将得到的离心上清分别转移至其他微型管中,作为“完成pH调节的培养液上清”(相当于“步骤(3)的固体分离后的溶液”)。向分离出的沉淀添加与完成pH调节的培养液上清相同容量的缓冲液(100mM Tris-HCl,pH8.5),并进行搅拌,沉淀迅速溶解,得到了“沉淀溶解溶液”(相当于“步骤(4)中得到的溶液”)。“沉淀溶解溶液”的pH均在中性附近,分别为pH8.3、pH8.3、pH8.1、pH7.8。
通过将上述操作得到的pH7.8、pH4.7、pH2.9、pH1.6的“完成pH调节的培养液上清”以及“沉淀溶解溶液”进行还原SDS-PAGE,确认融合蛋白质50-Biva18的条带,对伴随pH变化的融合蛋白质50-Biva18的沉淀和可溶化进行了评价。
pH7.8、pH4.7、pH2.9、pH1.6的“完成pH调节的培养液”中计算出的50-Biva18回收率分别为3%、5%、65%、63%。图2-A示出了计算出的回收率与”完成pH调节的培养液”的pH之间的关系。
图2-B示出了“完成pH调节的培养液”的pH、“完成pH调节的培养液上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中的融合蛋白质50-Biva18的条带部分,以及回收率。
在pH7.8以及pH4.7下“完成pH调节的培养液上清”中存在的50-Biva18在pH2.9、pH1.6为淡条带,而在“沉淀溶解溶液”中被检测出为浓条带。
然后,通过与上述同样的操作,制备pH3.0的“完成pH调节的培养液”并进行离心分离,所述pH3.0是低于使由图2-A求出的回收率达到10%的pH(步骤(2)中能够使用的pH的上限值)即pH值:约4.5。对得到的“完成pH调节的培养液上清”及“沉淀溶解溶液”进行反相HPLC分析,分别对包含的融合蛋白质50-Biva18以及杂质等进行了比较,其结果:“完成pH调节的培养液上清”中大量检测出源自培养液的杂质(例如保留时间0分钟~10分钟的峰群),与此相对,“沉淀溶解溶液”中基本未检测出目的的融合蛋白质50-Biva18以外的杂质峰(图2-C)。
需要说明的是,反相HPLC按以下条件实施。
系统:Waters Alliance PDA系统一套
柱:YMC-Triart C18φ4.6x 100mm,粒径5μm,微孔径12nm
柱温:30℃
流动相A:10mM乙酸铵水溶液,10%乙腈水溶液,pH7.0
流动相B:10mM乙酸铵水溶液,80%乙腈水溶液,pH7.0
流速:1.0mL/min
检测:220nm
注射体积:30μL
梯度:时间(分钟) | A(%) | B%) |
0 | 100 | 0 |
25 | 50 | 50 |
28 | 0 | 100 |
(5)融合蛋白质50-Biva18的酶切以及目标蛋白质Biva18的获得
用pH3.0的硫酸溶液对在上述(4)中由调节至pH3.0的“完成pH调节的培养液”得到的沉淀物融合蛋白质50-Biva18进行洗涤,除去附着在沉淀上的培养液。然后,用50mM碳酸氢钠缓冲液(pH8.3)溶解沉淀物,制备了“沉淀溶解溶液”。通过在该沉淀溶解溶液中添加Trypsin(识别融合蛋白质中的氨基酸序列:Lys。SIGMA-ALDRICH公司。T-303-10G),得到了“酶切溶液”。对该酶切溶液进行反相HPLC,未检测出添加酶前观察到的融合蛋白质50-Biva18的峰,而是检测出了新的峰,由此可知良好地进行了切割反应(图2-D)。
然后,为了确认酶切溶液中产生的物质是Biva18,对“酶切溶液”进行反相HPLC,通过获得保留时间5分附近的洗脱液,对被认为是Biva18的物质进行了纯化。
对该纯化物质进行质量分析,测定质量的结果为monoisotopic m/z中检测出了1935.8的测定质量(测定误差±0.1%)。另一方面,由Biva18的氨基酸序列计算的monoisotopic m/z理论值,通过将Biva18的序列输入到MS-Isotope(http:// prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgiyyform=msisotope)而得到的结果是1935.9,确认了与纯化物质中检测出的测定质量1935.8(测定误差±0.1%)一致(图2-E)。即,确认了纯化物质是目标蛋白质Biva18。
基于使用反相HPLC检测出的峰面积按以下的计算公式对于本实施例得到的Biva18的纯度进行了计算,为92%。
纯度(%)=(Biva18的峰面积/全部的峰面积的总计)×100
需要说明的是,反相HPLC按以下条件实施。
系统:Waters Alliance PDA系统一套
柱:YMC-Triart C18φ4.6x 100mm,粒径5μm,微孔径12nm
柱温:30℃
流动相A:10mM乙酸铵水溶液,10%乙腈水溶液,pH7.0
流动相B:10mM乙酸铵水溶液,80%乙腈水溶液,pH7.0
流速:1.0mL/min
检测:220nm
注射体积:30μL
梯度:时间(分钟) | A(%) | B%) |
0 | 100 | 0 |
25 | 50 | 50 |
28 | 0 | 100 |
由上述结果确认了:纯化物质是Biva18、以及能够由融合蛋白质获得目标蛋白。
然后,对”酶切溶液”进行强阴离子交换树脂色谱而代替反相HPLC,从而纯化了Biva18。
<色谱条件>
柱:强阴离子交换树脂(HiTrap Q FF,1mL,GE healthcare)
A缓冲液(结合)25mM磷酸Na水溶液,pH7.0
B缓冲液(洗脱)250mM磷酸Na水溶液,pH7.0
流速:1mL/min
检测出:280nm
样品通液量:0.3mg-Biva18(用酶切溶液250μL+A缓冲液750μL制备)
梯度洗脱:线性梯度,0-100%B通过20柱体积(CV)
强阴离子色谱的结果是,酶切溶液中所含的Biva18全部被树脂吸附,在接下来的梯度洗脱中,获得95%B附近的洗脱液,从而对Biva18进行了纯化(图2-F)。基于使用反相HPLC检测出的峰面积,按前述的计算公式对于得到Biva18的纯度进行计算,为83%(图2-G)。
〔实施例3〕
具有胰岛素原的融合蛋白质CspB50TEV-胰岛素(Proinsulin)(简称50-PIns)的制造
在实施例3中,使用了生理活性肽胰岛素的蛋白原即胰岛素原(86个氨基酸残基)(PIns)作为目标蛋白质,使用了由从CspB成熟蛋白的N末端起的50个氨基酸残基构成的序列(CspB50)作为具有自组装能力的蛋白质、使用了棒状杆菌型细菌谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)作为宿主。
(1)使用pPKK50Pins的融合蛋白质50-PIns的分泌表达
用实施例1(1)(ii)所述的质粒pPKK50Pins对WO01/23591所述的谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)YDK010株进行了转化。用含25mg/l的卡那霉素的MM液体培养基(葡萄糖120g、七水硫酸镁0.4g、硫酸铵30g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸铁0.01g、五水硫酸锰0.01g、硫胺盐酸盐200μg、生物素500μg、DL-甲硫氨酸0.15g、碳酸钙50g、用水1L调节至pH7.5)对得到的各转化株分别在30℃下培养72小时。培养结束后,将对各培养液进行离心分离而得到的培养上清进行还原SDS-PAGE后,用CBB R-250(Bio-Rad公司制造)进行染色,确认了目标蛋白质条带。
(2)从培养液除去菌体、以及除去菌体的培养液的保存
与实施例1同样地实施。
(3)伴随pH变化的融合蛋白质50-PIns的沉淀和可溶化
将冷冻保存的除去了菌体的培养液在25℃下解冻,用离心机以12000G离心1分钟,对冷冻保存中生成的沉淀进行分离。在4支微型管中分别添加0、5、10、30μL的0.5M硫酸水溶液以及30、25、20、0μL的MilliQ水并使之均匀,然后,分别注入所得离心上清100μL,制备成容量均为130μL。
对其进行搅拌后,静置10分钟,得到了pH7.8、pH4.8、pH4.0、pH2.0的“完成pH调节的培养液”(”相当于步骤(2)中得到的溶液”)。pH4.8、pH4.0、pH2.0的“完成pH调节的培养液”出现白浊,确认了沉淀生成。用离心机于12000G对这些“完成pH调节的培养液”离心5分钟,分离出因pH变化而生成的沉淀(相当于”步骤(3)中分离出的固体”)。将所得离心上清分别转移至其他微型管中,作为“完成pH调节的培养液上清”(相当于”步骤(3)的固体分离后的溶液”)。向残留的沉淀添加与除去了的离心上清相同容量的缓冲液(100mM Tris-HCl,pH8.5),进行搅拌,沉淀迅速溶解,得到了“沉淀溶解溶液”(相当于”步骤(4)中得到的溶液”),但pH2.0下产生的沉淀的一部分是不溶的。“沉淀溶解溶液”的pH均在中性附近,分别为pH8.3、pH8.3、pH8.3、pH8.3。
通过对上述操作得到的pH7.8、pH4.8、pH4.0、pH2.0的“完成pH调节的培养液上清”以及“沉淀溶解溶液”进行还原SDS-PAGE,确认50-PIns的条带,对伴随pH变化的50-PIns的沉淀和可溶化进行了评价。
计算出的pH7.8、pH4.8、pH4.0、pH2.0的“完成pH调节的培养液”的50-PIns回收率分别为1%、54%、58%、60%。图3-A示出了计算出的回收率与“完成pH调节的培养液”的pH之间的关系。
图3-B示出了“完成pH调节的培养液”的pH与”完成pH调节的培养液上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中的融合蛋白质50-PIns的条带部分,以及回收率。
在pH7.8下“完成pH调节的培养液上清”中存在的50-Pins在“沉淀溶解溶液”中被检测出为浓条带,而在pH4.8、pH4.0、pH2.0下为淡条带溶解溶液。
〔比较例1〕
未使用具有自组装能力的蛋白质的胰岛素原的制造
在比较例1中,使用了胰岛素原(86个氨基酸残基)(PIns)作为目标蛋白质,使用了棒状杆菌型细菌谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)作为宿主。但是,未使用具有自组装能力的蛋白。
(1)使用了pPK-Pins的胰岛素原的分泌表达
使用实施例1(1)(i)中所述的质粒pPKPIns,WO01/23591所述的谷氨酸棒杆菌YDK010株进行了转化了。在含25mg/l的卡那霉素的MM液体培养基(葡萄糖120g、七水硫酸镁0.4g、硫酸铵30g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸铁0.01g、五水硫酸锰0.01g、硫胺盐酸盐200μg、生物素500μg、DL-甲硫氨酸0.15g、碳酸钙50g、用水1L调节至pH7.5)中分别对所得到的各转化株在30℃下培养72小时。培养结束后,将对各培养液进行离心分离得到的培养上清进行还原SDS-PAGE后,用CBB R-250(Bio-Rad公司制造)进行染色,确认了目标蛋白质条带。
(2)从培养液除去菌体、以及除去菌体的培养液的保存
与实施例1同样地实施。
(3)伴随pH变化的胰岛素原(PIns)的沉淀和可溶化
将冷冻保存的除去了菌体的培养液在25℃下解冻,用离心机以12000G离心1分钟,对冷冻保存中生成的沉淀进行分离。在4支微型管中分别添加0、5、10、30μL的0.5M硫酸水溶液及30、25、20、0μL的MilliQ水并使之均匀,然后,分别注入所得离心上清100μL,制备成容量均为130μL。
对其进行搅拌后,静置10分钟,得到了pH7.5、pH4.6、pH4.0、pH2.2的“完成pH调节的培养液”。pH2.2的“完成pH调节的培养液”出现白浊,确认了沉淀生成。将这些“完成pH调节的培养液”,用离心机于12000G离心5分钟,分离出因pH变化而生成的沉淀。将所得离心上清分别转移至其他微型管中,作为“完成pH调节的培养液上清”。向残留的沉淀添加与除去了的离心上清相同容量的缓冲液(100mM Tris-HCl,pH8.5),进行了搅拌,但pH2.0中产生的沉淀的一部分是不溶的。所得“沉淀溶解溶液”的pH均在中性附近,分别为pH8.4、pH8.3、pH8.3、pH8.1。
通过上述操作得到的pH7.5、pH4.6、pH4.0、pH2.2的“完成pH调节的培养液上清”和”沉淀溶解溶液“进行还原SDS-PAGE,确认PIns的条带,对伴随pH变化的PIns的沉淀和可溶化进行了评价。
pH7.5、pH4.6、pH4.0、pH2.2的“完成pH调节的培养液”的PIns回收率分别为7%、6%、0%、7%。图4-A中示出了计算出的回收率与“完成pH调节的培养液”的pH之间的关系。
图4-B示出了“完成pH调节的培养液”的pH与“完成pH调节的培养液上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中融合蛋白质PIns的条带部分,以及回收率。
pH7.5下“完成pH调节的培养液上清”中存在的Pins在pH4.6、pH4.0、pH2.2下也被检测出,但在“沉淀溶解溶液”中未检测出。
〔实施例4〕
具有胰岛素原的融合蛋白质的制造
实施例4中,使用了胰岛素原(86个氨基酸残基)(PIns)作为目标蛋白质,使用了由从CspB成熟蛋白质的N末端起的250个氨基酸残基构成的序列CspB250作为具有自组装能力的蛋白质,使用了棒状杆菌型细菌谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)作为宿主。
(1)使用pPKK250Pins的融合蛋白质CspB250TEV-胰岛素(Proinsulin)(简称250-PIns)的分泌表达
用实施例1(1)(ii)中所述的质粒pPKK250Pins对WO01/23591所述的谷氨酸棒杆菌YDK010株进行了转化。用含25mg/l的卡那霉素的MM液体培养基(葡萄糖120g、七水硫酸镁0.4g、硫酸铵30g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸铁0.01g、五水硫酸锰0.01g、硫胺盐酸盐200μg、生物素500μg、DL-甲硫氨酸0.15g、碳酸钙50g、用水1L调节至pH7.5)对得到的各转化株分别在30℃下培养72小时。培养结束后,将对各培养液进行离心分离得到的培养上清进行还原SDS-PAGE后,用CBB R-250(Bio-Rad公司制造)进行染色,确认了目标蛋白质条带。
(2)从培养液除去菌体、以及除去菌体的培养液的保存
与实施例1同样地实施。
(3)伴随pH变化的融合蛋白质250-PIns的沉淀和可溶化
将冷冻保存的除去了菌体的培养液在25℃下解冻,用离心机以12000G离心1分钟,对冷冻保存中生成的沉淀进行分离。在4支微型管中分别添加0、5、10、30μL的0.5M硫酸水溶液及30、25、20、0μL的MilliQ水并使之均匀,然后,分别注入得到的离心上清100μL,制备成容量均为130μL。
对其进行搅拌后,静置10分钟,得到了pH7.8、pH4.4、pH3.0、pH1.7的完成pH调节的培养液(“相当于步骤(2)中得到的溶液”)。各“完成pH调节的培养液”未出现白浊,目测未确认沉淀生成。将这些“完成pH调节的培养液”,用离心机以12000G离心5分钟,pH4.4以下的“完成pH调节的培养液”中确认了沉淀(相当于“步骤(3)中分离出的固体”)。对这些因pH变化而生成的沉淀进行离心分离后,将所得离心上清分别转移至其他微型管中,作为完成pH调节的培养液上清(相当于“步骤(3)的固体分离后的溶液”)。向残留的沉淀添加与除去了的离心上清相同容量的缓冲液(100mM Tris-HCl,pH8.5),进行搅拌,沉淀迅速溶解,得到了“沉淀溶解溶液”(相当于“步骤(4)中得到的溶液”)。“沉淀溶解溶液”的pH均在中性附近,全部为pH8.3。
通过上述操作得到的pH7.8、pH4.4、pH3.0、pH1.7的“完成pH调节的培养液上清”以及“沉淀溶解溶液”进行还原SDS-PAGE,确认250-PIns的条带,对伴随pH变化的250-PIns的沉淀和可溶化进行了评价。
计算出的pH7.8、pH4.4、pH3.0、pH1.7的“完成pH调节的培养液”的250-PIns回收率分别为7%、66%、70%、74%。图5-A示出了计算出的回收率与“完成pH调节的培养液”的pH之间的关系。
图5-B示出了“完成pH调节的培养液”的pH与“完成pH调节的培养液的上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中的融合蛋白质250-PIns的条带部分,以及回收率。
pH7.8下“完成pH调节的培养液上清”中存在的250-Pins在pH4.4、pH3.0、pH1.7下为淡条带,而在“沉淀溶解溶液”中被检测出为浓条带。
〔实施例5〕
具有胰岛素原的融合蛋白质的制造
在实施例5中,使用了胰岛素原(86个氨基酸残基)(PIns)作为目标蛋白质,使用了由从CspB成熟蛋白的N末端起的17个氨基酸残基构成的序列(CspB17)作为具有自组装能力的蛋白质,使用了棒状杆菌型细菌谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)作为宿主。
(1)使用pPKK17Pins的融合蛋白质CspB17TEV-胰岛素(Proinsulin)(简称17-PIns)的分泌表达
用实施例1(1)(ii)中所述的质粒pPKK17Pins对WO01/23591所述的谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)YDK010株进行了转化。用含25mg/l的卡那霉素的MM液体培养基(葡萄糖120g、七水硫酸镁0.4g、硫酸铵30g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸铁0.01g、五水硫酸锰0.01g、硫胺盐酸盐200μg、生物素500μg、DL-甲硫氨酸0.15g、碳酸钙50g、用水1L调节至pH7.5)对所得各转化株分别在30℃下培养72小时。培养结束后,将对各培养液进行离心分离得到的培养上清进行还原SDS-PAGE后,用CBB R-250(Bio-Rad公司制造)进行染色,确认了目标蛋白质条带。
(2)从培养液除去菌体、以及除去菌体的培养液的保存
与实施例1同样地实施。
(3)伴随pH变化的融合蛋白质17-PIns的沉淀和可溶化
将冷冻保存的除去了菌体的培养液在25℃下解冻,用离心机以12000G离心1分钟,对冷冻保存中生成的沉淀进行分离。在4支微型管中分别添加0、5、10、30μL的0.5M硫酸水溶液及30、25、20、0μL的MilliQ水并使之均匀,然后,分别注入所得离心上清100μL,制备成容量均为130μL。
对其进行搅拌后,静置10分钟,得到了pH7.8、pH4.6、pH3.7、pH2.0的“完成pH调节的培养液”(“相当于步骤(2)中得到的溶液”)。pH2.0的“完成pH调节的培养液”出现白浊,确认了沉淀生成。用离心机以12000G对这些“完成pH调节的培养液”离心5分钟,分离出因pH变化而生成的沉淀(相当于“步骤(3)中分离出的固体”)。将所得离心上清分别转移至其他微型管中,作为”完成pH调节的培养液上清”(相当于“步骤(3)的固体分离后的溶液”)。向残留的沉淀添加与除去了的离心上清相同容量的缓冲液(100mM Tris-HCl,pH8.5),进行搅拌,沉淀迅速溶解,但pH2.0时产生的沉淀的一部分是不溶的。所得“沉淀溶解溶液”(相当于“步骤(4)中得到的溶液”)的pH均在中性附近,均为pH8.5。
通过上述操作得到的pH7.8、pH4.6、pH3.7、pH2.0的“完成pH调节的培养液上清”以及“沉淀溶解溶液”进行还原SDS-PAGE,确认17-PIns的条带,对伴随pH变化的17-PIns的沉淀和可溶化进行了评价。
pH7.8、pH4.6、pH3.7、pH2.0的“完成pH调节的培养液”的17-PIns回收率分别为9%、46%、43%、45%。图6-A示出了计算出的回收率与“完成pH调节的培养液”的pH之间的关系。
图6-B示出了完成pH调节的培养液的pH与“完成pH调节的培养液上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中的融合蛋白质17-PIns的条带部分,以及回收率。
pH7.8下“完成pH调节的培养液上清”中存在的17-Pins,在pH4.6、pH3.7、pH2.0下在“沉淀溶解溶液”中也被检测出为浓条带。
〔实施例6〕
具有胰岛素原的融合蛋白质的制造
在实施例6中,使用了胰岛素原(86个氨基酸残基)(PIns)作为目标蛋白质,使用了由从CspB成熟蛋白的N末端起的6个氨基酸残基构成的序列(CspB6)作为具有自组装能力的蛋白质,使用了棒状杆菌型细菌谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)作为宿主。
(1)使用pPKK6Pins的融合蛋白质CspB6TEV-胰岛素(Proinsulin)(简称6-PIns)的分泌表达
用实施例1(1)(ii)中所述的质粒pPKK6Pins对WO01/23591所述的谷氨酸棒杆菌YDK010株进行了转化。用含25mg/l的卡那霉素的MM液体培养基(葡萄糖120g、七水硫酸镁0.4g、硫酸铵30g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸铁0.01g、五水硫酸锰0.01g、硫胺盐酸盐200μg、生物素500μg、DL-甲硫氨酸0.15g、碳酸钙50g、用水1L调节至pH7.5)对得到的各转化株分别在30℃下培养72小时。培养结束后,将对各培养液进行离心分离得到的培养上清进行还原SDS-PAGE后,用CBB R-250(Bio-Rad公司制造)进行染色,确认了目标蛋白质条带。
(2)从培养液除去菌体、以及除去菌体的培养液的保存
与实施例1同样地实施。
(3)伴随pH变化的融合蛋白质6-PIns的沉淀和可溶化
将冷冻保存的除去了菌体的培养液在25℃下解冻,用离心机以12000G离心1分钟,对冷冻保存中生成的沉淀进行分离。在4支微型管中分别添加0、5、10、30μL的0.5M硫酸水溶液及30、25、20、0μL的MilliQ水并使之均匀,然后,分别注入所得离心上清100μL,制备成容量均为130μL。
对其进行搅拌后,静置10分钟,得到了pH7.6、pH4.6、pH3.5、pH1.8的“完成pH调节的培养液”(“相当于步骤(2)中得到的溶液”)。pH1.8的“完成pH调节的培养液”出现白浊,确认了沉淀生成。用离心机以12000G对这些“完成pH调节的培养液”离心5分钟,分离出因pH变化而生成的沉淀(相当于“步骤(3)中分离出的固体”)。将所得离心上清分别转移至其他微型管中,作为“完成pH调节的培养液上清”(相当于“步骤(3)的固体分离后的溶液”)。向残留的沉淀添加与除去了的离心上清相同容量的缓冲液(100mM Tris-HCl,pH8.5),进行搅拌,沉淀迅速溶解,但pH1.8时产生的沉淀的一部分是不溶的。得到的“沉淀溶解溶液”(相当于“步骤(4)中得到的溶液”)的pH均在中性附近,全部为pH8.5。
通过上述操作得到的pH7.6、pH4.6、pH3.5、pH1.8的“完成pH调节的培养液上清”以及“沉淀溶解溶液”进行还原SDS-PAGE,确认6-PIns的条带,对伴随pH变化的6-PIns的沉淀和可溶化进行了评价。
计算出的pH7.6、pH4.6、pH3.5、pH1.8的“完成pH调节的培养液”的6-PIns回收率分别为3%、34%、31%、45%。图7-A示出了计算出的回收率与“完成pH调节的培养液”的pH之间的关系。
图7-B示出了“完成pH调节的培养液”的pH与”完成pH调节的培养液上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中的融合蛋白质6-PIns的条带部分,以及回收率。
pH7.6下“完成pH调节的培养液上清”中存在的6-Pins,在pH4.6、pH3.5、pH1.8下,在“沉淀溶解溶液”中也被检测出为条带。
〔实施例7〕
具有特立帕肽的融合蛋白质的制造
实施例7中,与实施例1同样地,使用了作为生理活性肽的特立帕肽(34个氨基酸残基)(Teri)作为目标蛋白质,使用了由从CspB成熟蛋白的N末端起的50个氨基酸残基构成的序列(CspB50)作为具有自组装能力的蛋白质,使用了proTEV蛋白酶识别序列作为用于酶切的氨基酸序列,使用了棒状杆菌型细菌谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)作为宿主。
但是,包含融合蛋白质的溶液的pH调节使用盐酸进行(实施例1中使用硫酸)。
(1)特立帕肽分泌表达质粒(pPKK50TEV-Teri)的构建
与实施例1同样地实施。
(2)使用pPKK50TEV-Teri的融合蛋白质的分泌表达
与实施例1同样地实施。
(3)从培养液除去菌体、以及除去菌体的培养液的保存
与实施例1同样地实施。
(4)伴随pH变化的融合蛋白质(Ter与CspB50的融合蛋白质(50-Teri))的沉淀和可溶化
将冷冻保存的除去了菌体的培养液在25℃下解冻,用离心机以12000G离心1分钟,对冷冻保存中生成的沉淀进行分离。在4支微型管中分别添加0、3.5、5、10μL的1M盐酸水溶液以及10、6.5、5、0μL的MilliQ水并使之均匀,然后,分别注入所得离心上清100μL,制备成容量全部为110μL。
对其进行搅拌后,通静置10分钟,得到了pH7.9、pH7.0、pH5.3、pH3.1的“完成pH调节的培养液”(“相当于步骤(2)中得到的溶液”)。pH7.0以下的“完成pH调节的培养液”出现白浊,确认了沉淀生成。用离心机以12000G对这些“完成pH调节的培养液”离心5分钟,分离出因pH变化而生成的沉淀(相当于“步骤(3)中分离出的固体”)。将得到的离心上清分别转移至其他微型管中,作为“完成pH调节的培养液上清”(相当于“步骤(3)的固体分离后的溶液”)。向残留的沉淀添加与除去了的离心上清相同容量的缓冲液(100mM Tris-HCl,pH8.5),进行搅拌,沉淀迅速溶解,得到了“沉淀溶解溶液”(相当于“步骤(4)中得到的溶液”)。“沉淀溶解溶液”的pH均在中性附近,分别为pH8.5、pH8.5、pH8.4、pH8.3。
通过上述操作得到的pH7.9、pH7.0、pH5.3、pH3.1的“完成pH调节的培养液上清”以及“沉淀溶解溶液”进行还原SDS-PAGE,通过确认50-Teri的条带,对伴随pH变化的50-Teri的沉淀和可溶化进行了评价。
计算出的pH7.9、pH7.0、pH5.3、pH3.1的“完成pH调节的培养液”的50-Teri回收率分别为2%、80%、100%、99%。图8-A示出了计算出的回收率与“完成pH调节的培养液”的pH之间的关系。
图8-B示出了“完成pH调节的培养液”的pH与“完成pH调节的培养液的上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中的融合蛋白质50-Teri的条带部分,以及回收率。
pH7.9下“完成pH调节的培养液上清”中存在的50-Teri在pH7.0、pH5.3、pH3.1下未检测出,而在”沉淀溶解溶液”中被检测出溶解溶液。
〔实施例8〕
具有特立帕肽的融合蛋白质的制造
在实施例8中,与实施例1同样地,使用了作为生理活性肽的特立帕肽(34个氨基酸残基)(Teri)作为目标蛋白质,使用了由从CspB成熟蛋白的N末端起的50个氨基酸残基构成的序列(CspB50)作为具有自组装能力的蛋白质,使用了proTEV蛋白酶识别序列作为用于酶切的氨基酸序列,使用了棒状杆菌型细菌谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)作为宿主。
但是,包含融合蛋白质的溶液的pH调节使用乙酸来进行(实施例1中使用硫酸)。
(1)特立帕肽分泌表达质粒(pPKK50TEV-Teri)的构建
与实施例1同样地实施。
(2)使用pPKK50TEV-Teri的融合蛋白质CspB50TEV-特立帕肽(Teriparatide)(简称50-Teri)的分泌表达
与实施例1同样地实施。
(3)从培养液除去菌体、以及除去菌体的培养液的保存
与实施例1同样地实施。
(4)伴随pH变化的融合蛋白质50-Teri的沉淀和可溶化
将冷冻保存的除去了菌体的培养液在25℃解冻,用离心机以12000G离心1分钟,对冷冻保存中生成的沉淀进行分离。在4支微型管中分别添加0、2、4、10μL的10%乙酸水溶液以及10、8、6、0μL的MilliQ水并使之均匀,然后,分别注入所得离心上清100μL,制备成容量均为110μL。
对其进行搅拌后,静置10分钟,得到了pH7.9、pH6.8、pH5.0、pH4.3的“完成pH调节的培养液”(“相当于步骤(2)中得到的溶液”)。pH6.8以下的“完成pH调节的培养液”出现白浊,确认了沉淀生成。用离心机于12000G对这些“完成pH调节的培养液”离心5分钟,分离出因pH变化而生成的沉淀(相当于“步骤(3)中分离出的固体”)。将得到的离心上清分别转移至其他微型管中,作为“完成pH调节的培养液上清”(相当于“步骤(3)的固体分离后的溶液”)。向残留的沉淀添加与除去了的离心上清相同容量的缓冲液(100mM Tris-HCl,pH8.5),进行搅拌,沉淀迅速溶解,得到了“沉淀溶解溶液”(相当于“步骤(4)中得到的溶液”)。“沉淀溶解溶液”的pH均在中性附近,分别为pH8.5、pH8.3、pH8.1、pH7.9。
通过上述操作得到的pH7.9、pH6.8、pH5.0、pH4.3的“完成pH调节的培养液上清”以及“沉淀溶解溶液”进行还原SDS-PAGE,通过确认50-Teri的条带,对伴随pH变化的50-Teri的沉淀和可溶化进行了评价。
pH7.9、pH6.8、pH5.0、pH4.3的“完成pH调节的培养液”的回收率分别为2%、95%、99%、98%。图9-A示出了计算出的回收率与“完成pH调节的培养液”的pH之间的关系。
图9-B示出了“完成pH调节的培养液”的pH与“完成pH调节的培养液上清”以及对应的“沉淀溶解溶液”的各电泳图中的融合蛋白质50-Teri的条带部分,以及回收率。
pH7.9下“完成pH调节的培养液上清”中存在的50-Teri,在在pH6.8、pH5.0、pH4.3下未检测出,而“沉淀溶解溶液”中被检测出溶解溶液。
〔实施例9〕
具有特立帕肽的融合蛋白质的制造
实施例9中,与实施例1以及实施例1-2同样地,使用了作为生理活性肽的特立帕肽(Teriparatide)(34个氨基酸残基)(Teri)作为目标蛋白质,使用了由从CspB成熟蛋白的N末端起的50个氨基酸残基构成的序列(CspB50)作为具有自组装能力的蛋白质,使用了proTEV蛋白酶识别序列作为用于酶切的氨基酸序列,使用了棒状杆菌型细菌谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)作为宿主。
(1)特立帕肽(Teriparatide)分泌表达质粒(pPKK50TEV-Teri)的构建
与实施例1同样地实施。
(2)pPKK50TEV-Teriを用いた融合蛋白质CspB50TEV-特立帕肽(Teriparatide)(简称50-Teri)的分泌表达
与实施例1同样地实施。
(3)从培养液除去菌体、以及除去菌体的培养液的保存
与实施例1同样地实施。
(4)伴随pH变化的融合蛋白质50-Teri的沉淀和可溶化及纯度提高评价
将冷冻保存的除去了菌体的培养液在25℃解冻,用离心机以12000G离心1分钟,对冷冻保存中生成的沉淀进行分离。在微型管中添加50μL的0.5M硫酸水溶液及所得离心上清600μL。
将其搅拌后,静置10分钟,得到了pH3.7的“完成pH调节的培养液”(“相当于步骤(2)中得到的溶液”)。该值pH3.7是基于实施例1以及实施例1-2的结果,作为“使回收率达到10%以上的pH”而采用的。用离心机以12000G对该“完成pH调节的培养液”离心5分钟,分离出因pH变化而生成的沉淀(相当于“步骤(3)中分离出的固体”)。将得到的离心上清转移至其他微型管,作为“完成pH调节的培养液上清”(相当于“步骤(3)的固体分离后的溶液”)。向残留的沉淀添加与除去了的离心上清相同容量的缓冲液(100mM Tris-HCl,pH8.5),进行搅拌,沉淀迅速溶解,得到了“沉淀溶解溶液”(相当于”步骤(4)中得到的溶液”)。“沉淀溶解溶液”的pH在中性附近,为pH7.4。该值pH7.4是基于实施例1以及实施例1-2的结果,作为“12以下且比步骤(2)中得到的溶液的pH高0.1的pH”而采用的。
对除去了菌体的培养液(操作前)以及通过上述操作得到的“沉淀溶解溶液”进行反相HPLC,求出50-Teri以及其他峰面积,按下述计算公式计算出纯度并进行比对,从而对上述操作带来的50-Teri的纯度提高进行了评价。
纯度(%)=(50-Teri的峰面积/全部的峰面积的总计)×100
需要说明的是,反相HPLC按以下条件实施。
系统:Waters Alliance PDA系统一套
柱:YMC-Pack C8φ4.6×100mm,粒径5μm微孔径30nm
柱温:30℃
流动相A:10mM乙酸铵,10%乙腈,pH7.0(pH未调整)
流动相B:10mM乙酸铵,80%乙腈,pH7.0(pH未调整)
流速:1.0mL/min
检测:280nm,220nm
注射体积:30μL
梯度:时间(min) | A(%) | B(%) |
0 | 100 | 0 |
5 | 74 | 26 |
25 | 64 | 36 |
30 | 0 | 100 |
各溶液的反相HPLC的分析结果示于图10-A以及10-B。图10-A示出了280nm的波长下检测出的峰,图10-B示出了220nm的波长下检测出的峰。
在用280nm的波长进行检测的情况下,除去了菌体的培养液中的50-Teri的纯度为11%,与此相对,沉淀溶解溶液中的50-Teri的纯度提高至46%(图10-A)。同样地,在用220nm的波长进行检测的情况下,除去了菌体的培养液中的50-Teri的纯度为46%,与此相对,沉淀溶解溶液中的50-Teri的纯度提高至73%(图10-B)。
由此可知,根据本发明的上述操作不仅可以回收50-Teri,还可以提高纯度。
工业实用性
本发明可应用于制造目标蛋白质的方法中。
〔序列表自由文本〕
SEQ ID NO:1:谷氨酸棒杆菌ATCC13869(C.glutamicum ATCC13869)的cspB基因的碱基序列
SEQ ID NO:2:谷氨酸棒杆菌ATCC13869(C.glutamicum ATCC13869)的CspB蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:3:谷氨酸棒杆菌ATCC13869(C.glutamicum ATCC13869)的CspB成熟蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:4:源自谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的PS1的信号肽的氨基酸序列
SEQ ID NO:5:源自谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的PS2(CspB)的信号肽的氨基酸序列
SEQ ID NO:6:源自谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的SlpA(CspA)的信号肽的氨基酸序列
SEQ ID NO:7:Factor Xa蛋白酶的识别序列
SEQ ID NO:8:ProTEV蛋白酶的识别序列
SEQ ID NO:9~16:全胰岛素原合成用DNA的碱基序列
SEQ ID NO:17、18:引物
SEQ ID NO:19:胰岛素原基因的碱基序列
SEQ ID NO:20~55:引物
SEQ ID NO:56~69:全人生长激素hGH合成用DNA的碱基序列
SEQ ID NO:70、71:引物
SEQ ID NO:72:hGH基因的碱基序列
SEQ ID NO:73~77:引物
SEQ ID NO:78、79:特立帕肽合成用DNA的碱基序列
SEQ ID NO:80、81:引物
SEQ ID NO:82:特立帕肽基因的碱基序列
SEQ ID NO:83~86:引物
SEQ ID NO:87~89:引物
SEQ ID NO:90:Biva18合成用DNA的碱基序列
SEQ ID NO:91、92:引物
SEQ ID NO:93:Biva18的氨基酸序列
Claims (23)
1.一种融合蛋白质的制造方法,其是具有自组装能力的蛋白质与目标蛋白质形成的融合蛋白质的制造方法,所述制造方法包括下述(1)~(4)的步骤:
(1)制备包含融合蛋白质的溶液的步骤;
(2)将步骤(1)中得到的溶液的pH调节至使回收率达到10%以上的pH的步骤,其中步骤(2)的pH为9以下;
(3)从步骤(2)中得到的溶液分离固体的步骤;以及
(4)将步骤(3)中分离出的固体溶解在溶液中的步骤,所述溶液具有12以下且比步骤(2)中得到的溶液的pH高0.1以上的pH;
其中所述具有自组装能力的蛋白质由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列构成的蛋白质或为SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的N末端起的6~250个氨基酸残基构成的序列。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述具有自组装能力的蛋白质为SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的N末端起的6、17、50或250个氨基酸残基构成的序列。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,目标蛋白质的氨基酸残基数为10~1000个。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,具有自组装能力的蛋白质与目标蛋白质之间还包含用于酶切或化学切割的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的方法,其中,具有自组装能力的蛋白质与目标蛋白质之间存在的用于酶切的氨基酸序列是ProTEV蛋白酶识别序列、胰蛋白酶的识别序列或Factor Xa蛋白酶的识别序列。
6.根据权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,步骤(2)的pH调节使用选自硫酸、盐酸、乙酸、磷酸以及三氟乙酸中的酸进行。
7.根据权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,步骤(3)的分离利用离心分离和/或膜过滤进行。
8.根据权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,步骤(1)中得到的溶液是具有表达融合蛋白质的基因构建物的棒状杆菌型细菌的培养液的上清。
9.根据权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,步骤(2)中指定的回收率为30%以上。
10.一种目标蛋白质的制造方法,其包括下述(1)~(5)的步骤:
(1)制备包含具有自组装能力的蛋白质与目标蛋白质形成的融合蛋白质的溶液的步骤,且该融合蛋白质在具有自组装能力的蛋白质与目标蛋白质之间包含用于酶切或化学切割的氨基酸序列;
(2)将步骤(1)中得到的溶液的pH调节至使回收率达到10%以上的pH的步骤,其中步骤(2)的pH为9以下;
(3)由步骤(2)中得到的溶液分离固体的步骤;以及
(4)将步骤(3)中分离出的固体溶解在溶液中的步骤,所述溶液具有12以下且比步骤(2)中得到的溶液的pH高0.1以上的pH;
(5)与步骤(4)同时、或在步骤(4)中途、或在步骤(4)之后,位于具有自组装能力的蛋白质与目标蛋白质之间的氨基酸序列部位对融合蛋白质进行酶切或化学切割的处理的步骤;
其中所述具有自组装能力的蛋白质由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列构成的蛋白质或为SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的N末端起的6~250个氨基酸残基构成的序列。
11.根据权利要求10所述的方法,其中,对所述融合蛋白质进行切割处理的步骤是进行酶切处理的步骤。
12.根据权利要求10所述的方法,其中,所述具有自组装能力的蛋白质为SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的N末端起的6、17、50或250个氨基酸残基中的任意残基构成的序列。
13.根据权利要求10所述的方法,其中,目标蛋白质的氨基酸残基数为10~1000个。
14.权利要求10~13中任一项所述的方法,其中,目标蛋白质是特立帕肽。
15.根据权利要求10~13中任一项所述的方法,其中,目标蛋白质是SEQ ID NO:93所示的比伐卢定中间体。
16.根据权利要求10~13中任一项所述的方法,其中,具有自组装能力的蛋白与目标蛋白质之间存在的用于酶切的氨基酸序列是ProTEV蛋白酶识别序列、胰蛋白酶的识别序列或Factor Xa蛋白酶的识别序列。
17.根据权利要求10~13中任一项所述的方法,其中,步骤(2)的pH调节使用选自硫酸、盐酸、乙酸、磷酸以及三氟乙酸中的酸来进行。
18.根据权利要求10~13中任一项所述的方法,其中,步骤(3)的分离通过离心分离和/或膜过滤来进行。
19.根据权利要求10~13中任一项所述的方法,其中,步骤(1)中得到的溶液是具有表达融合蛋白质的基因构建物的棒状杆菌型细菌培养液的上清。
20.根据权利要求10~13中任一项所述的方法,其包括在步骤(4)和/或步骤(5)之后进行的(6)对融合蛋白质或目标蛋白质进行纯化的步骤。
21.根据权利要求20所述的方法,其中,步骤(6)利用柱色谱来进行。
22.根据权利要求10~13中任一项所述的方法,其中,步骤(2)中指定的回收率为30%以上。
23.一种产生融合蛋白质的固体并对其进行分离的方法,其包括将包含具有自组装能力的蛋白与目标蛋白质形成的融合蛋白质的溶液的pH调节至9以下,从而产生固体,然后,对该固体进行分离;其中所述具有自组装能力的蛋白质由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列构成的蛋白质或为SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的N末端起的6~250个氨基酸残基构成的序列。
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