KR102435811B1

KR102435811B1 - 식물에서 탄산무수화효소를 대량생산하는 방법

Info

Publication number: KR102435811B1
Application number: KR1020200035245A
Authority: KR
Inventors: 황인환; 아드부르 라짜크엠디; 류봉열; 이동욱; 이준호; 마두 쿠마리
Original assignee: 주식회사 바이오컴
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2020-03-23
Publication date: 2022-08-24
Also published as: CN111718952A; EP3715463A1; EP3715463B1; KR20200112751A; US20200354726A1; CN111718952B

Abstract

본 발명은 식물에서 탄산무수화효소의 생산 및 분리정제를 위한 재조합 벡터 의 디자인 및 식물에서 생산된 탄산무수화효소를 포함하는 재조합 단백질을 이 재조합 단백질의 CBM3 도메인의 cellulose bead 결합 성질을 이용하여 분리 정제하는 방법과, CBM3를 이용하여 cellulose bead의 표면에 단단하게 고정된 상태의 탄산무수화효소를 이용하여 이산화탄소의 수화 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

Description

식물에서 탄산무수화효소를 대량생산하는 방법 {A Method of mass production of carbonic anhydrase in plant}

본 발명은 식물에서 탄산무수화효소를 대량생산 및 이를 이용하여 이산화탄소의 수화 반응에 활용하는 방법에 관한 것이다.

탄산무수화효소(Carbonic anhydrase)는 이산화탄소를 물에 수화시키거나 바이카보네이트 이온으로부터 탈수화 반응을 수행한다. 탄산무수화효소는 활성부위에 Zinc 금속 이온을 가지고 있어 메탈화 효소라 일컫는다. 탄산무수화효소는 CO₂를 특이적으로 포집하는데 활용할 수 있다. 탄산무수화효소를 MDEA에 같이 사용하였을 때 MDEA를 단독으로 사용했을 때보다 더 높은 CO₂포집 활성을 보인다. 또한 MEDA 용액에 포집된 CO₂를 회수하는데 효율적이다. 탄산무수화효소는 CO₂를 포함하는 혼합 기체로부터 CO₂를 순수하게 포집하여 CO₂만을 회수할 수 있다. 현재는 아민 계열의 화합물인 MDEA(methyl diethanol amine)나 Ni-MOF-74와 같은 멤브레인을 이용하여 배기가스로부터 CO₂를 포집하거나, PSA(pressurization swinging adsorption) 공법으로 CO₂를 포함하는 혼합기체로부터 CO₂만을 순수하게 정제하는 기술이 개발되고 있다. CO₂의 포집에 활용하기 위해서는 탄산무수화효소의 저비용 대량 생산이 필수적이며, 이를 정제하여 사용하여야 한다. MEDA 용액에 탄산무수화효소를 포함하여 사용한 경우에는 대장균을 이용하여 DvCA 탄산무수화효소를 (Desulfovibrio vulgaris 로부터 유래된 CAH) 생산하였으며 분리정제하지 않고 탄산무수화효소를 포함하는 대장균을 그대로 사용하였다.

분자생물학과 유전공학 기술의 눈부신 발달은 식물분야에도 적용되어 식물체로부터 유용 생리활성 물질을 생산하려는 노력이 꾸준히 이어지고 있다. 식물에서 유용 물질을 생산하는 경우, 생산 단가를 파격적으로 줄일 수 있고, 종래의 동물세포나 미생물에서 합성하여 단백질을 분리 정제하는 방법에서 발생할 수 있는 바이러스, 암 유전자, 장독소와 같은 여러 가지 오염원을 원천 배제할 수 있으며, 상품화 단계에서도 동물세포나 미생물과는 달리 종자로 장기 보관 및 관리할 수 있다는 이점을 갖는다. 또한, 해당 유용 물질의 수요가 급증할 경우 대량생산에 필요한 설비 기술이나 비용 면에서 기존의 동물세포 시스템에 비해 절대적으로 유리하기 때문에 최단 기간에 높아진 수요에 따른 공급이 가능하다는 것도 장점이다.

하지만, 이와 같은 장점에도 식물 세포에서 단백질을 생산함에서 동물세포를 포함하는 다른 숙주들에 비해 상대적으로 낮은 단백질 발현 및 분리 정제의 어려움이 가장 큰 단점이 되고 있다. 이에 많은 연구가 진행되고 있으며 다양한 방법으로 식물세포에서 단백질 발현량을 증가시키고 효율적으로 단백질을 분리 정제하려는 시도가 있었다. 식물을 이용하는 경우에는 형질 전환체를 이용하여 단백질을 생산하는 방법, 아그로박테리움-매개 형질전환을 이용하여 식물에서 과도하게 단백질의 발현을 유도하고 이를 통해서 단백질을 생산하는 방법 등이 있다. 예를 들어 한국 공개특허번호 제 10-2018-0084680호에는 식물 세포에서의 목적 단백질을 발현을 위한 재조합 벡터가 개시되어 있고, 한국공개번호 제 10-2017-0131207호에는 RbcS 융합 단백질을 이용하여 식물로부터 목적 단백질을　고발현하는 방법 및 목적 단백질 발현 식물체를 이용한 의료용 단백질의 경구투여용 조성물의 제조 방법이 개시되어 있다. 형질 전환체를 이용하는 경우 식물 전체를 이용하여 잎이나 씨와 같은 특정 조직에서 단백질을 생산하는 방법, 형질전환체로부터 세포주(cell line)을 유도하여 단백질을 생산하는 방법이 활용되고 있다. 아그로박테리움-매개 형질전환을 통한 방법이 신속하고, 발현 수준도 높지만, 아그로박테리움을 배양하고 진공을 통해 침윤하는 단계를 포함하는 등 형질전환 식물을 이용하는 것보다 공정이 더 복잡하다.

본 발명은 식물에서 탄산무수화효소를 분리 정제를 용이하기 위해 예의 노력한 결과, CBM3, SUMO 및 M 도메인을 탄산무수화효소인 GcCAHα3 또는 SazCA에 융합하였을 때 식물에서 탄산무수화효소의 생산이 용이하고, 이를 이용하여 분리 정제할 수 있다는 것을 확인하였으며, 또한 셀룰로즈 비드의 표면에 고정된 탄산무수화효소를 이용하여 이산화탄소의 수화 반응에 활용하여 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 탄산무수화효소를 식물에서 생산하기 위한 재조합 벡터를 제공하는데 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는 식물에서 탄산무수화효소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다:

(a) 상기 서술한 재조합 벡터를 제작하는 단계;

(b) 상기 재조합 벡터를 세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;

(c) 상기 형질전환체를 배양하는 단계;

(d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및

(e) 상기 식물을 분쇄하여 셀룰로스 비드에 결합하는 단계.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 서술한 탄산무수화효소를 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이산화탄소 포집용 조성물에 이산화탄소를 공급하는 단계를 포함하는 이산화탄소를 포집하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 서술한 탄산무수화효소를 포함하는 이산화탄소 유리용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 서술한 이산화탄소 유리용 조성물에 CO₃를 포함하는 화합물을 공급하는 단계를 포함하는 이산화탄소를 유리하는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (i) M 도메인; (ii) SUMO (a small ubiquitin-related modifier); (iii) 탄산무수화효소; 및 (iv) CBM3 (Cellulose-binding module 3);를 포함하는, 식물에서 탄산무수화효소를 생산하기 위한 재조합 벡터를 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 탄산무수화효소는 Sulfurihydrogenibium azorense 또는 개꼬시레기(Gracilariopsis chorda)에서 유래될 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 개꼬시레기(Gracilariopsis)에서 유래된 탄산무수화효소의 유전자 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, 상기 Sulfurihydrogenibium azorense에서 유래된 탄산무수화효소의 유전자 서열은 서열번호 11의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 개꼬시레기(Gracilariopsis)에서 유래된 탄산무수화효소의 유전자 서열은 서열번호 2의 염기서열을 포함하고, 상기 Sulfurihydrogenibium azorense에서 유래된 탄산무수화효소의 유전자 서열은 서열번호 12의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 M 도메인의 유전자 서열은 SUMO의 N-말단 앞에 위치할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 M 도메인은 SUMO의 N-말단 앞; 및 CBM3의 N-말단 앞에 각각 위치할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 M 도메인의 유전자 서열은 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 M 도메인의 유전자 서열은 서열번호 6의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 SUMO의 유전자는 서열번호 7의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 CBM3(cellulose-binding module 3)의 유전자는 서열번호 7의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터는 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 형질 전환체는 아그로박테리움(Agrobacterium)일 수 있다.

본 발명은 또한, 하기의 단계를 포함하는 식물에서 탄산무수화효소를 생산하는 방법을 제공할 수 있다:

(a) 상기 서술한 재조합 벡터를 제작하는 단계;

(c) 상기 형질전환체를 배양하는 단계;

(d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및

(e) 상기 식물을 분쇄하여 셀룰로스 비드에 결합하는 단계.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 셀룰로스 비드는 카르복실 메틸 셀룰로스(carboxyl methyl cellulose, CMC), 메틸 셀룰로스(methyl cellulose, MC), 무정형 셀룰로스 (amphous cellulose, AMC), 히드록시 에틸 셀룰로스(hydroxy ethyl cellulose,HEC) 및 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스(hydroxy propyl methyl cellulose, HPMC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 셀룰로스 비드를 이용 할 수 있다.

본 발명은 상기 탄산무수화효소를 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 상기 이산화탄소 포집용 조성물에 이산화탄소를 공급하는 단계를 포함하는 이산화탄소를 포집하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명은 상기 탄산무수화효소를 포함하는 이산화탄소 유리용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 이산화탄소 유리용 조성물에 CO₃를 포함하는 화합물을 공급하는 단계를 포함하는 이산화탄소를 유리하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 식물에서 탄산무수화효소를 저비용 고효율로 생산할 수 있는 효과가 있다. 자세하게는 상기 재조합 벡터는 ER의 높은 축적을 유도하는 BiP, 단백질의 발현을 높이는 M 도메인, 셀룰로스 결합 도메인을 포함하는 CBM3, ER에 높은 축적률을 유도하는 HDEL을 순서대로 포함한 것이다. 또한 상기 재조합 벡터에 번역 증폭 서열인 5’CaMV 35S 프로모터 와 HSP terminator를 순서대로 연결하여 제조한 벡터이다. 상기 재조합 벡터를 아그로박테리움에 형질전환한 후 배양하여, 진공 침윤 방법으로 식물에서 탄산무수화효소를 저비용 고효율로 생산할 수 있고, 상기 생산된 탄산무수화효소는 셀룰로스 비드를 통해 분리 및 정제할 수 있는 효과가 있다. 상기 셀룰로스 비드에 결합한 탄산무수화효소는 탄산무수화효소를 고체의 표면에 고정하는 효과를 가지며, 이러한 상태의 탄산무수화효소를 이용하여 이산화탄소의 수화 반응에 활용할 수 있는 효과가 있다. 상기 셀룰로스 비드의 표면에 결합한 탄산무수화효소는 열안정성이 대장균을 이용하여 생산한 자유로운 형태의 탄산무수화효소보다 높은 효과가 있다. 상기 셀룰로스 비드의 표면에 결합한 탄산무수화효소는 높은 내구성을 갖는 효과가 있다. 셀룰로스 비드에 결합한 탄산무수화효소는 반응용액으로부터 손쉬운 회수가 가능하므로 재활도가 높은 효과가 있다.

도 1은 MSC-GcCAHa3 및 MSC-SazCA의 구조 및 이의 발현 수준 확인한 결과로써, 1a은 MSC-GcCAHa3의 개열지도이고, 1b은 이의 N. benthamiana에서의 발현 수준을 웨스턴 블랏을 수행한 멤브레인을 쿠마시 블루로 염색한 결과이고, 1c는 CBM3의 항체와 반응시킨 결과이며, 1d은 MSC-SazCA의 개열지도이고, 1e은 이의 N. benthamiana에서의 발현 수준을 웨스턴 블랏을 수행한 멤브레인을 쿠마시 블루로 염새학 결과이고, 1f는 CBM3의 항체와 반응시킨 결과이다.
도 2는 MSC-GcCAHa3-M 및 MSC-SazCA-M의 구조 및 이의 발현 수준 확인한 결과로서, 2a은 MSC-GcCAHa3-M 의 개열지도이고, 2b은 이의 N. benthamiana에서의 발현 수준을 웨스턴 블랏을 수행한 멤브레인을 쿠마시 블루로 염색한 결과이고, 2c는 CBM3의 항체와 반응시킨 결과이며, 2d은 MSC-SazCA-M의 개열지도이고, 2e은 이의 N. benthamiana에서의 발현 수준을 웨스턴 블랏을 수행한 멤브레인을 쿠마시 블루로 염새학 결과이고, 2f는 CBM3의 항체와 반응시킨 결과이다.
도 3은 MSC-GcCAHa3 (3a), MSC-SazCA(3b), MSC-GcCAHa3-M(3c) 및 MSC-SazCA-M(3d)의 재조합 단백질의 셀룰로스 비드의 결합량을 확인한 결과이다.
도 4는 셀룰로스 비드를 이용한 N. benthamiana 잎 추출물로부터 MSC-GcCAHα3 및 MSC-SazCA 재조합 단백질을 순수 분리한 결과로써, 도 4a는 MSC-GcCAHα3을 끓여 용리한 단백질을 웨스턴 블랏을 수행한 멤브레인을 쿠마시 블루로 염색한 결과이고, 도 4b는 이의 멤브레인을 CBM3의 항체와 반응시킨 결과이며, 도 4c는 MSC-SazCA을 끓여 용리한 단백질을 웨스턴 블랏을 수행한 멤브레인을 쿠마시 블루로 염색한 결과이고, 도 4d는 이의 멤브레인을 CBM3의 항체와 반응시킨 결과이다. (Lane M, 단백질 크기 마커; NT, non-transformed wild type N. benthamiana 단백질 추출물; T, total transformed N. benthamiana 잎의 전체 단백질 추출물; FT, column의 flow-through fraction; W, washing-off fraction; E, cellulose bead로부터 boiling을 통해서 회수한 단백질)
도 5는 셀룰로스 비드를 이용한 N. benthamiana 잎 추출물로부터 MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-SazCA-M 재조합 단백질을 순수 분리한 결과로써, 도 5a는 MSC-GcCAHα3-M을 끓여 용리한 단백질을 웨스턴 블랏을 수행한 멤브레인을 쿠마시 블루로 염색한 결과이고, 도 5b는 이의 멤브레인을 CBM3의 항체와 반응시킨 결과이며, 도 5c는 MSC-SazCA-M을 끓여 용리한 단백질을 웨스턴 블랏을 수행한 멤브레인을 쿠마시 블루로 염색한 결과이고, 도 5d는 이의 멤브레인을 CBM3의 항체와 반응시킨 결과이다. (Lane M, 단백질 크기 마커; NT, non-transformed wild type N. benthamiana 단백질 추출물; T, total transformed N. benthamiana 잎의 전체 단백질 추출물; FT, column의 flow-through fraction; W, washing-off fraction; E, cellulose bead로부터 boiling을 통해서 회수한 단백질)
도 6은 MSC-GcCAHa3 (6a), MSC-SazCA(6b), MSC-GcCAHa3-M(6c) 및 MSC-SazCA-M(6d)의 재조합 단백질의 발현양을 확인한 결과이다. (끓여서 얻어진 MSC-GcCAHα3을 1 μl에서 8 μl (lane 2, 1 μl; 3, 2 μl; 4, 4 μl; 5, 8 μl)까지 loading하여 비교 하였다. EG로 용리한 단백질을 20 ng에서 100 ng (Lane 6,20 ng; 7,40 ng; 8,80 ng; 9, 100 ng)을 로딩하여 끓여 용리한 단백질의 양을 정량적으로 비교 하는데 기준으로 사용 하였다. 단백질은 SDS-PAGE로 분리한 후 anti-CBM3 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다)
도 7은 MSC-GcCAHa3 (7a), MSC-SazCA(7b), MSC-GcCAHa3-M(7c) 및 MSC-SazCA-M(7d)의 재조합 단백질에 의해 생산된 탄산무수화효소의 CO₂의 수화 반응의 열 안정성을 비교한 결과이다.
도 8은 MSC-GcCAHa3 (8a), MSC-SazCA(8b), MSC-GcCAHa3-M(8c) 및 MSC-SazCA-M(8d)의 재조합 단백질에 의해 생산된 탄산무수화효소의 CO₂의 수화반응에 있어서 내구성을 확인한 결과이다.
도 9은 MSC-GcCAHa3, MSC-SazCA, MSC-GcCAHa3-M 및 MSC-SazCA-M 재조합 벡터로 생산된 탄산무수화효소의 CO₂ 수화 반응의 지속성을 확인한 실험 디자인 결과이다.
도 10은 MSC-GcCAHa3, MSC-SazCA, MSC-GcCAHa3-M 및 MSC-SazCA-M 재조합 벡터로 생산된 탄산무수화효소의 CO₂ 수화 반응의 지속성을 확인한 결과이다.

상술한 바와 같이, 동물세포 또는 미생물을 이용하여 단백질을 생산하는 것은 바이러스, 암 유전자, 장독소와 같은 여러 가지 오염원과 같은 문제를 야기하며, 대량으로 생산할 때 기간 및 비용이 많이 소비 된다는 한계들을 갖는다. 이를 극복하기 위해 식물에서 단백질을 생산하는 방법이 개발되고 있으나, 이 또한 낮은 단백질 발현 및 분리정제의 어려움이 있다.

이에 본 발명자들은 식물에서 단백질 발현량을 증가시키고 효율적으로 단백질을 분리 정제 하기위한 방법을 개발하여 재조합 벡터를 제작하였다. 본 발명의 재조합 벡터는 탄산무수화효소를 포함하여, 상기 탄산무수화효소를 포함하는 재조합 벡터를 배양한 후, 상기 배양액을 주사기 침윤 방법을 통해 식물에 침윤 한 뒤, 이를 대량 생산한 후, 셀룰로스 비드를 통해 정제한 결과 높은 정제률 보였다. 또한 재조합 벡터로 제조된 탄산무수화효소는 열안정성을 높았으며, 재사용률이 높아 오랫동안 사용할 수 있으며, 이산화탄소의 포집도 높았다.

이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

본원 발명은 (i) M 도메인; (ii) SUMO (a small ubiquitin-related modifier); (iii) 탄산무수화효소; 및 (iv) CBM3 (Cellulose-binding module 3); 포함하는 식물에서 탄산무수화효소를 생산하기 위한 재조합 벡터를 제공할 수 있다.

본 발명에서 용어“탄산무수화효소(carbonic anhydrase, CA)"란 내부에 아연을 포함하고 있는 금속 효소로서 이산화탄소의 수화반응을 촉매하는 효소를 말한다. 상기 탄산무수화효소는 Sulfurihydrogenibium azorense 또는 개꼬시레기(Gracilariopsis chorda)에서 유래일 수 있다.

본 발명의기 개꼬시레기(Gracilariopsis)에서 유래된 탄산무수화효소의 유전자 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, 상기 Sulfurihydrogenibium azorense에서 유래된 탄산무수화효소의 유전자 서열은 서열번호 11의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 개꼬시레기(Gracilariopsis)에서 유래된 탄산무수화효소의 유전자 서열은 서열번호 2의 염기서열을 포함하고, 상기 Sulfurihydrogenibium azorense에서 유래된 탄산무수화효소의 유전자 서열은 서열번호 12의 염기서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 12의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 식물에서 탄산무수화효소를 생산하는 벡터에 관한 것으로 단백질의 발현을 높이는 M 도메인, 단백질의 수용성을 증가시키는 SUMO (a small ubiquitin-related modifier), 및 셀룰로즈 비드에 바인딩하여 단백질을 분리할 수 있는 CBM3 (Cellulose-binding module 3)를 포함하는 식물에서 탄산무수화효소를 생산하기 위한 재조합 벡터를 제조하였다. 본 발명자들은 상기 M 도메인을 SUMO N-말단에 하나를 넣거나 CBM3 N-말단에 추가로 하나를 더 융합하였다. 이를 아그로박테리움에 형질전환한 후, 배양하여 바늘 없는 주사기, 또한 진공 침윤 방법을 이용하여 Nicotiana benthamiana에 침윤한 뒤, 상기 Nicotiana benthamiana에서 단백질을 추출하였다. 그 결과 M 도메인을 단일로 융합한 벡터보다, M 도메인 2 개를 융합한 벡터에서 탄산무수화효소의 발현량이 증가하는 것으로 나타났다 (도 1 및 도 2). 본 발명자들은 다양한 양 (1μl ~ 20μl)의 N. benthamiana 총 잎 추출물을 이용하여 10 mg의 셀룰로스 비드의 CBM3의 결합력을 결정하였다. 그 결과 MSC-GcCAHα3는 4 μl의 총 추출물를 셀룰로스 비드와 섞었을 때 아주 소량의 CBM3 밴드가 결합하지 않은 부분에서 나타나기 시작했으며, 10 μl과 20 μl에서는 절반정도가 결합하지 않은 부분에서 나왔다. 이를 통해서 총 단백질 추출물 4 μl에 있는 CBM3의 양이 셀룰로스 비드를 포화(saturation)을 조금 넘긴 양이라 판단하였다. MSC-GcCAHα3-M은 2 μl의 총 추출물까지 셀룰로스 비드와 섞었을 때 CBM3 밴드가 결합하지 않은 부분이 나타나지 않았고, 4 μl과 10μl에서는 절반정도가 결합하지 않은 부분에서 나왔다 (도 3). MSC-Saz 및 MSC-Saz-M은 총 단백질 추출물이 20 μl까지 셀룰로스 비드와 섞었을 때 CBM3의 밴드가 결합하지 않는 밴드가 나타지 않았다. MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M이 셀룰로스 비드에 밀착되게 결합하며 거의 순수하게 분리 정제됨을 확인하였다. Western blot과 쿠마시 블루로 염색한 (Coomassie blue staining) 결과에 따르면 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M이 68 kD 위치에 나타나며, 116 kD 위치(position)보다 더 큰 크기로 또 다른 밴드로 나타났다 (도 4 및 도 5). 68 kD 위치(position)의 단백질도 doublet으로 존재하고 있으며, 이는 M 도메인 등에 존재하는 N-glycosylation site들의 다른 당화(differential glycosylation)에 의한 것으로 예측된다. 그리고 116 kD position 위의 밴드는 멀티머로 판단되었다. 상기 N. benthamiana 총 잎 추출물을 셀룰로즈 비드를 이용하여 분리 정제하여 이의 단백질함량을 측정한 결과 100 μg/g 생중량의 단백질 발현 수준을 확인할 수 있었다(도 6). 상기 재조합 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M에서 분리한 정제한 GcCAHα 및 대장균에서 분리 정제한 GcCAHα3를 70℃에 계속해서 배양하면서 열 안정성을 실험한 결과, 셀룰로스 비드에 고정된 GcCAHα가 대장균에서 분리 정제한 GcCAHα3보다 열안정성이 높았다 (도 7). MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M에서 분리 정젱한 GcCAHα3 의 활성의 재사용 정도를 10μg의 단백질을 CO₂-포화된(4 mL)의 물에 더하고 이를 얼음으로 냉각된 6 mL of 20 mM Tris buffer (pH 8.3) 에 섞어서 반응을 유도하고, pH가 8.3에서 6.3으로 바뀌는데 걸리는 시간을 측정하여 단백질의 활성으로 측정하였다. Free form의 GcCAHα3 비활성(specific activity)는 5722 Wilber-Anderson units (WAU)/mg였으며, MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-MD에서 분리 정제하고, 셀룰로스에 고정된 GcCAHα3의 비활성(specific activity)는 5200 WAU/mg 였다 (도 8). 이는 분자량이 식물에서 분리 정제한 MSC-GcCAHα3이 대장균에서 생산한 free form에 비해서 두 배가 크기 때문이다. 따라서 실제 활성은 식물생산 MSC-GcCAHα3이 거의 두 배의 활성을 갖는 효과가 있다. 셀룰로스 비드에 결합한 단백질은 반응 후 다시 셀룰로스 비드를 회수하여 새로이 동일한 반응을 유도하였고, 이를 10회 반응 시에도 전혀 활성에 변화가 없었다. 이를 통해서 셀룰로스 비드에 고정한 MSC-GcCAHα3가 오랫동안 사용할 수 있는 효과가 있다. 또한 도 9와 같은 실험 디자인을 통해 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-MD에서 분리 정제하고, 셀룰로스에 고정된 GcCAHα3의 이산화탄소를 물에 수화시키거나 바이카보네이트 이온으로부터 탈수화 반응을 수행한 결과 조금씩 시간에 따라 감소하였지만 40일 동안 90% 이상을 유지하였다 (도 10).

본 발명의 M 도메인은 단백질의 발현을 높이기 위해 융합하는 것으로, 상기 M 도메인의 유전자 서열은 SUMO의 N-말단 앞에 위치할 수 있고, 또는 탄산무수화효소 C-말단 뒤에 위치할 수 있으며, 상기 M 도메인의 유전자 서열은 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 자세하게는 서열번호 6의 염기서열을 포함할수 있으며, 더 자세하게는 서열번호 6의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 SUMO(Small ubiquitin-related modifier)는 C-말단을 통해서 다양한 타겟 단백질에 존재하는 라이신의 ε-amino 잔기와 isopeptide를 형성함으로써 공유 결합으로 연결된다. 이 SUMO를 타겟 단백질에 융합하기 위해서는 SUMO 특이적인 단백질 분해효소가 SUMO 전구체로부터 C-말단 부위에 존재하는 extra 부위를 제거하여야 한다. 이때 SUMO 특이적인 단백질 분해효소는 SUMO domain의 C-말단부에 특이적으로 존재하는 글라이신(glycine)-글라이신(glycine) 모티프를 인식하여, GG 서열의 C-말단에 존재하는 extra 부위를 제거하게 된다. SUMO protease가 SUMO 전구체로부터 SUMO를 만들때 SUMO 도메인을 인식하게 되고 두 개의 글라이신의 C-말단 부위를 자르게 되므로 SUMO protease는 대단히 높은 특이성을 보일 수 있다. 또한 두 개의 glycine residue 다음에 오는 아미노산의 종류에 대해서 거의 특이성을 보이지 않으므로 다양한 단백질을 di-glycine 잔기 뒤에 달수가 있으며 이로부터 정확하게 di-glycine을 C-말단에 갖는 mature SUMO 도메인을 제거함으로써 C-말단 부위에 있는 특정 단백질이 extra 아미노산을 갖지 않게 할 수 있는 특성을 가지고 있다. 본 발명의 상기 SUMO은 서열번호 7의 염기서열을 포함 할 수 있고, 자세하게는 서열번호 7로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 CBM3(cellulose-binding module 3)은 C. thermocellum에서 확보한 셀룰로스 결합 도메인으로 셀룰로스에 대단히 높은 결합력을 보이고 있어서 단백질 순수 분리용 affinity tag로서 활용하기 위한 몇 가지의 특성을 가지고 있다. 상기 CBM3는 무정형 셀룰로스에 특이적이고 높은 결합도를 가지고 있으며, CBM3에 목적 단백질을 융합하였을 때 융합된 목적 단백질의 간섭을 덜 받으며, 또한 융합된 목적 단백질의 접힘(folding)을 도와준다. 미생물에서는 CBM3이 단백질의 생산수율을 높이는 것으로 보고되었다. 상기 CBM3가 결합하는 셀룰로스는 친화성 수지로서 친환경적이며, 가격이 대단히 저렴하다는 것 등 여러 가지 장점을 가지고 있다. 셀룰로스는 화학적인 반응성이 거의 없어 다양한 조성의 버퍼 용액을 사용할 수 있으며, 단백질과도 반응을 하지 않을 것으로 알려졌다. 또한, 다양한 형태의 셀룰로스가 상업적으로 쉽게 구할 수 있는 장점도 있다. 따라서 단백질 순수 분리에 최적의 친화적 수지가 될 수 있는 다양한 조건을 가지고 있다. 실제로 인체친화성으로 인하여 이미 다양한 의료용 및 인체적용 제품에 활용되고 있다. 본 발명의 상기 CBM3은 서열번호 8의 염기서열을 포함할 수 있고, 자세하게는 서열번호 8의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

재조합 단백질의 유전자의 N-과 C-말단에 각각 BiP의 signal sequence와 ER retention signal인 HDEL를 포함하므로써, ER(소포체)에 고농도로 축적을 유도하는 효과를 가질 수 있다. 상기 재조합 벡터는 BiP(chaperone binding protein) 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가로 포함할 수 있고, 상기 BiP(chaperone binding protein)는 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있고, HDEL(His-Asp-Glu-Leu)는 서열번호 9의 염기서열을 포함할 수 있다.

또한 상기 재조합 벡터에 번역 증폭 서열인 5’를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 5’은 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 재조합은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내재도입된 것이다.

용어 “재조합 발현 벡터”는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다. 상기 재조합 발현 벡터 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질 전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

상기 적합한 벡터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 326 GFP 또는 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리벡터를 사용하는 것이 바람직하며 당업자라면 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 탄산무수화효소를 암호화하는 유전자를 식물 세포내에서 발현시킬 수 있는 어떠한 벡터라도 선택하여 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 재조합 벡터는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 프로모터, 목적단백질의 발현량을 증진시키는 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 순차적으로 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터이다. 또한, 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

용어 "작동 가능하게 연결"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 인자에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 인자일 수 있다.

발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프로모터 일수 있으나, 이에 제한되지 않는다.“프로모터”란 용어는 구조유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. “식물 프로모터”는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. “구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 투마파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 서술한 재조합 벡터는 개열지도 도 1a, 1d, 도 2a 또는 도 2d로 표시될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 제조합 벡터로 형질 전환된 형질 전환제를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용 될 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움(Agrobacterium)될 수 있고, 바람직하게는 아그로박테리움(Agrobacterium) 투마파시엔스일 수 있으며, 더 자세하게는 아그로박테리움 LBA4404, GV3101, AGL1, EHA101 또는 EHA105일 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본명은 또한, (a) 상기 서술한 재조합 벡터를 제작하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; (c) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; (d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및 (e) 상기 식물을 분쇄하여 셀룰로스 비드에 결합하는 단계;를 포함하는 식물에서 탄산무수화효소를 생산하는 방법을 제공할 수 있다.

상기 형질 전환된 식물세로부터 탄산무수화효소를 생산하는 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환 시킨 다음, 탄산무수화효소가 발현되도록 적당한 시간 동안 배양한 후, 형질 전환된 세포로부터 수득할 수 있다. 이때 상기 탄산무수화효소를 발현시키는 방법은 당업계에 공지된 방법이라면 모두 사용 가능하다.

상기 셀룰로스 비드는 카르복실 메틸 셀룰로스(carboxyl methyl cellulose, CMC), 메틸 셀룰로스(methyl cellulose, MC), 무정형 셀룰로스(amphous cellulose, AMC), 히드록시 에틸 셀룰로스(hydroxy ethyl cellulose, HEC) 및 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스(hydroxy propyl methyl cellulose, HPMC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 셀룰로스 비드를 이용할 수 있으며 가장 바람직하게는 무정형 셀룰로스(amphous cellulose, AMC)일 수 있다.

본 발명은 (d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계에 본 발명의 탄산무수화효소를 생산하기 위한 재조합 벡터 배양물 외 P38을 포함하는 재조합 벡터의 배양물을 동시에 침윤할 수 있다. p38은 gene silencing suppressor이다. 이외에도 gene silencing suppressor P19, HC-Pro, TVA 2b 등일 수 있다.

상기 식물에 침유하는 방법은 화학 전지법, 진공 또는 주사기 침윤 방법이 있고 가장 바람직하게는 주사기 침윤 방법일 수 있으나, 이에 제한되는 것이 아니다.

상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배 나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 (e) 상기 식물을 분쇄하여 셀룰로스 비드에 결합하는 단계에서, 식물을 분쇄한 추출물 및 셀룰로스 비드의 비율은 1:10 내지 2:1일 수 있고, 바람직하게는 1:10 내지 1:1일 수 있으며 가장 바람직하게는 4:10일 수 있다.

본 발명자들은 양한 양 (1μl ~ 20μl)의 N. benthamiana 총 잎 추출물을 이용하여 10 mg의 셀룰로스 비드의 CBM3의 결합력을 결정하였다. 그 결과 MSC-GcCAHα3는 4 μl의 총 추출물을 셀룰로스 비드와 섞었을 때 아주 소량의 CBM3 밴드가 결합하지 않은 부분에서 나타나기 시작했으며, 10 μl과 20 μl에서는 절반정도가 결합하지 않은 부분에서 나왔다. 이를 통해서 총 단백질 추출물 4 μl에 있는 CBM3의 양이 셀룰로스 비드를 포화(saturation)을 조금 넘긴 양이라 판단하였다. MSC-GcCAHα3-M은 2 μl의 총 추출물까지 셀룰로스 비드와 섞었을 때 CBM3 밴드가 결합하지 않은 부분이 나타나지 않았고, 4 μl과 10μl에서는 절반정도가 결합하지 않은 부분에서 나왔다 (도 3). MSC-Saz 및 MSC-Saz-M은 총 단백질 추출물이 20 μl까지 셀룰로스 비드와 섞었을 때 CBM3의 밴드가 결합하지 않는 밴드가 나타지 않았다.

본 발명은 상기 탄산무수화효소를 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 탄산무수화효소는 CBM3를 포함하고 있고, 상기 CBM3는 셀룰로즈 비드 표면과 단단한 결합을 유도하고, 이를 이산화탄소의 수화 반응을 유도하여 이산화탄소를 포집할 수 있다 (도 9 및 도 10).

본 발명은 상기 이산화탄소 포집용 생물 반응 장치를 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 이산화탄소포집용 조성물을 제조하는 단계; 및 상기 이산화탄소 포집용 조성물에 이산화탄소를 공급하는 단계를 포함하는 이산화탄소 포집 방법을 제공할 수 있다.

이산화탄소 포집용 조성물을 제조하는 단계는 (a) 상기 서술한 재조합 벡터를 제작하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; (c) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; (d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및 (e) 상기 식물을 분쇄하여 셀룰로스 비드에 결합하는 단계;를 포함하는 조성물을 제조하는 단계로 구체화 할 수 있다.

상기 이산화탄소 포집용 조성물에 이산화탄소를 공급하는 방법으로는 특별한 제한이 없으며, 이산화탄소를 다량 함유하고 있으며 이산화탄소를 제거할 필요가 있는 공급원, 예를 들면 폐수 또는 연도가스 등의 형태로 공급할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기와 같이 본 발명의 이산화탄소 포집용 조성물을 이용하여 이산화탄소를 포집한 다음에는, 금속 양이온 공급원을 추가하여 포집된 이산화탄소를 최종적으로 탄산염 또는 중탄산염 침전물로 전환하여 산업적으로 다양하게 사용할 수 있으며, 또한 바이카보네이트 용액으로부터 탈수화 반응을 통해서 다시 순수하게 CO₂를 만드는 방법으로 활용될 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 이산화탄소 포집용 조성물 및 금속 양이온을 포함하는 탄산염 또는 중탄산염, 순수 CO₂ 제조용 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 탄산염 또는 중탄산염을 제조하는 방법을 제공할 수 있다. 바람직하게, 본 발명은 상기 이산화탄소 포집용 조성물을 제조하는 단계; 및 상기 이산화탄소 포집용 조성물에 금속 양이온 및 이산화탄소를 공급하는 단계를 포함하는, 탄산염 또는 중탄산염을 제조하는 방법을 제공할 수 있다. 또한 다양한 종류의 가스가 섞인 배가스로부터 CO₂만을 수화하여 바이오카본네이를 생성하고 이로부터 다시 순수한 CO₂를 생산하는 방법을 제공할 수 있다. 탄산무수화효소가 배기가스에 존재하는 CO₂와 반응을 할 때 이 과정에 Nmethyldiethanolamine(MDEA)을 포함하는 다양한 종류의 아민계열의 화합물을 포함하여 반응을 촉진할 수 있다. 또한 CO₃를 화합물의 일부로 구성하는 다양한 화합물질로부터 CO₂를 유리하는 방법을 제공할 수 있다. 이때 이 화합물을 포함하는 용액으로는 수용액을 포함하여 다양한 아민계열의 화합물을 포함하는 방법을 제공할 수 있다.

본원에서 용어, "탄산염" 또는 "탄산염 침전물"은 일반적으로 탄산염 그룹 CO₃를 함유하는 무기물 성분을 의미한다. 당해 용어는 탄산염과 중탄산염의 혼합물 및 탄산염 이온만을 함유하는 종 둘 다를 포함할 수 있다. 또한, 용어 "중탄산염" 또는 "중탄산염 침전물"은 일반적으로 중탄산염 그룹 HCO₃를 함유하는 무기물 성분을 의미한다. 당해 용어는 탄산염과 중탄산염의 혼합물 및 중탄산염 이온만을 함유하는 종 둘 다를 포함할 수 있다.

이산화탄소와 반응하여 탄산염 또는 중탄산염을 생성하기 위하여 공급되는 금속 이온원은, 금속 이온을 포함한다면 특별히 제한되지 않으며, 용도에따라 적절히 선택될 수 있지만, 바람직하게는 탄산원과 반응할 수 있고 방해석(칼사이트) 결정형, 아라고나이트 결정형, 배터라이트 결정형, 또는 비정질 결정형을 갖는 탄산염을 형성할 수 있는 것들이 사용될 수 있다.

예를 들어, 금속 이온원으로 Na⁺ 이온, Ca²⁺ 이온, Fe²⁺이온, Mn²⁺이온, Sr²⁺이온, Ca²⁺이온, Ba²⁺ 이온, Zn²⁺이온, 또는 Pb²⁺이온 등을 사용할 수 있고, 이들을 포함하는 질산염, 염산염, 수산화물 또는 염기성 용액 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 전술한 탄산무수화효소를 포함하는 이산화탄소 유리용 조성물을 제공할 수 있다.

이산화탄소 유리용 조성물을 제조하는 단계는, (a) 상기 서술한 재조합 벡터를 제작하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; (c) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; (d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및 (e) 상기 식물을 분쇄하여 셀룰로스 비드에 결합하는 단계;를 포함하는 조성물을 제조하는 단계로 구체화 할 수 있다.

본 발명은 상기 이산화탄소 유리용 생물 반응 장치를 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 조성물에 CO₃를 포함하는 화합물을 공급하는 단계를 포함하는 이산화탄소를 유리하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 CO₃를 포함하는 화합물은 수용액, NH3 및 다양한 아민계통의 CO₂ 흡착제 등의 용액에 포함되어 있는 CO₃를 구성물질의 일부로 하는 다양한 화합물 일 수 있으며, 더욱 자세하게는 탄산수소염 (HCO₃-), 탄산수소나트륨 (NaHCO₃), 소듐 카보네이트(Na₂CO₃) 카본산(H₂CO₃), 리튬 카보네이트(Li₂CO₃), 포타슘 카보네이트(K₂CO₃), 루비듐 카보네이트(Rb₂CO₃), 세슘 카보네이트(Cs₂CO₃), 베릴륨 카보네이트(BeCO₃), 마그네슘 카보네이트(MgCO₃), 칼슘 카보네이트(CaCO₃), 스트론튬 카보네이트(SrCO₃), 바륨 카보네이트(BaCO₃), 망간 카보네이트(MnCO₃), 철카보네이트(FeCO₃), 코발트 카보네이트(CoCO₃), 니켈 카보네이트(NiCO₃), 구리 카보네이트(CuCO₃), 실버 카보네이트(Ag₂CO₃), 징크 카보네이트(ZnCO₃), 카드뮴 카보네이트(CdCO₃), 알루미늄 카보네이트(Al2(CO₃)₃), 탈륨 카보네이트(Tl₂CO₃), 리드 카보네이트(PbCO₃) 및 란타늄 카보네이트(La₂(CO₃)₃)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상 일 수 있다.

이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

MSC-GcCAHα3 (BiP:M:SUMO:GcCAHα3:CBM3:HDEH의 재조합 융합 컨스트럭트) 및 MSC-SazCA((BiP:M:SUMO:SazCA:CBM3:HDEH)의 제작

MSC-GcCAHα3 는 하기와 같이 디자인 되었다. GcCAHα3을 ER에 발현을 유도하여 높은 수준으로 축적되도록 ER 목적 신호 (targeting signal)인 BiP를 이용하였다. 단백질의 발현을 높이는 M 도메인(M domain)을 BiP에 연결하였다. 단백질의 용해성(solubility)을 높이는 bdSUMO를 갖도록 융합하였다. GcCAHα3를 융합하였다. 마지막으로, CBM3-HDEL을 융합하였다. CBM3는 셀룰로스 결합 도메인으로 단백질의 분리에 이용하며, C-터미널 (C-terminal) 말단에 HDEL은 ER에 높은 축적을 유도하였다. 상기 재조합 융합 유전자 (BiP:M:SUMO:GcCAHα3:CBM3:HDEH, MSC-GcCAHα3)에 번역 증폭 서열인 5’을 포함 시켜서 번역 수준을 높였다. 상기 재조합 융합 유전자의 프로모터와 종결부위(terminator)로는 CaMV 35S 프로모터(promoter) 와 HSP 종결부위를 이용하여 발현용 바이너리 벡터(binary vector)를 완성하였다. 바이너리 (Binary)의 기본구조(backbone)로는 pCAMBIA1300을 이용하였다 (도 1A). 상기 유전자의 서열번호는 하기 표 1와 같다. 상기와 같이 디자인된 바이너리 벡터(binary vector)를 하기와 같이 제작하였다. CBM3 (AEI55081)과 bdSUMO (아미노산 21-97) DNA 단편은 화학적으로 합성하였다 (Bioneer corp., Daejeon, Korea). 모든 합성된 DNA는 Nicotiana benthamiana 에 적합하도록 코돈(codon)을 최적화하였다. 재조합 유전자 MSC-GcCAHα3 오버래핑 PCR (overlapping PCR)을 통해서 제작하였다. ER 잔류 신호 (retention signal)인 HDEL (His-Asp-Glu-Leu)은 오버래핑 PCR (overlapping PCR) 동안에 사용된 역 프라이머 (reverse primer)의 C-말단 (C-terminus)에 포함 시키는 방법으로 추가 되었다. 최종 PCR 산물을 BamHI과 XhoI 제한효소로 자른 후 식물발현 벡터인 326-GFP를 BamHI과 XhoI으로 자른 후 연결하였다. MSC-GcCAHα3의 M 도메인(M domain) (human protein tyrosine phosphatase receptor type C (CD45)의 N-말단 단편 (N-terminal fragment)로 아미노산 위치 231부터 290까지)은 플라즈미드 EelepfM를 템플릿으로 사용하여 오버래핑 PCR(overlapping PCR)를 통해서 도입하였다. 이렇게 하여 얻어진 플라즈미드를 326-M-bdSUMO-GcCAHα3-CBM3-HDEL라 명명하였다. 이를 XbaI과 EcoRI로 자른 후 얻어진 단편을 바이너리 벡터 (binary vector)인 pCAMBIA1300를 XbaI와 EcoRI로 자른 후 연결하여 MSC-GcCAHα3 (도 1A)를 제작하였다. MSC-GcCAHα3 에 cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S 프로모터(promoter)의 double enhancer version (d35S)을 프로모터로 사용하였다. 추가로 5’enhancer region (5’Arabidopsis thaliana BiP1 (BAA13947)의 leader sequence (아미노산 1번부터 34까지)를 5’에 추가하였으며, Arabidopsis thaliana의 HSP18를 종결 부위(terminator)로 사용하였다. 플라즈미드 (Plasmid DNA)는 35s 프로모터 (promoter) (5’’와 HSP 종결부위 (terminator) 프라이머(primer) (5’’를 이용하여 염기서열을 확인하였다. 상기 MSC-GcCAHα3과 동일하게 SazCA 바이너리 발현 벡터 (binary expression vector)를 제작하였다 (도 1D). 코돈에 최적화된 SazCA를 화학적인 방법으로 합성하였다 (Bioneer corp. Daejeon, South Korea). SazCA의 아미노산 서열 및 염기서열은 하기 도 1과 같다. 이를 대장균에 도입하여 증폭한 후 사용하였다. MC-SazCA를 제작하기 위해서 BiP와 M 도메인(M domain)을 먼저 PCR을 통해서 확보하였다. PCR 산물의 5’말단에 XbaI 제한효소 자리를 갖도록 했으며 M-domain의 3’말단에 SpeI 제한효소 자리를 갖도록 하였다. PCR 산물 (PCR product)를 326-sGFP 벡터에 있는 CBM3-HDEL의 CBM의 5’쪽에 도입하였다. 이어서 SazCA를 M-도메인(M-domain)과 CBM3 사이에 SpeI과 KpnI 제한효소 자리를 이용하여 도입하였다. 최종적으로 BiP:M:SazCA:CBM3:HDEL를 제한효소 XbaI와 EcoRI을 이용하여 확보하여 같은 종류의 제한효소를 처리한 pCAMBIA 1300에 연결하여 바이너리 벡터(binary vector)를 제작하였다. 확보된 클론(clone)들은 35s 프로모터 프라이머(35s promoter primer) (5’’와 HSP 종결부위 프라이머(terminator primer) (5’’를 이용하여 염기서열 분석을 하여 확인하였다 .

유전자	서열	서열번호
GcCAHα3 (Amino acid)	MNFFATASVFLLFLSVALPVRANEEIEVDTAGCPVKSAQGDFSYDMTLPNNPTRWGDIKEDFATCKEGEKQSPINFPANVQYAPKSAGPKSQMSLANMTFGASSYNWAMSCSDESGSCGKTSFAGKTYELINVHFHSPSEHKLFGKEYPLECHMVHAAEDGSLAVVGMMFEYAEQTSYPARIYQNVVEEYGDNVVFSTILGGVKSDRGEWAVPVGQLVNHNKGYCSYSGSLTTPPCTESVTWFMSMNIWTVSERQVHDYVRTVGTSIEGNHRPVQPLNERPVTCYVS	서열번호 1
GcCAHα3 (CDS)	ATGAACTTCTTCGCTACCGCCTCCGTCTTTCTACTCTTCTTGTCCGTCGCCCTCCCCGTGCGGGCGAACGAGGAAATCGAGGTCGACACCGCCGGCTGCCCCGTCAAGAGCGCCCAAGGAGACTTCAGTTATGACATGACTCTTCCAAACAACCCCACCCGCTGGGGCGACATCAAGGAGGACTTCGCCACATGCAAGGAAGGAGAAAAGCAATCGCCCATCAACTTCCCCGCCAACGTTCAATACGCCCCGAAATCGGCCGGACCCAAGTCTCAAATGTCGCTCGCAAACATGACCTTTGGCGCCTCCTCCTACAACTGGGCCATGTCCTGCAGCGACGAATCCGGATCGTGTGGAAAGACCTCCTTCGCTGGAAAGACCTATGAACTTATCAATGTTCACTTCCACTCCCCGAGTGAGCACAAGTTGTTCGGCAAAGAATATCCGCTTGAATGTCACATGGTGCATGCTGCCGAGGATGGATCGCTTGCTGTGGTCGGAATGATGTTTGAGTACGCCGAACAAACCTCCTATCCCGCCAGAATTTACCAGAACGTCGTTGAGGAATATGGCGACAACGTCGTCTTTTCCACTATTTTGGGAGGCGTCAAGAGCGATCGTGGAGAATGGGCTGTGCCGGTGGGTCAACTGGTCAACCATAACAAGGGATATTGCTCCTACTCCGGGTCGCTCACCACACCGCCTTGCACTGAAAGTGTCACCTGGTTCATGTCTATGAACATCTGGACCGTGTCTGAACGACAGGTGCATGACTACGTCCGAACGGTTGGCACCAGCATTGAGGGAAATCATCGACCGGTTCAACCACTCAACGAACGTCCGGTCACTTGCTACGTGTCCTAA	서열번호 2
5’	TCTAGAATTATTACATCAAAACAAAAA	서열번호 3
BIP	ATGGCTCGCTCGTTTGGAGCTAACAGTACCGTTGTGTTGGCGATCATCTTCTTCGGTGAGTGATTTTCCGATCTTCTTCTCCGATTTAGATCTCCTCTACATTGTTGCTTAATCTCAGAACCTTTTTTCGTTGTTCCTGGATCTGAATGTGTTTGTTTGCAATTTCACGATCTTAAAAGGTTAGATCTCGATTGGTATTGACGATTGGAATCTTTACGATTTCAGGATGTTTATTTGCGTTGTCCTCTGCAATAGAAGAGGCTACGAAGTTAA	서열번호 4
M domain (Amino acid)	ANITVDYLYNKETKLFTAKLNVNENVECGNNTCTNNEVHNLTECKNASVSISHNSCTAPD	서열번호 5
M domain	GGATCCCGATGGCAAACATCACTGTGGATTACTTATATAACAAGGAAACTAAATTATTTACAGCAAAGCTAAATGTTAATGAGAATGTGGAATGTGGAAACAATACTTGCACAAACAATGAGGTGCATAACCTTACAGAATGTAAAAATGCGTCTGTTTCCATATCTCATAATTCATGTACTGCTCCTGATGGTGGAGGAGGTTCTGGTGGTGGATCAACTAGTCATATT	서열번호 6
SUMO	AATTTGAAAGTGAAGGGACAGGACGGAAACGAGGTTTTCTTCCGTATCAAAAGATCAACACAACTCAAGAAACTCATGAATGCTTACTGCGATAGACAAAGCGTGGACATGACAGCTATAGCTTTCCTATTTGATGGGAGAAGGTTGAGAGCGGAACAGACTCCGGATGAGCTTGAAATGGAAGATGGAGATGAGATTGACGCAATGTTACATCAGACTGGTGCCGGCGGTCCCGGGGGT	서열번호 7
CBM 3	GGAGGAGGTTCAGGTGGTACCGTATCAGGTAACCTTAAGGTGGAGTTTTACAACTCGAACCCTTCTGATACAACTAACTCAATAAACCCACAGTTCAAAGTTACAAACACAGGCAGCTCTGCGATCGATTTGTCTAAATTAACCCTCAGATACTATTATACGGTTGATGGACAGAAGGACCAGACTTTCTGGTGTGATCATGCAGCTATCATTGGTTCTAACGGTAGCTACAACGGAATTACATCAAACGTGAAGGGCACTTTCGTTAAGATGTCCTCTAGCACTAACAACGCAGACACATATTTGGAGATCAGTTTTACGGGGGGAACCCTTGAACCAGGTGCTCACGTCCAGATTCAAGGAAGATTCGCTAAAAACGACTGGTCGAACTATACCCAAAGTAATGATTACAGTTTTAAATCCGCCTCACAATTTGTTGAGTGGGATCAGGTCACTGCTTACCTGAACGGGGTTCTAGTGTGGGGAAAGGAACCTGGT	서열번호 8
HDEL	CATGACGAGCTT	서열번호 9
SazCA (Amino acid sequence)	MKKFILSILSLSIVSIAGEHAILQKNAEVHHWSYEGENGPENWAKLNPEYFWCNLKNQSPVDISDNYKVHAKLEKLHINYNKAVNPEIVNNGHTIQVNVLEDFKLNIKGKEYHLKQFHFHAPSEHTVNGKYYPLEMHLVHKDKDGNIAVIGVFFKEGKANPELDKVFKNALKEEGSKVFDGSININALLPPVKNYYTYSGSLTTPPCTEGVLWIVLKQPITASKQQIELFKSIMKHNNNRPTQPINSRYILESN	서열번호 11
SazCA	ATGAAAAAATTCATACTGAGCATACTCAGTCTATCCATCGTCTCAATAGCGGGAGAGCATGCCATTCTGCAAAAAAATGCAGAGGTACATCACTGGTCATATGAAGGTGAAAACGGTCCAGAGAATTGGGCAAAATTGAACCCGGAATATTTTTGGTGCAACCTGAAGAATCAGTCTCCCGTGGATATATCTGACAATTATAAGGTGCACGCAAAGCTGGAAAAATTGCATATCAACTACAATAAAGCAGTCAATCCTGAGATAGTGAATAATGGGCACACAATTCAGGTGAATGTCCTTGAGGACTTTAAGCTAAATATAAAAGGAAAAGAGTATCATCTCAAACAGTTCCATTTCCATGCACCGAGTGAACACACCGTCAACGGAAAATACTATCCCTTGGAGATGCACCTGGTACATAAAGATAAAGACGGTAACATCGCTGTCATCGGGGTTTTTTTTAAGGAAGGTAAGGCGAACCCAGAACTCGATAAAGTCTTCAAAAACGCCCTGAAGGAAGAGGGCTCTAAGGTCTTCGACGGAAGTATAAACATCAACGCTTTACTTCCGCCCGTGAAGAACTACTATACGTACAGCGGCTCACTGACAACTCCGCCGTGCACTGAAGGAGTTTTATGGATTGTACTGAAGCAGCCGATTACCGCTTCCAAGCAGCAAATAGAACTCTTTAAGTCAATAATGAAGCATAATAACAATCGACCCACGCAACCTATCAATAGCCGATACATCTTGGAATCTAA	서열번호 12

MSC-GcCAHα3-M(BiP:M:SUMO:GcCAHα3:M:CBM3:HDEL의 재조합 융합 컨스트럭트) 및 MSC-SazCA-M((BiP:M:SUMO:SazCA:M:CBM3:HDEL)의 제작

MSC-GcCAHα3-M (BiP : M : SUMO : GcCAHα3 : M : CBM3 : HDEL의 재조합 융합 성 화합물)을 생성하기 위해 두 개의 프라이머에 의해 CBM3와 함께 M 도메인을 증폭시켰다 (Forward primer는 Kpn1을, Reverse primer는 Xho1 restriction 효소 부위)에 p1300-C3bdSU-hIL6 DNA(Islam et al., 2018) 를 주형으로 사용하여 PCR을 수행 하였다. 증폭 된 단편을 326-M-bdSUMO-GcCAHα3-CBM3-HDEL-HSPt 벡터에 서브 클로닝하였다. 이렇게 제작된 플라스미드를 326-M-bdSUMO-ML-CBM3-HDEL-HSPt로 명명하고, XbaI 및 EcoRI로 절단하고, 동일한 제한 효소 Xba I과 EcoRI으로 절단한 식물 발현 바이너리 벡터 pCAMBIA1300에 삽입하였으며 이렇게 만들어진 컨스트럭트를 pCAMBIA1300-M-bdSUMO-ML-CBM3-HDEL-HSPt라 명명하였다. 마지막으로 MSC-GcCAHα3-M은 pCAMBIA1300-M-bdSUMO-ML-CBM3-HDEL-HSPt를 Xma1 및 Kpn1 제한 효소를 사용하여 자른 후 bdSUMO와 M 도메인 사이에 GcCAHα3를 삽입함으로써 생성되었다. MSC-SazCA-M 컨스트럭트를 제작하기 위해서, BiP:M:SUMO:SazCA:CBM3:HDEH를 XmaI와 KpnI 제한 효소를 사용하여 SazCA을 분절을 확보하였다. 이를 동일한 제한 효소로 자른 MSC-GcCAHα3-M에 삽입함으로써 SazCA가 bdSUMO와 M 도메인 사이에 위치하도록 하여 MSC-SazCA-M 제작 하였다.

Agrobacterium strain GV3101와 EHA105에의 플라즈미드 도입

상기 실시예 1 및 실시예 2에 제작된 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M를 아그로박테리움 (agrobacterium) strain인 GV3101과 EHA105를 각각 형질주입 (transfection) 하였다. 플라즈미드 DNA를 전기 천공법으로 아그로박테리움에 형질주입 한 후 카나마이신과 리팜피신(각각 50 mg/L and 100 mg/L)를 포함하는 LB plate에 28℃에서 2일 동안 배양하였다. 하나의 콜로니를 선택 한 후 5 mL의 카나마이신과 리팜피신를 포함하는 LB media에서 밤새 배양하였다. 이렇게 만들어진 배양액을 이용하여 주사기 침윤용 50 mL LB 배양액을 만들거나 진공 침윤용 400 mL LB 배양액을 만들었다.

MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M의 Nicotiana benthamiana 에서의 발현

아그로박테리움-매개 침윤을 위해 야생종 N. benthamiana를 재배하였다. 식물은 씨를 이용하여 24℃, 40-65% 상대습도, 장일조건 (14 h 광/10 h 암 상태) 광 세기가 130-150 μE m-2 sec-1의 조건에서 재배하였다. 6주 키운 식물을 아그로박테리움-매개 침윤에 사용하였다. 상기 실시예 3의 1 mL의 아그로박테리움 배양액을 카나마이신 및 리팜피신(50 mg/L and 100 mg/L)을 포함하는 50ml LB 배양액에 첨가하였다. 16 시간 동안 배양 후 아크로박테리움를 8분 동안 28℃에서 4000xg 조건에서 원심분리 하여 회수하였다. 상등액은 버리고 아크로박테리움의 침전물은 침윤 버퍼(10 mM MES, 10 mM MgSO4. 7H2O; pH 5.7)에 녹였다. 세포의 농도는 침윤 버퍼를 이용하여 OD600 에서 0.8 이 되도록 하였다. 그런 후 400 μM 아세토신린곤 (acetosyringone)을 아그로박테리움 용액에 첨가 하였으며, 실온에 2 시간 동안 두었다. 주사기를 이용한 침윤은 주사바늘 없는 1mL 크기의 주사기를 사용하였다. 동시에 유전자 침묵 억제 (gene silencing suppression) 유전자인 turnip crinkle virus의 코트 단백질(coat protein)의 유전자인 P38이 들어 있는 바이너리 (binary vector)를 동시-침윤하였다. 이를 위해서 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 또는 MSC-Saz-M 재조합 유전자와 P38을 각각의 아그로박테리움에 도입한 후 적절한 농도의 아그로박테리움 배양액을 1:1의 비율로 섞어서 N. benthamiana 잎에 침윤하였다. 침윤한 후 3, 5, 7일째에 총 단백질 추출물을 N. benthamiana 잎 조직으로부터 확보하여 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 수행하여 발현 수준을 확인하였다. 전체 단백질 추출물은 추출용 버퍼(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X100, 2mM DTT and 1% protease inhibitor cocktail)를 이용하여 제조하였으며, 여기에 5× sample buffer (250 mM Tris-HCl [pH 6.8], 10% SDS, 0.5% bromophenol blue, 50% 글리세롤 v/v, and 500 mM DTT)를 최종 1× 농도로 첨가하여 전기영동 단백질 샘플(sample)을 만들었다. 단백질 추출물 샘플을 5 분 동안 끓인 후 10% SDS-PAGE 를 통해서 전개한 후 이를 anti-CBM3 항체(antibody)를 이용하여 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 수행하였다. 그 결과 MSC-GcCAHα3은 3, 5과 7일째 얻어진 단백질 추출물 사이에 커다란 발현의 차이는 보이지 않았다. 하지만 아그로박테리움의 스트레인(strain) 따라서 차이를 나타내었으며, EHA105가 더 높은 발현을 보였다 (도 1C). MSC-Saz도 3,5,7일째 얻어진 단백질 추출물 사이에서는 큰 차이가 없었고, 아그로박테리움 스트레인에 따른 차이도 없었다. 66 kD 밴드 아래에 위치에 강한 밴드가 나타났으며, 그것의 두 배 정도의 크기인 116 kD 위치(position)에 5일과 7일의 샘플에서 약한 밴드를 확인하였다. 이는 다이머에 해당하는 단백질로 추정되었다 (도 1F). MSC-GcCAHα3-M은 5일 째 얻은 단백질 추출물이 3일 및 7일보다 높은 발현을 보였고, 아그로박테리움의 스트레인(strain) 따라서 차이를 나타내었으며, EHA105가 더 높은 발현을 보였다 (도 2C). MSC-Saz-M도 MSC-Saz와 비슷한 경향을 보이는 것을 확인하였다 (도 2F). 이를 보아 M 도메인을 벡터 융합함에 있어서, M1 및 M2로 나누어 융합하는 것이 단백질의 발현을 더욱 높인다는 것을 확인하였다. 아그로박테리움 EHA105이 더 높은 발현을 보인다는 것을 확인하였다.

셀룰로스 비드를 이용한 재조합 단백질 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M의 순수 분리

CBM3는 셀룰로스 (cellulose)에 대해서 높은 결합 친화성을 갖는다. 이러한 성질을 이용하여 CBM3를 단백질 분리용 친화성 수지(affinity resin)로 사용하였다. N. benthamiana 의 잎 조직을 액체질소에 넣고 막자와 사발을 이용하여 분말로 만들었다. 40 mL의 추출용 버퍼 (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X100, 2 mM DTT and 1% protease inhibitor cocktail)를 잎 조직 분말(20g)에 첨가하였다. 샘플(Samples)을 3-4 분 동안 호모제네이트 (homogenate)를 이용하여 볼텍싱(vortexing)하여 추출물을 만들었다. 세포 파괴물(Cell debris)를 14000 x g에서 20 분 동안 원심분리 하여 제거하였다. 원심분리 후 상등액에 10 g의 셀룰로스 비드(500 μM 평균 크기)를 첨가 한 후 4℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 셀룰로스 비드에 결합한 단백질을 1000 x g에서 2 분 동안 원심 분리하여 확보하였다. 셀룰로스 비드를 40 mM Tris, pH 7.5 용액을 이용하여 최소한 4 번 세척하였다. 식물에서 생산한 재조합 단백질 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M을 포함하는 다양한 양 (1μl ~ 20μl)의 N. benthamiana 총 잎 추출물을 이용하여 10 mg의 셀룰로스 비드의 CBM3의 결합력을 결정하였다. 셀룰로스 비드에 결합한 부분과 결합하지 않은 부분으로 나누고 이를 SDS-PAGE를 통해서 전개하고 난 후 이를 CBM3 항체(antibody)를 이용하여 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 통해서 CBM3의 셀룰로스 결합력을 결정하였다. 도 3에서 나타난 것과 같이 MSC-GcCAHα3은 4 μl의 총 추출물를 셀룰로스 비드와 섞었을 때 아주 소량의 CBM3 밴드가 결합하지 않은 부분에서 나타나기 시작했으며, 10 μl과 20 μl에서는 절반정도가 결합하지 않은 부분에서 나왔다. 이를 통해서 총 단백질 추출물 4 μl에 있는 CBM3의 양이 셀룰로스 비드를 포화(saturation)을 조금 넘긴 양이라 판단하였다. MSC-GcCAHα3-M은 2 μl의 총 추출물까지 셀룰로스 비드와 섞었을 때 CBM3 밴드가 결합하지 않은 부분이 나타나지 않았고, 4 μl과 10μl에서는 절반정도가 결합하지 않은 부분에서 나왔다 (도 3). 이를 통해서 총 단백질 추출물 2μl에 있는 CBM3의 양이 셀룰로스 비드를 포화(saturation)을 조금 넘긴 양이라 판단하였다. MSC-Saz 및 MSC-Saz-M은 총 단백질 추출물이 20 μl까지 셀룰로스 비드와 섞었을 때 CBM3의 밴드가 결합하지 않는 밴드가 나타지 않았다. 이를 통해서 총 단백질 추출물 20μl 이상의 양에 대해 CBM3의 양이 셀룰로스 비드를 포화(saturation)될 것이라고 판단하였다. 이러한 결합력을 이용하여 CBM3를 포함한 재조합 단백질을 순수 분리하였다. 이어서 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M의 CBM3 (cellulose binding module)를 이용하여 셀룰로스 비드를 가지고 순수 분리하고자 하였다. 총 잎 추출물을 셀룰로스 비드와 섞은 후 결합하지 않는 단백질을 제거하였다. 이를 flow through fraction으로 모으고, 이어서 셀룰로스 비드를 세척액을 이용하여 4번 세척하였다. 세척 1회부터 4회까지 선별하였다. 그리고 셀룰로스 비드에 밀착해서 결합한 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M을 끓여 용리하여 이를 용리한 부분으로 모집하였다. 이들 부분을 SDS-PAGE를 통해서 분리하고 CBM3 항체를 이용하여 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 수행하였다 (도 4 및 도 5). 이를 통해서 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M이 셀룰로스 비드에 밀착되게 결합하며 거의 순수하게 분리 정제됨을 확인하였다. Western blot과 쿠마시 블루로 염색한 (Coomassie blue staining) 결과에 따르면 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M이 68 kD 위치에 나타나며, 116 kD 위치(position)보다 더 큰 크기로 또 다른 밴드로 나타났다 (도 4 및 도 5). 68 kD 위치(position)의 단백질도 doublet으로 존재하고 있으며, 이는 M 도메인 등에 존재하는 N-glycosylation site들의 다른 당화(differential glycosylation)에 의한 것으로 예측된다. 그리고 116 kD position 위의 밴드는 멀티머로 판단되었다. 탄산무수화효소가 테트라머(tetramer)와 같은 멀티머로 존재하는 것은 잘 알려져 있다.

[비교예 1]

대장균에서 탄산무수화효소의 발현 및 분리

대조군 단백질 (GcCAHα3 자유형)을 만들기 위해 우리는 GcCAHα3의 코딩 영역을 갖는 플라스미드를 생성시켰다. 신호 서열이 없는 GcCAHα3의 코딩 영역을 Gracilariopsis chorda 게놈 DNA로부터 주형으로하여 지정된 프라이머 (forward, 5'-cgggatccgaggaaatcgaggtcgac-3', reverse, 3'-ccgctcgagttaggacacgtagcaagt-5')를 갖는 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 생성물을 BamHI 및 XhoI 제한 효수를 사용하여 pRSET-A 벡터 (Invitrogen)에 삽입시켰다. pRSET-A 벡터는 N- 말단에 His6 태그를 함유하고 있으며, 결과 컨스트럭트인 His6:GcCAHα3을 단백질 발현을 위해 대장균 BL21 (DE3) 균주에 도입 하였다. His6:GcCAHα3 발현 플라스미드를 전기천공법(electroporation)을 통해 대장균 BL21 (DE3)에 도입하고, 단일 콜로니를 5 mL LB 액체 배지에서 밤새 배양 하였다. 다음날, 5 mL 배양액을 암피실린 (100 μg / mL)이 들어있는 200 mL LB 액체 배지로 옮겼다. 배양액이 600nm에서 OD 값이 0.6에 도달하면 (3-4 시간 배양 후) 배양 온도를 30 ℃로 낮추었다. IPTG를 0.1 mM ZnSO4와 함께 1 mM의 최종 농도로 하여, 대장균을 18 ℃에서 밤새 항온 배양 하였다. 그런 다음 세포를 5,000 x g에서 10 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 수집하고 펠렛을 -20 ℃에서 보관했다. 동결 된 펠렛을 얼음 위에서 15 분 동안 해동시키고, 1 mM 페닐메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF)를 함유하는 5 ㎖의 빙냉 인산 완충 식염수 (PBS; 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4), 1 mM dithiothreitol (DDT), 1 % 프로티에이제 억제제 (1 μg / mL leupeptin 및 1 μg / mL pepstatin)를 포함한 용액에 용해하였다. 박테리아 세포는 초음파 생성기 VC 505 / VC 750 장치 (Sonics, Newtown, CT, USA)를 사용하여 얼음 위에서 5-10 분 동안 40 % 진폭에서 3-5 초 펄스를 사용하여 초음파 처리에 의해 파쇄되었다. 세포 추출물을 14,000 × g에서 20 분 동안 원심 분리하여 분리하고, 상등액을 수집 하였다. Ni2+-NTA 슬러리 (1 mL, 0.5 mL 베드 부피)를 15 mL 튜브에 첨가하고 잠시 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고, 2 mL의 용해 완충액을 튜브에 첨가 하였다. 천천히 섞은 후, Ni2+-NTA 수지를 다시 원심 분리하고 상등액을 버렸다. 맑은 박테리아 용해물을 Ni2+-NTA 수지에 첨가하고 회전식 진탕기를 사용하여 4 ℃에서 60 분간 200 x g으로 흔들어 주면서 부드럽게 혼합하였다. 용해물-Ni2+-NTA 혼합물을 바닥 출구가 덮인 컬럼에 넣었다. 하부캡을 제거한 후, 용출액을 수집 하였다. 컬럼을 베드 부피 (2.5 mL)의 5 배에 해당하는 세척 완충액으로 2 회 세척 한 다음, 30 mM 이미다졸을 함유하는 세척 완충액으로 4 회 이상 세척 하였다. 250 mM 이미다졸을 함유하는 용출 완충액으로 단백질을 용출시켰다. 용출된 단백질을 5 개의 튜브로 나누고 활성 분석을 위한 대조 단백질로 사용 하였다.

SazCA에 대한 자유로운 모양의 대조군 단백질을 만들기 위하여, SazCA 단편을 합성 된 SazCA 유전자로부터 지정된 프라이머 (forward, 5'-gctggatccatgaaaaaattcatactgagc-3 ', 역방향, 3'- gggccgaattcttaattagattccaagatgtatcggct-5')를 갖는 PCR에 의해 증폭시키고 PCR 생성물을 pRSET-A 벡터 (Invitrogen BamHI 및 EcoRI 제한 효소를 사용하여 자른 훈 여기에 삽입하였다. 이렇게 제작된 플라즈미드는 SazCA의 N-말단에 His6 태그를 포함하게 된다. 이 컨스트럭트로부터 His6:SazCA 단백질 발현을 위해 대장균 BL21 (DE3) 균주에 전기 충격법을 이용하여 도입 하였다 [31]. 이로부터 단일 콜로니를 확보하고 이를 진탕기내 5 mL LB 액체 배지에서 밤새 배양 하였다. 다음날, 5 mL 배양액을 암피실린 (100 μg / mL)이 들어있는 200 mL LB 액체 배지로 옮겼다. 배양액이 600 nm (OD600)에서 0.6 내지 0.8의 광학 밀도에 도달하면 (배양 3-4 시간 후), 배양 온도를 30 ℃로 낮추었다. IPTG를 0.1 mM ZnSO4와 함께 1 mM의 최종 농도가 되도록 첨가하고, 대장균을 18 ℃에서 밤새 항온 배양 하였다. 그런 다음 대장균을 5,000 x g에서 10 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 수집하고 펠렛을 -20 ℃에서 보관했다. 동결 된 펠렛으로부터 His6:SazCA는 위의 His6:GcCAHα3을 대장균으로부터 얻는 방법과 동일하게 분리 정제하였다.

식물에서 생산한 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M의 정량

MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M을 정량하기 위해서 셀룰로스 비드에 결합된 단백질을 끓여 용리하였다. 그리고 셀룰로스 비드에 결합된 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M을 100% 에틸렌 글리콜( ethylene glycol(EG))을 이용하여 용리하였다. EG로 용리한 양은 브래드포드 어세이 (Bradford assay)를 이용하여 정확히 정량 하였다. 그런 후 알려진 양의 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M을 로딩(loading)하고 끓여 용리한 양을 1 μl에서부터 8 μl까지 로딩하여 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 통해서 신호 강도를 비교하여 셀룰로스 비드에 결합 한 양을 정량 하였다. 이를 통해서 식물에서 발현되는 양을 추정하였다. 그 결과 잎의 생중량(fresh weight) 1g으로부터 100 μg의 탄산무수화 효소가 단백질 발현 된다는 것을 확인 할 수 있었다 (도 6).

식물 생산 재조합 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M를 셀룰로스 비드에 고정하여 이산화탄소의 수화 반응에 이용 및 열 안정성 증진

탄산무수화효소를 이용하여 이산화탄소의 수화반응을 유도할 때 다양한 조건에서 할 수 있다. 탄산무수화효소를 고체의 표면에 부착하는 경우 재활용을 위한 회수, 반응물로부터 분리 등에서 유리한 조건을 제공한다. 셀룰로스 비드의 표면에 부착한 형태의 탄산무수화효소가 이산화탄소의 수화반응을 어느 정도 유도하는지를 확인하기 위해서 대장균에서 분리 정제한 자유형의 탄산무수화효소와 활성을 비교하였다. 이 두 형태의 탄산무수화효소는 이산화탄소의 수화반응의 효율에 있어서 거의 차이가 없는 것으로 나타났다. 또한 탄산무수화효소를 이용한 CO2 수화반응에 있어서 가장 중요한 성질 중 하나는 열 안정성이다. 따라서 셀룰로스 비드에 고정된 상태로의 식물 생산 재조합 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M에서 분리한 정제한 GcCAHα3의 열 안정성을 확인하기 위해서 70 ℃에서의 안정성을 확인하였다. 대조군으로 대장균에서 분리 정제한 자유형(free form)의 GcCAHα3를 사용하였다. 셀룰로스 비드에 고정된 GcCAHα3 재조합 단백질을 분취하여 물중탕기 (Finemould Precision Ind. Co, Korea)를 이용하여 70℃에서 물중탕 하였다. 단백질 침강물을 4℃, 10,000× g에서 5 분 동안 원심 분리하여 제거 하였다. 상등액을 단백질 활성을 측정할 때가지 4 ℃에 보관하였으며, 단백질의 활성은 Wilbur-Anderson 기법을 이용하여 측정하였다. Wilbur and Anderson (1948) 방법에서 탄산무수화효소의 활성은 0℃에서 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3)에 CO2가 포화된 수용액을 첨가한 후 pH가 8.3에서 6.3까지 내려가는 시간 (초)을 측정하여 결정하였다. 효소 없이 측정한 시간을 Tb 라 하며, 효소를 가지고 측정한 시간을 Tc 라 하였다. Blank 값을 결정하기 위해서 6.0 ml의 냉각된 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.3를 20 ml beaker에 더하고 0-4 ℃에 1 시간 동안 유지한 후 pH를 기록하였다. 4 ml 의 얼음을 이용하여 냉각한 CO2가 포화된 물을 Tris buffer에 첨가하였다. 즉시 pH가 8.3으로부터 6.3까지 변화하는 시간을 기록하여 이를 Tb 값으로 하였다. 마찬가지로 효소의 활성을 측정하기 위해서 6.0 ml의 ice-chilled 20 mM M Tris-HCl buffer, pH 8.3를 20 ml beaker에 더하고 0-4℃에 1 시간 동안 유지한 후 pH를 기록한다. 여기에 0.1 ml 의 희석한 효소 용액을 더한다. 빠르게 4 ml의 CO2 포화 수용액을 첨가한 후 pH가 8.3으로부터 6.3까지 떨어지는 시간을 측정하여 이를 Tc 값으로 하였다.

효소활성의 계산

U=10 ((T_(b )/T_(c ) )-1)/(mg protein)

열처리 후 단백질의 잔존 활성(%)은 열처리한 후 의 단백질의 활성과 열처리 하지 않은 단백질의 활성의 비를 이용하여 구하였다. 상기 재조합 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M에서 분리한 정제한 GcCAHα3; 및 대장균에서 분리 정제한 GcCAHα3를 70℃에 계속해서 배양하면서 하면서 매주 활성을 확인하였다. 활성은 GcCAHα3의 CO2에 대한 수화반응을 이용하여 활성을 측정하였다. 그 결과 MSC-GcCAHα3 및 MSC-GcCAHα3-M에서 분리한 정제한 GcCAHα3은 가열함에 따라서 활성이 증가 되었으며, 1 주에서부터 2 주까지는 활성에 거의 차이를 보이지 않았다. 하지만 3, 4 주에는 셀룰로스 비드에 고정된 것이 조금 낮은 것으로 나타나지만 실제로 5주, 6주에는 서서히 활성이 떨어졌으며, 최종 확인한 6주에 원래 초기에 가열을 하지 않았던 활성을 갖는 정도로 감소하였다. 반면에 자유형 (free form)의 GcCAHα3은 5주, 6주에는 급격히 활성이 줄어드는 것을 나타내었으며, 5 주차에 원래 가열하기 전에 가지고 있던 활성의 50%까지 줄어들었으며, 6 주차에는 거의 활성이 없어진 상태가 되었다 (도 7). 이를 통해서 셀룰로스 비드에 고정한 형태의 GcCAHα3이 더 오랫동안 열 안정성을 유지하는 것을 확인하였다. 또한 여기에서 식물 생산 GcCAHα3와 대장균 생산 GcCAHα3 사이에는 두 배의 분자량에 차이가 있으므로 실제로 셀룰로스 비드에 고정한 단백질의 활성이 두 배 정도 높을 것으로 예상하였다. MSC-Saz 및 MSC-Saz-M 에서 분리한 정제한 GcCAHα3은 두 샘플 다 가열하지 않은 샘플에 비해서 70℃에서 가열을 하면 활성이 높아졌다. 2 주 동안 가열 하였을 경우 활성이 두 배 정도 증가 하였다. 이렇게 활성이 증가 된 채로 3 주 동안 유지되다가 4 주째에 낮아졌으며, 6 주째에 처음 가열하기 전의 활성 수준으로 낮아졌다. Free form도 유사한 활성 커브를 보였으며, 5 주째에 처음 가열하기 전의 활성 수준 보다 낮아졌다. 이를 통해서 셀룰로스 비드에 고정된 SazCA가 대장균에서 발현한 자유형 (free form)에 비해서 고온 저항성이 높다는 것을 확인 할 수 있었다 (도 7).

셀룰로스 비드에 고정된 재조합 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M를 이용한 내구성

셀룰로스 비드에 고정한 단백질은 재사용이 가능하다. 따라서 식물생산 재조합 단백질인 MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M에서 분리 정젱한 GcCAHα3 의 활성의 재사용 정도를 확인하였다. 자유형(Free form)인 대장균에서 분리 정제한 GcCAHα3를 대조군으로 사용하였다. 10 μg의 단백질을 CO2-포화된(4 mL)의 물에 더하고 이를 얼음으로 냉각된 6 mL of 20 mM Tris buffer (pH 8.3) 에 섞어서 반응을 유도하고, pH가 8.3에서 6.3으로 바뀌는데 걸리는 시간을 측정하여 단백질의 활성을 측정하였다. 이렇게 측정된 반응 시간을 Wilbur-Anderson formula를 이용하여 비활성(specific activity)으로 변환하였다. 자유형(Free form)의 GcCAHα3 비활성(specific activity)는 5722 Wilber-Anderson units (WAU)/mg였으며, MSC-GcCAHα3 또는 MSC-GcCAHα3-M에서 분리하고 정제한 GcCAHα3의 비활성(specific activity)는 5200 WAU/mg 였다 (도 8). 자유형(Free form)의 GcCAHα3 비활성(specific activity)는 8200 Wilber-Anderson units (WAU)/mg였으며, MSC-Saz 또는 MSC-Saz-MD에서 분리하고 정제한 GcCAHα3의 비활성(specific activity)는 8200 WAU/mg 였다 (도 8). 이는 분자량이 식물에서 분리 정제한 MSC-GcCAHα3이 대장균에서 생산한 자유형(free form)에 비해서 두 배가 크기 때문이다. 따라서 실제 활성은 식물생산 MSC-GcCAHα3이 거의 두 배의 활성을 갖는 것으로 추정하였다. 셀룰로스 비드에 결합한 단백질은 반응 후 다시 셀룰로스 비드를 회수하여 새로이 동일한 반응을 유도하였고, 이를 10회 반응 시에도 전혀 활성에 변화가 없었다. 이를 통해서 셀룰로스 비드에 고정한 MSC-GcCAHα3가 오랫동안 사용할 수 있을 것으로 예상하였다. 이어서 실제로 계속적으로 셀룰로스 비드에 결합한 단백질의 사용 가능성을 확인하였다. 이를 위해서 도 9와 같은 반응 시스템을 구축하였다. MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-MD에서 분리 정제한 MSC-GcCAHα3가 고정된 셀룰로스를 이용하여 컬럼 구축하고 CO2가 포화(saturation)된 물을 주입 펌프(infusion pump)를 이용하여 지속적으로 공급하였다. 그리고 컬럼의 아래에서 바이카보네이트 (bicarbonate (HCO3-)) 용액을 수집하였다(도 9). 그리고 여기에 5 ml의 0.1 M CaCl2를 함유한 0.2 M Tris buffer (pH 10.5)를 첨가하여 CaCO3 형성을 유도하였다. CO2가 GcCAHα3의 수화 반응을 통하여 바이카보네이트 (bicarbonate) 이온으로 변화하면 이는 pH 10.5와 같은 높은 pH에서 Ca2+와 순간적으로 결합하여 CaCO3를 형성한다. 침전된 CaCO3는 회수하여 60°C에서 4 시간 말려서 무게를 측정하였다. MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M에서 분리 정제하고 셀룰로스 비드에 고정된 GcCAHα3의 비활성(specific activity)를 40 동안 측정하였다. MSC-GcCAHα3, MSC-Saz, MSC-GcCAHα3-M 및 MSC-Saz-M에서 분리 정제하고, 셀룰로스 비드에 고정한 GcCAHα3:CBM3 활성이 조금씩 시간에 따라 감소하였지만 40일 동안 90% 이상을 유지하였다 (도 10). 이를 통해서 셀룰로스 비드에 고정한 GcCAHα3가 활성을 오랫동안 유지한다는 결론을 얻었다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION BioCompanion Inc. <120> A Method of mass production of carbonic anhydrase in plant <130> 1065296 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 287 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid of GCCAHa3 <400> 1 Met Asn Phe Phe Ala Thr Ala Ser Val Phe Leu Leu Phe Leu Ser Val 1 5 10 15 Ala Leu Pro Val Arg Ala Asn Glu Glu Ile Glu Val Asp Thr Ala Gly 20 25 30 Cys Pro Val Lys Ser Ala Gln Gly Asp Phe Ser Tyr Asp Met Thr Leu 35 40 45 Pro Asn Asn Pro Thr Arg Trp Gly Asp Ile Lys Glu Asp Phe Ala Thr 50 55 60 Cys Lys Glu Gly Glu Lys Gln Ser Pro Ile Asn Phe Pro Ala Asn Val 65 70 75 80 Gln Tyr Ala Pro Lys Ser Ala Gly Pro Lys Ser Gln Met Ser Leu Ala 85 90 95 Asn Met Thr Phe Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Trp Ala Met Ser Cys Ser 100 105 110 Asp Glu Ser Gly Ser Cys Gly Lys Thr Ser Phe Ala Gly Lys Thr Tyr 115 120 125 Glu Leu Ile Asn Val His Phe His Ser Pro Ser Glu His Lys Leu Phe 130 135 140 Gly Lys Glu Tyr Pro Leu Glu Cys His Met Val His Ala Ala Glu Asp 145 150 155 160 Gly Ser Leu Ala Val Val Gly Met Met Phe Glu Tyr Ala Glu Gln Thr 165 170 175 Ser Tyr Pro Ala Arg Ile Tyr Gln Asn Val Val Glu Glu Tyr Gly Asp 180 185 190 Asn Val Val Phe Ser Thr Ile Leu Gly Gly Val Lys Ser Asp Arg Gly 195 200 205 Glu Trp Ala Val Pro Val Gly Gln Leu Val Asn His Asn Lys Gly Tyr 210 215 220 Cys Ser Tyr Ser Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys Thr Glu Ser Val 225 230 235 240 Thr Trp Phe Met Ser Met Asn Ile Trp Thr Val Ser Glu Arg Gln Val 245 250 255 His Asp Tyr Val Arg Thr Val Gly Thr Ser Ile Glu Gly Asn His Arg 260 265 270 Pro Val Gln Pro Leu Asn Glu Arg Pro Val Thr Cys Tyr Val Ser 275 280 285 <210> 2 <211> 864 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCCAHa3 <400> 2 atgaacttct tcgctaccgc ctccgtcttt ctactcttct tgtccgtcgc cctccccgtg 60 cgggcgaacg aggaaatcga ggtcgacacc gccggctgcc ccgtcaagag cgcccaagga 120 gacttcagtt atgacatgac tcttccaaac aaccccaccc gctggggcga catcaaggag 180 gacttcgcca catgcaagga aggagaaaag caatcgccca tcaacttccc cgccaacgtt 240 caatacgccc cgaaatcggc cggacccaag tctcaaatgt cgctcgcaaa catgaccttt 300 ggcgcctcct cctacaactg ggccatgtcc tgcagcgacg aatccggatc gtgtggaaag 360 acctccttcg ctggaaagac ctatgaactt atcaatgttc acttccactc cccgagtgag 420 cacaagttgt tcggcaaaga atatccgctt gaatgtcaca tggtgcatgc tgccgaggat 480 ggatcgcttg ctgtggtcgg aatgatgttt gagtacgccg aacaaacctc ctatcccgcc 540 agaatttacc agaacgtcgt tgaggaatat ggcgacaacg tcgtcttttc cactattttg 600 ggaggcgtca agagcgatcg tggagaatgg gctgtgccgg tgggtcaact ggtcaaccat 660 aacaagggat attgctccta ctccgggtcg ctcaccacac cgccttgcac tgaaagtgtc 720 acctggttca tgtctatgaa catctggacc gtgtctgaac gacaggtgca tgactacgtc 780 cgaacggttg gcaccagcat tgagggaaat catcgaccgg ttcaaccact caacgaacgt 840 ccggtcactt gctacgtgtc ctaa 864 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 UTR <400> 3 tctagaatta ttacatcaaa acaaaaa 27 <210> 4 <211> 273 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP <400> 4 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt taa 273 <210> 5 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M DOMAIN (AMINO ACID) <400> 5 Ala Asn Ile Thr Val Asp Tyr Leu Tyr Asn Lys Glu Thr Lys Leu Phe 1 5 10 15 Thr Ala Lys Leu Asn Val Asn Glu Asn Val Glu Cys Gly Asn Asn Thr 20 25 30 Cys Thr Asn Asn Glu Val His Asn Leu Thr Glu Cys Lys Asn Ala Ser 35 40 45 Val Ser Ile Ser His Asn Ser Cys Thr Ala Pro Asp 50 55 60 <210> 6 <211> 230 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M DOMAIN <400> 6 ggatcccgat ggcaaacatc actgtggatt acttatataa caaggaaact aaattattta 60 cagcaaagct aaatgttaat gagaatgtgg aatgtggaaa caatacttgc acaaacaatg 120 aggtgcataa ccttacagaa tgtaaaaatg cgtctgtttc catatctcat aattcatgta 180 ctgctcctga tggtggagga ggttctggtg gtggatcaac tagtcatatt 230 <210> 7 <211> 240 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SUMO <400> 7 aatttgaaag tgaagggaca ggacggaaac gaggttttct tccgtatcaa aagatcaaca 60 caactcaaga aactcatgaa tgcttactgc gatagacaaa gcgtggacat gacagctata 120 gctttcctat ttgatgggag aaggttgaga gcggaacaga ctccggatga gcttgaaatg 180 gaagatggag atgagattga cgcaatgtta catcagactg gtgccggcgg tcccgggggt 240 240 <210> 8 <211> 498 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBM3 <400> 8 ggaggaggtt caggtggtac cgtatcaggt aaccttaagg tggagtttta caactcgaac 60 ccttctgata caactaactc aataaaccca cagttcaaag ttacaaacac aggcagctct 120 gcgatcgatt tgtctaaatt aaccctcaga tactattata cggttgatgg acagaaggac 180 cagactttct ggtgtgatca tgcagctatc attggttcta acggtagcta caacggaatt 240 acatcaaacg tgaagggcac tttcgttaag atgtcctcta gcactaacaa cgcagacaca 300 tatttggaga tcagttttac ggggggaacc cttgaaccag gtgctcacgt ccagattcaa 360 ggaagattcg ctaaaaacga ctggtcgaac tatacccaaa gtaatgatta cagttttaaa 420 tccgcctcac aatttgttga gtgggatcag gtcactgctt acctgaacgg ggttctagtg 480 tggggaaagg aacctggt 498 <210> 9 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDEL <400> 9 catgacgagc tt 12 <210> 10 <211> 2153 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FULL EXPRESSION CASSETTE (FULL SEQUENCE): BIP_M_GCCAHa3 _CBM3_HDEL <400> 10 tctagaatta ttacatcaaa acaaaaaatg gctcgctcgt ttggagctaa cagtaccgtt 60 gtgttggcga tcatcttctt cggtgagtga ttttccgatc ttcttctccg atttagatct 120 cctctacatt gttgcttaat ctcagaacct tttttcgttg ttcctggatc tgaatgtgtt 180 tgtttgcaat ttcacgatct taaaaggtta gatctcgatt ggtattgacg attggaatct 240 ttacgatttc aggatgttta tttgcgttgt cctctgcaat agaagaggct acgaagttaa 300 ggatcccgat ggcaaacatc actgtggatt acttatataa caaggaaact aaattattta 360 cagcaaagct aaatgttaat gagaatgtgg aatgtggaaa caatacttgc acaaacaatg 420 aggtgcataa ccttacagaa tgtaaaaatg cgtctgtttc catatctcat aattcatgta 480 ctgctcctga tggtggagga ggttctggtg gtggatcaac tagtcatatt aatttgaaag 540 tgaagggaca ggacggaaac gaggttttct tccgtatcaa aagatcaaca caactcaaga 600 aactcatgaa tgcttactgc gatagacaaa gcgtggacat gacagctata gctttcctat 660 ttgatgggag aaggttgaga gcggaacaga ctccggatga gcttgaaatg gaagatggag 720 atgagattga cgcaatgtta catcagactg gtgccggcgg tcccgggggt atgaacttct 780 tcgctaccgc ctccgtcttt ctactcttct tgtccgtcgc cctccccgtg cgggcgaacg 840 aggaaatcga ggtcgacacc gccggctgcc ccgtcaagag cgcccaagga gacttcagtt 900 atgacatgac tcttccaaac aaccccaccc gctggggcga catcaaggag gacttcgcca 960 catgcaagga aggagaaaag caatcgccca tcaacttccc cgccaacgtt caatacgccc 1020 cgaaatcggc cggacccaag tctcaaatgt cgctcgcaaa catgaccttt ggcgcctcct 1080 cctacaactg ggccatgtcc tgcagcgacg aatccggatc gtgtggaaag acctccttcg 1140 ctggaaagac ctatgaactt atcaatgttc acttccactc cccgagtgag cacaagttgt 1200 tcggcaaaga atatccgctt gaatgtcaca tggtgcatgc tgccgaggat ggatcgcttg 1260 ctgtggtcgg aatgatgttt gagtacgccg aacaaacctc ctatcccgcc agaatttacc 1320 agaacgtcgt tgaggaatat ggcgacaacg tcgtcttttc cactattttg ggaggcgtca 1380 agagcgatcg tggagaatgg gctgtgccgg tgggtcaact ggtcaaccat aacaagggat 1440 attgctccta ctccgggtcg ctcaccacac cgccttgcac tgaaagtgtc acctggttca 1500 tgtctatgaa catctggacc gtgtctgaac gacaggtgca tgactacgtc cgaacggttg 1560 gcaccagcat tgagggaaat catcgaccgg ttcaaccact caacgaacgt ccggtcactt 1620 gctacgtgtc ctaaggagga ggttcaggtg gtaccgtatc aggtaacctt aaggtggagt 1680 tttacaactc gaacccttct gatacaacta actcaataaa cccacagttc aaagttacaa 1740 acacaggcag ctctgcgatc gatttgtcta aattaaccct cagatactat tatacggttg 1800 atggacagaa ggaccagact ttctggtgtg atcatgcagc tatcattggt tctaacggta 1860 gctacaacgg aattacatca aacgtgaagg gcactttcgt taagatgtcc tctagcacta 1920 acaacgcaga cacatatttg gagatcagtt ttacgggggg aacccttgaa ccaggtgctc 1980 acgtccagat tcaaggaaga ttcgctaaaa acgactggtc gaactatacc caaagtaatg 2040 attacagttt taaatccgcc tcacaatttg ttgagtggga tcaggtcact gcttacctga 2100 acggggttct agtgtgggga aaggaacctg gtcatgacga gctttaactc gag 2153 <210> 11 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AMINO ACID SEQUENCE OF SAZCA <400> 11 Met Lys Lys Phe Ile Leu Ser Ile Leu Ser Leu Ser Ile Val Ser Ile 1 5 10 15 Ala Gly Glu His Ala Ile Leu Gln Lys Asn Ala Glu Val His His Trp 20 25 30 Ser Tyr Glu Gly Glu Asn Gly Pro Glu Asn Trp Ala Lys Leu Asn Pro 35 40 45 Glu Tyr Phe Trp Cys Asn Leu Lys Asn Gln Ser Pro Val Asp Ile Ser 50 55 60 Asp Asn Tyr Lys Val His Ala Lys Leu Glu Lys Leu His Ile Asn Tyr 65 70 75 80 Asn Lys Ala Val Asn Pro Glu Ile Val Asn Asn Gly His Thr Ile Gln 85 90 95 Val Asn Val Leu Glu Asp Phe Lys Leu Asn Ile Lys Gly Lys Glu Tyr 100 105 110 His Leu Lys Gln Phe His Phe His Ala Pro Ser Glu His Thr Val Asn 115 120 125 Gly Lys Tyr Tyr Pro Leu Glu Met His Leu Val His Lys Asp Lys Asp 130 135 140 Gly Asn Ile Ala Val Ile Gly Val Phe Phe Lys Glu Gly Lys Ala Asn 145 150 155 160 Pro Glu Leu Asp Lys Val Phe Lys Asn Ala Leu Lys Glu Glu Gly Ser 165 170 175 Lys Val Phe Asp Gly Ser Ile Asn Ile Asn Ala Leu Leu Pro Pro Val 180 185 190 Lys Asn Tyr Tyr Thr Tyr Ser Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys Thr 195 200 205 Glu Gly Val Leu Trp Ile Val Leu Lys Gln Pro Ile Thr Ala Ser Lys 210 215 220 Gln Gln Ile Glu Leu Phe Lys Ser Ile Met Lys His Asn Asn Asn Arg 225 230 235 240 Pro Thr Gln Pro Ile Asn Ser Arg Tyr Ile Leu Glu Ser Asn 245 250 <210> 12 <211> 761 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BACTERIAL CARBONIC ANHYDRASE (SAZCA) FROM SULFURIHYDROGENIBIUM AZORENSE <400> 12 atgaaaaaat tcatactgag catactcagt ctatccatcg tctcaatagc gggagagcat 60 gccattctgc aaaaaaatgc agaggtacat cactggtcat atgaaggtga aaacggtcca 120 gagaattggg caaaattgaa cccggaatat ttttggtgca acctgaagaa tcagtctccc 180 gtggatatat ctgacaatta taaggtgcac gcaaagctgg aaaaattgca tatcaactac 240 aataaagcag tcaatcctga gatagtgaat aatgggcaca caattcaggt gaatgtcctt 300 gaggacttta agctaaatat aaaaggaaaa gagtatcatc tcaaacagtt ccatttccat 360 gcaccgagtg aacacaccgt caacggaaaa tactatccct tggagatgca cctggtacat 420 aaagataaag acggtaacat cgctgtcatc ggggtttttt ttaaggaagg taaggcgaac 480 ccagaactcg ataaagtctt caaaaacgcc ctgaaggaag agggctctaa ggtcttcgac 540 ggaagtataa acatcaacgc tttacttccg cccgtgaaga actactatac gtacagcggc 600 tcactgacaa ctccgccgtg cactgaagga gttttatgga ttgtactgaa gcagccgatt 660 accgcttcca agcagcaaat agaactcttt aagtcaataa tgaagcataa taacaatcga 720 cccacgcaac ctatcaatag ccgatacatc ttggaatcta a 761 <210> 13 <211> 1805 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FULL EXPRESSION CASSETTE (FULL SEQUENCE): BIP_M_SAZCA_CBM3_HDEL <400> 13 tctagaatta ttacatcaaa acaaaaaatg gctcgctcgt ttggagctaa cagtaccgtt 60 gtgttggcga tcatcttctt cggtgagtga ttttccgatc ttcttctccg atttagatct 120 cctctacatt gttgcttaat ctcagaacct tttttcgttg ttcctggatc tgaatgtgtt 180 tgtttgcaat ttcacgatct taaaaggtta gatctcgatt ggtattgacg attggaatct 240 ttacgatttc aggatgttta tttgcgttgt cctctgcaat agaagaggct acgaagttaa 300 ggatcccgat ggcaaacatc actgtggatt acttatataa caaggaaact aaattattta 360 cagcaaagct aaatgttaat gagaatgtgg aatgtggaaa caatacttgc acaaacaatg 420 aggtgcataa ccttacagaa tgtaaaaatg cgtctgtttc catatctcat aattcatgta 480 ctgctcctga tggtggagga ggttctggtg gtggatcaac tagtatgaaa aaattcatac 540 tgagcatact cagtctatcc atcgtctcaa tagcgggaga gcatgccatt ctgcaaaaaa 600 atgcagaggt acatcactgg tcatatgaag gtgaaaacgg tccagagaat tgggcaaaat 660 tgaacccgga atatttttgg tgcaacctga agaatcagtc tcccgtggat atatctgaca 720 attataaggt gcacgcaaag ctggaaaaat tgcatatcaa ctacaataaa gcagtcaatc 780 ctgagatagt gaataatggg cacacaattc aggtgaatgt ccttgaggac tttaagctaa 840 atataaaagg aaaagagtat catctcaaac agttccattt ccatgcaccg agtgaacaca 900 ccgtcaacgg aaaatactat cccttggaga tgcacctggt acataaagat aaagacggta 960 acatcgctgt catcggggtt ttttttaagg aaggtaaggc gaacccagaa ctcgataaag 1020 tcttcaaaaa cgccctgaag gaagagggct ctaaggtctt cgacggaagt ataaacatca 1080 acgctttact tccgcccgtg aagaactact atacgtacag cggctcactg acaactccgc 1140 cgtgcactga aggagtttta tggattgtac tgaagcagcc gattaccgct tccaagcagc 1200 aaatagaact ctttaagtca ataatgaagc ataataacaa tcgacccacg caacctatca 1260 atagccgata catcttggaa tctaatggag gaggttcagg tggtaccgta tcaggtaacc 1320 ttaaggtgga gttttacaac tcgaaccctt ctgatacaac taactcaata aacccacagt 1380 tcaaagttac aaacacaggc agctctgcga tcgatttgtc taaattaacc ctcagatact 1440 attatacggt tgatggacag aaggaccaga ctttctggtg tgatcatgca gctatcattg 1500 gttctaacgg tagctacaac ggaattacat caaacgtgaa gggcactttc gttaagatgt 1560 cctctagcac taacaacgca gacacatatt tggagatcag ttttacgggg ggaacccttg 1620 aaccaggtgc tcacgtccag attcaaggaa gattcgctaa aaacgactgg tcgaactata 1680 cccaaagtaa tgattacagt tttaaatccg cctcacaatt tgttgagtgg gatcaggtca 1740 ctgcttacct gaacggggtt ctagtgtggg gaaaggaacc tggtcatgac gagctttaac 1800 tcgag 1805

Claims

(i) 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 서열번호 6의 염기 서열을 포함하는 M 도메인;
(ii) SUMO (a small ubiquitin-related modifier);
(iii) 탄산무수화효소; 및
(iv) CBM3 (Cellulose-binding module 3);
를 포함하는, 식물에서 탄산무수화효소를 생산하기 위한 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 탄산무수화효소는 개꼬시레기(Gracilariopsis chorda) 또는 Sulfurihydrogenibium azorense에서 유래된, 재조합 벡터.
제 2항에 있어서, 상기 개꼬시레기(Gracilariopsis chorda)에서 유래된 탄산무수화효소의 유전자 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, 상기 Sulfurihydrogenibium azorense에서 유래된 탄산무수화효소의 유전자 서열은 서열번호 11의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는, 재조합 벡터.
제 3항에 있어서, 상기 개꼬시레기(Gracilariopsis chorda)에서 유래된 탄산무수화효소의 유전자 서열은 서열번호 2의 염기서열을 포함하고, 상기 Sulfurihydrogenibium azorense에서 유래된 탄산무수화효소의 유전자 서열은 서열번호 12의 염기서열을 포함하는, 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 M 도메인의 유전자 서열은 SUMO의 N-말단 앞에 위치하는, 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 도메인은 SUMO의 N-말단 앞; 및 CBM3의 N-말단 앞에 각각 위치하는, 재조합 벡터.
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제1항에 있어서, 상기 SUMO의 유전자는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는, 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 CBM3(cellulose-binding module 3)의 유전자는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는, 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프로모터를 추가로 포함하는, 재조합 벡터.
제 1항의 재조합 벡터로 형질 전환된 형질 전환체.
제 12항에 있어서, 상기 형질 전환체는 아그로박테리움(Agrobacterium)인, 형질 전환체.
(a) 제 1항에 따른 재조합 벡터를 제작하는 단계;
(b) 상기 재조합 벡터를 세포에 도입하여 형질 전환체를 제조하는 단계;
(c) 상기 형질 전환체를 배양하는 단계;
(d) 상기 배양한 형질 전환체를 식물에 침윤하는 단계; 및
(e) 상기 식물을 분쇄하여 셀룰로스 비드에 결합하는 단계;
를 포함하는 식물에서 탄산무수화효소를 생산하는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 셀룰로스 비드는 카르복실 메틸 셀룰로스(carboxyl methyl cellulose, CMC), 메틸 셀룰로스(methyl cellulose, MC), 무정형 셀룰로스 (amphous cellulose, AMC), 히드록시 에틸 셀룰로스(hydroxy ethyl cellulose, HEC) 및 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스(hydroxy propyl methyl cellulose, HPMC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 셀룰로스 비드를 이용하는, 식물에서 탄산무수화효소를 생산하는 방법.
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