WO2022015124A1 - 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 백신 조성물 - Google Patents

중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 백신 조성물 Download PDF

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spike
orf3a
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박영근
조병문
정문섭
이효진
유송연
조영란
박보영
길아름
전보현
오예은
박지호
조엘매슬로우
로버츠 크리스틴클레어
김미영
이정아
임희지
황윤호
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진원생명과학 주식회사
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Definitions

  • the present invention relates to a vaccine composition for preventing severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection.
  • Coronavirus disease-19 is a respiratory infection caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2).
  • SARS-CoV-2 is a novel single-stranded RNA beta-coronavirus newly discovered in Wuhan, China on December 23, 2019, and was named SARS-CoV-2 by the International Commission on Virus Classification in January 2020. Although the route of SARS-CoV-2 infection has not yet been clearly identified, some studies have reported that it is transmitted from bats to humans.
  • the genome of SARS-CoV-2 is non-segmented and about 30 kb in size encodes 10 proteins.
  • the ten proteins consist of one replicating polyprotein (open reading frames 1ab), four structural proteins (Spike, envelope, membrane and nucleocapsid), and five non-structural proteins (open reading frames 3a, 6, 7a, 8 and 10). Consists of.
  • SARS-CoV-2 can be transmitted from person to person and has a fairly high mortality rate, so it is a big problem both at home and abroad.
  • 167,511 cases occurred, of which 13,908 deaths were reported to the WHO, and the number of deaths is rapidly increasing even now.
  • SARS-CoV-2 Since its first discovery in China in 2019, SARS-CoV-2, which has been intensively transmitted in China, has been infected in more than 160 countries, including Korea, Japan, and Italy in 2020, and has a high transmission rate. There is a problem accompanying complications such as acute renal failure, and it is causing a big problem due to the high mortality rate and contagiousness.
  • the present inventors have completed the present invention by developing a DNA vaccine expressing Spike and ORF3a or nucleocapsid as a result of efforts to develop a vaccine for preventing severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection.
  • an object of the present invention is, (a) a SARS-CoV-2 Spike protein or a gene encoding the same and (b) a SARS-CoV-2 ORF3a protein or a gene encoding the same; Or SARS-CoV-2 nucleocapsid or a gene encoding it; to provide a vaccine composition for preventing severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection, including.
  • Another object of the present invention (a) SARS-CoV-2 Spike protein or a gene encoding the same and (b) SARS-CoV-2 ORF3a protein or a gene encoding the same; Or SARS-CoV-2 nucleocapsid or a gene encoding the same; to provide an immunogenic composition containing, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
  • Another object of the present invention (a) a gene encoding SARS-CoV-2 Spike protein and (b) a gene encoding SARS-CoV-2 ORF3a protein; Or a gene encoding the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein; to provide a bicistronic expression cassette comprising.
  • Another object of the present invention is to provide a vaccine composition for preventing severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection comprising the bicistronic expression cassette.
  • Another object of the present invention is to provide an immunogenic composition for preventing severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection comprising the bicistronic expression cassette.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection, comprising the step of treating the bicistronic expression cassette to the subject.
  • the present invention provides (a) SARS-CoV-2 Spike protein or a gene encoding the same and (b) SARS-CoV-2 ORF3a protein or a gene encoding the same; Or SARS-CoV-2 nucleocapsid or a gene encoding it; provides a vaccine composition for preventing severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection, including.
  • the present invention provides (a) SARS-CoV-2 Spike protein or a gene encoding the same and (b) SARS-CoV-2 ORF3a protein or a gene encoding the same; Or SARS-CoV-2 nucleocapsid or a gene encoding the same; it provides a, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 immunogenic composition comprising.
  • the present invention provides (a) a gene encoding SARS-CoV-2 Spike protein and (b) a gene encoding SARS-CoV-2 ORF3a protein; Or a gene encoding the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein; provides a bicistronic expression cassette comprising.
  • the present invention also provides a vaccine composition for preventing severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection comprising the bicistronic expression cassette.
  • the present invention also provides an immunogenic composition for preventing severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection comprising the bicistronic expression cassette.
  • the present invention also provides a method for preventing severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection, comprising the step of treating the bicistronic expression cassette to the subject.
  • the vaccine composition for preventing severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection includes Spike and ORF3a or nucleocapsid as antigens for SARS-CoV-2.
  • the vaccine composition has a significant antibody immune response and T-cell immune response induction effect by a plurality of co-expressed antigens compared to containing one antigen, and is widely used in the field of preventing severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection can be
  • 1A is a diagram showing a cleavage map of plasmid pGO-1002 containing genes encoding antigen Spike and ORF3a according to the present invention.
  • Figure 1b is a diagram showing the mechanism of post-translational modification of the peptide expressed by the plasmid pGO-1002.
  • Figure 2a is a diagram showing the result of confirming the generation of antigen Spike and OPF3a protein in cells transfected with the plasmid pGO-1002 through Western blotting.
  • Figure 2b is a diagram showing the result of confirming the generation of antigen Spike and OPF3a protein in the cells transfected with the plasmid pGO-1002 through immunofluorescence staining.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of evaluating the toxicity of the plasmid pGO-1002 according to the present invention in vivo.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of measuring the titer of the Spike antigen-specific binding antibody through the antibody immune response.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of measuring the titer of the ORF3a antigen-specific binding antibody through the antibody immune response.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of evaluating the T-cell immune response of spleen cells stimulated with Spike OLP through ELISpot analysis.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of evaluating the T cell immune response of spleen cells stimulated with ORF3a OLP through ELISpot analysis.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of evaluating the T cell immune response of spleen cells stimulated with Spike OLP and ORF3a OLP through ELISpot analysis.
  • 9 and 10 are diagrams showing the results of evaluating the neutralizing antibody titer through a plaque reduction neutralization assay.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of confirming the competitive binding ability with the ACE protein through the ACE receptor competition evaluation.
  • the present invention provides (a) a SARS-CoV-2 Spike protein or a gene encoding the same and (b) a SARS-CoV-2 ORF3a protein or a gene encoding the same; Or SARS-CoV-2 nucleocapsid or a gene encoding it; provides a vaccine composition for preventing severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection and a severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 immunogenic composition, including.
  • the gene encoding the Spike, ORF3a or nucleocapsid protein is preferably optimized with a human codon.
  • Spike refers to a multifunctional protein that mediates the entry of coronavirus into host cells
  • the Spike of SARS-CoV-2 consists of 1273 amino acids (Genebank Accession No. YP_009724390.1).
  • the virus removal effect ie, sterilization effect
  • MERS-CoV which is the same coronavirus
  • the gene encoding the Spike protein is optimized with human codons, and is preferably represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
  • ORF3a (open reading frame 3a) is the largest accessory protein in SARS-CoV-2, and consists of 275 amino acids (Genebank Accession No. YP_009724391.1).
  • the ORF3a is a protein involved in internalization of SARS-CoV-2 during endocytosis.
  • an open reading frame is an amino acid sequence and refers to a DNA nucleotide sequence to be translated.
  • the gene encoding the ORF3a protein is optimized with a human codon, and is preferably represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • nucleocapsid refers to a protein structure containing RNA or DNA, which is genetic information of a virus, inside.
  • the nucleocapsid consists of a sequence of 419 amino acids (Genebank Accession No. YP_009724397.2).
  • the gene encoding the nucleocapsid protein is optimized with human codons, and is preferably represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • a gene encoding a Spike protein is preferably contained in a bicistronic expression vector, but is not limited thereto.
  • a vaccine is a drug that imparts acquired immunity to an antigen, and is administered for the purpose of inducing specific and active immunity to SARS-CoV-2.
  • composition of the present invention may include one or more adjuvants or excipients or carriers suitable for constituting the composition.
  • the adjuvant that may be included in the composition of the present invention refers to a substance that enhances the immune response of an injected animal, and a number of different adjuvants are known to those skilled in the art.
  • the immune adjuvant includes Freund's complete and incomplete immune enhancers, vitamin E, nonionic blocking polymer, muramyl dipeptide, Quil A, mineral oil and non-mineral oil and Carbopol, water-in-oil type emulsion adjuvant, and the like. it is not going to be
  • excipients examples include aluminum phosphate, aluminum hydroxide, aluminum potassium sulfate, and the like.
  • the carrier that may be included in the composition of the present invention may be a pharmaceutically acceptable carrier, and examples of the pharmaceutically acceptable carrier include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol. , ethanol, and the like.
  • composition of the present invention may further comprise preservatives and other additives such as, for example, antimicrobial agents, antioxidants, chelating agents, inert gases, and the like.
  • the preservatives include formalin, thimerosal, neomycin, polymyxin B and amphotericin B, and the like.
  • the compositions of the present invention may comprise one or more suitable emulsifiers, such as Span or Tween.
  • the composition of the present invention may include a protective agent, and any protective agent known in the art can be used without limitation, which may include lactose (Lactose; LPGG) or trehalose (Trehalose; TPGG). It is not limited.
  • the composition is preferably for two administrations, and more preferably for two administrations at an interval of two weeks.
  • the composition comprises (a) a Spike protein; and (b) ORF3a or nucleocapsid protein; preferably, simultaneously induce immunogenicity.
  • the composition induces an antibody response and a T-cell immune response at the same time.
  • the present invention provides (a) a gene encoding a SARS-CoV-2 Spike protein and (b) a gene encoding a SARS-CoV-2 ORF3a protein; Or a gene encoding the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein; provides a bicistronic expression cassette comprising.
  • the present invention provides a vaccine composition for preventing severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection, and an immunogenic composition for preventing severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection, comprising a bicistronic expression cassette.
  • the gene encoding the Spike protein is preferably optimized with a human codon, and more preferably, the signal peptide unique to SARS-CoV-2 is replaced with an IgE leader sequence it is preferable to have
  • the gene encoding the Spike protein may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
  • the gene encoding the ORF3a protein is preferably optimized with a human codon, and more preferably an IgE leader sequence is added.
  • the gene encoding the ORF3a protein may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the gene encoding the nucleocapsid protein is preferably optimized with a human codon, and more preferably an IgE leader sequence is added.
  • the gene encoding the nucleocapsid protein may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • bicistronic refers to a system in which ribosomes can synthesize polypeptides even inside mRNA in eukaryotic cells, so that several proteins can be synthesized from one mRNA, and in the present invention (i ) Spike protein and ORF3a protein; or (ii) Spike protein and nucleocapsid protein; an expression cassette was designed so that it can be expressed simultaneously.
  • the expression cassette designed so that the Spike protein and the ORF3a protein can be expressed simultaneously, the gene encoding the Spike protein represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; and a gene encoding the ORF3a protein represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
  • an expression cassette designed so that the Spike protein and the nucleocapsid protein can be expressed simultaneously, the gene encoding the Spike protein represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; and a gene encoding the nucelocapsid protein of SEQ ID NO: 4;
  • the expression cassette includes a promoter and a gene encoding a target protein, and thus means a unit cassette that can be expressed to produce a target protein operably linked downstream of the promoter.
  • the target protein expression cassette may be one in which a gene encoding the target protein is operably linked to the downstream of the promoter sequence.
  • the operably linked means that the gene sequence and the promoter sequence are functionally linked so that the nucleic acid sequence having promoter activity of the present invention initiates and mediates transcription of a gene encoding a target protein.
  • the operable linkage may be prepared using a genetic recombination technique known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation may be made using a cleavage and ligation enzyme in the art, but is not limited thereto.
  • the bicistronic expression cassette contains additional components, ie, CMV promoter, Kozak sequence, IgE leader sequence, furin recognition site, GSG- It is preferable to further include one or more components selected from the group consisting of T2A cleavage site, BGH poly adenylation signal, kanamycin resistance gene, and pUC origin.
  • the CMV promoter, Kozak sequence and IgE leader sequence are for inducing high-level gene expression and secretion in animal cells;
  • the furin recognition site and the GSG-T2A cleavage site are for protein cleavage;
  • the BGH polyadenylation signal is for efficient transcription termination and stabilization of the transcript;
  • the kanamycin resistance gene is an E. coli selectable marker;
  • pUC Origin is for maintaining high copy number in E. coli;
  • the bicistronic expression cassette is preferably a vector, and more preferably, may be represented by the following cleavage map.
  • a vector means a means for expressing a target gene in a host cell.
  • Viral vectors such as, for example, plasmid vectors, adenoviral vectors, retroviral vectors and adeno-associated viral vectors are included.
  • Vectors that can be used as the recombinant vector include plasmids often used in the art (eg, pGLS, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, ME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1).
  • phage eg, ⁇ gt4 ⁇ B, ⁇ Charon, ⁇ z1 and M13, etc.
  • viruses eg, AAV, MVA, etc.
  • the recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or a vector for expression.
  • the expression vector may be a conventional vector used to express a foreign protein in plants, animals or microorganisms in the art.
  • the recombinant vector can be constructed through various methods known in the art.
  • the recombinant vector can be constructed using a prokaryotic cell or a eukaryotic cell as a host.
  • the replication origin operating in the eukaryotic cell contained in the vector is the f1 origin of replication, the SV40 origin of replication, the pMB1 origin of replication, the adeno origin of replication, the AAV origin of replication, the CMV origin of replication, and the BBV origin of replication. Including, but not limited to, the origin of replication.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells eg, metallotionine promoter
  • mammalian viruses eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, The cytomegalovirus (CMV) promoter and the tk promoter of HSV
  • CMV cytomegalovirus
  • tk promoter of HSV can be used and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.
  • the composition is preferably administered 1 to 3 times at intervals of 1 to 3 weeks, and more preferably inoculated twice at intervals of 2 weeks.
  • the composition may be formulated using methods known in the art to permit rapid, sustained or delayed release of the active ingredient upon administration to a mammal.
  • Formulations include powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, and sterile powder forms.
  • the composition may be administered by one or more routes selected from the group consisting of intramuscular, intravenous, subcutaneous, intradermal and intranasal. .
  • the composition may be administered through a method of applying a physical stimulus to increase delivery efficiency during administration, examples of which include an electroporation method, a gene gun method, and a jet injection method. (Jet injection) method, etc.
  • a method of applying a physical stimulus to increase delivery efficiency during administration examples of which include an electroporation method, a gene gun method, and a jet injection method. (Jet injection) method, etc.
  • electroporation is a technique for introducing a chemical, drug, or DNA into a cell by increasing the permeability of the plasma membrane by applying an electric field to the cell.
  • electroporation is utilized to transform bacteria, animal cells or plant cells by introducing new DNA.
  • the gene gun refers to a device made to pass through a cell wall or cell membrane by attaching a recombinant plasmid to gold, tungsten, or plastic particles having a diameter of 1 to 5 ⁇ m and accelerating it at an appropriate speed.
  • the delivery method using the gene gun is used to introduce a biological material into living cells.
  • the jet injection method refers to a method of injecting a liquid drug under the skin by finely injecting a liquid drug at a high pressure using an injection syringe without using a needle.
  • the composition is preferably administered intramuscularly via electroporation.
  • the composition may be administered through a biochemical method to increase delivery efficiency, and preferably, the composition may be administered through a liposome-mediated delivery method.
  • the liposome-mediated delivery method refers to a method of delivering a target substance into a cell using a liposome containing the target substance.
  • composition according to the present invention may be formulated in a suitable form together with a commonly used pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers for parenteral administration such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycol, and may further include stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives are benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • composition according to the present invention may contain a suspending agent, a solubilizing agent, a stabilizer, an isotonic agent, a preservative, an adsorption inhibitor, a surfactant, a diluent, an excipient, a pH adjuster, an analgesic agent, a buffer, Antioxidants and the like may be included as appropriate.
  • the dosage of the composition to a patient will depend on many factors, including the patient's height, body surface area, age, the particular compound being administered, sex, time and route of administration, general health, and other drugs being administered concurrently.
  • composition of the present invention is administered in a therapeutically effective amount.
  • a therapeutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is defined as the subject type and severity, age, sex, drug activity, drug It can be determined according to factors including sensitivity to, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, concomitant drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the composition of the present invention may be administered in an amount of 0.01 mg/60 kg to 1 g/60 kg based on a 60 kg adult. Meanwhile, the dosage may be appropriately adjusted according to the patient's age, sex, and condition.
  • a bicistronic expression cassette comprising genes encoding antigen proteins Spike and ORF3a according to the present invention; or a bicistronic expression cassette comprising a gene encoding Spike and nucleocapsid; a composition comprising effectively induces an antigen-antibody immune response and a T-cell immune response, and has a neutralizing antibody and high competitive binding ability with hACE2 protein Confirmed. Therefore, the composition according to the present invention can be used in various ways in the field of preventing SARS-CoV-2 virus infection.
  • the present invention provides a method for preventing severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection comprising the step of treating the bicistronic expression cassette to an individual.
  • the bicistronic expression cassette is preferably treated in a subject in the form of a vector containing the same, but is not limited thereto.
  • the subject may be an individual at risk of being infected with Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 or an individual expected to be infected.
  • Example 1 Candidate antigen selection and bicistronic vector design
  • Candidate antigens Spike (Genebank Accession No. YP_009724390.1), ORF3a (Genebank Accession No. YP_009724391.1) and nucleocapsid (Genebank Accession No. YP_009724397.2) from the entire sequence of Wuhan-Hu-1 (Genebank Accession No. MN908947) was selected.
  • ORF3a is the largest accessory protein consisting of 275 amino acids and is involved in internalization of SARS-CoV-2 during endocytosis.
  • a bicistronic vector ie, a combined vaccine in the form of a DNA vaccine containing the coding gene was prepared.
  • the gene encoding Spike, ORF3a or nucleocapsid used in the preparation of the bicistronic vector is a nucleotide sequence obtained by optimizing the amino acid sequence of the corresponding Accession No. with human codons.
  • the signal peptide unique to SARS-CoV-2 was replaced with an IgE leader sequence
  • ORF3a and nucleocapsid an IgE leader sequence was added.
  • the gene encoding the Spike protein used in the preparation of the bicistronic vector is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3
  • the gene encoding the ORF3a protein is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • encoding the nucleocapsid protein The gene is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • a bicistronic vector comprising a gene encoding a Spike protein (SEQ ID NO: 1) and a gene encoding ORF3a (SEQ ID NO: 2) was designed, and this was performed using the plasmid pGO It was designated as -1002.
  • the cleavage map of the plasmid pGO-1002 is shown in Fig. 1a.
  • the peptide expressed in the cell using the plasmid pGO-1002 of FIG. 1A includes various cleavage sites such as signal peptidase and carboxypeptidase.
  • the peptide expressed by the plasmid pGO-1002 is cleaved by post-translational modification as shown in FIG. 1B, and thus only Spike and ORF3a proteins are secreted during extracellular secretion.
  • a bicistronic vector comprising a gene encoding a Spike protein (SEQ ID NO: 3) and a gene encoding a nucleocapsid (SEQ ID NO: 4) was designed, and the plasmid pGO It was named -1003.
  • the peptide expressed in the cell includes various cleavage sites such as signal peptidase and carboxypeptidase.
  • the peptide expressed by the plasmid pGO-1003 is cleaved by post-translational modification. Accordingly, only Spike and nucleocapsid proteins are secreted during extracellular secretion.
  • plasmid pGLS101 was used as a negative control, and as a positive control, plasmids pGLS-Spike (pGO-1001) and pGLS-ORF3a into which one spike and one ORF3a were inserted were used as positive controls.
  • the plasmid pGLS101 was derived from Invitrogen's pVAX1 plasmid (Cat. No. V26020).
  • the plasmid pGO-1002 prepared in Example 1 produced antigens Spike and ORF3a proteins in the transfected cells.
  • the HEK293T cell line was transfected with the plasmid pGO-1002 (pGLS-BC-nCoV-S-ORF3a_hCO). Cells were lysed 48 hours after transfection. Generation of Spike and ORF3a proteins was confirmed through SDS-PAGE and Western blotting. Antibodies used for the Western blotting are as follows.
  • Spike and ORF3a protein expression was confirmed by immunofluorescence staining. Specifically, the HEK293T cell line was transfected with the plasmid pGO-1002. Transfected cells were immunofluorescently labeled 48 hours after transfection. Cell nucleus DNA was stained with DAPI and used as a control (blue panel). The staining results are shown in Figure 2b.
  • the cells transfected with the bicistronic vector containing the genes encoding Spike and nucleocapsid prepared in Example 1 normally express Spike and nucleocapsid in the cells, respectively.
  • the toxicity of the plasmid pGO-1002 prepared in Example 1 was evaluated.
  • the cell assay evaluated toxicity by measuring the body weight change induced by antigen expression in mice immunized with plasmid pGO-1002.
  • the immunized mice were intramuscularly inoculated with the plasmid pGO-1002 through electroporation inoculation, and inoculated twice with an interval of 2 weeks.
  • the mice used in this example were first inoculated with the plasmid pGO-1002, and the second inoculated 15 days later.
  • the negative control group was inoculated with the plasmid pGLS-101, and the positive control group was inoculated with the plasmid pGLS-ORF3a.
  • the results of evaluating the toxicity of the antigen are shown in FIG. 3 .
  • the experimental group showed similar weight gain to the negative and positive controls, which means that antigen Spike and nucleocapsid have low toxicity in the body.
  • the ELISA plate was coated with 1 ⁇ g/ml of 1x phosphate buffered saline (PBS) containing recombinant antigen and then incubated at 4°C overnight.
  • Blocking buffer (seracare, Cat.5140-0011) was added to the coated plate and incubated at 37°C for 2 hours. After incubation, the plate was washed with 1x PBS containing 5% Tween 20, and mouse serum was serially diluted and incubated at 37°C for 2 hours.
  • the mouse serum was obtained from mice in which the plasmid pGO-1002 prepared in Example 1 was intramuscularly inoculated (twice at 2 week intervals) and then transferred by electroporation to mice through electroporation inoculation.
  • the plate was washed with 1x PBS, and a primary antibody binding to Spike or ORF3a was added and incubated, followed by washing with 1x PBS.
  • the plate was treated with a Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody (invitrogen, Cat. 31430) (1:2,500) bound to force eadish peroxidase (HRP), and then incubated at room temperature for 1 hour. After that, the plate was washed with 1x PBS, and the plate was developed using the ABTS Peroxidase Substrate System (KPL, cat. 5120-0032), and treated with ABTS Peroxidase Stop Solution (KPL, cat. 5150-0017). The reaction was stopped. The plate was read at 405 nm in 30 minutes. A Synergy HTX (BioTek Instruments, Highland Park, VT) was used to read the plate. The cutoff value was calculated as follows.
  • mice inoculated with plasmids pGLS-101 (negative control) and pGLS-Spike (positive control) were used.
  • mouse serum was collected before (D0), 2 weeks (Wk2) and 4 weeks (Wk4) after plasmid inoculation.
  • the titer of the Spike antigen-specific binding antibody was measured through ELISA using the collected serum and the mouse Spike-binding primary antibody. The results of measuring the titer of the Spike antigen-specific binding antibody are shown in FIG. 4 .
  • test group pGLS-Spike-ORF3a
  • plasmid pGO-1002 had a similar titer to the positive control group (pGLS-Spike) of the Spike antigen-specific binding antibody.
  • test group pGLS-Spike-ORF3a
  • pGLS-101 the test group inoculated with the plasmid pGO-1002 had significantly higher titer of the ORF3a antigen-specific binding antibody than the negative control group (pGLS-101).
  • the proteins (ie, Spike and nucleocapsid) expressed by the bicistronic vector containing the genes encoding Spike and nucleocapsid prepared in Example 1 induce a sufficient immune response, respectively.
  • the plasmid pGO-1002 was intramuscularly inoculated into mice through the electroporation inoculation method, and the inoculation was performed twice at an interval of 2 weeks. The mice were sacrificed to obtain a spleen.
  • Single cell suspensions were prepared by individually collecting single spleen cells from mouse-derived spleens in R10 medium.
  • the R10 medium refers to RPMI1640 medium supplemented with 10% FBS and penicillin/streptomycin.
  • the cell suspension was centrifuged to obtain a cell pellet, and the cell pellet was resuspended in 5 ml of ACK lysis buffer (Life Technologies, cat. A1049201) and incubated for 8 minutes.
  • R10 medium was added to the tube containing the cells, and then centrifuged at 1400 rpm for 5 minutes to obtain a cell pellet.
  • the cell pellet was resuspended in R10 medium to prepare a cell suspension.
  • the ELISpot assay was performed using mouse IFN- ⁇ ELISpotPLUS plates (MABTECH, cat. 33212H). For blocking, R10 medium was added to a 96-well ELISpot plate coated with a capture antibody, and then incubated at room temperature for 1 hour. 200,000 mouse splenocytes were plated in each well of the blocked ELISpot plate. The plated cells were stimulated with an overlapping long peptide (OLP) pool for 14 hours. Cells were stimulated with 1 ⁇ g/ml of each peptide per well in R10 medium. Spots expressed after cell stimulation were developed according to the manufacturer's manual. R10 medium and a mixture of 1% DMSO and ConA (concanavaline A) were used as negative and positive controls, respectively.
  • OHP overlapping long peptide
  • the OLP pool is an OLP pool derived from the Spike or ORF3a protein of SARS CoV-2; or a combination thereof;
  • mice inoculated with plasmids pGLS-101 (negative control) and pGLS-Spike (positive control) were used.
  • T-cell immune response of spleen cells stimulated with Spike OLP was evaluated through ELISpot analysis.
  • ORF3_OLP1 which is a pool of 53 OLPs corresponding to ORF3a M1-L275, was used.
  • the OLP pool is composed of 15 mer-long peptides with 10 amino acids overlapping each other.
  • the results of evaluating the T cell immune response to Spike OLP are shown in FIG. 6 .
  • test group pGLS-Spike-ORF3a
  • plasmid pGO-1002 effectively induced the T cell immune response to the Spike OLP than the positive control group (pGLS-Spike).
  • the T cell immune response of spleen cells stimulated with ORF3a OLP was evaluated through ELISpot analysis, and the results are shown in FIG. 7 .
  • test group pGLS-Spike-ORF3a
  • the test group inoculated with the plasmid pGO-1002 effectively induced a T cell immune response to the ORF3a OLP.
  • the T-cell immune response of spleen cells stimulated with Spike OLP and ORF3a OLP was evaluated by ELISpot analysis.
  • the plasmid pGO-1002 was administered to mice through intramuscular injection and electroporation.
  • the control group was administered by intramuscular injection and electroporation with plasmid pGLS101.
  • the results of evaluating the summated T-cell immune response to Spike OLP and ORF3a OLP are shown in FIG. 8 .
  • test group inoculated with the bicistronic vector containing the gene encoding Spike and nucleocapsid prepared in Example 1 had a significant T-cell immune response effect compared to the positive control group.
  • the neutralizing antibody titer was evaluated through the PRNT 50 test using a neutralizing antibody that inhibits Live SARS-CoV-2. Specifically, SARS-CoV-2/South Korea/2020 separation and neutralization analysis was performed by the Korea Centers for Disease Control and Prevention. Neutralizing virus titers were measured in heat-inactivated serum samples at 56 °C for 30 min.
  • the test group serum was obtained from mice inoculated with the plasmid pGO-1002 prepared in Example 1 (twice at 2 week intervals) through electroporation after intramuscular inoculation, and the control serum was obtained from the plasmid pGLS-101 or It was obtained from mice inoculated with pGLS-Spike.
  • SARS-CoV-2 (BetaCoV / Korea / KCDC03 / 2020) (60 pfu ml -1) for 10% FBS, 100 IU ml -1 DMEM medium containing penicillin and 100 ⁇ g ml -1 streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, USA) and 50:50: serial dilutions from 1:4 to 1:2040 in a 96-well U bottomed plate.
  • test group pGLS-Spike-ORF3a
  • the test group inoculated with the plasmid pGO-1002 prepared in Example 1 showed an excellent neutralizing antibody immune response at a similar level to the pGLS-Spike inoculation group. .
  • test group inoculated with the bicistronic vector containing the gene encoding Spike and nucleocapsid prepared in Example 1 had a high neutralizing antibody titer.
  • Circulating neutralizing antibodies to SARS-CoV-2 that block the interaction between the receptor binding domain of viral spike glycoprotein (RBD) and the ACE2 cell surface receptor (GenScript cat# L00847) were detected.
  • the diluted control and test group sera were mixed with the HRP-RBD solution diluted in a 1:1 volume ratio.
  • the test group sera was obtained from mice that were intramuscularly inoculated with the plasmid pGO-1002 prepared in Example 1 through electroporation inoculation (twice at 2 week intervals), and the control sera was the plasmid pGLS-101 or pGLS - Obtained from mice inoculated with Spike. The mixture was incubated at 37 °C for 30 min.
  • FIG. 11 The results of ACE receptor competition evaluation are shown in FIG. 11. As shown in FIG. 11, the test group (pGLS-Spike-ORF3a) inoculated with the plasmid pGO-1002 prepared in Example 1 had competitive binding ability with hACE2 protein. It was confirmed that this was remarkably high.
  • test group inoculated with the bicistronic vector containing the gene encoding Spike and nucleocapsid prepared in Example 1 had high competitive binding ability with hACE2 protein.
  • the present inventors have proposed a DNA vaccine against SARS CoV-2, that is, a bicistronic vector comprising Spike and ORF3a genes, which are genes encoding antigenic proteins; and a bicistronic vector including Spike and nucleocapsid genes; was prepared.
  • the bicistronic vector generates two antigenic proteins through expression and post-translational modification in vivo, and the produced antigenic protein exhibits remarkable immunogenicity. More specifically, distinct antibodies to each of the two antigens It was confirmed that not only can induce an immune response, but also induce a strong T-cell immune response. Therefore, the bicistronic vector according to the present invention can be used in various ways in the field of preventing SARS-CoV-2 virus infection.
  • formulation examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not to be construed as being limited by the formulation examples.

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Abstract

본 발명은 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 백신 조성물은 SARS-CoV-2에 대한 항원으로 Spike와, ORF3a 또는 nucleocapsid를 포함한다. 상기 백신 조성물은 1종의 항원을 포함하는 것에 비해 다수의 동시 발현되는 항원에 의한 현저한 항체 면역반응 및 T세포 면역반응 유도효과가 있는바, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 백신 조성물
본 발명은 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
코로나바이러스감염증-19(corona virus disease-19, COVID-19)는 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)에 의한 호흡기 감염증이다. SARS-CoV-2는 2019년 12월 23일에 중국 우한에서 새로 발견된 단일 가닥 RNA의 신종 베타코로나 바이러스로 2020년 1월 국제바이러스 분류 위원회에서 SARS-CoV-2라 명명하였다. 이러한 SARS-CoV-2의 감염경로는 아직 명확하게 규명되지 않았으나, 일부 연구에 따르면 박쥐로부터 사람에게 감염되는 것으로 보고되고 있다.
SARS-CoV-2의 유전체는 비분절 형태이며 크기는 약 30 kb로 10개의 단백질을 encoding하고 있다. 10개의 단백질은 한 개의 복제 polyproteins(open reading frames 1ab), 4개의 구조 단백질(Spike, envelope, membrane and nucleocapsid), 5개의 non-structural 단백질(open reading frames 3a, 6, 7a, 8 and 10)로 구성되어 있다.
SARS-CoV-2는 사람 간의 전염이 가능하며 상당히 높은 치사율을 보이고 있어 국내외로 큰 문제가 되고 있다. 2020년 3월 16 일, 167,511 건의 환자가 발생했으며, 그 중 13,908명의 환자가 사망하였음이 WHO에 보고되었으며, 현재도 그 사망자가 급속하게 증가하고 있는 추세이다.
국내에서는 2019년 1월 중국에서 입국한 36세 여성에서 최초 SARS-CoV-2 감염이 확인되었으며, 2020년 3월 17일까지 SARS-CoV-2 감염 확진자가 발생하여 8,320명의 SARS-CoV-2 감염자가 확진되었고, 286,716명의 격리자가 발생하였다.
2019년 중국에서의 첫 발견 이후 중국지역에서 집중적으로 발병하였으며, 2020년 한국, 일본, 이탈리아 등 160 개 이상의 국가에서 감염자가 발생하여 높은 전파율을 보인 SARS-CoV-2는 감염 시 호흡기뿐만 아니라 폐렴이나 급성신부전 등의 합병증을 동반하는 문제가 있으며, 높은 치사율 및 전염성으로 인해 큰 문제를 발생시키고 있다.
현재 국내외에서 신규 환자가 지속적으로 발생하고 있고 전파율이 높은 바이러스에 해당함을 고려할 때, 이를 예방하기 위한 백신의 개발이 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염을 예방하기 위한 백신을 개발하기 위하여 노력한 결과, Spike와 ORF3a 또는 nucleocapsid를 발현하는 DNA 백신을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, (a) SARS-CoV-2 Spike 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 및 (b) SARS-CoV-2 ORF3a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 또는 SARS-CoV-2 nucleocapsid 또는 이를 코딩하는 유전자;를 포함하는, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, (a) SARS-CoV-2 Spike 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 및 (b) SARS-CoV-2 ORF3a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 또는 SARS-CoV-2 nucleocapsid 또는 이를 코딩하는 유전자;를 포함하는, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, (a) SARS-CoV-2 Spike 단백질을 코딩하는 유전자 및 (b) SARS-CoV-2 ORF3a 단백질을 코딩하는 유전자; 또는 SARS-CoV-2 nucleocapsid 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는, 바이시스트로닉 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 바이시스트로닉 발현 카세트를 포함하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 바이시스트로닉 발현 카세트를 포함하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 바이시스트로닉 발현 카세트를 개체에 처리하는 단계;를 포함하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) SARS-CoV-2 Spike 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 및 (b) SARS-CoV-2 ORF3a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 또는 SARS-CoV-2 nucleocapsid 또는 이를 코딩하는 유전자;를 포함하는, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) SARS-CoV-2 Spike 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 및 (b) SARS-CoV-2 ORF3a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 또는 SARS-CoV-2 nucleocapsid 또는 이를 코딩하는 유전자;를 포함하는, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 면역원성 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) SARS-CoV-2 Spike 단백질을 코딩하는 유전자 및 (b) SARS-CoV-2 ORF3a 단백질을 코딩하는 유전자; 또는 SARS-CoV-2 nucleocapsid 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는, 바이시스트로닉 발현 카세트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바이시스트로닉 발현 카세트를 포함하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바이시스트로닉 발현 카세트를 포함하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 면역원성 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바이시스트로닉 발현 카세트를 개체에 처리하는 단계;를 포함하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 백신 조성물은 SARS-CoV-2에 대한 항원으로 Spike와, ORF3a 또는 nucleocapsid를 포함한다. 상기 백신 조성물은 1종의 항원을 포함하는 것에 비해 다수의 동시 발현되는 항원에 의한 현저한 항체 면역반응 및 T세포 면역반응 유도효과가 있는바, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1a는 본 발명에 따른 항원 Spike 및 ORF3a를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드 pGO-1002의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 1b는 상기 플라스미드 pGO-1002에 의해 발현된 펩타이드의 번역 후 변형(Post-translational modification) 메커니즘을 나타낸 도이다.
도 2a는 웨스턴 블롯팅을 통해 플라스미드 pGO-1002가 형질감염된 세포에서 항원 Spike 및 OPF3a 단백질의 생성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 면역형광 염색을 통해 플라스미드 pGO-1002가 형질감염된 세포에서 항원 Spike 및 OPF3a 단백질의 생성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 생체 내에서 본 발명에 따른 플라스미드 pGO-1002의 독성을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 항체 면역반응을 통해 Spike 항원 특이적 결합항체의 역가를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 항체 면역반응을 통해 ORF3a 항원 특이적 결합항체의 역가를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 ELISpot 분석을 통해 Spike OLP로 자극된 비장 세포의 T세포 면역반응을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 ELISpot 분석을 통해 ORF3a OLP로 자극된 비장 세포의 T세포 면역반응을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 ELISpot 분석을 통해 Spike OLP 및 ORF3a OLP로 자극된 비장 세포의 T세포 면역반응을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 9 및 10은 plaque reduction neutralization assay를 통해 중화항체가를 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 ACE 수용체 경쟁 평가를 통해 ACE 단백질과의 경쟁적 결합능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 (a) SARS-CoV-2 Spike 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 및 (b) SARS-CoV-2 ORF3a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 또는 SARS-CoV-2 nucleocapsid 또는 이를 코딩하는 유전자;를 포함하는, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 백신 조성물 및 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 Spike, ORF3a 또는 nucleocapsid 단백질을 코딩하는 유전자는 인간의 코돈으로 최적화된 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, Spike는 숙주세포로 코로나 바이러스의 진입을 매개하는 다기능 단백질을 의미하며, SARS-CoV-2의 Spike는 1273개 아미노산으로 이루어져 있다(Genebank Accession No. YP_009724390.1). 또한 Spike는 기존 백신의 항원으로 이용되고 있으나, 낙타 및 원숭이와 같은 대동물에서는 임상 증상은 개선됨에도 불구하고, 바이러스 제거 효과(즉, 살균 효과)가 낮은 수준임이 확인되었다. 같은 코로나 바이러스인 MERS-CoV의 사례에서, Spike만을 항원으로 사용한 동물실험의 경우 마우스와 같은 소동물에 비하여 대동물에서 면역반응 유도 효과에 한계가 있는 것이 확인된바 있다. 이에 따라 대동물에서 효과적인 반응을 유도하고자 Spike 이외의 항원을 추가하여 이를 보완할 필요성이 대두되고 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 Spike 단백질을 코딩하는 유전자는 인간의 코돈으로 최적화된 것으로, 서열번호 1 또는 3의 염기서열로 표시되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, ORF3a(open reading frame 3a)는 SARS-CoV-2에서 가장 큰 보조 단백질(accessory protein)로, 275개의 아미노산으로 이루어져있다(Genebank Accession No. YP_009724391.1). 상기 ORF3a는 SARS-CoV-2의 내포 작용(endocytosis) 중 내재화(internalization)에 관여하는 단백질이다.
본 발명에 있어서, ORF(open reading frame)는 아미노산 배열로서, 번역되는 DNA 염기 서열을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 ORF3a 단백질을 코딩하는 유전자는 인간의 코돈으로 최적화된 것으로, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, nucleocapsid는 바이러스의 유전정보인 RNA나 DNA를 안쪽에 포함하고 있는 단백질 구조체를 의미한다. 상기 nucleocapsid는 419개의 아미노산 서열로 이루어져 있다(Genebank Accession No. YP_009724397.2).
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 nucleocapsid 단백질을 코딩하는 유전자는 인간의 코돈으로 최적화된 것으로, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 (a) Spike 단백질을 코딩하는 유전자; 및 (b) ORF3a 또는 nucleocapsid 단백질을 코딩하는 유전자;는 바이시스트로닉 발현 벡터에 포함된 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 백신(vaccine)은 항원에 대한 후천성 면역을 부여하는 의약품으로, SARS-CoV-2에 대하여 특이적이고 능동의 면역성을 유도하기 위한 목적으로 투여된다.
본 발명의 조성물은 항원인 Spike, ORF3a 및 nucleocapsid 이외에도 조성물을 구성하는 데 적절한 하나 이상의 면역증강제 또는 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 면역증강제는 주사한 동물의 면역 반응을 증대시키는 물질을 의미하는 것으로, 다수의 상이한 면역증강제가 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 상기 면역증강제는 프로인트 완전 및 불완전 면역 증강제, 비타민 E, 비이온성 차단 폴리머, 뮤라밀디펩티드, Quil A, 광유 및 무광물유 및 카보폴(Carbopol), 유중수형 유제 면역증강제 등을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 부형제의 예로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포타슘 설페이트 등이 있다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체는 약학적으로 허용 가능한 담체일 수 있고, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체의 예로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등이 있다.
본 발명의 조성물은 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B 등을 포함한다. 본 발명의 조성물은 하나 이상의 적절한 유화제, 예로서 스판(Span) 또는 트윈(Tween)을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 보호제를 포함할 수 있으며, 당업계에 공지된 보호제를 제한 없이 사용할 수 있고, 이는 락토오스(Lactose; LPGG) 또는 트레할로오스(Trehalose; TPGG)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체예에서, 상기 조성물은 2회 투여용인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 2주 간격으로 2회 투여용인 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 조성물은 (a) Spike 단백질; 및 (b) ORF3a 또는 nucleocapsid 단백질;에 대한 면역원성이 동시에 유도되는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 조성물은 항체 반응 및 T세포 면역반응을 동시에 유도하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) SARS-CoV-2 Spike 단백질을 코딩하는 유전자 및 (b) SARS-CoV-2 ORF3a 단백질을 코딩하는 유전자; 또는 SARS-CoV-2 nucleocapsid 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는, 바이시스트로닉 발현 카세트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바이시스트로닉 발현 카세트를 포함하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 백신 조성물 및 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 Spike 단백질을 코딩하는 유전자는 인간 코돈으로 최적화(optimization)된 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 SARS-CoV-2 고유의 신호 펩타이드(signal peptide)를 IgE leader 서열로 교체된 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 Spike 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 3의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 ORF3a 단백질을 코딩하는 유전자는 인간 코돈으로 최적화(optimization)된 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 IgE leader 서열이 추가된 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 ORF3a 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 nucleocapsid 단백질을 코딩하는 유전자는 인간 코돈으로 최적화(optimization)된 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 IgE leader 서열이 추가된 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 nucleocapsid 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 바이시스트로닉(bicistronic)은 진핵세포 내에서 mRNA의 내부에서도 리보좀이 폴리펩티드를 합성할 수 있게 되어 하나의 mRNA로부터 여러 단백질이 합성 가능하게 된 시스템을 의미하며, 본 발명에서는 (i) Spike 단백질 및 ORF3a 단백질; 또는 (ii) Spike 단백질 및 nucleocapsid 단백질;이 동시에 발현될 수 있도록 발현 카세트를 디자인하였다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 (i) Spike 단백질 및 ORF3a 단백질이 동시에 발현될 수 있도록 디자인된 발현 카세트는, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 Spike 단백질을 코딩하는 유전자; 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 ORF3a 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, (ii) Spike 단백질 및 nucleocapsid 단백질이 동시에 발현될 수 있도록 디자인된 발현 카세트는, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 Spike 단백질을 코딩하는 유전자; 및 서열번호 4의 nucelocapsid 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 발현 카세트는 프로모터와 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고 있어서, 프로모터 하류에 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 생산하기 위해 발현시킬 수 있는 단위 카세트를 의미한다. 이와 같은 발현 카세트의 내부 또는 외부에는 상기 목적 단백질의 효율적인 생산을 도울 수 있는 다양한 인자가 포함될 수 있다. 상기 목적 단백질 발현 카세트는 구체적으로, 프로모터 서열 하류에 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 작동 가능하게 연결이란 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열이 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 개시 및 매개하도록, 상기 유전자 서열과 프로모터 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 바이시스트로닉 발현 카세트는 추가 구성요소, 즉, CMV 프로모터, 코작 서열(Kozak sequence), IgE 리더 서열(IgE leader sequence), 퓨린 인식 부위(furin recognition site), GSG-T2A 절단 부위, BGH 폴리아데닐화 신호(BGH poly adenylation signal), 카나마이신 저항 유전자 및 pUC 오리진으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 구성을 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기 CMV 프로모터, 코작 서열 및 IgE 리더 서열은 동물세포 내 높은 수준의 유전자 발현 및 분비를 유도하기 위한 것이며; 퓨린 인식 부위 및 GSG-T2A 절단 부위는 단백질 절단을 위한 것이며; BGH 폴리아데닐화 신호는 효율적인 전사 종결과 전사체의 안정화를 위한 것이며; 카나마이신 저항 유전자는 대장균 선택마커이고; pUC Origin은 대장균 내 높은 복제수를 유지하기 위한 것;이다.
본 발명의 구체예에서, 상기 바이시스트로닉 발현 카세트는 벡터(vector)인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 하기의 개열지도로 표시되는 것일 수 있다.
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본 발명에 있어서, 벡터는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pGLS, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, ME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λCharon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, AAV, MVA 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 조성물은 1 내지 3주 간격으로 1 내지 3회 투여하는 것이 바람직하며, 2주 간격으로 2회 접종하는 것이 더 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 조성물은 포유동물에 투여 시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 조성물은 근육내(intramuscular), 정맥내(Intravenous), 피하(subcutaneous), 피내(Intradermal) 및 비강내(intranasal)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 경로로 투여될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 조성물은 투여 시 전달 효율을 높이기 위하여 물리적인 자극을 가하는 방법을 통해 투여할 수 있으며, 그 예로는 전기천공(electroporation)법, 유전자 총(gene gun)법 및 제트 분사(Jet injection)법 등이 있다.
본 발명에 있어서, 전기천공(electroporation)은 세포에 전기장을 가하여 원형질막의 투과성을 증가시킴으로써 화학물질, 약물 또는 DNA가 세포 내로 도입되도록 하는 기술이다. 특히, 전기천공은 새로운 DNA를 도입하여 박테리아, 동물세포 또는 식물세포를 형질전환시키는데 활용된다.
본 발명에 있어서, 유전자 총(gene gun)은 지름 1~5μm로 크기가 적당한 금, 텅스텐 또는 플라스틱 입자에 재조합 플라스미드를 부착하고 적정 속도로 가속하여 세포벽이나 세포막을 통과할 수 있도록 만든 기구를 의미한다. 상기 유전자 총을 이용한 전달방법은 살아 있는 세포내로 생물학적인 물질을 도입하기 위하여 사용된다.
본 발명에 있어서, 제트 분사법은 주삿바늘을 쓰지 않고 분사 주사기를 이용하여 액체 약물을 고압으로 미세하게 분사시켜 피부 밑에 주입하는 방법을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 전기천공법을 통해 근육 내 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 조성물은 전달 효율을 높이기 위하여 생화학적 방법을 통해 투여할 수 있으며, 바람직하게는 리포좀 매개 전달(Liposome-mediated delivery)법을 통해 조성물을 투여할 수 있다.
본 발명에 있어서, 리포좀 매개 전달법은 목적 물질을 함유하는 리포좀을 이용하여 목적 물질을 세포 내에 전달하는 방법을 의미한다.
본 발명에 따른 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여 방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다.
상기 조성물의 환자에 대한 투여량은 환자의 신장, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 많은 요소들에 따라 다르다.
아울러, 본 발명의 조성물은 치료적으로 유효한 양으로 투여된다.
본 발명에 있어서, 치료적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 60 kg의 성인을 기준으로 0.01 mg/60 kg 내지 1 g/60 kg로 투여될 수 있다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
본 발명에 따른, 항원 단백질인 Spike 및 ORF3a를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이시스트로닉 발현 카세트; 또는 Spike 및 nucleocapsid를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이시스트로닉 발현 카세트;를 포함하는 조성물은 항원 항체 면역반응 및 T세포 면역반응을 효과적으로 유도하며, 중화항체가 및 hACE2 단백질과의 경쟁적 결합 능력이 높은 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 SARS-CoV-2 바이러스 감염증의 예방 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 바이시스트로닉 발현 카세트를 개체에 처리하는 단계;를 포함하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방 방법을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 바이시스트로닉 발현 카세트는 이를 포함하는 벡터의 형태로 개체에 처리하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 개체는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2에 감염될 위험이 있는 개체 또는 감염된 것으로 예상되는 개체일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 후보 항원 선정 및 바이시스트로닉 벡터 설계
Wuhan-Hu-1의 전체서열(Genebank Accession No. MN908947)로부터 후보 항원 Spike(Genebank Accession No. YP_009724390.1), ORF3a(Genebank Accession No. YP_009724391.1) 및 nucleocapsid(Genebank Accession No. YP_009724397.2)를 선정하였다.
상기 후보 항원 중 ORF3a는 275개의 아미노산으로 이루어진 가장 큰 보조 단백질(accessory protein)로, SARS-CoV-2의 내포 작용(endocytosis) 중 내재화(internalization)에 관여한다.
상기 선정된 후보 항원 중 (i) Spike 및 ORF3a; 또는 (ii) Spike 및 nucleocapsid;를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이시스트로닉 벡터(즉, DNA 백신 형태의 혼합 백신)를 제조하였다. 상기 바이시스트로닉 벡터의 제조에 사용한 Spike, ORF3a 또는 nucleocapsid를 코딩하는 유전자는 해당 Accession No.의 아미노산 서열을 인간 코돈으로 최적화(optimization)한 염기서열이다. Spike의 경우 SARS-CoV-2 고유의 신호 펩타이드(signal peptide)를 IgE leader 서열로 교체하였고, ORF3a 및 nucleocapsid의 경우 IgE leader 서열을 추가한 것이다. 상기 바이시스트로닉 벡터의 제조에 사용한 Spike 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 3의 염기서열로 표시되며, ORF3a 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되고, nucleocapsid 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 표시된다.
(i) Spike 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 1) 및 ORF3a를 코딩하는 유전자(서열번호 2)를 포함하는 바이시스트로닉 벡터(pGLS-BC-nCoV-S-Orf3a_hCO)를 설계하였고, 이를 플라스미드 pGO-1002로 명명하였다. 상기 플라스미드 pGO-1002의 개열지도는 도 1a에 나타내었다. 상기 도 1a의 플라스미드 pGO-1002를 이용하여 세포 내에서 발현된 펩타이드는 시그널 펩티다아제, 카복시펩티다아제 등의 다양한 절단 부위를 포함하고 있다. 상기 플라스미드 pGO-1002에 의해 발현된 펩타이드는 도 1b에 나타낸 바와 같이 번역 후 변형(Post-translational modification)에 의해 절단되며, 이에 따라 세포 밖 분비 시 Spike 및 ORF3a 단백질만 분비된다.
(ii) Spike 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 3) 및 nucleocapsid를 코딩하는 유전자(서열번호 4)를 포함하는 바이시스트로닉 벡터(pGLS-BC-nCoV-S-N_hCO)를 설계하였고, 이를 플라스미드 pGO-1003으로 명명하였다. 상기 플라스미드 pGO-1003은 세포 내에서 발현된 펩타이드는 시그널 펩티다아제, 카복시펩티다아제 등의 다양한 절단 부위를 포함하고 있다. 상기 플라스미드 pGO-1003에 의해 발현된 펩타이드는 번역 후 변형(Post-translational modification)에 의해 절단되며, 이에 따라 세포 밖 분비 시 Spike 및 nucleocapsid 단백질만 분비된다.
또한 후술되는 실험에서, 플라스미드 pGLS101을 음성 대조군으로 사용하였고, 양성 대조군으로는 spike와 ORF3a가 각각 하나씩 삽입된 플라스미드 pGLS-Spike(pGO-1001) 및 pGLS-ORF3a를 사용하였다. 상기 플라스미드 pGLS101은 Invitrogen 사의 pVAX1 plasmid (Cat. No. V26020)에서 유래한 것이다.
실시예 2. 시험관 내(in vitro) 항원 생성 확인
상기 실시예 1에서 제조된 플라스미드 pGO-1002가 형질감염된 세포에서 항원인 Spike 및 ORF3a 단백질을 생성하는지 확인하였다. 구체적으로, 상기 HEK293T 세포주에 플라스미드 pGO-1002(pGLS-BC-nCoV-S-ORF3a_hCO)를 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후 세포를 용해시켰다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 통해 Spike 및 ORF3a 단백질의 생성 여부를 확인하였다. 상기 웨스턴 블롯팅에 사용한 항체는 다음과 같다.
<1차 항체>
- Anti-SARS-CoV-2 Spike antibody(Cat.3525, ProSci), 1:5,000
- Anti-ORF3a serum (Lab-made polyclonal Ab), 1:100
- Anti-β-actin (ab8226, Abcam), 1:1,000
<2차 항체>
- Anti-Rabbit IgG-HRP(Cat. G-21234, Thermo), 1:10,000
- Anti-Mouse IgG-HRP(62-6520, Thermo), 1:5,000
웨스턴 블롯팅 결과는 도 2a에 나타내었다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pGO-1002가 형질감염된 세포는 세포 내에서 Spike 및 ORF3a가 각각 정상적으로 발현되는 것을 확인하였다.
면역형광 염색을 통해 Spike 및 ORF3a 단백질 발현 여부를 확인하였다. 구체적으로, HEK293T 세포주에 플라스미드 pGO-1002를 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후 형질감염된 세포를 면역형광 표지하였다. 세포핵의 DNA는 DAPI로 염색 표지되었으며, 대조군으로 활용하였다(파란색 패널). 염색 결과는 도 2b에 나타내었다.
도 2b에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pGO-1002가 형질감염된 세포는 세포 내에서 Spike(TRITC) 및 ORF3a(FITC)가 각각 정상적으로 발현되는 것을 확인하였다.
또한 상기 실시예 1에서 제조된 Spike 및 nucleocapsid를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이시스트로닉 벡터 pGO-1003을 이용하여 위와 동일한 방법으로 실험하였다.
그 결과, 상기 실시예 1에서 제조된 Spike 및 nucleocapsid를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이시스트로닉 벡터로 형질감염된 세포는 세포 내에서 Spike 및 nucleocapsid가 각각 정상적으로 발현되는 것을 확인하였다.
실시예 3. 항원의 독성 평가
상기 실시예 1에서 제조된 플라스미드 pGO-1002의 독성을 평가하였다. 상기 세포 평가는 플라스미드 pGO-1002로 면역화된 마우스에서 항원 발현에 의해 유도된 체중 변화를 측정함으로써 독성을 평가하였다. 상기 면역화된 마우스는 전기천공 접종법을 통해 플라스미드 pGO-1002를 근육 내 접종하였으며, 2주 간격으로 2회 접종하였다. 본 실시예에서 사용한 마우스는 플라스미드 pGO-1002를 1차 접종하였고, 15일 후 2차 접종한 것이다. 음성 대조군은 플라스미드 pGLS-101을 접종하였고, 양성 대조군은 플라스미드 pGLS-ORF3a를 접종하였다. 항원의 독성을 평가한 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pGO-1002를 접종한 실험군(pGLS-Spike-ORF3a)은 음성 및 양성 대조군과 유사한 체중 증가율을 보였다. 상기 결과는 항원 Spike 및 ORF3a가 체내에서 독성이 낮다는 것을 의미한다.
또한 상기 실시예 1에서 제조된 Spike 및 nucleocapsid를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이시스트로닉 벡터 pGO-1003을 이용하여 위와 동일한 방법으로 실험하였다.
그 결과, 실험군은 음성 및 양성 대조군과 유사한 체중 증가율을 보였으며, 이는 항원 Spike 및 nucleocapsid가 체내에서 독성이 낮다는 것을 의미한다.
실시예 4. 항체 면역반응을 통한 면역원성 평가
항체 면역반응을 통한 면역원성 평가는 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 시험법으로 수행하였다.
실험방법
ELISA 플레이트를 재조합 항원이 포함된 1x 인산염완충식염수(phosphate buffered saline, PBS) 1 μg/ml로 코팅한 후 4℃에서 밤새도록 배양하였다. 코팅된 플레이트에 블로킹 버퍼(seracare, Cat.5140-0011)를 첨가한 후 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 배양 후 플레이트를 5% Tween 20이 포함된 1x PBS로 세척하였고, 마우스 혈청을 연속희석(serial dilution)하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 상기 마우스 혈청은 마우스에 전기천공 접종법을 통해 상기 실시예 1에서 제조된 플라스미드 pGO-1002를 근육 내 접종(2주 간격으로 2회) 후 전기천공법으로 전달한 마우스로부터 얻은 것이다. 배양 후 플레이트를 1x PBS로 세척하였고, Spike 또는 ORF3a와 결합하는 1차 항체를 첨가하여 배양한 후 1x PBS로 세척하였다. 플레이트에 HRP(forse eadish peroxidase)가 결합된 Goat anti-Mouse IgG(H+L) 2차 항체(invitrogen, Cat. 31430)(1:2,500)를 처리한 후 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후 1x PBS로 플레이트를 세척하였고, 플레이트는 ABTS Peroxidase Substrate System(KPL, cat. 5120-0032)을 사용하여 현상(deveoping)하였고, ABTS Peroxidase Stop Solution(KPL, cat. 5150-0017)을 처리하여 반응을 중지시켰다. 플레이트를 405 nm에서 30분 내에 판독하였다. 상기 플레이트 판독에는 Synergy HTX(BioTek Instruments, Highland Park, VT)를 사용하였다. 컷오프 값은 다음과 같이 계산하였다.
- cutoffs : Day 0 of each group; (each value - blank ) Avg +(2.5 x SD)
정규화(normalization)는 플라스미드 pGLS-Spike 및 pGLS-ORF3a가 접종된 마우스 혈청으로 하였다.
대조군은 플라스미드 pGLS-101(음성 대조군), pGLS-Spike(양성 대조군)를 접종한 마우스로부터 채취한 혈청을 사용하였다.
Spike 항원 특이적 결합항체 역가 측정
Spike 항원 특이적 결합항체의 역가를 측정하기 위하여, 플라스미드 접종 전(D0), 2주(Wk2) 및 4주(Wk4) 후에 마우스의 혈청을 채취하였다. 상기 채취된 혈청 및 마우스의 Spike에 결합하는 1차 항체를 이용한 ELISA를 통해 Spike 항원 특이적 결합항체의 역가를 측정하였다. Spike 항원 특이적 결합항체의 역가를 측정한 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pGO-1002를 접종한 시험군(pGLS-Spike-ORF3a)은 Spike 항원 특이적 결합항체의 역가가 양성 대조군(pGLS-Spike)와 유사한 수준임을 확인하였다.
ORF3a 항원 특이적 결합항체 역가 측정
ORF3a 항원 특이적 결합항체의 역가를 측정하기 위하여, 플라스미드 접종 전(D0), 2주(Wk2) 및 4주(Wk4) 후에 마우스의 혈청을 채취하였다. 상기 채취된 혈청 및 마우스의 ORF3a에 결합하는 1차 항체를 이용한 ELISA를 통해 ORF3a 항원 특이적 결합항체의 역가를 측정하였다. ORF3a 항원 특이적 결합항체의 역가를 측정한 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pGO-1002를 접종한 시험군(pGLS-Spike-ORF3a)은 ORF3a 항원 특이적 결합항체의 역가가 음성 대조군(pGLS-101)보다 현저히 높은 것을 확인하였다.
상기 결과는 플라스미드 pGO-1002에 의해 발현된 Spike 및 ORF3a 단백질이 각각 충분한 면역반응을 유도한다는 것을 의미한다.
또한 상기 실시예 1에서 제조된 Spike 및 nucleocapsid를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이시스트로닉 벡터를 이용하여 위와 동일한 방법으로 실험하였다.
그 결과, 상기 실시예 1에서 제조된 Spike 및 nucleocapsid를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이시스트로닉 벡터에 의해 발현된 단백질(즉, Spike 및 nucleocapsid)은 각각 충분한 면역반응을 유도한다는 것을 의미한다.
실시예 5. T세포 면역반응을 통한 면역원성 평가
바이러스를 체내에서 제거하기 위해서는 강력한 항체 반응과 동시에 T세포 면역반응이 필요하다. 본 발명의 Spike 및 ORF3a가 항체 형성에 의한 면역뿐만 아니라, T세포 면역반응을 유도하는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. T세포 면역반응을 통한 면역원성 평가는 ELISpot 분석법(enzymelinked immuno-spot assay)으로 수행하였다.
실험방법
전기천공 접종법을 통해 플라스미드 pGO-1002를 마우스에 근육 내 접종하였으며, 접종은 2주 간격으로 2회 시행하였다. 상기 마우스를 희생시켜 비장을 얻었다. R10 배지에서 마우스 유래 비장으로부터 단일 비장 세포를 개별적으로 수집하여, 단일 세포 현탁액(single cell suspension)을 제조하였다. 상기 R10 배지는 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI1640 배지를 의미한다. 상기 세포 현탁액을 원심분리하여 세포 펠릿을 얻었고, 세포 펠릿을 ACK 용해 완충액(Life Technologies, cat. A1049201) 5 ml에 재부유시킨 후 8분 동안 배양하였다. 배양 후 반응을 정지시키기 위하여, 세포가 포함된 튜브에 R10 배지를 첨가한 후 1400 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 얻었다. 상기 세포 펠릿을 R10 배지에 재부유시켜 세포 현탁액을 제조하였다.
ELISpot 분석법은 마우스 IFN-γ ELISpotPLUS 플레이트(MABTECH, cat. 33212H)를 사용하여 수행하였다. 블로킹(blocking)을 위하여, 포획 항체(capture antibody)로 코팅된 96웰 ELISpot 플레이트에 R10 배지를 첨가한 후 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 마우스 비장세포(splenocyte) 200,000개는 상기 블로킹된 ELISpot 플레이트의 각 웰에 플레이팅하였다. 플레이팅된 세포는 OLP(overlapping long peptide) 풀로 14시간 동안 비장 세포를 자극하였다. R10 배지에서 웰 당 1 μg/ml의 각 펩티드로 세포를 자극하였다. 세포 자극 후 발현된 스팟은 제조사의 매뉴얼에 따라 현상하였다. R10 배지 및 1% DMSO 혼합물과 ConA(concanavaline A)는 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하였다. 스팟은 ImmunoSpot CTL reader로 스캔 및 정량하였다. 세포 1,000,000개 당 SFU(spot-forming unit)는 R10 배지 및 1% DMSO 혼합물을 처리한 웰의 값을 빼서 계산하였다. 컷오프 값(cutoff value)은 다음과 같이 계산하였다:CUTOFF = MEAN of Spot numbers in OLPs + (Standard deviation of spot numbers in OLPs * 3). 컷오프 값을 위한 시료는 백신을 접종하지 않은 비장 세포를 사용하였다.
상기 OLP 풀은 SARS CoV-2의 Spike 또는 ORF3a 단백질 유래 OLP 풀; 또는 이들의 조합;이다.
대조군은 플라스미드 pGLS-101(음성 대조군), pGLS-Spike(양성 대조군)를 접종한 마우스로부터 채취한 비장 세포를 사용하였다.
Spike OLP에 대한 T세포 면역반응 평가
ELISpot 분석을 통해 Spike OLP로 자극된 비장 세포의 T세포 면역반응을 평가하였다. 상기 T세포 면역반응 평가에는 Spike V16-V350에 해당하는 65개의 OLP pool인 S1_OLP1; Spike Y351-Q675에 해당하는 65개의 OLP pool인 S1_OLP2; Spike I666-S975에 해당하는 60개의 OLP pool S2_OLP1; Spike L966-T1273에 해당하는 60개의 OLP pool인 S2_OLP2; ORF3a M1-L275에 해당하는 53개의 OLP pool인 ORF3_OLP1을 사용하였다. 상기 OLP pool은 10개의 아미노산이 중복되는 15 mer 길이의 펩타이드로 구성된다. Spike OLP에 대한 T세포 면역반응을 평가한 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pGO-1002를 접종한 시험군(pGLS-Spike-ORF3a)은 양성 대조군(pGLS-Spike)보다 Spike OLP에 대한 T세포 면역반응을 효과적으로 유도하는 것을 확인하였다.
ORF3a OLP에 대한 T세포 면역반응 평가
ELISpot 분석을 통해 ORF3a OLP로 자극된 비장 세포의 T세포 면역반응을 평가하였으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pGO-1002를 접종한 시험군(pGLS-Spike-ORF3a)은 ORF3a OLP에 대한 T세포 면역반응을 효과적으로 유도하였다.
Spike OLP 및 ORF3a OLP에 대한 합산 T세포 면역반응 평가
ELISpot 분석을 통해 Spike OLP 및 ORF3a OLP로 자극된 비장 세포의 T세포 면역반응을 평가하였다. 실험군은 마우스에 플라스미드 pGO-1002를 근육 내 주사 및 전기천공법을 통해 투여하였다. 대조군은 플라스미드 pGLS101을 근육 내 주사 및 전기천공법으로 투여한 군이다. Spike OLP 및 ORF3a OLP에 대한 합산 T세포 면역반응을 평가한 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pGO-1002를 접종한 시험군(pGLS-Spike-ORF3a)은 발현된 각각의 단백질 Spike 및 ORF3a에 의하여 T세포 면역반응이 효과적으로 유도된 것을 확인하였다.
또한 상기 실시예 1에서 제조된 Spike 및 nucleocapsid를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이시스트로닉 벡터를 이용하여 위와 동일한 방법으로 실험하였다.
그 결과, 상기 실시예 1에서 제조된 Spike 및 nucleocapsid를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이시스트로닉 벡터를 접종한 시험군은 양성 대조군에 비해 현저한 T세포 면역반응 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 6. plaque reduction neutralization assay를 통한 중화항체가 평가
Live SARS-CoV-2를 억제하는 중화항체를 이용한 PRNT50 시험을 통해 중화항체가를 평가하였다. 구체적으로, SARS-CoV-2/South Korea/2020 분리 중화 분석은 질병관리본부에서 수행하였다. 중화 바이러스 역가는 56°C에서 30분 동안 열-비활성화된(heat-inactivated) 혈청 샘플에서 측정하였다. 시험군 혈청은 마우스에 근육내 접종 후 전기천공법을 통해 상기 실시예 1에서 제조된 플라스미드 pGO-1002를 접종(2주 간격으로 2회)한 마우스로부터 얻은 것이며, 대조군 혈청은 플라스미드 pGLS-101 또는 pGLS-Spike를 접종한 마우스로부터 얻은 것이다. SARS-CoV-2(BetaCoV/Korea/KCDC03/2020)(60 pfu ml-1)를 10% FBS, 100 IU ml-1 페니실린 및 100 μg ml-1 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지(Invitrogen, Carlsbad, USA)와 50:50:으로 혼합하였고, 96-well U bottomed plate에서 1:4 내지 1:2040까지 연속 혈청 희석하였다. 상기 플레이트를 37℃인 humidified box에서 1시간 동안 배양한 후 바이러스를 DMEM(Invitrogen, Carlsbad, USA)(10% FBS, 100 IU ml-1 penicillin, 100 μg ml-1 streptomycin 포함)에서 12웰 플레이트(웰당 2.5 x 105 Vero 세포(ATCC, CCL-81)가 시딩된 것)에 접종하였다. 바이러스를 37°C에서 1시간 동안 흡착시키고 플라크 분석 오버레이 배지(2x MEM/1.5% Agar/4% FBS 최종)로 오버레이하였다. 그 후 humidified box에서 37°C에서 3일 동안 배양하였다. 배양된 플레이트를 고정 및 염색하여 플라크를 계수하였다. 각 웰의 Cytopathic effect(CPE)를 현미경으로 기록하고 50% 보호 조건의 희석수로 중화 역가를 계산하였다. 실험 결과는 도 9 및 10에 나타내었다.
도 9 및 10에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제조된 플라스미드 pGO-1002를 접종한 시험군(pGLS-Spike-ORF3a)은 pGLS-Spike 접종군과 유사한 수준의 우수한 중화항체 면역반응이 확인되었다.
또한 상기 실시예 1에서 제조된 Spike 및 nucleocapsid를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이시스트로닉 벡터를 이용하여 위와 동일한 방법으로 실험하였다.
그 결과, 상기 실시예 1에서 제조된 Spike 및 nucleocapsid를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이시스트로닉 벡터를 접종한 시험군은 중화항체가가 높은 것을 확인하였다.
실시예 7. ACE 수용체 경쟁(ACE receptor competition) 평가
바이러스 스파이크 당단백질(RBD)의 수용체 결합 도메인과 ACE2 세포 표면 수용체(GenScript cat# L00847) 사이의 상호 작용을 차단하는 SARS-CoV-2에 대한 순환 중화 항체를 검출하였다. 별도의 튜브에 희석된 대조군 및 시험군 혈청을 1:1 부피비로 희석된 HRP-RBD 용액과 혼합하였다. 상기 시험군 혈청은 마우스에 전기천공 접종법을 통해 상기 실시예 1에서 제조된 플라스미드 pGO-1002를 근육 내 접종(2주 간격으로 2회)한 마우스로부터 얻은 것이며, 대조군 혈청은 플라스미드 pGLS-101 또는 pGLS-Spike를 접종한 마우스로부터 얻은 것이다. 혼합물을 37°C에서 30분 동안 배양하였다. 대조군을 각각 100ul 씩 플레이트의 각 웰에 넣은 후 플레이트 실러로 플레이트를 덮어 37°C에서 15분 동안 배양하였다. 플레이트 실러를 제거한 후 1X 세척 용액 260 ul로 플레이트를 4회 세척하였다. 세척 후 웰에 잔존하는 액체를 제거하기 위하여, 종이타월에 플레이트를 두드렸다. 각 웰에 TMB 용액 100 ul을 첨가하여 20-25°C 조건인 암실에서 15분 동안 배양하고, 각 웰에 정지 용액 50 ul을 첨가하여 반응을 종료시켰다. microtiter plate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 컷오프 값은 확인된 COVID-19 환자 혈청 및 건강한 대조군 혈청에 대한 GenScript 패널의 검증을 기반으로 하며, 다음의 식으로 계산하였다.
Inhibition = (1- OD Value of sample/OD value of Negative Control)*100%
컷오프 값에 대한 해석은 표 1에 나타내었다.
Items Cutoff Result Interpretation
SARS CoV-2 neutralizing antibody test > 20% Positive SARS-CoV2 neutralizing antibody detected
< 20% Negative No detectable SARS CoV-2 neutralizing antibody
ACE 수용체 경쟁 평과 결과는 도 11에 나타내었다.도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제조된 플라스미드 pGO-1002를 접종한 시험군(pGLS-Spike-ORF3a)은 hACE2 단백질과의 경쟁적 결합 능력이 현저히 높은 것을 확인하였다.
또한 상기 실시예 1에서 제조된 Spike 및 nucleocapsid를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이시스트로닉 벡터를 이용하여 위와 동일한 방법으로 실험하였다.
그 결과, 상기 실시예 1에서 제조된 Spike 및 nucleocapsid를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이시스트로닉 벡터를 접종한 시험군은 hACE2 단백질과의 경쟁적 결합 능력이 높은 것을 확인하였다.
종합적으로 본 발명자들은 SARS CoV-2에 대한 DNA 백신, 즉 항원 단백질을 코딩하는 유전자인 Spike 및 ORF3a 유전자를 포함하는 바이시스트로닉 벡터; 및 Spike 및 nucleocapsid 유전자를 포함하는 바이시스트로닉 벡터;를 제조하였다. 상기 바이시스트로닉 벡터는 생체 내에서 발현 및 번역 후 변형을 통해 두 항원 단백질을 생성하고, 생성된 항원 단백질은 현저한 면역원성을 나타낸다는 것, 보다 상세하게는, 2종의 항원 각각에 대하여 뚜렷한 항체 면역반응을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 강한 T세포 면역반응을 유도할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 바이시스트로닉 벡터는 SARS-CoV-2 바이러스 감염증의 예방 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이하, 제제예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 제제예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 제제예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다.
제제예 1. 백신 조성물
플라스미드 pGO-1002
시트르산나트륨수화물(Sodium Citrate)
염화나트륨(Sodium Chloride)
멸균 주사용수(sterile water for injection)
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (24)

  1. (a) SARS-CoV-2 Spike 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 및
    (b) SARS-CoV-2 ORF3a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 또는 SARS-CoV-2 nucleocapsid 또는 이를 코딩하는 유전자;
    를 포함하는, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 백신 조성물.
  2. (a) SARS-CoV-2 Spike 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 및
    (b) SARS-CoV-2 ORF3a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 또는 SARS-CoV-2 nucleocapsid 또는 이를 코딩하는 유전자;
    를 포함하는, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 면역원성 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 Spike, ORF3a 또는 nucleocapsid 단백질을 코딩하는 유전자는 인간의 코돈으로 최적화된 것인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 Spike 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 3의 염기서열로 표시되는 것인, 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 ORF3a 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것인, 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 nucleocapsid 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것인, 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 (a) Spike 단백질을 코딩하는 유전자; 및
    (b) ORF3a 또는 nucleocapsid 단백질을 코딩하는 유전자;는 바이시스트로닉 발현 벡터에 포함된 것인, 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 2회 투여용인, 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 (a) Spike 단백질; 및 (b) ORF3a 또는 nucleocapsid 단백질;에 대한 면역원성이 동시에 유도되는 것인, 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 항체 반응 및 T세포 면역반응을 동시에 유도하는 것인, 조성물.
  11. (a) SARS-CoV-2 Spike 단백질을 코딩하는 유전자 및
    (b) SARS-CoV-2 ORF3a 단백질을 코딩하는 유전자; 또는 SARS-CoV-2 nucleocapsid 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는, 바이시스트로닉 발현 카세트.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 Spike, ORF3a 또는 nucleocapsid 단백질을 코딩하는 유전자는 인간의 코돈으로 최적화된 것인, 바이시스트로닉 발현 카세트.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 Spike 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 3의 염기서열로 표시되는 것인, 바이시스트로닉 발현 카세트.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 ORF3a 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것인, 바이시스트로닉 발현 카세트.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 nucleocapsid 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것인, 바이시스트로닉 발현 카세트.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 바이시스트로닉 발현 카세트는 CMV 프로모터, 코작 서열(Kozak sequence), IgE 리더 서열(IgE leader sequence), 퓨린 인식 부위(furin recognition site), GSG-T2A 절단 부위, BGH 폴리아데닐화 신호(BGH poly adenylation signal), 카나마이신 저항 유전자 및 pUC 오리진으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 구성요소를 더 포함하는 것인, 바이시스트로닉 발현 카세트.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 바이시스트로닉 발현 카세트는 하기의 개열지도로 표시되는 것인, 바이시스트로닉 발현 카세트.
    [개열지도]
    Figure PCTKR2021009290-appb-img-000002
  18. 제11항에 따른 바이시스트로닉 발현 카세트를 포함하는, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방용 백신 조성물.
  19. 제11항에 따른 바이시스트로닉 발현 카세트를 포함하는, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 면역원성 조성물.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    상기 조성물은 근육내(intramuscular), 정맥내(Intravenous), 피하(subcutaneous), 피내(Intradermal) 및 비강내(intranasal)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 경로로 투여되는 것인, 조성물.
  21. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    상기 조성물은 전기천공(electroporation)법, 유전자 총(gene gun)법 및 제트 분사(Jet injection)법으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 방법으로 투여되는 것인, 조성물.
  22. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    상기 조성물은 전기천공법을 통해 근육 내 투여되는 것인, 조성물.
  23. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    상기 조성물은 리포좀 매개 전달(Liposome-mediated delivery)법을 통해 투여되는 것인, 조성물.
  24. 제11항에 따른 바이시스트로닉 발현 카세트를 개체에 처리하는 단계;를 포함하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방 방법.
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FLAVIA CHIUPPESI, MARCELA D’ALINCOURT SALAZAR, HEIDI CONTRERAS, VU H NGUYEN, JOY MARTINEZ, SOOJIN PARK, JENNY NGUYEN, MINDY : "Abstract", BIORXIV, 2 July 2020 (2020-07-02), XP055745182, Retrieved from the Internet <URL:https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.07.01.183236v1.full.pdf> DOI: 10.1101/2020.07.01.183236 *
MAMEDOV TARLAN, YUKSEL DAMLA, ILGIN MERVE, GÜRBÜZASLAN İREM, GULEC BURCU, MAMMADOVA GULSHAN, SAY DENIZ, HASANOVA GULNARA: "Engineering, production and characterization of Spike and Nucleocapsid structural proteins of SARS–CoV-2 in Nicotiana benthamiana as vaccine candidates against COVID-19", BIORXIV, 30 December 2020 (2020-12-30), XP055888021, DOI: 10.1101/2020.12.29.424779 *
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TREVOR R. F. SMITH, AMI PATEL, STEPHANIE RAMOS, DUSTIN ELWOOD, XIZHOU ZHU, JIAN YAN, EBONY N. GARY, SUSANNE N. WALKER, KATHERINE S: "Immunogenicity of a DNA vaccine candidate for COVID-19", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 11, no. 1, 1 December 2020 (2020-12-01), XP055767550, DOI: 10.1038/s41467-020-16505-0 *

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