KR20030062118A

KR20030062118A - 유전자 발현 동물세포 제조용 바이시스트로닉 벡터 및이를 포함하는 세포주 그리고 이를 이용한 항체단백질의생산방법

Info

Publication number: KR20030062118A
Application number: KR1020020002544A
Authority: KR
Inventors: 박우영; 윤혜성; 라근배; 장현숙; 유진산; 정종근; 양재영; 심동섭
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 2002-01-16
Filing date: 2002-01-16
Publication date: 2003-07-23
Also published as: KR100450266B1

Abstract

본 발명은 동물세포에서 바이시스트로닉 발현벡터(bicistronic expression vector)를 이용하여 선택용 표지유전자로 선택시 또는 증폭용 유전자를 증폭할 때 목표유전자를 효율적으로 증폭시킴으로써 원하는 단백질을 고농도로 발현시키는 동물세포용 발현벡터, 이를 포함하는 동물세포주 및 이를 이용한 단백질의 생산방법에 관한 것으로, 항체유전자를 비롯한 여러가지 유전자를 효율적으로 발현시키는데 사용할 수 있다.

Description

유전자 발현 동물세포 제조용 바이시스트로닉 벡터 및 이를 포함하는 세포주 그리고 이를 이용한 항체단백질의 생산방법 {Bicistronic vector for gene-expression by animal cell, the cell line thereof, and the preparation method for antibody peptide thereof}

본 발명은 포유 동물세포에서 유전자를 계속적, 안정적으로 발현하는 세포를 제조하는데 유용하게 사용될 수 있는 바이시스트로닉 발현벡터(bicistronicexpression vector)를 이용하여 선택용 표지유전자로 선택시 또는 증폭용 유전자를 증폭할 때 목표유전자를 효율적으로 증폭시킴으로써 원하는 단백질을 고농도로 발현시키는 동물세포용 발현벡터, 이를 포함하는 동물세포주 및 이를 이용한 단백질의 생산방법에 관한 것이다.

유전 공학적으로 유용한 단백질을 제조하는데 여러 가지 세포 시스템이 이용되지만, 인간 유전자에서 유래된 많은 단백질이 동물세포에서 발현된 경우에만 활성을 갖고 있는 것으로 알려져 있다(Wasley 등, Blood (1991) 77, 2624). 이는 포유동물세포 단백질이 대장균에 의해 발현될 때 대부분의 경우 부정확하게 또는 비능률적으로 3차 구조가 형성됨으로 인해 단백질 활성이 없거나 감소하게 된다. 또한 대부분의 포유동물 단백질은 합성이 된후 당화(glycosylation), 인산화(phosphorylation), 올리고머 형성(oligomerization) 및 특이 위치에서 단백질이 절단되는 일련의 과정을 거쳐 생물학적으로 활성을 나타내는 단백질이 형성된다.

항체유전자는 중쇄(heavy chain) 유전자와 경쇄(light chain) 유전자로 구성되어있으며 이들 유전자로부터 만들어지는 중쇄와 경쇄 단백질이 진핵세포의 골지에서 결합하여 세포벽에 고정되거나 세포외로 분비되게 된다. 치료용 항체로 많이 사용되는 면역글로불린G(IgG)의 경우 골지(Golgi)내에서 중쇄와 경쇄가 이황화결합(disulfide bond)에 의해서 결합되며, 결합된 중쇄-경쇄가 다시 서로 결합된 약 150kDa의 분자량을 갖는 항체분자가 세포외로 분비된다.

유전 공학적으로 치료용 항체 단백질을 동물 세포에서 발현하기 위하여 중국햄스터 난소(CHO, Chinsese Hamster Ovary 이하 'CHO'라 칭한다)세포를 많이 이용하는데(Kaufman 등, Mol. Cell. Biol. (1985) 5, 1750), 이 세포가 현탁 배양이 가능하여 대량 배양을 할 수 있고, 미연방 식품 의약국(FDA)이 의약품 제조용으로 허가한 세포이기 때문이다.

외부 유전자를 발현하는 세포를 제조하는 과정을 간단히 요약하면(Kaufman, Methods in Enz.(1990)185, 537), CHO 세포에 외부 유전자를 형질전환 시킨 후 화학 약품을 이용하여 외부 유전자가 염색체에 재조합된 세포만 성장이 가능하도록 선택 배양하여 세포를 분리한다. 또한 더욱 많은 단백질을 발현하도록 하기 위해서 증가된 양의 화학 약품을 배지에 첨가하여 염색체에 재조합된 외부 유전자의 증폭을 유도한다.

이런 과정을 통하여 약 1000 개 이상의 증폭된 외부 유전자를 갖는 세포주의 제조가 가능하게 된다. 이때 사용되는 선별 유전자와 선별 약품으로는 다이하이드로 폴레이트 리덕테이즈(Dihydrofolate Reductase, 이하 'DHFR'이라 칭한다) 유전자와 이의 억제제인 메소트랙세이트(Methotrexate, 이하 'MTX'라 칭한다)를 주로 사용한다.

통상적으로 항체 유전자를 계속적으로 발현하는 CHO 세포를 제조하기 위해서는 발현하고자 하는 중쇄와 경쇄 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 DNA 와 DHFR 유전자를 갖는 벡터 DNA를 함께 세포에 동시 형질전환(Cotransfection) 시킨 후 두개의 DNA가 동시에 염색체에 통합(integration)된 세포주를 선택배양을 거쳐 분리한다(Kaufman, Methods in Enz.(1990) 185, 487).

그러나 이 동시 형질 전환 체계의 단점은 약품을 이용한 증폭 과정에서 선별 유전자인 DHFR 유전자만 선택적으로 증폭되고 발현하고자 하는 외부 유전자는 제거되는 경우가 많아 외부 유전자를 많이 발현하는 세포주를 제조하는데 성공할 가능성이 매우 희박하다는 문제점이 있었다(Kaufman, Nucl. Acids Res. (1991) 19. 4485).

상기의 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자와 선별 유전자인 DHFR(dihydroxyfolate reductase) 및 NEO유전자가 하나의 유전자처럼 발현되도록 벡터를 설계, 제조함으로써 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자가 효율적으로 증폭 가능한 발현벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

제 1도는 동물 세포 발현용 바이시스트로닉(bicistronic) 발현벡터인 pLCD-MoK-Mok의 클로닝 과정을 도식화 한 공정도이다.

제 2도는 발현벡터 pLCD-MoK-Mok의 자세한 구조를 나타낸 지도이다.

제 3도는 동물 세포 발현용 바이시스트로닉(bicistronic) 발현벡터인 pLCN-MoH의 클로닝 과정을 도식화 한 공정도이다.

제 4도는 발현벡터 pLCN-MoH의 자세한 구조를 나타낸 지도이다.

제 5도는 pANTIBODY의 클로닝 과정을 도식화 한 공정도이다.

제 6도는 발현벡터 pANTIBODY의 자세한 구조를 나타낸 지도이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (1)바이시스트로닉 발현벡터(bicistronic expression vector)에 있어서, 전사 RNA생성에 필요로 되는 부분이 사이토메갈로바이러스(CMV)프로모터, 외래유전자로서 항체의 경쇄 유전자 혹은 중쇄 유전자중에서 1이상 선택된 외래유전자, IRES 서열, 선별유전자 그리고 poly(A)서열의 순서로 구성되는 것을 특징으로 하는 바이시스트로닉 발현벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 (2)상기 선별유전자는 DHFR(dihydroxyfolate reductase) 혹은 NEO^R(neomycine resistance gene)임을 특징으로 하는 상기 바이시스트로닉 발현벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 (3)바이시스트로닉 발현벡터를 동물세포에 형질전환시켜 만들어진 것을 특징으로 하는 형질전환 동물 세포를 제공한다.

또한 본 발명은 (4)상기 형질전환된 동물세포를 이용하여 외래유전자를 대량으로 발현하는 동물세포를 이용한 단백질의 생산방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (5)전사 RNA 생성에 필요로 되어지는 부분이 사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터, 외래 유전자, IRES 서열, 선별 유전자로 DHFR 및 poly(A)의 서열의 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는 바이시스트로닉 발현벡터 pLCD-MoK(KCTC 10151BP)를 제공한다.

또한 본 발명은 (6)전사되어지는 RNA가 '항체의 경쇄 유전자-IRES-DHFR-poly(A)'의 서열의 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는 바이시스트로닉 발현벡터 pLCE-MoK(KCTC 10151BP)를 제공한다.

또한 본 발명은 (7)상기 (6)의 발현벡터로 형질전환된 CHO 세포주를 제공한다.

또한 본 발명은 (8)전사되어지는 RNA가 '항체의 중쇄 유전자-IRES-NEO-poly(A)'의 서열의 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는 바이시스트로닉 발현벡터 pLCN-MoH(KCTC 10150BP)를 제공한다.

또한 본 발명은 (9)상기 (8)의 발현벡터로 형질전환된 CHO 세포주를 제공한다.

또한 본 발명은 (10)전사되어지는 RNA가 '항체의 경쇄 유전자-IRES-DHFR-poly(A)-항체 중쇄 유전자-IRES-NEO-poly(A)'의 서열의 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는 바이시스트로닉 발현벡터 pANTIBODY(KTCC 10152BP)를 제공한다.

또한 본 발명은 (11)상기 (10)의 발현벡터로 형질전환된 CHO 세포주를 제공한다.

일반적으로 대장균과 같은 원핵세포에서는 하나의 mRNA상의 여러부위에 리보소옴이 부착될 수 있으며, 그 근처의 시작 코돈 AUG를 찾게 되고, 그 결과 하나의 mRNA로부터 여러 폴리펩티드가 합성될 수 있다. 이를 폴리시스트로닉 (polycistronic) 시스템이라 부른다.

반면, 진핵세포에서는 mRNA로부터 단백질을 해독(translation)할 때 리보소옴이 mRNA의 5'끝에 부착된 후 스캐닝(scanning)방법을 통해서 시작 코돈인 AUG를 찾게 되고, 이 AUG 코돈으로 부터 단백질의 합성이 시작된다. 따라서 하나의 mRNA로부터 반드시 하나의 폴리펩티드가 형성된다. 이러한 시스템을 모노시스트로닉(monocistronic) 시스템이라 부른다.

하지만 폴리오바이러스 또는 EMC바이러스(Encephalomyocarditis virus)의 경우는, 내부 인트론 진입부분(Internal Ribosome Entry Site, IRES, 이하 'IRES'라 칭한다)이라 불리는 특별한 구조로 되어있는 RNA서열을 갖고 있으며, 이를 이용하여 대장균(E.coli)과 같이 mRNA의 내부에서도 리보소옴이 폴리펩티드를 합성 할 수 있다(Jang 등, J. Virol.(1989) 63, 1651).

본 발명에서는, 지금까지 알려진 가장 강력한 동물 세포용 프로모터중의 하나인 사이토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus, 이하 'CMV'라 칭한다; Bohart 등, Cell (1985) 41, 521; Thomen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1984) 81, 659)의 프로모터를 이용하였다.

이 프로모터의 인헨서(enhancer) 역시 광범위한 숙주에서 활성을 나타낼 뿐 아니라 일시 발현 시스템(transient expression system)에서 강력한 인헨서 중의 하나(Foecking 등, Gene (1986) 45, 101)라고 알려져 있는 CMV 초기 프로모터를 이용하여 항체의 경쇄와 중쇄 유전자의 높은 발현을 유도하였으며, 특히 효율적으로 경쇄 유전자를 증폭시키기 위하여 경쇄 유전자 밑에 선택 유전자인 DHFR유전자의 오픈리딩프레임(open reading frame, ORF)이 오도록 하고, DHFR유전자의 개시코돈 바로 위에 IRES서열이 오도록 발현벡터를 디자인하였다.

따라서 CMV 초기 프로모터에 의해서 전사된 RNA는 경쇄 및 DHFR유전자를 포함하게 된다. 이는 MTX를 이용해서 DHFR 유전자를 증폭했을 때 중쇄를 코딩하는 부분도 함께 증폭됨을 의미한다. 중쇄 유전자의 경우는 경쇄 유전자의 경우와 동일한 방법으로 CMV 프로모터-중쇄 유전자-IRES-NEO 유전자 순으로 배열되도록 발현벡터를 디자인하였다.

본 발명에서 사용된 항체의 유전자는 활성화된 T-면역세포에서 발현이 유도되는 4-1BB(또는 CD137)에 대한 인간화된 항체유전자를 사용하였으며(대한민국 특허출원 공개번호 제2000-034847호), 기존의 항체 발현벡터와 본 발명에서 제조된 항체 발현벡터(pANTIBODY, KCTC 10152BP)를 이용하여 제조된 항체생산세포주의 항체생산능력을 서로 비교하였으며, 비교결과 본 발명자들이 개발한 항체발현벡터가 기존의 방법보다 적어도 5배 이상 생산성이 향상됨을 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 경쇄발현벡터 pLCD-MoK-Mok의 제조

멀티클로닝(Multicloning)부위와 CMV 프로모터, SV40 인트론(intron)과 폴리 A 시그널 시퀀스(signal sequence)를 갖고 있는 pcDNA3(Invitrogen사 제품, 3985 B Sorrento Valley Blvd. San Diego, Ca92121, USA)의 HinDIII, XbaI 제한 효소 인지 부위에, 2개의 DNA절편(DNA절편 1 과 2)을 접합하여 경쇄발현벡터 pLCD-MoK-Mok를 제조하였다.

DNA절편 1은 경쇄유전자를 가지고 있는 플라스미드 pRc-HzB4-Mok-gs(대한민국 특허출원 공개번호 제2000-034847호)에서 프라이머 Mok H3 와 프라이머 Mok Sal 을 이용하여 PCR(Polymerase chain reaction, 이하 'PCR'이라 칭한다)로 증폭하였다.

본 발명에서 사용된 모든 프라이머의 염기서열은 하기 표 1에 표시하였다.

증폭된 DNA절편은 제한 효소 HinDIII, SalI으로 절단하여 순수 정제하였으며, 모든 DNA절편의 순수 정제는 누클레오트렙 DNA 익스트렉션 키트(NucleoTrap DNA Extraction Kit, 클론테크 레보레터리스사(Clontech laboratories, Inc)제품)을 사용하였다. 한편 EMC 바이러스(Encephalomyocarditis virus)의 IRES와 DHFR 유전자를 함유하고 있는 DNA절편 2는 pLCED4 gDs(대한민국 특허공개공보 제1997-006485호)을 XhoI, XbaI으로 절단하여 순수 정제하였다.

또한 접합반응 벡터 및 삽입할 DNA 절편을 약 100ng씩 사용하였으며, 2㎕의 10배 접합 반응용액(50mM 트리스-염산(HCl), pH 7.8, 10mM 염화마그네슘(MgCl₂),10mM 디티오트레이톨, 1mM ATP, 25㎍/㎖ 소혈청알부민(BSA))과 10 단위체의 T4 DNA 리가제(ligase)를 가하고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃ 에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된후 대장균 HB101(ATCC 33694)를 형질전환시켜 엠피실린이 함유된 플레이트에서 선별한후 적절한 제한효소로 절단하여 원하는 DNA 절편을 함유한 플라스미드를 얻었으며, 최종적으로 DNA 염기서열을 확인하였다.

PCR은 온도 순환기(DNA Thermocycler, 미합중국 Perkin-elmer사 제품)를 이용하였는데 순환 프로그램은 94℃, 30초; 45℃, 30초; 72℃, 1분간의 순환을 25회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 제한효소절단 및 접합은 미합중국소재 뉴잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs)사에서 구입한 제한효소와 접합효소를 사용하였으며, 반응조건은 제조회사에서 추천하는 방법을 따랐다. 상기의 발현벡터의 클로닝 과정을 도 1에 도시하였고 이 벡터의 자세한 지도는 도 2에 도시하였다.

PCR 및 변이발생(Mutagenesis)에 사용된 프라이머 이름 및 그 염기서열

프라이머 이름	프라이머 염기서열
Mok H3	5'-gctagtaagcttagagcttcatcagacaggca-3'
Mok Sal	5'-gctagtgtcgacgaatgagagaaacca-3'
MoH H3	5'-gctcagaagcttgccgccaccatgggatggag-3'
MoH Sal	5'-gctcaggtcgacctgacccgtggaaag-3'
NEO Cla1	5'-atggtaatcgatatgattgaacaagatgga-3'
NEO Xba1	5'-gggccctctagatcagaagaactcgtcaag-3'
MoH Xho	5'-gtgagctaacctcgagtcacattaat-3'
Mok Xho	5'-tctgaggcggaactcgagagaaccag-3'

<실시예 2> 중쇄발현벡터 pLCN-MoH의 제조

중쇄발현벡터 pLCN-MoH의 제조는 실시예 1에서 얻은, HinDIII, XbaI 제한 효소에 의해서 절단된 pcDNA3에 3개의 DNA절편(DNA절편 3, 4 및 5)을 접합하여 중쇄발현벡터 pLCN-MoH를 제조하였다.

DNA절편 3은 중쇄유전자를 가지고있는 플라스미드 pCI-HzB4-MoH (대한민국 특허출원 제 99-16750호)에서 프라이머 MoH H3 와 프라이머 MoH Sal 을 이용하여 PCR(Polymerase chain reaction)로 증폭하였다. 증폭된 DNA절편은 제한 효소 HinDIII, SalI으로 절단하여 순수 정제하였다.

DNA절편 4는 EMC의 IRES유전자를 함유하고 있으며 pLCED4 gDs (대한민국 특허출원 출원번호 제1995-022864호)을 XhoI, ClaI으로 절단하여 순수 정제하였다. DNA절편 5는 네오마이신 유전자(NEO gene)을 함유한 절편으로 pcDNA3에서 프라이머 NEO Cla1 와 프라이머 NEO Xba1 을 이용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 DNA절편은 제한 효소 Cla1, XbaI으로 절단하여 순수 정제하였다.

DNA조작에 관련된 PCR, 제한효소절단, 접합, DNA 절편의 분리정제 방법은 실시예 1에서와 동일한 방법을 사용하였다. 상기의 발현벡터의 클로닝 과정을 도 3에 도시하였고 이 벡터의 자세한 지도는 도 4에 도시하였다.

<실시예 3> 경쇄/중쇄 발현벡터 pANTIBODY 의 제조

하나의 플라스미드에서 항체의 경쇄와 중쇄를 동시에 발현할 수 있는 발현벡터시스템을 만들기 위해 중쇄 발현벡터인 pLCN-MoH의 SV40 poly(A)와 플라스미드 복제 오리진(ColE1 origin) 사이에 경쇄발현벡터 pLCD-MoK-Mok 의 CMV 프로모터-경쇄 유전자-EMC IRES-DHFR 유전자를 함유하는 DNA 절편을 삽입하여 pANTIBODY을 제조하였다.

먼저 클로닝을 용이하게 하기 위하여 다음과 같이 pLCN-MoH와 pLCD-MoK-Mok에 사이트-디렉티드 뮤타지네시스(site-directed mutagenesis)방법을 이용하여 XhoI 제한효소 인지부위를 각각 도입하였다. pLCN-MoH 에 XhoI 제한효소 인지부위를 각각 도입하기위해 프라이머 MoH Xho 을 이용하였으며, pLCD-MoK-Mok에 XhoI 제한효소 인지부위를 각각 도입하기 위해 프라이머 Mok Xho 을 이용하였다.

사이트-디렉티드 뮤타지네시스(site-directed mutagenesis)는 미합중국 소재 프로메가(Promega)사(2800 Woods Hollow Road, Medison, WI, USA)제품으로 상표명 진이디터(GeneEditor^TMin vitro Site-Directed Mutagenesis Kit 카탈로그 번호 Q9280)를 이용하였으며, 그 방법은 제조회사에서 추천하는 방법을 따랐다.

그 결과 변형된 플라스미드는 각각 pLCN-MoH(xho), pLCD-MoK-Mok(xho)라 명명하였다.

pLCN-MoH(xho)를 제한효소 XhoI으로 완전 절단한 후, 제한효소 SalI으로 부분절단하여 약 8.1kb 절편을 분리정제 하였으며, 이를 'DNA절편6' 이라 명명하였다. 한편 pLCD-MoK-Mok(xho)은 제한효소 XhoI과 제한효소 SalI으로 완전절단하여 약 3.1kb 절편을 분리정제하여 'DNA절편7' 이라 명명하였다.

이어 DNA절편6 과 DNA절편7을 접합하여 11.16kb 크기의 pANTIBODY를 얻었다. 상기의 발현벡터의 클로닝 과정을 도 5에 도시하였고 이 벡터의 자세한 지도는 도 6에 도시하였다.

<실시예 4> 경쇄/중쇄 발현벡터 pANTIBODY 의 발현율 검사.

(단계 1) 형질전환

항체단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위해 우선 DHFR 결핍 CHO 세포(ATCC CRL 9096)를 형질 감염 실험 전날 36mm 플레이트에 12배 정도 희석 분양한 후, 37℃, 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.

세포가 플레이트에 70 내지 80% 정도 성장한 것을 확인한 후 리포펙트아민 플러스 시약(Lipofectamine plus reagent, Gibco BRL사 제품 카탈로그 번호 10964-013/11514-015)으로 플라스미드 pANTIBODY DNA를 세포내로 형질감염시켰다. 이때 배지로는 10% 송아지 혈청, 하이포산크산틴(hypoxanthine)과 티미딘(thymidine)이 각각 10㎍/㎖ 함유된 IMDM배지(Iscove's modified Dulbecco's media, Gibco BRL사 제품, 카탈로그 번호 12200-069)를 사용하였다.

이틀 후에 하이포크산틴과 티미딘이 없고 투석된 송아지 혈청이 10%, 지네티신(Geneticin, Gibco BRL사 제품, 카탈로그 번호 11811-031)이 800㎍/㎖ 농도로 함유된 알파 배지(complete alpha medium; minimum essential medium(MEM), Gibco BRL사 제품, 카탈로그 번호 12000-022)로 교체하여 형질전환된 CHO 세포만이 성장할 수 있도록 선택배양을 하였다.

선택배양 시작일로부터 10 내지 14일이 경과된 후부터 살아남은 세포의 콜로니가 형성되기 시작하였다. 이중 성장속도가 양호한 세포들이 직경 100mm 배양접시당 10⁷이상 될 때까지 배양한 후 일부를 동결 보관하고 일부는 유전자 증폭과정을 실행하였다.

(단계 2) 형질전환된 CHO 세포의 항체 유전자 증폭

형질전환된 유전자의 증폭은 DHFR의 저해제인 메토트렉세이트(methotrexate, MTX)를 선택배지에 첨가해 주고 세포를 배양하면서 그 농도를 단계적으로 증가시켜서 DHFR 유전자와 함께 항체 유전자의 증폭을 유도함으로써 수행하였다.

MTX의 농도는 초기에는 30nM에서 시작하여 약 3 배씩 증가시켜 나가는데 각 MTX의 농도에서 최소한 2 내지 3회 이상 단계 배양을 실시해서 정상적인 CHO 세포의 성장과 성장속도를 보일 때 다음 단계의 MTX로 그 농도를 증가시켰다.

특히 1μM의 MTX 농도에서 성장속도가 양호한 40개의 세포군으로 나누어서 항체 단백질의 발현율은 지에스티-휴먼(GST-human)4-1BB로 코팅된 플레이트를 이용한 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay, 이하 'ELISA'라 칭한다)방법으로 정량하였다. ELISA는 96-웰플레이트(well plate)의 한 웰(well)당 2㎍/㎖농도의 지에스티-휴먼(GST-human)4-1BB 단백질을 100㎕씩 가하고 37℃, 4시간 동안 배양한 후에, 0.05% 티머로졸(thimerosol)을 함유하는 1%의 소혈청 알부민(BSA)로 블로킹(blocking)한 후 1차 항체 100㎕를 가하여 37℃, 1시간 동안 반응 시킨 후 1xPBS, 0.05% 트윈20(tween20)으로 다섯 차례 세척하였다.

이어 2차 항체 100㎕를 가하여 37℃, 1시간 동안 반응 시킨 후 1xPBS, 0.05% 트윈20(tween20)으로 다섯 차례 세척하였다. o-페닐렌디아민(OPD ; o-Phenylenediamine)으로 발색시킨후 490nm에서 ELISA 리더(ELISA READER, Molecular Devices사 제품, 제품명 SPECTRA MAX340)로 발색정도를 측정하였다. 이후 이로부터 성장 속도가 양호하고 높은 발현율을 보여준 클론들을 배양하여 항체 생산성을 측정하였다(실시예 5 참조).

<실시예 5> pANTIBODY에의해 형질전환된 세포주와 기존 항체발현벡터에 의해 형질전환된 세포주의 항체생산성의 비교

(단계 1) 실시예 4에서 얻은 pANTIBODY에 의해 형질전환된 세포를 플라스크 T175에서 무혈청배지(CHO-S-SFMII, Gibco사 제품)로 37℃, 5% CO2 조건을 유지하면서 3일간 배양하였다. 이 배양액이 함유하고 있는 발현된 항체량을 상기와 동일한 ELISA 방법으로 정량하였다. 기존 항체발현벡터에 의해 형질전환된 세포주 SB500-23(KCTC 0541BP)와 항체생산성을 비교해 본 결과는 다음과 같다.

항체 발현벡터	세포주	발현양 (mg/L)
pANTIBODY	HB02-164	6.9
pCI-HzB4-MoH/pRc-HzB4-Mok-gs	SB500-23	0.13

상기 표 2에서 보는 바와 같이 본 발명에 의한 벡터를 이용하여 발현시킨 항체의 양이 기존의 항체발현벡터에 의하여 형질전환된 세포에서 발현된 항체의 양에 비하여 약 530%이상 증가된 것을 알 수 있었다.

이상에서 본 바와 같이 본 발명은 동물세포에서 바이시스트로닉 벡터시스템을 이용하여 선택용 표지유전자로 선택시 또는 증폭용 유전자를 증폭할 때 목표유전자를 효율적으로 증폭시킴으로써 원하는 단백질을 고효율로 발현시킬 수 있는 동물세포용 발현벡터, 이를 포함하는 동물 세포주 및 이를 이용한 단백질의 생산방법을 제공하는 유용한 발명인 것이다.

Claims

바이시스트로닉 발현벡터에 있어서,

전사 RNA생성에 필요로 되는 부분이 사이토메갈로바이러스(CMV)프로모터, 외래유전자로서 항체의 경쇄 유전자 혹은 중쇄 유전자중에서 1이상 선택된 외래유전자, IRES 서열, 선별유전자 그리고 poly(A)서열의 순서로 구성되는 것을 특징으로 하는 바이시스트로닉 발현벡터.
제 1항에 있어서,

상기 선별유전자는 DHFR(dihydroxyfolate reductase) 혹은 NEO^R(neomycine resistance gene)임을 특징으로 하는 상기 바이시스트로닉 발현벡터.
제 1항의 바이시스트로닉 발현벡터를 동물세포에 형질전환시켜 만들어진 것을 특징으로 하는 형질전환 동물세포.
동물세포의 증식에 의한 단백질의 생산방법에 있어서,

제 3항의 형질전환된 동물세포를 이용하여 항체의 경쇄 유전자 혹은 중쇄 유전자중에서 1이상 선택된 외래유전자를 대량으로 발현하는 단백질의 생산방법.
제 1항에 있어서,

전사 RNA 생성에 필요로 되어지는 부분이 사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터, 외래 유전자, IRES 서열, 선별 유전자로 DHFR 및 poly(A)의 서열의 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는 바이시스트로닉 발현벡터 pLCD-MoK(수탁번호 KCTC 10151BP).
전사되어지는 RNA가 '항체의 경쇄 유전자-IRES-DHFR-poly(A)'의 서열의 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는 바이시스트로닉 발현벡터 pLCD-MoK(수탁번호 KCTC 10151BP).
전사되어지는 RNA가 '항체의 중쇄 유전자-IRES-NEO-poly(A)'의 서열의 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는 바이시스트로닉 발현벡터 pLCN-MoH(수탁번호 KCTC 10150BP).
전사되어지는 RNA가 '항체의 경쇄 유전자-IRES-DHFR-poly(A)-항체 중쇄 유전자-IRES-NEO-poly(A)'의 서열의 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는 바이시스트로닉 발현벡터 pANTIBODY(수탁번호 KCTC 10152BP).