JPH08502644A

JPH08502644A - 多シストロン発現ユニットおよびそれらの使用

Info

Publication number: JPH08502644A
Application number: JP6506831A
Authority: JP
Inventors: ディルクス，ヴィルヘルム; ヴィルト，マンフレート; ホイザー，ハンスエルク; アイヒナー，ヴォルフラム; アハターベルク，フォルカー; デルシュナー，アルブレヒト; マイヤー−インゴルト，ヴォルフガング; ミエルケ，ハイコ
Original assignee: バイアースドルフアーゲー; ゲゼルシャフトフュアビオテヒノロギッシェフォルシュングエムベーハー
Priority date: 1992-08-27
Filing date: 1993-08-26
Publication date: 1996-03-26
Anticipated expiration: 2019-04-05
Also published as: DE59309352D1; US6060273A; DE4228458A1; ES2127831T3; JP3515110B2; EP0658198B1; EP0658198A1; WO1994005785A1; DK0658198T3; AU4953793A

Abstract

(57)【要約】多シストロン発現ユニットにより、対応したシストロンに位置する遺伝子が等モル発現する。これらの発現ユニットは、特に、２つまたはそれ以上のポリペプチドサブユニットから構成されるタンパク質の組換え産生に適切である。

Description

【発明の詳細な説明】多シストロン発現ユニットおよびそれらの使用本発明は、多シストロン発現ユニット、および宿主細胞としての哺乳動物細胞におけるポリペプチドおよびそれらのサブユニットの等モル発現のためのそれらの使用に関する。種々の原核細胞および真核細胞において、操作および遺伝子転移によって、遺伝子がクローニングにより単離された個々のタンパク質を調製することが、長年にわたって可能であった。適切な折り畳みおよびプロセシング、および、適切な場合では、原核および下等真核発現系ではしばしば適切には行われない翻訳後の改変もまた、多くのタンパク質の完全な生物学的活性を達成するために必要である。この理由のために、しばしば、哺乳動物細胞が宿主として使用される。このことに加えて、哺乳動物細胞は、多量のタンパク質を分泌することができる。種々の理由により、２つ以上のタンパク質鎖の同時調製が、しばしば要求される。例えば、多くの天然タンパク質は、その機能形態において、数個のサブユニットから構成されている（例えば、抗体）。実際に、複合タンパク質の個々のサブユニットの会合は、タンパク質合成後に行われる。細胞組織のその他の成分は、触媒または制御要素として、しばしはこの会合に関与し、場合に応じて本来の構造の折り畳みが起こる。会合の妨害は、例えば、個々の成分の一様でない合成の結果として、形成されるべきタンパク質および宿主細胞の両方にとって、成果のあがらない結果になり得る。実際に、この系は精巧な調節を必要とし、ほとんどの部分に対して細胞特異性である。この調節は、遺伝子操作された細胞では一般的に調節されないので、数種の外来タンパク質の同時産生を行うための下記に説明されている代替法が、開発され、適用されている： 1)遺伝子を、発現ベクター中に別々に組み込み、次に、適切な割合で細胞に共転移する。このことは、いくつかのプラスミドコピーが、安定な様式で同時に取り込まれ、分裂時に停留し続けることを前提にする。個々の遺伝子の互いの遺伝子に対する発現割合は、コピー数および宿主細胞ゲノム中への組み込み部位の両方に依存する。精巧なスクリーニング法により、所望の割合で個々の遺伝子産物を発現する細胞クローンを単離することが可能である。 2)コピー数を一様にするために、個々の遺伝子を、１つのベクターの独立した転写ユニットに配置する。これは、広範囲にわたり、遺伝子の化学量論的表現を確実にするが、このプロセスはまた問題を有する。従って、同じ強度のプロモーターを有する発現ユニットが使用されても、異なるタンパク質をコードするmRNA が、同じ安定性および翻訳効率を有することは、決して保証されない。２つの遺伝子の転写効率が必ずしも同じである必要はない。この場合において、発現の化学量論は、組換えDNA法により、段階的に（step-wise）生成される（互いに関連する転写ユニットの配置、および、個々の要素の除去または付加による、個々のプロモーターの強度の調節）。 3)複シストロンまたは多シストロンベクターは、個々の転写物のmRNAの安定性に関連した問題を避けるために開発された。この目的のために、タンパク質鎖をコードする遺伝子セグメント（シストロン）の個々の読み取り枠は、１つの転写ユニット（発現ユニット）上に存在する。多シストロン遺伝子の発現は、１つのプロモーターにより影響される。このようなベクター中の最初のシストロンは、通常は非常に効率よく翻訳されるが、後続のシストロンは、シストロン間配列に依存して翻訳される。単シストロン遺伝子の通常の5'非翻訳配列（5'UTR）が、これらのシストロン間配列に使用される場合には、後続シストロンの発現は普通非常に低い（概して、最初のシストロンの翻訳の約0.5から２％、Kaufmanら、19 87；Boelら、1987）。リーダー配列（高効率リーダー、HEL）を挿入することにより、この効率を約20％増すことが最初に可能となった。翻訳の内部開始を可能にする特定の細胞配列およびウイルス配列（IRES；Jacksonら，1990）の発見および使用により、最初のシストロンと後続のシストロンとの翻訳比を3:1に達成することが続けて可能となった。翻訳は、複シストロンベクターまたは多シストロンベクターの使用において重要な役割を果たす。通常、翻訳は、「キャップ」依存機構に従って真核生物で開始され、これにおいて、タンパク質およびRNAからなる前開始複合休（pre-initiation complex）が「キャップ」（メチル化ヌクレオチド）を有するmRNAの5'末端に構築される。この点から、適切な翻訳開始コドンが選択され、その位置から翻訳が開始される。このことは、前開始複合体が3'方向へmRNAに沿って移動する「スキャニング」プロセスにより起こると考えられる。数種の例外を除き、5'末端に存在するシストロンは、この様式で、いつも効率よく翻訳される（Kozak，1989）。後続の全てのシストロンは、全く翻訳されないか、または非常に非効率的にのみ翻訳される。後続シストロンの翻訳効率を改良することは、遺伝子間の距離（シストロン間領域；Kozak，1987；Wirthら、1991）の最適化、またはいわゆる「高効率リーダー」配列（HEL、上記を参照のこと）の使用により可能であった（例えば、Falcone およびAndrews，1991、およびそこに援用されている参考文献）。HELは、「キャップ」依存翻訳の開始を刺激する、遺伝子またはその他の配列の5'非翻訳領域である。しかし、この種の構築物においてさえ、第２および後続シストロンで達成され得る発現値は、「キャップ」依存様式で調節される第１シストロンの発現値より、いつも明らかに低い。近年発見された内部で翻訳を開始させる機構、すなわち「キャップ」構造のないmRNAで翻訳を開始する機構は、特異的核酸配列を使用する。これらの配列は、個々のピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルスおよび脳心筋炎ウイルス（Pe lletierおよびSonenberg，1988：Jangら、1988；Jangら、1989））およびある種の細胞タンパク質（例えば、BiP（MacejakおよびSarnow，1991））の非翻訳領域を含む。ピコルナウイルスでは、いわゆるIRES（リボソーム内部エントリー部位）である5'非翻訳領域の短いセグメントが、前開始複合体の内部結合の原因となる。628ntの領域が、この翻訳を効率よく開始させるために必要である。研究により、IRESの3'領域の400塩基対のみではなく、ピコルナウイルス非翻訳領域の5'末端部分もまた効率的な翻訳に必要であることが示されている（Si moesおよびSarnow，1991）。他方で、翻訳開始の通常の機構には不可欠である「キャッピング」は、対応するmRNAの5'末端に存在するときには、ポリオウイルス IRESによる内部開始効率を減退させる（HambridgeおよびSarnow，1991）。ネガティブ効果は、IRESが第２シストロンの開始の原因となる場合に避けられ、それは、シストロンが「キャップ」とIRESとの間に存在するときである。従って、IRES要素は、読み取り枠の効率的な翻訳のイニシエーターとして機能し得る。これを行うとき、それらは、第１シストロンの「キャップ」依存翻訳に対して影響を及ぼさない。さらに逆に、IRES依存開始における影響は、「キャップ」依存翻訳開始には依存しないようである。２つのプロセスの機構もまた、異なる細胞因子の使用において明らかに区別される（Meerovitchら、1989；JangおよびWimmer，1990）。過去には、複シストロン発現プラスミドを使用したいくつかの研究が公表された（Adamら、1991；Ghattasら、1991；Kaufmanら、1991；Wo odら、1991；Wirthら、1991）。しかし、「キャップ」依存翻訳は、IRES依存翻訳より明らかに強いので、２つのタンパク質鎖の化学量論的発現を達成することは不可能であった。従って、今までの応用は、第２シストロンにおける選択マーカーの使用に集中していた。選択マーカー発現物と、発現されるべき遺伝子（第１シストロンを構成する）との近接カップリングは、高レベルの発現を選択するとき、特に前に遺伝子増幅が必要である場合に、特に有利である。しかし、複シストロンまたは多シストロン発現ベクターによる等モル量タンパク質の合成はまだ達成されていない。組換え調製法における２つの異なるタンパク質鎖の当モル発現が重要であると考えられる典型的な例は、血小板由来成長因子（PDGF）ヒト血清中の主要マイトジェンの１つ）の遺伝子操作による単離である。ヒト血小板から精製されたPDGF は、ジスルフィド架橋によって互いに結合される、２つの異なるが密接に関連するポリペプチド鎖からなる。還元条件下では、ダイマーPDGFはそのモノマーサブユニットに解離し、このサブユニットのうちより大きいサブユニット（M_r 15-17 ,000 D）はPDGF-A鎖、そして小さなサブユニット（M_r 14,000 D）はPDGF-B鎖と命名されている（Johnssonら、1984）。 PDGF-AおよびPDGF-Bタンパク質鎖は、異なる遺伝子によりコードされる。両遺伝子産物の完全な構造を、cDNAクローニング法により解明することは可能となった（Ratnerら、1985，Betsholtzら、1986）。これに関連して、両PDGF分子は、非常に長い前駆体分子として最初に合成され、続いて細胞内でプロセシングされて成熟PDGF鎮を生じることが明らかになった。3'領域の69-bpセグメントの存在または不在により異なる、２つの異なるPDGF-A転写物は、別のスプライシングに基づいて説明され得る（Betsholtzら、1986；Wiseら、1989）。この挿入は、コーディングセグメントに変化を生じさせ、その結果、PDGF-A鎖の短い変異体（PDGF-A_K、110アミノ酸）および長い変異体（PDGF-A_L、125アミノ酸）が形成される。両変異体は、互いに並んだ通常の細胞タンパク質として検出され、より短い形態がより頻繁に生じる種である（Matoskovaら、1989；Youngら、 1990）。２つの遺伝子は異なる染色休上に配置され、高度の相同性を示す。多くの研究で、２つの遺伝子は、異なる調節機構に従属することが示されている。この結果、実際に、２つのPDGF鎖は、互いに異なる割合で、別々の細胞型で産生される。 PDGFの可能な３つの異性体（AA、AB、およびBB）はすべて天然に存在し、血小板中のいわゆるα顆粒中に蓄えられる。多量に形成するPDGF-ABヘテロダイマーとは別に、約30％までのPDGF-BBもまた、成人ヒト血小板から単離され得る（Ham macherら、1988）。新しく調製された血小板もまた高い割合（27％）でPDGF-AA を含有する（Hartら、1990）。従って、栓球前駆体細胞、すなわち巨核球中では、２つのホモダイマーを合わせた割合は、ABヘテロダイマーの割合にほぼ一致することが予測され得る。血小板中の各PDGF種の濃度は、創傷治癒過程での個々の重要性に直接関連するので、最も頻繁に生じるイソ型、すなわちPDGF-ABが、特に「創傷治癒ホルモン」の研究で重要視される。各々の異なるイソ型は、インビトロで生物学的活性を有する。種々のPDGF種の活性の異なるスペクトルを区別することを目的とする比較研究を可能にしたのは、高度精製の組換えPDGFイソ型の入手性のみであった（Hoppeら、1989：Hoppeら、1990）。一方、一連の研究により、走化性およびDNA増殖テストにおけるPDGF- AA、PDGF-AB、およびPDGF-BBの能力の違い（Hosangら、1989：Nisterら、1988： ReillyおよびBroski，1989；Siegbahnら、1990）、および、イノシトール1,4,5- トリホスフェート遊離、ジアシルグリセロールの産生、および［Ca²⁺］_i、移動におけるそれらの影響の差異（Blockら、1989：Sachinidisら、1990 A,1990 B）が実証されている。２つの異なるPDGFレセプター群（PDGFαレセプターは全PDGF イソ型に結合し、βレセプターはPDGF-BBのみに結合する、Hartら，1988；Heldi nら，1988）は、PDGFイソ型の効果の相違が、それらの異なるレセプター活性化能力により、いかに導き出され得るかに関してもっともらしい説明を提供する。 PDGFイソ型が測定可能であり、異なるインビトロ効果を有することにより、２つの異なるレセプター群が実証されるとともに、PDGF-AA、PDGF-AB、およびPDGF-B B活性のインビボスペクトルが異なるという結論が導き出される。この理由により、夾雑タンパク質としてPDGF-BBまたはPDGF-AAが存在しない、純粋PDGF-ABの生産が望まれる。均質な、よく特徴づけられたヘテロダイマーを得るために、その点で、ホモダイマーが精製により完全に除去されなければならないが、この精製は、全PDGF種が非常に類似したクロマトグラフィー特性を有することによりあまり役に立たない。組換えPDGFホモダイマー（特にPDGF-BB）の調製のための一連の種々の経路が、比較的長い間、ある程度知られていた（Kellyら、1985；Heldinら、1986；Hop peら、1989；Beckmannら、1988：Bywaterら、1988：StroobantおよびWaterfie1d 1984）。高度に純粋なPDGF-ABの調製方法は、Hoppeらにより記載された（1990 ，PCT/EP 90/00 063もまた参照のこと）。この方法では、個別のE.coli細胞で別々に調製された不活性モノマーを、インビトロで復元して、生物学的に活性なPD GF-ABに変換する。 AおよびB一本鎖の種々の長さにも関わらず、従来合成されていた３つのPDGFイソ型の遺伝子産物は、広範囲にわたり互いに一致する生物学的活性を示す。序論に掲載されている２つ（またはそれ以上）のタンパク質の同時発現の基準は、真核生物系でのPDGF-ABヘテロダイマーの異種発現にもまた適用する。組換えCHO細胞でのPDGF-ABの 2］について以前に公表された戦略は、上記の2)で考察された例に相当し、ここでは、両PDGF遺伝子は、独立した転写ユニットで１つのベクター上に配置されている。この様式でCHO細胞で発現された個々のPDGFダイマーの定量により、19％P DG 1988）。両遺伝子の化学量論的説明だけではなく、最優先事項としてそれらの同等発現もまた、真核発現系によるPDGF-ABヘテロダイマーの好ましい合成のための重要な必須条件として考察されるべきである。この理由により、複シストロン発現ユニットは、ヘテロダイマータンパク質および従ってPDGF-ABを発現するための可能な補助物として、自身を提示する。この種の系もまた、PDGFの発現に関してWO 90/01550に記載されている。しかし、上記の3）により詳細に説明されているように、これらの構築物は、第２（および、後続の）シストロンに対して非常に制限された発現率でのみ得られる。第１シストロンに配置されたPDGF鎖に依存して、この型のホモダイマーが優先的に形成される。その他の発現系を使用して真核細胞で両PDGF遺伝子を発現するための、文献に以前記載された試みでは、ホモダイマー副産物の割合が３０％以上の範囲になった。それにもかかわらず、これらの細胞系を使用して高度に精製されたPDGF-ABを得るためには、精密であって非常に浪費的な精製法が使用されなければならない。従って、本発明の目的は、２つまたはそれ以上のポリペプチドまたはそれらのサブユニットの、それぞれ等モルでの、そしてさらにヘテロ（ダイ）マーの好ましい形成を保証する組換え調製を可能にする因子を生成することである。それにより、下流のタンパク質精製法の収量および経済性が改良される。この目的を達成するには、宿主細胞としての哺乳動物細胞におけるポリペプチドまたはそれらのサブユニットの等モル発現のための多シストロン発現ユニットが、本発明に従って提案される。このユニットは以下の一般式によって特徴づけられる。 p-5'UTR-C₁-（IRES-Y-C₂）_n-3'UTR-ポリA ここで、「p」は、転写プロモーターであり、「5'UTR」は、非翻訳ヌクレオチド配列であり、ｎは１、２、または３であり、「C₁」および「C₂」は、それぞれポリペプチドまたはそのサブユニットをコードする遺伝子を含むシストロンであり、ここで、ｎが２または３の場合、連続基の配列（IRES-Y-C₂）は互いに同じであるかまたは異なり得、そしてさらにC₁およびC₂は同じであるかまたは異なり得、「IRES」は、ウイルス、細胞、または合成起源のヌクレオチド配列であり、そのヌクレオチド配列は、翻訳段階で内部開始の原因となる配列であり、「Y」は、IRESと共同して、C₁およびC₂の遺伝子産物が等モル量で発現されるような様式でC₂に含まれる遺伝子の発現を確実にするヌクレオチド配列であり、「3'UTR」は、非翻訳ヌクレオチド配列であり、「polyA」は、ポリアデニル化シグナルである。本特許（the patent）の構築物では、同等の翻訳効率がシストロン間要素を導入することにより達成され、そして驚くべきことに、遺伝子産物の１：１の化学量論が見出された。このようにして、本質的な土台は、動物細胞においてヘテロ（ダイ）マーを発現するように作製された。細胞の発現能が転写および翻訳のレベルまで十分に用いられており、そしてさらに、ほとんど完全なヘテロダイマー形成の結果としてホモ（ダイ）マーを除去するための精巧な精製工程が省かれ得るという事実により、経済性の高い哺乳動物細胞における個々のタンパク質の産生が確実となる。真核細胞中で活性のあるすべてのプロモーター、すなわち、真核細胞において遺伝子発現を開始させるプロモーターは、本発明の発現ユニットにおけるプロモーターとして用いるのに適切である。特に、ウイルス起源（例えば、レトロウイルスの「長末端反復」（LTR）またはサイトメガロウイルス（CMV）の初期プロモーター）、細胞起源（例えば、ヒトアクチンプロモーターまたはユビキチンプロモーター）、または合成起源の構成および誘導プロモーターが使用され得る。SV 40プロモーターが、本発明によれば好ましい。 5'UTRおよび3'UTRは、調節要素を含有し得、そして「C₁」および「C₂」を転写制御要素に作動可能に連結する役割をなす任意の、原則として非翻訳のヌクレオチド配列てある。本発明によれば、例えば、Arteltら（1988）によるSV40由来の配列が適している。リボソームの内部結合を仲介する、ウイルス、細胞、または合成起源のこれらの全ての配列が、IRESとして使用され得る。このような配列の例は、ポリオウイルス１型由来のIRESであり、さらに、脳心筋炎ウイルス（EM CV）の5'UTR、「サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス」（TMEV）の5'UTR、「口蹄疫ウイルス」（FMDV）の5'UTR、「ウシ腸内ウイルス」（BEV）の5'UTR、「コクサッキーＢ型ウイルス」（CBV）の5'UTR、または「ヒトライノウイルス」（HRV ）の5'UTR、または「ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質」（BIP）5'UTR、ショウジョウバエアンテナペディア（Drosophila antennapediae）5'UTR、またはショウジョウバエウルトラビトラックス（Drosophila ultrabithorax）5'UTR 、または上記の配列の遺伝子ハイブリッドまたはフラグメントを包含する。本発明によれば、配列番号：５のポリオウイルス１型由来のIRESが好ましく、これは、ポリオウイルス１型の5'非翻訳領域の最初の628ヌクレオチドを含む。一般式で与えられたように、IRESと共同して、C₁およびC₂の遺伝子産物が等モル量で発現されるような様式でC₂に含まれる遺伝子の発現を確実にする、これらのすべてのヌクレオチド配列が、「Y」として用いられ得る。特に、アフリカツメガエルレービス（Xenopus laevis）βグロビン（β-Grobin）5'UTR（Falcone およびAndrews，1991；Patientら，1983）、アルファルファモザイクウイルスRN A4 5'UTR（JoblingおよびGehrke，1987）、フエリチン5'UTR（動物、Klausnerおよび Harford，1989）、タバコモザイクウイルス5'UTR（「オメガ」）、プラス、リーダー変異体（Gallieら，1987A，1987B；Gallieら，（1988））、カブ黄斑モザイクウイルス（TYMV）5'UTR、ブロムモザイクウイルス（BMV）RNA3 5'UTR、およびラウス肉腫ウイルス（RSV）5'UTR（それぞれGallieら，1987Bを参照のこと）、アデノウイルス三部分リーダー（L1-3）および変異休（Berkner ，Zymogenetics WO 90/01550；BerknerおよびSharp（1985）；Kaufman（1985））、アフリカツメガエルボレアリス（Xenopus borealis）5'UTRβグロビンおよびアフリカツメガエルトロピカリス（Xenopus tropicalis）5'UTRβグロビン（ぞれぞれKnoechelら，（1986）を参照のこと）が適切であり、配列番号：６に記載のアフリカツメガエルレービス由来のβグロビン配列が本発明によれば特に好ましい。本発明の特に好ましい実施態様によれは、IRESは、配列番号：５に記載のポリオウイルス１型UTRであり、そして「Y」が配列番号：６に記載のアフリカツメガエルレービス由来のβグロビン配列である。その上、さらに適切なIRESおよび「Y」配列は、以下の詳細な説明に記載され、同様に本発明の一部である方法を用いて確かめられ得る。 C₁およびC₂シストロンは、互いに独立して、そして任意の配列において、ぞれぞれ、単独のポリペプチド成分、または２つまたはそれ以上の成分からなるヘテロマ−性ポリペプチドをコードする遺伝子を含み得、その遺伝子は本発明に従って等モル様式で発現され、従ってこの成分はそれそれ１：１の比で宿主細胞内で利用可能になり得る。従って、シストロンC₁およびC₂は、同じであるかまたは異なり得、そして連続基（IRES-Y-C₂）のシストロンC₂は、互いに同じであるかまたは異なり得る。特に、C₁およびC₂は、それぞれ、第VIII因子、クレアチンキナーゼ、ヘモグロビン、免疫グロブリン、組織適合性抗原、Ｔ-細胞レセプター、散乱因子（HGF-SF）、トランスフォーミング増殖因子β型ファミリーのメンバー、骨形態形成タンパク質（BMP）のメンバー、インテグリンファミリーのメンバー、またはPDGF、またはそれらの天然または合成の変異体および誘導体、の異なるサブユニットをコードする遺伝子を含み得る。特に好ましい実施態様によれば、本発明は、PDGF-ABに関する；対応して、特に好ましい発現ユニットでは、「n」が１であり、そしてC₁およびC₂が、PDGFのA 鎖またはB鎖、またはその生物学的に活性なアナログ、またはそれらのフラグメントをコードする遺伝子を代替的に含み、両遺伝子はこの発現ユニットで同時発現される。しかし、基本的には、PDGF-B前駆体のさらなる変化が、PDGF-ABの産生のために生じなければならなかった。これは、PDGF-AとPDGF-B前駆体分子とでは生物物理学的特性が異なるからである。PDGF-Bの発現が、生物学的に活性である物質の分泌と必然的に相関しているわけではないことが知られている。大部分の発現PD GF-BBは、原形質膜と近接結合してとどまっている（Robbinsら，1985）。単シストロン発現ベクターを用いるとき、CHO細胞において、PDGF-Bの発現はPDGF-Aの発現よりもかなり低い。このような理由のため、PDGF-BBは、静電的相互作用の結果として、産生細胞の細胞の外側の原形質膜上にとどまっており、そしてそれのほんのわずかの量しか培地中に放出されない（La Rochelleら，1990：La Rochelleら，19 91；（patent）に従う構築物では、PDGF-B前駆体配列のこのセグメントは、成熟PDGF -B鎖の３'末端に終止コドンを導入することにより除去された。PDGF-B前駆体の相当する切断DNA配列は、B190と命名される。この構築物で形質転換された細胞の培養上清由来の分泌PDGF-BBは、B^*と命名される。本発明のPDGF-ABを調製するために、C₁またはC₂は、PDGF-A_K（配列番号：１）またはPDGF-A_L前駆体配列、完全PDGF-B前駆体配列（配列番号：３）、サル肉腫ウイルス由来のv-sis遺伝子、または配列番号：３に記載の283から609塩基対、またはPDGF-B前駆体の191位のアミノ酸でアルギニンをコードするコドンを翻訳終止コドンに置換することにより末端切断されているPDGF-B前駆分子をコードする遺伝子フラグメントを含む。前述の遺伝子は、ぞれぞれ、A鎖をコードする遺伝子とB鎖をコードする遺伝子とが存在する限り、いかなる組み合わせでも存在し得る。本発明によれば、特に好ましい発現ユニットでは、C₁およびC₂が、PDGF-A_K（配列番号：１）または末端切断されたPDGF-B前駆体配列（配列番号：24）を代替的に含み、両遺伝子はその発現ユニットで同時発現される。以下に記載のようにさらに適切なIRESおよび「Y」配列を同定するために、「n 」が１であり、そしてC₁およびC₂が、互いに異なるリポーター遺伝子を含む発現ユニットが用いられる。本発明の特に好ましい実施態様によれば、この種の発現ユニットは、リポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ（配列番号：22）および分泌アルカリホスファターゼ（配列番号：20）をコードする遺伝子を含む。本発明は、さらに、作動可能な様式で挿入された本発明の発現ユニットを含む組換えＤＮＡベクターに関する。本発明に従う好ましいベクター、およびそれらの調製は図１から６Ｃに示される。本発明はさらに、哺乳動物細胞であって、そして作動可能な様式で挿入された本発明の発現ユニットを有する組換えDNAベクターで形質転換される宿主細胞を含む。それらは、好ましくはCHOまたはBHK細胞である。本発明の特に好ましい実施態様は、上述で詳細に記載されたPDGF-ABをコードする発現ユニットの１つを有するベクターで形質転換される宿主細胞（特にBHK 細胞）に関する。これらは、好ましくは、C₁およびC₂が、PDGF-AK配列（配列番号：１）、または完全な（配列番号：３）または末端切断された（配列番号：24 ）PDGF-B前駆体配列を代替的に含む。本発明に従って、形質転換PDGF-AB産生BHK細胞は、Deutcshe Sammlung von Mi kroorganismen und Zellkulturen GmbH （DSM）（German collection of microorganisms and cell cultures）に、1992 年8月11日（11.8.1992）に、DSM ACC 2048に相当する92-22-6（pSBC-PDGF-A/-G- B190）表２を参照のこと）、またはDSM ACC 2049に相当する92-22-7（pSBC-PDGF -B190/-G-A、表２を参照のこと）の名称で寄託した。さらに、適切なIRESまたは「Y」配列を同定するために、上述で詳細に記載されるように、リポーター遺伝子を含む発現ユニットを有するベクターで形質転換される宿主細胞が、適切な培地で培養される。好ましくは、このベクターは、ルシフェラーゼおよび分泌アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を含む、本発明のベクターである。本発明によれば、ルシフェラーゼをコードする遺伝子（配列番号：22）および分泌アルカリホスファターゼをコードする遺伝子（配列番号：20）で形質転換された宿主細胞は、German collection of microorganisms and cell cultures （ DSM）に、1992年8月11日に、DSM ACC 2046に相当する91-46-9（pSBC-SEAP/-G-LU C、表１を参照のこと）、およびDSM ACC 2047に相当する91-46-10（pSBC-G-SEAP -LUC、表１を参照のこと）の名称で寄託した。本発明は、さらに、等モル割合の異なるポリペプチドサブユニットからなるタンパク質を調製する方法を含み、この方法は、上述で詳細に記載される本発明の発現ユニットで形質転換される宿主細胞を適切な培地て培養し、そしてこのようにして産生されたタンパク質を細胞および培地から分離することによる。例として、第VIII因子、クレアチンキナーゼ、ヘモグロビン、免疫グロブリン、組織適合性抗原、Ｔ-細胞レセプター、散乱因子（HGF-SF）、トランスフォーミング増殖因子β型ファミリーのメンバー、骨形態形成タンパク質（BMP）のメンバー、インテグリンファミリーのメンバー、またはPDGF、またはそれらの天然または合成の変異体または誘導体のようなタンパク質が、このようにして調製され得る。本発明のベクターを用いて、ＰＤＧＦのダイマー、または異なるスプライス型が存在する他のタンパク質（例えば、VEGF（血管内皮増殖因子）のような今までは容易に調製できなかったタンパク質）のダイマーを産生することもまた初めて可能となった。このダイマーとしては、例えば、長／短鎖型のダイマーPDGF-A(P DGF-A_L/PDGF-A_K）またはPDGF-B/v-sis型の分子が挙げられる。別の選択物は、１つの鎖のみが翻訳後修飾に関するシグナル配列（例えばグリコシル化シグナル）を含むダイマーまたはマルチマーにより代表される。従って、このようにして、グリコシル化またはさもなければ「片側だけの（one-sided）」様式で修飾されるタンパク質が調製され得る。本発明の特に好ましい実施態様によれば、この方法は、ヘテロダイマーrPDGF- ABを調製するために用いられる。この方法は、PDGF-A鎖およびPDGF-B鎖をコードする遺伝子を有する本発明の発現ユニットを有するベクターで形質転換される宿主細胞を、上述で記載される適切な培地で培養することによる。このようにして産生されたrPDGF-ABが、続いて細胞および培地から分離される。 PDGF-ABヘテロダイマーが、本発明に従って複シストロンベクター系により、独占的にまたは実質独占的に産生され得、そしてPDGFホモダイマーの合成が妨害され得ることを、実施例２において証明し得た。予期しないことに、第２シストロンの発現レベルが、第１シストロンの発現レベルと一致するように、この構築物において刺激される。これに関連し、そして本発明に従って、C₁およびC₂が、PDGF-A_K配列（配列番号：１）、または完全な（配列番号：３）または末端切断された（配列番号：24 ）PDGF-B前駆体配列をそれぞれ代替的に含むベクターで形質転換されるBHK細胞が、好ましく培養される。哺乳動物細胞を培養するための公知の全ての培地が、培地として適当である。この培地には、合成のタンパク質非含有または低タンパク質含有産生培地が含まれる。4.5ｇ／1グルコースおよび5〜10％のFCSを補充したDMEM（ダルベッコの改変イーグル培地）が、本発明に好ましかった。 rPDGF-ABは、従来の方法により、細胞および培地から分離らのPDGF-AAのために開発された高度に有効な方法（Eichnerら、1989）が、好ましい方法てある。最後に、本発明は、ホモダイマー夾雑産物を本質的に含まない、上記の宿主細胞を本発明に従って培養することにより得られ得るヘテロダイマーrPDGF-ABに関する。驚くべきことには、本発明の構築物で形質転換された宿主細胞が、形成されたPDGFの総量に基づく純度90％以上でヘテロダイマーPDGF-ABを分泌することが明らかにされた。本発明によれば、本発明の構築物で形質転換されるBHK細胞を培養することにより得られるPDGF-ABが好ましい。本発明のrPDGF-ABはその高純度により、従来から公知である組換えPDGF-ABとは主として異なる。序論に述べたように、得られる産物の90％以上がヘテロダイマーからなるような組換え方法は、今までに記載されていない。ホモダイマーをヘテロダイマーから完全に分離することは実質的に不可能であるので、既知産物は、必然的に３つの全イソ型の混合物となる。このことに加えて、既知産物は、その調製法によって、多くの点で不都合である。例えば、EP 259 632または288 307に記載のような、酵母細胞での異種遺伝子発現は、グリコシル化パターンが、ヒト産物に比較して変化しているタンパク質産物を導くことが知られている。さらに、酵母細胞で発現されたPDGF-Bは、少なくとも一部はプロセシングが不完全であり、および／または、タンパク質分解的に減成される（WO 92/01716を参照のこと）。従って、この種の産物は、種々の炭水化物パターンを有し、タンパク質分解減成産物で夾雑される。前述の不都合を避けるために、WO 92/01716には、グリコシル化の共通配列およびプロテアーゼ感受性ドメインが除去された改変PDGF鎖を調製する方法が記載されている。しかし、この種の改変は、産物の生物学的活性に影響する（WO 92/01716を参照のこと）。本発明の特に好ましい実施態様では、ヘテロダイマーrPDGF-ABは、本発明に従って形質転換されたBHK細胞を培養することにより、例えば、German collection of microorganisms and cell cultures （DSM）に、1992年8月11日に、DSM ACC 2048に相当する92-22-6、またはDSM ACC 2049に相当する92-22-7の名称で寄託したBHK細胞を培養することにより得られる。さらに、WO 90/08163は、細菌細胞、特にE.coliでのPDGF-ABの組換え調製を開示しており、この調製は必然的に非グリコシル化産物を導く。しかし、この方法によりE.coli細胞中で発現されたPDGF-B鎖は、アミノ末端の12アミノ酸で切断されている。これに加えて、細菌からの産物はインビトロで復元されなければならないが、分子内および分子間での適切なジスルフィド架橋形成、およびタンパク質の適切な折り畳みの方法が保証されないので、その結果、この産物の免疫学的特性が変化され得、生物学的活性が影響を受け得る。本発明のヘテロダイマーrPDGF-ABは、薬学的調製物として（特に創傷治癒用）、薬学的に許容可能な（tolerated）補助剤および賦形剤と共に、好ましくは処方される。これに関連して、それは、膏薬および創傷帯などの中で活性化合物として含有され得る。それは、特に局所塗布用に適しているが、その他の投与形態にもまた適している。この他の投与形態では、その活性化合物が創傷中に導入されるかまたは経皮投与される。例えば、PDGF-AB は、創傷周辺領域に、貯蔵機能を有する適切なマトリックスで、皮下投与され得るか、または、直接皮下注射され得る。さらに、本発明のrPDGF-ABは、化粧用調製物、例えば、皮膚再生、皮膚をなめらかにする、皮膚荒れまたは皮膚の加齢の予防、および日焼けの塗布用の製造に適している。適切な補助剤および賦形剤には、水ベースのセルロースゲル、生分解性ポリマー、および任意の軟膏基剤およびクリーム基剤、およびスプレー剤が含まれる。さらに、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、第XIII因子、線維芽細胞増殖因子（aFGF、bFGF）、トランスフォーミング増殖因子αまたはβ型、上皮増殖因子、インスリンまたは「インスリン様増殖因子」（IGF IおよびII）、または別の増殖因子のような、創傷治癒に影響するさらなる活性化合物が、本発明の調製物中に含有され得る。本発明の調製物はまた、例えば、水溶液状で創傷帯中に存在し得る。上述で説明したように、本発明は、特定の配列「Y」を取り込むことにより、C₂ のIRES依存翻訳は、それが「キャップ」依存翻訳の効率を達成するように増大され得るという認識に基づく。従って、配列「Y」は、IRES依存翻訳開始の増大が、少なくともキャップ依存翻訳効率に対応して得られるように、IRESと共に作動し得る。この機能を十分に満たす「Y」配列は、上記で詳細に説明されている。本特許によれば、アフリカツメガエルレービス由来のβグロビン5'UTRが好ましい。本発明の必須要件を満たすさらなる配列は、本発明の発現ユニットにおいて、 IRESと共同して、C₁およびC₂の遺伝子産物のほぼ等モル発現をもたらす翻訳に影響を及ぼす「Y」配列を検出する方法により同定され得る。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）Yとして試験される配列を、複シストロンまたは多シストロン発現ユニット中に導入する工程であって、ここで、このユニットでは、C₁およびC₂がそれぞれリポーター遺伝子を含んでおり、これらの遺伝子は、異なる、そして容易に識別可能な遺伝子産物をコードしている、工程；（ｂ）作動可能な様式で挿入された個々の発現ユニットを含むベクターを構築する工程；（ｃ）宿主細胞として哺乳動物を工程（ｂ）からのベクターで形質転換し、適切な培地で培養する工程；および（ｄ）C₁およびC₂の発現産物を、培地中で定量するか、または次いで細胞および／または培地から分離する工程。好ましくは、CHOまたはBHK細胞が工程（ｃ）において宿主細胞として用いられ、BHK-21細胞が特に好ましい。あるいは、本発明の必須要件を満たすさらなる配列は、請求項１から１５に記載の発現ユニットにおいて、「Y」と共同して、C₁およびC₂の遺伝子産物のほぼ等モル発現をもたらす翻訳を開始させるIRES配列を検出する方法により同定され得る。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）IRESとして試験される配列を、複シストロンまたは多シストロン発現ユニット中に導人する工程であって、ここで、このユニットでは、C₁およびC₂がそれぞれリポーター遺伝子を含んでおり、これらの遺伝子は、異なる、そして容易に識別可能な遺伝子産物をコードしている、工程；（ｂ）作動可能な様式で挿入された個々の該発現ユニットを含むベクターを構築する工程；（ｃ）宿主細胞として哺乳動物を工程（ｂ）からのベクターで形質転換し、適切な培地で培養する工程；および（ｄ）C₁およびC₂の発現産物を、培地中で定量するか、または次いで細胞および／または培地から分離する工程。この方法において、CHOまたはBHK細胞が、宿主細胞として好ましく用いられ、特に好ましい様式では、ルシフエラーゼおよび分泌アルカリホスファターゼをコードする遺伝子（LUCおよびSEAP）を、それぞれリポーター遺伝子として含むBHK 細胞が用いられる。本発明は、図面および実施例により以下に説明される。Ｉ．図面の説明：図１）基本ベクターpSBC-1およびpSBC-2の調製ベクターpSBC-1を構築するために、プラスミドpGEM3-5'ポリオ（M）（Sarnow ，1989）由来の627bpのMseI/BalI-フラグメントを、以下のプライマーを用いるP CRのためのマトリックスとして用いた（図１）： 5'ポリオ＃1 5'TTT CTGCAG AAGCTT AAAACAGCTCTGGGG3' PstI HindIII （配列番号：14） 3'ポリオ＃2 5'TT GCGGCCGC AATCCAATTCGCTTTATG3' NotI （配列番号：15）増幅から得られた652bpフラグメントをPolIKで処理し、次いでPstIで切断し、対応させて調製したベクターpBEH（Arteltら，1988）に挿入した。ベクターpSBC -2の構築について、プラスミドpBEHをEcoRIで線状化し、そして以下のオリゴヌクレオチド配列をハイブリダイズし、挿入した： E-N-E＃1 5'AATT GCGGCCGC G3' （配列番号：16） E-N-E＃2 3'CGCCGGCG CTTAA5' （配列番号：17）図２ＡおよびＢ）発現ベクターpSBC-LUC/SEAPおよびpSBC-SEAP/LUCの構築ルシフェラーゼおよび分泌アルカリホスファターゼに対する遺伝子のコーディングcDNA配列を、EcoRI/HindIII制限断片を用いて単シストロンベクターpSBC-1 およびpSBC-2（図２Ａおよび２Ｂ）に挿人した。複シストロン発現ユニットを形成する２つのベクターの融合を、制限酵素XmnI/NotIを用いて行った。図２Ｃ）プラスミドpSBC-SEAP/-G-LUCおよびpSBC-LUC/-G-SEAPの構築発現構築物pSBC-SEAP/-G-LUCおよびpSBC-LUC/-G-SEAPは図２Ａおよび２Ｂに示したプラスミドに由来する。それらは、唯一のNotI部位に連結されたオリゴマーＧ（配列番号：６）をさらに含む。オリゴマーＧは、NotI部位に連結することにより5'-NotI部位が欠失されるが（SalI部位はこの位置に含まれる）3'-NotI部位は保存されるように構築される。図３）ベクターM13BCL1の模式図 c-sisに相同なpMVW-2の領域（PDGF-B）をベクターマップ上に示す。成熟PDGF- BおよびNcoI/SalIアダプターの領域を黒棒線により強調する。図４）完全PDGF-B前駆体配列の再構築プラスミドpMVW-2は、ヒトPDGF-B遺伝子のcDNAを含む。この配列は前駆体配列の5'-翻訳領域において不完全である（Weichら，1986）。真正（authentic）PDG F-B前駆体を再構築するために、BclI切断部位を、クローンpMVW-2のコーディングセグメントの30位のC-T変換により前駆体の5'末端領域に導入した。この工程の結果として、コーディング領域の短いセグメントのみが最終的に欠失され、これに関して局部的にコードされたアミノ酸（アスパラギン酸）が保存されている。ほとんどのE.coli株において、メチル化の結果、BclI切断部位は酵素切断に対して抵抗性であるので、この切断部位を含むフラグメントはdam-株に再クローニングされるかまたはPCR工程によって増幅されなければならない。次いで、前駆体の欠失領域を、合成SalI/BclIフラグメント［オリゴマーPPDGFB1および PPDGFB2］として挿入する。このために、まずpMVW-2由来の914bpのBamHI/NcoIフラグメントを、BamHI/Sal I切断バクテリオファージM13mp19（pharmacia）に、合成アダプター［オリゴマーNCCLSA1（配列番号：９）およびNCCLSA2（配列番号：10）］によって挿入した。この構築物は、次のインビトロ変異誘発工程に必要な一本鎖DNAを提供した。この工程は、Ecksteinらの方法に基づいて、Amershamのオリゴマー特異的インビトロ変異誘発系（２型）を用いて行った［Taylorら，（1985），Nakamaye K．およびEckstein F．（1986），Sayersら，（1988）］。合成プライマーPDGBBCL（配列番号：11）を用いて、配列番号：３で示された配列の144位での塩基置換（C からT）は、変異誘発の後達成され、それによりBc11切断部位がPDGF-B前駆体の5 '領域に導入される。この変異誘導休をM13BCL1と命名した（図３）。 M13BCL1由来の1100bpフラグメントを、プライマーM1317MER（配列番号：７）およびM1324MER（配列番号：８）を用いてPCR工程で増幅し、続けてBclI/HindIII 制限酵素処理にかけ、次いで得られた770bpのフラグメントを単離した。合成オリゴマーPPDGFB1（配列番号：12）およびPPDGFB2（配列番号：13）は、BclI切断部位までのPDGF-B前駆体の欠失5'領域を形成する。アニーリング後、続けてこの二本鎖オリゴマーを、770bpのPDGF-Bフラグメントとともに、ベクターpGEM-2（Promega）に連結した。これは、SalI/HindIIIでの制限酵素処理により予め調製しておいた（図．４）。PDGF-Bの真正配列を、完全に配列決定することにより実証した。図５）分泌PDGF-B鎖の調製単シストロン発現ベクターを用いると、BHK細胞でのPDGF-B遺伝子の発現は、P DGF-Aの発現よりも低い。この理由は、PDGF-BBが産生細胞の細胞の外側の原形質膜上に保持されており、少量しか培地中に放出されないからである（La Rochell e 端領域により仲介されており、これは天然状態では、PDGF-Bの放出と関連して切り落とされる（La Rochelleら，1991）。さらに容易に分泌され得るPDGF-Bの変異株を調製するために、PCR仲介変異誘発を行い、終止コドンをPDGF-B前駆休の1 91位のアミノ酸（Arg）の位置に挿入した。保持に関わる領域は、このようにして調製された変異体（PDGF-B190（配列番号：24））では発現されない。610bpの長いPCR産物が、以下のプライマーを用いて得られた（図５）： PDGF-B190プライマ-I 5'GAATTCGAGCTCGCCCGGG3'（配列番号：18） PDGF-B190プライマ-II 5'CCCGGGAAGCTTCCGGTTATCAGGTCACAGGCCGTGC3'（配列番号：19）図６ＡおよびＢ）発現ベクターpSBC-PDGF-A/BおよびpSBC-PDGF-B/Aの構築 PDGF-B前駆体に対する完全なコーディングcDNA（Ratnerら，1985）は、ベクターpGEM2-PDGF-Bに存在する（図４）。PDGF-A鎖の短い変異体の完全なcDNA配列（ Betsholtzら，1986）は、発現ベクターp0DA（Eichnerら，1989）中に含まれる。このベクターは、pPGF-1（Hoppeら，1987）由来のRsaIフラグメントをSV-40発現ベクターpBEH（Arteltら，1988）中にクローニングすることにより得られた。PD GF-A鎖およびPDGF-B鎖のコーディングcDNA配列を、EcoRI/HindIII制限断片（図１）を用いて単シストロンベクターpSBC-1およびpSBC-2に挿入した。複シストロン発現ユニットを形成する２つのベクターの融合を、制限酵素XmnI/NotIを用いて行った（図６Ａ、６Ｂ）。図６Ｃ）プラスミドpSBC-PDGF-A/-G-B190およびpSBC-PDGF-B190/-G-Aの模式図発現構築物pSBC-PDGF-A/-G-B190およびpSBC-PDGF-B190/-G-Aは、図６Ａおよび６Ｂに示したプラスミドに由来する。それらは、唯一のNotI部位に連結されるオリゴマ−Ｇ（配列番号：６）をさらに含む。オリゴマーＧは、NotI部位に連結することにより5'-NotI部位が欠失される（SalI部位はこの位置に含まれる）が、3 '-NotI部位は保存されるように構築される。図７）２つのポリクローナル抗PDGF抗休を用いてPDGF-A鎖およびPDGF-B鎖を検出するためのサンドイッチELISA：PDGF標準物からの検量線ポリスチレンプレートをヤギ抗PDGF-AB-IgG（ポリクローナル、Collaborative Researchから入手）でコーティングし；種々のPDGF標準物とのインキュベートを行った後（以下を参照のこと）、結合したPDGFを、ポリクローナルウサギ抗PD GF-AAまたは抗PDGF-BB、次にペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgGを用いて検出した。抗PDGF-AAを用いる場合（ELISA I.1）、0.D.シグナルは配列：PDGF-AB＞PDGF-AA ≫PDGF-BB（7.1）中で得られる。抗PDGF-BBを用いると（ELISA I.2）、PDGF-AB およびPDGF-BBに対して最大0.D.値が10ng/mlから得られるが、一方PDGF-AAは100 0ng/mlまでシグナルを全く生じない（7.2）。［標準物の材料源：AB：ヒト血小板由来、Promega Corp.No.G 6191から入手；BB ：酵母からの組換え体、Promega Corp．No．G 5191から入手；AA：BHK細胞からの組換え体、約70％純度（Eichnerら，1989）］。図８）モノクローナルおよびポリクローナル抗PDGF抗休を用いてPDGF-ABを検出するためのサンドイッチELISA:PDGF標準物からの検量線ポリスチレンプレートをヒツジ抗マウスIgGでコーティングし、次いでマウスハイブリドーマ上清（クローン1B3由来であり、PDGF-ABおよびPDGF-BBにおけるＢ鎖に対するモノクローナル抗体を含む）とインキュベートし；種々のPDGF標準物とのインキュベーションを行った後（図７の解説を参照のこと）、PDGF-ABを、ポリクローナルウサギ抗PDGF-AA）次にペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgGを用いて検出した。真核生物起源のPDGFを用いると、特異的シグナルが、PDGF-AB（ヒト血小板由来）により得られ、わずかな交差反応がPDGF-BBにより得られる。図９）ELISA Iを用いる組換えBHK細胞の培養上清中のPDGF-A鎖またはPDGF-B鎖の検出：標準物からの検量線（図7.1および2を参照のこと）；以下の遺伝子でトランスフェクトされたBHK細胞起源の試料：試料１：pSBC-2-PDGF-A；試料２：pSBC-2-PDGF-B；試料３：pSBC-2-G-PDGF-B190 ；試料４：pSBC-PDGF-A/B；試料５：pSBC-PDGF-B/A；試料６：pSBC-PDGF-A/-G-B 190；試料７：pSBC-PDGF-B190/-G-A；試料８：pSBC-2-PDGF-A+pSBC-2-PDGF-B；試料９：pSBC-PDGF-A+pSBC-2-G-PDGF-B190；試料10：pSBC-LUC/-G-SEAP；試料11 ：pSBC-SEAP/-G-LUC。表１）細胞性配列（グロビン）の単シストロンベクターおよび複シストロンベクターへの挿入によるリポーター遺伝子の発現の増大左手側：DNA構築物の模式表示Ｌ＝ルシフェラーゼに対する構造遺伝子Ｓ＝分泌アルカリホスファターゼに対する構造遺伝子 IRES＝「リボソーム内部エントリー部位」Ｇ＝アフリカツメガエルレービスグロビンmRNA由来の配列ｐＡ＝SV40由来のポリアデニル化部位中央：ノーザンブロット分析 LUCおよびSEAPに対する単シストロンおよび複シストロン発現構築物で安定してトランスフェクトされたBHK細胞の全プールからのmRNAを試験した。RNAをPurc hioら（1979）の方法により単離し、１％アガロースホルムアルデヒドゲル（Leh rachら， 1977）上で分画し、ナイロン膜上にブロットし、［³²Ｐ］-標識アクチン、LUCおよびSEAP特異的プローブとハイブリダイズさせた。予測通り、単シストロンmRNA は約1900〜2500ntの大きさであるが、これに対して複シストロンmRNAの場合は、２つのリポーター遺伝子のコーディング配列に対応する大きさ（約3800〜4400ヌクレオチド）で存在する。このことは、対応する遺伝子産物は１つの複シストロンmRNAに解読されていることを実証している。右手側：ルシフェラーゼおよびSEAP発現の結果 1.1および1.2に記載のようにして結果を決定した。表２）BHK細胞におけるPDGF-A鎖およびPDGF-B鎖についての単シストロンおよび複シストロン発現ベクターの生産性培養上清中のPDGF濃度を、マイトジエン試験を用いて測定した。PDGF-ABは、E LISA IIを用いて特異的に検出された（2.3、標準物からの検量線を参照のこと、図８を参照のこと）。 II．実施例：実施例に挙げた発現の適用は、単シストロンおよび複シストロン転写ユニットに基づく。発現されるべき遺伝子は、それぞれベクターpSBC-1およびpSBC-２に組み込まれる。ベクターの構築は、LUCおよびSEAP遺伝子の発現について図２Ａから２Ｃ、およびPDGF-AおよびPDGF-B遺伝子の例を用いる図６Ａから６Ｃに示されるように、複シストロンを形成するpSBC-1およびpSBC-2の組換えを容易にする。プラスミドpSBC-PDGF-A/-G-B190（Ｇ＝配列番号：６に記載のアフリカツメガエルレ−ビス由来のβ-グロビン配列）を動物細胞に移した後、P DGF-Aの翻訳がcap依存様式で行われ、そしてPDGF-Bの翻訳がポリオ−IRESに依存して行われる。相当する様式で、pSBC-PDGF-B190/-G-Aおよびリポーター遺伝子L UCおよびSEAPは、単シストロンおよび／または複シストロンmRNA分子により翻訳される。実施例１：複シストロンベクター系を用いるリポーター遺伝子LUCおよびSEAPの発現 1.1 ルシフェラーゼの検出方法ルシフエラーゼは細胞抽出物中に含まれる。その活性は、ルシフェリン（基質）、ATP、およびＭｇ²⁺を添加することにより定量され得、ルシフエラーゼ遺伝子の活性の測定にかけられ得る。以下の反応が起こる（de Wetら，1987）：ルシフェラーゼ＋ルシフェリン＋ATP＋Mg²⁺← →ルシフエラーゼ・ルシフェリル−AMP＋PP_iルシフェラーゼ・ルシフェリル-AMP＋O₂→ ルシフェラーゼ＋オキシルシフェリン＋AMP＋CO₂＋hv 1.2 分泌アルカリホスファターゼの検出方法アルカリホスファターゼは結合リン酸基の加水分解を触媒する酵素である。真核生物に存在する膜局在酵素は、糖リン脂質アンカー（anchor）を有しており、これによって、酵素はそのＣ末端により膜に結合されている。分泌タンパク質は、しはしば、細胞の内部にまたは膜中に局在しているタンパク質よりも検出するのに便利であるので、人工的な翻訳終止シグナルをヒト胎盤由来のアルカリホスファターゼの配列（513アミノ酸）に489位で導入した（Bergerら，1988）。対応する発現プラスミドのトランスフェクション後生じたタンパク質変異体は、有効に培地に分泌され、リポーター分子として使用するのにきわめて適切である（SE AP＝分泌アルカリホスファターゼ）。それは比色分析または蛍光分析により検出され得る（Bergerら，1988）。 1.3 形質転換BHK細胞の調製単シストロンおよび複シストロン発現ベクター（これらはリポーター遺伝子LU CおよびSEAPのコーディング配列またはPDGF-A鎖およびPDGF-B鎖を有する（図２Ａ−Ｃおよび６Ａ−Ｃを参照のこと））をリン酸カルシウム沈降法によりBHK細胞にトランスフェクトした（Wiglerら，1979：Grahamおよびvan der Eb，1973）。トランスフェクションの前日に、2〜3×10⁵BHK細胞／24cm²を新しい培養フラスコに移し、トランスフェクションの４時間前に、DME培地を用いて培地の交換を行った。５ μgの上述のプラスミドDNA、および0.5μgの選択プラスミドpAG60およびpSV2pac （Colbere-Garapin，1981；Varaら，1986、これらはそれぞれネオマイシン耐性遺伝子およびプロマイシン耐性をコードしている）を250μlの250mM CaCl₂中に共に懸濁した。この溶液を、無菌ガス中に吹き付けて連続的に撹拌しなから、25 0μlの2×HEPES緩衝液（280mM NaCl；50mM HEPES；1.5mM NaH₂P0₄，pH 7.1）にゆっくりと添加し、生じた沈殿物を栄養培地に加えた。トランスフェクションの２日後、安定してトランスフェクトした細胞の選択を、DME培地から２倍選択培地（５μg/mlプロマイシン；500μg/ml G418、Wirthら，1988）に培地を交換することにより開始した。PDGF産生またはLUP/SEAP産生BHK細胞の代表的なクローンを、1992年8月11日にDSMに寄託した。以下のような番号がつけられた： 1.4 IRES調節シストロンの前に翻訳増大配列を導入した結果としての等モル量の遺伝子産物LUCおよびSEAPの発現表１のリポーター遺伝子構築物pSBC-LUC/SEAPおよびpSBC-SEAP/LUCを用いる本研究者らの結果により、複シストロン構築物におけるIRESに依存する翻訳の発現は、通常、capに依存する様式で翻訳されるシストロンにおける発現よりも明らかに低いことが証明された。これは、文献から知られる値に相当する。アフリカツメガエルレービス由来のβグロビン配列（配列番号：６）を、単シストロンおよび複シストロンリポーター遺伝子構築物中の唯一のNotI切断部位（図２Ｃ）に挿入した。複シストロン発現ベクターでは、それは、第１シストロンのプロモ−ターと5'UTRとの間または第２シストロンのIRES要素と5'UTRとの間に直接配置される。個々のシストロンの翻訳効率の増大は、図２Ａ−２Ｃに示されるリポーター遺伝子構築物を用いて測定した。表１は、βグロビン配列が、５の要素による単シストロン発現ユニットにおけるルシフェラーゼのcap依存翻訳および３の要素による複シストロン発現ユニットにおけるIRES依存翻訳を刺激することを示す。後者は、複シストロンベクターにおいてシストロン１および２の等モル発現を指示する。表１に示されたノーザンブロットは、相当する遺伝子産物がそれぞれ単シストロンmRNAおよび複シストロンmRNAから解読されることを示す。特定のmRNA濃度は細胞において同じオーダーのマグニチュードからなるという事実から、グロビン配列の発現増大効果は翻訳のレベルで理解されることが分かる。第１シストロンおよび第２シストロンの遺伝子産物の等モル発現は、アフリカツメガエルレービス由来のグロビン遺伝子の5'UTR（配列番号：６）を導入することにより達成された。実施例２：複シストロンベクター系を用いるPDGF-ABヘテロダイマーの発現 2.1 馴化細胞培養上清の調製 BHK細胞を1.3と類似のようにして形質転換した。コロニー数を数えた後、細胞をトリプシン処理し、新鮮な選択培地に採取し、そして細胞数を10⁵細胞/mlにまて調整した。それそれ、この細胞懸濁液10mlを底面積65cm²のフラスコに移し、さらに24時間培養する。次いで培地を除去し、播種した細胞をPBSで２回洗浄し、そして培地を10mlの産生培地（DMEM、血清および選択抗生物質を含まない）と取り替える。24時間後、培地を取り去る。採取した上清を分析まで-20℃で保存する。細胞数を数え、液体窒素中に保存する。採取する時、フラスコ当たりの細胞数は0.8〜1.2×10⁷である。 2.2マイトジェン試験を用いる培養上清中のPDGFの検出 PDGFのマイトジェン活性は、密度阻止線維芽細胞におけるDNA合成速度の刺激を測定することにより決定され得る。PDGF種はすべてこの試験において生物学的に活性であるので、これによりイソ型は区別し得ない。このアッセイは、Shipleyら（1984）に従ってAKR-2Bマウス線維芽細胞を用いて24ウエルプレート中で行った。この試験では、純粋PDGFでは、約5ng/mlの濃度で半最大刺激を示した。この値を生産性を決定するために用いた。マイトジエン試験の結果を、表２中のPDGF-AB-ELISAからの値と比較する。 2.3 PDGF ELISAを用いる培養上清におけるPDGF-ABヘテロダイマーの検出２つの「２抗体サンドイッチアッセイ」を、Ｉ．）PDGFダイマー中のPDGF-A鎖およびPDGF-B鎖のおおよその定量、およびII．）PDGF-AAおよびPDGF-BBの存在下でのPDGF-ABの明確な定量が可能なように構成した。Ｉ．２つのポリクローナル抗PDGF抗体を用いるサンドイッチアッセイ 96ウエルのポリスチレンプレ−ト（Dynatechから入手、U-PIatte，No．M124B ）を以下の順にコーティングする（それぞれ、各工程間0.05％Tween 20を含むPB Sで４回洗浄する）。 I.1 ポリクローナルヤギ抗PDGF-AB-IgG（Collaborative Reseachから入手、No ．40017）；これはPDGF-AB、PDGF-BBに結合し、そして少量がPDGF-AAに結合する）、0.05M炭酸／炭酸水素緩衝液中2μg/mlのうちの50μlを４℃で一晩。 I.2 １％BSA（E.Merckから入手，No．12018、PBS中）、pH 7．5、100μlを室温で１時間。 I.3 0.1％BSAおよび0.05％Tween 20を含有するPBS（PBS+）中に希釈したPDGF含有溶液、50μlを室温で１時間。 I.4.1 ポリクローナルウサギ抗PDGF-AA-IgG（Genzymeから入手、No．ZP-214、これはPDGFダイマーのＡ鎖に結合する）、PBS+中2μg/mlのうちの50μlを室温で１時間；（ELISAI.1）または I.4.2 ポリクローナルウサギ抗PDGF-BB-IgG（Genzymeから入手、No．ZP-215、これはPDGFダイマーのＢ鎖に結合する）、I.4.1と同様（ELISAI.2）。 I.5 POD標識ヤギ抗ウサギIgG（Pierceから入手、No．31460）、PBS+中0.1μg/m lのうちの50μlを室温で１時間、E.S. BOSら（J. Immunoassay 2（1981），187- 204）に従って基質テトラメチルベンジジンを用いる検出。 II．モノクローナル抗PDGF抗体およびポリクローナル抗PDGF抗体を用いるサンドイッチアッセイ ELISA Iと同様のプレートを以下の順にコーティングする（量、緩衝液、およびインキュベーション時間は上記の通り）： II.1 ヒツジ抗マウスIgG（Boehringer Mannheimから入手、No．1097 105）、３ μg/ml。 II.2 １％BSA（PBS中） II.3 クローン1B3由来のマウスハイブリドーマ上清［SP2/0-骨髄腫細胞を、組換えPDGF-AB（J．Hoppeら、1990に従ってE．coliから得た）で免疫したマウス由来の牌臓細胞と融合することにより得られる］、２μg/ml IgG2a。モノクローナル抗体はPDGFダイマーのＢ鎖に特異的に結合する。 II.4 PDGF含有溶液。 II.5 ポリクローナルウサギ抗PDGF-AA-IgG（I.4.1を参照のこと）、２μg/ml II.6 I.5と同様。 2.4 IRES制御シストロンの前への翻訳増大配列の導入の結果としてのPDGF A鎖およびB鎖の等モル量の発現図５に記載のように変異させたPDGF-Bを含む複シストロン構築物は、通常、複シストロンベクターにおける配置に対応して、３：１の比てPDGF A鎖およびB鎖の発現を導く。２つの遺伝子の等モル発現は、ポリオ要素のリボソーム内部エントリー部位の3'領域に翻訳増大配列を導入することにより達成された。このような要素は、例えば、アフリカツメガエルレービス由来のβグロビン配列（配列番号：６）である。このβグロビン配列（オリゴマーＧ）を、複シストロンベクターの唯一のNotI切断部位に挿入した（図６Ｃ）。得られたプラスミドでは、それは、IRES要素と第２シストロンの5'UTRとの間に直接的に配置される。 2.5 結果：組換えBHK細胞の培養上清由来のPDGFの３つの異なる分析の結果を図９および表２に示す。 ELISA Iを用いて、２つのPDGF鎖の比の大まかな概算を行うことが可能である。従って、シストロン間要素の効率に関して結論が引き出され得、そして複シストロン構築物はおよそ等量のPDGF-AおよびPDGF-Bが翻訳されるように構築され得る。しかし、これに関連して、ELISA I.1においてPDGF-ABが、PDGF-AAよりも強いシグナルを与えることを考慮に入れるべきである。マイトジェン試験は、異なるイソ型（PDGF-AA）PDGF-AB）またはPDGF-BB ）間で差異を生じることなく、培養上清中に存在するrPDGFの全量に対する有用な値を提供する。ヘテロダイマーPDGF-ABの特定比は、PDGF-AB特異的ELISA IIによって決定され得る。PDGFホモダイマーの百分率比は、マイトジェン試験の結果とこの後者の分析の結果との間の差異から、高精度で決定され得る。略語： B190 −Ｃ末端切断PDGF-B前駆体（DNA）Ｂ^* −PDGF-B鎖（タンパク質）、切断PDGF-B前駆体起源 BHK −ハムスター細胞系 bp −塩基対 BSA −ウシ血清アルブミン CHO −ハムスター細胞系 DMEM −ダルベッコの改変イーグル培地 ELISA −酵素結合免疫吸着アッセイＧ −アフリカツメガエルレービス由来βグロビン配列 IgG −Ｇクラス免疫グロブリン IRES −リボソーム内部エントリ一部位 LUC −ルシフェラーゼ nt −ヌクレオチド PBS −リン酸緩衝化塩化ナトリウム溶液 PCR −ポリメラーゼ連鎖反応 PDGF −血小板由来成長因子 SEAP −分泌アルカリホスファターゼ UTR −非翻訳領域文献配列表（1）一般的情報：（i）出願人：（A）氏名：バイアースドルフアーゲー（B）番地：ウナシュトラーセ 48 （C）市：ハンブルク（E）国：ドイツ連邦共和国（F）郵便番号：20253 （A）氏名：ゲーベーエフ−ゲゼルシャフトフュアビオテヒノロギッシェフォルシュングエムベーハー（B）番地：マシェローダーベーク 1 （C）市：ブラウンシュバイク（E）国：ドイツ連邦共和国（F）郵便番号：38124 （ii）発明の名称：多シストロン発現ユニットおよびそれらの使用（iii）配列数：25 （iv）コンピューター読み出し形態：（A）媒休型：フロッピーデイスク（B）コンピューター：IBM PC互換（C）OS:PC-DOS/MS-DOS （D）ソフトウェア：パテントインリリース#1.0，バージョン#1.25（EPA）（2）配列番号：1の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：748塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （vi）起源：（A）生物名：ホモサピエンス（vii）直接の起源：（B）クローン名：p0DA（Eichnerら、1989）（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：CDS （B）存在位置：95..682 （D）他の情報：/産物=「PDGF-A前駆体配列（短いスプライシング形態）」 /注記=「末端が5'-EcoRIおよび3'-HindIII制限切断部位であるpODA 由来のヒトPDGF-A遺伝子（短いスプライシング形態、［2］）」 /出典=（［2］）（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：mat_peptide （B）存在位置：353..682 （D）他の情報：/産物=「成熟PDGF-A鎖」（x）公開情報：（A）著者：Eichner，W． Jaeger，V． Herbst，D． Hauser，H． Hoppe，J．（C）刊行物：Eur．J．Biochem．（D）巻：185 （F）頁：135-140 （G）日付：1989 （x）公開情報：（A）著者：Hoppe，J． Schumacher，L． Eichner，W． Weich，H．A．（C）刊行物：FEBS Lett．（D）巻：223 （F）頁：243-246 （G）日付：1987 （xi）配列：配列番号：1：（2）配列番号：2の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：196アミノ酸（B）配列の型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号：2：（2）配列番号：3の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：868塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （vi）起源：（A）生物名：ホモサピエンス（vii）直接の起源：（B）クローン名：pMVW-2（Weichら、1986）（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：CDS （B）存在位置：40..762 （D）他の情報：/産物=「PDGF-B前駆体配列」 /注記＝「末端が、5'-EcoRIおよび3'-HindIII制限切断部位である pGEM2-PDGF-B由来のヒトPDGF-B遺伝子」（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：mat_peptide （B）存在位置：283..609 （D）他の情報：/産物=「成熟PDGF-B鎖」（x）公開情報：（A）著者：Weich，H．A． Sebald，W． Schairer，H．U． Hoppe，U．（C）刊行物：FEBS Lett．（D）巻：198 （F）頁：344-348 （G）日付：1986 （xi）配列：配列番号：3：（2）配列番号：4の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：241アミノ酸（B）配列の型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号：4：（2）配列番号：5の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：628塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（vi）起源：（A）生物名：ポリオウイルス（Poliovirus）1型（Mahoney株）（vii）直接の起源：（B）クローン名：pGEM3-5'Polio（M）（4708 bp），（Sarnow，1989）（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：1..628 （D）他の情報:/注記=「ポリオウイルス1型(Mahoney)の5'非翻訳領域の最初の628ntが示されている」（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：610 （D）他の情報：/注記=「610位で塩基対がCからGに置換されでいる非正配列」（x）公開情報：（A）著者：Sarnow，P．（C）刊行物：J．Virol．（D）巻：63 （F）頁：467-470 （G）日付：1989 （xi）配列：配列番号：5：（2）配列番号：6の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：55塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（vi）起源：（A）生物名：アフリカツメガエルレービス（Xenopus laevis）（FalconeおよびAndrews；Patientら）（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：12..55 （D）他の情報：/注記=「β-グロビン相同性；末端が制限切断部位である部分配列」（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：12..55 （D）他の情報：/注記=「5'-3'方向付けは、複シストロンベクターのポリオ-UTRとシストロン2との間への挿入に関する」（x）公開情報：（A）著者：Falcone，D． Andrews，D．W．（C）刊行物：Mol．Cell．Biol．（D）巻：11 （E）号：5 （F）頁：2656-2664 （G）日付：1991 （x）公開情報：（A）著者：Patient，R．K． Harris，R． Walmsley，M．E． Williams，J．G．（C）刊行物：J．Biol．Chem．（D）巻：258 （F）頁：8521-8523 （G）日付：1983 （xi）配列：配列番号：6：（2）配列番号：7の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：17塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：1..17 （D）他の情報：/標識=M1317MER /注記=「合成DNA；PCRに利用されるM13配列決定用プライマー（New England Biolabs GmbH）」（xi）配列：配列番号：7：（2）配列番号：8の情報：（ｉ）配列の特徴：（A）配列の長さ：24塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：1..24 （D）他の情報：/標識=M1324MER /注記=「合成DNA；PCRに利用されるM13逆配列決定用プライマー（New England Biolabs GmbH）」（xi）配列：配列番号：8：（2）配列番号：9の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：19塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：1..19 （D）他の情報：/標識=NCCLSA1 /注記=「合成DNA；pMVW-2由来の短縮したPDGF-B前駆体を、バクテリオファージM13mp19中で再クローニングするための合成リンカー」（xi）配列：配列番号：9：（2）配列番号：10の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：19塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：1..19 （D）他の情報：/標識=NCCLSA2 /注記=「合成DNA；pMVW-2由来の短縮したPDGF-B前駆体を、バクテリオファージM13mp19中で再クロ−ニングするための合成リンカー」（xi）配列：配列番号：10：（2）配列番号：11の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：37塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：1..37 （D）他の情報：/標識=PDGBBCL /注記=「合成DNA；BclI-切断部位を、PDGF-B前駆体の5'-領域に挿入するための突然変異誘発プライマー」（xi）配列：配列番号：11：（2）配列番号：12の情報：（ｉ）配列の特徴（A）配列の長さ：110塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：1..110 （D）他の情報：/標識=PPDGFB1 /注記=「合成DNA；成熟PDGF-B前駆体配列の再構成のための合成リンカー」（xi）配列：配列番号：12：（2）配列番号：13の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：110塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：1..110 （D）他の情報：/標識=PPDGFB2 /注記=「合成DNA；成熟PDGF-B前駆体配列の再構成のための合成リンカー」（xi）配列：配列番号：13：（2）配列番号：14の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：30塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：1..30 （D）他の情報：/標識=5'-POLIO1 /注記=「合成DNA；合成PCRプライマー」（xi）配列：配列番号：14：（2）配列番号：15の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：28塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：1..28 （D）他の情報：/標識=3'-POLI02 /注記=「合成DNA；合成PCRプライマー」（xi）配列：配列番号：15：（2）配列番号：16の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：13塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：1..13 （D）他の情報：/標識=E-N-E1 /注記=「合成DNA；合成リンカー」（xi）配列：配列番号：16：（2）配列番号：17の情報：（ｉ）配列の特徴：（A）配列の長さ：13塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：1..13 （D）他の情報：/標識=E-N-E2 /注記=「合成DNA；合成リンカー」（xi）配列：配列番号：17：（2）配列番号：18の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：19塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：1..16 （D）他の情報：/標識=PDGFB190-PRIMI /注記=「合成DNA；合成PCRプライマー」（xi）配列：配列番号：18：（2）配列番号：19の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：37塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：- （B）存在位置：1..37 （D）他の情報：/標識=PDGFB190-PRIMII /注記=「合成DNA；合成PCRプライマー」（xi）配列：配列番号：19：（2）配列番号：20の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：1956塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （vi）起源：（A）生物名：ホモサピエンス（vii）直接の起源：（B）クローン名：pSQ2-SEAP（Bergerら、1988）（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：CDS （B）存在位置：43..1560 （D）他の情報:/注記=「ヒトSEAP遺伝子；末端に5'-EcoRIおよび3'-HindIII 制限切断部位を有する」（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：mat_peptide （B）存在位置：94..1560 （D）他の情報：/産物=「成熟タンパク質」（x）公開情報：（A）著者：Berger，J． Hauber，J． Hauber，R． Geiger，R． Cullen，B．R．（C）刊行物：Gene （D）巻：66 （F）頁：1-10 （G）日付：1988 （x）公開情報：（A）著者：Millan，J．L．（C）刊行物：J．Biol．Chem．（D）巻：261 （F）頁：3112-3115 （G）日付：1986 （xi）配列：配列番号：20：（2）配列番号：21の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：506アミノ酸（B）配列の型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号：21：（2）配列番号：22の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：1811塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （vi）起源：（A）生物名：ホタル（Photinus pyralis）（vii）直接の起源：（B）クローン名：pRSVLUC（de Wetら、1987）（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：CDS （B）存在位置：94..1743 （D）他の情報：/注記=「ルシフェラーゼ遺伝子のコーディング領域；末端が、5'-SmaIおよび3'-HindIII制限切断部位である」（x）公開情報：（A）著者：de Wet，J．R． Wood，K．V． DeLuca，M． Helinski，D．R． Subramani，S．（C）刊行物：Mol．Cell．Biol．（D）巻：7 （F）頁：725-737 （G）日付：1987 （xi）配列：配列番号：22：（2）配列番号：23の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：550アミノ酸（B）配列の型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号：23：（2）配列番号：24の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：625塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （vi）起源：（A）生物名：ホモサピエンス（vii）直接の起源：（B）クローン名：pSBC-1/-2-PDGF-B （ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：CDS （B）存在位置：40..609 （D）他の情報：/産物=「PDGF-B前駆体配列」（ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：mat_peptide （B）存在位置：283..609 （D）他の情報：/産物=「成熟PDGF-B鎖」（xi）配列：配列番号：24：（2）配列番号：25の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：190アミノ酸（B）配列の型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号：25：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/24 ＡＤＴ (72)発明者ヴィルト，マンフレートドイツ連邦共和国デー―38300 ヴォルフェンビュッテル，マルクトシュトラーセ１ (72)発明者ホイザー，ハンスエルクドイツ連邦共和国デー―38104 ブラウンシュバイク，ゲオルク―ヴェスターマンアレー 29 (72)発明者アイヒナー，ヴォルフラムドイツ連邦共和国デー―22301 ハンブルク，ドロテーンシュトラーセ 49 (72)発明者アハターベルク，フォルカードイツ連邦共和国デー―20257 ハンブルク，アイムスビュッテラーマルクトプラッツ 11 (72)発明者デルシュナー，アルブレヒトドイツ連邦共和国デー―20357 ハンブルク，シャンツェンシュトラーセ 107 (72)発明者マイヤー−インゴルト，ヴォルフガングドイツ連邦共和国デー―22457 ハンブルク，アムハーゼンカンプ 29 (72)発明者ミエルケ，ハイコドイツ連邦共和国デー―21629 ノイブルムストルフ，フィッシュベカーシュトラーセ 22 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の一般式で特徴づけられる、宿主細胞としての哺乳動物細胞におけるポリペプチドまたはそれらのサブユニットの等モル発現のための多シストロン発現ユニット： p-5'UTR-C₁-（IRES-Y-C₂）_n-3'UTR-ポリA ここで、「p」は、転写プロモーターであり、「5'UTR」は、非翻訳ヌクレオチド配列であり、ｎは１、２、または３であり、「C₁」および「C₂」は、それぞれポリペプチドまたはそのサブユニットをコードする遺伝子を含むシストロンであり、ここで、ｎが２または３の場合、連続基の配列（IRES-Y-C₂）は互いに同じであるかまたは異なり得、そしてさらにC₁およびC₂は同じであるかまたは異なり得、「IRES」は、ウイルス、細胞、または合成起源のヌクレオチド配列であり、該ヌクレオチド配列は翻訳段階で内部開始の原因となる配列であり、「Y」は、IRESと共同して、C₁およびC₂の遺伝子産物が等モル量で発現されるような様式でC_２に含まれる遺伝子の発現を確実にするヌクレオチド配列であり、「3'UTR」は、非翻訳ヌクレオチド配列であり、そして「ポリA」は、ポリアデニル化シグナルである。２．前記IRESが、ポリオウイルス１型の5'UTR、脳心筋炎ウイルス（EMV）の5' UTR、「サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス」（TMEV）の5'UTR、「ウシ腸内ウイルス」（BEV）の5'UTR、「コクサッキーＢ型ウイルス」（CBV）の5'UTR、「ヒトライノウイルス」（HRV）の5'UTR、「ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質」（BIP）5'UTR、ショウジョウバエアンテナペディア5'UTR、ショウジョウバエウルトラビトラックス5'UTR、または上記配列の遺伝的ハイブリッドまたはそれ由来のフラグメントであることにより特徴づけられる、請求項１に記載の発現ユニット。３．前記IRESが、配列番号：５に記載のヌクレオチド配列であることにより特徴づけられる、請求項１または２に記載の発現ユニット。４．「Y」が、アフリカツメガエルレービス由来のβグロビン配列、アルファルファモザイクウイルスRNA4 5'UTR、フェリチン5'UTR（動物）、タバコモザイクウイルス5'UTR（オメガ）、またはそれらのリーダー変異体、カブ黄斑モザイクウイルス（TYMV）、ブロムモザイクウイルス（BMV）RNA3 5'UTR、ラウス肉腫ウイルス（RSV）5'UTR、アデノウイルス三部分リーダー（L1-3）およびそれらの変異休、アフリカツメガエルボレアリス5'UTRβグロビン、またはアフリカツメガエルトロピカリス5'U TRβグロビン配列であることにより特徴づけられる、請求項１から３に記載の発現ユニット。５．「Y」が、配列番号：６に記載のアフリカツメガエルレービス由来のβグロビン配列、またはそれらのフラグメントまたは変異体であることにより特徴づけられる、請求項１から４に記載の発現ユニット。６．前記IRESが、配列番号：５に記載のポリオウイルス１型UTRであり、そして「Y」が配列番号：６に記載のアフリカツメガエルレービス由来のβグロビン配列であることにより特徴づけられる、請求項１から４に記載の発現ユニット。７．C₁およびC₂が、それぞれ、単一のタンパク質またはヘテロダイマーのタンパク質のポリペプチドサブユニットをコードする遺伝子を含むことにより特徴づけられる、請求項１から６に記載の発現ユニット。８．C₁およびC₂が、それぞれ、第VIIII因子、クレアチンキナーゼ、ヘモグロビン、免疫グロブリン、組織適合性抗原、散乱因子（HGF-SF）、トランスフォーミング増殖因子β型ファミリーのメンバー、骨形態形成タンパク質（BMP）のメンバー、インテグリンファミリーのメンバー、またはPDGF、またはそれらの天然または合成の変異体および誘導体、の異なるサブユニットをコードする遺伝子を含むことにより特徴づけられる、請求項１から７に記載の発現ユニット。９．「n」が１であり、そしてC₁およびC₂が、PDGFのA鎖またはB鎖、またはその生物学的に活性なアナログまたはフラグメントをコードする遺伝子を代替的に含むことにより特徴づけられる、請求項６に記載の発現ユニットであって、両遺伝子が該発現ユニットで同時発現される、発現ユニット。１０．C₁またはC₂が、PDGF-A_K（配列番号：１）またはPDGF-A_L前駆体配列を含むことにより特徴づけられる、請求項９に記載の発現ユニット。１１．C₁またはC₂が、完全PDGF-B前駆体配列（配列番号：３）、サル肉腫ウイルス由来のv-sis遺伝子、またはこれらの配列の変異体を含むことにより特徴づけられる、請求項９または１０に記載の発現ユニット。１２．C₁またはC₂が、191位のアミノ酸でアルギニンをコードするコドンを翻訳終止コドンに置換することにより末端切断されているPDGF-B前駆分子（配列番号：24）をコードする遺伝子フラグメントを含むことにより特徴づけられる、請求項９から１１に記載の発現ユニット。１３．C₁およびC₂が、PDGF-A_K（配列番号：１）または末端切断されたPDGF-B1 90前駆体配列（配列番号：24）を代替的に含むことにより特徴づけられる、請求項９に記載の発現ユニットであって、両遺伝子が該発現ユニットで同時発現される、発現ユニット。１４．「n」は１であり、そしてC₁およびC₂が、互いに異なるリポーター遺伝子を含むことにより特徴づけられる、請求項１から６に記載の発現ユニット。１５．前記リポーター遺伝子がルシフェラーゼおよび分泌アルカリホスファターゼをコードすることにより特徴づけられる、請求項１４に記載の発現ユニット。１６．作動可能な様式で挿入された請求項１から１５に記載の発現ユニットを含む組換えDNAベクター。１７．請求項１６に記載のベクターで形質転換された哺乳動物細胞である、宿主細胞。１８．前記宿主細胞がCHOまたはBHK細胞であることにより特徴づけられる、請求項１７に記載の宿主細胞。１９．作動可能な様式で挿入された請求項９から１３に記載の発現ユニットを含むベクターで形質転換される哺乳動物細胞であることにより特徴づけられる、宿主細胞。２０．前記細胞がCHOまたはBHK細胞であることにより特徴づけられる、請求項１９に記載の宿主細胞。２１．前記細胞がDSM ACC 2048に相当するクローン92-22-6またはDSM ACC 204 9に相当する92-22-7の１つに由来するPDGF-AB産生BHK細胞であることにより特徴づけられる、請求項２０に記載の宿主細胞。２２．請求項１７から２１に記載の宿主細胞が適切な培地で培養され、そして生じたタンパク質が該細胞および該培地から分離されることにより特徴づけられる、等モル割合のポリペプチドサブユニットからなるタンパク質を調製する方法。２３．ヘテロダイマータンパク質を調製するための、請求項２２に記載の方法。２４．前記タンパク質が、第VIII因子、クレアチンキナーゼ、ヘモグロビン、免疫グロブリン、組織適合性抗原、散乱因子（HGF-SF）、トランスフォーミング増殖因子β型ファミリーのメンバー、骨形態形成タンパク質（BMP）のメンバー、インテグリンファミリーのメンバー、またはPDGF、またはそれらの天然または合成の変異体または誘導体であることにより特徴づけられる、請求項２２または２３に記載の方法。２５．請求項１９から２１に記載の宿主細胞が適切な培地て培養され、そして生じたrPDGF-ABが該細胞および該培地から分離されることにより特徴づけられる、ヘテロダイマーrPDGF-ABを調製する方法。２６．ホモダイマー夾雑産物を本質的に含まない、ヘテロダイマーrPDGF-ABであって、宿主細胞としての哺乳動物細胞を適切な培地で培養し、ここで該細胞が作動可能な様式で連結された請求項９から１３に記載の発現ユニットを含んでおり、そして生じた該rPDGF-ABを該細胞および該培地から分離することにより得られる、ヘテロダイマーrPDGF-AB。２７．宿主細胞としてBHKまたはCHO細胞を培養することにより得られる、請求項２６に記載のヘテロダイマーrPDGF-AB。２８．ホモダイマー夾雑産物を本質的に含まない、ヘテロダイマーrPDGF-ABであって、作動可能な様式で連結された請求項１９から２１に記載の宿主細胞を適切な培地で培養し、そして生じた該rPDGF-ABを該細胞および該培地から分離することにより得られる、ヘテロダイマーrPDGF-AB。２９．薬学的に許容可能な補助剤および賦形剤とともに請求項２６から２８に記載のrPDGF-ABを含む薬学的および／または化粧用調製物。３０．軟膏、スプレー剤、ゲル剤、創傷帯、膏薬、または傷の手当用品であることにより特徴づけられる、請求項２９に記載の薬学的調製物。３１．作動可能な様式で挿入された請求項１４または１５に記載の発現ユニットを含むベクターで形質転換される哺乳動物であることにより特徴づけられる、宿主細胞。３２．DSM ACC 2046に相当するクローン91-46-9に由来することにより特徴づけられる、請求項３１に記載の宿主細胞。３３．請求項１から１５に記載の発現ユニットにおいて、IRESと共同して、C₁ およびC₂の遺伝子産物のほぼ等モルの発現をもたらす翻訳に影響を及ぼす「Y」配列を検出する方法であって、該方法は、以下の工程により特徴づけられる、方法：（ａ）Yとして試験される該配列を請求項１、１４、または１５に記載の発現ユニット中に導入する工程；（ｂ）作動可能な様式で挿入された個々の該発現ユニットを含むベクターを構築する工程；（ｃ）宿主細胞として哺乳動物を工程（ｂ）からのベクターで形質転換し、適切な培地て培養する工程；および（ｄ）C₁およびC₂の発現産物を、培地中で定量するか、または次いで該細胞および該培地から分離する工程。３４．CHOまたはBHK細胞が工程（ｃ）において宿主細胞として用いられることにより特徴づけられる、請求項３３に記載の方法。３５．請求項３１に記載の宿主細胞が工程（ｃ）において用いられることにより特徴づけられる、請求項３３に記載の方法。３６．前記IRESが配列番号：５に記載の配列であることにより特徴づけられる、請求項３３から３５に記載の方法。３７．請求項１から１５に記載の発現ユニットにおいて、「Y」と共同して、C₁ およびC₂の遺伝子産物のほぼ等モルの発現をもたらす翻訳を開始させるIRES配列を検出する方法であって、該方法は、以下の工程により特徴づけられる、方法：（ａ）IRESとして試験される該配列を請求項１、１４、または１５に記載の発現ユニット中に導入する工程；（ｂ）作動可能な様式で挿入された個々の該発現ユニットを含むベクターを構築する工程；（ｃ）宿主細胞として哺乳動物を工程（ｂ）からのベクターで形質転換し、適切な培地で培養する工程；および（ｄ）C₁およびC₂の発現産物を、培地中で定量するか、または次いで該細胞および該培地から分離する工程。３８．CHOまたはBHK細胞が工程（ｃ）において宿主細胞として用いられることにより特徴づけられる、請求項３７に記載の方法。３９．請求項３１に記載の宿主細胞が工程（ｃ）において用いられることにより特徴づけられる、請求項３７に記載の方法。４０．「Y」が配列番号：６に記載の配列であることにより特徴づけられる、請求項３７から３９に記載の方法。