JP3515110B2 - 多シストロン発現ユニットおよびそれらの使用 - Google Patents

多シストロン発現ユニットおよびそれらの使用

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、多シストロン発現ユニット、および宿主細
胞としての哺乳動物細胞におけるポリペプチドおよびそ
れらのサブユニットの等モル発現のためのそれらの使用
に関する。
種々の原核細胞および真核細胞において、操作および
遺伝子転移によって、遺伝子がクローニングにより単離
された個々のタンパク質を調製することが、長年にわた
って可能であった。適切な折り畳みおよびプロセシン
グ、および、適切な場合では、原核および下等真核発現
系ではしばしば適切には行われない翻訳後の改変もま
た、多くのタンパク質の完全な生物学的活性を達成する
ために必要である。この理由のために、しばしば、哺乳
動物細胞が宿主として使用される。このことに加えて、
哺乳動物細胞は、多量のタンパク質を分泌することがで
きる。
種々の理由により、２つ以上のタンパク質鎖の同時調
製が、しばしば要求される。例えば、多くの天然タンパ
ク質は、その機能形態において、数個のサブユニットか
ら構成されている（例えば、抗体）。実際に、複合タン
パク質の個々のサブユニットの会合は、タンパク質合成
後に行われる。細胞組織のその他の成分は、触媒または
制御要素として、しばしばこの会合に関与し、場合に応
じて本来の構造の折り畳みが起こる。会合の妨害は、例
えば、個々の成分の一様でない合成の結果として、形成
されるべきタンパク質および宿主細胞の両方にとって、
成果のあがらない結果になり得る。実際に、この系は精
巧な調節を必要とし、ほとんどの部分に対して細胞特異
性である。この調節は、遺伝子操作された細胞では一般
的に調節されないので、数種の外来タンパク質の同時産
生を行うための下記に説明されている代替法が、開発さ
れ、適用されている： １）遺伝子を、発現ベクター中に別々に組み込み、次
に、適切な割合で細胞に共転移する。このことは、いく
つかのプラスミドコピーが、安定な様式で同時に取り込
まれ、分裂時に停留し続けることを前提にする。個々の
遺伝子の互いの遺伝子に対する発現割合は、コピー数お
よび宿主細胞ゲノム中への組み込み部位の両方に依存す
る。精巧なスクリーニング法により、所望の割合で個々
の遺伝子産物を発現する細胞クローンを単離することが
可能である。
２）コピー数を一様にするために、個々の遺伝子を、１
つのベクターの独立した転写ユニットに配置する。これ
は、広範囲にわたり、遺伝子の化学量論的表現を確実に
するが、このプロセスはまた問題を有する。従って、同
じ強度のプロモーターを有する発現ユニットが使用され
ても、異なるタンパク質をコードするmRNAが、同じ安定
性および翻訳効率を有することは、決して保証されな
い。２つの遺伝子の転写効率が必ずしも同じである必要
はない。この場合において、発現の化学量論は、組換え
DNA法により、段階的に（step−wise）生成される（互
いに関連する転写ユニットの配置、および、個々の要素
の除去または付加による、個々のプロモーターの強度の
調節）。
３）複シストロンまたは多シストロンベクターは、個々
の転写物のmRNAの安定性に関連した問題を避けるために
開発された。この目的のために、タンパク質鎖をコード
する遺伝子セグメント（シストロン）の個々の読み取り
枠は、１つの転写ユニット（発現ユニット）上に存在す
る。多シストロン遺伝子の発現は、１つのプロモーター
により影響される。このようなベクター中の最初のシス
トロンは、通常は非常に効率よく翻訳されるが、後続の
シストロンは、シストロン間配列に依存して翻訳され
る。単シストロン遺伝子の通常の5'非翻訳配列（5'UT
R）が、これらのシストロン間配列に使用される場合に
は、後続シストロンの発現は普通非常に低い（概して、
最初のシストロンの翻訳の約0.5から２％、Kaufmanら、
1987;Boelら、1987）。リーダー配列（高効率リーダ
ー、HEL）を挿入することにより、この効率を約20％増
すことが最初に可能となった。翻訳の内部開始を可能に
する特定の細胞配列およびウイルス配列（IRES;Jackson
ら,1990）の発見および使用により、最初のシストロン
と後続のシストロンとの翻訳比を3:1に達成することが
続けて可能となった。
翻訳は、複シストロンベクターまたは多シストロンベ
クターの使用において重要な役割を果たす。通常、翻訳
は、「キャップ」依存機構に従って真核生物で開始さ
れ、これにおいて、タンパク質およびRNAからなる前開
始複合体（pre−initiation complex）が「キャップ」
（メチル化ヌクレオチド）を有するmRNAの5'末端に構築
される。この点から、適切な翻訳開始コドンが選択さ
れ、その位置から翻訳が開始される。このことは、前開
始複合体が3'方向へmRNAに沿って移動する「スキャニン
グ」プロセスにより起こると考えられる。数種の例外を
除き、5'末端に存在するシストロンは、この様式で、い
つも効率よく翻訳される（Kozak,1989）。後続の全ての
シストロンは、全く翻訳されないか、または非常に非効
率的にのみ翻訳される。後続シストロンの翻訳効率を改
良することは、遺伝子間の距離（シストロン間領域;Koz
ak,1987;Wirthら、1991）の最適化、またはいわゆる
「高効率リーダー」配列（HEL、上記を参照のこと）の
使用により可能であった（例えば、FalconeおよびAndre
ws,1991、およびそこに援用されている参考文献）。HEL
は、「キャップ」依存翻訳の開始を刺激する、遺伝子ま
たはその他の配列の5'非翻訳領域である。しかし、この
種の構築物においてさえ、第２および後続シストロンで
達成され得る発現値は、「キャップ」依存様式で調節さ
れる第１シストロンの発現値より、いつも明らかに低
い。
近年発見された内部で翻訳を開始させる機構、すなわ
ち「キャップ」構造のないmRNAで翻訳を開始する機構
は、特異的核酸配列を使用する。これらの配列は、個々
のピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルスおよび脳
心筋炎ウイルス（PelletierおよびSonenberg,1988;Jang
ら、1988;Jangら、1989））およびある種の細胞タンパ
ク質（例えば、BiP（MacejakおよびSarnow,1991））の
非翻訳領域を含む。ピコルナウイルスでは、いわゆるIR
ES（リボソーム内部エントリー部位）である5'非翻訳領
域の短いセグメントが、前開始複合体の内部結合の原因
となる。628ntの領域が、この翻訳を効率よく開始させ
るために必要である。研究により、IRESの3'領域の400
塩基対のみではなく、ピコルナウイルス非翻訳領域の5'
末端部分もまた効率的な翻訳に必要であることが示され
ている（SimoesおよびSarnow,1991）。他方で、翻訳開
始の通常の機構には不可欠である「キャッピング」は、
対応するmRNAの5'末端に存在するときには、ポリオウイ
ルスIRESによる内部開始効率を減退させる（Hambridge
およびSarnow,1991）。ネガティブ効果は、IRESが第２
シストロンの開始の原因となる場合に避けられ、それ
は、シストロンが「キャップ」とIRESとの間に存在する
ときである。
従って、IRES要素は、読み取り枠の効率的な翻訳のイ
ニシエーターとして機能し得る。これを行うとき、それ
らは、第１シストロンの「キャップ」依存翻訳に対して
影響を及ぼさない。さらに逆に、IRES依存開始における
影響は、「キャップ」依存翻訳開始には依存しないよう
である。２つのプロセスの機構もまた、異なる細胞因子
の使用において明らかに区別される（Meerovitchら、19
89;JangおよびWimmer,1990）。過去には、複シストロン
発現プラスミドを使用したいくつかの研究が公表された
（Adamら、1991;Ghattasら、1991;Kaufmanら、1991;Woo
dら、1991;Wirthら、1991）。しかし、「キャップ」依
存翻訳は、IRES依存翻訳より明らかに強いので、２つの
タンパク質鎖の化学量論的発現を達成することは不可能
であった。従って、今までの応用は、第２シストロンに
おける選択マーカーの使用に集中していた。選択マーカ
ー発現物と、発現されるべき遺伝子（第１シストロンを
構成する）との近接カップリングは、高レベルの発現を
選択するとき、特に前に遺伝子増幅が必要である場合
に、特に有利である。しかし、複シストロンまたは多シ
ストロン発現ベクターによる等モル量タンパク質の合成
はまだ達成されていない。
組換え調製法における２つの異なるタンパク質鎖の当
モル発現が重要であると考えられる典型的な例は、血小
板由来成長因子（PDGF、ヒト血清中の主要マイトジェン
の１つ）の遺伝子操作による単離である。ヒト血小板か
ら精製されたPDGFは、ジスルフィド架橋によって互いに
結合される、２つの異なるが密接に関連するポリペプチ
ド鎖からなる。還元条件下では、ダイマーPDGFはそのモ
ノマーサブユニットに解離し、このサブユニットのうち
より大きいサブユニット（Mr 15−17,000 D）はPDGF−
Ａ鎖、そして小さなサブユニット（Mr 14,000 D）はPDG
F−Ｂ鎖と命名されている（Johnssonら、1984）。
PDGF−ＡおよびPDGF−Ｂタンパク質鎖は、異なる遺伝
子によりコードされる。両遺伝子産物の完全な構造を、
cDNAクローニング法により解明することは可能となった
（Ratnerら、1985,Betsholtzら、1986）。これに関連し
て、両PDGF分子は、非常に長い前駆体分子として最初に
合成され、続いて細胞内でプロセシングされて成熟PDGF
鎖を生じることが明らかになった。3'領域の69−bpセグ
メントの存在または不在により異なる、２つの異なるPD
GF−Ａ転写物は、別のスプライシングに基づいて説明さ
れ得る（Betsholtzら、1986;Wiseら、1989）。この挿入
は、コーディングセグメントに変化を生じさせ、その結
果、PDGF−Ａ鎖の短い変異体（PDGF−AK、110アミノ
酸）および長い変異体（PDGF−AL、125アミノ酸）が形
成される。両変異体は、互いに並んだ通常の細胞タンパ
ク質として検出され、より短い形態がより頻繁に生じる
種である（Matoskovaら、1989;Youngら、1990）。
２つの遺伝子は異なる染色体上に配置され、高度の相
同性を示す。多くの研究で、２つの遺伝子は、異なる調
節機構に従属することが示されている。この結果、実際
に、２つのPDGF鎖は、互いに異なる割合で、別々の細胞
型で産生される。
PDGFの可能な３つの異性体（AA、AB、およびBB）はす
べて天然に存在し、血小板中のいわゆるα顆粒中に蓄え
られる。多量に形成するPDGF−ABヘテロダイマーとは別
に、約30％までのPDGF−BBもまた、成人ヒト血小板から
単離され得る（Hammacherら、1988）。新しく調製され
た血小板もまた高い割合（27％）でPDGF−AAを含有する
（Hartら、1990）。従って、栓球前駆体細胞、すなわち
巨核球中では、２つのホモダイマーを合わせた割合は、
ABヘテロダイマーの割合にほぼ一致することが予測され
得る。血小板中の各PDGF種の濃度は、創傷治癒過程での
個々の重要性に直接関連するので、最も頻繁に生じるイ
ソ型、すなわちPDGF−ABが、特に「創傷治癒ホルモン」
の研究で重要視される。
各々の異なるイソ型は、インビトロで生物学的活性を
有する。種々のPDGF種の活性の異なるスペクトルを区別
することを目的とする比較研究を可能にしたのは、高度
精製の組換えPDGFイソ型の入手性のみであった（Hoppe
ら、1989;Hoppeら、1990）。一方、一連の研究により、
走化性およびDNA増殖テストにおけるPDGF−AA、PDGF−A
B、およびPDGF−BBの能力の違い（Hosangら、1989;Nist
erら、1988;ReillyおよびBroski,1989;Siegbahnら、199
0）、および、イノシトール1,4,5−トリホスフェート遊
離、ジアシルグリセロールの産生、および［Ca2+］ｉ移
動におけるそれらの影響の差異（Blockら、1989;Sachin
idisら、1990 A,1990 B）が実証されている。２つの異
なるPDGFレセプター群（PDGFαレセプターは全PDGFイソ
型に結合し、βレセプターはPDGF−BBのみに結合する、
Hartら,1988;Heldinら,1988）は、PDGFイソ型の効果の
相違が、それらの異なるレセプター活性化能力により、
いかに導き出され得るかに関してもっともらしい説明を
提供する。PDGFイソ型が測定可能であり、異なるインビ
トロ効果を有することにより、２つの異なるレセプター
群が実証されるとともに、PDGF−AA、PDGF−AB、および
PDGF−BB活性のインビボスペクトルが異なるという結論
が導き出される。この理由により、夾雑タンパク質とし
てPDGF−BBまたはPDGF−AAが存在しない、純粋PDGF−AB
の生産が望まれる。均質な、よく特徴づけられたヘテロ
ダイマーを得るために、その点で、ホモダイマーが精製
により完全に除去されなければならないが、この精製
は、全PDGF種が非常に類似したクロマトグラフィー特性
を有することによりあまり役に立たない。
組換えPDGFホモダイマー（特にPDGF−BB）の調製のた
めの一連の種々の経路が、比較的長い間、ある程度知ら
れていた（Kellyら、1985;Heldinら、1986;Hoppeら、19
89;Beckmannら、1988;Bywaterら、1988;Stroobantおよ
びWaterfield 1984）。高度に純粋なPDGF−ABの調製方
法は、Hoppeらにより記載された（1990,PCT/EP 90/00 0
63もまた参照のこと）。この方法では、個別のE.coli細
胞で別々に調製された不活性モノマーを、インビトロで
復元して、生物学的に活性なPDGF−ABに変換する。
ＡおよびＢ一本鎖の種々の長さにも関わらず、従来合
成されていた３つのPDGFイソ型の遺伝子産物は、広範囲
にわたり互いに一致する生物学的活性を示す。
序論に掲載されている２つ（またはそれ以上）のタン
パク質の同時発現の基準は、真核生物系でのPDGF−ABヘ
テロダイマーの異種発現にもまた適用する。組換えCHO
細胞でのPDGF−ABの調製（stmanら、1988）および酵
母発現系の使用［EP 0 259 632］について以前に公表さ
れた戦略は、上記の２）で考察された例に相当し、ここ
では、両PDGF遺伝子は、独立した転写ユニットで１つの
ベクター上に配置されている。この様式でCHO細胞で発
現された個々のPDGFダイマーの定量により、19％ PDGF
−AA、69％ PDGF−AB、および12％ PDGF−BBを得た（
stmanら、1988）。
両遺伝子の化学量論的説明だけではなく、最優先事項
としてそれらの同等発現もまた、真核発現系によるPDGF
−ABヘテロダイマーの好ましい合成のための重要な必須
条件として考察されるべきである。この理由により、複
シストロン発現ユニットは、ヘテロダイマータンパク質
および従ってPDGF−ABを発現するための可能な補助物と
して、自身を提示する。この種の系もまた、PDGFの発現
に関してWO 90/01550に記載されている。しかし、上記
の３）により詳細に説明されているように、これらの構
築物は、第２（および、後続の）シストロンに対して非
常に制限された発現率でのみ得られる。第１シストロン
に配置されたPDGF鎖に依存して、この型のホモダイマー
が優先的に形成される。その他の発現系を使用して真核
細胞で両PDGF遺伝子を発現するための、文献に以前記載
された試みでは、ホモダイマー副産物の割合が30％以上
の範囲になった。それにもかかわらず、これらの細胞系
を使用して高度に精製されたPDGF−ABを得るためには、
精密であって非常に浪費的な精製法が使用されなければ
ならない。
従って、本発明の目的は、２つまたはそれ以上のポリ
ペプチドまたはそれらのサブユニットの、それぞれ等モ
ルでの、そしてさらにヘテロ（ダイ）マーの好ましい形
成を保証する組換え調製を可能にする因子を生成するこ
とである。それにより、下流のタンパク質精製法の収量
および経済性が改良される。
この目的を達成するには、宿主細胞としての哺乳動物
細胞におけるポリペプチドまたはそれらのサブユニット
の等モル発現のための多シストロン発現ユニットが、本
発明に従って提案される。このユニットは以下の一般式
によって特徴づけられる。
ｐ−5'UTR−C1−（IRES−Ｙ−C2）ｎ−3'UTR−ポリＡ ここで、 「ｐ」は、転写プロモーターであり、 「5'UTR」は、非翻訳ヌクレオチド配列であり、 ｎは１、２、または３であり、 「C1」および「C2」は、それぞれポリペプチドまたは
そのサブユニットをコードする遺伝子を含むシストロン
であり、ここで、ｎが２または３の場合、連続基の配列
（IRES−Ｙ−C2）は互いに同じであるかまたは異なり
得、そしてさらにC1およびC2は同じであるかまたは異な
り得、 「IRES」は、ウイルス、細胞、または合成起源のヌク
レオチド配列であり、そのヌクレオチド配列は、翻訳段
階で内部開始の原因となる配列であり、 「Ｙ」は、IRESと共同して、C1およびC2の遺伝子産物
が等モル量で発現されるような様式でC2に含まれる遺伝
子の発現を確実にするヌクレオチド配列であり、 「3'UTR」は、非翻訳ヌクレオチド配列であり、 「polyA」は、ポリアデニル化シグナルである。
本特許（the patent）の構築物では、同等の翻訳効率
がシストロン間要素を導入することにより達成され、そ
して驚くべきことに、遺伝子産物の1:1の化学量論が見
出された。このようにして、本質的な土台は、動物細胞
においてヘテロ（ダイ）マーを発現するように作製され
た。細胞の発現能が転写および翻訳のレベルまで十分に
用いられており、そしてさらに、ほとんど完全なヘテロ
ダイマー形成の結果としてホモ（ダイ）マーを除去する
ための精巧な精製工程が省かれ得るという事実により、
経済性の高い哺乳動物細胞における個々のタンパク質の
産生が確実となる。
真核細胞中で活性のあるすべてのプロモーター、すな
わち、真核細胞において遺伝子発現を開始させるプロモ
ーターは、本発明の発現ユニットにおけるプロモーター
として用いるのに適切である。特に、ウイルス起源（例
えば、レトロウイルスの「長末端反復」（LTR）または
サイトメガロウイルス（CMV）の初期プロモーター）、
細胞起源（例えば、ヒトアクチンプロモーターまたはユ
ビキチンプロモーター）、または合成起源の構成および
誘導プロモーターが使用され得る。SV40プロモーター
が、本発明によれば好ましい。
5'UTRおよび3'UTRは、調節要素を含有し得、そして
「C1」および「C2」を転写制御要素に作動可能に連結す
る役割をなす任意の、原則として非翻訳のヌクレオチド
配列である。本発明によれば、例えば、Arteltら（198
8）によるSV40由来の配列が適している。
リボソームの内部結合を仲介する、ウイルス、細胞、
または合成起源のこれらの全ての配列が、IRESとして使
用され得る。このような配列の例は、ポリオウイルス１
型由来のIRESであり、さらに、脳心筋炎ウイルス（EMC
V）の5'UTR、「サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス」
（TMEV）の5'UTR、「口蹄疫ウイルス」（FMDV）の5'UT
R、「ウシ腸内ウイルス」（BEV）の5'UTR、「コクサッ
キーＢ型ウイルス」（CBV）の5'UTR、または「ヒトライ
ノウイルス」（HRV）の5'UTR、または「ヒト免疫グロブ
リン重鎖結合タンパク質」（BIP）5'UTR、ショウジョウ
バエアンテナペディア（Drosophila antennapediae）5'
UTR、またはショウジョウバエウルトラビトラックス（D
rosophila ultrabithorax）5'UTR、または上記の配列の
遺伝子ハイブリッドまたはフラグメントを包含する。本
発明によれば、配列番号:5のポリオウイルス１型由来の
IRESが好ましく、これは、ポリオウイルス１型の5'非翻
訳領域の最初の628ヌクレオチドを含む。
一般式で与えられたように、IRESと共同して、C1およ
びC2の遺伝子産物が等モル量で発現されるような様式で
C2に含まれる遺伝子の発現を確実にする、これらのすべ
てのヌクレオチド配列が、「Ｙ」として用いられ得る。
特に、アフリカツメガエルレービス（Xenopus laevis）
βグロビン（β−Grobin）5'UTR（FalconeおよびAndrew
s,1991;Patientら,1983）、アルファルファモザイクウ
イルスRNA4 5'UTR（JoblingおよびGehrke,1987）、フェ
リチン5'UTR（動物、KlausnerおよびHarford,1989）、
タバコモザイクウイルス5'UTR（「オメガ」）、プラ
ス、リーダー変異体（Gallieら,1987A,1987B;Gallie
ら，（1988））、カブ黄斑モザイクウイルス（TYMV）5'
UTR、ブロムモザイクウイルス（BMV）RNA3 5'UTR、およ
びラウス肉腫ウイルス（RSV）5'UTR（それぞれGallie
ら,1987Bを参照のこと）、アデノウイルス三部分リーダ
ー（L1−３）および変異体（Berkner,Zymogenetics WO
90/01550;BerknerおよびSharp（1985）;Kaufman（198
5））、アフリカツメガエルボレアリス（Xenopus borea
lis）5'UTRβグロビンおよびアフリカツメガエルトロピ
カリス（Xenopus tropicalis）5'UTRβグロビン（ぞれ
ぞれKnoechelら，（1986）を参照のこと）が適切であ
り、配列番号:6に記載のアフリカツメガエルレービス由
来のβグロビン配列が本発明によれば特に好ましい。
本発明の特に好ましい実施態様によれば、IRESは、配
列番号:5に記載ポリオウイルス１型UTRであり、そして
「Ｙ」が配列番号:6に記載のアフリカツメガエルレービ
ス由来のβグロビン配列である。
その上、さらに適切なIRESおよび「Ｙ」配列は、以下
の詳細な説明に記載され、同様に本発明の一部である方
法を用いて確かめられ得る。
C1およびC2シストロンは、互いに独立して、そして任
意の配列において、ぞれぞれ、単独のポリペプチド成
分、または２つまたはそれ以上の成分からなるヘテロマ
ー性ポリペプチドをコードする遺伝子を含み得、その遺
伝子は本発明に従って等モル様式で発現され、従ってこ
の成分はそれぞれ1:1の比で宿主細胞内で利用可能にな
り得る。従って、シストロンC1およびC2は、同じである
かまたは異なり得、そして連続基（IRES−Ｙ−C2）のシ
ストロンC2は、互いに同じであるかまたは異なり得る。
特に、C1およびC2は、それぞれ、第VIII因子、クレアチ
ンキナーゼ、ヘモグロビン、免疫グロブリン、組織適合
性抗原、Ｔ−細胞レセプター、散乱因子（HGF−SF）、
トランスフォーミング増殖因子β型ファミリーのメンバ
ー、骨形態形成タンパク質（BMP）のメンバー、インテ
グリンファミリーのメンバー、またはPDGF、またはそれ
らの天然または合成の変異体および誘導体、の異なるサ
ブユニットをコードする遺伝子を含み得る。
特に好ましい実施態様によれば、本発明は、PDGF−AB
に関する；対応して、特に好ましい発現ユニットでは、
「ｎ」が１であり、そしてC1およびC2が、PDGFのＡ鎖ま
たはＢ鎖、またはその生物学的に活性なアナログ、また
はそれらのフラグメントをコードする遺伝子を代替的に
含み、両遺伝子はこの発現ユニットで同時発現される。
しかし、基本的には、PDGF−Ｂ前駆体のさらなる変化
が、PDGF−ABの産生のために生じなければならなかっ
た。これは、PDGF−ＡとPDGF−Ｂ前駆体分子とでは生物
物理学的特性が異なるからである。PDGF−Ｂの発現が、
生物学的に活性である物質の分泌と必然的に相関してい
るわけではないことが知られている。大部分の発現PDGF
−BBは、原形質膜と近接結合してとどまっている（Robb
insら,1985）。単シストロン発現ベクターを用いると
き、CHO細胞において、PDGF−Ｂの発現はPDGF−Ａの発
現よりもかなり低い。このような理由のため、PDGF−BB
は、静電的相互作用の結果として、産生細胞の細胞の外
側の原形質膜上にとどまっており、そしてそれのほんの
わずかの量しか培地中に放出されない（La Rochelleら,
1990;La Rochelleら,1991;stmanら,1991）。PDGF−Ｂ
前駆体のＣ末端領域の短いセグメントが、保持をもたら
す原因となる（stmanら,1991）。本特許（patent）に
従う構築物では、PDGF−Ｂ前駆体配列のこのセグメント
は、成熟PDGF−Ｂ鎖の3'末端に終止コドンを導入するこ
とにより除去された。PDGF−Ｂ前駆体の相当する切断DN
A配列は、B190と命名される。この構築物で形質転換さ
れた細胞の培養上清由来の分泌PDGF−BBは、Ｂ＊と命名
される。
本発明のPDGF−ABを調製するために、C1またはC2は、
PDGF−AK（配列番号:1）またはPDGF−AL前駆体配列、完
全PDGF−Ｂ前駆体配列（配列番号:3）、サル肉腫ウイル
ス由来のｖ−sis遺伝子、または配列番号:3に記載の283
から609塩基対、またはPDGF−Ｂ前駆体の191位のアミノ
酸でアルギニンをコードするコドンを翻訳終止コドンに
置換することにより末端切断されているPDGF−Ｂ前駆分
子をコードする遺伝子フラグメントを含む。前述の遺伝
子は、ぞれぞれ、Ａ鎖をコードする遺伝子とＢ鎖をコー
ドする遺伝子とが存在する限り、いかなる組み合わせで
も存在し得る。
本発明によれば、特に好ましい発現ユニットでは、C1
およびC2が、PDGF−AK（配列番号:1）または末端切断さ
れたPDGF−Ｂ前駆体配列（配列番号:24）を代替的に含
み、両遺伝子はその発現ユニットで同時発現される。
以下に記載のようにさらに適切なIRESおよび「Ｙ」配
列を同定するために、「ｎ」が１であり、そしてC1およ
びC2が、互いに異なるリポーター遺伝子を含む発現ユニ
ットが用いられる。本発明の特に好ましい実施態様によ
れば、この種の発現ユニットは、リポーター遺伝子とし
て、ルシフェラーゼ（配列番号:22）および分泌アルカ
リホスファターゼ（配列番号:20）をコードする遺伝子
を含む。
本発明は、さらに、作動可能な様式で挿入された本発
明の発現ユニットを含む組換えDNAベクターに関する。
本発明に従う好ましいベクター、およびそれらの調製は
図１から6Cに示される。
本発明はさらに、哺乳動物細胞であって、そして作動
可能な様式で挿入された本発明の発現ユニットを有する
組換えDNAベクターで形質転換される宿主細胞を含む。
それらは、好ましくはCHOまたはBHK細胞である。
本発明の特に好ましい実施態様は、上述で詳細に記載
されたPDGF−ABをコードする発現ユニットの１つを有す
るベクターで形質転換される宿主細胞（特にBHK細胞）
に関する。これらは、好ましくは、C1およびC2が、PDGF
−AK（配列番号:1）、または完全な（配列番号:3）また
は末端切断された（配列番号:24）PDGF−Ｂ前駆体配列
を代替的に含む。
本発明に従って、形質転換PDGF−AB産生BHK細胞は、D
eutcshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultu
ren GmbH（DSM）（German collection of microorganis
ms and cell cultures）に、1992年８月11日（11.8.199
2）に、DSM ACC 2048に相当する92−22−６（pSBC−PDG
F−A/−Ｇ−B190、表２を参照のこと）、またはDSM ACC
2049に相当する92−22−７（pSBC−PDGF−B190/−Ｇ−
Ａ、表２を参照のこと）の名称で寄託した。
さらに、適切なIRESまたは「Ｙ」配列を同定するため
に、上述で詳細に記載されるように、リポーター遺伝子
を含む発現ユニットを有するベクターで形質転換される
宿主細胞が、適切な培地で培養される。好ましくは、こ
のベクターは、ルシフェラーゼおよび分泌アルカリホス
ファターゼをコードする遺伝子を含む、本発明のベクタ
ーである。
本発明によれば、ルシフェラーゼをコードする遺伝子
（配列番号:22）および分泌アルカリホスファターゼを
コードする遺伝子（配列番号:20）で形質転換された宿
主細胞は、German collection of microorganisms and
cell cultures（DSM）に、1992年８月11日に、DSM ACC
2046に相当する91−46−９（pSBC−SEAP/−Ｇ−LUC、表
１を参照のこと）、およびDSM ACC 2047に相当する91−
46−10（pSBC−Ｇ−SEAP−LUC、表１を参照のこと）の
名称で寄託した。
本発明は、さらに、等モル割合の異なるポリペプチド
サブユニットからなるタンパク質を調製する方法を含
み、この方法は、上述で詳細に記載される本発明の発現
ユニットで形質転換される宿主細胞を適切な培地で培養
し、そしてこのようにして産生されたタンパク質を細胞
および培地から分離することによる。
例として、第VIII因子、クレアチンキナーゼ、ヘモグ
ロビン、免疫グロブリン、組織適合性抗原、Ｔ−細胞レ
セプター、散乱因子（HGF−SF）、トランスフォーミン
グ増殖因子β型ファミリーのメンバー、骨形態形成タン
パク質（BMP）のメンバー、インテグリンファミリーの
メンバー、またはPDGF、またはそれらの天然または合成
の変異体または誘導体のようなタンパク質が、このよう
にして調製され得る。
本発明のベクターを用いて、PDGFのダイマー、または
異なるスプライス型が存在する他のタンパク質（例え
ば、VEGF（血管内皮増殖因子）のような今までは容易に
調製できなかったタンパク質）のダイマーを産生するこ
ともまた初めて可能となった。このダイマーとしては、
例えば、長／短鎖型のダイマーPDGF−Ａ（PDGF−AL/PDG
F−AK）またはPDGF−B/v−sis型の分子が挙げられる。
別の選択物は、１つの鎖のみが翻訳後修飾に関するシグ
ナル配列（例えばグリコシル化シグナル）を含むダイマ
ーまたはマルチマーにより代表される。従って、このよ
うにして、グリコシル化またはさもなければ「片側だけ
の（one−sided）」様式で修飾されるタンパク質が調製
され得る。
本発明の特に好ましい実施態様によれば、この方法
は、ヘテロダイマーrPDGF−ABを調製するために用いら
れる。この方法は、PDGF−Ａ鎖およびPDGF−Ｂ鎖をコー
ドする遺伝子を有する本発明の発現ユニットを有するベ
クターで形質転換される宿主細胞を、上述で記載される
適切な培地で培養することによる。このようにして産生
されたrPDGF−ABが、続いて細胞および培地から分離さ
れる。
PDGF−ABヘテロダイマーが、本発明に従って複シスト
ロンベクター系により、独占的にまたは実質独占的に産
生され得、そしてPDGFホモダイマーの合成が妨害され得
ることを、実施例２において証明し得た。予期しないこ
とに、第２シストロンの発現レベルが、第１シストロン
の発現レベルと一致するように、この構築物において刺
激される。
これに関連し、そして本発明に従って、C1およびC
2が、PDGF−AK（配列番号:1）、または完全な（配列番
号:3）または末端切断された（配列番号:24）PDGF−Ｂ
前駆体配列をそれぞれ代替的に含むベクターで形質転換
されるBHK細胞が、好ましく培養される。
哺乳動物細胞を培養するための公知の全ての培地が、
培地として適当である。この培地には、合成のタンパク
質非含有または低タンパク質含有産生培地が含まれる。
4.5g/lグルコースおよび５〜10％のFCSを補充したDMEM
（ダルベッコの改変イーグル培地）が、本発明に好まし
かった。
rPDGF−ABは、従来の方法により、細胞および培地か
ら分離される（例えば、stmannら、1988を参照のこ
と）。BHK細胞からのPDGF−AAのために開発された高度
に有効な方法（Eichnerら、1989）が、好ましい方法で
ある。
最後に、本発明は、ホモダイマー夾雑産物を本質的に
含まない、上記の宿主細胞を本発明に従って培養するこ
とにより得られ得るヘテロダイマーrPDGF−ABに関す
る。驚くべきことには、本発明の構築物で形質転換され
た宿主細胞が、形成されたPDGFの総量に基づく純度90％
以上でヘテロダイマーPDGF−ABを分泌することが明らか
にされた。本発明によれば、本発明の構築物で形質転換
されるBHK細胞を培養することにより得られるPDGF−AB
が好ましい。
本発明のrPDGF−ABはその高純度により、従来から公
知である組換えPDGF−ABとは主として異なる。序論に述
べたように、得られる産物の90％以上がヘテロダイマー
からなるような組換え方法は、今までに記載されていな
い。ホモダイマーをヘテロダイマーから完全に分離する
ことは実質的に不可能であるので、既知産物は、必然的
に３つの全イソ型の混合物となる。
このことに加えて、既知産物は、その調製法によっ
て、多くの点で不都合である。例えば、EP 259 632また
は288 307に記載のような、酵母細胞での異種遺伝子発
現は、グリコシル化パターンが、ヒト産物に比較して変
化しているタンパク質産物を導くことが知られている。
さらに、酵母細胞で発現されたPDGF−Ｂは、少なくとも
一部はプロセシングが不完全であり、および／または、
タンパク質分解的に減成される（WO 92/01716を参照の
こと）。従って、この種の産物は、種々の炭水化物パタ
ーンを有し、タンパク質分解減成産物で夾雑される。前
述の不都合を避けるために、WO 92/01716には、グリコ
シル化の共通配列およびプロテアーゼ感受性ドメインが
除去された改変PDGF鎖を調製する方法が記載されてい
る。しかし、この種の改変は、産物の生物学的活性に影
響する（WO 92/01716を参照のこと）。
本発明の特に好ましい実施態様では、ヘテロダイマー
rPDGF−ABは、本発明に従って形質転換されたBHK細胞を
培養することにより、例えば、German collection of m
icroorganisms and cell cultures（DSM）に、1992年８
月11日に、DSM ACC 2048に相当する92−22−６、または
DSM ACC 2049に相当する92−22−７の名称で寄託したBH
K細胞を培養することにより得られる。
さらに、WO 90/08163は、細菌細胞、特にE.coliでのP
DGF−ABの組換え調製を開示しており、この調製は必然
的に非グリコシル化産物を導く。しかし、この方法によ
りE.coli細胞中で発現されたPDGF−Ｂ鎖は、アミノ末端
の12アミノ酸で切断されている。これに加えて、細菌か
らの産物はインビトロで復元されなければならないが、
分子内および分子間での適切なジスルフィド架橋形成、
およびタンパク質の適切な折り畳みの方法が保証されな
いので、その結果、この産物の免疫学的特性が変化され
得、生物学的活性が影響を受け得る。
本発明のヘテロダイマーrPDGF−ABは、薬学的調製物
として（特に創傷治癒用）、薬学的に許容可能な（tole
rated）補助剤および賦形剤と共に、好ましくは処方さ
れる。これに関連して、それは、膏薬および創傷帯など
の中で活性化合物として含有され得る。それは、特に局
所塗布用に適しているが、その他の投与形態にもまた適
している。この他の投与形態では、その活性化合物が創
傷中に導入されるかまたは経皮投与される。例えば、PD
GF−ABは、創傷周辺領域に、貯蔵機能を有する適切なマ
トリックスで、皮下投与され得るか、または、直接皮下
注射され得る。
さらに、本発明のrPDGF−ABは、化粧用調製物、例え
ば、皮膚再生、皮膚をなめらかにする、皮膚荒れまたは
皮膚の加齢の予防、および日焼けの塗布用の製造に適し
ている。
適切な補助剤および賦形剤には、水ベースのセルロー
スゲル、生分解性ポリマー、および任意の軟膏基剤およ
びクリーム基剤、およびスプレー剤が含まれる。さら
に、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、第XIII因
子、線維芽細胞増殖因子（aFGF、bFGF）、トランスフォ
ーミング増殖因子αまたはβ型、上皮増殖因子、インス
リンまたは「インスリン様増殖因子」（IGF IおよびI
I）、または別の増殖因子のような、創傷治癒に影響す
るさらなる活性化合物が、本発明の調製物中に含有され
得る。本発明の調製物はまた、例えば、水溶液状で創傷
帯中に存在し得る。
上述で説明したように、本発明は、特定の配列「Ｙ」
を取り込むことにより、C2のIRES依存翻訳は、それが
「キャップ」依存翻訳の効率を達成するように増大され
得るという認識に基づく。従って、配列「Ｙ」は、IRES
依存翻訳開始の増大が、少なくともキャップ依存効率に
対応して得られるように、IRESと共に作動し得る。この
機能を十分に満たす「Ｙ」配列は、上記で詳細に説明さ
れている。本特許によれば、アフリカツメガエルレービ
ス由来のβグロビン5'UTRが好ましい。
本発明の必須要件を満たすさらなる配列は、本発明の
発現ユニットにおいて、IRESと共同して、C1およびC2の
遺伝子産物のほぼ等モル発現をもたらす翻訳に影響を及
ぼす「Ｙ」配列を検出する方法により同定され得る。こ
の方法は、以下の工程を包含する： （ａ）Ｙとして試験される配列を、複シストロンまたは
多シストロン発現ユニット中に導入する工程であって、
ここで、このユニットでは、C1およびC2がそれぞれリポ
ーター遺伝子を含んでおり、これらの遺伝子は、異な
る、そして容易に識別可能な遺伝子産物をコードしてい
る、工程； （ｂ）作動可能な様式で挿入された個々の発現ユニット
を含むベクターを構築する工程； （ｃ）宿主細胞として哺乳動物を工程（ｂ）からのベク
ターで形質転換し、適切な培地で培養する工程；および （ｄ）C1およびC2の発現産物を、培地中で定量するか、
または次いで細胞および／または培地から分離する工
程。
好ましくは、CHOまたはBHK細胞が工程（ｃ）において
宿主細胞として用いられ、BHK−21細胞が特に好まし
い。
あるいは、本発明の必須要件を満たすさらなる配列
は、請求項１から請求項15に記載の発現ユニットにおい
て、「Ｙ」と共同して、C1およびC2の遺伝子産物のほぼ
等モル発現をもたらす翻訳を開始させるIRES配列を検出
する方法により同定され得る。この方法は、以下の工程
を包含する： （ａ）IRESとして試験される配列を、複シストロンまた
は多シストロン発現ユニット中に導入する工程であっ
て、ここで、このユニットでは、C1およびC2がそれぞれ
リポーター遺伝子を含んでおり、これらの遺伝子は、異
なる、そして容易に識別可能な遺伝子産物をコードして
いる、工程； （ｂ）作動可能な様式で挿入された個々の該発現ユニッ
トを含むベクターを構築する工程； （ｃ）宿主細胞として哺乳動物を工程（ｂ）からのベク
ターで形質転換し、適切な培地で培養する工程；および （ｄ）C1およびC2の発現産物を、培地中で定量するか、
または次いで細胞および／または培地から分離する工
程。
この方法において、CHOまたはBHK細胞が、宿主細胞と
して好ましく用いられ、特に好ましい様式では、ルシフ
ェラーゼおよび分泌アルカリホスファターゼをコードす
る遺伝子（LUCおよびSEAP）を、それぞれリポーター遺
伝子として含むBHK細胞が用いられる。
本発明は、図面および実施例により以下に説明され
る。
I.図面の説明： 図１）基本ベクターpSBC−１およびpSBC−２の調製 ベクターpSBC−１を構築するために、プラスミドpGEM
3−5'ポリオ（Ｍ）（Sarnow,1989）由来の627bpのMse I
/Bal I−フラグメントを、以下のプライマーを用いるPC
Rのためのマトリックスとして用いた（図１）： 増幅から得られた652bpフラグメントをPol I Kで処理
し、次いでPst Iで切断し、対応させて調製したベクタ
ーpBEH（Arteltら,1988）に挿入した。ベクターpSBC−
２の構築について、プラスミドpBEHをEcoR Iで線状化
し、そして以下のオリゴヌクレオチド配列をハイブリダ
イズし、挿入した： 図2AおよびＢ）発現ベクターpSBC−LUC/SEAPおよびpSBC
−SEAP/LUCの構築 ルシフェラーゼおよび分泌アルカリホスファターゼに
対する遺伝子のコーディングcDNA配列を、EcoR I/Hind
III制限断片を用いて単シストロンベクターpSBC−１お
よびpSBC−２（図2Aおよび2B）に挿入した。複シストロ
ン発現ユニットを形成する２つのベクターの融合を、制
限酵素Xmn I/Not Iを用いて行った。
図2C）プラスミドpSBC−SEAP/−Ｇ−LUCおよびpSBC−LU
C/−Ｇ−SEAPの構築 発現構築物pSBC−SEAP/−Ｇ−LUCおよびpSBC−LUC/−
Ｇ−SEAPは図2Aおよび2Bに示したプラスミドに由来す
る。それらは、唯一のNot I部位に連結されたオリゴマ
ーＧ（配列番号:6）をさらに含む。オリゴマーＧは、No
t I部位に連結することにより5'−Not I部位が欠失され
るが（Sal I部位はこの位置に含まれる）3'−Not I部位
は保存されるように構築される。
図３）ベクターM13BCL1の模式図 ｃ−sisに相同なpMVW−２の領域（PDGF−Ｂ）をベク
ターマップ上に示す。成熟PDGF−ＢおよびNco I/Sal I
アダプターの領域を黒棒線により強調する。
図４）完全PDGF−Ｂ前駆体配列の再構築 プラスミドpMVW−２は、ヒトPDGF−Ｂ遺伝子のcDNAを
含む。この配列は前駆体配列の5'−翻訳領域において不
完全である（Weichら,1986）。真正（authentic）PDGF
−Ｂ前駆体を再構築するために、Bcl I切断部位を、ク
ローンpMVW−２のコーディングセグメントの30位のＣ−
Ｔ変換により前駆体の5'末端領域に導入した。この工程
の結果として、コーディング領域の短いセグメントのみ
が最終的に欠失され、これに関して局部的にコードされ
たアミノ酸（アスパラギン酸）が保存されている。ほと
んどのE.coli株において、メチル化の結果、Bcl I切断
部位は酵素切断に対して抵抗性であるので、この切断部
位を含むフラグメントはdam-株に再クローニングされる
かまたはPCR工程によって増幅されなければならない。
次いで、前駆体の欠失領域を、合成Sal I/Bcl Iフラグ
メント［オリゴマーPPDGFB1およびPPDGFB2］として挿入
する。
このために、まずpMVW−２由来の914bpのBamH I/Nco
Iフラグメントを、BamH I/Sal I切断バクテリオファー
ジM13mp19（pharmacia）に、合成アダプター［オリゴマ
ーNCCLSA1（配列番号:9）およびNCCLSA2（配列番号:1
0）］によって挿入した。この構築物は、次のインビト
ロ変異誘発工程に必要な一本鎖DNAを提供した。この工
程は、Ecksteinらの方法に基づいて、Amershamのオリゴ
マー特異的インビトロ変異誘発系（２型）を用いて行っ
た［Taylorら，（1985）,Nakamaye K.およびEckstein
F.（1986）,Sayersら，（1988）］。合成プライマーPDG
BBCL（配列番号:11）を用いて、配列番号:3で示された
配列の144位での塩基置換（ＣからＴ）は、変異誘発の
後達成され、それによりBcol I切断部位がPDGF−Ｂ前駆
体の5'領域に導入される。この変異誘導体をM13BCL1と
命名した（図３）。
M13BCL1由来の1100bpフラグメントを、プライマーM1317
MER（配列番号:7）およびM1324MER（配列番号:8）を用
いてPCR工程で増幅し、続けてBcl I/Hind III制限酵素
処理にかけ、次いで得られた770bpのフラグメントを単
離した。合成オリゴマーPPDGFB1（配列番号:12）および
PPDGFB2（配列番号:13）は、Bcl I切断部位までのPDGF
−Ｂ前駆体の欠失5'領域を形成する。アニーリング後、
続けてこの二本鎖オリゴマーを、770bpのPDGF−Ｂフラ
グメントとともに、ベクターpGEM−２（Promega）に連
結した。これは、Sal I/Hind IIIでの制限酵素処理によ
り予め調製しておいた（図４）。PDGF−Ｂの真正配列
を、完全に配列決定することにより実証した。
図５）分泌PDGF−Ｂ鎖の調製 単シストロン発現ベクターを用いると、BHK細胞でのP
DGF−Ｂ遺伝子の発現は、PDGF−Ａの発現よりも低い。
この理由は、PDGF−BBが産生細胞の細胞の外側の原形質
膜上に保持されており、少量しか培地中に放出されない
からである（La Rochelleら,1991;stmannら,1991）。
PDGF−Ｂの保持はカルボキシ末端領域により仲介されて
おり、これは天然状態では、PDGF−Ｂの放出と関連して
切り落とされる（La Rochelleら,1991）。さらに容易に
分泌され得るPDGF−Ｂの変異株を調製するために、PCR
仲介変異誘発を行い、終止コドンをPDGF−Ｂ前駆体の19
1位のアミノ酸（Arg）の位置に挿入した。保持に関わる
領域は、このようにして調製された変異体（PDGF−B190
（配列番号:24））では発現されない。610bpの長いPCR
産物が、以下のプライマーを用いて得られた（図５）： 図6AおよびＢ）発現ベクターpSBC−PDGF−A/BおよびpSB
C−PDGF−B/Aの構築 PDGF−Ｂ前駆体に対する完全なコーディングcDNA（Ra
tnerら,1985）は、ベクターpGEM2−PDGF−Ｂに存在する
（図４）。PDGF−Ａ鎖の短い変異体の完全なcDNA配列
（Betsholtzら,1986）は、発現ベクターpODA（Eichner
ら,1989）中に含まれる。このベクターは、pPGF−１（H
oppeら,1987）由来のRsa IフラグメントをSV−40発現ベ
クターpBEH（Arteltら,1988）中にクローニングするこ
とにより得られた。PDGF−Ａ鎖およびPDGF−Ｂ鎖のコー
ディングcDNA配列を、EcoR I/Hind III制限断片（図
１）を用いて単シストロンベクターpSBC−１およびpSBC
−２に挿入した。複シストロン発現ユニットを形成する
２つのベクターの融合を、制限酵素Xmn I/Not Iを用い
て行った（図6A、6B）。
図6C）プラスミドpSBC−PDGF−A/−Ｇ−B190およびpSBC
−PDGF−B190/−Ｇ−Ａの模式図 発現構築物pSBC−PDGF−A/−Ｇ−B190およびpSBC−PD
GF−B190/−Ｇ−Ａは、図6Aおよび6Bに示したプラスミ
ドに由来する。それらは、唯一のNot I部位に連結され
るオリゴマーＧ（配列番号:6）をさらに含む。オリゴマ
ーＧは、Not I部位に連結することにより5'−Not I部位
が欠失される（Sal I部位はこの位置に含まれる）が、
3'−Not I部位は保存されるように構築される。
図７）２つのポリクローナル抗PDGF抗体を用いてPDGF−
Ａ鎖およびPDGF−Ｂ鎖を検出するためのサンドイッチEL
ISA:PDGF標準物からの検量線 ポリスチレンプレートをヤギ抗PDGF−AB−IgG（ポリ
クローナル、Collaborative Researchから入手）でコー
ティングし；種々のPDGF標準物とのインキュベートを行
った後（以下を参照のこと）、結合したPDGFを、ポリク
ローナルウサギ抗PDGF−AAまたは抗PDGF−BB、次にペル
オキシダーゼ標識抗ウサギIgGを用いて検出した。
抗PDGF−AAを用いる場合（ELISA I.1）、O.D.シグナル
は配列:PDGF−AB＞PDGF−AA≫PDGF−BB（7.1）中で得ら
れる。抗PDGF−BBを用いると（ELISA I.2）、PDGF−AB
およびPDGF−BBに対して最大O.D.値が10ng/mlから得ら
れるが、一方PDGF−AAは1000ng/mlまでシグナルを全く
生じない（7.2）。
［標準物の材料源:AB:ヒト血小板由来、Promega Corp.N
o.G 6191から入手;BB:酵母からの組換え体、Promega Co
rp.No.G 5191から入手;AA:BHK細胞からの組換え体、約7
0％純度（Eichnerら,1989）］。
図８）モノクローナルおよびポリクローナル抗PDGF抗体
を用いてPDGF−ABを検出するためのサンドイッチELISA:
PDGF標準物からの検量線 ポリスチレンプレートをヒツジ抗マウスIgGでコーテ
ィングし、次いでマウスハイブリドーマ上清（クローン
1B3由来であり、PDGF−ABおよびPDGF−BBにおけるＢ鎖
に対するモノクローナル抗体を含む）とインキュベート
し；種々のPDGF標準物とのインキュベーションを行った
後（図７の解説を参照のこと）、PDGF−ABを、ポリクロ
ーナルウサギ抗PDGF−AA、次にペルオキシダーゼ標識抗
ウサギIgGを用いて検出した。
真核生物起源のPDGFを用いると、特異的シグナルが、PD
GF−AB（ヒト血小板由来）により得られ、わずかな交差
反応がPDGF−BBにより得られる。
図９）ELISA Iを用いる組換えBHK細胞の培養上清中のPD
GF−Ａ鎖またはPDGF−Ｂ鎖の検出： 標準物からの検量線（図7.1および２を参照のこ
と）；以下の遺伝子でトランスフェクトされたBHK細胞
起源の試料： 試料1:pSBC−２−PDGF−A;試料2:pSBC−２−PDGF−B;試
料3:pSBC−２−Ｇ−PDGF−B190;試料4:pSBC−PDGF−A/
B;試料5:pSBC−PDGF−B/A;試料6:pSBC−PDGF−A/−Ｇ−
B190;試料7:pSBC−PDGF−B190/−Ｇ−A;試料8:pSBC−２
−PDGF−Ａ＋pSBC−２−PDGF−B;試料9:pSBC−PDGF−Ａ
＋pSBC−２−Ｇ−PDGF−B190;試料10:pSBC−LUC/−Ｇ−
SEAP;試料11:pSBC−SEAP/−Ｇ−LUC。
中央：ノーザンブロット分析 LUCおよびSEAPに対する単シストロンおよび複シスト
ロン発現構築物で安定してトランスフェクトされたBHK
細胞の全プールからのmRNAを試験した。RNAをPurchioら
（1979）の方法により単離し、１％アガロースホルムア
ルデヒドゲル（Lehrachら,1977）上で分画し、ナイロン
膜上にブロットし、［32P］−標識アクチン、LUCおよび
SEAP特異的プローブとハイブリダイズさせた。予測通
り、単シストロンmRNAは約1900〜2500ntの大きさである
が、これに対して複シストロンmRNAの場合は、２つのリ
ポーター遺伝子のコーディング配列に対応する大きさ
（約3800〜4400ヌクレオチド）で存在する。このこと
は、対応する遺伝子産物は１つの複シストロンmRNAに解
読されていることを実証している。
右手側：ルシフェラーゼおよびSEAP発現の結果 1.1および1.2に記載のようにして結果を決定した。
表２）BHK細胞におけるPDGF−Ａ鎖およびPDGF−Ｂ鎖に
ついての単シストロンおよび複シストロン発現ベクター
の生産性 培養上清中のPDGF濃度を、マイトジェン試験を用いて
測定した。PDGF−ABは、ELISA IIを用いて特異的に検出
された（2.3、標準物からの検量線を参照のこと、図８
を参照のこと）。
II.実施例： 実施例に挙げた発現の適用は、単シストロンおよび複
シストロン転写ユニットに基づく。発現されるべき遺伝
子は、それぞれベクターpSBC−１およびpSBC−２に組み
込まれる。ベクターの構築は、LUCおよびSEAP遺伝子の
発現について図2Aから2C、およびPDGF−ＡおよびPDGF−
Ｂ遺伝子の例を用いる図6Aから6Cに示されるように、複
シストロンを形成するpSBC−１およびpSBC−２の組換え
を容易にする。プラスミドpSBC−PDGF−A/−Ｇ−B190
（Ｇ＝配列番号:6に記載のアフリカツメガエルレービス
由来のβ−グロビン配列）を動物細胞に移した後、PDGF
−Ａの翻訳がcap依存様式で行われ、そしてPDGF−Ｂの
翻訳がポリオ−IRESに依存して行われる。相当する様式
で、pSBC−PDGF−B190/−Ｇ−Ａおよびリポーター遺伝
子LUCおよびSEAPは、単シストロンおよび／または複シ
ストロンmRNA分子により翻訳される。
実施例1:複シストロンベクター系を用いるリポーター遺
伝子LUCおよびSEAPの発現 1.1 ルシフェラーゼの検出方法 ルシフェラーゼは細胞抽出物中に含まれる。その活性
は、ルシフェリン（基質）、ATP、およびMg2+を添加す
ることにより定量され得、ルシフェラーゼ遺伝子の活性
の測定にかけられ得る。以下の反応が起こる（de Wet
ら,1987）： ルシフェラーゼ＋ルシフェリン＋ATP＋Mg2+←→ルシフェラーゼ・ ルシフェリル−AMP＋PPi ルシフェラーゼ・ルシフェリル−AMP＋O2→ルシフェラーゼ ＋オキシルシフェリン＋AMP＋CO2＋hv 1.2 分泌アルカリホスファターゼの検出方法 アルカリホスファターゼは結合リン酸基の加水分解を
触媒する酵素である。真核生物に存在する膜局在酵素
は、糖リン脂質アンカー（anchor）を有しており、これ
によって、酵素はそのＣ末端により膜に結合されてい
る。分泌タンパク質は、しばしば、細胞の内部にまたは
膜中に局在しているタンパク質よりも検出するのに便利
であるので、人工的な翻訳終止シグナルをヒト胎盤由来
のアルカリホスファターゼの配列（513アミノ酸）に489
位で導入した（Bergerら,1988）。対応する発現プラス
ミドのトランスフェクション後生じたタンパク質変異体
は、有効に培地に分泌され、リポーター分子として使用
するのにきわめて適切である（SEAP＝分泌アルカリホス
ファターゼ）。それは比色分析または蛍光分析により検
出され得る（Bergerら,1988）。
1.3 形質転換BHK細胞の調製 単シストロンおよび複シストロン発現ベクター（これ
らはリポーター遺伝子LUCおよびSEAPのコーディング配
列またはPDGF−Ａ鎖およびPDGF−Ｂ鎖を有する（図2A−
Ｃおよび6A−Ｃを参照のこと））をリン酸カルシウム沈
降法によりBHK細胞にトランスフェクトした（Wiglerら,
1979;Grahamおよびvan der Eb,1973）。トランスフェク
ションの前日に、２〜３×105BHK細胞/24cm2を新しい培
養フラスコに移し、トランスフェクションの４時間前
に、DME培地を用いて培地の交換を行った。５μｇの上
述のプラスミドDNA、および0.5μｇの選択プラスミドpA
G60およびpSV2pac（Colbre−Garapin,1981;Varaら,19
86、これらはそれぞれネオマイシン耐性遺伝子およびプ
ロマイシン耐性をコードしている）を250μｌの250mM C
aCl2中に共に懸濁した。この溶液を、無菌ガス中に吹き
付けて連続的に撹拌しながら、250μｌの２×HEPES緩衝
液（280mM NaCl;50mM HEPES;1.5mM NaH2PO4,pH7.1）に
ゆっくりと添加し、生じた沈殿物を栄養培地に加えた。
トランスフェクションの２日後、安定してトランスフェ
クトした細胞の選択を、DME培地から２倍選択培地（５
μg/mlプロマイシン;500μg/ml G418、Wirthら,1988）
に培地を交換することにより開始した。PDGF産生または
LUP/SEAP産生BHK細胞の代表的なクローンを、1992年８
月11日にDSMに寄託した。以下のような番号がつけられ
た： 1.4 IRES調節シストロンの前に翻訳増大配列を導入し
た結果としての等モル量の遺伝子産物LUCおよびSEAPの
発現 表１のリポーター遺伝子構築物pSBC−LUC/SEAPおよび
pSBC−SEAP/LUCを用いる本研究者らの結果により、複シ
ストロン構築物におけるIRESに依存する翻訳の発現は、
通常、capに依存する様式で翻訳されるシストロンにお
ける発現よりも明らかに低いことが証明された。これ
は、文献から知られる値に相当する。アフリカツメガエ
ルレービス由来のβグロビン配列（配列番号:6）を、単
シストロンおよび複シストロンリポーター遺伝子構築物
中の唯一のNot I切断部位（図2C）に挿入した。複シス
トロン発現ベクターでは、それは、第１シストロンのプ
ロモーターと5'UTRとの間または第２シストロンのIRES
要素と5'UTRとの間に直接配置される。
個々のシストロンの翻訳効率の増大は、図2A−2Cに示さ
れるリポーター遺伝子構築物を用いて測定した。表１
は、βグロビン配列が、５の要素による単シストロン発
現ユニットにおけるルシフェラーゼのcap依存翻訳およ
び３の要素による複シストロン発現ユニットにおけるIR
ES依存翻訳を刺激することを示す。後者は、複シストロ
ンベクターにおいてシストロン１および２の等モル発現
を指示する。表１に示されたノーザンブロットは、相当
する遺伝子産物がそれぞれ単シストロンmRNAおよび複シ
ストロンmRNAから解読されることを示す。特定のmRNA濃
度は細胞において同じオーダーのマグニチュードからな
るという事実から、グロビン配列の発現増大効果は翻訳
のレベルで理解されることが分かる。
第１シストロンおよび第２シストロンの遺伝子産物の
等モル発現は、アフリカツメガエルレービス由来のグロ
ビン遺伝子の5'UTR（配列番号:6）を導入することによ
り達成された。
実施例2:複シストロンベクター系を用いるPDGF−ABヘテ
ロダイマーの発現 2.1 馴化細胞培養上清の調製 BHK細胞を1.3と類似のようにして形質転換した。コロ
ニー数を数えた後、細胞をトリプシン処理し、新鮮な選
択培地に採取し、そして細胞数を105細胞/mlにまで調整
した。それぞれ、この細胞懸濁液10mlを底面積65cm2の
フラスコに移し、さらに24時間培養する。次いで培地を
除去し、播種した細胞をPBSで２回洗浄し、そして培地
を10mlの産生培地（DMEM、血清および選択抗生物質を含
まない）と取り替える。24時間後、培地を取り去る。採
取した上清を分析まで−20℃で保存する。細胞数を数
え、液体窒素中に保存する。採取する時、フラスコ当た
りの細胞数は0.8〜1.2×107である。
2.2 マイトジェン試験を用いる培養上清中のPDGFの検
出 PDGFのマイトジェン活性は、密度阻止線維芽細胞にお
けるDNA合成速度の刺激の測定することにより決定され
得る。PDGF種はすべてこの試験において生物学的に活性
であるので、これによりイソ型は区別し得ない。
このアッセイは、Shipleyら（1984）に従ってAKR−2B
マウス線維芽細胞を用いて24ウエルプレート中で行っ
た。この試験では、純粋PDGFでは、約5ng/mlの濃度で半
最大刺激を示した。この値を生産性を決定するために用
いた。マイトジェン試験の結果を、表２中のPDGF−AB−
ELISAからの値と比較する。
2.3 PDGF ELISAを用いる培養上清におけるPDGF−ABヘ
テロダイマーの検出 ２つの「２抗体サンドイッチアッセイ」を、I.）PDGF
ダイマー中のPDGF−Ａ鎖およびPDGF−Ｂ鎖のおおよその
定量、およびII.）PDGF−AAおよびPDGF−BBの存在下で
のPDGF−ABの明確な定量が可能なように構成した。
I.2つのポリクローナル抗PDGF抗体を用いるサンドイッ
チアッセイ 96ウエルのポリスチレンプレート（Dynatechから入
手、Ｕ−Platte,No.M124B）を以下の順にコーティング
する（それぞれ、各工程間0.05％Tween 20を含むPBSで
４回洗浄する）。
I.1 ポリクローナルヤギ抗PDGF−AB−IgG（Collaborat
ive Reseachから入手、No.40017）；これはPDGF−AB、P
DGF−BBに結合し、そして少量がPDGF−AAに結合す
る）、0.05M炭酸／炭酸水素緩衝液中２μg/mlのうちの5
0μｌを４℃で一晩。
I.2 １％BSA（E.Merckから入手,No.12018、PBS中）、p
H7.5、100μｌを室温で１時間。
I.3 0.1％BSAおよび0.05％Tween 20を含有するPBS（PB
S＋）中に希釈したPDGF含有溶液、50μｌを室温で１時
間。
I.4.1 ポリクローナルウサギ抗PDGF−AA−IgG（Genzym
eから入手、No.ZP−214、これはPDGFダイマーのＡ鎖に
結合する）、PBS＋中２μg/mlのうちの50μｌを室温で
１時間；（ELISA I.1）または I.4.2 ポリクローナルウサギ抗PDGF−BB−IgG（Genzym
eから入手、No.ZP−215、これはPDGFダイマーのＢ鎖に
結合する）、I.4.1と同様（ELISA I.2）。
I.5 POD標識ヤギ抗ウサギIgG（Pierceから入手、No.31
460）、PBS＋中0.1μg/mlのうちの50μｌを室温で１時
間、E.S.BOSら（J.Immunoassay ２（1981）,187−204）
に従って基質テトラメチルベンジジンを用いる検出。
II.モノクローナル抗PDGF抗体およびポリクローナル抗P
DGF抗体を用いるサンドイッチアッセイ ELISA Iと同様のプレートを以下の順にコーティング
する（量、緩衝液、およびインキュベーション時間は上
記の通り）： II.1 ヒツジ抗マウスIgG（Boehringer Mannheimから入
手、No.1097 105）、３μg/ml。
II.2 １％BSA（PBS中） II.3 クローン1B3由来のマウスハイブリドーマ上清［S
P2/0−骨髄腫細胞を、組換えPDGF−AB（J.Hoppeら、199
0に従ってE.coliから得た）で免疫したマウス由来の脾
臓細胞と融合することにより得られる］、２μg/ml IgG
2a。モノクローナル抗体はPDGFダイマーのＢ鎖に特異的
に結合する。
II.4 PDGF含有溶液。
II.5 ポリクローナルウサギ抗PDGF−AA−IgG（I.4.1を
参照のこと）、２μg/ml II.6 I.5と同様。
2.4 IRES制御シストロンの前への翻訳増大配列の導入
の結果としてのPDGF A鎖およびＢ鎖の等モル量の発現 図５に記載のように変異させたPDGF−Ｂを含む複シス
トロン構築物は、通常、複シストロンベクターにおける
配置に対応して、3:1の比でPDGF A鎖およびＢ鎖の発現
を導く。２つの遺伝子の等モル発現は、ポリオ要素のリ
ボソーム内部エントリー部位の3'領域に翻訳増大配列を
導入することにより達成された。このような要素は、例
えば、アフリカツメガエルレービス由来のβグロビン配
列（配列番号:6）である。このβグロビン配列（オリゴ
マーＧ）を、複シストロンベクターの唯一のNot I切断
部位に挿入した（図6C）。得られたプラスミドでは、そ
れは、IRES要素と第２シストロンの5'UTRとの間に直接
的に配置される。
2.5 結果： 組換えBHK細胞の培養上清由来のPDGFの３つの異なる
分析の結果を図９および表２に示す。
ELISA Iを用いて、２つのPDGF鎖の比の大まかな概算を
行うことが可能である。従って、シストロン間要素の効
率に関して結論が引き出され得、そして複シストロン構
築物はおよそ等量のPDGF−ＡおよびPDGF−Ｂが翻訳され
るように構築され得る。しかし、これに関連して、ELIS
A I.1においてPDGF−ABが、PDGF−AAよりも強いシグナ
ルを与えることを考慮に入れるべきである。マイトジェ
ン試験は、異なるイソ型（PDGF−AA、PDGF−AB、または
PDGF−BB）間で差異を生じることなく、培養上清中に存
在するrPDGFの全量に対する有用な値を提供する。ヘテ
ロダイマーPDGF−ABの特定比は、PDGF−AB特異的ELISA
IIによって決定され得る。PDGFホモダイマーの百分率比
は、マイトジェン試験の結果とこの後者の分析の結果と
の間の差異から、高精度で決定され得る。
略語： B190 − Ｃ末端切断PDGF−Ｂ前駆体（DNA） Ｂ＊ − PDGF−Ｂ鎖（タンパク質）、切断PDGF−Ｂ前
駆体起源 BHK − ハムスター細胞系 bp − 塩基対 BSA − ウシ血清アルブミン CHO − ハムスター細胞系 DMEM − ダルベッコの改変イーグル培地 ELISA − 酵素結合免疫吸着アッセイ G − アフリカツメガエルレービス由来βグロビン
配列 IgG − Ｇクラス免疫グロブリン IRES − リボソーム内部エントリー部位 LUC − ルシフェラーゼ nt − ヌクレオチド PBS − リン酸緩衝化塩化ナトリウム溶液 PCR − ポリメラーゼ連鎖反応 PDGF − 血小板由来成長因子 SEAP − 分泌アルカリホスファターゼ UTR − 非翻訳領域 配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人： （Ａ）氏名：バイアースドルフ アーゲー （Ｂ）番地：ウナシュトラーセ 48 （Ｃ）市：ハンブルク （Ｅ）国：ドイツ連邦共和国 （Ｆ）郵便番号:20253 （Ａ）氏名：ゲーベーエフ−ゲゼルシャフト フュ
ア ビオテヒノロギッシェ フォルシュング エムベー
ハー （Ｂ）番地：マシェローダー ベーク １ （Ｃ）市：ブラウンシュバイク （Ｅ）国：ドイツ連邦共和国 （Ｆ）郵便番号:38124 （ii）発明の名称：多シストロン発現ユニットおよび
それらの使用 （iii）配列数:25 （iv）コンピューター読み出し形態： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換 （Ｃ）OS:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃1.0,
バージョン＃1.25（EPA） （２）配列番号:1の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:748塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:pODA（Eichnerら、1989） （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:95..682 （Ｄ）他の情報:/産物＝「PDGF−Ａ前駆体配列（短
いスプライシング形態）」 ／注記＝「末端が5'−EcoR Iおよび3'−
Hind III制限切断部位であるpODA由来のヒトPDGF−Ａ遺
伝子（短いスプライシング形態、［２］）」 ／出典＝（［２］） （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:mat_peptide （Ｂ）存在位置:353..682 （Ｄ）他の情報:/産物＝「成熟PDGF−Ａ鎖」 （ｘ）公開情報： （Ａ）著者:Eichner,W. Jaeger,V. Herbst,D. Hauser,H. Hoppe,J. （Ｃ）刊行物:Eur.J.Biochem. （Ｄ）巻:185 （Ｆ）頁:135−140 （Ｇ）日付:1989 （ｘ）公開情報： （Ａ）著者:Hoppe,J. Schumacher,L. Eichner,W. Weich,H.A. （Ｃ）刊行物:FEBS Lett. （Ｄ）巻:223 （Ｆ）頁:243−246 （Ｇ）日付:1987 （xi）配列：配列番号:1: （２）配列番号:2の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:196アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:2: （２）配列番号:3の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:868塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:pMVW−２（Weichら、1986） （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:40..762 （Ｄ）他の情報:/産物＝「PDGF−Ｂ前駆体配列」 ／注記＝「末端が、5'−EcoR Iおよび3'
−Hind III制限切断部位であるpGEM2−PDGF−Ｂ由来の
ヒトPDGF−Ｂ遺伝子」 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:mat_peptide （Ｂ）存在位置:283..609 （Ｄ）他の情報:/産物＝「成熟PDGF−Ｂ鎖」 （ｘ）公開情報： （Ａ）著者:Weich,H.A. Sebald,W. Schairer,H.U. Hoppe,U. （Ｃ）刊行物:FEBS Lett. （Ｄ）巻:198 （Ｆ）頁:344−348 （Ｇ）日付:1986 （xi）配列：配列番号:3: （２）配列番号:4の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:241アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:4: （２）配列番号:5の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:628塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （vi）起源： （Ａ）生物名：ポリオウイルス（Poliovirus）１型
（Mahoney株） （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:pGEM3−5'Polio（Ｍ）（4708 b
p），（Sarnow,1989） （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..628 （Ｄ）他の情報:/注記＝「ポリオウイルス１型（Ma
honey）の5'非翻訳領域の最初の628ntが示されている」 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:610 （Ｄ）他の情報:/注記＝「610位で塩基対がＣから
Ｇに置換されている非正配列」 （ｘ）公開情報： （Ａ）著者:Sarnow,P. （Ｃ）刊行物:J.Virol. （Ｄ）巻:63 （Ｆ）頁:467−470 （Ｇ）日付:1989 （xi）配列：配列番号:5: （２）配列番号:6の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:55塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （vi）起源： （Ａ）生物名：アフリカツメガエルレービス（Xeno
pus laevis）（FalconeおよびAndrews;Patientら） （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:12..55 （Ｄ）他の情報:/注記＝「β−グロビン相同性；末
端が制限切断部位である部分配列」 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:12..55 （Ｄ）他の情報:/注記＝「5'−3'方向付けは、複シ
ストロンベクターのポリオ−UTRとシストロン２との間
への挿入に関する」 （ｘ）公開情報： （Ａ）著者:Falcone,D. Andrews,D.W. （Ｃ）刊行物:Mol.Cell.Biol. （Ｄ）巻:11 （Ｅ）号:5 （Ｆ）頁:2656−2664 （Ｇ）日付:1991 （ｘ）公開情報： （Ａ）著者:Patient,R.K. Harris,R. Walmsley,M.E. Williams,J.G. （Ｃ）刊行物:J.Biol.Chem. （Ｄ）巻:258 （Ｆ）頁:8521−8523 （Ｇ）日付:1983 （xi）配列：配列番号:6: （２）配列番号:7の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:17塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..17 （Ｄ）他の情報:/標識＝M1317MER ／注記＝「合成DNA;PCRに利用されるM13
配列決定用プライマー（New England Biolabs GmbH）」 （xi）配列：配列番号:7: （２）配列番号:8の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:24塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..24 （Ｄ）他の情報:/標識＝M1324MER ／注記＝「合成DNA;PCRに利用されるM13
逆配列決定用プライマー（New England Biolabs Gmb
H）」 （xi）配列：配列番号:8: （２）配列番号:9の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:19塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..19 （Ｄ）他の情報:/標識＝NCCLSA1 /注記＝「合成DNA;pMVW−２由来の
短縮したPDGF−Ｂ前駆体を、バクテリオファージM13mp1
9中で再クローニングするための合成リンカー」 （xi）配列：配列番号:9: （２）配列番号:10の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:19塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..19 （Ｄ）他の情報:/標識＝NCCLSA2 ／注記＝「合成DNA;pMVW−２由来の短縮
したPDGF−Ｂ前駆体を、バクテリオファージM13mp19中
で再クローニングするための合成リンカー」 （xi）配列：配列番号:10: （２）配列番号:11の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:37塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..37 （Ｄ）他の情報:/標識＝PDGBBCL ／注記＝「合成DNA;Bcl I−切断部位
を、PDGF−Ｂ前駆体の5'−領域に挿入するための突然変
異誘発プライマー」 （xi）配列：配列番号:11: （２）配列番号:12の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:110塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..110 （Ｄ）他の情報:/標識＝PPDGFB1 ／注記＝「合成DNA;成熟PDGF−Ｂ前駆体
配列の再構成のための合成リンカー」 （xi）配列：配列番号:12: （２）配列番号:13の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:110塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..110 （Ｄ）他の情報:/標識＝PPDGFB2 ／注記＝「合成DNA;成熟PDGF−Ｂ前駆体
配列の再構成のための合成リンカー」 （xi）配列：配列番号:13: （２）配列番号:14の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..30 （Ｄ）他の情報:/標識＝5'−POLIO1 ／注記＝「合成DNA;合成PCRプライマ
ー」 （xi）配列：配列番号:14: （２）配列番号:15の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..28 （Ｄ）他の情報:/標識＝3'−POLIO2 ／注記＝「合成DNA;合成PCRプライマ
ー」 （xi）配列：配列番号:15: （２）配列番号:16の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:13塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..13 （Ｄ）他の情報:/標識＝Ｅ−Ｎ−E1 ／注記＝「合成DNA;合成リンカー」 （xi）配列：配列番号:16: （２）配列番号:17の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:13塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..13 （Ｄ）他の情報:/標識＝Ｅ−Ｎ−E2 ／注記＝「合成DNA;合成リンカー」 （xi）配列：配列番号:17: （２）配列番号:18の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:19塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..16 （Ｄ）他の情報:/標識＝PDGFB190−PRIM I ／注記＝「合成DNA;合成PCRプライマ
ー」 （xi）配列：配列番号:18: （２）配列番号:19の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:37塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..37 （Ｄ）他の情報:/標識＝PDGFB190−PRIM II /注記＝「合成DNA;合成PCRプライ
マー」 （xi）配列：配列番号:19: （２）配列番号:20の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:1956塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:pSQ2−SEAP（Bergerら、1988） （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:43..1560 （Ｄ）他の情報:/注記＝「ヒトSEAP遺伝子；末端に
5'−EcoR Iおよび3'−Hind III制限切断部位を有する」 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:mat_peptide （Ｂ）存在位置:94..1560 （Ｄ）他の情報:/産物＝「成熟タンパク質」 （ｘ）公開情報： （Ａ）著者:Berger,J. Hauber,J. Hauber,R. Geiger,R. Cullen,B.R. （Ｃ）刊行物:Gene （Ｄ）巻:66 （Ｆ）頁:1−10 （Ｇ）日付:1988 （ｘ）公開情報： （Ａ）著者:Millan,J.L. （Ｃ）刊行物:J.Biol.Chem. （Ｄ）巻:261 （Ｆ）頁:3112−3115 （Ｇ）日付:1986 （xi）配列：配列番号:20: （２）配列番号:21の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:506アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:21: （２）配列番号:22の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:1811塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：ホタル（Photinus pyralis） （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:pRSVLUC（de Wetら、1987） （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:94..1743 （Ｄ）他の情報:/注記＝「ルシフェラーゼ遺伝子の
コーディング領域；末端が、5'−Sma Iおよび3'−Hind
III制限切断部位である」 （ｘ）公開情報： （Ａ）著者:de Wet,J.R. Wood,K.V. DeLuca,M. Helinski,D.R. Subramani,S. （Ｃ）刊行物:Mol.Cell.Biol. （Ｄ）巻:7 （Ｆ）頁:725−737 （Ｇ）日付:1987 （xi）配列：配列番号:22: （２）配列番号:23の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:550アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:23: （２）配列番号:24の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:625塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:pSBC−1/−２−PDGF−Ｂ （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:40..609 （Ｄ）他の情報:/産物＝「PDGF−Ｂ前駆体配列」 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:mat_peptide （Ｂ）存在位置:283..609 （Ｄ）他の情報:/産物＝「成熟PDGF−Ｂ鎖」 （xi）配列：配列番号:24: （２）配列番号:25の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:190アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:25:
フロントページの続き (72)発明者 ディルクス，ヴィルヘルム ドイツ連邦共和国 デー―38106 ブラ ウンシュバイク，ビェルテンヴェク 13 (72)発明者 ヴィルト，マンフレート ドイツ連邦共和国 デー―38300 ヴォ ルフェンビュッテル，マルクトシュトラ ーセ １ (72)発明者 ホイザー，ハンスエルク ドイツ連邦共和国 デー―38104 ブラ ウンシュバイク，ゲオルク―ヴェスター マンアレー 29 (72)発明者 アイヒナー，ヴォルフラム ドイツ連邦共和国 デー―22301 ハン ブルク，ドロテーンシュトラーセ 49 (72)発明者 アハターベルク，フォルカー ドイツ連邦共和国 デー―20257 ハン ブルク，アイムスビュッテラー マルク トプラッツ 11 (72)発明者 デルシュナー，アルブレヒト ドイツ連邦共和国 デー―20357 ハン ブルク，シャンツェンシュトラーセ 107 (72)発明者 マイヤー−インゴルト，ヴォルフガング ドイツ連邦共和国 デー―22457 ハン ブルク，アム ハーゼンカンプ 29 (72)発明者 ミエルケ，ハイコ ドイツ連邦共和国 デー―21629 ノイ ブルムストルフ，フィッシュベカー シュトラーセ 22 (56)参考文献 特開 昭63−119682（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ. 263，Ｎｏ．31（1988）ｐ．16202− 16208 日本生化学会編「新生化学実験講座第 ７巻、増殖分化因子とその受容体」 （1991） 東京化学同人ｐ．12−18 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ. 263，Ｎｏ．31（1988）ｐ．16493− 16498 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏ ｌ．185，Ｎｏ．１（1989）ｐ．135− 140 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．186，Ｎ ｏ．２（1992．Ｆｅｂ．）ｐ．669−675 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．20，Ｎｏ．６（1992．Ｍ ａｒ．）ｐ．1293−1299 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (33)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の一般式で特徴づけられる、宿主細胞
    としての哺乳動物細胞におけるポリペプチドまたはそれ
    らのサブユニットの等モル発現のための多シストロン発
    現ユニット： ｐ−5'UTR−C1−（IRES−Ｙ−C2）ｎ−3'UTR−ポリＡ であって、 ここで、 「ｐ」は、転写プロモーターであり、 「5'UTR」は、非翻訳ヌクレオチド配列であり、 ｎは１、２、または３であり、 「C1」および「C2」は、それぞれポリペプチドまたはそ
    のサブユニットをコードする遺伝子を含むシストロンで
    あり、ここで、ｎが２または３の場合、連続基の配列
    （IRES−Ｙ−C2）は互いに同じであるかまたは異なり
    得、そしてさらにC1およびC2は同じであるかまたは異な
    り得、 「IRES」は、ウイルス、細胞、または合成起源のヌクレ
    オチド配列であり、該ヌクレオチド配列は翻訳段階で内
    部開始の原因となる配列であり、 「Ｙ」は、アフリカツメガエルレービス由来のβ−グロ
    ビン配列またはそのフラグメントであり、 ここで、アフリカツメガエルレービス由来の該β−グロ
    ビン配列は、以下： （ａ）配列番号:6に記載のヌクレオチド配列；および （ｂ）（ａ）に規定される該ヌクレオチド配列における
    １または数個のヌクレオチドの置換、欠失または付加に
    よって、（ａ）の該配列から誘導される、ヌクレオチド
    配列、 からなる群より選択され、 ここで、「Ｙ」は、IRESと共同して、C1およびC2の遺伝
    子産物が等モル量で発現されるような様式でC2に含まれ
    る遺伝子の発現を確実にし、 「3'UTR」は、非翻訳ヌクレオチド配列であり、そして 「ポリＡ」は、ポリアデニル化シグナルである、 発現ユニット。
  2. 【請求項２】前記IRESが、ポリオウイルス１型の5'UT
    R、脳心筋炎ウイルス（EMV）の5'UTR、「サイラーのネ
    ズミ脳脊髄炎ウイルス」（TMEV）の5'UTR、「ウシ腸内
    ウイルス」（BEV）の5'UTR、「コクサッキーＢ型ウイル
    ス」（CBV）の5'UTR、「ヒトライノウイルス」（HRV）
    の5'UTR、「ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質」
    （BIP）5'UTR、ショウジョウバエアンテナペディア5'UT
    R、ショウジョウバエウルトラビトラックス5'UTR、また
    は上記配列の遺伝的ハイブリッドまたは上記配列由来の
    フラグメントであることにより特徴づけられる、請求項
    １に記載の発現ユニット。
  3. 【請求項３】前記IRESが、配列番号:5に記載のヌクレオ
    チド配列であることにより特徴づけられる、請求項１ま
    たは２に記載の発現ユニット。
  4. 【請求項４】前記IRESが、配列番号:5に記載のポリオウ
    イルス１型UTRであり、そして「Ｙ」が配列番号:6に記
    載のアフリカツメガエルレービス由来のβグロビン配列
    であることにより特徴づけられる、請求項１から３のい
    ずれか１つに記載の発現ユニット。
  5. 【請求項５】C1およびC2が、それぞれ、単一のタンパク
    質またはヘテロマーのタンパク質のポリペプチドサブユ
    ニットをコードする遺伝子を含むことにより特徴づけら
    れる、請求項１から４のいずれか１つに記載の発現ユニ
    ット。
  6. 【請求項６】C1およびC2が、それぞれ、第VIII因子、ク
    レアチンキナーゼ、ヘモグロビン、免疫グロブリン、組
    織適合性抗原、Ｔ−細胞レセプター、散乱因子（HGF−S
    F）、トランスフォーミング増殖因子β型ファミリーの
    メンバー、骨形態形成タンパク質（BMP）のメンバー、
    インテグリンファミリーのメンバー、またはPDGF、の異
    なるサブユニットをコードする遺伝子を含むことにより
    特徴づけられる、請求項１から５のいずれか１つに記載
    の発現ユニット。
  7. 【請求項７】「ｎ」が１であり、そしてC1およびC2が、
    PDGFのＡ鎖またはＢ鎖、またはそのアナログまたはフラ
    グメントをコードする遺伝子を代替的に含むことにより
    特徴づけられる、請求項４に記載の発現ユニットであっ
    て、両遺伝子が該発現ユニットで同時発現され、 ここで、該アナログは、以下： （ａ）PDGFのＡ鎖またはＢ鎖のアミノ酸配列における１
    または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加によっ
    て、該PDGFのＡ鎖またはＢ鎖から誘導される、ポリペプ
    チド；および （ｂ）PDGFのＡ鎖またはＢ鎖のヌクレオチド配列からな
    るDNAまたはその相補体にストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズする核酸によってコードされる、ポリペ
    プチド、 からなる群より選択され、 ここで、該C1およびC2の産物が、マイトジェン活性を有
    するヘテロダイマーを形成し得る、 発現ユニット。
  8. 【請求項８】C1またはC2が、PDGF−AK（配列番号:1）ま
    たはPDGF−AL前駆体配列を含むことにより特徴づけられ
    る、請求項７に記載の発現ユニット。
  9. 【請求項９】C1またはC2が、完全PDGF−Ｂ前駆体配列
    （配列番号:3）、サル肉腫ウイルス由来のｖ−sis遺伝
    子、またはこれらの配列の変異体を含むことにより特徴
    づけられる、請求項７または８に記載の発現ユニットで
    あって、 ここで、該変異体は、以下： （ａ）完全PDGF−Ｂ前駆体配列（配列番号:3）およびサ
    ル肉腫ウイルス由来のｖ−sis遺伝子のうちの一方にお
    ける１または数個のヌクレオチドの置換、欠失または付
    加によって、該完全PDGF−Ｂ前駆体配列（配列番号:3）
    およびサル肉腫ウイルス由来のｖ−sis遺伝子のうちの
    一方の配列から誘導される、ヌクレオチド配列；および （ｂ）完全PDGF−Ｂ前駆体配列（配列番号:3）およびサ
    ル肉腫ウイルス由来のｖ−sis遺伝子のうちの一方のヌ
    クレオチド配列からなるDNAまたはその相補体にストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の、ヌク
    レオチド配列、 からなる群より選択され、 ここで、該C1およびC2の産物が、マイトジェン活性を有
    するヘテロダイマーを形成し得る、 発現ユニット。
  10. 【請求項１０】C1またはC2が、191位のアミノ酸でアル
    ギニンをコードするコドンを翻訳終止コドンに置換する
    ことにより末端切断されているPDGF−Ｂ前駆分子（配列
    番号:24）をコードする遺伝子フラグメントを含むこと
    により特徴づけられる、請求項７から９のいずれか１つ
    に記載の発現ユニット。
  11. 【請求項１１】C1およびC2が、PDGF−AK（配列番号:1）
    または末端切断されたPDGF−B190前駆体配列（配列番
    号:24）を代替的に含むことにより特徴づけられる、請
    求項７に記載の発現ユニットであって、両遺伝子が該発
    現ユニットで同時発現される、発現ユニット。
  12. 【請求項１２】「ｎ」は１であり、そしてC1およびC
    2が、互いに異なるリポーター遺伝子を含むことにより
    特徴づけられる、請求項１から４のいずれか１つに記載
    の発現ユニット。
  13. 【請求項１３】前記リポーター遺伝子がルシフェラーゼ
    および分泌アルカリホスファターゼをコードすることに
    より特徴づけられる、請求項12に記載の発現ユニット。
  14. 【請求項１４】作動可能な様式で挿入された請求項１か
    ら13のいずれか１つに記載の発現ユニットを含む組換え
    DNAベクター。
  15. 【請求項１５】請求項14に記載のベクターで形質転換さ
    れた哺乳動物細胞である、宿主細胞。
  16. 【請求項１６】CHOまたはBHK細胞であることにより特徴
    づけられる、請求項15に記載の宿主細胞。
  17. 【請求項１７】作動可能な様式で挿入された請求項７か
    ら11のいずれか１つに記載の発現ユニットを含むベクタ
    ーで形質転換される哺乳動物細胞であることにより特徴
    づけられる、宿主細胞。
  18. 【請求項１８】CHOまたはBHK細胞であることにより特徴
    づけられる、請求項17に記載の宿主細胞。
  19. 【請求項１９】前記細胞がDSM ACC 2048に相当するクロ
    ーン92−22−６またはDSM ACC 2049に相当する92−22−
    ７の１つに由来するPDGF−AB産生BHK細胞であることに
    より特徴づけられる、請求項18に記載の宿主細胞。
  20. 【請求項２０】請求項15から19のいずれか１つに記載の
    宿主細胞が適切な培地で培養され、そして生じたタンパ
    ク質が該細胞および該培地から分離されることにより特
    徴づけられる、等モル割合のポリペプチドサブユニット
    からなるタンパク質を調製する方法。
  21. 【請求項２１】ヘテロマータンパク質を調製するため
    の、請求項20に記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記タンパク質が、第VIII因子、クレア
    チンキナーゼ、ヘモグロビン、免疫グロブリン、組織適
    合性抗原、Ｔ−細胞レセプター、散乱因子（HGF−S
    F）、トランスフォーミング増殖因子β型ファミリーの
    メンバー、骨形態形成タンパク質（BMP）のメンバー、
    インテグリンファミリーのメンバー、またはPDGFである
    ことにより特徴づけられる、請求項20または21に記載の
    方法。
  23. 【請求項２３】請求項17から19のいずれか１つに記載の
    宿主細胞が適切な培地で培養され、そして生じたrPDGF
    −ABが該細胞および該培地から分離されることにより特
    徴づけられる、ヘテロマーrPDGF−ABを調製する方法。
  24. 【請求項２４】作動可能な様式で挿入された請求項12ま
    たは13に記載の発現ユニットを含むベクターで形質転換
    される哺乳動物であることにより特徴づけられる、宿主
    細胞。
  25. 【請求項２５】DSM ACC 2046に相当するクローン91−46
    −９に由来することにより特徴づけられる、請求項24に
    記載の宿主細胞。
  26. 【請求項２６】一般式ｐ−5'UTR−C1−（IRES−Ｙ−
    C2）ｎ−3'UTR−ポリＡによって特徴付けられる発現ユ
    ニットにおいて、IRESと共同して、C1およびC2の遺伝子
    産物のほぼ等モルの発現をもたらす翻訳に影響を及ぼす
    「Ｙ」配列を検出する方法であって、 ここで、 「ｐ」は、転写プロモーターであり、 「5'UTR」は、非翻訳ヌクレオチド配列であり、 ｎは１、２、または３であり、 「C1」および「C2」は、それぞれポリペプチドまたはそ
    のサブユニットをコードする遺伝子を含むシストロンで
    あり、ここで、ｎが２または３の場合、連続基の配列
    （IRES−Ｙ−C2）は互いに同じであるかまたは異なり
    得、そしてさらにC1およびC2は同じであるかまたは異な
    り得、 「IRES」は、ウイルス、細胞、または合成起源のヌクレ
    オチド配列であり、該ヌクレオチド配列は翻訳段階で内
    部開始の原因となる配列であり、 「3'UTR」は、非翻訳ヌクレオチド配列であり、そして 「ポリＡ」は、ポリアデニル化シグナルであり、 該方法は、以下： （ａ）試験される配列を、該一般式の「Ｙ」の位置に導
    入して、発現ユニットを構築する工程； （ｂ）作動可能な様式で挿入された該発現ユニットを含
    むベクターを構築する工程； （ｃ）宿主細胞として哺乳動物細胞を工程（ｂ）からの
    ベクターで形質転換し、適切な培地で培養する工程；お
    よび （ｄ）C1およびC2の発現産物を、培地中で定量するか、
    または次いで該細胞および／または該培地から分離する
    工程、 によって特徴付けられる、方法。
  27. 【請求項２７】CHOまたはBHK細胞が工程（ｃ）において
    宿主細胞として用いられることにより特徴づけられる、
    請求項26に記載の方法。
  28. 【請求項２８】請求項24に記載の宿主細胞が工程（ｃ）
    において用いられることにより特徴づけられる、請求項
    26に記載の方法。
  29. 【請求項２９】前記IRESが配列番号:5に記載の配列であ
    ることにより特徴づけられる、請求項26から28のいずれ
    か１項に記載の方法。
  30. 【請求項３０】一般式ｐ−5'UTR−C1−（IRES−Ｙ−
    C2）ｎ−3'UTR−ポリＡによって特徴付けられる発現ユ
    ニットにおいて、「Ｙ」と共同して、C1およびC2の遺伝
    子産物のほぼ等モルの発現をもたらす翻訳を開始させる
    IRES配列を検出する方法であって、 ここで、 「ｐ」は、転写プロモーターであり、 「5'UTR」は、非翻訳ヌクレオチド配列であり、 ｎは１、２、または３であり、 「C1」および「C2」は、それぞれポリペプチドまたはそ
    のサブユニットをコードする遺伝子を含むシストロンで
    あり、ここで、ｎが２または３の場合、連続基の配列
    （IRES−Ｙ−C2）は互いに同じであるかまたは異なり
    得、そしてさらにC1およびC2は同じであるかまたは異な
    り得、 「Ｙ」は、アフリカツメガエルレービス由来のβ−グロ
    ビン配列またはそのフラグメントであり、 ここで、アフリカツメガエルレービス由来の該β−グロ
    ビン配列は、以下： （ａ）配列番号:6に記載のヌクレオチド配列；および （ｂ）（ａ）に規定される該ヌクレオチド配列における
    １または数個のヌクレオチドの置換、欠失または付加に
    よって、（ａ）の該配列から誘導される、ヌクレオチド
    配列、 からなる群より選択され、 「3'UTR」は、非翻訳ヌクレオチド配列であり、そして 「ポリＡ」は、ポリアデニル化シグナルであり、 該方法は、以下： （ａ）試験される配列を、該一般式の「IRES」の位置に
    導入して、発現ユニットを構築する工程； （ｂ）作動可能な様式で挿入された該発現ユニットを含
    むベクターを構築する工程； （ｃ）宿主細胞として哺乳動物細胞を工程（ｂ）からの
    ベクターで形質転換し、適切な培地で培養する工程；お
    よび （ｄ）C1およびC2の発現産物を、培地中で定量するか、
    または次いで該細胞および／または該培地から分離する
    工程、 によって特徴付けられる、方法。
  31. 【請求項３１】CHOまたはBHK細胞が工程（ｃ）において
    宿主細胞として用いられることにより特徴づけられる、
    請求項30に記載の方法。
  32. 【請求項３２】請求項24に記載の宿主細胞が工程（ｃ）
    において用いられることにより特徴づけられる、請求項
    30に記載の方法。
  33. 【請求項３３】「Ｙ」が配列番号:6に記載の配列である
    ことにより特徴づけられる、請求項30から32のいずれか
    １つに記載の方法。
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EP (1) EP0658198B1 (ja)
JP (1) JP3515110B2 (ja)
AU (1) AU4953793A (ja)
DE (2) DE4228458A1 (ja)
DK (1) DK0658198T3 (ja)
ES (1) ES2127831T3 (ja)
WO (1) WO1994005785A1 (ja)

Families Citing this family (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5939391A (en) * 1993-03-31 1999-08-17 Pro-Neuron, Inc. Hemoglobin alpha chain peptide fragments useful for inhibiting stem cell proliferation
US6610654B2 (en) 1993-03-31 2003-08-26 Wellstat Therapeutics Corporation Inhibitor of stem cell proliferation and uses thereof
AT403167B (de) * 1994-11-14 1997-11-25 Immuno Ag Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems
DE19514310A1 (de) * 1995-04-18 1996-10-24 Univ Ludwigs Albert Vektoren zur Transfektion von eukaryotischen Zellen, deren Verwendung und damit transfizierte Zielzellen
DE19542051C2 (de) 1995-11-10 2000-03-23 Asta Medica Ag Gentechnisch veränderte tumorigene Zellinien und Verwendung derselben für die Testung von Antitumor-Wirkstoffen
DE69626960T2 (de) 1995-11-16 2003-11-06 Matsushita Electric Ind Co Ltd Verfahren und vorrichtung zur urinanalyse, verfahren zur messung optischer rotation und polarimeter
US5861483A (en) 1996-04-03 1999-01-19 Pro-Neuron, Inc. Inhibitor of stem cell proliferation and uses thereof
FR2749857B1 (fr) * 1996-06-12 1998-08-14 Centre Nat Rech Scient Generation de molecules replicatives in vivo
JP2001503257A (ja) * 1996-10-18 2001-03-13 バレンティス・インコーポレーテッド Ｉｌ―１２遺伝子発現および送達系および使用
FR2762615B1 (fr) * 1997-04-28 1999-07-16 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau site interne d'entree des ribosomes et vecteur le contenant
US20030138808A1 (en) * 1998-02-19 2003-07-24 Simard John J.L. Expression vectors encoding epitopes of target-associated antigens
CA2358385C (en) 1998-12-31 2013-08-06 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
US7935805B1 (en) * 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
WO2000039302A2 (en) * 1998-12-31 2000-07-06 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
CA2358915C (en) 1998-12-31 2010-06-01 Chiron Corporation Modified hiv env polypeptides
US6610508B1 (en) * 1999-03-08 2003-08-26 Anadys Pharmaceuticals, Inc. Translation driver system and methods for use thereof
AU2001231171B2 (en) * 2000-01-28 2007-01-04 The Scripps Research Institute Synthetic internal ribosome entry sites and methods of identifying same
US20030215425A1 (en) * 2001-12-07 2003-11-20 Simard John J. L. Epitope synchronization in antigen presenting cells
US6861234B1 (en) 2000-04-28 2005-03-01 Mannkind Corporation Method of epitope discovery
JP2001299361A (ja) * 2000-04-28 2001-10-30 Oriental Yeast Co Ltd 溶液安定性の組換えヒトクレアチンキナーゼヘテロダイマー
DE60142615D1 (de) * 2000-04-28 2010-09-02 Mannkind Corp Epitop-synchronisierung in antigen präsentierenden zellen
NZ523220A (en) * 2000-06-19 2005-03-24 Gtc Biotherapeutics Inc Transgenically produced platelet derived growth factor
JP4510242B2 (ja) * 2000-07-11 2010-07-21 キヤノン株式会社 薄膜形成方法
WO2002096948A2 (en) * 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
CA2436092A1 (en) * 2001-01-29 2002-08-08 Idec Pharmaceutical Corporation Modified antibodies and methods of use
WO2003004657A1 (en) * 2001-07-05 2003-01-16 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b and/or type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP2412242A3 (en) 2001-07-05 2012-06-13 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
CA2458995C (en) * 2001-08-31 2013-04-30 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b polypeptides, polypeptides and uses thereof
US20030170614A1 (en) * 2001-08-31 2003-09-11 Megede Jan Zur Polynucleotides encoding antigenic HIV type B polypeptides, polypeptides and uses thereof
ITMI20012110A1 (it) * 2001-10-12 2003-04-12 Keryos Spa Vettori multi-cistronici utilizzabili in protocolli di trsferimento genico
US20030108524A1 (en) * 2001-10-18 2003-06-12 Melissa Diagana Vectors for expressing multiple transgenes
CN1313617C (zh) * 2001-11-07 2007-05-02 曼康公司 编码靶相关抗原表位的表达载体及其设计方法
EP2022799A2 (en) * 2001-11-16 2009-02-11 Biogen Idec Inc. Polycistronic expression of antibodies
US20030157641A1 (en) * 2001-11-16 2003-08-21 Idec Pharmaceuticals Corporation Polycistronic expression of antibodies
WO2003059932A2 (en) * 2001-12-27 2003-07-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Methods of inducing or enhancing connective tissue repair
US9738907B2 (en) 2002-02-01 2017-08-22 Oxford Biomedica (Uk) Limited Viral vector
EP1504108B1 (en) * 2002-02-01 2013-04-17 Oxford Biomedica (UK) Limited Lentiviral vector
ES2362273T3 (es) * 2002-06-14 2011-06-30 Chromagenics B.V. Método para la producción simultánea de múltiples proteínas; vectores y células para su uso en el mismo.
US7344886B2 (en) 2002-11-29 2008-03-18 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg Neomycin-phosphotransferase-genes and methods for the selection of recombinant cells producing high levels of a desired gene product
US7384744B2 (en) 2002-11-29 2008-06-10 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products
US20050032728A1 (en) * 2002-12-17 2005-02-10 Sidney Kimmel Cancer Center Tumor suppression through bicistronic co-expression of p53 and p14ARF
DE60312039T2 (de) * 2002-12-20 2007-11-08 Chromagenics B.V. Mittel und methoden zur produktion eines proteins durch chromatin-öffner, die chromatin zugänglicher für transkriptionsfaktoren machen können
GB0326798D0 (en) * 2003-11-17 2003-12-24 Crusade Lab Ltd Methods for generating mutant virus
US20080077999A1 (en) * 2004-03-23 2008-03-27 Eisai R&D Management Co., Ltd. Using Nonhuman Animal Model, Method of Measuring Transcription Activity Method of Measuring Cell Quantity and Method of Measuring Tumor Volume
TW200613554A (en) * 2004-06-17 2006-05-01 Wyeth Corp Plasmid having three complete transcriptional units and immunogenic compositions for inducing an immune response to HIV
ES2384391T3 (es) * 2004-11-08 2012-07-04 Chromagenics B.V. Selección de células hospedantes que expresan proteína a altos niveles
US20060195935A1 (en) 2004-11-08 2006-08-31 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
US20100136616A1 (en) * 2004-11-08 2010-06-03 Chromagenics B.V. Selection of Host Cells Expressing Protein at High Levels
CA2610619A1 (en) * 2005-05-31 2006-12-07 University Of Rochester Method of determining immune enhancement of virus infectivity using fc receptor-transfected cell lines
EP1910550A4 (en) 2005-07-21 2009-11-04 Abbott Lab MULTIGENIC EXPRESSION COMPRISING SORF CONSTRUCTS AND METHODS USING POLYPROTEINS, PRO-PROTEINS, AND PROTEOLYSIS
US20080124760A1 (en) 2006-07-26 2008-05-29 Barbara Enenkel Regulatory Nucleic Acid Elements
CN101743306A (zh) 2007-03-23 2010-06-16 威斯康星校友研究基金会 体细胞重编程
EP2205249B1 (en) 2007-09-28 2018-11-07 Intrexon Corporation Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof
ES2587395T3 (es) 2008-06-04 2016-10-24 Cellular Dynamics International, Inc. Procedimientos para la producción de células IPS usando un enfoque no vírico
WO2010019569A1 (en) 2008-08-12 2010-02-18 Cellular Dynamics International. Inc. Methods for the production of ips cells
KR101361416B1 (ko) 2008-10-08 2014-02-21 인트렉손 코포레이션 다수의 면역조절자를 발현하는 조작된 세포 및 그 용도
CN102812040A (zh) * 2009-10-30 2012-12-05 雅培制药有限公司 Sorf构建体和多基因表达
EP2640743B1 (en) 2010-11-16 2016-10-05 Excelimmune, Inc. Methods for producing recombinant proteins
US20140350087A9 (en) 2012-03-22 2014-11-27 Halozyme, Inc. Oncovector Nucleic Acid Molecules and Methods of Use
WO2013161958A1 (ja) 2012-04-27 2013-10-31 日本ケミカルリサーチ株式会社 新規な発現ベクター
MA44314A (fr) 2015-11-05 2018-09-12 Juno Therapeutics Inc Récepteurs chimériques contenant des domaines induisant traf, et compositions et méthodes associées
MX2018006789A (es) 2015-12-03 2019-02-13 Juno Therapeutics Inc Receptores quimericos modificados y composiciones y metodos relacionados.
CA3031955A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Juno Therapeutics, Inc. Immunomodulatory polypeptides and related compositions and methods
MX2019003768A (es) 2016-10-03 2019-06-24 Juno Therapeutics Inc Moleculas de enlace especificas de hpv.
CA3045323A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 Juno Therapeutics, Inc. Engineered b cells and related compositions and methods
BR112019011207A2 (pt) 2016-12-05 2019-10-08 Juno Therapeutics Inc produção de células modificadas para terapia celular adotiva
JP2020505034A (ja) 2017-01-20 2020-02-20 ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー 細胞表面コンジュゲートならびに関連する細胞組成物および方法
DE102017103383A1 (de) 2017-02-20 2018-08-23 aReNA-Bio GbR (vertretungsberechtigter Gesellschafter: Dr. Heribert Bohlen, 50733 Köln) System und Verfahren zur Zelltyp-spezifischen Translation von RNA-Molekülen in Eukaryoten
AU2018250336A1 (en) 2017-04-07 2019-09-26 Juno Therapeutics, Inc. Engineered cells expressing prostate-specific membrane antigen (PSMA) or a modified form thereof and related methods
CN111201438A (zh) 2017-06-02 2020-05-26 朱诺治疗学股份有限公司 与和细胞疗法相关的毒性有关的制品和方法
WO2019027850A1 (en) 2017-07-29 2019-02-07 Juno Therapeutics, Inc. CELL EXPANSION REAGENTS EXPRESSING RECOMBINANT RECEPTORS
JP2020530997A (ja) * 2017-08-08 2020-11-05 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド キメラ抗原受容体媒介性細胞標的化
BR112020001601A2 (pt) 2017-08-09 2020-08-11 Juno Therapeutics Inc métodos e composições para preparar células geneticamente manipuladas
WO2019051335A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 Juno Therapeutics, Inc. METHODS OF IDENTIFYING CELLULAR CHARACTERISTICS RELATED TO RESPONSES ASSOCIATED WITH CELL THERAPY
EP4215543A3 (en) 2017-10-03 2023-10-11 Juno Therapeutics, Inc. Hpv-specific binding molecules
US11623961B2 (en) 2017-11-01 2023-04-11 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for B-cell maturation antigen
CN111902159A (zh) 2017-11-01 2020-11-06 朱诺治疗学股份有限公司 对b细胞成熟抗原（bcma）具有特异性的嵌合抗原受体
CN109837293A (zh) * 2017-11-24 2019-06-04 康码（上海）生物科技有限公司 一种能够增强蛋白质合成效率的串联dna元件
US20210128616A1 (en) 2017-12-08 2021-05-06 Juno Therapeutics, Inc. Phenotypic markers for cell therapy and related methods
SG11202005272SA (en) 2017-12-08 2020-07-29 Juno Therapeutics Inc Process for producing a composition of engineered t cells
WO2019113556A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 Juno Therapeutics, Inc. Serum-free media formulation for culturing cells and methods of use thereof
WO2019118937A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 Juno Therapeutics, Inc. Anti-cct5 binding molecules and methods of use thereof
WO2019152743A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Celgene Corporation Combination therapy using adoptive cell therapy and checkpoint inhibitor
EP3773908A1 (en) 2018-04-05 2021-02-17 Juno Therapeutics, Inc. T cell receptors and engineered cells expressing same
BR112020020245A2 (pt) 2018-04-05 2021-04-06 Editas Medicine, Inc. Métodos de produzir células expressando um receptor recombinante e composições relacionadas
RU2020136054A (ru) 2018-04-05 2022-05-06 Джуно Терапьютикс, Инк. Т-клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, соответствующие полинуклеотиды и способы
EP3787751A1 (en) 2018-05-03 2021-03-10 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapy of a chimeric antigen receptor (car) t cell therapy and a kinase inhibitor
AU2019316647A1 (en) 2018-08-09 2021-02-25 Juno Therapeutics, Inc. Methods for assessing integrated nucleic acids
JP2021533746A (ja) 2018-08-09 2021-12-09 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 操作された細胞およびその組成物を生成するための方法
CA3111789A1 (en) 2018-09-11 2020-03-19 Juno Therapeutics, Inc. Methods for mass spectrometry analysis of engineered cell compositions
JP2022512872A (ja) 2018-10-31 2022-02-07 ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー 細胞の選択および刺激のための方法ならびにそのための装置
EP3873943A2 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Juno Therapeutics, Inc. Methods for treatment using chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
AU2019374103A1 (en) 2018-11-01 2021-05-20 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for G Protein-Coupled Receptor Class C Group 5 Member D (GPRC5D)
CA3117720A1 (en) 2018-11-06 2020-05-14 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing genetically engineered t cells
US20220096651A1 (en) 2019-01-29 2022-03-31 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1 (ror1)
AU2020265741A1 (en) 2019-05-01 2021-11-25 Editas Medicine, Inc. Cells expressing a recombinant receptor from a modified TGFBR2 Locus, related polynucleotides and methods
KR20220016474A (ko) 2019-05-01 2022-02-09 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 변형된 ｃｄ247 유전자 자리로부터 키메라 수용체를 발현하는 세포, 관련 폴리뉴클레오타이드 및 방법
CN112439056B (zh) * 2019-08-28 2022-05-31 中国农业科学院生物技术研究所 基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及由其制备的o型口蹄疫疫苗和应用
US20220333132A1 (en) 2019-09-03 2022-10-20 Sana Blotechnology, Inc. Cd24-associated particles and related methods and uses thereof
AU2020377043A1 (en) 2019-10-30 2022-06-02 Juno Therapeutics Gmbh Cell selection and/or stimulation devices and methods of use
JP2022554353A (ja) 2019-11-07 2022-12-28 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｔ細胞療法と（ｓ）－３－［４－（４－モルホリン－４－イルメチル－ベンジルオキシ）－１－オキソ－１，３－ジヒドロ－イソインドール－２－イル］－ピペリジン－２，６－ジオンとの併用
WO2021151008A1 (en) 2020-01-24 2021-07-29 Juno Therapuetics, Inc. Methods for dosing and treatment of follicular lymphoma and marginal zone lymphoma in adoptive cell therapy
JP2023512209A (ja) 2020-01-28 2023-03-24 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｔ細胞形質導入のための方法
KR20220152220A (ko) 2020-02-12 2022-11-15 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Ｃｄ19-지시된 키메라 항원 수용체 ｔ 세포 조성물 및 이의 방법 및 용도
JP2023519099A (ja) 2020-02-12 2023-05-10 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｂｃｍａ指向性キメラ抗原受容体ｔ細胞組成物ならびにその方法および使用
WO2021231661A2 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing donor-batched cells expressing a recombinant receptor
US20230190871A1 (en) 2020-05-20 2023-06-22 Sana Biotechnology, Inc. Methods and compositions for treatment of viral infections
WO2021249116A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc. Coronavirus vaccine compositions, methods, and uses thereof
EP4171616A1 (en) 2020-06-26 2023-05-03 Juno Therapeutics GmbH Engineered t cells conditionally expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods
CA3188656A1 (en) 2020-07-17 2022-01-20 Simurx, Inc. Chimeric myd88 receptors for redirecting immunosuppressive signaling and related compositions and methods
CN116802203A (zh) 2020-11-04 2023-09-22 朱诺治疗学股份有限公司 从经修饰的恒定cd3免疫球蛋白超家族链基因座表达嵌合受体的细胞、相关多核苷酸和方法
CA3210581A1 (en) 2021-03-22 2022-09-29 Neil HAIG Methods of determining potency of a therapeutic cell composition
EP4313126A1 (en) 2021-03-29 2024-02-07 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a car t cell therapy and an immunomodulatory compound for treatment of lymphoma
CN117916256A (zh) 2021-05-06 2024-04-19 朱诺治疗学有限公司 用于刺激和转导t细胞的方法
WO2023019227A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions
WO2023017115A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Iba Lifesciences Gmbh Fractionation of cells based on a marker protein
WO2023019229A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified primary cells for allogeneic cell therapy
AU2022325955A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions
WO2023019226A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy
WO2023017494A1 (en) 2021-08-13 2023-02-16 Triovance Holding Llc A skin substitute composition and methods of producing and using the same
WO2023081900A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Juno Therapeutics, Inc. Engineered t cells expressing a recombinant t cell receptor (tcr) and related systems and methods
WO2023115049A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Umoja Biopharma, Inc. Cytotoxic innate lymphoid cell and uses thereof
WO2023147515A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Juno Therapeutics, Inc. Methods of manufacturing cellular compositions
WO2023158836A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered cd47 proteins and uses thereof
WO2023164440A1 (en) 2022-02-22 2023-08-31 Juno Therapeutics, Inc. Proteinase 3 (pr3) chimeric autoantibody receptor t cells and related methods and uses
WO2023173123A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells and compositions and uses thereof
WO2023205705A2 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Bluesphere Bio, Inc. Allogeneic t cells for treatment of hematological malignancies
WO2023213969A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Juno Therapeutics Gmbh Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use
WO2023240282A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Umoja Biopharma, Inc. Engineered stem cells and uses thereof
WO2024006960A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Juno Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
US20240041929A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for gprc5d and bcma
WO2024044779A2 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for delta-like ligand 3 (dll3)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3751632T2 (de) * 1986-08-13 1996-06-13 Zymogenetics Inc Expression von biologisch-aktiven PDGF-Analogen in eukaryotischen Zellen
EP0426744A1 (en) * 1988-07-29 1991-05-15 Zymogenetics, Inc. High efficiency translation of polycistronic messages in eucaryotic cells
DE3900770A1 (de) * 1989-01-12 1990-07-26 Juergen Prof Dr Hoppe Verfahren zur herstellung von pdgf-a und pdgf-aa
ES2173082T3 (es) * 1991-08-07 2002-10-16 W French Anderson Vectores retrovirales que contienen sitios de entrada del ribosoma internos.
DE4228457A1 (de) * 1992-08-27 1994-04-28 Beiersdorf Ag Herstellung von heterodimerem PDGF-AB mit Hilfe eines bicistronischen Vektorsystems in Säugerzellen

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．１８５，Ｎｏ．１（１９８９）ｐ．１３５−１４０
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６３，Ｎｏ．３１（１９８８）ｐ．１６２０２−１６２０８
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６３，Ｎｏ．３１（１９８８）ｐ．１６４９３−１６４９８
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６（１９９２．Ｍａｒ．）ｐ．１２９３−１２９９
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８６，Ｎｏ．２（１９９２．Ｆｅｂ．）ｐ．６６９−６７５
日本生化学会編「新生化学実験講座第７巻、増殖分化因子とその受容体」（１９９１） 東京化学同人ｐ．１２−１８

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