JP3515111B2 - 哺乳動物細胞における複シストロンベクター系を用いるヘテロダイマーｐｄｇｆ−ａｂの調製 - Google Patents

哺乳動物細胞における複シストロンベクター系を用いるヘテロダイマーｐｄｇｆ−ａｂの調製

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、宿主細胞として哺乳動物細胞で、本質的に
ホモダイマー夾雑産物PDGF−AAおよびPDGF−BBを含まな
い、PDGF−ABの組換え調製物（rPDGF−AB）に関する。
種々の原核細胞および真核細胞において、操作および
遺伝子転移によって、遺伝子がクローニングにより単離
された個々のタンパク質を調製することが、長年にわた
って可能であった。適切な折り畳みおよびプロセシン
グ、および、適切な場合では、原核および下等真核発現
系ではしばしば適切には行われない翻訳後の改変もま
た、多くのタンパク質の完全な生物学的活性を達成する
ために必要である。この理由のために、しばしば、哺乳
動物細胞が宿主として使用される。このことに加えて、
哺乳動物細胞は、多量のタンパク質を分泌することがで
きる。
種々の理由により、２つ以上のタンパク質鎖の同時調
製が、しばしば要求される。例えば、多くの天然タンパ
ク質は、その機能形態において、数個のサブユニットか
ら構成されている（例えば、抗体）。実際に、複合タン
パク質の個々のサブユニットの会合は、タンパク質合成
後に行われる。細胞組織のその他の成分は、触媒または
制御要素として、しばしばこの会合に関与し、場合に応
じて本来の構造の折り畳みが起こる。会合の妨害は、例
えば、個々の成分の一様でない合成により、形成される
べきタンパク質および宿主細胞の両方にとって、成果の
あがらない結果になり得る。実際に、この系は精巧な調
節を必要とし、ほとんどの部分に対して細胞特異性であ
る。この調節は、遺伝子操作された細胞では一般的に調
節されないので、下記に説明されている代替法が開発さ
れ、数種の外来タンパク質の同時調製に使用された： １）遺伝子を、発現ベクター中に別々に組み込み、次
に、適切な割合で細胞に共転移する。このことは、いく
つかのプラスミドコピーが、安定な様式で同時に取り込
まれ、分裂時に停留し続けることを前提にする。個々の
遺伝子の互いの遺伝子に対する発現割合は、コピー数お
よび宿主細胞ゲノム中への組み込み部位の両方に依存す
る。所望の割合で個々の遺伝子産物を発現する細胞クロ
ーンを単離することは、精巧なスクリーニング法により
可能である。
２）コピー数を一様にするために、個々の遺伝子を、１
つのベクターの独立した転写ユニットに配置する。これ
は、広範囲にわたり、遺伝子の化学量論的表現を確実に
するが、このプロセスはまた問題を有する。従って、同
じ強度のプロモーターを有する発現ユニットが使用され
ても、異なるタンパク質をコードするmRNAが、同じ安定
性および翻訳効率を有することは、決して保証されな
い。２つの遺伝子の転写効率が必ずしも同じである必要
はない。この場合において、発現の化学量論は、組換え
DNA戦略により、段階的に（step−wise）生成物される
（互いに関連する転写ユニットの配置、および、個々の
要素の除去または付加による、個々のプロモーターの強
度の調節）。
３）複シストロンまたは多シストロンベクターは、個々
の転写物のmRNAの安定性に関連した問題を避けるために
開発された。この目的のために、タンパク質鎖をコード
する遺伝子セグメント（シストロン）の個々の読み取り
枠は、１つの転写ユニット（発現ユニット）上に存在す
る。多シストロン遺伝子の発現は、１つのプロモーター
により影響される。このようなベクター中の最初のシス
トロンは、通常は非常に効率よく翻訳されるが、後続の
シストロンは、シストロン間配列に依存して翻訳され
る。単シストロン遺伝子の通常の5'非翻訳配列（5'UT
R）が、これらのシストロン間配列に使用される場合に
は、後続シストロンの発現は普通非常に低い（概して、
最初のシストロンの翻訳の約0.5から２％、Kaufmanら、
1987;Boelら、1987）。リーダー配列（高効率リーダ
ー、HEL）を挿入することにより、この効率を約20％増
すことが最初に可能となった。翻訳の内部開始を可能に
する特定の細胞配列およびウイルス配列（IRES;Jackson
ら,1990）の発見および使用により、最初のシストロン
と後続のシストロンとの翻訳比を3:1に達成することが
続けて可能となった。
翻訳は、複シストロンベクターまたは多シストロンベ
クターの使用において重要な役割を果たす。通常、翻訳
は、「キャップ」依存機構に従って真核生物で開始さ
れ、これにおいて、タンパク質およびRNAからなる前開
始複合体（pre−initiation complex）が「キャップ」
（メチル化ヌクレオチド）を有するmRNAの5'末端に構築
される。この点から、適切な翻訳開始コドンが捜し求め
られ、その位置から翻訳が開始される。このことは、前
開始複合体が3'方向へmRNAに沿って移動する「スキャニ
ング」プロセスにより起こると考えられる。数種の例外
を除き、5'末端に存在するシストロンは、この様式で、
いつも効率よく翻訳される（Kozak,1989）。後続の全て
のシストロンは、全く翻訳されないか、または非常に非
効率的にのみ翻訳される。後続シストロンの翻訳効率を
改良することは、遺伝子間の距離（シストロン間領域;K
ozak,1987;Wirthら、1991）の最適化、またはいわゆる
「高効率リーダー」配列（HEL、上記を参照のこと）に
より可能であった（例えば、FalconeおよびAndrews,199
1、およびそこに援用されている参考文献）。HELは、
「キャップ」依存翻訳の開始を刺激する、遺伝子または
その他の配列の5'非翻訳領域である。しかし、この種の
構築物においてさえ、第２および後続シストロンで達成
され得る発現値は、「キャップ」依存様式で調節される
第１シストロンの発現値より、いつも明らかに低い。
近年発見された内部翻訳開始の機構は、特異的核酸配
列を使用する。これらの配列は、個々のピコルナウイル
ス（例えば、ポリオウイルスおよび脳心筋炎ウイルス
（PelletierおよびSonenberg,1988;Jangら、1988;Jang
ら、1989））およびある種の細胞タンパク質（例えば、
BiP（MacejakおよびSarnow,1991））の非翻訳領域を含
む。ピコルナウイルスでは、いわゆるIRES（リボソーム
内部エントリー部位）である5'非翻訳領域の短いセグメ
ントが、前開始複合体の内部結合の原因となる。これに
加えて、この領域からのさらなるセグメントが、この翻
訳を効率よく開始するために必要である。従って、例え
ば、IRESの上流400塩基対のみではなく、ピコルナウイ
ルス非翻訳領域の5'末端部分もまた効率的な翻訳に必要
であることは明白である（SimoesおよびSarnow,199
1）。他方で、翻訳開始の通常の機構には不可欠である
「キャッピング」は、対応するmRNAの5'末端に依存する
ときには、ポリオウイルスIRESによる内部開始効率を減
退させる（HambridgeおよびSarnow,1991）。ネガティブ
効果は、IRESが第２シストロンの開始の原因となる場合
に避けられ、それは、シストロンが「キャップ」とIRES
との間に存在するときである。
従って、IRES要素は、読み取り枠の効率的な翻訳のイ
ニシエーターとして機能し得る。これを行うとき、それ
らは、第１シストロンの「キャップ」依存翻訳に対して
影響を及ぼさない。さらに逆に、IRES依存開始における
いかなる影響もまた、「キャップ」依存翻訳開始には依
存しないようである。２つのプロセスの機構もまた、異
なる細胞因子の使用において明らかに区別される（Meer
ovitchら、1989;JangおよびWimmer,1990）。過去には、
複シストロン発現プラスミドを使用したいくつかの研究
が公表された（Adamら、1991;Ghattasら、1991;Kaufman
ら、1991;Woodら、1991;Wirthら、1991）。しかし、
「キャップ」依存翻訳は、IRES依存翻訳より明らかに強
いので、２つのタンパク質鎖の化学量論的発現を達成す
ることは不可能であった。従って、今までの応用は、第
２シストロンにおける選択マーカーの使用に集中してい
た。選択マーカー発現物と、発現されるべき遺伝子の発
現物（第１シストロンを構成する）との近接カップリン
グは、高レベルの発現を選択するとき、特に前に遺伝子
増幅が必要である場合に、特に有利である。
しかし、複シストロンまたは多シストロン発現ベクタ
ーによる当モル量のタンパク質の合成はまだ達成されて
いない。２つの異なるタンパク質鎖の当モル発現は、血
小板からの成長因子［「血小板由来成長因子」（PDG
F）、ヒト血清中の主要マイトジェンの１つ］の組換え
調製に、特に重要である。ヒト血小板から精製されたPD
GFは、ジスルフィド架橋によって互いに結合される、２
つの異なるが密接に関連するポリペプチド鎖からなる。
還元条件下では、ダイマーPDGFはそのモノマーサブユニ
ットに解離し、このサブユニットのうちより大きいサブ
ユニット（Mr15−17,000 D）はPDGF−Ａ鎖、そして小さ
なサブユニット（Mr14,000 D）はPDGF−Ｂ鎖と命名され
ている（Johnssonら、1984）。
PDGF−ＡおよびPDGF−Ｂタンパク質鎖は、異なる遺伝
子によりコードされる。両遺伝子産物の完全な構造を、
cDNAクローニング法により解明することは可能となった
（Ratnerら、1985,Betsholtzら、1986）。これに関連し
て、両PDGF分子は、非常に長い前駆体分子として最初に
合成され、続いて細胞内でプロセシングされて成熟PDGF
鎖を生じることが明らかになった。3'領域の69−bpセグ
メントの存在または不在により異なる、２つの異なるPD
GF−Ａ転写物は、別のスプライシングに基づいて説明さ
れ得る（Betsholtzら、1986;Wiseら、1989）。この挿入
は、コーディングセグメントに変化を生じさせ、その結
果、PDGF−Ａ鎖の短い変異体（PDGF−AK、110アミノ
酸）および長い変異体（PDGF−AL、125アミノ酸）が形
成される。両変異体は、平行して、通常の細胞タンパク
質として検出され、より短い形態がより頻繁に生じる種
である（Matoskovaら、1989;Youngら、1990）。
２つの遺伝子は異なる染色体上に配置され、高度の相
同性を示す。多くの研究で、２つの遺伝子は、異なる調
節機構に従属することが示されている。この結果、実際
に、２つのPDGF鎖は、互いに異なる割合で、別々の細胞
型で産生される。
PDGFの可能な３つの異性体（AA、AB、およびBB）はす
べて天然に存在し、血小板中のいわゆるα顆粒中に蓄え
られる。多量に形成するPDGF−ABヘテロダイマーとは別
に、約30％までのPDGF−BBもまた、成人ヒト血小板から
単離され得る（Hammacherら、1988）。新しく調製され
た血小板もまた高い割合（27％）でPDGF−AAを含有する
（Hartら、1990）。従って、栓球前駆細胞、すなわち巨
核球中では、２つのホモダイマーを合わせた割合は、AB
ヘテロダイマーの割合にほぼ一致することが予測され得
る。血小板中の各PDGF種の濃度は、創傷治癒過程での個
々の重要性に直接関連するので、最も頻繁に生じるイソ
型、すなわちPDGF−ABが、特に「創傷治癒ホルモン」の
研究で重要視される。
各々の異なるイソ型は、インビトロで生物学的活性を
有する。種々のPDGF種の活性の異なるスペクトルを区別
する、目指す比較研究を可能にしたのは、高度精製の組
換えPDGFイソ型を入手できるかどうかということのみで
あった（Hoppeら、1989;Hoppeら、1990）。今までに、
一連の研究により、走化性およびDNA増殖テストにおけ
るPDGF−AA、PDGF−AB、およびPDGF−BBの能力の違い
（Hosangら、1989;Nisterら、1988;ReillyおよびBrosk
i,1989;Siegbahnら、1990）、および、イノシトール1,
4,5−トリホスフェート遊離、ジアシルグリセロールの
産生、および［Ca2+］ｉ移動におけるそれらの影響の差
異（Blockら、1989;Sachinidisら、1990 A,1990 B）が
実証されている。２つの異なるPDGFレセプター群（PDGF
αレセプターは全PDGFイソ型に結合し、βレセプターは
PDGF−BBのみに結合する、Hartら,1988;Heldinら,198
8）は、PDGFイソ型の効果の相違が、それらの異なるレ
セプター活性化能力により、いかに導き出され得るかに
関してもっともらしい説明を提供する。PDGFイソ型が測
定可能であり、異なるインビトロ効果を有することによ
り、２つの異なるレセプター群が実証されるとともに、
PDGF−AA、PDGF−AB、およびPDGF−BB活性のインビボス
ペクトルが異なるという結論が導き出される。この理由
により、夾雑タンパク質としてPDGF−BBまたはPDGF−AA
が存在しない、純粋PDGF−ABの生産が望まれる。均質
な、よく特徴づけられたヘテロダイマーを得るために、
その点で、ホモダイマーが精製により完全に除去されな
ければならないが、この精製は、全PDGF種が非常に類似
したクロマトグラフィー特性を有することによりあまり
役に立たない。
組換えPDGFホモダイマー（特にPDGF−BB）の調製のた
めの一連の種々の経路が、比較的長い間、ある程度知ら
れていた（Kellyら、1985;Heldinら、1986;Hoppeら、19
89;Beckmannら、1988;Bywaterら、1988;Stroobantおよ
びWaterfield 1984）。高度に純粋なPDGF−ABの調製方
法は、Hoppeらにより記載された（1990,PCT/EP 90/00 0
63もまた参照のこと）。この方法では、個別のE.coli細
胞で別々に調製された不活性モノマーを、インビトロで
復元して、生物学的に活性なPDGF−ABに変換する。
ＡおよびＢ一本鎖の種々の長さにも関わらず、従来合
成されていた３つのPDGFイソ型の遺伝子産物は、広範囲
にわたり互いに一致する生物学的活性を示す。
序論に掲載されている２つ（またはそれ以上）のタン
パク質の同時発現の基準は、真核生物系でのPDGF−ABヘ
テロダイマーの異種発現に適用する。組換えCHO細胞で
のPDGF−ABの調製（stmanら、1988）および酵母発現
系の使用［EP 0 259 632］について以前に公表された戦
略は、上記の２）で考察された例に相当し、ここでは、
両PDGF遺伝子は、独立した転写ユニットで１つのベクタ
ー上に配置されている。この様式でCHO細胞で発現され
た個々のPDGFダイマーの定量により、19％PDGF−AA、69
％PDGF−AB、および12％PDGF−BBを得た（stmanら、1
988）。
両遺伝子の化学量論的説明だけではなく、最優先事項
としてそれらの同等発現もまた、真核発現系によるPDGF
−ABヘテロダイマーの好ましい合成のための重要な必須
条件として考察されるべきである。この理由により、複
シストロン発現ユニットは、ヘテロダイマータンパク質
およびこのPDGF−ABを発現するための可能な補助物とし
て、自身を提示する。この種の系もまた、PDGFの発現に
関してWO 90/01550に記載されている。しかし、上記の
３）により詳細に説明されているように、これらの構築
物は、第２（および、後続の）シストロンに対して非常
に制限された発現率でのみ得られる。第１シストロンに
配置されたPDGF鎖に依存して、この型のホモダイマーが
優先的に形成される。その他の発現系を使用して真核細
胞で両PDGF遺伝子を発現するための、文献に以前記載さ
れた試みでは、ホモダイマー副産物の割合が30％以上の
範囲になった。それにもかかわらず、これらの細胞系を
使用してPDGF−ABを得るためには、精密であって非常に
浪費的な精製法が使用されなければならない。
従って、本発明の目的は、いかなる認められ得るほど
の夾雑物も伴わずに、PDGF−ABがそれぞれのホモポリマ
ーにより調製され得る発現系を作製することである。
本発明に従って、それ自体公知の様式ではあるが、第
１および第２シストロン間のIRES配列を使用して、PDGF
−Ｂをコードする遺伝子を第１シストロンに導入する構
築物を使用して、目的を達成し得た。驚くべきことに
は、本発明に従って、これらの構築物によるトランスフ
ェクションを行った後、宿主細胞が、無視し得る程度の
量のホモダイマーを含有したPDGF−ABを分泌することが
分かった。それにより、続くタンパク質精製法の収量お
よび有益性は、かなり改良される。
従って、本発明は、宿主細胞としての哺乳動物細胞に
おける、ヘテロダイマーPDGF−ABの組換え調製のための
複シストロン発現ユニットに関する。このユニットは以
下の一般式によって特徴づけられる。
ｐ−5'UTR−C1−IRES−C2−3'UTR−ポリＡ ここで、 ｐは、転写プロモーターであり、 5'UTRは、非翻訳ヌクレオチド配列であり、 C1は、PDGFのＢ鎖をコードする遺伝子、生物学的に活
性なアナログ、またはそれらのフラグメントを含むシス
トロンであり、 IRESは、ウイルス、細胞、または合成起源のヌクレオ
チド配列であり、そのヌクレオチド配列は、翻訳段階で
内部開始の原因となるヌクレオチド配列であり、 C2は、PDGFのＡ鎖をコードする遺伝子または生物学的
に活性なアナログ、またはそれらのフラグメントを含む
シストロンであり、 3'UTRは、非翻訳ヌクレオチド配列であり、そして、 ポリＡは、ポリアデニル化シグナルであり、 ここで、C1、IRES、およびC2は、作動可能な様式で互
いに連結されている。
真核細胞中で有効な、すなわち、真核細胞中で遺伝子
発現を開始し得る、それらの全てのプロモーターが、プ
ロモーターとして適している。特に、ウイルス起源（例
えば、レトロウイルスの「長末端反復」（LTR）または
単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）、細胞起
源（例えば、インターフェロンまたはユビキチンプロモ
ーター）、または合成起源の構成および誘導プロモータ
ーが使用され得る。SV40プロモーターが、本発明によれ
ば好ましい。
5'UTRおよび3'UTRは、調節要素を含有し得る、任意
の、原則として非翻訳のヌクレオチド配列である。本発
明によれば、例えば、Arteltら（1988）によるSV40から
の配列が適している。
第１シストロンC1は、完全PDGF−Ｂ前駆体配列（配列
番号:3）、そのアナログ、および生物学的に活性なPDGF
−Ｂ鎖をコードする任意のフラグメントを含み得る。特
に、PDGF−Ｂ鎖に相同であるｖ−sis遺伝子（サル肉腫
ウイルス（SSV）の生成物）、および、成熟PDGF−Ｂ鎖
をコードする配列番号:3の283から609塩基対が、これに
関連して適している。
類似の様式で、第２シストロンC2は、長いまたは短い
PDGF−Ａ前駆体配列（PDGF−ALまたはPDGF−AS−配列番
号:1）、および生物学的に活性なPDGF−Ａ鎖をコードす
る任意のフラグメントを含み得る。特に、成熟PDGF−Ａ
鎖をコードする配列番号:1の353から682塩基対のフラグ
メントが適している。
リボソームの内部結合を仲介する、ウイルス、細胞、
または合成起源の全ての配列が、IRESとして使用され得
る。このような配列の例は、配列番号:5のポリオウイル
ス１型由来のIRESであり、これは、ポリオウイルス１型
の5'非翻訳領域の最初の628ヌクレオチド、さらに、脳
心筋炎ウイルス（EMV）の5'UTR、「サイラーのネズミ脳
脊髄炎ウイルス」（TMEV）の5'UTR、「口蹄疫ウイル
ス」（FMDV）の5'UTR、「ウシ腸内ウイルス」（BEV）の
5'UTR、「コクサッキーＢ型ウイルス」（CBV）の5'UT
R、または「ヒトライノウイルス」（HRV）の5'UTR、ま
たは「ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質」（BI
P）5'UTR、ショウジョウバエアンテナペディア（Drosop
hila antennapediae）5'UTR、またはショウジョウバエ
ウルトラビトラックス（Drosophila ultrabithorax）5'
UTR、または上記の配列の遺伝子ハイブリッドまたはフ
ラグメントを包含する。配列番号:5のポリオウイルス１
型由来のIRESが、本発明に従って好ましい。
さらに、本発明は、本発明の発現ユニットを含有する
組換えDNAベクターに関する。本発明に好ましいベクタ
ーは、図4Bに記載されており、その調製は図１から３に
記載されている。
さらに、本発明は、哺乳動物細胞であって、本発明の
発現ユニットを有するベクターで形質転換される宿主細
胞を包含する。好ましくは、この細胞は、CHOまたはBHK
細胞であり、後者が特に好ましい。本発明に従って形質
転換されたBHK細胞は、Deutsche Sammlung von Mikroor
ganismen und Zellkulturen GmbH（DSM）（German coll
ection of microorganisms and cell cultures）に、91
−21−4Dの名称で、1992年８月11日（11.8.1992）に寄
託した。受託番号DSM ACC2045が、それに対して割り当
てられた。
これに加えて、本発明は、ヘテロダイマーrPDGF−AB
を調製する方法を包含し、その方法では、作動可能な様
式で挿入された本発明の発現ユニットを保有する宿主細
胞としての哺乳動物細胞を適切な培地で培養し、生じた
rPDGF−ABを細胞および培地から分離する。哺乳動物細
胞を培養するための公知の全ての培地が、培地として適
当である。この培地には、合成のタンパク質非含有また
は低タンパク質含有産生培地が含まれる。4.5g/lグルコ
ースおよび５から10％のFCSを補充したDMEM（ダルベッ
コの改変イーグル培地）が、本発明に好ましかった。
rPDGF−ABは、従来の方法により、細胞および培地か
ら分離される（例えば、Ostmanら、1988を参照のこ
と）。PDGF−AAのために開発された高度に有効な方法
（Eichnerら、1989）は、本発明によれば好ましく使用
される。
最後に、本発明は、ホモダイマー夾雑産物を本質的に
含まない、上記の宿主細胞を本発明に従って培養するこ
とにより得られ得るヘテロダイマーrPDGF−ABに関す
る。驚くべきことには、本発明の構築物で形質転換され
た宿主細胞が、形成されたPDGFの総量に基づく純度90％
以上でヘテロダイマーPDGF−ABを分泌することが明らか
にされた。本発明によれば、本発明の構築物で形質転換
されたBHK細胞、例えば、German collection of microo
rganisms and cell cultures（DSM）に、91−21−4Dの
名称で、1992年８月11日に寄託された細胞（受託番号DS
M ACC2045）を培養することにより得られるPDGF−ABが
好ましい。
本発明のrPDGF−ABはその高純度により、従来から公
知である組換えPDGF−ABとは主として異なる。序論に述
べたように、得られる産物の90％以上がヘテロダイマー
からなるような組換え方法は、今までに記載されていな
い。ホモダイマーをヘテロダイマーから完全に分離する
ことは実質的に不可能であるので、既知産物は、必然的
に３つの全イソ型の混合物となる。
このことに加えて、既知産物は、その調製法によっ
て、多くの点で不都合である。例えば、EP 259 632また
は288 307に記載のような、酵母細胞での異種遺伝子発
現は、グリコシル化パターンが、ヒト産物に比較して変
化しているタンパク質産物を導くことが知られている。
さらに、酵母細胞で発現されたPDGF−Ｂは、少なくとも
一部はプロセシングが不完全であり、および／または、
タンパク質分解的に減成される（WO 92/01716を参照の
こと）。従って、この種の産物は、種々の炭水化物パタ
ーンを有し、タンパク質分解減成産物で夾雑される。前
述の不都合を避けるために、WO 92/01716には、グリコ
シル化の共通配列およびプロテアーゼ感受性ドメインが
除去された改変PDGF鎖を調製する方法が記載されてい
る。しかし、この種の改変は、産物の生物学的活性に影
響する（WO 92/01716を参照のこと）。
本発明の特に好ましい実施態様では、ヘテロダイマー
rPDGF−ABは、本発明に従って形質転換されたBHK細胞を
培養することにより、特に、受託番号DSM ACC2045の91
−21−4D宿主細胞を培養することにより得られる。
さらに、WO 90/08163は、細菌細胞、特にE.coliでのP
DGF−ABの組換え調製を開示しており、この調製は必然
的に非グリコシル化産物を導く。しかし、この方法によ
りE.coli細胞中で発現されたPDGF−Ｂ鎖は、アミノ末端
の12アミノ酸で切断されている。これに加えて、細菌か
らの産物はインビトロで復元されなければならないが、
分子内および分子間での適切なジスルフィド架橋形成、
およびタンパク質の適切な折り畳みの方法が保証されな
いので、その結果、この産物の免疫学的特性が変化され
得、生物学的活性が影響を受け得る。
本発明のヘテロダイマーrPDGF−ABは、薬学的調製物
として（特に創傷治癒用）、薬学的に許容可能な（tole
rated）補助剤および賦形剤と共に、好ましくは処方さ
れる。これに関連して、それは、膏薬および創傷帯など
の中で活性化合物として含有され得る。それは、特に局
所塗布用に適しているが、その他の投与形態にもまた適
している。この他の投与形態では、その活性化合物が創
傷中に導入されるかまたは経皮投与される。例えば、PD
GF−ABは、創傷周辺領域に、貯蔵機能を有する適切なマ
トリックスで、皮下投与され得るか、または、直接皮下
注射され得る。
さらに、本発明のrPDGF−ABは、化粧用調製物、例え
ば、皮膚再生、皮膚をなめらかにする、皮膚荒れまたは
皮膚の加齢の予防、および日焼けの塗布用の製造に適し
ている。
適切な補助剤および賦形剤には、水ベースのセルロー
スゲル、生分解性ポリマー、および任意の軟膏基剤およ
びクリーム基剤、およびスプレー剤が含まれる。さら
に、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、第XIII因
子、線維芽細胞増殖因子（aFGFおよびbFGF）、トランス
フォーミング増殖因子αまたはβ型、上皮増殖因子、イ
ンスリンまたは「インスリン様増殖因子」（IGF Iおよ
びII）、または別の増殖因子のような、創傷治癒に影響
するさらなる活性化合物が、本発明の調製物中に含有さ
れ得る。本発明の調製物はまた、例えば、水溶液状で創
傷帯中に存在し得る。
本発明は、実施例により以下に説明される。
1.図面の簡単な説明： 図１）基本ベクターpSBC−１およびpSBC−２の調製の様
式図である。
図２）ベクターM13BCL1;c−sis（PDGF−Ｂ）に相同であ
るpMVW−２からの領域は、ベクターマップ上に示されて
いる。成熟PDGF−ＢおよびNco I/Sal I（配列番号:8お
よび９）アタプターの領域は、黒棒線により強調してい
る。
図３）完全PDGF−Ｂ前駆体配列の再構築の模式図であ
る。
図4AおよびＢ）比較目的のために使用される複シストロ
ンベクターpSBC−A/Bの構築の模式図（図4A）、およ
び、基本ベクターpSBC−１およびpSBC−２からの本発明
の発現ベクターpSBC−PDGF−B/Aの構築の模式図（図4
B）である。発現ベクターpSBC−PDGF−A/BおよびpSBC−
PDGF−B/Aは、PDGF−ＡおよびPDGF−Ｂ鎖のコーディン
グcDNA配列の向きに基づいて、すなわち、それぞれに読
み取り方向で第１または第２シストロンとしてのそれら
のプラスミド上の配置に基づいて、互いに異なってい
る。
図５）形質転換BHK細胞のノーザンブロット分析であ
る。実験は、単シストロンまたは複シストロンのPDGF発
現構築物で、安定にトランスフェクトされた全BHK細胞
プールからのmRNAで実施された。予測通り、単シストロ
ンのmRNAは、約1,300ntの大きさであり、一方、複シス
トロンのmRNAは、２つのPDGF鎖のコーディング配列の大
きさ（2,500ヌクレオチド）である。このことは、対応
の遺伝子産物は１つの複シストロンmRNAから読み取られ
ることを実証する。ネズミαアクチン試料をリファレン
スとして使用した（Minty,A.J.ら、J.Biol.Chem.256,10
08−1014,（1981））。
図６）モノクローナルおよびポリクローナル抗PDGF抗体
を使用した、PDGF−ABの検出のためのサンドイッチELIS
Aである。
PDGF標準物からの検量線： ポリスチレンプレートをヒツジ抗マウスIgGで被覆し、
続いて、マウスハイブリドーマ上清（クローン1B3由
来、PDGF−ABおよびPDGF−BBのＢ鎖に対するモノクロー
ナル抗体を含有する）とインキュベートし；種々のPDGF
標準物とインキュベーションを行った後、結合PDGFを、
ポリクローナルウサギ抗PDGF−AAで、次いでペルオキシ
ダーゼ標準抗ウサギIgGで検出した。
PDGF標準の材料源： AB:ヒト血小板、PROMEGA Corp.No.G 5161から入手； BB:酵母からの組換え体、PROMEGA Corp.No.G 5191から
入手； AA:BHK細胞からの組換え体、約70％純度（Eichnerら、1
989）。真核生物起源のPDGFを使用することにより、こ
のアッセイでは、PDGF−BBとのわずかな交差反応を伴う
が、PDGF−AB（ヒト血小板由来）により特異的シグナル
が与えられる。
図７）PDGF−AB−ELISAによる、組換えBHK細胞の培養上
清中のPDGF−ABの検出である（標準物からの検量線は図
６を参照のこと）。表示試料は、以下のベクター構築物
でトランスフェクトされたBHK細胞由来である： 試料:No.1:pSBC−A/B No.2:pSBC−B/A No.3:pSBC−２−PDGF−Ａ＋pSBC−２−PDGF−Ｂ No.4:pSBC−２−PDGF−Ａ No.5:pSBC−２−PDGF−Ｂ No.6:pSBC−２−コントロール 図８）精製rPDGFのSDS PAGEによる分析である。試料
を、SDS存在下の13.5％ポリアクリルアミドゲルで分離
し、後にクーマシブルーで染色した。
１、６、11＝分子量マーカー（PHARMACIA）［14400、
20100、30000、43000、67000、94000 D］ ２ ＝pSBC−B/A ３ ＝pSBC−２−PDGF−Ａ＋pSBC−２−PDGF−
Ｂ ４ ＝pSBC−A/B ５ ＝pSBC−２−PDGF−Ａ ７−10 ＝各々に10％（v/v）β−メルカプトエタ
ノール（10分、95℃）を加えた、２−５で使用した同じ
配列 SDS−PAGEでの精製分泌産物の分析は、培養上清の分
析からの結果と相関する（表１）。特に、還元条件下で
現れたPDGFモノマーのバンドからは、pSBC−2PDGF−Ａ
＋pSBC−２−PDGF−Ｂ（共転移）およびpSBC−A/B（第
１シストロン中のPDGF−Ａ鎖）グループのトランスフェ
クション細胞プールが優先的にPDGF−AAホモダイマーを
分泌することが明らかに理解され得る。
pSBC−B/A培養上清から単離され得るPDGFは、リファ
レンスとして適用したPDGF−AAよりごくわずかに低い分
子量にバンドを示した。還元条件下では、両モノマー
は、ほぼ等量で検出され得る。上方のバンドは、PDGF−
Ａ鎖のモノマーバンドに相当する。BHK細胞からの組換
えPDGF−AAについて、この物質が完全なPDGF−Ａ鎖とＣ
末端が切断された種とから、ほぼ等しい割合で構成され
ることは、既に示されている（Eichnerら、1989）。
モノマーPDGF−Ａ鎖は、約17KDのMrにバンドを示す。
同様に、pSBC−B/A上清から単離された物質中で切断さ
れた形態で生じるPDGF−Ｂ鎖は、この下方（Mr16KD）に
バンドを示す。２つの鎖の亜種は、タンパク質配列分析
により共に分析され、PDGF−ＡおよびPDGF−Ｂとして明
瞭に同定された。従って、PDGF−Ｂの分子量差は、PDGF
−Ａの場合のように、Ｃ末端切断または改変グリコシル
化パターンに起因すると思われる。従って、pSBC−B/A
上清からのPDGFは、ほぼ等量のPDGF−Ａ鎖およびPDGF−
Ｂ鎖からなる。
リファレンスとして使用され、同様にBHK細胞中で発
現されたPDGF−AAは、グリコシル化されていないが（Ei
chnerら、1989）、一方、CHO細胞で発現されたPDGFは、
約７％の炭水化物を含有する（Kolvenbachら、1991）。
PDGF−AAホモダイマーおよびABヘテロダイマーの両方か
らのPDGF−Ａモノマーは、SDS−PAGE上の移動に関して
互いに一致する。
2.複シストロンベクター系によるPDGF−ABヘテロダイマ
ーの発現 2.1 基本ベクターpSBC−１およびpSBC−２の調製（図
１） ベクターpSBC−１を構築するために、プラスミドpGEM
3−5'ポリオ（Ｍ）（Sarnow,、1989）由来の627bpのMse
I/Bal Iフラグメントを、以下のプライマーを使用する
PCRのテンプレートとして用いた： 増幅後に生成した652bpフラグメントを、pol I Kで処
理し、次に、Pst Iで切断して、対応する様式で調製し
ておいたベクターpBEH（Arteltら、1988）に挿入した。
ベクターpSBC−２を構築するために、プラスミドpBEH
をEcoR Iで線状化し、以下のオリゴヌクレオチド配列を
ハイブリダイズして挿入した： 2.2 完全PDGF−Ｂ前駆体配列の再構築 プラズミドpMVW−２は、ヒトPDGF−Ｂ遺伝子のcDNAを
含有しているが、これは前駆体配列の5'−翻訳領域で不
完全である（Weichら、1986）。真正（authentic）PDGF
−Ｂ前駆体を再構築するために、Bcl I切断部位を、ク
ローンpMVW−２のコーディングセグメントの30位でのＣ
−Ｔ変換により、前駆体の5'末端領域に導入した。最後
に、この工程の結果としてコーディング領域の短いセグ
メントのみを消失し、局部的にコードされたアミノ酸
（アスパラギン酸）が保存されている。ほとんどのE.co
li株では、Bcl I切断部位は、メチル化の結果、酵素切
断に対して抵抗性であるので、この切断部位を有するフ
ラグメントは、dam-株に再クローニングされるか、また
は別にPCR工程で増幅されなければならない。次に、前
駆体の欠失領域を、合成Sal I/Bcl Iフラグメント［オ
リゴマーPPDGFB1およびPPDGFB2（配列番号:11および1
2）］として挿入する。
この目的のために、pMVW−２由来の914bpのBamH I/Nc
o Iフラグメントを、まず、BamH I/Sal I切断バクテリ
オファージM13mp19（Pharmacia）に、合成アダプター
［オリゴマーNCCLSA1およびNCCLSA2（配列番号:8および
９）］により挿入した。この構築物は、次のインビトロ
での変異誘発工程に必要な一本鎖DNAを提供した。この
工程は、Ecksteinらの方法に基づいて、Amershamのオリ
ゴマー特異的インビトロ変異誘発系（２型）を用いて実
施した［Taylor J.W.,Ott J.およびEckstein F.（198
5）Nucl.Acids Res.13,8764−8785;Nakamaye K.およびE
ckstein F.（1986）Nucl.Acids Res.14,9679−9698;Say
ers J.R.,Schmidt W.およびEckstein F.（1988）Nucl.A
cids Res.16,791−802］。変異誘発後に、合成プライマ
ー［PDGBBCL（配列番号:10）］を用いて、配列番号:3に
示されている配列の144位で塩基変換（ＣからＴに）を
行い、それにより、PDGF−Ｂ前駆体の5'領域にBCl I切
断部位を導入する。この変異誘発誘導体はM13BCL1と称
した（図２）。
M13BCL1由来の1100bpフラグメントを、プライマーM13
17MERおよびM1324MER（配列番号:6および７）を用いてP
CR工程で増幅し、次に、Bcl I/Hind III制限酵素処理に
かけ、得られた770bpフラグメントを単離した。合成オ
リゴマーPPDGFB1およびPPDGFB2（配列番号:11および1
2）は、Bcl I切断部位までのPDGF−Ｂ前駆体の欠失5'領
域を形成する。アニーリング後、この二本鎖オリゴマー
を770bp PDGF−Ｂフラグメントとともに、ベクターpGEM
−２（Promega）に連結した。これは、Sal I/Hind III
での制限酵素処理により予め調製しておいた（図３）。
PDGF−Ｂの真正配列を、完全に配列分析することにより
実証した。
2.3 PDGF−ＡおよびPDGF−Ｂ鎖に対する複シストロン
発現ベクターpSBC−PDGF−A/BおよびpSBC−PDGF−B/Aの
構築（図4AおよびＢ） 1.2に記載したように、PDGF−Ｂ前駆体の完全コーデ
ィングcDNA（Ratnerら、1985）は、ベクターpGEM2−PDG
F−Ｂ中に存在する。PDGF−Ａ鎖の短い変異体の完全cDN
A配列（Betsholtzら、1986）は、発現ベクターpODA（Ei
chnerら、1989）中に含まれている。このベクターは、p
PGF−１由来のRas Iフラグメント（Hoppeら,1987）をSV
40発現ベクターpBEH（Arteltら、1988）にクローニング
して得た。
PDGF−ＡおよびPDGF−Ｂ鎖をコードするcDNA配列を、
EcoR I/Hind III制限酵素処理により、単シストロンベ
クターpSBC−１およびpSBC−２に挿入した（図４）。複
シストロン発現ユニットを形成するための２つのベクタ
ーの融合を、制限酵素Xmn I/Not Iを用いて実施した。
2.4 形質転換BHK細胞の調製 単シストロンおよび複シストロン発現ベクター（これ
らはPDGFのＡ鎖およびＢ鎖のコーディング配列を有する
（図１、4A＋Ｂを参照のこと））をリン酸カルシウム沈
降法によりBHK細胞にトランスフェクトした（Wiglerら,
1979;Grahamおよびvan der Eb,1973）。トランスフェク
ションの前日に、２〜３×105BHK細胞/24cm2を新しい培
養フラスコに移し、トランスフェクションの４時間前
に、DME培地を用いて培地の交換を行った。５μｇの上
述のプラスミドDNAを、0.5μｇの選択プラスミドpAG60
およびpSVpac（Colbre−Gerapin,1981;Veraら,1986、
これらはそれぞれネオマイシン耐性遺伝子およびプロマ
イシン耐性をコードしている）と共に250μｌの250mM C
aCl2に懸濁した。この溶液を、無菌ガス中に吹き付けて
連続的に撹拌しながら、250μｌの２×HEPES緩衝液（28
0mM NaCl;50mM HEPES;1.5mM NaH2PO4,pH7.1）にゆっく
りと添加し、次いで生じた沈殿物を栄養培地に加えた。
トランスフェクションの２日後、安定してトランスフェ
クトした細胞の選択を、DME培地から２倍選択培地（５
μg/mlプロマイシン;500μg/ml G418、Wirthら,1988）
に培地を交換することにより開始し、そしてPDGF分泌細
胞クローン群を得た。これらの細胞の代表的なクローン
混合物を、DSM ACC2045の番号で、1992年８月11日にDSM
に寄託した。
2.5 ノーザンブロット分析 形質転換BHK細胞由来のポリアデニル化RNAをPurchio
ら（1979）の方法により単離し、１％アガロースホルム
アルデヒドゲル（Lahrachら,1977）上で分画し、ナイロ
ン膜上にブロッティングし、そして［32P］標識PDGF−
ＡおよびPDGF−Ｂ鎖特異的プローブとハイブリダイズし
た（図５）。
2.6 馴化細胞培養上清の調製 BHK細胞を2.4と類似のようにして形質転換した。コロ
ニー数を数えた後、細胞をトリプシン処理し、新鮮な選
択培地に採取し、そして細胞数を105細胞/mlにまで調整
した。各場合において、この細胞懸濁液10mlを底面積65
cm2のフラスコに移し、さらに48時間培養した。次いで
培地を除去し、播種した細胞をPBSで２回洗浄し、そし
て培地を10mlの産生培地（DHEM、血清および選択抗生物
質を含まない）と取り替えた。24時間後、培地を取り去
り、血清含有選択培地と取り替えた。採取した上清を分
析まで−20℃で保存した。採取する時、フラスコ当たり
の細胞数は0.8〜1.2×107であった。
2.7 マイトジェン試験を用いる培養上清中のPDGFの検
出 PDGFのマイトジェン活性は、密度阻止線維芽細胞にお
けるDNA合成速度の刺激を測定することにより決定され
得る。この試験においてイソ型間を区別し得ない。
このアッセイは、Shipleyら（1984）に従ってAKR−2B
マウス線維芽細胞を用いて24ウエルプレート中で行っ
た。この試験では、純粋PDGFでは、約5ng/mlの濃度で半
最大刺激を示した。この値を生産性を決定するために用
いた。マイトジェン試験の結果を、図７においてPDGF−
AB ELISAからの値と比較する。
2.8 特定のPDGF−AB ELISAを用いる培養上清におけるP
DGF−ABヘテロダイマーの検出 「２抗体サンドイッチアッセイ」を、PDGF−AAおよび
PDGF−BBの存在下でのPDGF−ABの明確な定量が可能なよ
うに構成した。
モノクローナル抗PDGF抗体およびポリクローナル抗PDGF
抗体を用いるサンドイッチアッセイ： 96ウエルのポリスチレンプレート（Dynatechから入
手、Ｕ−Platte,No.M124B）を以下の順にコーティング
する（各場合において、各工程間0.05％Tween 20を含む
PBSで４回洗浄する）。
１）ヒツジ抗マウスIgG（Boehringer Mannheimから入
手、No.1097 105）、３μg/ml。
２）１％BSA（E.Merckから入手,No.12018、PBS中）、pH
7.5、100μｌを室温で１時間。
３）クローン1B3由来のマウスハイブリドーマ上清［SP2
/0−骨髄腫細胞を、組換えPDGF−AB（Hoppeら（1990）
に従ってE.coliから得た）で免疫したマウス由来の脾臓
細胞と融合することにより得られる］、２μg/ml IgG2a
/ml。モノクローナル抗体はPDGFダイマーのＢ鎖に特異
的に結合する。
４）0.1％BSAおよび0.05％Tween 20を含有するPBS（PBS
＋）中に希釈したPDGF含有溶液の50μｌを室温で１時
間。
５）ポリクローナルウサギ抗PDGF−AA−IgG（Genzymeか
ら入手、No.ZP−214、これはPDGFダイマーのＡ鎖に結合
する）、PBS＋中２μg/mlのうちの50μｌを室温で１時
間。
６）POD標識ヤギ抗ウサギIgG（Pierceから入手、No.314
60）、PBS＋中0.1μg/mlのうちの50μｌを室温で１時
間。E.S.BOSら（J.Immunoassay ２（1981）,187−204）
に従って基質テトラメチルベンジジンを用いる検出。
2.8.1 結果： 組換えBHK細胞の培養上清由来のPDGFの３つの異なる
分析の結果を図７に示す。
マイトジェン試験は、異なるイソ型（PDGF−AA、PDGF
−AB、またはPDGF−BB）間で差異を生じることなく、培
養上清中に存在するrPDGFの全量に対する有用な値を提
供する。
ヘテロダイマーPDGF−ABの特定比は、PDGF−AB特異的
ELISAによって十分に高精度で決定され得る。PDGFホモ
ダイマーの百分率比は、マイトジェン試験の結果とこの
後者の分析の結果との間の差異から計算され得る（表
１）。
ELISAの結果により、pSBC−PDGF−B/A型のトランスフ
ェクトした細胞系由来の培養上清においてのみ、マイト
ジェン試験における測定可能な生物学的活性が高いPDGF
−AB値に関連することが示される。
2.9 分泌PDGF−ABの精製 細胞培養物上清からrPDGF−AAを精製するために開発
されたプロセス（Eichnerら,1989）を用いて、種々のト
ランスフェクション細胞プール由来の馴化培養物上清1.
5〜2.5リットルから分泌産物を精製した。HPLC工程後で
高度にまたは部分的に精製されたPDGFを、SDSの存在下
でLaemmli（1970）ポリアクリルアミドゲル上で分画
し、続くクーマシーブルーでの染色後分析した（図８を
参照のこと）。
2.10 PDGFポリペプチドのアミノ末端配列決定 この場合において切断されプロセシングされた形態の
１つのPDGF鎖のみが存在し得るという可能性を取り除く
ために、タンパク質配列分析により、２つのPDGF鎖を明
瞭に同定することを目的とした（図８を参照のこと）。
BLOTT1サイクルを用いる477Aモデル（Applied Biosys
tems）で自動化配列分析を行った。フェニルチオヒダン
トインアミノ酸誘導体を、オンラインでつながっている
120A PTHアナライザーで分析した。
試料のジスルフィド架橋をジチオトレイトールで還元
し、４−ビニルピリジンでアルキル化する。次いで、記
載（Westermeierら,SD 092/89,Pharmacia LKB Biotechn
ology）のように改変したSchggerおよびvon Jagowに
よる水平SDS電気泳動ゲル上で分離する。試料を、記載
のような不連続緩衝系（Westermeierら,SDRE−072、Pha
rmacia LKB Biotechnology）を用いてPVDF膜（Problo
t、Applied Biosystems）上にブロッティングし、次い
でクーマシーブリリアントブルーR250で染色する。17kD
および16kDの２つの二重バンドを切り出し、共に配列決
定する。
タンパク質決定付けの結果に基づいて、10μｇの試料
を分析した。PDGF−Ａ鎖およびPDGF−Ｂ鎖のＮ末端アミ
ノ酸を等量で検出することができた（表２）。夾雑配列
は検出されなかった。
略語 BHK − ハムスター細胞系（ベビーハムスター腎臓） bp − 塩基対 CHO − ハムスター細胞系（チャイニーズハムスター
卵巣） BSA − ウシ血清アルブミン D − ダルトン DMEM −タルベッコの改変イーグル培地 ELISA −酵素結合免疫吸着アッセイ HEPES −４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラ
ジンエタン−スルホン酸 HPLC −高圧液体クロマトグラフィー IgG − Ｇクラス免疫グロブリン IRES − リボソーム内部エントリー部位 nt − ヌクレオチド PAGE − ポリアクリルアミドゲル電気泳動 PBS − リン酸緩衝化塩化ナトリウム溶液 PCR − ポリメラーゼ連鎖反応 PDGF − 血小板由来成長因子 POD − ペルオキシダーゼ PVDF − ポリビニリデンフルオライド SDS − ドデシル硫酸ナトリウム UTR − 非翻訳領域 配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人： （Ａ）氏名：バイアースドルフ アーゲー （Ｂ）番地：ウナシュトラーセ 48 （Ｃ）市：ハンブルク （Ｅ）国：ドイツ連邦共和国 （Ｆ）郵便番号:20253 （Ａ）氏名：ゲーベーエフ−ゲゼルシャフト フュ
ア ビオテヒノロギッシェ フォルシュング エムベー
ハー （Ｂ）番地：マシェローダー ベーク １ （Ｃ）市：ブラウンシュバイク （Ｅ）国：ドイツ連邦共和国 （Ｆ）郵便番号:38124 （ii）発明の名称：哺乳動物細胞における複シストロ
ンベクター系を用いるヘテロダイマーPDGF−ABの調製 （iii）配列数:16 （iv）コンピューター読み出し形態： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換 （Ｃ）OS:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃1.0,
バージョン＃1.25（EPA） （２）配列番号:1の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:748塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:pODA（Eichnerら、1989） （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:95..682 （Ｄ）他の情報:/産物＝「PDGF−Ａ前駆体配列（短
いスプライシング形態）」 /注記＝「末端が5'−EcoR Iおよび
3'−Hind III制限切断部位であるpODA由来のヒトPDGF−
Ａ遺伝子（短いスプライシング形態［２］）」 /出典＝（［２］） （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:mat_peptide （Ｂ）存在位置:353..682 （Ｄ）他の情報:/産物＝「成熟PDGF−Ａ鎖」 （ｘ）公開情報： （Ａ）著者:Eichner,W. Jaeger,V. Herbst,D. Hauser,H. Hoppe,J. （Ｃ）刊行物:Eur.J.Biochem. （Ｄ）巻:185 （Ｆ）頁:135−140 （Ｇ）日付:1989 （ｘ）公開情報： （Ａ）著者:Hoppe,J. Schumacher,L. Eichner,W. Weich,H.A. （Ｃ）刊行物:FEBS Lett. （Ｄ）巻:223 （Ｆ）頁:243−246 （Ｇ）日付:1987 （xi）配列：配列番号:1: （２）配列番号:2の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:196アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:2: （２）配列番号:3の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:868塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:pMVW−２（Weichら、1986） （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:40..762 （Ｄ）他の情報:/産物＝「PDGF−Ｂ前駆体配列」 /注記＝「末端が5'−EcoR Iおよび
3'−Hind III制限切断部位であるpGEM2−PDGF−Ｂ由来
のヒトPDGF−Ｂ遺伝子」 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:mat_peptide （Ｂ）存在位置:283..609 （Ｄ）他の情報:/産物＝「成熟PDGF−Ｂ鎖」 （ｘ）公開情報： （Ａ）著者:Weich,H.A. Sebald,W. Schairer,H.U. Hoppe,U. （Ｃ）刊行物:FEBS Lett. （Ｄ）巻:198 （Ｆ）頁:344−348 （Ｇ）日付:1986 （xi）配列：配列番号:3: （２）配列番号:4の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:241アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:4: （２）配列番号:5の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:628塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （vi）起源： （Ａ）生物名：ポリオウイルス（Poliovirus）１型
（Mahoney株） （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:pGEM 3−5'ポリオ（Ｍ）（4708b
p），（Sarnow,1989） （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..628 （Ｄ）他の情報:/注記＝「ポリオウイルス１型（Ma
honey）の5'非翻訳領域の最初の628ntが示されている」 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:610 （Ｄ）他の情報:/注記＝「610位で塩基対がＣから
Ｇに置換されている非正配列」 （ｘ）公開情報： （Ａ）著者:Sarnow,P. （Ｃ）刊行物:J.Virol. （Ｄ）巻:63 （Ｆ）頁:467−470 （Ｇ）日付:1989 （xi）配列：配列番号:5: （２）配列番号:6の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:17塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..17 （Ｄ）他の情報:/標識＝M1317MER /注記＝「合成DNA;PCRに用いたM13
配列決定用プライマー（New England Biolabs GmbH）」 （xi）配列：配列番号:6: （２）配列番号:7の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:24塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..24 （Ｄ）他の情報:/標識＝M1324MER /注記＝「合成DNA;PCRに利用したM
13逆配列決定用プライマー（New England Biolabs Gmb
H）」 （xi）配列：配列番号:7: （２）配列番号:8の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:19塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..19 （Ｄ）他の情報:/標識＝NCCLSA1 /注記＝「合成DNA;pMVW−２由来の
短縮したPDGF−Ｂ前駆体を、バクテリオファージM13mp1
9中で再クローニングするための合成リンカー」 （xi）配列：配列番号:8: （２）配列番号:9の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:19塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..19 （Ｄ）他の情報:/標識＝NCCLSA2 /注記＝「合成DNA;pMVW−２由来の
短縮したPDGF−Ｂ前駆体を、バクテリオファージM13mp1
9中で再クローニングするための合成リンカー」 （xi）配列：配列番号:9: （２）配列番号:10の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:37塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..37 （Ｄ）他の情報:/標識＝PDGBBCL /注記＝「合成DNA;Bcl I−切断部
位を、PDGF−Ｂ前駆体の5'−領域に挿入するための突然
変異誘発プライマー」 （xi）配列：配列番号:10: （２）配列番号:11の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:110塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..110 （Ｄ）他の情報:/標識＝PPDGFB1 /注記＝「合成DNA;成熟PDGF−Ｂ前
駆体配列の再構成のための合成リンカー」 （xi）配列：配列番号:11: （２）配列番号:12の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:110塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..110 （Ｄ）他の情報:/標識＝PPDGFB2 /注記＝「合成DNA;成熟PDGF−Ｂ前
駆体配列の再構成のための合成リンカー」 （xi）配列：配列番号:12: （２）配列番号:13の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..30 （Ｄ）他の情報:/標識＝5'−POLIO1 /注記＝「合成DNA;合成PCRプライ
マー」 （xi）配列：配列番号:13: （２）配列番号:14の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..28 （Ｄ）他の情報:/標識＝3'−POLIO2 /注記＝「合成DNA;合成PCRプライ
マー」 （xi）配列：配列番号:14: （２）配列番号:15の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:13塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..13 （Ｄ）他の情報:/標識＝Ｅ−Ｎ−E1 /注記＝「合成DNA;合成リンカー」 （xi）配列：配列番号:15: （２）配列番号:16の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:13塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：− （Ｂ）存在位置:1..13 （Ｄ）他の情報:/標識＝Ｅ−Ｎ−E2 /注記＝「合成DNA;合成リンカー」 （xi）配列：配列番号:16:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アイヒナー，ヴォルフラム ドイツ連邦共和国 デー―22301 ハン ブルク，ドロテーンシュトラーセ 49 (72)発明者 アハターベルク，フォルカー ドイツ連邦共和国 デー―20257 ハン ブルク，アイムスビュッテラー マルク トプラッツ 11 (72)発明者 デルシュナー，アルブレヒト ドイツ連邦共和国 デー―20357 ハン ブルク，シャンツェンシュトラーセ 107 (72)発明者 マイヤー−インゴルト，ヴォルフガング ドイツ連邦共和国 デー―22457 ハン ブルク，アム ハーゼンカンプ 29 (72)発明者 ミエルケ，ハイコ ドイツ連邦共和国 デー―21629 ノイ ブルムストルフ，フィッシュベカー シュトラーセ 22 (72)発明者 ディルクス，ヴィルヘルム ドイツ連邦共和国 デー―38106 ブラ ウンシュバイク，ビェルテンヴェク 13 (72)発明者 ヴィルト，マンフレート ドイツ連邦共和国 デー―38300 ヴォ ルフェンビュッテル，マルクトシュトラ ーセ １ (72)発明者 ホイザー，ハンスエルク ドイツ連邦共和国 デー―38104 ブラ ウンシュバイク，ゲオルク―ヴェスター マンアレー 29 (56)参考文献 特開 昭63−119682（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ. 263，Ｎｏ．31（1988）ｐ．16202− 16208 日本生化学会編「新生化学実験講座第 ７巻、増殖分化因子とその受容体」 （1991) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ. 263，Ｎｏ．31（1988）ｐ．16493− 16498 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ．185，Ｎｏ．１（1989）ｐ．135− 140 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．186，Ｎ ｏ．２（1992．Ｆｅｂ．）ｐ．669−675 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．20，Ｎｏ．６（1992．Ｍ ａｒ．）ｐ．1293−1299 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の一般式により特徴づけられる、宿主
    細胞としての哺乳動物細胞におけるヘテロダイマーPDGF
    −AB（血小板由来成長因子AB）の組換え調製のための二
    シストロン発現ユニット： ｐ−5'UTR−C1−IRES−C2−3'UTR−ポリＡ であって、 ここで、 ｐは、転写プロモーターであり、 5'UTR（5'非翻訳領域）は、非翻訳ヌクレオチド配列で
    あり、 C1は、PDGFのＢ鎖、アナログ、またはそれらのフラグメ
    ントをコードする遺伝子を含むシストロンであり、 ここで、該アナログは、以下： （ａ）PDGFのＢ鎖のアミノ酸配列における１または数個
    のアミノ酸の置換、欠失または付加によって、該PDGFの
    Ｂ鎖から誘導される、ポリペプチド；および （ｂ）PDGFのＢ鎖のヌクレオチド配列からなるDNAまた
    はその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダ
    イズする核酸によってコードされる、ポリペプチド、 からなる群より選択され、 IRES（リボソーム内部エントリー部位）は、ウイルス、
    細胞、または合成起源のヌクレオチド配列であり、その
    ヌクレオチド配列は、リボソームの内部結合を仲介し、 C2は、PDGFのＡ鎖またはアナログ、またはそれらのフラ
    グメントをコードする遺伝子を含むシストロンであり、 ここで、該アナログは、以下： （ａ）PDGFのＡ鎖のアミノ酸配列における１または数個
    のアミノ酸の置換、欠失または付加によって、該PDGFの
    Ａ鎖から誘導される、ポリペプチド；および （ｂ）PDGFのＡ鎖のヌクレオチド配列からなるDNAまた
    はその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダ
    イズする核酸によってコードされる、ポリペプチド、 からなる群より選択され、 3'UTR（3'非翻訳領域）は、非翻訳ヌクレオチド配列で
    あり、 そして ポリＡは、ポリアデニル化シグナルであり、 ここで、C1、IRES、およびC2は、作動可能な様式で互い
    に連結されており、 ここで、該C1およびC2の産物が、マイトジェン活性を有
    するヘテロダイマーを形成し得る、 発現ユニット。
  2. 【請求項２】C1が、生物学的に活性なPDGF−Ｂ鎖をコー
    ドする、完全PDGF−Ｂ前駆体配列（配列番号:3）、その
    対立変異体、またはそれらのフラグメントを含むことに
    より特徴づけられる、請求項１に記載の発現ユニット。
  3. 【請求項３】C1が、サル肉腫ウイルス由来ｖ−sis遺伝
    子、または配列番号:3に記載の塩基対283から609を含む
    ことにより特徴づけられる、請求項２に記載の発現ユニ
    ット。
  4. 【請求項４】C2が、PDGF−AK（配列番号:1）またはPDGF
    −AL前駆体配列を含むことにより特徴づけられる、請求
    項１から３のいずれか１項に記載の発現ユニット。
  5. 【請求項５】前記IRESが、配列番号:5に記載のヌクレオ
    チド配列であることにより特徴づけられる、請求項１か
    ら４のいずれか１項に記載の発現ユニット。
  6. 【請求項６】前記IRESが、脳心筋炎ウイルス（EMV）の
    5'UTR、「サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス」（TME
    V）の5'UTR、「口蹄疫ウイルス」（FMDV）の5'UTR、
    「ウシ腸内ウイルス」（BEV）の5'UTR、「コクサッキー
    Ｂ型ウイルス」（CBV）の5'UTR、「ヒトライノウイル
    ス」（HRV）の5'UTR、「ヒト免疫グロブリン重鎖結合タ
    ンパク質」（BIP）5'UTR、ショウジョウバエアンテナペ
    ディア5'UTRまたはショウジョウバエウルトラビトラッ
    クス5'UTR、または上記配列の遺伝的ハイブリッドまた
    はそれ由来のフラグメントであることにより特徴づけら
    れ、ここで該遺伝的ハイブリッドまたはフラグメントが
    リボソームの内部結合を仲介する、請求項１から４のい
    ずれか１項に記載の発現ユニット。
  7. 【請求項７】作動可能な様式で発現制御配列に連結され
    た請求項１から６のいずれか１項に記載の発現ユニット
    を含む組換えDNAベクター。
  8. 【請求項８】請求項７に記載のベクターで形質転換され
    た哺乳動物細胞である、宿主細胞。
  9. 【請求項９】前記宿主細胞がCHOまたはBHK細胞であるこ
    とにより特徴づけられる、請求項８に記載の宿主細胞。
  10. 【請求項１０】前記細胞がBHK細胞であり、そして寄託
    番号DSM ACC 2045を有するクローン91−21−4Dに由来す
    ることにより特徴づけられる、請求項９に記載の宿主細
    胞。
  11. 【請求項１１】ヘテロダイマーrPDGF−ABを調製する方
    法であって、作動可能な様式で挿入された請求項１から
    ６のいずれか１項に記載の発現ユニットを保有している
    宿主細胞としての動物細胞が適切な培地で培養され、そ
    して生じる該rPDGF−ABが該細胞および該培地から分離
    されることにより特徴づけられる、方法。
  12. 【請求項１２】前記宿主細胞が請求項８から10のいずれ
    か１項に記載の細胞であることにより特徴づけられる、
    請求項11に記載の方法。
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