JPH08502884A - 哺乳動物細胞における複シストロンベクター系を用いるヘテロダイマーpdgf−abの調製 - Google Patents
哺乳動物細胞における複シストロンベクター系を用いるヘテロダイマーpdgf−abの調製Info
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Abstract
(57)【要約】
複シストロンベクター系による、哺乳動物細胞におけるPDGF-ABの組換え産物が開示されている。このベクター系では、IRES配列が第1シストロンと第2シストロンとの間に配置され、そしてB鎖コーディング遺伝子が第1シストロンに配置されている。開示された発現ユニットにより、Aポリペプチド鎖およびBポリペプチド鎖の等モル発現が可能になる。
Description
【発明の詳細な説明】
哺乳動物細胞における複シストロンベクター系を用いる
ヘテロダイマーPDGF-ABの調製
本発明は、宿主細胞として哺乳動物細胞で、本質的にホモダイマー夾雑産物PD
GF-AAおよびPDGF-BBを含まない、PDGF-ABの組換え調製物(rPDGF-AB)に関する
。
種々の原核細胞および真核細胞において、操作および遺伝子転移によって、遺
伝子がクローニングにより単離された個々のタンパク質を調製することが、長年
にわたって可能であった。適切な折り畳みおよびプロセシング、および、適切な
場合では、原核および下等真核発現系ではしばしば適切には行われない翻訳後の
改変もまた、多くのタンパク質の完全な生物学的活性を達成するために必要であ
る。この理由のために、しばしば、哺乳動物細胞が宿主として使用される。この
ことに加えて、哺乳動物細胞は、多量のタンパク質を分泌することができる。
種々の理由により、2つ以上のタンパク質鎖の同時調製が、しばしば要求され
る。例えば、多くの天然タンパク質は、その機能形態において、数個のサブユニ
ットから構成されている(例えば、抗体)。実際に、複合タンパク質の個々のサ
ブユニットの会合は、タンパク質合成後に行われる。細胞組織のその他の成分は
、触媒または制御要素として、しばしばこの会合に関与し、場合に応じて本来の
構造の折り畳みが起こ
る。会合の妨害は、例えば、個々の成分の一様でない合成により、形成されるべ
きタンパク質および宿主細胞の両方にとって、成果のあがらない結果になり得る
。実際に、この系は精巧な調節を必要とし、ほとんどの部分に対して細胞特異性
である。この調節は、遺伝子操作された細胞では一般的に調節されないので、下
記に説明されている代替法が開発され、数種の外来タンパク質の同時調製に使用
された:
1)遺伝子を、発現ベクター中に別々に組み込み、次に、適切な割合で細胞に共
転移する。このことは、いくつかのプラスミドコピーが、安定な様式で同時に取
り込まれ、分裂時に停留し続けることを前提にする。個々の遺伝子の互いの遺伝
子に対する発現割合は、コピー数および宿主細胞ゲノム中への組み込み部位の両
方に依存する。所望の割合で個々の遺伝子産物を発現する細胞クローンを単離す
ることは、精巧なスクリーニング法により可能である。
2)コピー数を一様にするために、個々の遺伝子を、1つのベクターの独立した
転写ユニットに配置する。これは、広範囲にわたり、遺伝子の化学量論的表現を
確実にするが、このプロセスはまた問題を有する。従って、同じ強度のプロモー
ターを有する発現ユニットが使用されても、異なるタンパク質をコードするmRNA
が、同じ安定性および翻訳効率を有することは、決して保証されない。2つの遺
伝子の転写効率が必ずしも同じである必要はない。この場合において、発現の化
学量論は、組換えDNA戦略により、段階的に(step-wise)生成
される(互いに関連する転写ユニットの配置、および、個々の要素の除去または
付加による、個々のプロモーターの強度の調節)。
3)複シストロンまたは多シストロンベクターは、個々の転写物のmRNAの安定性
に関連した問題を避けるために開発された。この目的のために、タンパク質鎖を
コードする遺伝子セグメント(シストロン)の個々の読み取り枠は、1つの転写
ユニット(発現ユニット)上に存在する。多シストロン遺伝子の発現は、1つの
プロモーターにより影響される。このようなベクター中の最初のシストロンは、
通常は非常に効率よく翻訳されるが、後続のシストロンは、シストロン間配列に
依存して翻訳される。単シストロン遺伝子の通常の5'非翻訳配列(5'UTR)が、
これらのシストロン間配列に使用される場合には、後続シストロンの発現は普通
非常に低い(概して、最初のシストロンの翻訳の約0.5から2%、Kaufmanら、1987
;Boelら、1987)。リーダー配列(高効率リーダー、HEL)を挿入することによ
り、この効率を約20%増すことが最初に可能となった。翻訳の内部開始を可能に
する特定の細胞配列およびウイルス配列(IRES;Jacksonら,1990)の発見およ
び使用により、最初のシストロンと後続のシストロンとの翻訳比を3:1に達成す
ることが続けて可能となった。
翻訳は、複シストロンベクターまたは多シストロンベクターの使用において重
要な役割を果たす。通常、翻訳は、「キャップ」依存機構に従って真核生物で開
始され、これにおい
て、タンパク質およびRNAからなる前開始複合休(pre-initiation complex)が
「キャップ」(メチル化ヌクレオチド)を有するmRNAの5'末端に構築される。こ
の点から、適切な翻訳開始コドンが捜し求められ、その位置から翻訳が開始され
る。このことは、前開始複合体が3'方向へmRNAに沿って移動する「スキャニング
」プロセスにより起こると考えられる。数種の例外を除き、5'末端に存在するシ
ストロンは、この様式で、いつも効率よく翻訳される(Kozak,1989)。後続の
全てのシストロンは、全く翻訳されないか、または非常に非効率的にのみ翻訳さ
れる。後続シストロンの翻訳効率を改良することは、遺伝子間の距離(シストロ
ン間領域;Kozak,1987;Wirthら、1991)の最適化、またはいわゆる「高効率リ
ーダー」配列(HEL、上記を参照のこと)により可能であった(例えば、Falcone
およびAndrews,1991、およびそこに援用されている参考文献)。HELは、「キャ
ップ」依存翻訳の開始を刺激する、遺伝子またはその他の配列の5'非翻訳領域で
ある。しかし、この種の構築物においてさえ、第2および後続シストロンで達成
され得る発現値は、「キャップ」依存様式で調節される第1シストロンの発現値
より、いつも明らかに低い。
近年発見された内部翻訳開始の機構は、特異的核酸配列を使用する。これらの
配列は、個々のピコルナウイルス(例えば、ポリオウイルスおよび脳心筋炎ウイ
ルス(PelletierおよびSonenberg,1988;Jangら、1988;Jangら、1989))およ
びある種の細胞タンパク質(例えば、BiP(MacejakおよびSarn
ow,1991))の非翻訳領域を含む。ピコルナウイルスては、いわゆるIRES(リボ
ソーム内部エントリー部位)である5'非翻訳領域の短いセグメントが、前開始複
合体の内部結合の原因となる。これに加えて、この領域からのさらなるセグメン
トが、この翻訳を効率よく開始するために必要である。従って、例えば、IRESの
上流400塩基対のみではなく、ピコルナウイルス非翻訳領域の5'末端部分もまた
効率的な翻訳に必要であることは明白である(SimoesおよびSarnow,1991)。他
方で、翻訳開始の通常の機構には不可欠である「キャッピング」は、対応するmR
NAの5'末端に存在するときには、ポリオウイルスIRESによる内部開始効率を減退
させる(HambridgeおよびSarnow,1991)。ネガティブ効果は、IRESが第2シス
トロンの開始の原因となる場合に避けられ、それは、シストロンが「キャップ」
とIRESとの間に存在するときである。
従って、IRES要素は、読み取り枠の効率的な翻訳のイニシエーターとして機能
し得る。これを行うとき、それらは、第1シストロンの「キャップ」依存翻訳に
対して影響を及ぼさない。さらに逆に、IRES依存開始におけるいかなる影響もま
た、「キャップ」依存翻訳開始には依存しないようである。2つのプロセスの機
構もまた、異なる細胞因子の使用において明らかに区別される(Meerovitchら、
1989;JangおよびWimmer,1990)。過去には、複シストロン発現プラスミドを使
用したいくつかの研究が公表された(Adamら、1991;Ghattasら、1991;Kaufman
ら、1991;Woodら、1991;Wirthら、199
1)。しかし、「キャップ」依存翻訳は、IRES依存翻訳より明らかに強いので、
2つのタンパク質鎖の化学量論的発現を達成することは不可能であった。従って
、今までの応用は、第2シストロンにおける選択マーカーの使用に集中していた
。選択マーカー発現物と、発現されるべき遺伝子の発現物(第1シストロンを構
成する)との近接カップリングは、高レベルの発現を選択するとき、特に前に遺
伝子増幅が必要である場合に、特に有利である。
しかし、複シストロンまたは多シストロン発現ベクターによる当モル量のタン
パク質の合成はまだ達成されていない。2つの異なるタンパク質鎖の当モル発現
は、血小板からの成長因子[「血小板由来成長因子」(PDGF)、ヒト血清中の主
要マイトジェンの1つ]の組換え調製に、特に重要である。ヒト血小板から精製
されたPDGFは、ジスルフィド架橋によって互いに結合される、2つの異なるが密
接に関連するポリペプチド鎖からなる。還元条件下では、ダイマーPDGFはそのモ
ノマーサブユニットに解離し、このサブユニットのうちより大きいサブユニット
(Mr 15-17,000 D)はPDGF-A鎖、そして小さなサブユニット(Mr 14,000 D)はP
DGF-B鎖と命名されている(Johnssonら、1984)。
PDGF-AおよびPDGF-Bタンパク質鎖は、異なる遺伝子によりコードされる。両遺
伝子産物の完全な構造を、cDNAクローニング法により解明することは可能となっ
た(Ratnerら、1985,Betsholtzら、1986)。これに関連して、両PDGF分子は、
非
常に長い前駆体分子として最初に合成され、続いて細胞内でプロセシングされて
成熟PDGF鎖を生じることが明らかになった。3'領域の69-bpセグメントの存在ま
たは不在により異なる、2つの異なるPDGF-A転写物は、別のスプライシングに基
づいて説明され得る(Betsholtzら、1986;Wiseら、1989)。この挿入は、コー
ディングセグメントに変化を生じさせ、その結果、PDGF-A鎖の短い変異体(PDGF
-AK、110アミノ酸)および長い変異体(PDGF-AL、125アミノ酸)が形成される。
両変異体は、平行して、通常の細胞タンパク質として検出され、より短い形態が
より頻繁に生じる種である(Matoskovaら、1989;Youngら、1990)。
2つの遺伝子は異なる染色体上に配置され、高度の相同性を示す。多くの研究
で、2つの遺伝子は、異なる調節機構に従属することが示されている。この結果
、実際に、2つのPDGF鎖は、互いに異なる割合で、別々の細胞型で産生される。
PDGFの可能な3つの異性体(AA、AB、およびBB)はすべて天然に存在し、血小
板中のいわゆるα顆粒中に蓄えられる。多量に形成するPDGF-ABヘテロダイマー
とは別に、約30%までのPDGF-BBもまた、成人ヒト血小板から単離され得る(Hamm
acherら、1988)。新しく調製された血小板もまた高い割合(27%)でPDGF-AAを
含有する(Hartら、1990)。従って、栓球前駆細胞、すなわち巨核球中では、2
つのホモダイマーを合わせた割合は、ABヘテロダイマーの割合にほぼ一致するこ
とが予測され得る。血小板中の各PDGF種の濃度は、創傷治癒
過程での個々の重要性に直接関連するので、最も頻繁に生じるイソ型、すなわち
PDGF-ABが、特に「創傷治癒ホルモン」の研究で重要視される。
各々の異なるイソ型は、インビトロで生物学的活性を有する。種々のPDGF種の
活性の異なるスペクトルを区別する、目指す比較研究を可能にしたのは、高度精
製の組換えPDGFイソ型を入手できるかどうかということのみであった(Hoppeら
、1989;Hoppeら、1990)。今までに、一連の研究により、走化性およびDNA増殖
テストにおけるPDGF-AA、PDGF-AB、およびPDGF-BBの能力の違い(Hosangら、198
9;Nisterら、1988;ReillyおよびBroski,1989;Siegbahnら、1990)、および
、イノシトール1,4,5-トリホスフェート遊離、ジアシルグリセロールの産生、お
よび[Ca2+]i移動におけるそれらの影響の差異(Blockら、1989;Sachinidisら
、1990 A,1990 B)が実証されている。2つの異なるPDGFレセプター群(PDGFα
レセプターは全PDGFイソ型に結合し、βレセプターはPDGF-BBのみに結合する、H
artら,1988;Heldinら,1988)は、PDGFイソ型の効果の相違が、それらの異な
るレセプター活性化能力により、いかに導き出され得るかに関してもっともらし
い説明を提供する。PDGFイソ型が測定可能であり、異なるインビトロ効果を有す
ることにより、2つの異なるレセプター群が実証されるとともに、PDGF-AA、PDG
F-AB、およびPDGF-BB活性のインビボスペクトルが異なるという結論が導き出さ
れる。この理由により、夾雑タンパク質としてPDGF-BBまたはPDGF-AAが存在
しない、純粋PDGF-ABの生産が望まれる。均質な、よく特徴づけられたヘテロダ
イマーを得るために、その点で、ホモダイマーが精製により完全に除去されなけ
ればならないが、この精製は、全PDGF種が非常に類似したクロマトグラフィー特
性を有することによりあまり役に立たない。
組換えPDGFホモダイマー(特にPDGF-BB)の調製のための一連の種々の経路が
、比較的長い間、ある程度知られていた(Kellyら、1985;Heldinら、1986;Hop
peら、1989;Beckmannら、1988;Bywaterら、1988;StroobantおよびWaterfield
1984)。高度に純粋なPDGF-ABの調製方法は、Hoppeらにより記載された(1990
,PCT/EP 90/00 063もまた参照のこと)。この方法では、個別のE.coli細胞で
別々に調製された不活性モノマーを、インビトロで復元して、生物学的に活性な
PDGF-ABに変換する。
AおよびB一本鎖の種々の長さにも関わらず、従来合成されていた3つのPDGFイ
ソ型の遺伝子産物は、広範囲にわたり互いに一致する生物学的活性を示す。
序論に掲載されている2つ(またはそれ以上)のタンパク質の同時発現の基準
は、真核生物系でのPDGF-ABヘテロダイマーの異種発現に適用する。組換えCHO細
胞でのPDGF-ABの調製
について以前に公表された戦略は、上記の2)で考察された例に相当し、ここでは
、両PDGF遺伝子は、独立した転写ユニットで1つのベクター上に配置されている
。この様式でCHO細胞
で発現された個々のPDGFダイマーの定量により、19% PDGF-A
8)。
両遺伝子の化学量論的説明だけではなく、最優先事項としてそれらの同等発現
もまた、真核発現系によるPDGF-ABヘテロダイマーの好ましい合成のための重要
な必須条件として考察されるべきである。この理由により、複シストロン発現ユ
ニットは、ヘテロダイマータンパク質およびこのPDGF-ABを発現するための可能
な補助物として、自身を提示する。この種の系もまた、PDGFの発現に関してWO 9
0/01550に記載されている。しかし、上記の3)により詳細に説明されているよう
に、これらの構築物は、第2(および、後続の)シストロンに対して非常に制限
された発現率でのみ得られる。第1シストロンに配置されたPDGF鎖に依存して、
この型のホモダイマーが優先的に形成される。その他の発現系を使用して真核細
胞で両PDGF遺伝子を発現するための、文献に以前記載された試みでは、ホモダイ
マー副産物の割合が30%以上の範囲になった。それにもかかわらず、これらの細
胞系を使用してPDGF-ABを得るためには、精密であって非常に浪費的な精製法が
使用されなければならない。
従って、本発明の目的は、いかなる認められ得るほどの夾雑物も伴わずに、PD
GF-ABがそれぞれのホモポリマーにより調製され得る発現系を作製することであ
る。
本発明に従って、それ自体公知の様式ではあるが、第1お
よび第2シストロン間のIRES配列を使用して、PDGF-Bをコードする遺伝子を第1
シストロンに導入する構築物を使用して、目的を達成し得た。驚くべきことには
、本発明に従って、これらの構築物によるトランスフェクションを行った後、宿
主細胞が、無視し得る程度の量のホモダイマーを含有したPDGF-ABを分泌するこ
とが分かった。それにより、続くタンパク質精製法の収量および有益性は、かな
り改良される。
従って、本発明は、宿主細胞としての哺乳動物細胞における、ヘテロダイマー
PDGF-ABの組換え調製のための複シストロン発現ユニットに関する。このユニッ
トは以下の一般式によって特徴づけられる。
p - 5'UTR - C1 - IRES - C2 - 3'UTR - ポリA
ここで、
pは、転写プロモーターであり、
5'UTRは、非翻訳ヌクレオチド配列であり、
C1は、PDGFのB鎖をコードする遺伝子、生物学的に活性なアナログ、またはそ
れらのフラグメントを含むシストロンであり、
IRESは、ウイルス、細胞、または合成起源のヌクレオチド配列であり、そのヌ
クレオチド配列は、翻訳段階で内部開始の原因となるヌクレオチド配列であり、
C2は、PDGFのA鎖をコードする遺伝子または生物学的に活性なアナログ、また
はそれらのフラグメントを含むシストロンであり、
3'UTRは、非翻訳ヌクレオチド配列であり、そして、
ポリAは、ポリアデニル化シグナルであり、
ここで、C1、IRES、およびC2は、作動可能な様式で互いに連結されている。
真核細胞中で有効な、すなわち、真核細胞中で遺伝子発現を開始し得る、それ
らの全てのプロモーターが、プロモーターとして適している。特に、ウイルス起
源(例えば、レトロウイルスの「長末端反復」(LTR)または単純ヘルペスチミ
ジンキナーゼプロモーター)、細胞起源(例えば、インターフェロンまたはユビ
キチンプロモーター)、または合成起源の構成および誘導プロモーターが使用さ
れ得る。SV40プロモーターが、本発明によれば好ましい。
5'UTRおよび3'UTRは、調節要素を含有し得る、任意の、原則として非翻訳のヌ
クレオチド配列である。本発明によれば、例えば、Arteltら(1988)によるSV40
からの配列が適している。
第1シストロンC1は、完全PDGF-B前駆体配列(配列番号:3)、そのアナログ
、および生物学的に活性なPDGF-B鎖をコードする任意のフラグメントを含み得る
。特に、PDGF-B鎖に相同であるv-sis遺伝子(サル肉腫ウイルス(SSV)の生成物
)、および、成熟PDGF-B鎖をコードする配列番号:3の283から609塩基対が、こ
れに関連して適している。
類似の様式で、第2シストロンC2は、長いまたは短いPDGF-A前駆体配列(PDGF
-ALまたはPDGF-AS - 配列番号:1)、および生物学的に活性なPDGF-A鎖をコー
ドする任意のフラグメン
トを含み得る。特に、成熟PDGF-A鎖をコードする配列番号:1の353から682塩基
対のフラグメントが適している。
リボソームの内部結合を仲介する、ウイルス、細胞、または合成起源の全ての
配列が、IRESとして使用され得る。このような配列の例は、配列番号:5のポリ
オウイルス1型由来のIRESであり、これは、ポリオウイルス1型の5'非翻訳領域
の最初の628ヌクレオチド、さらに、脳心筋炎ウイルス(EMV)の5'UTR、「サイ
ラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス」(TMEV)の5'UTR、「口蹄疫ウイルス」(FMDV
)の5'UTR、「ウシ腸内ウイルス」(BEV)の5'UTR、「コクサッキーB型ウイル
ス」(CBV)の5'UTR、または「ヒトライノウイルス」(HRV)の5'UTR、または「
ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質」(BIP)5'UTR、ショウジョウバエアン
テナペディア(Drosophila antennapediae)5'UTR、またはショウジョウバエウ
ルトラビトラックス(Drosophila ultrabithorax)5'UTR、または上記の配列の
遺伝子ハイブリッドまたはフラグメントを包含する。配列番号:5のポリオウイ
ルス1型由来のIRESが、本発明に従って好ましい。
さらに、本発明は、本発明の発現ユニットを含有する組換えDNAベクターに関
する。本発明に好ましいベクターは、図4Bに記載されており、その調製は図1
から3に記載されている。
さらに、本発明は、哺乳動物細胞であって、本発明の発現ユニットを有するベ
クターで形質転換される宿主細胞を包含
する。好ましくは、この細胞は、CHOまたはBHK細胞であり、後者が特に好ましい
。本発明に従って形質転換されたBHK細胞は、Deutsche Sammlung von Mikroorga
nismen und Zellkulturen GmbH(DSM)(German collection of microorganisms
and cell cultures)に、91-21-4Dの名称で、1992年8月11日(11.8.1992)に
寄託した。受託番号 DSM ACC2045が、それに対して割り当てられた。
これに加えて、本発明は、ヘテロダイマーrPDGF-ABを調製する方法を包含し、
その方法では、作動可能な様式で挿入された本発明の発現ユニットを保有する宿
主細胞としての哺乳動物細胞を適切な培地で培養し、生じたrPDGF-ABを細胞およ
び培地から分離する。哺乳動物細胞を培養するための公知の全ての培地が、培地
として適当である。この培地には、合成のタンパク質非含有または低タンパク質
含有産生培地が含まれる。4.5 g/lグルコースおよび5から10%のFCSを補充したDM
EM(ダルベッコの改変イーグル培地)が、本発明に好ましかった。
rPDGF-ABは、従来の方法により、細胞および培地から分離される(例えば、Os
tmanら、1988を参照のこと)。PDGF-AAのために開発された高度に有効な方法(E
ichnerら、1989)は、本発明によれば好ましく使用される。
最後に、本発明は、ホモダイマー夾雑産物を本質的に含まない、上記の宿主細
胞を本発明に従って培養することにより得られ得るヘテロダイマーrPDGF-ABに関
する。驚くべきこと
には、本発明の構築物で形質転換された宿主細胞が、形成されたPDGFの総量に基
づく純度90%以上でヘテロダイマーPDGF-ABを分泌することが明らかにされた。本
発明によれば、本発明の構築物で形質転換されたBHK細胞、例えば、German coll
ection of microorganisms and cell cultures(DSM)に、91-21-4Dの名称で、1
992年8月11日に寄託された細胞(受託番号 DSM ACC2045)を培養することによ
り得られるPDGF-ABが好ましい。
本発明のrPDGF-ABはその高純度により、従来から公知である組換えPDGF-ABと
は主として異なる。序論に述べたように、得られる産物の90%以上がヘテロダイ
マーからなるような組換え方法は、今までに記載されていない。ホモダイマーを
ヘテロダイマーから完全に分離することは実質的に不可能であるので、既知産物
は、必然的に3つの全イソ型の混合物となる。
このことに加えて、既知産物は、その調製法によって、多くの点で不都合であ
る。例えば、EP 259 632または288 307に記載のような、酵母細胞での異種遺伝
子発現は、グリコシル化パターンが、ヒト産物に比較して変化しているタンパク
質産物を導くことが知られている。さらに、酵母細胞で発現されたPDGF-Bは、少
なくとも一部はプロセシングが不完全であり、および/または、タンパク質分解
的に減成される(WO 92/01716を参照のこと)。従って、この種の産物は、種々
の炭水化物パターンを有し、タンパク質分解減成産物で夾雑される。前述の不都
合を避けるために、WO 92/01716には、グリコ
シル化の共通配列およびプロテアーゼ感受性ドメインが除去された改変PDGF鎖を
調製する方法が記載されている。しかし、この種の改変は、産物の生物学的活性
に影響する(WO 92/01716を参照のこと)。
本発明の特に好ましい実施態様では、ヘテロダイマーrPDGF-ABは、本発明に従
って形質転換されたBHK細胞を培養することにより、特に、受託番号DSM ACC2045
の91-21-4D宿主細胞を培養することにより得られる。
さらに、WO 90/08163は、細菌細胞、特にE.coliでのPDGF-ABの組換え調製を開
示しており、この調製は必然的に非グリコシル化産物を導く。しかし、この方法
によりE.coli細胞中で発現されたPDGF-B鎖は、アミノ末端の12アミノ酸で切断
されている。これに加えて、細菌からの産物はインビトロで復元されなければな
らないが、分子内および分子間での適切なジスルフィド架橋形成、およびタンパ
ク質の適切な折り畳みの方法が保証されないので、その結果、この産物の免疫学
的特性が変化され得、生物学的活性が影響を受け得る。
本発明のヘテロダイマーrPDGF-ABは、薬学的調製物として(特に創傷治癒用)
、薬学的に許容可能な(tolerated)補助剤および賦形剤と共に、好ましくは処
方される。これに関連して、それは、膏薬および創傷帯などの中で活性化合物と
して含有され得る。それは、特に局所塗布用に適しているが、その他の投与形態
にもまた適している。この他の投与形態では、その活性化合物が創傷中に導入さ
れるかまたは経皮投与され
る。例えば、PDGF-ABは、創傷周辺領域に、貯蔵機能を有する適切なマトリック
スで、皮下投与され得るか、または、直接皮下注射され得る。
さらに、本発明のrPDGF-ABは、化粧用調製物、例えば、皮膚再生、皮膚をなめ
らかにする、皮膚荒れまたは皮膚の加齢の予防、および日焼けの塗布用の製造に
適している。
適切な補助剤および賦形剤には、水ベースのセルロースゲル、生分解性ポリマ
ー、および任意の軟膏基剤およびクリーム基剤、およびスプレー剤が含まれる。
さらに、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、第XIII因子、線維芽細胞増殖因
子(aFGFおよびbFGF)、トランスフォーミング増殖因子αまたはβ型、上皮増殖
因子、インスリンまたは「インスリン様増殖因子」(IGF IおよびII)、または
別の増殖因子のような、創傷治癒に影響するさらなる活性化合物が、本発明の調
製物中に含有され得る。本発明の調製物はまた、例えば、水溶液状で創傷帯中に
存在し得る。
本発明は、実施例により以下に説明される。
1.図面の簡単な説明:
図1)基本ベクターpSBC-1およびpSBC-2の調製の模式図である。
図2)ベクターM13BCL1;c-sis(PDGF-B)に相同であるpMVW-2からの領域は、
ベクターマップ上に示されている。成熟
PDGF-BおよびNcoI/SalI(配列番号:8および9)アダプターの領域は、黒棒線
により強調している。
図3)完全PDGF-B前駆体配列の再構築の模式図である。
図4AおよびB)比較目的のために使用される複シストロンベクターpSBC-A/B
の構築の模式図(図4A)、および、基本ベクターpSBC-1およびpSBC-2からの本
発明の発現ベクターpSBC-PDGF-B/Aの構築の模式図(図4B)である。発現ベク
ターpSBC-PDGF-A/BおよびpSBC-PDGF-B/Aは、PDGF-AおよびPDGF-B鎖のコーディン
グcDNA配列の向きに基づいて、すなわち、それぞれに読み取り方向で第1または
第2シストロンとしてのそれらのプラスミド上の配置に基づいて、互いに異なっ
ている。
図5)形質転換BHK細胞のノーザンブロット分析である。実験は、単シストロ
ンまたは複シストロンのPDGF発現構築物で、安定にトランスフェクトされた全BH
K細胞プールからのmRNAで実施された。予測通り、単シストロンのmRNAは、約1,3
00 ntの大きさであり、一方、複シストロンのmRNAは、2つのPDGF鎖のコーディ
ング配列の大きさ(2,500ヌクレオチド)である。このことは、対応の遺伝子産
物は1つの複シストロンmRNAから読み取られることを実証する。ネズミαアクチ
ン試料をリファレンスとして使用した(Minty,A.J.ら、J.Biol.Chem.
256,1008-1014,(1981))。
図6)モノクローナルおよびポリクローナル抗PDGF抗体を使用した、PDGF-AB
の検出のためのサンドイッチELISAである。PDGF標準物からの検量線:
ポリスチレンプレートをヒツジ抗マウスIgGで被覆し、続いて、マウスハイブリ
ドーマ上清(クローン1B3由来、PDGF-ABおよびPDGF-BBのB鎖に対するモノクロー
ナル抗体を含有する)とインキュベートし;種々のPDGF標準物とインキュベーシ
ョンを行った後、結合PDGFを、ポリクローナルウサギ抗PDGF-AAで、次いでペル
オキシダーゼ標識抗ウサギIgGで検出した。
PDGF標準の材料源:
AB:ヒト血小板、PROMEGA Corp.No.G 5161から入手;
BB:酵母からの組換え体、PROMEGA Corp.No.G 5191から入手;
AA:BHK細胞からの組換え体、約70%純度(Eichnerら、1989)。真核生物起源のP
DGFを使用することにより、このアッセイでは、PDGF-BBとのわずかな交差反応を
伴うが、PDGF-AB(ヒト血小板由来)により特異的シグナルが与えられる。
図7)PDGF-AB-ELISAによる、組換えBHK細胞の培養上清中のPDGF-ABの検出で
ある(標準物からの検量線は図6を参照のこと)。表示試料は、以下のベクター
構築物でトランスフェクトされたBHK細胞由来である:
試料:No.1:pSBC-A/B
No.2:pSBC-B/A
No.3:pSBC-2-PDGF-A+pSBC-2-PDGF-B
No.4:pSBC-2-PDGF-A
No.5:pSBC-2-PDGF-B
No.6:pSBC-2-コントロール
図8)精製rPDGFのSDS PAGEによる分析である。試料を、SDS存在下の13.5%ポ
リアクリルアミドゲルで分離し、後にクーマシブルーで染色した。
1、6、11 = 分子量マーカー(PHARMACIA)[14400、20100、30000、43000、
67000、94000 D]
2 = pSBC-B/A
3 = pSBC-2-PDGF-A + pSBC-2-PDGF-B
4 = pSBC-A/B
5 = pSBC-2-PDGF-A
7-10 = 各々に10%(v/v)β-メルカプトエタノール(10分、95℃)を加
えた、2-5で使用した同じ配列
SDS-PAGEでの精製分泌産物の分析は、培養上清の分析からの結果と相関する(
表1)。特に、還元条件下で現れたPDGFモノマーのバンドからは、pSBC-2PDGF-A
+ pSBC-2-PDGF-B(共転移)およびpSBC-A/B(第1シストロン中のPDGF-A鎖)グ
ループのトランスフェクション細胞プールが優先的にPDGF-AAホモダイマーを分
泌することが明らかに理解され得る。
pSBC-B/A培養上清から単離され得るPDGFは、リファレンスとして適用したPDGF
-AAよりごくわずかに低い分子量にバンドを示した。還元条件下では、両モノマ
ーは、ほぼ等量で検出され得る。上方のバンドは、PDGF-A鎖のモノマーバンドに
相当する。BHK細胞からの組換えPDGF-AAについて、この物質が完全なPDGF-A鎖と
C末端が切断された種とから、ほぼ等しい割合で構成されることは、既に示され
ている(Eichnerら、1989)。
モノマーPDGF-A鎖は、約17 KDのMrにバンドを示す。同様に、pSBC-B/A上清か
ら単離された物質中で切断された形態で生じるPDGF-B鎖は、この下方(Mr 16 KD
)にバンドを示す。2つの鎖の亜種は、タンパク質配列分析により共に分析され
、PDGF-AおよびPDGF-Bとして明瞭に同定された。従って、PDGF-Bの分子量差は、
PDGF-Aの場合のように、C末端切断または改変グリコシル化パターンに起因する
と思われる。従って、pSBC-B/A上清からのPDGFは、ほぼ等量のPDGF-A鎖およびPD
GF-B鎖からなる。
リファレンスとして使用され、同様にBHK細胞中で発現されたPDGF-AAは、グリ
コシル化されていないが(Eichnerら、1989)、一方、CHO細胞で発現されたPDGF
は、約7%の炭水化物を含有する(Kolvenbachら、1991)。PDGF-AAホモダイマー
およびABヘテロダイマーの両方からのPDGF-Aモノマーは、SDS-PAGE上の移動に関
して互いに一致する。
2.複シストロンベクター系によるPDGF-ABヘテロダイマーの発現
2.1 基本ベクターpSBC-1およびpSBC-2の調製(図1)
ベクターpSBC-1を構築するために、プラスミドpGEM3-5'ポリオ(M)(Sarnow,
、1989)由来の627bpのMseI/BalIフラグメントを、以下のプライマーを使用する
PCRのテンプレートとして用いた:
増幅後に生成した652 bpフラグメントを、pol I Kで処理し、次に、PstIで切断
して、対応する様式で調製しておいたベクターpBEH(Arteltら、1988)に挿入し
た。
ベクターpSBC-2を構築するために、プラスミドpBEHをEcoRIで線状化し、以下
のオリゴヌクレオチド配列をハイブリダイズして挿入した:
2.2 完全PDGF-B前駆体配列の再構築
プラスミドpMVW-2は、ヒトPDGF-B遺伝子のcDNAを含有して
いるが、これは前駆体配列の5'-翻訳領域で不完全である(Weichら、1986)。真
正(authentic)PDGF-B前駆体を再構築するために、BclI切断部位を、クローンp
MVW-2のコーディングセグメントの30位でのC-T変換により、前駆体の5'末端領域
に導入した。最後に、この工程の結果としてコーディング領域の短いセグメント
のみを消失し、局部的にコードされたアミノ酸(アスパラギン酸)が保存されて
いる。ほとんどのE.colI株では、BclI切断部位は、メチル化の結果、酵素切断に
対して抵抗性であるので、この切断部位を有するフラグメントは、dam-株に再ク
ローニングされるか、または別にPCR工程で増幅されなければならない。次に、
前駆体の欠失領域を、合成SalI/BclIフラグメント[オリゴマーPPDGFB1およびPP
DGFB2(配列番号:11および12)]として挿入する。
この目的のために、pMVW-2由来の914bpのBamHI/NcoIフラグメントを、まず、B
amHI/SalI切断バクテリオファージM13mp19(Pharmacia)に、合成アダプター[
オリゴマーNCCLSA1およびNCCLSA2(配列番号:8および9)]により挿入した。
この構築物は、次のインビトロでの変異誘発工程に必要な一本鎖DNを提供した。
この工程は、Ecksteinらの方法に基づいて、Amershamのオリゴマー特異的インビ
トロ変異誘発系(2型)を用いて実施した[Taylor J.W.,Ott J.およびEckste
in F.(1985)Nucl.Acids Res.13,8764-8785;Nakamaye K.およびEckstein
F.(1986)Nucl.Acids Res.14,679−9698;Sayers J.R.,Schmidt W.およ
びEckstein F.(1988)Nucl.A
cids Res.16,791-802]。変異誘発後に、合成プライマー[PDGBBCL(配列番号
:10)]を用いて、配列番号:3に示されている配列の144位で塩基変換(Cから
Tに)を行い、それにより、PDGF-B前駆体の5'領域にBClI切断部位を導入する。
この変異誘発誘導体はM13BCL1と称した(図2)。
M13BCL1由来の1100bpフラグメントを、プライマーM1317MERおよびM1324MER(
配列番号:6および7)を用いてPCR工程で増幅し、次に、BclI/HindIII制限酵
素処理にかけ、得られた770 bpフラグメントを単離した。合成オリゴマーPPDGFB
1およびPPDGFB2(配列番号:11および12)は、BclI切断部位までのPDGF-B前駆体
の欠失5'領域を形成する。アニーリング後、この二本鎖オリゴマーを770 bp PDG
F-Bフラグメントとともに、ベクターpGEM-2(Promega)に連結した。これは、Sa
lI/HindIIIでの制限酵素処理により予め調製しておいた(図3)。PDGF-Bの真正
配列を、完全に配列分析することにより実証した。
2.3 PDGF-AおよびPDGF-B鎖に対する複シストロン発現ベクターpSBC-PDGF-A/Bお よびpSBC-PDGF-B/Aの構築(図4AおよびB)
1.2に記載したように、PDGF-B前駆体の完全コーディングcDNA(Ratnerら、198
5)は、ベクターpGEM2-PDGF-B中に存在する。PDGF-A鎖の短い変異体の完全cDNA
配列(Betsholtzら、1986)は、発現ベクターpODA(Eichnerら、1989)中に含ま
れている。このベクターは、pPGF-1由来のRsalフラグメント(Hoppeら,1987)
をSV40発現ベクターpBEH(Arteltら、1988)に
クローニングして得た。
PDGF-AおよびPDGF-B鎖をコードするcDNA配列を、EcoRI/HindIII制限酵素処理
により、単シストロンベクターpSBC-1およびpSBC-2に挿入した(図4)。複シス
トロン発現ユニットを形成するための2つのベクターの融合を、制限酵素XmnI/N
otIを用いて実施した。
2.4 形質転換BHK細胞の調製
単シストロンおよび複シストロン発現ベクター(これらはPDGFのA鎖およびB鎖
のコーディング配列を有する(図1、4A+Bを参照のこと))をリン酸カルシ
ウム沈降法によりBHK細胞にトランスフェクトした(Wiglerら,1979;Grahamお
よびvan der Eb,1973)。トランスフェクションの前日に、2〜3×105BHK細胞
/24cm2を新しい培養フラスコに移し、トランスフェクションの4時間前に、DME
培地を用いて培地の交換を行った。5μgの上述のプラスミドDNAを、0.5μgの選
択プ
ら,1986、これらはそれぞれネオマイシン耐性遺伝子およびプロマイシン耐性を
コードしている)と共に250μlの250mMCaCl2中に懸濁した。この溶液を、無菌ガ
ス中に吹き付けて連続的に撹拌しながら、250μlの2×HEPES緩衝液(280mM NaC
l;50mM HEPES;1.5mM NaH2P04,pH7.1)にゆっくりと添加し、次いで生じた沈
殿物を栄養培地に加えた。トランスフェクションの2日後、安定してトランスフ
ェクトした細胞の選
択を、DME培地から2倍選択培地(5μg/mlプロマイシン;500μg/ml G418、Wir
thら,1988)に培地を交換することにより開始し、そしてPDGF分泌細胞クローン
群を得た。これらの細胞の代表的なクローン混合物を、DSM ACC2045の番号で、1
992年8月11日にDSMに寄託した。
2.5 ノーザンブロット分析
形質転換BHK細胞由来のポリアデニル化RNAをPurchioら(1979)の方法により
単離し、1%アガロースホルムアルデヒドゲル(Lehrachら,1977)上で分画し
、ナイロン膜上にブロッティングし、そして[32P]標識PDGF-AおよびPDGF-B鎖
特異的プローブとハイブリダイズした(図5)。
2.6 馴化細胞培養上清の調製
BHK細胞を2.4と類似のようにして形質転換した。コロニー数を数えた後、細胞
をトリプシン処理し、新鮮な選択培地に採取し、そして細胞数を105細胞/mlにま
で調整した。各場合において、この細胞懸濁液10mlを底面積65cm2のフラスコに
移し、さらに48時間培養した。次いで培地を除去し、播種した細胞をPBSで2回
洗浄し、そして培地を10mlの産生培地(DHEM、血清および選択抗生物質を含まな
い)と取り替えた。24時間後、培地を取り去り、血清含有選択培地と取り替えた
。採取した上清を分析まで-20℃で保存した。採取する時、フラスコ当たりの細
胞数は0.8〜1.2×107であった。
2.7 マイトジェン試験を用いる培養上清中のPDGFの検出
PDGFのマイトジエン活性は、密度阻止線維芽細胞におけるDNA合成速度の刺激
を測定することにより決定され得る。この試験においてイソ型間を区別し得ない
。
このアッセイは、Shipleyら(1984)に従ってAKR-2Bマウス線維芽細胞を用い
て24ウエルプレート中で行った。この試験では、純粋PDGFでは、約5ng/mlの濃
度で半最大刺激を示した。この値を生産性を決定するために用いた。マイトジェ
ン試験の結果を、図7においてPDGF-AB ELISAからの値と比較する。
2.8 特定のPDGF-AB ELISAを用いる培養上清におけるPDGF-ABヘテロダイマーの 検出
「2抗体サンドイッチアッセイ」を、PDGF-AAおよびPDGF-BBの存在下でのPDGF
-ABの明確な定量が可能なように構成した。
モノクローナル抗PDGF抗体およびポリクローナル抗PDGF抗体を用いるサンドイッ
チアッセイ:
96ウエルのポリスチレンプレート(Dynatechから入手、U-Platte,No.M124B
)を以下の順にコーティングする(各場合において、各工程間0.05%Tween 20を
含むPBSで4回洗浄する)。
1)ヒツジ抗マウスIgG(Boehringer Mannheimから入手、No.1097 105)、3μ
g/ml。
2)1%BSA(E.Merckから入手,No.12018、PBS中)、pH7.5、100μlを室温で
1時間。
3)クローン1B3由来のマウスハイブリドーマ上清[SP2/O-骨髄腫細胞を、組換
えPDGF-AB(Hoppeら(1990)に従ってE.coliから得た)で免疫したマウス由来
の脾臓細胞と融合することにより得られる]、2μg/ml IgG2a/ml。モノクロー
ナル抗体はPDGFダイマーのB鎖に特異的に結合する。
4)0.1%BSAおよび0.05%Tween 20を含有するPBS(PBS+)中に希釈したPDGF含
有溶液の50μlを室温で1時間。
5)ポリクローナルウサギ抗PDGF-AA-IgG(Genzymeから入手、No.ZP-214、これ
はPDGFダイマーのA鎖に結合する)、PBS+中2μg/mlのうちの50μlを室温で1
時間。
6)POD標識ヤギ抗ウサギIgG(Pierceから入手、No.31460)、PBS+中0.1μg/ml
のうちの50μlを室温で1時間。E.S.BOSら(J.Immunoassay 2(1981),187-
204)に従って基質テトラメチルベンジジンを用いる検出。
2.8.1 結果:
組換えBHK細胞の培養上清由来のPDGFの3つの異なる分析の結果を図7に示す
。
マイトジェン試験は、異なるイソ型(PDGF-AA、PDGF-AB)またはPDGF-BB)間
で差異を生じることなく、培養上清中に存在するrPDGFの全量に対する有用な値
を提供する。
ヘテロダイマーPDGF-ABの特定比は、PDGF-AB特異的ELISAによって十分に高精
度で決定され得る。PDGFホモダイマーの百分率比は、マイトジェン試験の結果と
この後者の分析の結果
との間の差異から計算され得る(表1)。
ELISAの結果により、pSBC-PDGF-B/A型のトランスフェクトした細胞系由来の培
養上清においてのみ、マイトジェン試験における測定可能な生物学的活性が高い
PDGF-AB値に関連することが示される。
2.9 分泌PDGF-ABの精製
細胞培養物上清からrPDGF-AAを精製するために開発されたプロセス(Eichner
ら,1989)を用いて、種々のトランスフェクション細胞プール由来の馴化培養物
上清1.5〜2.5リットルから分泌産物を精製した。HPLC工程後で高度にまたは部分
的に精製されたPDGFを、SDSの存在下でLaemmli(1970)ポリアクリルアミドゲル
上で分画し、続くクーマシーブルーでの染色後分析した(図8を参照のこと)。
2.10 PDGFポリペプチドのアミノ末端配列決定
この場合において切断されプロセシングされた形態の1つのPDGF鎖のみが存在
し得るという可能性を取り除くために、タンパク質配列分析により、2つのPDGF
鎖を明瞭に同定することを目的とした(図8を参照のこと)。
BLOTT1サイクルを用いる477Aモデル(Applied Biosystems)で自動化配列分析
を行った。フェニルチオヒダントインアミノ酸誘導体を、オンラインでつながっ
ている120A PTHアナライザーで分析した。
試料のジスルフィド架橋をジチオトレイトールで還元し、4−ビニルピリジン
でアルキル化する。次いで、記載(Westermeierら,SD 092/89,Pharmacia LKB
Biotechnology)のよう
ゲル上で分離する。試料を、記載のような不連続緩衝系(Westermeierら,SDRE-
072、Pharmacia LKB Riotechnology)を用いてPVDF膜(Problot、Applied Biosy
stems)上にブロッティングし、次いでクーマシーブリリアントブルーR250で染
色する。17kDおよび16kDの2つの二重バンドを切り出し、共に配列決定する。
タンパク質決定付けの結果に基づいて、10μgの試料を分析した。PDGF-A鎖お
よびPDGF-B鎖のN末端アミノ酸を等量で検出することができた(表2)。夾雑配
列は検出されなかった。
略語
BHK − ハムスター細胞系(ベビーハムスター腎臓)
bp − 塩基対
CHO − ハムスター細胞系(チャイニーズハムスター卵巣)
BSA − ウシ血清アルブミン
D − ダルトン
DMEM − ダルベッコの改変イーグル培地
ELISA − 酵素結合免疫吸着アッセイ
HEPES − 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタン-
スルホン酸
HPLC − 高圧液体クロマトグラフィー
IgG − Gクラス免疫グロブリン
IRES − リボソーム内部エントリー部位
nt − ヌクレオチド
PAGE − ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PBS − リン酸緩衝化塩化ナトリウム溶液
PCR − ポリメラーゼ連鎖反応
PDGF − 血小板由来成長因子
POD − ペルオキシダーゼ
PVDF − ポリビニリデンフルオライド
SDS − ドデシル硫酸ナトリウム
UTR − 非翻訳領域
配列表
(1)一般的情報:
(i)出願人:
(A)氏名:バイアースドルフ アーゲー
(B)番地:ウナシュトラーセ 48
(C)市:ハンブルク
(E)国:ドイツ連邦共和国
(F)郵便番号:20253
(A)氏名:ゲーベーエフ−ゲゼルシャフト フュア ビオテヒノロギ
ッシェ フォルシュング エムベーハー
(B)番地:マシェローダー ベーク 1
(C)市:ブラウンシュバイク
(E)国:ドイツ連邦共和国
(F)郵便番号:38124
(ii)発明の名称:哺乳動物細胞における複シストロンベクター系を用いる
ヘテロダイマーPDGF-ABの調製
(iii)配列数:16
(iv)コンピューター読み出し形態:
(A)媒体型:フロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PC互換
(C)OS:PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア:パテントインリリース#1.0,バージョン#1.25(E
PA)
(2)配列番号:1の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:748塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(vi)起源:
(A)生物名:ホモサピエンス
(vii)直接の起源:
(B)クローン名:pODA(Eichnerら、1989)
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:95..682
(D)他の情報:/産物=「PDGF-A前駆体配列(短いスプライシング形態
)」
/注記=「末端が5'-EcoRIおよび3'-HindIII制限切断部
位であるpODA由来のヒトPDGF-A遺伝子(短いスプライ
シング形態[2])」
/出典=([2])
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:mat_peptide
(B)存在位置:353..682
(D)他の情報:/産物=「成熟PDGF-A鎖」
(x)公開情報:
(A)著者:Eichner,W.
Jaeger,V.
Herbst,D.
Hauser,H.
Hoppe,J.
(C)刊行物:Eur.J.Biochem.
(D)巻:185
(F)頁:135-140
(G)日付:1989
(x)公開情報:
(A)著者:Hoppe,J.
Schumacher,L.
Eichner,W.
Weich,H.A.
(C)刊行物:FEBS Lett.
(D)巻:223
(F)頁:243-246
(G)日付:1987
(xi)配列:配列番号:1:
(2)配列番号:2の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:196アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号:2:
(2)配列番号:3の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:868塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(vi)起源:
(A)生物名:ホモサピエンス
(vii)直接の起源:
(B)クローン名:pMVW-2(Weichら、1986)
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:40..762
(D)他の情報:/産物=「PDGF-B前駆体配列」
/注記=「末端が5'-EcoRIおよび3'-HindIII制限切断部
位であるpGEM2-PDGF-B由来のヒトPDGF-B遺伝子」
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:mat-peptide
(B)存在位置:283..609
(D)他の情報:/産物=「成熟PDGF-B鎖」
(x)公開情報:
(A)著者:Weich, H. A.
Sebald,W.
Schairer,H.U.
Hoppe,U.
(C)刊行物:FEBS Lett.
(D)巻:198
(F)頁:344-348
(G)日付:1986
(xi)配列:配列番号:3:
(2)配列番号:4の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:241アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号:4:
(2)配列番号:5の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:628塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(vi)起源:
(A)生物名:ポリオウイルス(Poliovirus)1型(Mahoney株)
(vii)直接の起源:
(B)クローン名:pGEM 3-5'ポリオ(M)(4708 bp),(Sarnow,1989
)
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:-
(B)存在位置:1..628
(D)他の情報:/注記=「ポリオウイルス1型(Mahoney)の5'非翻訳領
域の最初の628ntが示されている」
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:-
(B)存在位置:610
(D)他の情報:/注記=「610位で塩基対がCからGに置換されている非正
配列」
(x)公開情報:
(A)著者:Sarnow, P.
(C)刊行物:J.Virol.
(D)巻:63
(F)頁:467-470
(G)日付:1989
(xi)配列:配列番号:5:
(2)配列番号:6の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:17塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:-
(B)存在位置:1..17
(D)他の情報:/標識=M1317MER
/注記=「合成DNA;PCRに用いたM13配列決定用プライマ
ー(New England Blolabs GmbH)」
(xi)配列:配列番号:6:
(2)配列番号:7の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:24塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:-
(B)存在位置:1..24
(D)他の情報:/標識=M1324MER
/注記=「合成DNA;PCRに利用したM13逆配列決定用プラ
イマー(New England Biolabs GmbH)」
(xi)配列:配列番号:7:
(2)配列番号:8の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:19塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:-
(B)存在位置:1..19
(D)他の情報:/標識=NCCLSAI
/注記=「合成DNA;pMVW-2由来の短縮したPDGF-B前駆体
を、バクテリオファージM13mp19中で再クローニング
するための合成リンカー」
(xi)配列:配列番号:8:
(2)配列番号:9の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:19塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:-
(B)存在位置:1..19
(D)他の情報:/標識=NCCLSA2
/注記=「合成DNA;pMVW-2由来の短縮したPDGF-B前駆体を
、バクテリオファージM13mp19中で再クローニングする
ための合成リンカー」
(xi)配列:配列番号:9:
(2)配列番号:10の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:37塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:-
(B)存在位置:1..37
(D)他の情報:/標識=PDGBBCL
/注記=「合成DNA;BclI-切断部位を、PDGF-B前駆体の5'
-領域に挿入するための突然変異誘発プライマー」
(xi)配列:配列番号:10:
(2)配列番号:11の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:110塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:-
(B)存在位置:1..110
(D)他の情報:/標識=PPDGFB1
/注記=「合成DNA;成熟PDGF-B前駆体配列の再構成のた
めの合成リンカー」
(xi)配列:配列番号:11:
(2)配列番号:12の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:110塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:-
(B)存在位置:1..110
(D)他の情報:/標識=PPDGFB2
/注記=「合成DNA;成熟PDGF-B前駆体配列の再構成のた
めの合成リンカー」
(xi)配列:配列番号:12:
(2)配列番号:13の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:30塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:-
(B)存在位置:1..30
(D)他の情報:/標識=5'-POLIO1
/注記=「合成DNA;合成PCRプライマー」
(xi)配列:配列番号:13:
(2)配列番号:14の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:28塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:-
(B)存在位置:1..28
(D)他の情報:/標識=3'-POLI02
/注記=「合成DNA;合成PCRプライマー」
(xi)配列:配列番号:14:
(2)配列番号:15の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:13塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:-
(B)存在位置:1..13
(D)他の情報:/標識=E-N-E1
/注記=「合成DNA;合成リンカー」
(xi)配列:配列番号:15:
(2)配列番号:16の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:13塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:-
(B)存在位置:1..13
(D)他の情報:/標識=E-N-E2
/注記=「合成DNA;合成リンカー」
(xi)配列:配列番号:16:
【手続補正書】特許法第184条の8
【提出日】1994年3月7日
【補正内容】
【図1a】
【図1b】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図4A/1】
【図4A/2】
【図4B/1】
【図4B/2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
C07K 14/49 8318−4H
19/00 8318−4H
C12N 5/10
C12P 21/02 H 9282−4B
//(C12N 5/10
C12R 1:91)
(C12P 21/02
C12R 1:91)
9455−4C A61K 37/24 ADT
(C12N 5/00 B
C12R 1:91)
(72)発明者 アハターベルク,フォルカー
ドイツ連邦共和国 デー―20257 ハンブ
ルク,アイムスビュッテラー マルクトプ
ラッツ 11
(72)発明者 デルシュナー,アルブレヒト
ドイツ連邦共和国 デー―20357 ハンブ
ルク,シャンツェンシュトラーセ 107
(72)発明者 マイヤー−インゴルト,ヴォルフガング
ドイツ連邦共和国 デー―22457 ハンブ
ルク,アム ハーゼンカンプ 29
(72)発明者 ミエルケ,ハイコ
ドイツ連邦共和国 デー―21629 ノイ
ブルムストルフ,フィッシュベカー シュ
トラーセ 22
(72)発明者 ディルクス,ヴィルヘルム
ドイツ連邦共和国 デー―38106 ブラウ
ンシュバイク,ビェルテンヴェク 13
(72)発明者 ヴィルト,マンフレート
ドイツ連邦共和国 デー―38300 ヴォル
フェンビュッテル,マルクトシュトラーセ
1
(72)発明者 ホイザー,ハンスエルク
ドイツ連邦共和国 デー―38104 ブラウ
ンシュバイク,ゲオルク―ヴェスターマン
アレー 29
【要約の続き】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.以下の一般式により特徴づけられる、宿主細胞としての哺乳動物細胞にお けるヘテロダイマーPDGF-AB(血小板由来成長因子)の組換え調製のための複シ ストロン発現ユニット: p - 5'UTR - C1 - IRES - C2 - 3'UTR - ポリA ここで、 pは、転写プロモーターであり、 5'UTR(5'非翻訳領域)は、非翻訳ヌクレオチド配列であり、 C1は、PDGFのB鎖をコードする遺伝子、生物学的に活性なアナログ、またはそ れらの生物学的に活性なフラグメントを含むシストロンであり、 IRES(リボソーム内部エントリー部位)は、ウイルス、細胞、または合成起源 のヌクレオチド配列であり、そのヌクレオチド配列は、翻訳段階で内部開始の原 因となるヌクレオチド配列であり、 C2は、PDGFのA鎖をコードする遺伝子または生物学的に活性なアナログ、また はそれらの生物学的に活性なフラグメントを含むシストロンであり、 3'UTR(3'非翻訳領域)は、非翻訳ヌクレオチド配列であり、 そして、 ポリAは、ポリアデニル化シグナルであり、 ここで、C1、IRES、およびC2は、作動可能な様式で互いに連結されている。 2.C1が、生物学的に活性なPDGF-B鎖をコードする、完全PDGF-B前駆体配列( 配列番号:3)、その対立変異体、またはそれらのフラグメントを含むことによ り特徴づけられる、請求項1に記載の発現ユニット。 3.C1が、サル肉腫ウイルス由来v-sis遺伝子、または配列番号:3に記載の 塩基対283から609を含むことにより特徴づけられる、請求項2に記載の発現ユニ ット。 4.C2が、PDGF-AK(配列番号:1)またはPDGF-AL前駆体配列を含むことによ り特徴づけられる、請求項1から3に記載の発現ユニット。 5.前記IRESが、配列番号:5に記載のヌクレオチド配列であることにより特 徴づけられる、請求項1から4に記載の発現ユニット。 6.前記IRESが、脳心筋炎ウイルス(EMV)の5'UTR、「サイラーのネズミ脳脊 髄炎ウイルス」(TMEV)の5'UTR、「口蹄疫ウイルス」(FMDV)の5'UTR、「ウシ 腸内ウイルス」(BEV)の5'UTR、「コクサッキーB型ウイルス」(CBV)の5'UTR 、「ヒトラ イノウイルス」(HRV)の5'UTR、「ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質」( BIP)5'UTR、ショウジョウバエアンテナペディア5'UTRまたはショウジョウバエ ウルトラビトラックス5'UTR、または上記配列の遺伝的ハイブリッドまたはそれ 由来のフラグメントであることにより特徴づけられ、ここで該遺伝的ハイブリッ ドまたはフラグメントがリボソームの内部結合を仲介する、請求項1から4に記 載の発現ユニット。 7.作動可能な様式で発現制御配列に連結された請求項1から6に記載の発現 ユニットを含む組換えDNAベクター。 8.請求項7に記載のベクターで形質転換された哺乳動物細胞である、宿主細 胞。 9.前記宿主細胞がCHOまたはBHK細胞であることにより特徴づけられる、請求 項8に記載の宿主細胞。 10.前記細胞がBHK細胞であり、そして寄託番号DSM ACC 2045を有するクロ ーン91-24-4Dに由来することにより特徴づけられる、請求項9に記載の宿主細胞 。 11.ヘテロダイマーrPDGF-ABを調製する方法であって、作動可能な様式で挿 入された請求項1から6に記載の発現ユニットを保有している宿主細胞としての 動物細胞が適切な培 地で培養され、そして生じる該rPDGF-ABが該細胞および該培地から分離されるこ とにより特徴づけられる、方法。 12.前記宿主細胞が請求項9から11に記載の細胞であることにより特徴づ けられる、請求項11に記載の方法。 13.ホモダイマー夾雑産物を本質的に含まない、ヘテロダイマーrPDGF-ABで あって、作動可能な様式で連結された請求項1から6に記載の発現ユニットを保 有する宿主細胞としての哺乳動物細胞を適切な培地で培養し、そして生じた該rP DGF-ABを該細胞および該培地から分離することにより得られる、ヘテロダイマー rPDGF-AB。 14.ホモダイマー夾雑産物を本質的に含まない、ヘテロダイマーrPDGF-ABで あって、作動可能な様式で連結された請求項1から6に記載の発現ユニットを保 有する宿主細胞としてのBHKまたはCHO細胞を適切な培地で培養し、そして生じた 該rPDGF-ABを該細胞および該培地から分離することにより得られる、ヘテロダイ マーrPDGF-AB。 15.ホモダイマー夾雑産物を本質的に含まない、ヘテロダイマーPDGF-ABで あって、作動可能な様式で連結された請求項1から6に記載の発現ユニットを保 有している請求項10に記載の宿主細胞を適切な培地で培養し、そして生じた該 rP DGF-ABを該細胞および該培地から分離することにより得られる、ヘテロダイマー PDGF-AB。 16.薬学的に許容可能な補助剤および賦形剤とともに請求項13から15に 記載のrPDGF-ABを含む薬学的調製物。 17.軟膏、ゲル剤、スプレー剤、膏薬、創傷帯、または傷の手当用品である 、請求項16に記載の薬学的調製物。
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PCT/EP1993/002295 WO1994005786A1 (de) | 1992-08-27 | 1993-08-26 | Herstellung von heterodimerem pdgf-ab mit hilfe eines bicistronischen vektorsystems in säugerzellen |
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