KR20230017876A - 망막 색소 상피 및 광수용체의 이중층 및 이의 용도 - Google Patents

망막 색소 상피 및 광수용체의 이중층 및 이의 용도 Download PDF

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KR20230017876A
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앤드류 디아스
에리히 베른트
루카스 체이스
주안 아마랄
아비다스 마미니시키스
카필 바르티
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후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드
더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카, 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬스 앤드 휴먼 서비시즈
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Abstract

본원에서는 광수용체 세포 및/또는 광수용체 전구체 세포(PR/PRP)를 갖는 망막 상피 세포 (RPE)의 별개의 이중층 배양물을 제조하는 방법이 제공된다. 본원에서는 추가로 RPE 및 PR/PRP 이중층의 이식을 포함하는 치료요법 및 이중층을 사용하는 후보 약물을 시험하기 위한 방법이 제공된다.

Description

망막 색소 상피 및 광수용체의 이중층 및 이의 용도
우선권 주장
[0001] 본 출원은 2020년 5월 29일로 출원된 미국 가출원 번호 제63/032,346호에 대한 우선권을 주장하고, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
공동 연구 계약 협정의 당사자
[0002] 본 발명은 본 발명이 만들어질 당시 유효한 공동 연구 협정의 범위 내에서 착수된 활동의 결과로 이루어졌다. 상기 공동 연구 협정의 당사자는 미국 정부, 국가 눈 연구소에 의해 대표되는 보건 국가 연구소, 보건 국가 연구소의 연구소 및 후지필름 셀룰라 다이나믹스 인터내셔널 인크이다.
1. 분야
[0003] 본원의 개시내용은 일반적으로 줄기 세포 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 이는 광수용체(PR) 및/또는 광수용체 전구체(PRP) 세포와 망막 상피 세포(RPE)의 이중층을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
2. 관련 분야의 기재
[0004] 연령 관련 황반 변성(AMD)은 2016년부터 미국에서 1,100만명, 전 세계적으로 1억 7,000만명에게 영향을 미치는 쇠약 상태이며, 전 세계 유병률은 2020년에는 1억 9,600만명에 이를 것으로 예상된다(문헌참조: Pennington and DeAngelis, 2016; Wong et al., 2014). 이의 원인은 망막 색소 상피(RPE)의 기능부전으로 추정되고, 이는 광수용체의 사멸 및 기능부전으로 이어진다(문헌참조: Bhutto and Lutty, 2012). RPE를 사용하는 세포 치료요법은 AMD, 근시성 황반 변성 또는 희귀한 형태의 유전성 황반 변성을 치료하는 데 효과적일 수 있고, 현재 시각 기능을 회복하기 위해 여러 줄기 세포 기반 임상 시험이 진행 중이며 계획되어 있다(문헌참조: Oner, 2018). AMD는 실명의 가장 흔한 원인 중 하나이지만, 망막 색소변성증, 원추형-간상 이영양증, 레버 선천성 흑암시와 같은 다른 기능부전은 주로 광수용체 기능부전에 의해 유발되고 광수용체(PR) 이식으로 해결할 수 있다(문헌참조: Barnea-Cramer et al., 2016; Zhou et al., 2015; Zhao et al., 2017).
[0005] 광수용체는 광 감지를 담당하는 외부 분절을 연장한다. RPE 세포는 흘린 외부 분절 및 기타 광수용기 파편의 재활용을 지원하고 전반적인 광수용체 건강을 지원한다(문헌참조: Strauss, 2005). 따라서, 이중층 배양 치료요법으로서 RPE와 PR 및/또는 PRP(본원에서는 PR/PRP라고 함)둘다의 전달은 RPE 또는 광수용체 기능부전의 상태를 치료할 수 있는 잠재적인 기회이고, 어느 한 세포 유형의 전달보다 더 광범위하게 관련 응용이 가능하다. 또한, RPE와 PR/PRP 사이의 공생 관계는 이러한 치료를 보다 효과적이게 할 수 있다. 따라서, 이러한 질환의 치료를 위해 PR/PRP 및 RPE 세포로 구성된 이중층 배양 치료요법에 대한 요구가 충족되지 않고 있다.
발명의 개요
[0006] 제1 구현예에서, 본원의 개시내용은 생분해성 스캐폴드상에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)와 함께 광수용체 전구체 세포 (PRP) 및/또는 광수용체 세포 (PR)을 포함하는 조직 대체 이식체를 제공한다. 특정 양상에서, 이식체는 한정되고, 제노-프리(xeno-free) 및 피더-프리(feeder-free)이다.
[0007] 일부 양상에서, RPE는 베스트로핀-1(BEST1) 및/또는 ZO-1을 발현하는 성숙한 RPE이다. 특정 양상에서, RPE는 양극화된다.
[0008] 특정 양상에서, PR/PRP 및 RPE는 이중층에 있다. 특정 양상에서, 이중층 PR/PRP는 세포-세포 접촉 또는 공유 매트릭스에 대한 부착을 통해 RPE에 부착된다.
[0009] 일부 양상에서, 생분해성 스캐폴드는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리락트산(PLLA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(글리세롤 세바케이트(PGS), 폴리피롤(PPy), 폴리비닐 알콜(PVA), 젤라틴, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 피브린, 히울라론산, 실크, 키토산 및/또는 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA)을 포함한다. 특정 양상에서, 생분해성 스캐폴드는 PLGA를 포함한다. 특정 양상에서, PLGA는 약 1:1의 DL-락티드/글리콜라이드 비율을 갖는다. 일부 양상에서, PLGA는 약 1마이크론 미만의 평균 공극 크기를 갖는다. 특정 양상에서, 상기 PLGA는 약 150 내지 약 650 nm의 섬유 직경을 갖는다.
[0010] 일부 양상에서, 생분해성 스캐폴드는 세포외 기질(ECM) 단백질로 코팅된다. 예를 들어, ECM 단백질은 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐 I, 콜라겐 IV 또는 피브로넥틴을 포함한다. 특정 양상에서, ECM 단백질은 비트로넥틴을 포함한다. 일부 양상에서, 생분해성 스캐폴드는 두께가 약 20 내지 약 30마이크론, 예를 들어, 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30마이크론이다.
[0011] 특정 양상에서, 조직 대체 이식체에서 PR/PRP 대 RPE의 비율은 약 2:1 내지 약 30:1, 예를 들어, 약 3:1 내지 약 5:1, 약 5:1 내지 약 10:1, 약 10:1 내지 약 15:1, 또는 약 15:1 내지 약 30:1이다. 일부 양상에서, 조직 대체 이식체에서 PR/PRP 대 RPE의 비율은 약 1:1 내지 약 5:1, 예를 들어, 약 1:1 내지 약 2:1, 약 2:1 내지 약 3:1, 약 3:1 내지 약 4:1, 또는 약 4:1 내지 약 5:1이다.
[0012] 특정 양상에서, RPE 및/또는 PR/PRP는 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)와 같은 만능 줄기 세포(PSC)로부터 유래된다. 일부 양상에서, iPSC는 범용, HLA 매칭 또는 저면역 iPSC이다. 특정 양상에서, iPSC는 사람 iPSC (hiPSC)이다. 특정 양상에서, PR/PRP는 오가노이드로부터 유래하지 않았다.
[0013] 일부 양상에서, RPE 및/또는 PR/PRP는 이전에 냉동보존하였다. 일부 양상에서, 냉동보존된 RPE 및/또는 PR/PRP는 해동시키고 적어도 1주동안 배양하였다. 특정 양상에서, 냉동보존된 RPE 및/또는 PR/PRP는 해동시키고 1주 미만 동안 배양하였다.
[0014] 특정 양상에서, RPE는 약 100,000개 세포/cm2 내지 약 1,000,000개 세포/cm2, 예를 들어, 약 200,000개 세포/cm2, 300,000개 세포/cm2, 400,000개 세포/cm2, 500,000개 세포/cm2, 600,000개 세포/cm2, 700,000개 세포/cm2, 800,000개 세포/cm2, 또는 900,000개 세포/cm2의 밀도로 존재한다. 일부 양상에서, RPE는 약 300,000개 세포/cm2 내지 약 800,000개 세포/cm2, 예를 들어, 약 400,000개 세포/cm2, 500,000개 세포/cm2, 600,000개 세포/cm2 또는 700,000개 세포/cm2의 밀도로 존재한다. 일부 양상에서, PR/PRP는 약 100,000개 세포/cm2 내지 약 10,000,000개 세포/cm2, 예를 들어, 약 200,000개 세포/cm2, 300,000개 세포/cm2, 400,000개 세포/cm2, 500,000개 세포/cm2, 600,000개 세포/cm2, 700,000개 세포/cm2, 800,000개 세포/cm2, 또는 900,000개 세포/cm2의 밀도로 존재한다. 특정 양상에서, PR/PRP는 약 200,000개 세포/cm2 내지 약 20,000,000개 세포/cm2, 예를 들어, 약 300,000개 세포/cm2 내지 약 5,000,000개 세포/cm2, 예를 들어, 약 400,000개 세포/cm2, 500,000개 세포/cm2, 600,000개 세포/cm2, 700,000개 세포/cm2, 800,000개 세포/cm2, 900,000개 세포/cm2, 1,000,000개 세포/cm2, 2,000,000개 세포/cm2, 3,000,000개 세포/cm2, 4,000,000개 세포/cm2, 5,000,000개 세포/cm2, 6,000,000개 세포/cm2, 7,000,000개 세포/cm2, 8,000,000개 세포/cm2, 9,000,000개 세포/cm2, 10,000,000개 세포/cm2, 11,000,000개 세포/cm2, 12,000,000개 세포/cm2, 13,000,000개 세포/cm2, 14,000,000개 세포/cm2, 15,000,000개 세포/cm2 이상의 밀도로 존재한다. 특정 양상에서, PR/PRP는 약 4, 5, 6, 또는 700만개 세포/cm2, 예를 들어, 600만개 세포/cm2의 밀도로 존재한다.
[0015] 일부 양상에서, RPE 및/또는 PR/PRP는 동일한 공여자 유래이다. 특정 양상에서, PR/PRP는 간상(rod) 성향이 있다. 일부 양상에서, PR/PRP는 원추체 성향이 있다.
[0016] 추가의 구현예는 본 구현예 또는 이의 양상의 조직 대체 이식체(생분해성 스캐폴드상에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)와 함께 광수용체 전구체 세포 (PRP) 및/또는 광수용체 세포 (PR)를 포함하는 조직 대체 이식체)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 추가의 양상에서, 조성물은 나트륨 히알루로네이트를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 히알루로네이트는 약 0.5% 미만, 예를 들어, 0.4%, 0.3%, 또는 0.2%의 농도로 존재한다. 일부 양상에서, 조성물은 중탄산나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 제1 인산칼륨, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 및/또는 제2 인산나트륨을 추가로 포함한다.
[0017] 또 다른 구현예는 본원 구현예 또는 이의 양상의 조직 대체 이식체 (예를 들어, 생분해성 스캐폴드 상에 망막 색소 상피 세포 (RPE)와 함께 광수용체 전구체 세포 (PRP) 및/또는 광수용체 세포(PR)를 포함하는 조직 대체 이식체)을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 생분해성 스캐폴드 상에 RPE를 씨딩하는 단계; (b) 상기 RPE를 양극화된 RPE를 생성하기에 충분한 기간 동안 제1 조직 배양 배지에서 생분해성 스캐폴드 상에서 배양하는 단계; (c) PR/PRP를 RPE 상에 씨딩하여 조직 대체 이식체를 형성하는 단계; 및 (d) 상기 조직 대체 이식체를 PR/PRP를 RPE에 접착시키기에 충분한 기간 동안 제2 조직 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함한다.
[0018] 일부 양상에서 스캐폴드는 플라스틱 O-고리에 의해 제자리에 고정된다. 특정 양상에서, 상기 양극화된 RPE는 베스트로핀1 (BEST1)을 발현한다. 특정 양상에서, 제2 조직 배양 배지는 제1 조직 배양 배지와 필수적으로 동일하다.
[0019] 특정 양상에서, 생분해성 스캐폴드는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리락트산(PLLA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(글리세롤 세바케이트(PGS), 폴리피롤(PPy), 폴리비닐 알콜(PVA), 젤라틴, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 피브린, 히울라론산, 실크, 키토산 또는 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA)을 포함한다. 특정 양상에서, 생분해성 스캐폴드는 PLGA를 포함한다. 일부 양상에서, PLGA는 약 1:1의 DL-락티드/글리콜라이드 비율을 갖는다. 특정 양상에서, PLGA는 약 1마이크론 미만의 평균 공극 크기를 갖는다. 일부 양상에서, 상기 PLGA는 약 150 내지 약 650 nm의 섬유 직경을 갖는다. 특정 양상에서, 생분해성 스캐폴드는 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐 I, 콜라겐 IV 또는 피브로넥틴과 같은 세포외 기질(ECM) 단백질로 코팅된다. 특정 양상에서, ECM 단백질은 비트로넥틴을 포함한다. 특정 양상에서, 상기 비트로넥틴은 약 0.5 μg/cm2 초과, 예를 들어, 약 1 μg/cm2, 5 μg/cm2, 또는 10 μg/cm2의 농도로 표면에 첨가된다.
[0020] 일부 양상에서, RPE는 약 100,000개 세포/cm2 내지 약 1,000,000개 세포/cm2, 예를 들어, 약 200,000개 세포/cm2, 300,000개 세포/cm2, 400,000개 세포/cm2, 500,000개 세포/cm2, 600,000개 세포/cm2, 700,000개 세포/cm2, 800,000개 세포/cm2, 또는 900,000개 세포/cm2의 밀도로 씨딩한다. 특정 양상에서, RPE는 약 300,000개 세포/cm2 내지 약 800,000개 세포/cm2, 예를 들어, 약 400,000개 세포/cm2, 500,000개 세포/cm2, 600,000개 세포/cm2 또는 700,000개 세포/cm2의 밀도로 씨딩한다. 일부 양상에서, PR/PRP는 약 100,000개 세포/cm2 내지 약 1000만개 세포/cm2, 예를 들어, 약 200,000개 세포/cm2, 300,000개 세포/cm2, 400,000개 세포/cm2, 500,000개 세포/cm2, 600,000개 세포/cm2, 700,000개 세포/cm2, 800,000개 세포/cm2, 또는 900,000개 세포/cm2의 농도로 씨딩한다. 특정 양상에서, PR/PRP는 약 300만개 세포/cm2 내지 약 500만개 세포/cm2, 예를 들어, 약 400만개 세포/cm2의 농도로 씨딩한다.
[0021] 일부 양상에서, RPE 및/또는 PR/PRP는 이전에 냉동보존하였다.
[0022] 특정 양상에서, 생분해성 스캐폴드는 조직 배양 삽입체가 있는 다중 웰 지지대에 배치된다. 특정 양상에서, 제1 조직 배양 배지는 조직 배양 삽입체를 갖는 다중-웰 지지체의 하부 구획에 첨가된다. 특정 양상에서, 제2 조직 배양 배지는 조직 배양 삽입체를 갖는 다중-웰 지지체의 상부 구획에 첨가된다. 일부 양상에서, 제1 조직 배양 배지는 타우린 및 하이드로코르티손을 포함한다. 특정 양상에서, 제1 조직 배양 배지는 추가로 트리요오도티로닌을 포함한다. 특정 양상에서, 제1 조직 배양 배지는 합성 배지 또는 무혈청 배지이다. 일부 양상에서, 제1 조직 배양 배지는 혈청 대체물을 포함한다. 특정 양상에서, 제1 조직 배양 배지는 예를 들어 50-75 μM 또는 75-100 μM과 같은 50μM 내지 100μM의 농도로 프로스타글란딘 E2(PGE2)를 추가로 포함한다. 특정 양상에서, 제1 조직 배양 배지는 RPE-MM 배지이다. 일부 양상에서, 제2 조직 배양 배지는 제1 조직 배양 배지와 필수적으로 동일하다. 특정 양상에서, 제2 조직 배양 배지는 제1 조직 배양 배지와 구분된다. 일부 양상에서, 제2 조직 배양 배지는 최소 배지(RMN)이다. 특정 양상에서, 제1 조직 배양 배지는 다중-웰 지지체의 하부 구획에 첨가되고 제2 조직 배양 배지는 다중-웰 지지체의 상부 구획에 첨가된다. 일부 양상에서, 하부 구획의 배지로부터의 조직 배양 삽입체에 대한 압력은 상부 구획의 배지로부터의 압력보다 높다.
[0023] 일부 양상에서, 단계 (b)는 적어도 약 2주 동안, 예를 들어, 3주 또는 4주 동안이다. 특정 양상에서, 단계 (d)는 적어도 약 5일, 예를 들어, 6일, 7일 또는 10일 동안이다. 일부 양상에서, 단계 (d)는 약 1일, 예를 들어, 약 2일, 3일 또는 4일 동안이다.
[0024] 특정 양상에서, PRP는 간상 성향이 있다. 일부 양상에서, PRP는 원추체 성향이 있다.
[0025] 일부 양상에서, 제1 조직 배양 배지 및 제2 조직 배양 배지는 적어도 5일마다 1회, 예를 들어 적어도 4일마다, 3일마다 또는 격일 적어도 1회 교환된다.
[0026] 특정 양상에서, 조직 대체 이식체에서 PR/PRP 대 RPE의 비율은 약 2:1 내지 약 30:1, 예를 들어, 약 3:1 내지 약 5:1, 약 5:1 내지 약 10:1, 약 10:1 내지 약 15:1, 또는 약 15:1 내지 약 30:1이다. 일부 양상에서, 조직 대체 이식체에서 PR/PRP 대 RPE의 비율은 약 1:1 내지 약 5:1, 예를 들어, 약 1:1 내지 약 2:1, 약 2:1 내지 약 3:1, 약 3:1 내지 약 4:1, 또는 약 4:1 내지 약 5:1이다.
[0027] 추가의 구현예는 본원 구현예 또는 이의 양상의 조직 대체 이식체를 제공하고 이는 본원의 구현예 또는 이의 양상의 방법에 따라 제조된다.
[0028] 또 다른 구현예는 PR/PRP-RPE 이중층을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 조직 배양 삽입체를 갖는 다중-웰 지지체의 상부 구획에서 조직 배양 배지에 RPE를 씨딩하는 단계; (b) 상기 멀티-웰 지지체의 상부 구획에서 RPE와 직접 접촉하는 조직 배양 배지에 PR/PRP를 씨딩하는 단계로서, 여기서 하부 구획의 중간 압력이 상부 구획의 중간 압력보다 높은, 단계; 및 (c) PR/PRP-RPE 이중층을 생성하기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함한다.
[0029] 일부 양상에서, 조직 배양 삽입체를 갖는 다중 웰 지지체의 하부 및 상부 구획에 있는 배지는 필수적으로 동일하다. 특정 양상에서, 조직 배양 삽입체를 갖는 다중 웰 지지체의 하부 및 상부 구획에 있는 배지는 구분된다.
[0030] 특정 양상에서, RPE는 양극화된 RPE이다. 특정 양상에서, 양극화된 RPE는 BEST1을 발현한다. 일부 양상에서, RPE는 생분해성 스캐폴드 상에 씨딩한다. 특정 양상에서, 생분해성 스캐폴드는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리락트산(PLLA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(글리세롤 세바케이트(PGS), 폴리피롤(PPy), 폴리비닐 알콜(PVA), 젤라틴, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 피브린, 히울라론산, 실크, 키토산 또는 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA)을 포함한다. 일부 양상에서, 생분해성 스캐폴드는 PLGA를 포함한다. 특정 양상에서, PLGA는 약 1:1의 DL-락티드/글리콜타이드 비율을 갖는다. 일부 양상에서, PLGA는 약 1마이크론 미만의 평균 공극 크기를 갖는다. 특정 양상에서, PLGA는 약 150 내지 약 650 nm의 섬유 직경을 갖는다.
[0031] 일부 양상에서, 생분해성 스캐폴드는 세포외 기질(ECM) 단백질로 코팅된다. 특정 양상에서, ECM 단백질은 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐 I, 콜라겐 IV 또는 피브로넥틴을 포함한다. 특정 양상에서, ECM 단백질은 비트로넥틴을 포함한다. 일부 양상에서, 비트로넥틴은 약 0.5 μg/cm2 초과, 예를 들어, 약 1 μg/cm2, 예를 들어, 약 5 μg/cm2, 또는 약 10 μg/cm2의 농도로 표면에 첨가된다.
[0032] 일부 양상에서, RPE는 약 100,000개 세포/cm2 내지 약 1,000,000개 세포/cm2, 예를 들어, 약 200,000개 세포/cm2, 300,000개 세포/cm2, 400,000개 세포/cm2, 500,000개 세포/cm2, 600,000개 세포/cm2, 700,000개 세포/cm2, 800,000개 세포/cm2, 또는 900,000개 세포/cm2의 밀도로 씨딩한다. 특정 양상에서, RPE는 약 300,000개 세포/cm2 내지 약 800,000개 세포/cm2, 예를 들어, 약 400,000개 세포/cm2, 500,000개 세포/cm2, 600,000개 세포/cm2 또는 700,000개 세포/cm2의 밀도로 씨딩한다. 특정 양상에서, PR/PRP는 약 100,000개 세포/cm2 내지 약 1000만개 세포/cm2, 예를 들어, 약 200,000개 세포/cm2, 300,000개 세포/cm2, 400,000개 세포/cm2, 500,000개 세포/cm2, 600,000개 세포/cm2, 700,000개 세포/cm2, 800,000개 세포/cm2, 또는 900,000개 세포/cm2의 농도로 씨딩한다. 일부 양상에서, PR/PRP는 약 300만개 세포/cm2 내지 약 500만개 세포/cm2, 예를 들어, 약 400만개 세포/cm2의 농도로 씨딩한다.
[0033] 특정 양상에서, RPE 및/또는 PR/PRP는 이전에 냉동보존하였다.
[0034] 일부 양상에서, 제1 조직 배양 배지는 타우린 및 하이드로코르티손을 포함한다. 추가의 양상에서, 제1 조직 배양 배지는 추가로 트리요오도티로닌을 포함한다. 특정 양상에서, 제1 조직 배양 배지는 합성 배지 또는 무혈청 배지이다. 일부 양상에서, 제1 조직 배양 배지는 혈청 대체물을 포함한다. 특정 양상에서, 제1 조직 배양 배지는 RPE-MM 배지이다. 특정 양상에서, 제2 조직 배양 배지는 타우린 및 하이드로코르티손을 포함한다. 일부 양상에서, 제2 조직 배양 배지는 추가로 트리요오도티로닌을 포함한다. 특정 양상에서, 제2 조직 배양 배지는 합성 배지 또는 무혈청 배지이다. 특정 양상에서, 제2 조직 배양 배지는 혈청 대체물을 포함한다. 일부 양상에서, 제2 조직 배양 배지는 RPE-MM 배지이다.
[0035] 일부 양상에서, PR/PRP는 간상 성향이 있다. 특정 양상에서, PR/PRP는 원추체 성향이 있다.
[0036] 일부 양상에서, 제1 조직 배양 배지 및 제2 조직 배양 배지는 적어도 5일마다 1회, 예를 들어 적어도 4일마다, 3일마다 또는 격일 적어도 1회 교환된다.
[0037] 특정 양상에서, 조직 대체 이식체에서 PR/PRP 대 RPE의 비율은 약 2:1 내지 약 30:1, 예를 들어, 약 3:1 내지 약 5:1, 약 5:1 내지 약 10:1, 약 10:1 내지 약 15:1, 또는 약 15:1 내지 약 30:1이다. 일부 양상에서, 조직 대체 이식체에서 PR/PRP 대 RPE의 비율은 약 1:1 내지 약 5:1, 예를 들어, 약 1:1 내지 약 2:1, 약 2:1 내지 약 3:1, 약 3:1 내지 약 4:1, 또는 약 4:1 내지 약 5:1이다.
[0038] 추가 구현예는 양극화된 RPE 상에서 배양된 성숙한 PRP의 별개의 이중층을 포함하는 RPE-PR/PRP 이중층 세포 조성물을 제공한다. 특정 양상에서, 양극화된 RPE는 베스트로핀 및/또는 ZO-1에 대해 양성이다. 일부 양상에서, 성숙한 PR/PRP는 페리페린-2 및/또는 신경망막 류신 지퍼(NRL)에 대해 양성이다.
[0039] 대상체에서 안구 손상 또는 장애를 치료하는 방법은 유효량의 망막 상피 세포(RPE) 및 PR/PRP(RPE-PR/PRP) 이중층 조성물을 대상체의 눈에 이식하는 것을 포함한다.
[0040] 일부 양상에서, 안구 장애는 RPE 기능부전 또는 광수용체 기능부전으로 인한 것이다. 특정 양상에서, 안구 장애는 연령 관련 황반 변성, 망막 색소변성증, 원추체-간상 이영양증, 또는 레버 선천성 흑암시이다. 특정 양상에서, RPE-PR/PRP 이중층 조성물은 대상체의 망막으로 이식된다. 일부 양상에서, RPE-PR/PRP 이중층 조성물은 스캐폴드 상으로 이식된다. 특정 양상에서, RPE-PR/PRP 이중층 조성물은 본 구현예 또는 이의 양상의 조직 대체 이식체 또는 본 구현예 또는 이의 양상의 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 양상에서, 조직 대체 이식체는 망막하 공간으로 이식된다. 특정 양상에서, 조직 대체 이식체는 망막하 주사 도구를 사용함에 의해 이식된다. 특정 양상에서, RPE 및/또는 PR/PRP는 사람 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)로부터 유래된다. 일부 양상에서, RPE 및/또는 PR/PRP는 이전에 냉동보존하였다. 특정 양상에서, RPE는 베스트로핀 및/또는 ZO1에 대해 양성인 성숙한 RPE와 같은 성숙한 RPE이다. 일부 양상에서, RPE는 세포외 기질(ECM) 단백질 코팅 표면상에 있다. 특정 양상에서, ECM 단백질은 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐 I, 콜라겐 IV 또는 피브로넥틴이다. 특정 양상에서, ECM 단백질은 비트로넥틴이다. 일부 양상에서, RPE는 공중합체 스캐폴드 상에 있다. 특정 양상에서, 공중합체 스캐폴드는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리락트산(PLLA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(글리세롤 세바케이트(PGS), 폴리피롤(PPy), 폴리비닐 알콜(PVA), 젤라틴, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 피브린, 히울라론산, 실크, 키토산 또는 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA)를 포함한다. 특정 양상에서, PR/PRP는 오가노이드로부터 유래하지 않았다. 일부 양상에서, RPE- PR/PRP 이중층은 타우린 및 하이드로코르티손을 포함하는 배지에 있다. 특정 양상에서, 배지는 추가로 트리요오도티로닌을 포함한다. 특정 양상에서, 배지는 합성 배지 또는 무혈청 배지이다. 특정 양상에서, 배지는 혈청 대체물을 포함한다. 일부 양상에서, 배지는 RPE-MM 배지이다. 특정 양상에서, PR/PRP는 페리페린-2 및/또는 신경망막 류신 지퍼(NRL)에 대해 양성이다. 일부 양상에서, 별개의 이중층에서 PR/PRP 대 RPE의 비율은 1:1 내지 5:1, 예를 들어, 약 1:1 내지 약 2:1, 약 2:1 내지 약 3:1, 약 3:1 내지 약 4:1, 또는 약 4:1 내지 약 5:1이다.
[0041] 추가 구현예는 모델 망막으로서 본 구현예 또는 이의 양상의 조직 대체 이식체의 용도를 제공한다.
[0042] 또 다른 구현예는 기질 성장 성장하는 조직으로서 본 구현예 또는 이의 양상의 조직 대체 이식체의 용도를 제공한다.
[0043] 본원 개시내용의 다른 목적, 특성 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 본 발명의 바람직한 구현예를 지적하는 구체적인 실시예는, 상기 상세한 설명으로부터 본 발명의 취지 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형을 줄 수 있음이 당업자에게는 명백하기 때문에, 단지 예시로서만 제공되는 것으로 이해되어야만 한다.
[0044] 하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제공된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조로 보다 잘 이해될 수 있다.
[0045] 도 1a-1e: RPE/PRP 공동-배양. (도 1a) 공동-배양 전 PRP의 플로우 프로필 (도 1b-1c) 하루 후 RPE/PRP의 공동-배양. (도 1b) 2X 및 (도 1c) 10X에서 상 대조 현미경은 컨플루언트 RPE 층의 정상에 PRP 층을 보여준다. (도 1d-1e) 7일 후 RPE/PRP의 공동 배양. 형광성 현미경은 (도 1d) 모든 핵 (청색) 및 (도 1e) RPE-특이적 CRALBP (녹색), PRP-특이적 레코베린 (적색), 및 망막 선조체(progenitor)-특이적 CHX10 (자주색)을 보여준다. RPE 및 PRP 둘다는 명백하고, PRP (레코베린 양성 세포)가 서브-컨플루언트 클러스터에 부착되어 있다. 매우 소수의 망막 선조체가 명백하였다.
[0046] 도 2a-2b: ZO-1 및 레코베린 공동 염색 (도 2a) PRP에 대해 포커싱 및 (도 2b) RPE 상에 포커싱. PRP 포커스에서 레코베린 양성 세포의 명확한 존재와 RPE 주변의 ZO-1에 의해 강조된 전형적인 육각형의 단단한 연결 형태는 2개의 별개의 층을 입증한다.
[0047] 도 3a-3h: PRP (해동 후 3×106 및 1×107 세포/cm2의 수)를 갖는 (RPE/PRP) 이중층의 면역세포화학. 보다 낮은 밀도에서 세포는 (도 3a) ZO-1 (녹색), (도 3b) 레코베린 (적색), 및 (도 3c) CRALBP (녹색)/레코베린 (적색)에 대해 염색되었다. 보다 높은 밀도의 세포는 (도 3d) ZO-1 및 (도 3e) 레코베린에 대해 염색되었고, (도 3f)는 ZO-1과 함께 염색된 확대된 이미지 세포는 예상된 RPE “자갈(cobblestone)” 단단한 결합 형태를 보여준다. 측면 재구성된 공초점 이미지는 이들 2개의 세포 유형의 적층을 보여주는 (도 3g) ZO-1 (녹색)/레코베린 (적색) 및 (도 3h) CRALBP (녹색)/레코베린 (적색)의 다중층을 보여준다.
[0048] 도 4a-4f: 4e6 PRP를 RPE의 컨플루언트 단일층 상에 플레이팅한 후 7일째 RPE/PRP 비율 정량화. RPE는 TYRP1에 의해 지적되고 PRP는 AIPL1에 의해 지적된다. (도 4a) iPRP 대조군의 유동 세포측정 플롯, (도 4b) iRPE 대조군의 유동 세포측정 플롯, (도 4c) 단일 배양으로 스냅웰 상에서 배양된 RPE의 유동 세포측정 플롯, (도 4d) 공동 배양으로 7일 동안 양극화된 RPE의 정상에서 배양된 PRP의 유동 세포측정 플롯. (도 4e) 마커의 정량화는 RPE (TYRP1) 및 PRP (AIPL1) 둘다가 공동 배양된 샘플에 존재함을 보여주고, (도 f) PRP/RPE 비율에 대한 대용인, TYRP1을 발현하는 퍼센트로 AIPL1을 발현하는 세포의 퍼센트를 나눈 비율은 본 샘플에서 약 6이다. 세포는 iPSC 세포주 HLA-A로부터 기원하였다.
[0049] 도 5a-5c: 스냅-웰 스캐폴드 상에서 RPE/PRP 공동 배양의 특징 분석. (도 5a) 플로우 플롯은 각각의 세포 유형의 구분된 집단을 보여주지만, RPE-MM (5% FBS)과의 배양에서 레코베린이 보다 크게 발현한다. (도 5b) RPE-MM (5% FBS) 및 (도 5c) RPE-MM (15% KOSR)에서 ICC에 의한 형태는 유사하였다.
[0050] 도 6a-6c: VTN-코팅된 PLGA 스캐폴드 상의 RPE/PRP 이중층의 공초점 현미경 이미지. (도 6a) 5×106 세포/cm2 및 (도 6b) 1×107 세포/cm2에서 이중층, (도 6c) 별개의 RPE 및 PRP 층을 명백하게 보여주는 Z-스택 섹션의 측면도.
[0051] 도 7a-7d: 스냅웰에서 배지 용적을 조정하는 경우 개선된 접착. (A) 정점 측면 상에 보다 높은 압력을 갖고 (B) 기저 측면 상에 보다 높은 압력을 갖는 스냅웰 용적을 보여주는 도식. ZO-1 (녹색) 및 레코베린 (적색)에 대한 면역세포화학은 (C) 정점 측면 상의 보다 높은 압력이 보다 불량한 PRP 접착을 유도하는 반면(D) 기저 측면 상의 보다 높은 압력이 보다 양호한 PRP 접착을 유도하였음을 지적하였다.
[0052] 도 8a-8d: (도 8a, 8b) 낮은 또는 (도 8c, 8d) 높은 비트로넥틴 농도 및 (도 8a, 8b) 300만 PRP/cm2 또는 (도 8c, 8d) 1000만 PRP/cm2의 농도로 RPE상으로 씨딩된 PRP. PRP는 레코베린(적색)에 대해 염색되었다.
[0053] 도 9a-9c: iPSC-RPE/PRP 스캐폴드의 이식 2개월 후 돼지 망막의 면역세포화학. 사람 핵 항체로 동정된 이식된 사람 세포. 이식된 사람 핵은 (도 9a) ARR3에 의해 지적된 원추체 및 (도 9b) NRL 및 (도 9c) 로돕신에 의해 지적된 간상과 함께 동시 위치한다. 광수용체의 층은 숙주 신경 망막과 접촉해있다. 돼지는 RPE 및 광수용체가 붕괴된 레이저 돼지 모델이다.
[0054] 도 10: 사람 핵(Ku80)과 RPE(MITF)의 중첩을 보여주는 iPSC-RPE/PRP 스캐폴드 이식 2개월 후 돼지 망막-RPE-맥락막 섹편의 면역세포화학. 이식된 사람 RPE의 층은 이식된 PRP 층 위에 상주한다.
[0055] 도 11: 레코베린에 의해 지적된 광수용체를 보여주는 iPSC-RPE/PRP 스캐폴드 이식 2개월 후 돼지 망막-RPE-맥락막 섹편의 면역세포화학.
[0056] 도 12a-12c: (도 12a) 외부 제한 막을 재형성하지만 이식된 RPE 층에서 정지되는 뮬러 아교세포 (GFAP)를 보여주는, iPSC-RPE/PRP 스캐폴드의 이식 2개월 후 돼지 망막-RPE-맥락막 섹션의 면역세포화학. (도 12b) DIC 이미지는 절개된 망막의 맥락과 배향을 보여주며, 이식된 색소와 숙주 세포가 뚜렷하게 보인다. (도 12c) 어떠한 뚜렷한 Ki67-양성 증식 세포는 없다.
[0057] 도 13a-13b: (도 13a) 이식된 광수용체에 대한 시냅스전 마커 VGLUT1의 근접성 및 (도 13b) 숙주 양극성 세포(PKCα)의 이식된 광수용체 층으로의 이동을 보여주는, iPSC-RPE/PRP 스캐폴드 이식 2개월 후 돼지 망막-RPE-맥락막 섹션의 면역세포화학. 통합을 위한 잠재력은 화살표로 나타낸다.
[0058] 도 14a-14b: (도 14a) 이식된 세포에서 사람 특이적 시냅스전 마커 시냅토피신의 광범위 발현 및 (도 14b) ARR3-양성 원추체와 함께 동시 표지화를 보여주는 iPSC-RPE/PRP 스캐폴드의 이식 2개월 후 돼지 망막-RPE-맥락막 섹션의 면역세포화학.
I. 예시적인 구현예의 기재
[0059] RPE와 신경 망막은 생체 내에서 정렬된 층 세트로 발달하고 존재한다. 고유 RPE 및 PR/PRP 구조적 관계의 재현은 치료에서 필수적일 수 있고, 이는 특히 이들 층의 적절한 병치 및 올바른 순서가 기능을 가능하게 할 수 있기 때문이다. 또한, 적층된 RPE-PR/PRP의 시험관 내 재현은 또한 약물 또는 세포 질환 모델을 시험하기 위한 플랫폼으로도 실행 가능할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원 개시내용은 "이중 치료요법” 이중층에서 hiPSC-유래 PR 세포 및/또는 hiPSC-유래 PRP(iPRP)와 함께 사람 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)-유래 RPE(iRPE)를 배양하는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, RPE 및/또는 PR/PRP는 배아 줄기 세포와 같은 PSC에서 유래한다. 본 연구는 여기에 제공된 RPE-PR/PRP 별개의 이중층이 여러 배양 포맷에서 층 접착, 예상 마커 유지 및 층 계층화를 나타냄을 보여주었다.
[0060] 특정 양상에서, RPE는 먼저 표면 상에서 배양한다. RPE는 후기 양극화 마커 베스트로핀에 대해 양성인 양극화된 RPE를 생성하도록 배양될 수 있다. RPE는 hiPSC로부터, 예를 들어, 둘다가 전문이 본원에 참조로 인용되는 문헌(PCT/US2016/050543 및 PCT/US2016/050554)에 기재된 방법에 의해 유래할 수 있거나 배아 또는 태아 RPE일 수 있다. PR/PRP는 또한 hiPSC로부터, 예를 들어, 이의 전문이 본원에 참조로 인용되는 문헌(PCT/US2019/028557)에 기재된 방법에 의해 유래할 수 있거나, ES 세포일 수 있다. 다음으로, PRP를 지나 후기 단계에서 간상 및 원추체 및/또는 광수용체 세포로 성숙할 수 있는 능력이 미성숙한 PRP가 RPE 정상에 적층될 수 있다. PR/PRP를 해동하여 RPE상에 직접 씨딩하거나 RPE에 씨딩하기 전에 일정 기간 동안 배양할 수 있다. 일부 양상에서, RPE-PR/PRP 부착을 보충하기 위해 ROCK 억제제(예를 들어, Y-27632), 라미닌-521, 땅콩 응집소(PNA), 보다 높은 농도의 비트로넥틴(VTN) 또는 PGE2와 같은 인자가 배양 시스템에 첨가될 수 있다.
[0061] 본원에 제공된 RPE-PR/PRP 이중층은 다양한 생체내 및 시험관내 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, RPE-PR/PRP 이중층은 연령 관련 또는 유전성 황반 변성 및 망막 색소변성증 또는 기타 유전성 외부 망막 변성 질환 또는 기능부전 및/또는 RPE 및/또는 PR/PRP의 상실을 유발하는 손상을 포함하지만 이에 제한되지 않는 망막 또는 RPE의 병태를 치료하기 위해 생체 내에서 사용될 수 있다. RPE-PR/PRP 이중층은 추정 치료학적 또는 예방학적 치료 후보를 동정하기 위한 스크리닝 검정에서 시험관 내에서 사용될 수도 있다. 또한, RPE-PR/PRP 이중층은 보다 복잡한 조직을 구축하기 위한 기질로서 사용될 수 있다. 본 명세서의 추가의 구현예와 이점들을 하기에 기술한다.
I. 정의
[0062] “정제된” 이라는 용어는 절대적인 순도를 요하는 것이라기보다는; 오히려, 상대적인 용어로서 의도한 것이다. 따라서, 정제된 세포의 집단은 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과 또는 100% 순수하거나, 또는, 가장 바람직하게는, 필수적으로 다른 세포 유형이 없다.
[0063] 본원 명세서에서 사용된 바와 같은, 관사 (“a” 또는 “an”)는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원 청구항에서 사용된 바와 같은, 단수형 관사 ("a" 또는 "an")는 "포함하는" 이라는 단어와 함께 사용되는 경우 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
[0064] 청구항에서 "또는" 이라는 용어의 사용은, 그것이 명시적으로 대안만을 언급하지 않는 한 또는 명세서가 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 뒷받침하고 있더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서 "또 다른" 이라는 말은 적어도 두번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
[0065] "필수적으로"라는 용어는 방법 또는 조성물이 특정 단계 또는 재료만을 포함하고 이러한 방법 및 조성물의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 이해되어야 한다.　
[0066] 본원에 사용된 바와 같이, 특정 물질 또는 재료가 “실질적으로 부재”인 조성물 또는 매질은 물질 또는 재료의 ≤30%, ≤20%, ≤15%, 보다 바람직하게 ≤10%, 보다 더 바람직하게 ≤5%, 또는 가장 바람직하게 ≤1%를 함유한다.　
[0067] 본원에 사용된 "실질적으로" 또는 "대략"이라는 용어는 관련된 기본 기능의 변화를 초래하지 않고 허용될 수 있는 임의의 정량적 비교, 값, 측정 또는 기타 표현을 수식하기 위해 적용될 수 있다.
[0068] 용어 "약"은 일반적으로 명시된 값을 측정하기 위한 표준 분석 기술을 사용하여 결정된 명시된 값의 표준 편차 이내를 의미한다.　 상기 용어는 명시된 값의 플러스 또는 마이너스 5%를 언급함으로써 사용될 수도 있다.
[0069] 본원에 사용된 바와 같은 특정 성분과 관련하여 “필수적으로 부재”는 본원에서 특정 성분의 어느 것도 의도적으로 조성물에 제형화되지 않고/않거나 오염물로서 또는 미량으로만 존재함을 의미하기 위해 사용된다. 따라서, 조성물의 의도치 않은 임의의 오염으로 야기된 특정 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 표준 분석 방법으로 특정 성분의 양이 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
[0070] “세포군” 이라는 용어는 보통 통상적인 유형의 세포들의 군을 가리키는데 사용된다. 상기 세포군은 공통의 간세포로부터 유래할 수 있거나, 또는 하나 이상의 세포형을 포함할 수도 있다. “농축된” 세포군은 출발 세포군의 특정 세포형의 백분율보다 더 큰 백분율의 세포형을 포함하는 출발 세포군 (예를 들어, 분획화되지 않은, 이종성 세포군)으로부터 유래된 세포군을 지칭한다. 세포군은 하나 이상의 세포형에 대해 강화될 수 있고, 하나 이상의 세포형을 고갈시킬 수도 있다.
[0071] “줄기 세포” 라는 용어는 본원에서 적절한 조건 하에 다양한 범위의 분화 세포형으로 분화할 수 있는 세포, 한편으로는 적절한 다른 조건 하에 자기 재생 및 필수적으로 미분화된 만능 상태로 남아 있을 수 있는 세포를 지칭한다. 또한, “줄기 세포” 라는 용어는 만능 세포, 다능성 세포, 전구체 세포 및 간세포를 포괄한다. 전형적인 사람 줄기 세포는 골수 조직으로부터 수득된 조혈 또는 간엽 줄기 세포, 배아 조직으로부터 수득된 배아 줄기 세포, 또는 태아의 생식기 조직으로부터 수득된 배아 생식 세포로부터 수득될 수 있다. 또한, 전형적인 만능 줄기 세포는 다능성과 관련된 특정 전사 인자의 발현에 의해 만능 상태로 체세포를 재프로그래밍함으로써 해당 체세포로부터도 생성될 수 있으며; 이들 세포들은 “유도성 만능 줄기 세포” 또는 “iPSC”로 불린다.
[0072] “만능” 이라는 용어는 배아외, 또는 태반 세포를 제외하고 유기체 내에서 다른 모든 세포형으로 분화하는 세포의 특성을 가리킨다. 만능 줄기 세포는 장시간의 배양 이후에 조차도 세가지의 모든 배엽층 (예를 들어, 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포형)으로 분화할 수 있다. 만능 줄기 세포는 배반포의 내부 세포 덩어리에서 유래된 배아 줄기 세포이다. 다른 구현예에서, 만능 줄기 세포는 체세포를 재프로그래밍하여 유래된 유도성 만능 줄기 세포이다.
[0073] “분화” 라는 용어는 미분화된 세포가 구조적 및/또는 기능적 특성에 변화가 있는 보다 분화된 유형으로 되는 과정을 일컫는다. 성숙한 세포는 통상 변형된 세포 구조와 조직 특이적 단백질을 가진다.
[0074] 본원에서, “미분화된” 이라는 말은 해당 미분화된 세포를 배아 또는 성체 기원의 말단 분화된 세포와 명백하게 구별짓는 미분화된 세포의 특징적 마커 및 형태학적 특징을 나타내는 세포를 지칭한다.
[0075] “배양체 (EB)” 라는 말은 내배엽, 중배엽 및 외배엽 배엽층으로 분화할 수 있는 만능 줄기 세포의 응집체이다. 스페로이드 구조는 만능 줄기 세포가 비-접착 배양 조건하에 응집하도록 허용된 경우 형성되고 따라서 현탁액 중 EB를 형성한다.
[0076] “단리된” 세포는 유기체 또는 배양액 중에서 다른 세포로부터 실질적으로 분리되거나 정제된다. 단리된 세포는, 예를 들어, 99% 이상, 98% 이상 순수, 95% 이상 순수 또는 90% 이상 순수할 수 있다.
[0077] “배아”는 접합체 또는 인위적으로 재프로그래밍된 핵으로 활성화된 난모세포의 1회 이상의 분할로 수득된 세포 덩어리를 지칭한다.
[0078] “배아 줄기 (ES) 세포”는 초기 단계의 배아, 예를 들어 배반포 단계에서 내부 세포 덩어리로부터 수득되거나 또는 인위적인 수단 (예를 들어, 핵 치환)에 의해 생성되어 생식 세포 (예를 들어 정자 및 난자)를 비롯한 배아 또는 성체에서 임의의 분화된 세포형을 낼 수 있는 미분화된 만능 세포이다.
[0079] "유도성 만능 줄기 세포 (iPSC)"는 인자들 (본원에서 재프로그래밍 인자로 지칭함) 조합의 발현 또는 그 발현을 유도함으로써 체세포를 재프로그래밍하여 생성된 세포이다. iPSC는 태아, 출생후, 신생아, 발육기, 또는 성체 체세포를 사용하여 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용될 수 있는 인자들로는, 예를 들어, Oct4 (Oct 3/4로도 지칭함), Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog 및 Lin28을 포함한다. 일부 구현예에서, 체세포는 2개 이상의 재프로그래밍 인자, 3개 이상의 재프로그래밍 인자, 또는 4개의 재프로그래밍 인자를 발현시켜 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍함으로써 재프로그래밍된다.
[0080] “대립유전자”는 2 이상의 유전자 형태 중에서 하나를 가리킨다. 사람과 같은 이배체 유기체는 각 염색체를 두 카피씩 포함하기 때문에, 각각 하나의 대립유전자를 수반한다.
[0081] “동형접합성” 이라는 용어는 특정 자리에서 2개의 동일한 대립유전자를 포함하는 것으로 정의된다. “이형접합성” 이라는 용어는 특정 자리에서 2개의 서로 다른 대립유전자를 포함하는 것으로 정의된다.
[0082] “반수체형”은 하나의 염색를 따라 여러 유전자 자리에서 대립유전자의 조합을 지칭한다. 반수체형은 하나의 염색체 상의 한 세트의 단일 뉴클레오타이드 다형 (SNP) 및/또는 주요 조직적합성 복합체 내의 대립유전자를 기반으로 할 수 있다.
[0083] 본원에 사용된 바와 같은 “반수체형-일치된” 이라는 용어는 처리되는 세포 (예를 들어, iPSC 세포) 및 대상체가 하나 이상의 주요 조직적합성 유전자좌 반수체형을 공유하는 것으로 정의된다. 대상체의 반수체형은 당업계에 잘 알려진 분석법을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 반수체형-일치된 iPS 세포는 자가 또는 동종이계일 수 있다. 조직 배양물 중에서 성장하고 선천적으로 PRP 세포로 분화되는 자가 세포는 대상체와 반수체형 일치된다.
[0084] “실질적으로 동일한 HLA형”은 공여자의 사람 백혈구 항원(HLA) 유형이, 공여자의 체세포로부터 유래된 iPCS의 분화를 유도함으로써 수득된 이식 세포가 이들이 환자에게 이식될 때 접목될 수 있을 정도로 환자의 HLA형과 일치함을 지적한다.
[0085] “슈퍼 공여자 (Super donor)”는 본원에서 특정 MHC 부류 I 및 II 유전자에 대해 동종접합성인 개체로서 언급된다. 이러한 동종접합성 개체들은 슈퍼 공여자로서 작용할 수 있으며, 조직을 비롯한 이들의 세포 및 이들의 세포를 포함하는 기타 물질들은 해당 반수체형에 대해 동종접합성 또는 이종접합성인 개체에 이식될 수 있다. 상기 초 공여체는 각각 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP 또는 HLA-DQ 자리의 대립유전자에 대해 동형접합성일 수 있다.
[0086] “피더-프리” 또는 “피더 독립적인” 이라는 말은 본원에서 지지 세포층에 대한 대체물로서 사이토카인과 생장 인자 (예를 들어, TGFβ, bFGF, LIF)로 보충된 배양액을 가리키는데 사용된다. 따라서, “피더-프리” 또는 피더 독립적인 배양 시스템 및 배지는 만능 세포를 배양하여 미분화 및 증식 상태로 유지하는데 사용될 수 있다. 일부의 경우, 피더(feeder)가 없는 배양물은 동물계 매트릭스 (예를 들어 MATRIGEL™)를 이용하거나, 또는 피브로넥틴, 콜라겐 또는 비트로넥틴과 같은 기질 상에서 성장한다. 이러한 접근법들은 사람 줄기 세포가 마우스 섬유아세포 “피더층”에 대한 필요없이 필수적으로 미분화 상태로 남아있도록 해준다.
[0087] “피더층”은 배양 접시의 바닥 상에서와 같은 세포의 코팅층으로 정의된다. 상기 피더는 배양 배지로 영양분을 방출하여 만능 줄기 세포와 같은 다른 세포가 부착할 수 있는 표면을 제공할 수 있다.
[0088] 배지, 세포외 매트릭스 또는 배양 조건과 관련하여 사용되는 “합성 (defined)” 또는 “완전 합성 (fully defined)” 이라는 용어는 거의 모든 성분들의 화학 조성과 양이 공지된 배지, 세포외 매트릭스 또는 배양 조건을 가리킨다. 예를 들어, 합성 배지는 소태아 혈청, 소 혈청 알부민 또는 사람 혈청 알부민에서와 같이 규정되지 않은 인자들은 포함하지 않는다. 일반적으로, 합성 배지는 재조합 알부민, 화학적으로 합성된 지질 및 재조합 인슐린이 보충된 기본 배지 (예를 들어, 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM), F12, 또는 아미노산, 비타민, 무기염, 완충제, 산화방지제 및 에너지원을 포함하는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (Roswell Park Memorial Institute, RPMI) 배지 1640)를 포함한다. 완전 합성 배지의 예는 Essential 8™ 배지이다.
[0089] 사람 세포와 함께 사용되는 배지, 세포외 매트릭스 또는 배양 시스템에 대해, 용어 “제노-프리(Xeno-Free) (Xf)”는 사용되는 물질이 비-사람 동물-기원이 아닌 조건을 언급한다.
[0090] “융합전” 이라는 말은 세포에 의해 덮혀지는 배양액 표면의 비율이 약 60-80%인 세포 배양액을 지칭한다. 보통, 융합전이라는것은 배양액 표면의 약 70%가 세포에 의해 덮혀진 배양액을 가리킨다.
[0091] 또한 “망막 전구체 세포” 또는 “RPC”로 불리우는 용어 "망막 선조체 세포"는 간상, 원추체, 광수용체 전구체 세포, 및 RPE로 분화할 수 있는 세포를 포함하는 모든 세포 유형의 망막을 생성하기에 적격인 세포를 포함한다.
[0092] 용어 “뉴런 망막 선조체” 또는 “NRP”는 뉴런 망막 세포 유형으로의 이들의 분화 잠재력에서 제한되는 세포를 언급한다.
[0093] 용어 "광수용체" 또는 "PR" 세포는 광수용체 세포(간상, 원추체 또는 둘 다)의 초기 및 후기 마커 둘다를 포괄하는 (간상) 또는 임의의 3개의 원추체 옵신(원추체) 발현의 상향조절 전 및 후에 광수용체 계통(즉, 성숙) 경로 내에 있는 세포를 지칭한다.
[0094] 용어 “광수용체 전구체 세포” 및 “PRP”는 세포 마커 로돕신 또는 3개의 원추체 옵신 중 어느 하나를 발현하는 광수용체 세포로 분화할 수 있는 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 세포를 지칭한다. 광수용체는 간상 및/또는 원추체체 광수용체일 수 있다.
[0095] “망막 색소 상피”는 혈관으로 채워진 층인 맥락막과 뉴런 망막 사이의 색소 침착된 세포의 층을 언급한다.
[0096] 용어 "망막 변성-관련된 질환"은 선천적 또는 후천적 망막 변성 또는 비정상으로부터 비롯된 임의의 질환을 언급하는 것으로 의도된다. 망막변성 관련 질환의 예는 망막 이형성증, 망막 변성, 연령 관련 황반 변성, 스타가르트 질환, 베스트 질환, 맥락막 결절증, 유전성 황반 변성, 근시 변성, RPE 찢어짐, 황반 원공, 당뇨 망막병증, 망막 색소변성증, 유전성 망막 질환 또는 변성, 유전성 황반 변성, 원추체-간상 이영양증, 간상-원추체 이영양증, 선천성 망막 이영양증, 레버 선천성 흑암시, 망막 박리 및 망막 외상을 포함한다.
[0097] 본원에 사용된 “치료학적 유효량”은 화합물이 질환 또는 병태의 치료를 위해 투여될 때 그러한 치료를 유효화하기에 충분한 화합물의 양을 언급한다.
[0098] “성숙한” RPE 세포는 본원에서 Pax6과 같은 미성숙한 RPE 마커의 하향 발현 및 RPE65와 같은 성숙한 RPE 마커의 상향 발현된 RPE 세포로 지칭된다.
[0099] RPE 세포 “성숙”은 RPE 발달 경로를 조절하여 성숙한 RPE 세포를 생성하는 과정을 일컫는다. 예를 들어, 섬모 기능의 조절은 RPE 성숙을 유도할 수 있다.
[00100] “유도제”는 본원에서 세포 내에서 유전자를 활성화시키는 것과 같이 유전자 발현을 조절하는 분자로 정의된다. 유도제는 억제제 또는 활성제에 결합할 수 있다. 유도제는 억제제를 무능력하게 함으로서 기능한다.
[00101] 본원에서 사용되는 바와 같이, "RPE-PR/PRP 별개의 이중층"이라는 용어는 층 접착, 각각의 세포 유형 및 층 계층화에서 예상되는 마커의 유지를 갖는 공동-배양을 지칭한다.
[00102] 본원에서 사용되는 바와 같이, "생착된" 이중층이라는 용어는 이식된 세포를 숙주 망막으로 생착하고 이식된 세포와 숙주 세포가 시냅스를 형성할 준비가 되도록 시냅스전 및 시냅스후 기구를 형성하는 것을 지칭한다.
[00103] 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생분해성"은 전달된 세포에 대한 초기 구조적 지지를 제공하지만 시간 경과에 따라 이식체 숙주에 독성이 없고 공여 부위 이환율에 기여하지 않는 생성물로 분해되는 물질을 지칭한다.
II. 유도성 만능 줄기 세포
[00104] 만능성의 유도는 만능성과 연관된 전사 인자의 도입을 통한 체세포의 재프로그래밍에 의해 2006년에 마우스 세포를 사용하여 (Yamanaka et al. 2006), 그리고 2007년에 사람 세포를 사용하여 (Yu et al. 2007;Takahashi et al. 2007) 달성되었다. 만능 줄기 세포는 미분화 상태로 유지될 수 있어 임의의 성체 세포형으로 분화될 수 있다.
[00105] 생식계열 세포를 제외하고는, 어떤 체세포라도 iPCS를 위한 출발점으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 유형은 케라틴세포, 섬유아세포, 조혈 세포, 간엽 세포, 간 세포 또는 위 세포일 수 있다. T 세포는 재프로그래밍을 위한 체세포 공급원으로도 사용될 수 있다 (미국 특허 제8,741,648호). 세포 분화의 정도 또는 해당 세포가 수집되는 동물의 연령에는 제한이 없으며; 미분화 간세포 (체세포 줄기 세포를 포함) 및 최종적으로 분화된 성숙한 세포조차도 본원에 개시된 방법에서 체세포의 공급원으로 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 체세포는 그 자체가 PR/PRP 또는 PRP 세포, 예를 들어, 사람 PR/PRP 또는 RPE 세포이다. PR/PRP 또는 RPE 세포는 성체 또는 태아 PR/PRP 또는 RPE 세포일 수 있다. iPSC는 사람 ES 세포를 특정 세포형으로 분화시키는 것으로 알려진 조건 하에 성장하여, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81를 비롯한 사람 ES 세포 마커를 발현할 수 있다.
A. 출발 세포의 HLA
[00106] 주요 조직적합성 복합체(MHC)는 동종이계 기관 이식의 면역 거부에 있어서 주된 요인이다. 3개의 주요 부류 I MHC 반수체형 (A, B 및 C)과 3개의 주요 MHC 부류 II 반수체형 (DR, DP 및 DQ)이 존재한다.
[00107] 공여체와 수용체간의 MHC 조직적합성은, 공여체 세포가 HLA 동형접합성, 즉 각 항원 제시 단백질에 대해 동일한 대립유전자를 포함하는 경우에 크게 증가한다. 대부분의 개체들은 MHC 클래스 I 및 II 유전자에 대해 이형접합성이지만, 특정 개체들은 이러한 유전자들에 대해 동형접합성이다. 이들 동형접합성 개체들은 초 공여자로서 기능할 수 있으며, 이들의 세포로부터 생성된 이식편은 해당 반수체형에 대해 동형접합성 또는 이형접합성인 모든 개체에 이식될 수 있다. 추가로, 동형접합성 공여자 세포가 한 집단에서 높은 빈도수로 발견되는 반수체형을 보유하는 경우, 이러한 세포들은 다수의 개체들을 위한 이식 요법에 적용할 수 있다.
[00108] 따라서, iPSC는 치료될 대상체, 또는 해당 환자와 동일하거나 실질적으로 동일한 HLA 유형을 갖는 또 다른 대상체로부터 생성될 수 있다. 한 경우에 있어서, 공여자의 주요 HLA (예를 들어, HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 3개의 주요 유전자좌)는 수용자의 주요 HLA와 동일하다. 일부의 경우, 체세포 공여자는 초 공여자일 수 있어서; MHC 동형접합성 초 공여자로부터 유래한 iPSC는 PR/PRP 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 초 공여자로부터 유래한 iPSC는 해당 반수체형에 대해 동형접합성 또는 이형접합성인 대상체에 이식될 수 있다. 예를 들어, iPSC는 2개의 HLA 대립유전자, 예를 들어 HLA-A 및 HLA-B에 동형접합성일 수 있다. 이와 같이, 초 공여자로부터 생성된 iPSC는 다수의 잠재적인 수용자들을 잠재적으로 “매칭”할 수 있는 PR/PRP 세포를 생성하기 위한 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다.
B. 재프로그래밍 인자
[00109] 체세포는 당업자에게 공지된 방법들을 사용하여 재프로그래밍되어 유도성 만능 줄기 세포 (iPSC)를 생성할 수 있다. 당업자라면 유도된 만능 줄기 세포를 용이하게 생성할 수 있으며, 이에 대해서는 예를 들어, 공개된 미국 특허출원 20090246875호, 공개된 미국 특허출원 2010/0210014호; 공개된 미국 특허출원 20120276636호; 미국특허 8,058,065호; 미국특허 8,129,187호; 미국특허 8,278,620호; PCT 공보 WO 2007/069666 A1호, 및 미국특허 8,268,620호를 참조하고, 이들은 본원에 참고로 포함된다. 일반적으로, 핵 재프로그래밍 인자를 사용하여 체세로로부터 만능 줄기 세포를 생성한다. 일부 구현예에서, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog 및 Lin28을 사용한다. 다른 구현예에서, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4를 사용한다.
[00110] 세포는 핵 재프로그래밍 물질로 처리하는데, 이는 일반적으로 체세포 또는 이러한 물질들을 암호화하는 핵산으로부터 iPCS를 유도할 수 있는 하나 이상의 인자들이다 (벡터 내에 통합된 형태를 포함함). 상기 핵 재프로그래밍 물질은 일반적으로 적어도 Oct3/4, Klf4 및 Sox2 또는 이러한 분자들을 암호화하는 핵산을 포함한다. p53의 기능적 억제제인 L-myc, 또는 L-myc를 암호화하는 핵산, 및 Lin28 또는 Lin28b, 또는 Lin28 또는 Lin28b를 암호화하는 핵산은 추가의 핵 재프로그래밍 물질로 사용될 수 있다. Nanog도 핵 재프로그래밍을 위해 사용될 수 있다. 공개된 미국 특허출원 20120196360호에 개시된 바와 같이, iPCS의 제조를 위한 대표적인 재프로그래밍 인자로는 (1) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc (Sox2는 Soxl, Sox3, Soxl5, Soxl7 또는 Soxl8로 대체될 수 있으며; Klf4는 Klfl, Klf2 또는 Klf5로 대체가능함); (2) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, SV40 거대 T 항원 (SV40LT); (3) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, 사람 유두종 바이러스 (HPV)16 E6; (4) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E7 (5) Oct3/4, Klf4, Sox2, L- Myc, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7; (6) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, Bmil; (7) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28; (8) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, SV40LT; (9) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, TERT, SV40LT; (10) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, SV40LT; (11) Oct3/4, Esrrb, Sox2, L-Myc (Esrrb는 Esrrg로 대체가능함); (12) Oct3/4, Klf4, Sox2; (13) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, SV40LT; (14) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HP VI 6 E6; (15) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E7; (16) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7; (17) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, Bmil; (18) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28 (19) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, SV40LT; (20) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, TERT, SV40LT; (21) Oct3/4, Klf4, Sox2, SV40LT; 또는 (22) Oct3/4, Esrrb, Sox2 (Esrrb는 Esrrg로 대체가능함)를 포함한다. 비제한적인 한 예에서, Oct3/4, Klf4, Sox2 및 c-Myc가 사용된다. 다른 구현예에서, Oct4, Nanog 및 Sox2가 사용되는데, 예를 들어, 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 제7,682,828호를 참조한다. 이러한 인자들로는, 이에 제한되지는 않지만, Oct3/4, Klf4 및 Sox2를 포함한다. 다른 예에서, 상기 인자들로는, 이에 제한되지는 않지만 Oct 3/4, Klf4 및 Myc를 포함한다. 일부 비제한적인 예에서, Oct3/4, Klf4, c-Myc 및 Sox2가 사용된다. 다른 비제한적인 예에서, Oct3/4, Klf4, Sox2 및 Sal 4가 사용된다. Nanog, Lin28, Klf4 또는 c-Myc와 같은 인자들은 재프로그래밍 효율을 증가시킬 수 있으며, 수개의 서로 다른 발현 벡터들로부터 발현될 수 있다. 예를 들어, 통합 벡터, 예를 들어 EBV 성분 기반 시스템이 사용될 수 있다 (미국특허 8,546,140). 추가의 양태에서, 재프로그래밍 단백질은 단백질 형질도입에 의해 체세포 내로 직접 도입될 수 있다. 재프로그래밍은 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK-3) 억제제, 미토겐 활성화 단백질 키나제 (MEK) 억제제, 형질전환 생장 인자 베타 (TGF-β) 수용체 억제제 또는 신호전달 억제제, 백혈병 억제인자 (LIF), a p53 억제제, NF-카파 B 억제제 또는 이들의 조합을 비롯한 하나 이상의 신호전달 수용체로 세포를 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 조절자로는 소분자, 억제성 뉴클레오타이드, 발현 카세트, 또는 단백질 인자를 포함할 수 있다. 사실상 모든 임의의 iPS 세포 또는 세포주가 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
[00111] 이러한 핵 재프로그래밍 물질의 마우스 및 사람 cDNA 서열은 본원에 참고로 포함되는 WO 2007/069666호에 언급된 NCBI 등록 번호를 참조하여 이용가능하다. 하나 이상의 재프로그래밍 물질, 또는 이러한 재프로그래밍 물질을 암호화하는 핵산을 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 공개된 미국 특허 출원 제2012/0196360호 및 미국 특허 제8,071,369호에 기재되어 있고, 상기 2개의 문헌은 본원에 참고로 인용된다.
[00112] iPSC는 일단 유도되면 다능성을 유지하기에 충분한 배지 중에서 배양될 수 있다. iPSC는 미국 특허 7,442,548호 및 미국 특허 공개 공보 제2003/0211603호에 기술된 바와 같은 만능 줄기 세포, 보다 구체적으로, 배아 줄기 세포를 배양하기 위해 개발된 다양한 배지 및 기술과 함께 사용될 수 있다. 마우스 세포의 경우, 통상적인 배지에 분화 억제 인자로서 백혈병 억제인자 (LIF)를 첨가하여 배양을 수행한다. 사람 세포의 경우, LIF 대신에 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)를 첨가하는 것이 요망될 수 있다. 당업계의 숙련자에게 공지된 바와 같은 iPSC의 배양 및 유지를 위한 기타 방법들도 사용될 수 있다.
[00113] 특정 구현예에서, 비한정 조건이 사용될 수 있는데; 예를 들어, 만능 세포는 섬유아세포 피더 또는 줄기 세포를 미분화 상태로 유지하기 위해 섬유아세포 피더에 노출시킨 배지 상에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 피더 세포로서 세포 분열을 종료시키기 위해 방사선 또는 항생제로 처리된 마우스 배아 섬유아세포의 공존 하에 배양된다. 대안적으로, 만능 세포는 TESR™ 배지 (Ludwig et al., 2006a; Ludwig et al., 2006b) 또는 E8™ 배지 (Chen et al., 2011)와 같은 합성된 피더 독립적인 배양 시스템을 사용하여 배양되어 본질적으로 미분화 상태로 유지될 수 있다.
C. 플라스미드
[00114] 일부 구현예에서, iPSC는 프로모터 및 제1 마커를 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인핸서를 포함하는 것과 같이 외인성 핵산을 발현하도록 변형될 수 있다. 적합한 프로모터로는, 이에 제한되지는 않지만, 로돕신 키나제 프로모터와 같은, 광수용체 세포에서 발현되는 임의의 프로모터를 포함한다. 또한, 작제물은 해독 개시를 위한 리보솜 결합 부위 (내부 리보솜 결합 서열) 및 전사/번역 종결자와 같은 기타 요소들도 포함할 수 있다. 일반적으로, 세포를 작제물로 형질감염시키는 것이 유리하다. 안정한 형질감염을 위해 적절한 벡터로는, 이에 제한되지는 않지만 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 센다이 바이러스를 포함한다.
[00115] 일부 구현예에서 마커를 암호화하는 플라스미드는 다음으로 구성된다: (1) 고복제수의 복제 원점, (2) 선택가능한 마커, 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 카나마이신을 이용한 항생제 선별을 위한 네오 유전자, (3) 티로신 인핸서를 포함하는, 전사 종결 서열, (4) 다양한 핵산 카세트의 도입을 위한 멀티클로닝 부위; 및 (5) 티로시나제 프로모터에 작동가능하게 연결된 마커를 암호화하는 핵산서열. 단백질을 암호화하는 핵산을 유도하기 위해 당업계에 공지된 수많은 플라스미드 벡터들이 존재한다. 이들의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 미국특허 6,103,470호; 미국특허 7,598,364호; 미국특허 7,989,425호; 및 미국특허 6,416,998호에 개시된 벡터들을포함하며, 상기 특허문헌들은 본원에 참고로 포함된다.
[00116] 바이러스 유전자 전달 시스템은 RNA계 또는 DNA계 바이러스 벡터일 수 있다. 에피좀 유전자 전달 시스템은 플라스미드, 엡스타인-바르 바이러스 (EBV)계 에피좀 벡터, 효모계 벡터, 아데노바이러스계 벡터, 유인원 바이러스 40 (SV40)계 에피좀 벡터, 소 유두종 바이러스 (BPV)계 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
[00117] 마커로는, 이에 제한되지는 않지만, 형광 단백질 (예를 들어, 녹색 형광 단백질 또는 적색 형광 단백질), 효소 (예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리 포스파타제 또는 반딧불이/레닐라 루시퍼라제 또는 나노럭), 또는 기타 단백질을 포함한다. 마커는 단백질 (분비된, 세포 표면, 또는 내부 단백질 포함; 합성되거나 또는 세포에 의해 수취됨); 핵산 (예를 들어 mRNA, 또는 효소적으로 활성인 핵산 분자) 또는 다당류일 수 있다. 항체, 렉틴, 프로브 또는 관심 세포형의 마커에 특이적인 핵산 증폭 반응에 의해 검출가능한 임의의 이러한 세포 성분들의 결정자도 포함된다. 상기 마커들은 생화학적 또는 효소 검정, 또는 유전자 생성물의 기능에 의존하는 생물학적 반응에 의해 확인될 수도 있다. 이러한 마커들을 암호화하는 핵산 서열은 티로신 인핸서에 작동가능하게 연결될 수 있다. 또한, 다른 유전자들은 예를 들어, PRP 분화, 또는 광수용체 기능, 또는 생리학, 또는 병리학에 대해 줄기 세포에 영향을 줄 수 있는 유전자들도 포함될 수 있다.
D. 전달 시스템
[00118] 현재 개시내용과 함께 DNA 또는 RNA와 같은 핵산의 RPE 또는 PR/PRP로 프로그래밍될 만능 줄기 세포로의 도입은 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이 세포의 형질전환을 위한 핵산 전달을 위해 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 상기 방법은 예를 들어, 생체외 형질감염에 의한(Wilson et al., 1989, Nabel et al, 1989), 주사에 의한(미국 특허 제5,994,624호, 제5,981,274호, 제5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호, 이의 각각은 본원에 참조로 인용된다)(이는 마이크로주사(Harland and Weintraub, 1985; 미국 특허 제5,789,215, 본원에 참조로 인용된다)를 포함함); 전기천공에 의해(미국 특허 제5,384,253호, 본원에 참조로 인용됨; Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984); 인산칼슘 침전에 의해(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe　et　al.,　1990); DEAE-덱스트란에 이어서 폴리에틸렌 글리콜을 사용함에 의해(Gopal, 1985); 직접적인 음파 로딩에 의해(Fechheimer　et　al.,　1987); 리포좀 매개된 형질감염(Nicolau and Sene, 1982; Fraley　et　al.,　1979; Nicolau　et　al.,　1987; Wong　et　al., 1980; Kaneda　et　al.,　1989; Kato　et　al.,　1991) 및 수용체-개매된 형질감염에 의해 (Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988); 마이크로추진 충격에 의해(PCT Application Nos. WO 94/09699 and 95/06128; 미국 특허 제5,610,042호; 제5,322,783호, 제5,563,055호, 제5,550,318호, 제5,538,877호 및 제5,538,880호, 및 이의 각각은 본원에 참조로 인용됨); 탄화규소 섬유과 함께 진탕에 의해(Kaeppler　et　al.,　1990; 미국 특허 제5,302,523호 및 제5,464,765호, 이의 각각은 본원에 참조로 인용된다); 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환에 의해 (미국 특허 제5,591,616호 및 제5,563,055호, 각각은 본원에 참조로 인용됨); 건조/억제-매개된 DNA 취득에 의해(Potrykus　et　al.,　1985), 및 상기 방법의 임의의 조합과 같은 DNA의 직접적인 전달을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들과 같은 기술의 적용을 통해, 기관(들), 세포(들), 조직 (들) 또는 유기체(들)은 안정하게 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다.
1. 바이러스 벡터
[00119] 바이러스 벡터는 본원 개시내용의 특정 양상에서 제공될 수 있다. 재조합 바이러스 벡터를 생성하는데 있어서, 비-필수 유전자는 전형적으로 이종성 (또는 비-고유) 단백질에 대한 유전자 또는 암호화 서열로 대체된다. 바이러스 벡터는 일종의 발현 작제물이고 이는 핵산 및 능히 단백질을 세포로 도입하기 위해 바이러스 서열을 사용한다. 특정 바이러스가 세포를 감염시키거나 수용체-매개된 세포내이입을 통해 세포에 진입하고 숙주 세포 게놈에 통합하고 안정하게 및 효율적으로 바이러스 유전자를 발현시키는 능력은 이들이 외래 핵산의 세포 (예를 들어, 포유동물 세포)로의 전달을 위해 매력적인 후보물이 되게 한다. 본원의 개시내용의 특정 양상의 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 하기에 기재되어 있다.
[00120] 레트로바이러스는 이들의 유전자를 숙주 게놈에 통합시키고 대량의 외래 유전학적 물질을 전달하고, 광범위한 종 및 세포 유형을 감염시키고 특수 세포-주에서 팩키징되는 이들의 능력으로 인해 유전자 전달 벡터로서 유망하다(문헌참조: Miller, 1992).
[00121] 레트로바이러스 벡터를 작제하기 위해, 핵산은 특정 바이러스 서열 대신 바이러스 게놈에 삽입되어 복제-결함인 바이러스를 생성한다. 비리온을 생성하기 위해, gag, pol, 및 env 유전자를 함유하지만 LTR 및 팩키징 성분이 없는 팩키징 세포주를 작제한다(문헌참조: Mann　et al.,　1983). 레트로바이러스 LTR 및 팩키징 서열과 함께 cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드가 특수 세포주로 도입되는 경우 (예를 들어, 인산칼슘 침전에 의해), 팩키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자로 팩키징되도록 하고 이어서 이는 배양 배지로 분비된다(문헌참조: Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann　et al.,　1983). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 이어서 수거하고, 임의로 농축시키고 유전자 전달을 위해 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 광범위한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 요구한다(문헌참조: Paskind　et al.,　1975).
[00122] 렌티바이러스는 통상의 레트로바이러스 유전자 gag, pol, 및 env외에 , 조절 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자들을 함유하는 복합 레트로바이러스이다. 렌티바이러스 벡터는 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: 예를 들어, Naldini et al., 1996; Zufferey et al., 1997; Blomer et al., 1997; U.S. Patents 6,013,516 and 5,994,136).
[00123] 재조합 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고 생체내 및 생체외 유전자 전달 및 핵산 서열의 발현 둘다를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 비-분열 세포-여기서, 적합한 숙주 세포는 팩키징 기능, 즉, gag, pol 및 env, 및 rev 및 tat를 함유하는 2개 이상의 벡터로 형질감염된다―를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스는 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,994,136호에 기재되어 있다.
2. 에피좀 벡터
[00124] 플라스미드-또는 리포좀-기반 염색체외 (즉, 에피좀) 벡터의 사용은 또한 본원의 개시내용의 특정 양상에서 제공될 수 있다. 상기 에피좀 벡터는 예를 들어, oriP-기반 벡터, 및/또는 EBNA-1의 유도체를 암호화하는 벡터를 포함할 수 있다. 이들 벡터는 DNA의 큰 단편이 세포로 도입되고 염색체 외부에서 유지되고 세포 사이클 당 1회 복제되고 딸 세포를 효율적으로 분할시키고 실질적으로 어떠한 면역 반응을 유발할 수 없도록한다.
[00125] 특히, oriP-기반 발현 벡터의 복제를 위해 요구되는 유일한 바이러스 단백질인 EBNA-1은 세포 면역 반응을 유발하지 않는데 그 이유는 이것이 MHC 부류 I 분자의 제공을 위해 요구되는 프로세싱을 우회하는 효율적인 기전을 발달시키기 때문이다(문헌참조: Levitskaya et al., 1997). 추가로, EBNA-1은 트랜스로 작용하여, 클로닝된 유전자의 발현을 증진시킬 수 있고, 일부 세포주에서 100배까지 클로닝된 유전자의 발현을 유도할 수 있다(문헌참조: Langle-Rouault et al., 1998; Evans et al., 1997). 최종적으로, 상기 oriP-기반 발현 벡터의 제조는 저렴하다.
[00126] 특정 양상에서, 재프로그래밍 인자는 하나 이상의 외인성 에피좀 유전적 요소에 포함된 발현 카세트로부터 발현된다 (본원에 참조로 인용되는 미국 특허 공개공보 2010/0003757 참조). 따라서, iPS는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 요소와 같은 외인성 유전적 요소가 필수적으로 부재일 수 있다. 이러한 iPSC들은 외인성 벡터 또는 바이러스 요소가 필수적으로 없는 iPSC를 만들기 위해 에피솜 복제가 가능한 벡터인, 염색체외 복제 벡터 (즉, 에피솜 벡터)를 사용하여 제조된다 (본원에 참고로 포함되는 미국특허 8,546,140호; Yu et al., 2009). 다수의 DNA 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스, 유인원 액포형 바이러스 40 (SV40) 또는 소 유두종 바이러스 (BPV), 또는 출아 효모 ARS (Autonomously Replicating Sequences, 복제기점염기순서) 함유 플라스미드는 포유동물 세포 내에서 염색체외 또는 에피좀 복제를 한다. 이러한 에피좀 플라스미드는 필수적으로 통합 벡터와 관련된 이러한 모든 난점들 (Bode et al., 2001)이 부재이다. 예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 림프구친화성 heRPE 바이러스계 포함 또는 엡스타인 바르 바이러스 (EBV)는 염색체외 복제를 하여 재프로그래밍 유전자를 체세포로 전달하는데 도움을 줄 수 있다. 유용한 EBV 요소로는 OriP 및 EBNA-1, 또는 이들의 변이체 또는 기능적 균등물을 들 수 있다. 에피솜 벡터의 추가의 장점은 외인성 요소가 세포에 도입된 후 시간이 감에 따라 상실되어 필수적으로 이러한 요소가 없는 자립형 iPSC를 유도할 수 있다는 것이다.
[00127] 다른 염색체외 벡터로는 다른 림프구친화성 헤르페스 바이러스계 벡터를 포함한다. 림프구친화성 헤르페스 바이러스는 림프아세포 (예를 들어, 사람 B 림프아세포) 내에서 복제하여 그의 자연적인 수명 주기의 일부에 대한 플라스미드가 되는 헤르페스 바이러스이다. 단순 헤르페스 바이러스 (HSV)는 "림프구친화성" 헤르페스 바이러스는 아니다. 전형적인 림프구친화성 헤르페스 바이러스는, 이에 제한되지는 않지만 EBV, 카포시 육종 헤르페스 바이러스 (KSHV); 다람쥐원숭이 헤르페스 바이러스 (HS) 및 마렉병 바이러스 (MDV)를 포함한다. 또한, 에피좀계 벡터의 다른 공급원이 고려되고, 예를 들어, 효모 ARS, 아데노바이러스, SV40, 또는 BPV가 있다.
[00128] 당업자는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제하기 위한 장비를 잘 갖추고 있다(문헌참조: 예를 들어, Maniatis et al., 1988 and Ausubel et al., 1994, 이 둘다는 본원에 참조로 인용된다).
[00129] 벡터는 또한 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하거나 다르게는 표적화된 세포에 유익한 성질을 제공하는 다른 성분 또는 기능을 포함할 수 있다. 상기 다른 성분은 예를 들어, 세포로의 결합 또는 표적화에 영향을 주는 성분들(세포-유형 또는 조직-특이적 결합을 매개하는 성분들을 포함하는); 벡터 핵산의 세포에 의한 취득에 영향을 주는 성분들; 취득 후 세포 내 폴리뉴클레오타이드의 위치화에 영향을 주는 성분들(핵 위치화를 매개하는 매개하는 제제들과 같은); 및 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향을 주는 성분들을 포함한다.
[00130] 상기 성분들은 또한 핵산을 취득하고 벡터에 의해 전달된 핵산을 발현하는 세포를 검출하거나 선택하기 위해 사용될 수 있는 검출가능한 마커 및/또는 선택 마커와 같은 마커를 포함할 수 있다. 상기 성분들은 벡터의 천연 특성 (성분 또는 기능 매개 결합 및 취득을 갖는 특정 바이러스 벡터의 용도와 같은)으로서 제공되거나 벡터는 변형되어 상기 기능을 제공할 수 있다. 다양한 상기 벡터는 당업계에 공지되어 있고 일반적으로 가용하다. 벡터가 숙주 세포에 유지되는 경우, 상기 벡터는 숙주 세포의 게놈내에 혼입되어 있는 자율적 구조체로서 감수분열 동안에 세포에 의해 안정하게 복제될수 있거나 숙주 세포의 핵 또는 세포질에 유지될 수 있다.
3. 조절 요소들
[00131] 본원의 개시내용에 유용한 재프로그래밍 벡터에 포함된 발현 카세트는 바람직하게 (5'-에서-3' 방향으로) 단백질 암호화 서열에 작동적으로 연결된 진핵 전사 프로모터, 삽입 서열을 포함하는 스플라이스 신호, 및 전사 종결/폴리아데닐화 서열을 함유한다.
b. 프로모터/인핸서
[00132] 본원에 제공된 발현 작제물은 프로그래밍 유전자의 발현을 구동시키기 위해 프로모터를 포함한다. 프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 개시 부위를 위치시키는 기능을 하는 서열을 포함한다. 이의 최상의 공지된 예는 TATA 박스이지만, 예를 들어, 포유동물 종결 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 레이트 유전자에 대한 프로모터와 같이 TATA 박스가 부재인 일부 프로모터에서, 개시 부위 자체 위에 위치한 구분된 요소는 개시 위치를 고정시키는 것을 도와준다. 추가의 프로모터 요소들은 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 개시 부위의 30-110　bp 업스트림 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터는 또한 개시 부위의 다운스트림에 기능성 요소들을 함유하는 것으로 나타났다. 암호화 서열을 프로모터“의 제어하에” 있도록 하기 위해, 하나는 선택된 프로모터의 “다운스트림”(즉, 3')에 전사 판독 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단에 위치한다. “업스트림” 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 암호화된 RNA의 발현을 촉진시킨다.
[00133] 프로모터 요소들 사이의 공간은 흔히 가요성이어서 프로모터 기능은 요소들이 서로 상대적으로 역위되거나 이동되는 경우 보존된다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소들 간의 공간은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50bp 이격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 의존하여, 이것은 개별 요소들이 전사를 활성화시키기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있음을 나타낸다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용 조절 서열을 언급하는 “인핸서”와 연계하여 사용되거나 사용되지 않을 수 있다.
[00134] 프로모터는 암호화 분절 및/또는 엑손의 업스트림에 위치한 5* 비-암호화 서열을 단리시킴에 의해 수득될 수 있는 바와 같이 핵산 서열과 천연적으로 연합된 것일 수 있다. 상기 프로모터는 “내인성”으로서 언급될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 상기 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한, 핵산 서열과 천연적으로 연관된 것일 수 있다. 대안적으로, 특정 이점은 정상적으로 이의 천연 환경에서 핵산 서열과 연합되지 않은 프로모터 프로모터를 언급하는, 재조합 또는 이종성 프로모터의 제어하에 암호화 핵산 분절을 위치시킴에 의해 획득될 수 있다. 재조합 또는 이종성 인핸서는 또한 이의 천연 환경에서 핵산 성려과 정상적으로 연합되지 않은 인핸서를 언급한다. 상기 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 바이러스, 원핵 세포 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 “천연적으로 존재”하지 않는, 즉, 발현을 변화시키는 상이한 전사 조절 영역, 및/또는 돌연변이의 상이한 요소들을 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 작제물에서 대부분 통상적으로 사용되는 프로모터는 β-락타마제 (페니실리나제), 락토스 및 트립토판 (trp) 프로모터 시스템을 포함한다. 합성적으로 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 생성하는 것에 추가로, 서열은 본원에 기재된 조성물과 연계하여 PCR™을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다(문헌참조: 미국 특허 제4,683,202호 및 제5,928,906호, 각각은 본원에 참조로 인용된다). 추가로, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비-핵 기관 내 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열이 또한 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
[00135] 천연적으로, 기관(organelle), 세포 유형, 기관(organ), 또는 발현을 위해 선택된 유기체 내에서 DNA 분절의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요하다. 분자 생물학적 분야의 당업자는 일반적으로 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합의 사용을 알고 있다(문헌참조: 예를 들어, Sambrook et　al. 1989, 본원에 참조로 인용됨). 사용되는 프로모터는 항상성, 조직-특이적, 유도성일 수 있고/있거나 도입된 DNA 분절의 고수준의 발현을 지시하기 위해 적당한 조건하에서 유용할 수 있고, 예를 들어, 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대규모 생성에 유리하다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.
[00136] 추가로 임의의 프로모터/인핸서 조합(예를 들어, 진핵 세포 프로모터 데이터 베이스 EPDB 당)은 또한 발현을 구동시키기 위해 사용될 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 또 다른 가능한 구현예이다. 진핵 세포는 적당한 세균 폴리머라제가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가의 유전학적 발현 작제물의 일부로서 제공된 경우 특정 세균 프로모터로부터의 세포질 전사를 지지할 수 있다.
[00137] 프로모터의 비제한적인 예는 어얼리 또는 레이트 바이러스 프로모터, 예를 들어, SV40 어얼리 또는 레이트 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 이메디에이트 어얼리 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 어얼리 프로모터; 진핵 세포 프로모터, 예를 들어, 베타 액틴 프로모터 (Ng, 1989; Quitsche et al., 1989), GADPH 프로모터 (Alexander et al., 1988, Ercolani et al., 1988), 메탈로티오네인 프로모터(Karin et al., 1989; Richards et al., 1984); 및 연결된(concatenated) 반응 요소 프로모터들, 예를 들어, 사이클릭 AMP 반응 요소 프로모터들 (cre), 혈청 반응 요소 프로모터 (sre), 포르볼 (phorbol) 에스테르 프로모터 (TPA) 및 최소 TATA 박스 부근의 반응 요소 프로모터들 (tre)를 포함한다. 또한 사람 성장 호르몬 프로모터 서열(예를 들어, Genbank에 기재된 사람 성장 호르몬 최소 프로모터, 승인 번호 X05244, 뉴클레오타이드 283-341) 또는 마우스 유방 종양 프로모터(ATCC, Cat. No. ATCC 45007로부터 가용한)를 사용할 수 있다.
[00138] 특히, 프로그래밍으로부터 유래된 조혈 세포 및 조혈 세포의 전구체에서 리포터 유전자 발현을 위한 조직-특이적 전이유전자 발현은 유래된 조혈 세포 및 전구체를 동정하기 위한 방식으로서 바람직할 수 있다. 특이성 및 활성 둘다를 증가시키기 위해, 시스-작용 조절 요소들의 사용이 고려되었다. 예를 들어, 조혈 세포-특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 이러한 많은 조혈 세포 특이적 프로모터는 당업계에 공지되어 있다.
[00139] 특정 양상에서, 본 개시내용의 방법은 또한 인핸서 서열, 즉, 프로모터의 활성을 증가시키고 시스로 작용하고 이들의 배향과 무관하에 심지어 보다 상대적으로 긴 거리 (표적 프로모터로부터 수킬로베이스까지 이격되어 있는)에서 작용할 잠재력을 갖는 핵산 서열에 관한 것이다. 그러나, 인핸서 기능은 이들이 또한 소정의 프로모터에 근접하여 기능할 수 있으므로 필수적으로 상기 긴 거리에 제한되지 않는다.
[00140] 많은 조혈 세포 프로모터 및 인핸서 서열이 동정되었고 본 발명의 방법에 유용할 수 있다. 하기 문헌을 참조한다: 예를 들어, 미국 특허 제5,556,954호; 미국 특허 출원 제20020055144호; 미국 특허 출원 제20090148425호.
c. 개시 신호 및 연계된 발현
[00141] 특정 개시 신호는 또한 암호화 서열의 효율적인 해독을 위해 본원의 개시내용에 제공된 발현 작제물에 사용될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열을 포함한다. 외인성 해독 제어 신호는 ATG 개시 코돈을 포함하고 제공될 필요가 있을 수 있다. 당업자는 이를 용이하게 결정할 수 있고 필요한 신호를 제공할 수 있다. 개시 코돈은 전체 삽입체의 해독을 보장하기 위해 목적하는 암호화 서열의 판독 프레임과 “인 프레임”으로 있어야 한다는 것은 널리 공지되어 있다. 외인성 해독 제어 신호 및 개시 코돈은 천연이거나 합성일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 인핸서 요소들의 내포에 의해 증진될 수 있다.
[00142] 특정 구현예에서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소들을 사용하여 다중유전자, 또는 폴리시스트론 메시지를 생성한다. IRES 요소들은 5 메틸화된 캡 의존성 해독의 리보솜 스캐닝 모델을 우회할 수 있고 내부 부위에서 해독을 개시할 수 있다(문헌참조: Pelletier and Sonenberg, 1988). 피코나바이러스 패밀리의 2개의 구성원 (소아마비 및 뇌척수심근염)으로부터의 IRES 요소들은 문헌 (참조:Pelletier and Sonenberg, 1988)에 기재되었고, 또한 포유동물 메시지로부터의 IRES가 기재되어 있다(문헌참조: Macejak and Sarnow, 1991). IRES 요소들은 이종성 개방 판독 프레임에 연결될 수 있다. 다중 개방 판독 프레임은 함께 전사될 수 있고 각각은 IRES에 의해 분리되어 있고 폴리시스트론 메시지를 생성한다. IRES 요소에 의해, 각각의 개방 판독 프레임은 효율적인 해독을 위해 리보솜에 접근할 수 있다. 다중 유전자는 단일 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현될 수 있다(문헌참조: 미국 특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호, 각각은 본원에 참조로 인용된다).
[00143] 추가로, 특정 2A 서열 요소들을 사용하여 본원의 개시내용에 제공된 작제물 내 프로그래밍 유전자의 연결되거나 동시 발현을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 절단 서열을 사용하여 단일 시스트론을 형성하기 위해 개방 판독 프레임들을 연결시킴에 의해 유전자들을 공동 발현시킬 수 있다. 예시적 절단 서열은 F2A (구제역 질환 바이러스 2A) 또는 “2A-유사” 서열(예를 들어, 토세아 아시그나 바이러스 2A; T2A)이다. (Minskaia and Ryan, 2013). 특정 구현예에서, F2A-절단 펩타이드를 사용하여 다중-계통 작제물 내 유전자들의 발현을 연결한다.
d. 복제 오리진
[00144] 숙주 세포 내 벡터를 증가시키기 위해, 하나 이상의 복제 오리진 부위 (흔히 “ori”로 칭함), 예를 들어, 상기된 바와 같이 EBV의 oriP 또는 프로그래밍에서 유사하거나 상승된 기능을 갖고, 유전학적으로 가공된 oriP에 상응하는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 상기된 바와 같이 다른 염색체외 복제 바이러스의 복제 오리진 또는 자발적으로 복제하는 서열 (ARS)가 사용될 수 있다.
e. 선택 및 스크리닝 가능한 마커
[00145] 특정 구현예에서, 핵산 작제물을 함유하는 세포는 발현 벡터 내 마커를 포함시킴에 의해 시험관내 또는 생체내에서 동정될 수 있다. 상기 마커는 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 동정을 가능하게 하는 세포에 동정가능한 변화를 부여한다. 일반적으로, 선택 마커는 선택을 가능하게 하는 성질을 부여하는 마커이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 이의 선택을 가능하게 하는 마커이고 음성 선택 마커는 이의 존재가 이의 선택을 차단시키는 마커이다. 양성 선택 마커의 예는 약물 내성 마커이다.
[00146] 일반적으로, 약물 선택 마커의 내포는 형질전환체의 클로닝 및 동정을 원조하고, 예를 들어, 네오마이신, 푸로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자는 유용한 선택 마커이다. 조건의 수행을 기반으로 하는 형질전환체의 구별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커에 추가로, 스크리닝가능한 마커, 예를 들어, 이의 기반이 비색 분석인 GFP를 포함하는 다른 유형의 마커가 또한 고려된다. 대안적으로, heRPE 심플렉스 티미딘 키나제 (tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)와 같은 음성 선택 마커로서 스크리닝가능한 효소가 사용될 수 있다. 당업자는 또한 능히 FACS 분석과 연계된 면역학적 마커를 사용하는 방법을 알고 있다. 사용되는 마커는 이것이 유전자 생성물을 암호화하는 핵산과 공동 발현될 수 있는 한 중요한 것으로 사료되지 않는다. 선택 및 스크리닝 가능한 마커의 추가의 예는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
III. iPSC의 망막 색소 상피 세포 또는 광수용체/광수용체 전구체 세포로의 분화
A. RPE 분화
[00147] 일부 양상에서, RPE 세포는 예를 들어, PCT/US2016/050543 및 PCT/US2016/050554에 기재된 방법에 의해 iPSC로부터 본원에 기재된 방법으로 제조된다. 빛에 직접으로 감응하는 망막 내의 세포는 광수용체 세포이다. 광수용체는 망막 외부의 감광성 뉴런으로서 간상 또는 원추형일 수 있다. 광변환의 과정에서, 광수용체 세포는 각막 및 수정체에 의해 포커싱된 입사광 에너지를 궁극적으로 시신경을 통해 뇌로 전송되는 전기적 신호로 전환시킨다. 척추동물은 간상 또는 원추형을 포함하는 2가지 유형의 광수용체 세포를 가진다. 원추형은 미세한 세부적인 것들, 중심시 및 색채시를 감지하도록 적응되어 있어 밝은 빛에 잘 기능한다. 간상형은 주변시와 약광시를 담당한다. 간상형 및 원추형의 신경 신호는 망막의 다른 뉴런에 의한 처리과정을 겪게 된다.
[00148] 망막 색소 상피는 혈류와 망막 사이에 장벽으로 작용하고, 시각 기능 및 맥락막 혈액 공급의 유지에 있어서 광수용체와 긴밀하게 상호작용한다. 망막 색소 상피는 멜라닌의 과립으로 촘촘하게 팩킹된 육방형 세포의 단일층으로 구성된다. 분화 RPE 세포의 주요 기능은 하기를 포함한다: 글루코스, 레티놀 및 지방산과 같은 영양분을 혈액에서 광수용체로 운반; 물, 대사 최종 생성물 및 이온을 망막하공간에서 혈액으로 운반; 빛의 흡수 및 광산화에 대한 보호; 올-트랜스(all-trans)-레티놀을 11-시스-레티날(cis-retinal)로의 재이성질화; 탈락된 광수용체막의 식세포작용; 및 망막의 구조적 안정성을 위한 다양한 필수 인자의 분비.
[00149] 성숙한 망막 색소 상피는 세포성 레틴알데하이드 결합 단백질 (CRALBP), RPE65, 베스트 난황형 황반부 이영양증 유전자 (VMD2) 및 색소상피 유래 인자 (PEDF)와 같은 마커들을 발현한다. 망막 색소 상피의 기능부전은 다수의 시력을 변화시키는 병태, 예를 들어, 망막 색소 상피 박리, 형성이상, 위축, 망막병증, 망막 색소 변성증, 황반 이영양증, 또는 연령 관련 황반 변성을 포함하는 변성과 연관되어 있다.
[00150] 성숙한 망막 색소 상피 (RPE) 세포는 이들의 색소, 상피 형태 및 정점 기저 극성을 기초로 특징 분석될 수 있다. 분화된 RPE 세포는 이들의 자갈 형태 및 색소의 초기 외관에 의해 시각적으로 인지될 수 있다. 또한, 분화된 RPE 세포 층은 상피 통과 저항성/TER을 갖고 단층 전체에 걸쳐 상피 통과 전위/TEP (TER >100 ohms. cm2; TEP >2 mV)를 생성하여 정점에서 기저면으로 유체, 락트산 및 CO2를 수송하고, 사이토킨의 양극화된 분비를 조절한다.
[00151] RPE 세포는 면역세포화학, 웨스턴 블롯 분석, 유동 세포측정 및 효소 결합 면역검정 (ELISA)과 같은 방법의 사용에 의해 이들의 정체 및 성숙 상태의 검출용 마커로 기능할 수 있는 수개의 단백질을 발현한다. 예를 들어, RPE 특이적 마커로는 세포성 레틴알데하이드 결합 단백질 (CRALBP), 마이크로프탈미아 연관 전사 인자 (MITF), 티로시나제 관련 단백질 1 (TYRP-1), 망막 색소 상피 특이적 65 kDa 단백질 (RPE65), 전멜라닌소체 단백질 (PMEL17), 베스트로핀 1 (BEST1) 및 c-mer 원종양유전자 티로신 키나제 (MERTK)를 포함할 수 있다. 동시에, RPE 세포는 배아 줄기 세포 마커 Oct-4, nanog 또는 Rex-1를 (검출가능한 수준으로) 발현하지 않는다. 구체적으로, 이러한 유전자의 발현은 정량적 RT-PCR로 평가시 ES 세포 또는 iPSC 세포에서 보다 RPE 세포에서 약 100-1000배 낮다.
[00152] RPE 세포 마커는 예를 들어, 역전사효소 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR), 노던 블롯 분석법, 또는 공개적으로 이용가능한 서열 데이터를 이용하는 표준 증폭 방법에서 서열 특이적 프라이머를 사용하는 도트 블롯 하이브리드화 (dot-blot hybridization) 분석법에 의해 mRNA 수준으로 검출될 수 있다. 단백질 또는 mRNA 수준으로 검출되는 조직 특이적 마커의 발현은 해당 수준이 미분화 만능 줄기 세포 또는 관련되지 않은 다른 세포형과 같은 대조군 세포의 수준의 적어도 또는 약 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9배 및 보다 구체적으로는 10-, 20-, 30, 40-, 50배 이상 또는 그 이상인 경우에 긍정적으로 간주된다.
[00153] RPE 세포의 기능부전, 손상 및 상실은 연령 관련 황반 변성(AMD), 베스트 질환, 스타르가르트 질환 및 맥락막결절을 포함한 유전성 황반 변성, 기타 형태의 유전성 망막 질환 및 후천성 망막 기능부전, RPE 찢어짐/찢김을 포함하지만 이에 제한되지 않는 질환 및 손상을 포함한 많은 눈 질환 및 장애의 요인이다. 이러한 질환에 대한 잠재적 치료법은 그러한 치료가 필요한 대상체의 망막하 공간에 RPE 세포를 이식하는 것이다. 이식에 의한 RPE 세포의 인공주입은 퇴화를 지연, 중단 또는 역전시키고, 망막기능을 개선하며, 이러한 질환으로부터 기인하는 실명을 예방할 수 있다. 그러나, 사람 공여자 및 배아로부터 직접 RPE 세포를 수득하는 것이 난제이다.
2. A. PSC의 배양체로부터 RPE 세포의 유도
[00154] 잘 알려진 재프로그래밍 인자를 이용한 iPCS 재프로그래밍은 RPE 세포를 비롯한 뉴런 계통의 안구 세포를 유도할 수 있다 (Hirami et al., 2009). 본원에 그 내용 전부가 참고로 포함되는 PCT 공보 2014/121077호는 iPSC로부터 생성된 배양체 (EB)가 현탁 배양액 중에서 Wnt 및 Nodal 길항제로 처리되어 망막간세포의 마커 발현을 유도하는 방법을 개시하고 있다. 상기 공보는 iPSC의 EB를 RPE 세포에 대해서 매우 농축된 배양액으로 분화시키는 과정을 통해 RPE 세포를 iPSC로부터 유래시키는 방법을 개시하고 있다. 예를 들어, 배양체는 로 연관 코일드 코일 (rho-associated coiled-coil) 키나제 (ROCK) 억제제의 첨가에 의해 iPSC로부터 생성하고, 2개의 WNT 경로 억제제 및 Nodal 경로 억제제를 포함하는 제1 배지 중에서 배양시킨다. 추가로, 염기성 섬유아세포 생장 인자 (bFGF)를 포함하지 않고, Nodal 경로 억제제를 포함하며, 약 20 ng 내지 약 90 ng의 Noggin을 포함하고, 약 1 내지 약 5%의 녹아웃 혈청 대체물을 포함하는 제2 배지 중에서 MATRIGEL™이 코팅된 조직 배양체 상에 EB를 플레이팅하여 분화형 RPE 세포를 형성시킨다. 상기 분화형 RPE 세포를 액틴 및 WNT3a를 포함하는 제3 배지 중에서 배양시킨다. 이후, RPE 세포를 약 5%의 태아 혈청, 정형적인 WNT 억제제, 비정형적인 WNT 억제제, 및 소닉 헤지호그 (Sonic Hedgehog) 및 FGF 경로의 억제제를 포함하는 RPE 배지 중에서 배양시켜 사람 RPE 세포를 제조한다.
[00155] 분화된 세포형의 제조를 위한 EB를 사용함에 있어서는 여러 단점이 존재한다. 예를 들어, iPSC로부터 EB의 제조는 효율이 다양하고 EB의 크기 및 형태가 다양함으로 일관되지 않고 재현가능하지 않은 과정이다. 본 명세서는 EB 와는 독립적인 임상적, 연구적 또는 치료학적 용도에 필요한 iPSC 또는 ES 유래 세포의 대규모 생산을 가능하게 하는 방법을 제공한다.
3. B. 필수적으로 단일 세포인 PSC로부터 RPE 세포의 유도
[00156] 일부 구현예에서, 사람 iPSC와 같은 만능 줄기 세포 (PSC)의 필수적으로 단일 세포 현탁액으로부터 RPE 세포를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, PSC는 컨플루언스 전 상태 (pre-confluency)까지 배양하여 임의의 세포 응집을 방지한다. 특정 양상에서, PSC는 TRYPSIN 또는 TRYPLE™에 의해 예시되는 바와 같이 세포 해리 효소를 사용한 항온처리에 의해 해리된다. PSC는 파이펫팅에 의해 본질적으로 단일 세포 현탁액으로도 해리될 수 있다. 또한, 블레비스타틴 (예를 들어, 약 2.5 μM)을 배지에 첨가하여 단일 세포로 해리된 후 세포들이 배양 용기에 부착되지 않으면서 PCS 생존을 증가시킬 수도 있다. 블레비스타틴 대신에 ROCK 억제제를 대안으로 사용하여 단일 세포로 해리된 후 PCS 생존을 증가시킬 수도 있다.
[00157] 일단 PSC의 단일 세포 현탁액이 수득되면, 상기 세포를 일반적으로 적절한 배양 용기, 예를 들어, 플라스크, 다중층 플라스크, 6웰, 12웰, 24웰, 96웰 또는 10cm 플레이트와 같은 조직 배양 플레이트에 씨딩한다. 세포를 배양하는데 사용되는 배양 용기로는, 줄기 세포를 배양할 수 있다면 특별히 제한되지는 않지만, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 접시, 페트리 접시, 조직 배양용 접시, 멀티 접시, 마이크로 플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 튜브, 트레이, CELLSTACK® 챔버, 배양백 및 회전병을 포함할 수 있다. 세포는 배양의 필요에 따라 적어도 또는 약 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml, 500 ml, 550 ml, 600 ml, 800 ml, 1000 ml, 1500 ml, 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 부피 중에서 배양될 수 있다. 특정 구현예에서, 배양 용기는 세포가 증식될 수 있도록 생물학적으로 활성인 환경을 지원하는 생체외 임의의 장치 또는 시스템을 지칭할 수 있는 생물반응기일 수 있다. 상기 생물반응기는 적어도 또는 약 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 리터, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 입방 미터 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 부피를 가질 수 있다.
[00158] 특정 양상에서, PSC, 예를 들어 iPSC를 효율적인 분화에 적절한 세포 밀도로 플레이팅한다. 일반적으로, 세포를 약 1,000 내지 약 75,000 세포/cm2, 예를 들어 약 5,000 내지 약 40,000 세포/cm2의 세포 밀도로 플레이팅한다. 6웰 플레이트에서, 세포를 웰당 약 50,000 내지 약 400,000개 세포의 세포 밀도로 분주할 수 있다. 예시적인 방법에서, 세포를 웰당 약 100,000, 약 150,000, 약 200,000, 약 250,000, 약 300,000 또는 약 350,000개의 세포, 예를 들어 웰당 약 200,000개의 세포의 세포 밀도로 씨딩한다.
[00159] PSC, 예를 들어 iPSC는 일반적으로 하나 이상의 세포 부착 단백질로 코팅된 배양 플레이트 상에 배양하여 세포 생존력을 유지하면서 세포 부착을 촉진시킨다. 예를 들어, 바람직한 세포 부착 단백질로는 만능 세포 성장을 위한 고형 지지체를 제공하는 수단으로 배양체 표면을 코팅하는데 사용될 수 있는 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐 및/또는 피브로넥틴을 포함한다. “세포외 매트릭스” 라는 용어는 당업계에 주지되어 있다. 이의 성분들로는 하나 이상의 하기의 단백질을 포함한다: 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 테나신, 엔탁틴, 트롬보스폰딘, 엘라스틴, 젤라틴, 콜라겐, 피브릴린, 메로신, 안코린, 콘드로넥틴, 링크 단백질, 뼈 시알로단백질, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 에피넥틴, 히알루로넥틴, 언둘린, 에필리그린 및 칼리닌. 예시적인 방법에서, PSC를 비트로넥틴 또는 피브로넥틴으로 코팅된 배양 플레이트 상에서 성장시킨다. 일부 구현예에서, 세포 부착 단백질은 사람 단백질이다.
[00160] 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질은 자연에서 기원할 수 있어 사람 또는 동물 조직으로부터 정제될 수 있거나, 다르게는, ECM 단백질은 유전자 조작된 재조합 단백질이거나 또는 자연에서 합성될 수 있다. ECM 단백질은 전체 단백질이거나 또는 천연 또는 조작된 펩타이드 단편의 형태일 수 있다. 세포 배양용 매트릭스에서 유용할 수 있는 ECM 단백질의 예로는 라미닌, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및 비트로넥틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 매트릭스 조성물은 피브로넥틴 또는 재조합 피브로넥틴의 합성 제조된 펩타이드 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 매트릭스 조성물은 제노-프리이다. 예를 들어, 사람 세포를 배양하기 위한 제노-프리 매트릭스에서, 사람 기원의 매트릭스 성분이 사용될 수 있으며, 이 경우 사람이 아닌 임의의 동물 성분들은 배제될 수 있다.
[00161] 일부 양상에서, 매트릭스 조성물 내의 총 단백질 농도는 약 1 ng/mL 내지 약 1 mg/mL일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 매트릭스 조성물 내의 총 단백질 농도는 약 1 μg/mL 내지 약 300 μg/mL이다. 보다 바람직한 구현예에서, 매트릭스 조성물 내의 총 단백질 농도는 약 5 μg/mL 내지 약 200 μg/mL이다.
[00162] RPE 세포 또는 PSC와 같은 세포는 각각의 특정 세포 집단의 생장을 지원하는데 필요한 영양분으로 배양될 수 있다. 일반적으로, 세포는 성장 배지 및 pH를 유지하기 위한 완충액에서 배양한다. 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어 비필수 아미노산), 비타민, 생장 인자, 사이토카인, 항산화제 물질, 피루브산, 완충제 및 무기염을 포함할 수도 있다. 전형적인 증식 배지는 줄기 세포 성장을 향상시키기 위해 다양한 영양분, 예를 들어 비필수 아미노산 및 비타민이 보충된 최소 필수 배지, 예를 들어 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM) 또는 ESSENTIAL 8™ (E8™) 배지를 포함한다. 최소 필수 배지의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 최소 필수 배지 이글 (MEM), 알파 MEM, 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM), RPMI-1640 배지, 199 배지 및 F12 배지를 포함한다. 추가로, 최소 필수 배지는 말, 송아지 또는 소태아 혈청과 같은 첨가물로 보충될 수 있다. 다르게는, 배지는 무혈청일 수 있다. 다른 경우에 있어서, 증식 배지는 본원에서 배양액 중에서 줄기 세포와 같은 미분화 세포를 성장시켜 유지하는데 최적화된 무혈청 제제로 지칭되는 “녹아웃 혈청 대체물”을 포함할 수 있다. 녹아웃™ 혈청 대체물은, 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허출원 2002/0076747호에 개시되어 있다. 바람직하게는, PSC를 완전 합성되고 피더-프리 배지 중에서 배양한다.
[00163] 따라서, 단일 세포 PSC를 일반적으로 플레이팅 후 완전 합성된 배양 배지 중에서 배양한다. 특정 양태에서, 분주 후 약 18-24시간 후, 배지를 흡인시키고, 신선한 배지, 예를 들어 E8™ 배지를 배양액에 첨가한다. 특정 양태에서, 단일 세포 PSC를 완전 합성된 배양 배지 중에서 플레이팅 후 약 1, 2 또는 3일 동안 배양한다. 바람직하게는, 단일 세포 PSC를 분화 과정을 진행하기 전에 완전 합성된 배양 배지 중에서 약 2일 동안 배양한다.
[00164] 일부 구현예에서, 배지는 혈청에 대한 임의의 대체물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 혈청에 대한 대용물로는 알부민 (예를 들어, 지질이 풍부한 알부민, 알부민 대체물, 예를 들어 재조합 알부민, 식물성 전분, 덱스트란 및 단백질 가수분해산물), 트랜스페린 (또는 다른 철 운반체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량원소, 2-머캅토에탄올, 1'-티올글리세롤, 또는 이의 균등물을 적절하게 포함하는 물질을 포함할 수 있다. 혈청에 대한 대체물은 예를 들어 국제특허공보 WO 98/30679호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 다르게는, 보다 편리함을 위해 임의의 임의의 시판되는 물질이 사용될 수 있다. 시판되는 물질로는 녹아웃™ 혈청 대체물 (KSR), 화학적으로 합성된 지질 농축물 (Gibco) 및 GLUTAMAX™ (Gibco)을 포함한다.
[00165] 다른 배양 조건들은 적절하게 정의될 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 약 30 내지 40°C, 예를 들어, 적어도 또는 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39°C일 수 있지만, 특별히 이들에 제한되지 않는다. 한 구현예에서, 세포를 37°C에서 배양한다. CO2 농도는 약 1 내지 10%, 예를 들어, 약 2 내지 5% 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다. 산소 분압은 적어도, 이하, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20%, 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다.
4. a. 분화 배지
망막 유도 배지
[00166] 단일 세포 PSC가 배양 플레이트에 부착된 후, 상기 세포를 바람직하게는 망막 유도 배지 중에서 배양하여 망막 계통 세포로의 분화 과정을 시작한다. 망막 유도 배지 (RIM)는 WNT 경로 억제제를 포함하여 PSC의 망막 계통 세포로의 분화를 유도할 수 있다. RIM은 TGFβ 경로 억제제 및 BMP 경로 억제제를 더 포함한다.
[00167] RIM은 DMEM과 F12를 약 1:1 비율로 포함할 수 있다. 예시적인 방법에서, WNT 경로 억제제, 예를 들어 CKI-7이 RIM에 포함되고, BMP 경로 억제제, 예를 들어 LDN193189가 포함되며, TGFβ 경로 억제제, 예를 들어 Sb431542가 포함된다. 예를 들어, RIM은 약 5 nM 내지 약 50 nM, 예를 들어 약 10 nM의 LDN193189, 약 0.1 μM 내지 약 5 μM, 예를 들어 약 0.5 μM의 CKI-7 및 약 0.5 μM 내지 약 10 μM, 예를 들어 약 1 μM의 Sb431542를 포함한다. 추가로, RIM은 녹아웃 혈청 대체물, 예를 들어 약 1% 내지 약 5%, MEM 비필수 아미노산 (NEAA), 피루브산나트륨, N-2 보충제, B-27 보충제, 아스코르브산 및 인슐린 생장 인자 1 (IGF1)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, IGF1은 동물질이 사용되지 않은 IGF1 (AF-IGF1)이고, 이는 약 0.1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 예를 들어 약 1 ng/mL로 RIM 내에 포함된다. 배지는 날마다 흡인시켜 신선한 RIM으로 대체한다. 세포는 일반적으로 약 1일 내지 약 5일, 예를 들어 약 1, 2, 3, 4 또는 5일, 예를 들어 약 2일 동안 RIM 중에서 배양하여 망막 계통 세포를 제조한다.
망막 분화 배지
[00168] 다음으로, 추가의 분화를 위해 망막 계통 세포를 망막 분화 배지 (RDM) 중에서 배양할 수 있다. RDM은 WNT 경로 억제제, BMP 경로 억제제, TGFβ 경로 억제제 및 MEK 억제제를 포함한다. 한 구현예에서, RDM은 WNT 경로 억제제, 예를 들어 CKI-7, BMP 경로 억제제, 예를 들어 LDN193189, TGFβ 경로 억제제, 예를 들어 SB431542, 및 MEK 억제제, 예를 들어 PD0325901을 포함한다 다르게는, RDM은 WNT 경로 억제제, BMP 경로 억제제, TGFβ 경로 억제제 및 bFGF 억제제를 포함할 수 있다. 일반적으로, Wnt 경로 억제제, BMP 경로 억제제 및 TGFβ 경로 억제제의 농도는 RIM에 비해 RDM에서 예를 들어 약 9 내지 약 11배, 예를 들어 약 10배 더 높다. 예시적인 방법에서, RDM은 약 50 nM 내지 약 200 nM, 예를 들어 약 100 nM의 LDN193189, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 예를 들어 약 5 μM의 CKI-7, 약 1 μM 내지 약 50 μM, 예를 들어 약 10 μM의 SB431542, 및 약 0.1 μM 내지 약 10 μM, 예를 들어 약 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM 또는 9 μM의 PD0325901을 포함한다.
[00169] 일반적으로, RDM은 약 1:1 비율로 DMEM 및 F12를, 녹아웃 혈청 대체물 (예를 들어, 약 1% 내지 약 5%, 예를 들어 약 1.5%), MEM NEAA, 피루브산나트륨, N-2 보충제, B-27 보충제, 아스코르브산 및 IGF1 (예를 들어, 약 1 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 예를 들어 약 10 ng/mL)을 포함한다. 구체적인 방법에서, 세포는 전날의 배지를 흡인시킨 후 매일 신선한 RDM을 제공한다. 일반적으로, 세포를 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15일 또는 16일, 예를 들어 약 7일 동안 RDM 중에서 배양하여 분화된 망막세포를 유도한다.
망막배지
[00170] 다음으로, 분화된 망막세포는 망막배지 (RM) 중에서 해당 세포를 배양함으로써 추가로 더 분화될 수 있다. 망막배지는 액틴 A를 포함하며, 추가로 니코틴아미드를 포함할 수 있다. RM은 약 50 내지 약 200 ng/mL, 예를 들어 약 100 ng/mL의 액틴 A, 및 약 1 mM 내지 약 50 mM, 예를 들어 약 10 mM의 니코틴아미드를 포함할 수 있다. 다르게는, RM은 다른 TGF-β 경로 활성화제, 예를 들어, GDF1 및/또는 WNT 경로 활성화제, 예를 들어, CHIR99021, WAY-316606, IQ1, QS11, SB-216763, BIO (6-브로모인디루빈-3'-옥심), 또는 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐) 피리미딘을 포함할 수 있다. 다르게는, RM은 추가로 WNT3a를 포함할 수 있다.
[00171] RM은 약 1:1 비율로 DMEM 및 F12를, 약 1% 내지 약 5%, 예를 들어 약 1.5%의 녹아웃 혈청 대체물, MEM 비필수 아미노산 (NEAA), 피루브산나트륨, N-2 보충제, B-27 보충제, 및 아스코르브산을 포함할 수 있다. 배지는 실온의 RM으로 매일 바뀔 수 있다. 세포를 일반적으로 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16일 또는 17일, 예를 들어 약 10일 동안 RM 중에서 배양하여 분화된 RPE 세포를 유도한다.
RPE-성숙 배지
[00172] RPE 세포의 추가의 분화를 위해, 세포를 바람직하게는 RPE 성숙 배지 (RPE-MM) 중에서 배양한다. 예시적인 RPE-MM 배지가 표 3에 나타나 있다. RPE-성숙 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 예를 들어 약 250 μg/mL의 타우린, 약 10 μg/L 내지 약 30 μg/L, 예를 들어 약 20 μg/L의 히드로코르티손 및 약 0.001 μg/L 내지 약 0.1 μg/L, 예를 들어 약 0.013 μg/L의 트리요오도티로닌을 포함할 수 있다. 추가로, RPE-MM은 MEM 알파, N-2 보충제, MEM 비필수 아미노산 (NEAA), 피루브산나트륨, 및 태아 소 혈청(또는 KnockOut™ 혈청 대체)(예를 들어, 약 0.5% 내지 약 10%, 예를 들어 약 1% 내지 약 5%)을 포함할 수 있다. 배지는 실온의 RPE-MM으로 매일 바뀔 수 있다. 세포를 일반적으로 약 5일 내지 약 10일, 예를 들어 약 5일 동안 RPE-MM 중에서 배양한다. 이후, 세포를 예를 들어 세포 해리 효소를 사용하여 해리시키고, 재분주하며, RPE 세포로 추가로 분화시키기 위해 추가의 시간, 예를 들어 추가로 약 5 내지 약 30일, 예를 들어 약 15 내지 20일 동안 배양시킨다. 추가의 구현예에서, RPE-MM은 WNT 경로 억제제를 포함하지 않는다. RPE 세포는 이 단게에서 저온보존될 수 있다.
b. RPE 세포의 성숙
[00173] 다음으로, RPE 세포를 RPE-MM 중에서 성숙을 위한 지속된 시간 동안 배양한다. 일부 구현예에서, RPE 세포는 플라스크, 다중층 플라스크, 6웰, 12웰, 24웰 또는 10 cm 플레이트와 같은 웰에서 성장시킨다. RPE 세포는 약 4주 내지 약 10주, 예를 들어 약 6주 내지 8주, 예를 들어 6주, 7주 또는 8주 동안 RPE 배지 중에서 유지시킬 수 있다. RPE 세포의 지속적인 성숙을 위한 예시적인 방법에서, 세포를 세포 해리 효소, 예를 들어, TRYPLE™ 중에서 해리시키고, RPE-MM 중에서 약 1주 내지 10주 동안, 예를 들어, 5주 동안 특화된 SNAPWELL™ 디자인에서와 같은 분해성 스캐폴드 어셈블리 상에 재씨딩할 수 있다. RPE-MM은 bFGF 억제제 또는 MEK 억제제를 포함할 수 있다. 분해성 스캐폴드 상에서 RPE 세포를 배양하는 방법은 본원에 그 내용 전체가 참고로 포함되는 PCT 공보 WO 2014/121077호에 교시 및 개시되어 있다. 간략하게, 상기 방법의 주요 성분들은 CORNING® COSTAR® SNAPWELL™ 플레이트, 생체불활성 0-고리(ring) 및 생분해성 스캐폴드이다. SNAPWELL™ 플레이트 (예를 들어, 0.4 μm 공극 크기, 보다 작거나 보다 큰 공극 크기가 사용될 수 있고 0.3 μm 또는 0.5 μm를 포함하지만 이에 제한되지 않는다)는 생분해성 스캐폴드에 대한 구조 및 플랫폼을 제공한다. 정점과 기저면을 생성하는 미세다공성 막은 스캐폴드에 대한 지지체를 제공하고 세포의 극성층의 다른 면을 분리하는데 있어서 이상적이다. SNAPWELL™ 삽입체의 막을 분리해내는 능력은 상기 삽입체의 지지 고리가 스캐폴드를 위한 앵커로 사용될 수 있도록 해준다. 결과적으로 기능적 RPE 세포의 분화되고, 극성화된 융합성 단층은 이 단계에서 (예를 들어, 제노프리 CS10 배지 중에서) 저온보존될 수 있다.
[00174] 일부 구현예에서, 성숙한 RPE 세포는 RPE 성숙을 촉진하는 추가의 화학물질 또는 소분자와 함께 RPE-MM 중에서 지속적인 배양에 의해 온전한 RPE 조직으로 거동하는 기능적 RPE 세포 단층으로 더 성장시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 소분자들로는 원발성 섬모 유도제, 예를 들어 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 또는 아피디콜린을 들 수 있다. PGE2는 약 25 μM 내지 약 250 μM, 예를 들어 약 50 μM 내지 약 100 μM의 농도로 배지에 첨가될 수 있다. 다르게는, RPE-MM은 정형적인(canonical) WNT 경로 억제제를 포함할 수 있다. 예시적인 정형적 WNT 경로 억제제는 N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라히드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드 (IWP2) 또는 4-(1,3,3a,4,7,7a-헥사히드로-1,3-디옥소-4,7-메타노-2H-이소인돌-2-일)-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드 (엔도-IWR1)이다. 세포는 성숙한 기능적 RPE 세포 단층을 수득하기 위해 추가의 시간, 예를 들어 추가로 약 1주 내지 약 5주, 예를 들어 약 2주 내지 4주 더 이 배지 중에서 배양될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 임상적 용도를 위해 대규모로 일관성있게 재현될 수 있는 만능 세포의 단일 세포 현탁액으로부터 성숙한 RPE 세포를 제공한다.
B. 광수용체 세포
[00175] 일부 구현예에서, 광수용체 및/또는 전구체 세포는 본원에 기재된 방법에 의해 제조된다. 빛에 직접으로 감응하는 망막 내의 세포는 광수용체 세포이다. 광수용체는 망막 외부의 감광성 뉴런으로서 간상 또는 원추체일 수 있다. 광변환의 과정에서, 광수용체 세포는 각막 및 수정체에 의해 포커싱된 입사광 에너지를 궁극적으로 시신경을 통해 뇌로 전송되는 전기적 신호로 전환시킨다. 척추동물은 간상 또는 원추형을 포함하는 2가지 유형의 광수용체 세포를 가진다. 원추형은 미세한 세부적인 것들, 중심시 및 색채시를 감지하도록 적응되어 있어 밝은 빛에 잘 기능한다. 간상형은 주변시와 약광시를 담당한다. 간상형 및 원추형의 신경 신호는 망막의 다른 뉴런에 의한 처리과정을 겪게 된다.
[00176] 광수용체는 마커, 예를 들어 OTX2, CRX, PRDM1 (BLIMP1), NEUROD1, RCVRN, TUBB3 및 L1CAM (CD171)을 발현할 수 있다. 광수용체는 면역세포화학법, 웨스턴 블롯 분석법, 유세포분석 및 효소결합 면역분석법 (ELISA)과 같은 방법을 사용함에 의해 검출용 마커로 기능할 수 있는 수개의 단백질을 발현한다. 예를 들어, 하나의 특징적인 광수용체 마커는 RCVRN이다. 광수용체는 배아 줄기 세포 마커 OCT-4, NANOG 또는 REX-1 (임의의 검출가능한수준으로)을 발현할 수 없다. 구체적으로, 이들 유전자의 발현은 정량적 RT-PCR로 평가시 ES 세포 또는 iPSC 세포에서 보다 광수용체에서 대략 100-1000배 낮다.
[00177] 광수용체 마커는 예를 들어, 역전사효소 폴리머라제 연쇄반응 (RT-PCR), 노던 블롯 분석, 마이크로어레이 또는 공개적으로 이용가능한 서열 데이터를 이용하는 표준 증폭 방법에서 서열 특이적 프라이머(GENBANK®)를 사용하는 도트 블롯 하이브리드화(dot-blot hybridization) 분석에 의해 mRNA 수준으로 검출될 수 있다. 단백질 또는 mRNA 수준으로 검출되는 조직 특이적 마커의 발현은 해당 수준이 미분화 만능 줄기 세포 또는 관련되지 않은 다른 세포형과 같은 대조군 세포의 수준의 적어도 또는 약 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9배 및 보다 구체적으로는 10-, 20-, 30, 40-, 50배 이상 또는 그 이상인 경우에 긍정적으로 간주된다.
[00178] 광수용체 세포의 기능부전, 손상 및 상실은 연령 관련 황반 변성(AMD), 베스트 질환, 스타르가르트 질환 및 맥락막결절, 망막 색소변성증을 포함한 유전성 황반 변성, 기타 형태의 유전성 망막 질환 및 후천성 망막 기능부전, RPE 찢어짐/찢김을 포함하지만 이에 제한되지 않는 질환 및 손상을 포함한 많은 눈 질환 및 장애의 요인이다. 이러한 질환에 대하여 가능한 치료는 그러한 치료가 필요한 대상체의 망막에 PRP 및/또는 PR을 이식하는 것이다. 이식에 의한 PRP 및/또는 PR의 인공주입은 열화를 지연, 중단 또는 역전시키고, 망막기능을 개선하며, 이러한 병태로부터 기인하는 실명을 예방할 수 있다. 그러나, 사람 공여자 및 배아로부터 직접 PRP 및/또는 PR을 수득하는 것이 난제이다.
[00179] 일부 구현예에서, 사람 iPSC와 같은 PSC의 필수적으로 단일 세포 현탁액으로부터 광수용체를 생성하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, PSC는 컨플루언스 전 상태 (pre-confluency)까지 배양한다. 특정 양상에서, PSC는 세포 해리 용액 또는 예를 들어, 베르센(Versene), 트립신, ACCUTASE™ 또는 TRYPLE™에 의해 예시된 효소로 항온처리함에 의해 해리시킨다. PSC는 파이펫팅에 의해 본질적으로 단일 세포 현탁액으로도 해리될 수 있다.
[00180] 또한, 블레비스타틴 (예를 들어, 약 2.5 μM)을 배지에 첨가하여 단일 세포로 해리된 후 세포들이 배양 용기에 부착되지 않으면서 PCS 생존을 증가시킬 수도 있다. 블레비스타틴 대신에 ROCK 억제제를 대안으로 사용하여 단일 세포로 해리된 후 PCS 생존을 증가시킬 수도 있다.
[00181] 일단 PSC의 단일 세포 현탁액이 수득되면, 상기 세포를 일반적으로 적절한 배양 용기, 예를 들어, 플라스크, 다중층 플라스크, 6웰, 12웰, 24웰, 96웰 또는 10cm 플레이트와 같은 조직 배양 플레이트에 씨딩한다. 세포(들)를 배양하기 위해 사용되는 배양 용기로는, 줄기 세포를 배양할 수 있는 한, 특별히 제한되지는 않지만, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 접시, 페트리 접시, 조직 배양용 접시, 멀티 접시, 마이크로 플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 튜브, 트레이, CELLSTACK® 챔버, 배양백 및 롤러 병을 포함할 수 있다. 세포는 배양의 필요에 따라 적어도 또는 약 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml, 500 ml, 550 ml, 600 ml, 800 ml, 1000 ml, 1500 ml, 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 부피 중에서 배양될 수 있다. 특정 구현예에서, 배양 용기는 세포가 증식될 수 있도록 생물학적으로 활성인 환경을 지원하는 생체외 임의의 장치 또는 시스템을 지칭할 수 있는 생물반응기일 수 있다. 상기 생물반응기는 적어도 또는 약 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 리터, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 입방 미터 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 부피를 가질 수 있다.
[00182] 특정 양상에서, PSC, 예를 들어 iPSC를 효율적인 분화에 적절한 세포 밀도로 플레이팅한다. 일반적으로, 세포를 약 1,000 내지 약 75,000 세포/cm2, 예를 들어 약 5,000 내지 약 40,000 세포/cm2의 세포 밀도로 플레이팅한다. 6웰 플레이트에서, 세포를 웰당 약 50,000 내지 약 400,000개 세포의 세포 밀도로 분주할 수 있다. 예시적인 방법에서, 세포를 웰당 약 100,000, 약 150,000, 약 200,000, 약 250,000, 약 300,000 또는 약 350,000개의 세포, 예를 들어, 웰당 약 50,000개의 세포의 세포 밀도로 씨딩한다.
[00183] PSC, 예를 들어 iPSC는 일반적으로 하나 이상의 세포 부착 단백질로 코팅된 배양 플레이트 상에 배양하여 세포 생존력을 유지하면서 세포 부착을 촉진시킨다. 예를 들어, 바람직한 세포 부착 단백질로는 만능 세포 성장을 위한 고형 지지체를 제공하는 수단으로 배양 표면을 코팅하는데 사용될 수 있는 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어, 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐 및/또는 피브로넥틴을 포함한다. “세포외 매트릭스” 라는 용어는 당업계에 주지되어 있다. 이의 성분들로는 하나 이상의 하기의 단백질을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다: 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 테나신, 엔탁틴, 트롬보스폰딘, 엘라스틴, 젤라틴, 콜라겐, 피브릴린, 메로신, 안코린, 콘드로넥틴, 링크 단백질, 골 시알로단백질, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 에피넥틴, 히알루로넥틴, 언둘린, 에필리그린 및 칼리닌. 다른 ECM 성분들은 접착용 합성 펩타이드 (예를 들어, RGD 또는 IKVAV 모티프), 합성 하이드로겔 (예를 들어, PEG, PLGA, 등) 또는 천연 하이드로겔, 예를 들어, 알기네이트를 포함할 수 있다. 예시적인 방법에서, PSC를 비트로넥틴으로 코팅된 배양 플레이트 상에서 성장시킨다. 일부 구현예에서, 세포 접착 단백질은 사람 단백질이다.
[00184] 세포외 매트릭스 단백질은 천연 기원일 수 있어 사람 또는 동물 조직으로부터 정제될 수 있거나, 대안적으로, ECM 단백질은 유전자 조작된 재조합 단백질이거나 또는 천연에서 합성될 수 있다. ECM 단백질은 전체 단백질이거나 또는 천연 또는 조작된 펩타이드 단편의 형태일 수 있다. 세포 배양용 매트릭스에서 유용할 수 있는 ECM 단백질의 예로는 라미닌, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및 비트로넥틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 매트릭스 조성물은 제노-프리이다. 예를 들어, 사람 세포를 배양하기 위한 제노-프리 매트릭스에서, 사람 기원의 매트릭스 성분이 사용될 수 있으며, 이 경우 사람이 아닌 임의의 동물 성분들은 배제될 수 있다.
[00185] 일부 양상에서, 매트릭스 조성물 내의 총 단백질 농도는 약 1 ng/mL 내지 약 1 mg/mL일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 매트릭스 조성물 내의 총 단백질 농도는 약 1 μg/mL 내지 약 300 μg/mL이다. 보다 바람직한 구현예에서, 매트릭스 조성물 내의 총 단백질 농도는 약 5 μg/mL 내지 약 200 μg/mL이다.
[00186] 광수용체 또는 PSC와 같은 세포는 각각의 특정 세포 집단의 성장을 지원하는데 필요한 영양분으로 배양될 수 있다. 일반적으로, 세포는 탄소원, 질소원 및 pH를 유지하기 위한 완충액을 포함하는 성장 배지 중에서 배양한다. 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민(들), 성장 인자, 사이토킨, 항산화제 물질, 피루브산, 완충제 pH 지시제 및 무기염을 포함할 수도 있다. 전형적인 증식 배지는 줄기 세포 성장을 향상시키기 위해 다양한 영양분, 예를 들어 비필수 아미노산 및 비타민이 보충된 최소 필수 배지, 예를 들어 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM) 또는 ESSENTIAL 8™ (E8™) 배지를 포함한다. 최소 필수 배지의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 최소 필수 배지 이글 (MEM) 알파 배지, 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM), RPMI-1640 배지, 199 배지 및 F12 배지를 포함한다. 추가로, 최소 필수 배지는 말, 송아지 또는 소태아 혈청과 같은 첨가물로 보충될 수 있다. 다르게는, 배지는 무혈청일 수 있다. 다른 경우에 있어서, 증식 배지는 본원에서 배양액 중에서 줄기 세포와 같은 미분화 세포를 성장시켜 유지하는데 최적화된 무혈청 제제로 지칭되는 “녹아웃 혈청 대체물”을 포함할 수 있다. 녹아웃™ 혈청 대체물은, 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허출원 2002/0076747호에 개시되어 있다. 바람직하게는, PSC는 완전 합성되고 피더가 없는 배지 중에서 배양한다.
[00187] 따라서, 단일 세포 PSC를 일반적으로 플레이팅 후 완전 합성된 배양 배지 중에서 배양한다. 특정 양태에서, 분주 후 약 18-24시간 후, 배지를 흡인시키고, 신선한 배지, 예를 들어 E8™ 배지를 배양액에 첨가한다. 특정 양태에서, 단일 세포 PSC를 완전 합성된 배양 배지 중에서 플레이팅 후 약 1, 2 또는 3일 동안 배양한다. 바람직하게는, 단일 세포 PSC를 분화 과정을 진행하기 전에 완전 합성된 배양 배지 중에서 약 2일 동안 배양한다.
[00188] 일부 구현예에서, 배지는 혈청에 대한 임의의 대체물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 혈청에 대한 대용물로는 알부민 (예를 들어, 지질이 풍부한 알부민, 알부민 대체물, 예를 들어 재조합 알부민, 식물성 전분, 덱스트란 및 단백질 가수분해산물), 트랜스페린 (또는 다른 철 운반체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올글리세롤, 또는 이의 균등물을 적절하게 포함하는 물질을 포함할 수 있다. 혈청에 대한 대체물은 예를 들어 국제특허공보 WO 98/30679호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 다르게는, 보다 편리함을 위해 임의의 임의의 시판되는 물질이 사용될 수 있다. 시판되는 물질로는 녹아웃™ 혈청 대체물 (KSR), 화학적으로 합성된 지질 농축물 (Gibco) 및 GLUTAMAX™ (Gibco)을 포함한다.
[00189] 다른 배양 조건들은 적절하게 정의될 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 약 30 내지 40°C, 예를 들어, 적어도 또는 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39°C일 수 있지만, 특별히 이들에 제한되지 않는다. 한 구현예에서, 세포를 37°C에서 배양한다. CO2 농도는 약 1 내지 10%, 예를 들어, 약 2 내지 5% 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다. 산소 분압은 적어도, 이하, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20%, 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다.
2. a. 분화 배지
망막 성숙 배지
[00190] 상기된 바와 같이 RDM에서 배양된 분화된 망막 세포는 세포를 망막 성숙 배지(Retinal Maturation Medium, RM)에서 배양하여 RPC를 생성함으로써 추가로 분화되고 확장될 수 있다. RM은 니코틴아미드를 포함할 수 있다. RM은 약 1 mM 내지 약 50 mM, 예를 들어, 약 10 mM의 니코틴아미드를 포함할 수 있다. Rm은 추가로 아스코르브산을 예를 들어, 50-500 μm, 특히 약 100-300 μm, 예를 들어, 약 200 μm로 포함할 수 있다. 바람직하게, RM은 액티빈 A가 없거나 필수적으로 없다. 예시적인 RM 배지는 표 1에 나타낸다. RM (예를 들어, RM2)은 추가로 γ-세크레타제 억제제, 예를 들어 DAPT, 염기성 FGF, 및/또는 TGFβ 경로 억제제, 예를 들어, Sb431542를 포함할 수 있다.
[00191] RM은 약 1:1 비율로 DMEM 및 F12를, 약 1% 내지 약 5%, 예를 들어 약 1.5%의 녹아웃 혈청 대체물, MEM 비필수 아미노산 (NEAA), 피루브산나트륨, N-2 보충제, B-27 보충제, 및 아스코르브산을 포함할 수 있다. 배지는 실온의 RM으로 매일 바뀔 수 있다. 세포를 일반적으로 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16일 또는 17일, 예를 들어 약 10일 동안 RM 중에서 배양하여 확장된 RPC를 유도한다.
PRP 성숙 배지 (PM)
[00192] PRP는 PRP 성숙 배지 (PM)에서 성숙될 수 있다. 예시적인 PM 배지는 표 1에 나타낸다. PM 배지는 아스코르브산, 니코틴아미드 및 γ-세크레타제 억제제, 예를 들어, DAPT (예를 들어, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 예를 들어, 약 5 μM의 DAPT)를 포함한다. PM (예를 들어, PM2)는 또한 CDK 억제제, 예를 들어, CDK4/6 억제제, 예를 들어 PD0332991 (예를 들어, 약 1 μM 내지 약 50 μM, 예를 들어, 약 10 μM의 PD0332991)을 포함할 수 있다.
[00193] PM 배지는 약 1:1 비율의 DMEM 및 F12, 약 1% 내지 약 5%, 예를 들어 약 1.5%의 녹아웃 혈청 대체물, MEM 비필수 아미노산 (NEAA), 나트륨 피루베이트, N-2 보충물, B-27 보충물, 및 아스코르브산을 포함할 수 있다. 상기 배지는 실온의 PM 배지로 매일 갈아줄 수 있다. 세포는 일반적으로 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 동안, 예를 들어, 약 10일 동안 PM 배지에서 배양하여 성숙한 광수용체를 유도할 수 있다.
표 1: 예시적인 배지 성분
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
[00194] 추가로, 블레비스타틴(예를 들어, 약 2.5 μM)은 응집물 형성을 촉진시킴에 의해 광수용체를 증가시키고 순도를 유지하기 위해 배지에 첨가될 수 있다. 블레비스타틴 대신 ROCK 억제제는 대안적으로 사용하여 예를 들어, TRYPLE™을 사용함에 의해 단일 세포로의 해리 후 광수용체 생존률을 증가시킬 수 있다.
C. 세포의 냉동보존
[00195] 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 RPE, 광수용체 세포 또는 PRP는 냉동보존될 수 있고 예를 들어, 본원에 참조로 인용된 문헌(PCT 공개 공보 제2012/149484 A2호)를 참조한다. 세포는 기질과 함께 또는 기질없이 저온보존될 수 있다. 여러 구현예에서, 저장 온도는 약 -50°C 내지 약 -60°C, 약 -60°C 내지 약 -70°C, 약 -70°C 내지 약 -80°C, 약 -80°C 내지 약 -90°C, 약 -90°C 내지 약 -100°C 범위이고, 이들의 중첩 범위도 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존된 세포의 저장 (예를 들어, 유지)를 위해 보다 낮은 온도를 사용한다. 여러 구현예에서, 액체 질소 (또는 이와 유사한 다른 액체 냉각제)를 사용하여 세포를 저장한다. 추가의 구현예에서, 세포를 약 6시간 이상 동안 저장한다. 추가의 구현예에서, 세포를 약 72시간 저장한다. 여러 구현예에서, 세포를 48시간 내지 약 1주 저장한다. 또 다른 구현예에서, 세포를 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7주, 또는 8주 동안 저장한다. 추가의 구현예에서, 세포를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11개월 또는 12개월 동안 저장한다. 더 긴 시간 동안 세포를 저장할 수도 있다. 세포를 별도로 또는 본원에 개시된 임의의 기질과 같은 기질 상에서 저온보존할 수도 있다.
[00196] 일부 구현예에서, 추가의 동결보호제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 세포는 하나 이상의 냉동보호제, 예를 들어 DM80, 혈청 알부민, 예를 들어 사람 또는 소 혈청 알부민을 포함하는 냉동보존 용액 중에서 냉동보존될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 용액은 약 1 %, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10%의 DMSO를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 용액은 약 1% 내지 약 3%, 약 2% 내지 약 4%, 약 3% 내지 약 5%, 약 4% 내지 약 6%, 약 5% 내지 약 7%, 약 6% 내지 약 8%, 약 7% 내지 약 9%, 또는 약 8% 내지 약 10%의 디메틸설폭시드 (DMSO) 또는 알부민을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 상기 용액은 2.5%의 DMSO를 포함한다. 또 다른 구체적인 구현예에서, 상기 용액은 10%의 DMSO를 포함한다.
[00197] 세포는 예를 들어, 저온보존을 하는 동안 약 1 °C/분으로 냉각할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 저온보존 온도는 약 -80°C 내지 약 -180°C, 또는 약 -125°C 내지 약 -140°C이다. 일부 구현예에서, 세포는 약 1°C/분으로 냉각시키기 전에 4°C로 냉각된다. 냉동보존된 세포의 사용을 위해 해동하기 전에 액체 질소의 증기상으로 해당 냉동보존된 세포를 이동시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 세포가 일단 약 -80°C에 도달하면, 이들을 액체 질소 저장소로 이동시킨다. 냉동보존은 제어된-속도의 동결기 (controlled-rate freezer)를 사용하여 수행될 수도 있다. 냉동보존된 세포는 예를 들어, 약 25°C 내지 약 40°C의 온도에서, 통상 약 37°C의 온도에서 해동될 수 있다.
D. 억제제
WNT 경로 억제제
[00198] WNT는 세포와 세포간의 상호작용을 조절하는 고도로 보존된 분비성 신호전달 분자 계열로서, 초파리 체절 극성 (Drosophila segment polarity) 유전자인 윙리스 (wingless)와 관련이 있다. 사람에 있어서, WNT 유전자 계열은 38 내지 43 kDa의 시스테인이 풍부한 당단백질을 암호화한다. WNT 단백질은 소수성 신호 서열, 보존된 아스파라긴 연결된 올리고사카라이드 컨센서스 서열 (예를 들어, Shimizu et al., Cell Growth Differ 8: 1349-1358 (1997) 참조) 및 22개의 보존된 시스테인 잔기를 갖는다. WNT 단백질은 세포질 베타-카테닌의 안정화를 촉진시키는 능력때문에 전사 활성화제로 작용하여 아폽토시스를 억제할 수 있다. 특정 WNT 단백질의 과발현은 특정 암과 관련이 있는 것으로 나타났다.
[00199] 본원에서 WNT 억제제 (또한 WNT 경로 억제제로서 언급됨)는 일반적으로 WNT 억제제를 언급한다. 따라서, WNT 억제제는 WNT 계열 단백질, 예를 들어 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt4, Wnt5A, Wnt6, Wnt7A, Wnt7B, Wnt8A, Wnt9A, Wnt10a, Wnt11 및 Wnt16의 일원에 대한 임의의 억제제를 일컫는다. 본 발명의 방법의 특정 구현예는 분화 배지 중의 WNT 억제제를 고려한다. 이미 당업계에 공지된 적합한 WNT 억제제의 예는 N-(2-아미노에틸)-5-클로로이소퀴놀린-8-설폰아미드 디히드로클로라이드 (CKI-7), N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라히드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드 (IWP2), N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라히드로-3-(2-메톡시페닐)-4-옥소티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드 (IWP4), 2-페녹시벤조산-[(5-메틸-2-퓨라닐)메틸렌]히드라지드 (PNU 74654) 2,4-디아미노-퀴나졸린, 케르세틴, 3,5,7,8-테트라히드로-2-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-4H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4-온 (XAV939), 2,5-디클로로-N-(2-메틸-4-니트로페닐)벤젠설폰아미드 (FH 535), N-[4-[2-에틸-4-(3-메틸페닐)-5-티아졸릴]-2-피리디닐]벤즈아미드 (TAK 715), Dickkopf 관련 단백질 1 (DKK1) 및 분비성 프리즐 (Secreted frizzled) 관련 단백질 1 (SFRP1)을 포함한다. 또한, WNT의 억제제로는 WNT의 발현에 대한 항체, 우성적 음성 변이체, 및 WNT의 발현을 억제하는 siRNA 및 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. WNT의 억제는 RNA 매개 간섭 (RNAi)을 사용하여 달성할 수도 있다.
BMP 경로 억제제
[00200] 뼈형성 단백질 (BMP)은 형질전환 생장 인자 베타 (TGFβ) 상과에 속하는 다기능성 생장 인자이다. BMP는 일군의 중추적 형태발생 신호를 구성하여, 신체 전반에 걸쳐 구조를 조직화하는 것으로 생각된다. 생리학에서의 BMP 신호의 중요한 기능은 병리학적 과정에 있어서 조절기능이 상실된 BMP 신호전달에 대한 여러가지 역할에 의해 두드러진다.
[00201] BMP 경로 억제제 (또한 본원에서 BMP 억제제로서 언급됨)는 일반적으로 BMP 신호전달의 억제제 또는 BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP10 또는 BMP15에 특이적인 억제제를 포함할 수 있다. 예시적인 BMP 억제제로는 4-(6-(4-(피페라진-1-일)페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)퀴놀린 히드로클로라이드 (LDN193189), 6-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]-3-(4-피리디닐)-피라졸로[1,5-a]피리미딘 디히드로클로라이드 (도르소모핀(Dorsomorphin)), 4-[6-[4-(1-메틸에톡시)페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]-퀴놀린 (DMH1), 4-[6-[4-[2-(4-모르폴리닐)에톡시]페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린 (DMH-2) 및 5-[6-(4-메톡시페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린 (ML 347)을 포함한다.
TGFβ 경로 억제제
[00202] 형질전환 생장 인자 베타 (TGFβ)는 대부분의 세포에서 증식, 세포성 분화 및 기타 기능을 제어하는 분비성 단백질이다. 이는 면역, 암, 기관지 천식, 폐 섬유증, 심장병, 당뇨병 및 다발성 경화증에서 역할을 하는 사이토카인의 한 유형이다. TGF-β는 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 호칭되는 적어도 3개의 이소형으로 존재한다. TGF-β 계열은 인히빈, 액틴, 항뮬러관 호르몬, 뼈형성 단백질, 데카펜타플렉 (decapentaplegic) 유전자 및 Vg-1을 포함하는 형질전환 성장 인자 베타 슈퍼패밀리로 알려진 단백질 슈퍼패밀리의 일부이다.
[00203] TGFβ 경로 억제제(또한 본원에서 TGFβ 억제제로서 언급됨)는 일반적으로 TGFβ 신호 전달의 임의의 억제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, TGFβ 억제제로는 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드 (SB431542), 6-[2-(1,1-디메틸에틸)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-이미다졸-4-일]퀴녹살린 (SB525334), 2-(5- 벤조[1,3]디옥솔-5-일-2-tert-부틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 히드로클로라이드 하이드레이트 (SB- 505124), 4-(5-벤졸[1,3]디옥솔- 5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드 하이드레이트, 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2- 피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드 하이드레이트, 좌우 결정 인자 (Lefty), 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아미드 (A 83-01), 4-[4-(2,3-디히드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드 (D 4476), 4-[4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-2-피리디닐]-N-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-벤즈아미드 (GW 788388), 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린 (LY 364847), 4-[2-플루오로-5-[3-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]페닐]-1H-피라졸-1-에탄올 (R 268712) 또는 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘 (RepSox)이다.
MEK 억제제
[00204] MEK 억제제는 미토겐 활성화 단백질 키나제 효소 MEK1 또는 MEK2를 억제하는 화학물질 또는 약물이다. 이들은 MAPK/ERK 경로에 영향을 주기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, MEK 억제제로는 N-[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]-3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-아이오도페닐)아미노]- 벤즈아미드 (PD0325901), N-[3-[3-시클로프로필-5-(2-플루오로-4-아이오도아닐리노)-6,8-디메틸-2,4,7-트리옥소피리도[4,3-d]피리미딘-1-일]페닐]아세트아미드 (GSK1120212), 6-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-7-플루오로-N-(2-히드록시에톡시)-3-메틸벤즈이미다졸-5-카복스아미드 (MEK162), N-[3,4-디플루오로-2-(2-플루오로-4-아이오도아닐리노)-6-메톡시페닐]-1-(2,3-디히드록시프로필)시클로프로판-1-설폰아미드 (RDEA119) 및 6-(4-브로모-2-클로로아닐리노)-7-플루오로-N-(2-히드록시에톡시)-3-메틸벤즈이미다졸-5-카복스아미드 (AZD6244)를 들 수 있다.
감마-세크레타제 억제제
[00205] 감마 세크레타제는 막관통 도메인 내 잔기에서 단일-통과 막관통 단백질을 절단하는 통합 막 단백질 자체인 다중-서브유닛 프로테제 복합체이다. 상기 유형의 프로테아제는 막내 프로테아제로서 공지되어 있다. 감마 세크레타제의 가장 널리 공지된 기질은 감마 및 베타 세크레타제 둘다에 의해 절단되는 경우 비정상적으로 폴딩된 섬유 형태가 알츠하이머 질환 환자의 뇌에서 발견되는 아밀로이드 플라크의 주요 성분인 아밀로이드 베타로 불리우는 짧은 아미노산 펩타이드를 생성하는 대형 통합 막 단백질인 아밀로이드 전구체 단백질이다.
[00206] 본원에서 감마 세크레타제 억제제는 일반적으로 γ-세크레타제 억제제를 언급한다. 예를 들어, γ-세크레타제 억제제는 N-[(3,5-디플루오로페닐)아세틸]-L-알라닐-2-페닐]글라이신-1,1-디메틸에틸에틸 에스테르 (DAPT), 5-클로로-N-[(1S)-3,3,3-트리플루오로-1-(하이드록시메틸)-2-(트리플루오로메틸)프로필]-2-티오펜설폰아미드 (베가세스타트), MDL-28170,3,5-비스(4-니트로페녹시)벤조산 (화합물 W), 7-아미노-4-클로로-3-메톡시-1H-2-벤조피란 (JLK6), (5S)-(3급-부톡시카보닐아미노)-6-페닐-(4R)-하이드록시-(2R)-벤질헥사노일)-L-류시-L-페닐알라닌아미드 (L-685,485), (R)-2-플루오로-α-메틸[1,1'-바이페닐]-4-아세트산 ((R)-플러르바이프로펜; 플루리잔(Flurizan)), N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-디하이드로-5-메틸-6-옥소-5H-디벤즈[b,d]아제핀-7-일]아미노]-1-메틸-2-옥소에틸]-3,5-디플루오로벤젠아세트아미드(디벤즈아제핀; DBZ), N-[시스-4-[(4-클로로페닐)설포닐]-4-(2,5-디플루오로페닐)사이클로헥실]-1,1,1-트리플루오로메탄설폰아미드 (MRK560), (2S)-2-[[(2S)-6,8-디플루오로-1,2,3,4-테트라하이드로-2-나프탈레닐]아미노]-N-[1-[2-[(2,2-디메틸프로필)아미노]-1,1-디메틸에틸]-1H-이미다졸-4-일]펜탄아미드 디하이드로브로마이드(PF3084014 하이드로브로마이드) 및 2-[(1R)-1-[[(4-클로로페닐)설포닐](2,5-디플루오로페닐)아미노]에틸-5-플루오로벤젠부탄산(BMS299897)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
사이클린 의존성 키나제 억제제
[00207] 사이클린 의존성 키나제(CDK)는 세포 주기를 조절하는데 이들의 역할에 대해 먼저 발견된 슈가 키나제 패밀리이다. 이들은 또한 전사, mRNA 프로세싱 및 신경 세포의 분화를 조절하는데 관여한다. 많은 사람 암에서, CDK는 과활성이고 CDK-억제 단백질은 기능성이 아니다. CDK 억제제는 CDK1, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK8, 및/또는 CDK9 억제제일 수 있다. 특정 양상에서, CDK 억제제는 CDK4/6 억제제이다.
[00208] CDK 억제제는 팔보시클립 (PD-0332991) HCl, 로스코비틴(셀리시클립, CYC202), SNS-032 (BMS-387032), 디나시클립 (SCH727965), 플라보피리돌 (알보시딥), MSC2530818, JNJ-7706621, AZD5438, MK-8776 (SCH 900776), PHA-793887, BS-181 HCl, A-674563, 아베마시클립(LY2835219), BMS-265246, PHA-767491, 또는 밀시클립(PHA-848125)을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
bFGF 억제제
[00209] 염기성 섬유아세포 생장 인자 (bFGF, FGF2 또는 FGF-β로도 알려짐)는 섬유아세포 생장 인자 계열의 일원이다. bFGF는 기저막 및 혈관의 내피하 세포외 매트릭스 중에 존재한다. 또한, bFGF는 세포를 미분화 상태로 잔존시키는데 필요한 사람 ESC 배양 배지의 통상적인 성분이다.
[00210] 본원에서 bFGF 억제제는 일반적으로 bFGF 억제제를 지칭한다. 예를 들어, bFGF 억제제로는, 이에 제한되지는 않지만 N-[2-[[4-(디에틸아미노)부틸]아미노-6-(3,5- 디메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]-N'-(1,1-디메틸에틸)우레아 (PD173074), 2-(2- 아미노-3-메톡시페닐)-4H-1-벤조피란-4-온 (PD 98059), 1-tert-부틸-3-[6-(2,6-디클로로페닐)-2-[[4-(디에틸아미노)부틸]아미노]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]우레아 (PD161570), 6-(2,6-디클로로페닐)-2-[[4-[2-(디에틸아미노)에톡시]페닐]아미노]-8-메틸-피리도[2,3- d]피리미딘-7(8H)-온 디히드로클로라이드 하이드레이트 (PD166285), N-[2-아미노-6-(3,5-디메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]-N'-(1,1-디메틸에틸)-우레아 (PD166866) 및 MK-2206를 포함한다.
IV. RPE-광수용체 세포/광수용체 전구체 이중층 배양
[00211] 특정 양상에서, RPE는 임의의 적합한 배양 표면, 특히 이식이 허용되는 배양 표면, 예를 들어, GMP 순응 조건에서 스캐폴드 상에서 배양될 수 있다. 특정 양상에서, RPE는 ECM-, 예를 들어, 비트로넥틴-, 코팅된 표면, 예를 들어, 다중-웰 플레이트(예를 들어, 6-웰, 12-웰, 24-웰, 48-웰 또는 96-웰) 또는 중합체-, 예를 들어, 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA)-, 스냅웰 삽입체와 같은 트랜스웰 지지체 상에 코팅된 스캐폴드상에서 배양된다. RPE는 대안적으로 콜라겐 또는 라미닌 상에서 배양될 수 있다. 특정 양상에서, 배양 표면은 고농도의 비트로넥틴, 예를 들어, 1 μg/cm2 초과, 특히 2 μg/cm2, 3 μg/cm2, 4 μg/cm2, 5 μg/cm2, 6 μg/cm2, 7 μg/cm2, 8 μg/cm2, 9 μg/cm2, 10 μg/cm2, 또는 그 이상으로 코팅된다. RPE는 본원에 기재된 RPE-MM 배지와 같은 타우린, 하이드로코르티손 및 타우린을 포함하는 배지에서 배양될 수 있다. 특정 양상에서, 배지는 무혈청 또는 합성 배지이며 녹아웃 혈청 대체물을 포함할 수 있다. RPE는 약 100,000개 세포/cm2 내지 약 500,000개 세포/cm2, 예를 들어, 150,000개 세포/cm2, 200,000개 세포/cm2, 250,000개 세포/cm2, 300,000개 세포/cm2, 또는 350,000개 세포/cm2, 특히 약 300,000개 세포/cm2의 밀도로 배양될 수 있다.
[00212] 일부 양상에서, RPE는 베스트로핀 및/또는 Z01에 대해 양성인 양극화된 RPE를 생성하도록 배양될 수 있다. 양극화된 RPE는 PRE65 및/또는 에즈린에 대해 양성일 수 있다. RPE는 hiPSC에서 유래될 수 있고, 성숙될 수 있고, 예를 들어, RPE는 PMEL17, TYRP1 및 CRALBP에 대한 RPE이다. 상기된 방법에 의한 42일째 RPE와 같은 성숙한 RPE는 직접 배양하거나 미리 동결보존된 경우 해동할 수 있다. 이어서 RPE는 1주, 2주, 3주, 4주, 5주 또는 그 이상과 같이 RPE를 양극화하기에 충분한 시간 동안 배양될 수 있다. 특히, RPE는 양극화를 위해 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30일동안 배양될 수 있다.
[00213] RPE 상부 상에 층을 형성하는 광수용체는 미성숙 광수용체일 수 있고, 이는 간상형 또는 원추체형이 될 수 있다. 구체적으로, 광수용체는 본원에 기재된 하이브리드 분화 방법으로부터 유래될 수 있다. 광수용체는 배양 또는 동결 보존으로부터 RPE에 직접 씨딩될 수 있거나, 이들은 RPE에 씨딩하기 전에 재플레이팅되고, 배양될 수 있다. 광수용체는 RPE에 씨딩될 수 있고 이어서 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24일 또는 그 이상 동안 배양하여 부착되어 별개의 이중층을 생성할 수 있도록 한다. 광수용체는 50만개 세포/cm2, 100만개 세포/cm2, 200만개 세포/cm2, 300만개 세포/cm2, 400만개 세포/cm2, 500만개 세포/cm2, 600만개 세포/cm2, 700만개 세포/cm2, 800만개 세포/cm2, 900만개 세포/cm2, 1000만개 세포/cm2, 또는 그 이상의 밀도로 씨딩될 수 있다. 구체적으로 광수용체는 약 300만개 세포/cm2의 밀도로 씨딩될 수 있다. 특정 구현예에서, 광수용체는 오가노이드의 분류로부터가 아니라 hiPSC로부터 유래된다. 씨딩되는 광수용체는 필수적을 응집물이 부재인 단일 세포일 수 있다. RPE는 본원에 기재된 RPE-MM 배지와 같은 타우린, 하이드로코르티손 및 타우린을 포함하는 배지에서 배양될 수 있다. 특정 양상에서, 배지는 무혈청 또는 합성 배지이며 녹아웃 혈청 대체물을 포함할 수 있다.
[00214] 일부 양상에서, ROCK 억제제, ECM 단백질 및/또는 프로스타글란딘 E2(PGE2)는 예를 들어 RPE에 대한 광수용체의 부착을 증가시키기 위해 광수용체를 첨가하기 전에 RPE 배양물에 첨가될 수 있다. 상기 ROCK 억제제는 Y-27632일 수 있다. ECM 단백질은 라미닌, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 또는 비트로넥틴, 특히 라미닌-521일 수 있다. ROCK 억제제, ECM 단백질 또는 PGE2는 광수용체의 첨가 전 적어도 10분, 예를 들어 30분, 60분 또는 90분 전에 첨가될 수 있다.
[00215] 별개의 이중층에서 광수용체 대 RPE의 비율은 1:1, 1:2, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 또는 30:1일 수 있다.
V. 이중층 PR/PRP:RPE 공동 배양물의 용도
[00216] PR/PRP:RPE 이중층 배양물은 세포 구제 치료요법 또는 전체 조직 대체 치료요법과 같은 이식을 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예는 안구 조직 유지 및 복구가 필요한 망막변성 또는 유의적인 손상을 포함하는 임의의 병태에 대한 안구 조직 유지 및 복구를 증진시키기 위한 PR/PRP:RPE 이중층 배양물의 용도를 제공할 수 있다. 망막 변성은 연령 관련 황반 변성(AMD), 유전성 황반 변성, 스타가르트 황반 이영양증, 베스트 질환, 맥락막결절증, 유전성 망막 변성(망막 색소변성증, 원추체/간상 및 간상/원추체 이영양증 포함), 당뇨병성 망막병증, 망막 혈관 질환, 미숙아 망막병증(ROP)으로 인한 손상, 눈의 바이러스 감염, 기타 망막/안구 질환 또는 부상/외상과 관련될 수 있다.
[00217] 또 다른 양상에서, 본원의 개시내용은 PR/PRP:RPE 이중층을 포함하는 조성물을 상기 개체에게 이식함을 포함하는, 치료를 필요로하는 개체의 치료 방법을 제공한다. 상기 조성물은 눈, 예를 들어, 망막하 공간에 투여될 수 있다. 그러한 개체는 망막 색소변성증, 원추체/간상 또는 간상/원추체 이영양증, 스타가르트 질환, 베스트 질환, 맥락막결절증, 망막 이형성증, 망막 변성, 당뇨병성 망막병증, 선천성 망막 이영양증, 레버 선천성 흑암시, 망막 박리, 미숙아 망막병증(ROP)에 의해 유발된 손상, 또는 기타 망막 외상이나 손상과 같은 유전성 황반 또는 망막 변성을 가질 수 있다.
[00218] 치료제 투여를 위한 세포 조성물의 적합성을 결정하기 위해, 세포를 먼저 적합한 동물 모델, 예를 들어, 설치류 또는 돼지에서 시험할 수 있다. 하나의 양상에서, PR/PRP:RPE 이중층은 이들이 생존하여 이들의 생체내 표현형을 유지하는 능력에 대해 평가한다. 조성물을 면역결핍 동물 (예를 들어, 누드 마우스 또는 화학적으로 또는 방사선에 의해 면역결핍된 동물)에 이식한다. 조직들을 성장 기간 이후에 수거하여 만능 줄기 세포 유래의 세포들이 여전히 존재하는지의 여부에 대해 평가한다.
[00219] 본원에 기재된 사람 PR/PRP:RPE 이중층 배양물 또는 상기 이중층을 포함하는 약제학적 조성물은 질환의 치료가 필요한 환자의 병태를 치료하기 위한 약물의 제조를 위해 사용될 수 있다. 광수용체 또는 RPE는 이전에 냉동보존될 수 있다. 특정 양상에서, 상기 개시된 광수용체 또는 RPE는 iPSC로부터 유래될 수 있고, 안구 질환이 있는 환자를 위한 "개인화된 의약"을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자로부터 얻은 체세포는 질환 유발 돌연변이를 올바르게 하기 위해 유전학적으로 가공될 수 있어, PR/PRP 또는 RPE로 분화시키고 가공하여 PR/PRP:RPE 이중층 배양물을 형성할 수 있다. 상기 조직은 동일한 환자의 내인성 변성된 PR/PRP 및 RPE를 대체하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 건강한 공여자 또는 HLA 동형접합성 "초공여자"로부터 생성된 iPSC를 사용할 수 있다.
[00220] 다양한 눈 병태들은 본원에 개시된 방법을 사용하여 수득된 PR/PRP:RPE 이중층 배양물의 도입에 의해 치료되거나 예방될 수 있다. 상기 병태는 일반적으로 망막 기능부전 또는 변성, 망막 손상 및/또는 망막 색소 상피 및/또는 광수용체의 손실과 관련된 망막 질환 또는 장애를 포함한다. 치료할 수 있는 병태는 스타가르트 황반 이영양증, 망막 색소변성증, 간상/원추체 및 원추체/간상 이영양증, 황반 변성(예를 들어, 연령 관련 황반 변성, 근시성 황반 변성 또는 기타 후천성 또는 유전성 황반 변성), 미숙아 망막병증(ROP) 및 당뇨병성 망막병증으로 인한 망막 손상과 같은 망막의 변성 질환을 제한 없이 포함한다. 추가의 병태는 레버 선천성 흑암시, 유전성 또는 후천성 황반 또는 망막 변성, 베스트 질환, 망막 박리, 우곡상 위축, 맥락막결손증, 패턴 이영양증, 광수용체 세포의 다른 이영양증 및 광, 레이저, 염증, 감염, 방사선, 신생혈관 또는 외상성 손상 중 어느 하나에 의해 유발된 손상으로 인한 망막 손상을 포함한다. 특정 구현예에서, PR/PRP:RPE 이중층 배양물을 포함하는 유효량의 조성물을 망막 변성을 특징으로 하는 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 망막 변성을 특징으로 하는 병태를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 이들 방법은 하나 이상의 이러한 병태가 있는 대상체를 선택하는 단계, 및 병태를 치료하고/치료하거나 상기 병태의 증상을 개선하기에 충분한 치료학적 유효량의 PR/PRP:RPE 이중층 배양물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. PR/PRP:RPE 이중층 배양물은 다양한 포맷으로 이식될 수 있다. 예를 들어, PR/PRP:RPE 이중층은 매트릭스, 세포외 매트릭스 또는 기질, 예를 들어, 생분해성 중합체상에 접착된 표적 부위에 도입할 수 있다.
[00221] 유리하게, 본원 개시내용의 약제학적 제제는 RPE 및/또는 PR/PRP 세포 기능의 부재 또는 감소를 보상하기 위해 사용될 수 있다. 망막 세포 집단 및 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 망막 기능부전의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 광수용체 변성(예를 들어, 망막 색소변성증, 원추체 이영양증, 원추체-간상 및/또는 간상-원추체 이영양증 및 유전성 및 연령 관련 또는 근시 황반 변성); 망막 박리 및 망막 외상; 레이저 또는 태양광에 의해 유발되는 광 병변; 황반 원공(macular hole); 황반 부종; 야맹증 및 색맹; 당뇨병 또는 혈관 폐색에 의해 유발된 허혈 망막병증; 미성숙도/미성숙 출산으로 인한 망막병증/망막손상; 감염성 병태, 예를 들어, CMV, 망막염 및 톡소플라스마증; 염증 병태, 예를 들어, 포도막염; 종양, 예를 들어, 망막모세포종 및 안구 흑색종.
[00222] 하나의 양상에서, 세포는 치료를 필요로 하는 환자에서 유전성 망막 변성, 예를 들어 망막 색소변성증, 원추체/간상 또는 간상/원추체 이영양증, 레버 선천성 흑암시 또는 망막 손상/외상/손상의 증상을 치료하거나 완화할 수 있다. 또 다른 양상에서, 세포는 황반 변성, 예를 들어, 연령 관련 황반 변성 (습윤 또는 건조), 스타가르트 질환, 베스트 질환, 근시 황반 변성 등의 증상을 치료하거나 완화시킬 필요가 있는 대상체에서 상기 증상을 치료하거나 완화시킬 수 있다. 이들 치료 모두를 위해, 세포는 환자에게 자가 또는 동종이계일 수 있다. 추가의 양상에서, 본원 개시내용의 세포는 다른 치료와 조합하여 투여될 수 있다.
[00223] 일부 구현예에서, PR/PRP:RPE 이중층 배양물은 재생 의약을 투여받기에 적합한 대상체에 대한 자가 PRP 이식편을 위해 사용될 수 있다. PR/PRP:RPE 이중층 배양물은 다른 망막 세포와 함께 이식될 수 있다. 기재된 방법에 의해 생성되는 PR/PRP:RPE 이중층 배양물의 이식은 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다. 하나의 구현예에 따르면, 이식은 편평부 유리체 절제술 접근법에 이어서 작은 망막 개구를 통한 망막하 공간으로의 세포의 전달 또는 직접 주사에 의해 수행된다. PR/PRP:RPE 이중층 배양물은 매트릭스, 예를 들어, 세포외 매트릭스상에 접착되거나 기질, 예를 들어, 생분해성 중합체상에 제공된 표적 부위에 도입할 수 있다.
[00224] PR/PRP:RPE 이중층 배양물을 사용하여 신경감각 망막 구조를 생성할 수 있다. 이들 구조는 질환에 대한 모델로서 또는 약제학적 제제에서와 같이 약물 스크리닝을 위해 사용될 수 있다. 후자 경우에, 약제학적 제제는 “패치”처럼 이식될 수 있는 생적합성 고체 지지체 또는 매트릭스 (바람직하게 생분해성 매트릭스 또는 지지체) 상에 배치될 수 있는 RPE-광수용체 이식편일 수 있다.
[00225] 추가로 설명하기 위해, 세포에 대한 생물적합성 지지체는 RPE에 대한 필름 지지체인 폴리에스테르와 같은 생분해성 합성물일 수 있다. 생분해성 폴리에스테르는 망막 선조체 세포의 증식 및 분화를 지지하기 위한 기질 또는 스캐폴드로서 사용하기에 적합한 임의의 생분해성 폴리에스테르일 수 있다. 상기 폴리에스테르는 얇은 필름, 바람직하게 미세 질감 필름을 형성할 수 있어야만 하고 조직 또는 세포 이식을 위해 사용되는 경우 생분해성이어야만 한다. 본 발명에 사용하기 위해 적합한 생분해성 폴리에스테르는 폴리락트산 (PLA), 폴리락티드, 폴리하이드록시알카노에이트, 동종중합체 및 공중합체 둘다, 예를 들어, 폴리하이드록시부티레이트 (PHB), 폴리하이드록시부티레이트 코-하이드록시발레레이트(PHBV), 폴리하이드록시부티레이트 코-하이드록시헥사노트 (PHBHx), 폴리하이드록시부티레이트 코-하이드록시옥토노에이트 (PHBO) 및 폴리하이드록시부티레이트 코-하이드록시옥타데카노에이트 (PHBOd), 폴리카프롤락톤 (PCL), 폴리에스테르아미드 (PEA), 지방족 코폴리에스테르, 예를 들어, 폴리부틸렌 숙시네이트 (PBS) 및 폴리부틸렌 숙시네이트/아디페이트 (PBSA), 방향족 코폴리에스테르를 포함한다. 높고 낮은 분자량 폴리에스테르 둘다, 치환되고 비치환된 폴리에스테르, 블록, 분지되거나 무작위 및 폴리에스테르 혼합물 및 블렌드를 사용할 수 있다.
[00226] 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 PR/PRP:RPE 이중층 배양물의 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 이들 조성물은 적어도 약 1 x 103개의 세포, 약 1 x 104개의 세포, 약 1 x 105 개의 세포, 약 1 x 106 개의 세포, 약 1 x 107 개의 세포, 약 1 x 108 개의 세포 또는 약 1 x 109 개의 세포를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 분화된 PR/PRP:RPE 세포를 포함하는 (비-PR/PRP:RPE 세포에 대해) 실질적으로 정제된 제제이다. 스캐폴드, 중합체 캐리어로서 PR/PRP 및/또는 세포외 매트릭스, 및 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 유효량의 광수용체:RPE 세포를 포함하는 조성물도 제공된다. 매트릭스 물질은 일반적으로 생리학적으로 허용될 수 있고, 생체내 적용에 사용하기 위해 적합하다. 예를 들어, 상기 생리학적으로 허용가능한 물질로는, 이에 제한되지는 않지만, 흡수성 및/또는 비흡수성 고체 매트릭스 물질, 예를 들어 소장 점막하조직 (SIS), 가교성 또는 비가교성 알기네이트, 하이드로콜로이드, 발포체, 콜라겐 겔, 콜라겐 스펀지, 폴리글리콜산 (PGA) 메쉬, 플리스 및 생체접착제를 포함한다.
[00227] 적절한 중합체 캐리어로는 합성 또는 천연 중합체 뿐만 아니라 중합체 용액으로 형성된 다공성 메쉬 또는 스펀지도 포함한다. 예를 들어, 상기 매트릭스는 중합체 메쉬 또는 스펀지, 또는 중합체 하이드로겔이다. 사용될 수 있는 천연 중합체로는 단백질, 예를 들어 콜라겐, 알부민 및 피브린; 및 다당류, 예를 들어 알기네이트 및 히알루론산의 중합체를 포함한다. 합성 중합체로는 생분해성 중합체와 비생분해성 중합체를 모두 포함한다. 예를 들어, 생분해성 중합체로는 히드록시산, 예를 들어 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA) 및 폴리락트산-폴리글리콜산 (PGLA)의 중합체, 폴리오르쏘에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리포스파젠 및 이들의 조합을 포함한다. 비생분해성 중합체로는 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 에틸렌 비닐 아세테이트 및 폴리비닐 알콜을 포함한다.
[00228] 연성인 이온성 또는 공유결합성 하이드로겔을 형성할 수 있는 중합체가 사용될 수 있다. 하이드로겔은 유기 중합체 (천연 또는 합성)가 공유결합, 이온결합 또는 수소결합을 통해 가교결합되어 물분자를 가둬 겔을 형성하는 3차원 개방형 격자 구조를 생성하는 경우에 형성되는 물질이다. 하이드로겔을 형성하는데 사용될 수 있는 물질의 예로는 다당류, 예를 들어 이온 가교결합성인 알기네이트, 폴리포스파진 및 폴리아크릴레이트, 또는 블록 공중합체, 예를 들어 각각 온도 또는 H에 의해 가교결합되는 PLURON1CS™ 또는 TETRON1CS™, 폴리에틸렌 옥시드-폴리프로필렌 글리콜 블록 공중합체를 포함한다. 기타 물질로는 피브린과 같은 단백질, 폴리비닐피롤리돈, 히알루론산 및 콜라겐과 같은 중합체를 포함한다.
[00229] 약제학적 조성물은 임의로 망막 조직의 질환 또는 이상을 개선하기 위한 광수용체 기능의 재구성과 같은 요망되는 목적에 대한 서면 지침서를 구비한 적합한 용기에 팩키징될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 광수용체를 사용하여 이를 필요로 하는 대상체의 변성된 광수용체 세포를 대체할 수 있다.
VI. 키트
[00230] 일부 구현예에서, 예를 들어, PR/PRP:RPE 이중층 배양물의 생성을 위한 하나 이상의 배지 및 성분들을 포함할 수 있는 키트가 제공된다. 상기 제형은 광수용체 전구체 또는 광수용체 세포와 조합하기에 적합한 형태로, 망막 분화 및/또는 영양 인자의 칵테일을 포함할 수 있다. 시약 시스템은 수성 배지 중에 또는 동결건조된 형태로 적절히 포장될 수 있다. 키트 용기의 수단으로는 일반적으로 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기, 또는 성분이 배치될 수 있는 다른 용기 수단, 바람직하게는 적절히 분취될 수 있는 다른 용기 수단 중 하나 이상을 포함한다. 키트 내에 하나 이상의 성분이 존재하는 경우, 상기 키트는 일반적으로 추가의 성분들이 별도로 배치될 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가의 용기들을 포함할 것이다. 그러나, 성분들을 다양하게 조합하여 하나의 바이알에 포함시킬 수도 있다. 키트의 성분들은 건조 분말로 제공될 수도 있다. 시약 및/또는 성분들이 건조 분말로 제공되는 경우, 상기 분말은 적절한 용매를 첨가하여 재구성될 수 있다. 용매는 또한 또 다른 컨테이너 수단으로 제공될 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 상기 키트는 통상적으로 상업적 판매를 위해 긴밀하게 밀폐된 상태로 키트 성분들을 포함하기 위한 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기들로는 원하는 바이알들을 보존하는 사출 성형 또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다. 상기 키트는 인쇄형 또는 전자 포맷, 예를 들어, 디지털 포맷의 사용 지침서(예를 들어, 이중층 배양물 치료요법에 대해)를 포함할 수도 있다.
VII. 실시예
[00231] 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 당업계의 숙련자라면, 하기의 실시예에 기술된 기법들이 본 발명을 잘 수행하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기법들을 대표하는 것이기 때문에, 발명의 수행에 대한 바람직한 양태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 그러나, 당업계의 숙련자라면, 본 명세서의 내용을 고려하여, 개시된 구체적인 구현예에 있어서 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 여러가지 변화를 주어도 그와 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다.
실시예 1 - 이중층 배양물의 개발
[00232] 양극화된 RPE 상에 PRP 씨딩: iPSC로부터 유래된 RPE는 CD56 음성 선택을 사용하여 본원에 기재된 방법에 따라 성장시키고(문헌참조: PCT/US2016/050554) iPSC로부터 유래된 PRP는 하이브리드 안구 소포 PRP 분화 방법에 따라 성장시켰다(문헌참조: PCT/US2019/028557). RPE는 42일째에 해동시키고, 48웰 플레이트에서 68일때까지 100,000 또는 300,000개의 세포/cm2로 양극화되도록 하였다. 상기 시점에서 75일째 PRP를 라미닌-521 코팅된 용기에서 들어 올려 RPE-MM에 600만개의 세포/mL로 재현탁하였다. PRP는 배지 변형 없이 RPE-MM에서 RPE의 상부에 300만개 세포/cm2(0.5mL 배지 용적)로 씨딩하였다.
[00233] 1일 후, 모든 조건에서 PRP가 RPE 층에 부착되었다는 것이 상 대조 현미경에 의해 명백해졌다. 부착 후 대표적인 인풋 PRP 플로우 플롯 및 현미경 사진은 도 1에 나타낸다. 1. PRP 씨딩 전 30분 라미닌-521 항온처리의 존재 및 부재하에, 및 2개의 PRP 인풋 세포와 함께 2개 RPE 밀도에서 RPE에 부착된 PRP. 더욱이, RPE 및 PRP는 별개의 층을 유지하는 것으로 나타났다(도 2). RPE-MM에서 RPE에 대한 PRP 부착과 공동 배양 7일 후 2개 세포 유형의 명확한 존재는 상기 포맷이 이중층 배양 치료요법을 위한 잠재적으로 강력한 기반임을 시사한다.
[00234] 해동되고, 양극화된 RPE상에 씨딩된 PRP: PRP를 직접 사용하고 RPE와 PRP를 동시에 배양 및 성숙시키는 복잡한 타이밍 문제를 최소화하기 위해 PRP를 양극화된 RPE 층상에서 직접 해동시켰다. 추가로, PRP 층이 서브컨플루언트하였기 때문에, PRP 플레이팅을 2개의 상이한 밀도에서 시험하였다: 300만개의 세포/cm2 및 1000만개의 세포/cm2. RPE는 42일째에 해동시켰고 68일까지 양극하되도록 하였다. 75일 PRP는 임의의 블레비스타틴 또는 ROCK 억제제 없이 RPE-MM 내 RPE 층상으로 성공적으로 해동시켰다. 배양 7일 후, 세포를 고정시켰고 면역세포화학은 이중층 형태를 보여주었다(도 3). 추가로, 유동 세포측정 데이터는 또한 대부분의 RPE가 성숙한 베스트로핀1+ 표현형을 발현하는 별개의 집단으로서 세포 유형 둘다를 보여주었다(도 4).
[00235] 상기 실험은 이중층 배양 생성물에 대한 몇 가지 진전을 입증하였다. 첫번째, PRP를 RPE상으로 직접 해동시킬 수 있어 PRP 생성물이 뱅킹되고 이어서 목적하는 시간에 사용할 수 있는 모듈식 프로세스가 가능하다. RPE와 PRP는 별개의 층을 형성하고, 이는 상기 세포 이중층이 망막에 이식되는 치료요법과 손쉬운 시험관내 모델로 모두 사용될 수 있음을 시사한다. 최종적으로, 고밀도 (1×107개의 세포/cm2)로 PRP의 씨딩은 거의 컨플루언트한 PRP 층을 생성한다. 상기 실험은 컨플루언트 PRP 층이 달성 가능한 조건을 보여준다.
[00236] 스냅-웰 포맷의 RPE/PRP 공동 배양: RPE/PRP의 공동 배양물은 RPE-MM에서 및 5% FBS로 대체된 15% 녹아웃 혈청 대체(KOSR)를 갖는 RPE-MM에서 스냅-웰 포맷으로 씨딩하였다. RPE는 42일에 300,000개의 세포/cm2로 씨딩하였고, 68일까지 양극화되도록 하였다. PRP를 1×107개 세포/cm2로 RPE상으로 해동시켰다. 일부 샘플은 RPE-MM 대신 15% KOSR을 갖는 RPE-MM으로 플레이팅하였다. 배양 7일 후, 세포는 유동 세포측정 또는 면역세포화학에 의해 분석하였다(도 5). 상기 실험은 스냅웰 삽입체와 FBS 함유 및 KOSR 함유 RPE-MM 둘다에서 RPE/PRP 공동 배양의 가능성을 보여주었다.
[00237] PLGA 스캐폴드 상에서 RPE/PRP 공동 배양: 이어서, 스냅-웰 배양 시스템에서 조립된 비트로넥틴(VTN)-코팅된 PLGA 스캐폴드 상에서 공동 배양을 수행하였다. RPE는 42일에 300,000개의 세포/cm2로 씨딩하였고, 68일까지 양극화되도록 하였다. PRP는 2개의 밀도로 해동시켰다: 5×106개의 세포/cm2 및 1×107개의 세포/cm2. 배양 7일 후, 세포는 면역세포화학 및 공초점 현미경에 의해 분석하였다(도 6). 상기 실험은 VTN 코팅된 PLGA 스캐폴드상에서 RPE/PRP 이중층을 배양하는 가능성을 확인했고, 보다 낮은(5×106개의 세포/cm2) 및 보다 높은(1×107개 세포/cm2) 세포 밀도로 씨딩 후 PRP 형태를 확인하였고, 보다 높은 밀도는 PRP의 거의 컨플루언트하는 층을 달성하였다.
[00238] RPE 및 PRP를 이중층으로서 배양하는 능력은 세포 기반 치료요법을 위한 상기 배양 포맷의 실현 가능성을 입증하였다. 상기 "이중 치료요법"은 RPE 또는 PRP 단독보다 더 넓은 범위의 조건을 치료하는 데 적합할 수 있는데 그 이유는 2개 세포 유형이 존재하고 양극화된 RPE 위에 배치된 PR이 있는 뚜렷하고 적절하게 적층된 구성으로 조직되기 때문이다. 또한, PRP는 RPE상으로 직접 해동될 수 있으므로 이들 2개의 세포 유형을 독립적으로 제조하고 냉동 보존할 수 있다. 이중 치료요법의 이러한 특징은 상이한 PRP 서브타입(예를 들어, 간상- 또는 원추체 성향)이 모듈식 시스템에서 사용될 수 있도록 한다.
실시예 2 - PRP 부착 최적화
[00239] RPE를 48-웰 플레이트상으로 해동시키기 전에 10㎍/cm2의 비트로넥틴 농도는 0.5㎍/cm2의 비트로넥틴 농도와 비교하여 RPE에 보다 양호한 PRP 부착을 유도하였다(도 13). 상기 실험은 또한 PRP 플레이팅 밀도의 효과를 설명하였고, PRP는 0.5 μg/cm2 비트로넥틴에서 1000만개의 PRP/cm2와 비교하여 300만개의 PRP/cm2로 플레이팅된 경우 보다 양호하게 부착되었다.
[00240] 스냅웰 배양 용적 조정: 스냅웰 배양의 배지 용적은 배지로부터의 압력이 스냅웰의 상부(정점) 측면 또는 스냅웰의 하부(기저) 측면에서 보다 낮도록 조정되었다. 스냅웰의 기저측면에 대한 용적을 증가시켜 상기 측면에 대한 압력을 증가시키는 것은 배양에 2개의 효과를 가졌다. 첫번째로, 세포 이중층은 스냅웰로부터 보다 용이하게 분리된다. 두번째로, PRP는 RPE에 보다 강하게 부착되는 것으로 나타났고, 생검 펀치로 샘플을 펀칭한 후 완전한 PRP 커버리지로 입증되었다(도 8).
[00241] PRP 밀도 적정: 48-웰 플레이트에서 RM1에서 RPE에 대한 PRP의 밀도 적정은 씨딩 밀도가 증가함에 따라 PRP의 면적 커버리지가 증가했지만 약 500만개의 PRP/cm2 이상에서 PRP의 박리로 인한 박리를 보여주었다(도 7). 이러한 추세는 RPE/PRP 부착을 개선하는 대체 방법이 PRP 밀도를 저하시키는 것임을 시사한다. 높은 PRP:RPE 비율이 바람직하지만(이상적으로는 30:1), PRP 밀도가 낮으면 부착이 가능할 수 있다.
[00242] 결론적으로, 배지 또는 배양 시스템에 대한 몇 가지 변형은 RPE/PRP 세포 부착을 질적으로 향상시키는 것으로 나타났다. RPE 층 아래의 비트로넥틴 농도가 높을수록 PRP 부착도 개선되었다. 스냅웰 하부면 상의 보다 높은 용적의 배지는 또한 PRP 부착을 개선하였다. 최종적으로, PRP 밀도를 개선시키면 PRP 부착을 개선시킬 수 있다. 300만개의 PRP/cm2보다 낮은 밀도에서, PRP는 네트워크 보다는 콜로니로 클러스터링된다.
실시예 3 - RPE-PRP 이중층의 생체내 이식
[00243] RPE 및 PRP 세포의 이중층으로 구성된 이중 안구 세포 치료요법이 개발되었다. 이중 치료요법 PLGA-RPE-PRP의 이식을 돼지 눈에서 수행하고 이식체를 면역세포화학에 의해 분석하였다.
[00244] 수술 전에 PLGA 스캐폴드상에 RPE와 PRP의 이중층을 제조하였다. 간략하게, RPE (42일)를 해동시키고, 플레이팅하고 3×105개의 세포/cm2로 PLGA 스캐폴드상에 씨딩하였다. RPE를 26일 동안(분화 68일까지) 배양하여 54일부터 68일까지 PGE2 첨가를 포함하여 RPE가 양극화되도록 하였다. RPE 68일째에, PRP(75일 또는 77일)를 RPE에 단일 세포로서 4×106개 세포/cm2로 플레이팅하였다. 세포 이중층을 1-2일마다 배지(RPE-MM) 교환으로 7일 동안 배양하였다.
[00245] 수술 2일 전에 일부 돼지 망막에 매우 짧은 듀티 사이클(1%-3%) 및 역치 에너지(거의 눈에 보이지 않는 병변)를 갖는 532/577 마이크로펄스 레이저로 레이저 조사하여 외부 망막으로 방출되는 에너지를 제한하였다. 레이저 에너지는 호스트 RPE에 의해 픽업되고 광수용체를 손상시킨다. 돼지도 레이저 시술 5~8일 전부터 면역억제제 약물로 처리하고 안락사 당일까지 면역억제제 약물을 계속 투여하였다.
[00246] 수술 당일, 돼지를 마취하고, 삽관하고, 마비시키고, 망막하 이식을 위해 제조하였다. 이중 치료요법 이중층 샘플은 수술을 위해 제조하였다. 0.42% Healon-GV 용액을 제조하고 바늘(18G)을 통해 상하로 약 30-50회 밀고 당겨서 균질화하였다. 상기 용액의 여러 방울을 커팅 매트에 떨어뜨렸다. 스냅웰l 삽입체를 6-웰 플레이트에서 제거하고 HBSS+로 세척하고 Healon-GV 용액 한 방울 위에 놓았다. 전체 스냅웰 삽입체 바닥은 8mm 생검 펀치를 사용하여 펀칭하였다. 핀셋이나 주걱을 사용하여 스냅웰 삽입체 플라스틱 바닥을 PLGA-RPE-PRP 층으로부터 기계적으로 제거하였다. PLGA-RPE-PRP는 2x4mm 타원형 생검 펀치를 사용하여 다시 펀칭하고, 0.42% Healon GV 한 방울로 옮겼다. 이 시점에서, 2x4-mm 펀칭된 PLGA-RPE-PRP 이식체를 망막하 주사 도구에 부하하였다(도 9a).
[00247] 망막하 주사 도구는 Healon-GV와 같은 히알라론산 용액으로 프라이밍하였다. 주사기는 액체를 도구로 인출하기 위해 압력을 생성시켰고, 주사기는 또한 도구의 앞부분으로의 샘플의 부하를 제어하였다. 외과의가 편평부 유리체 절제술을 하고 망막하 이식을 준비하기 위해 2단계 2.4mm 작업 포트를 제조하는 동안 샘플을 도구에 부하하였다.
[00248] PLGA-RPE-PRP 이식체는 망막하 주사 도구를 사용하여 망막하 공간으로 전달하였다. 수술 중 광간섭 단층촬영(iOCT) 이미지화로 샘플이 망막하 공간으로 전달되었음을 확인하였다. 샘플 전달의 성공을 확인한 후, 유체/공기/가스 교환이 수행된다. 외과의는 작업 포트를 봉합하고 눈의 다른 봉합 없는 수술 포트를 제거한다. 수술 후 돼지 망막을 모니터링하기 위해 2주마다 OCT 이미지화를 수행하였다.
[00249] 이식체가 숙주 망막에 생착될 수 있도록 충분한 시간이 지난 후 눈을 조직학으로 분석하였다. 조직학은 냉동절제함에 의해 수행하였다. 간략하게, 해부된 눈을 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 매립하고, 동결시키고, 냉동절단기를 사용하여 망막에 직각으로 절개하였다. 절개된 샘플을 슈퍼프로스트(Superfrost) 플러스 슬라이드상에 탑재하였다. 슬라이드는 순차적으로 넘버링하였으므로 슬라이드 번호는 망막의 내측/외측 영역에 상응한다.
[00250] 절개된 돼지 망막에 대해 면역세포화학을 수행한 후, 간상 및 원추체 둘다에 대한 마커가 명백하다(도 9). 사람 RPE는 MITF(도 10)로 지적된 광수용체 층에 인접하여 명백하다. 광수용체의 존재는 또한 레코베린에 의해 지적된다(도 11). 이식된 세포 영역에서 GFAP 발현 세포는 사람 핵 음성이고 호스트 뮬러 교세포이다. 호스트 뮬러 교세포는 외부 제한막의 재형성을 시도했지만 이식된 RPE 층에서 멈췄다(도 12). 이식된 세포가 호스트 망막과 통합할 가능성은 이식된 광수용체에 대한 시냅스전 마커 VGLUT1의 근접성 및 PKCα로 지적된 호스트 양극성 세포의 근접성에 의해 지적된다(도 13). 시냅스전 마커 시냅토피신은 또한 이식된 세포에서 명백하고 원추체 마커 어레스틴-3과 함께 동시-국소화된 것으로 보인다(도 14).
[00251] RPE/PRP 이중층은 돼지 망막의 망막하 공간에 성공적으로 이식되었다. 수술 후 이식된 PRP는 간상 및 원추체 광수용체로 성숙되고, 이식된 RPE 및 PRP는 숙주 망막에 생착되어 통합될 준비가 된 것으로 보인다. 통합 능력에 대한 증거는 이식된 광수용체에 근접한 시냅스 전 마커의 존재와 이식된 광수용체 층으로의 호스트 양극성 세포의 이동에 의해 뒷받침된다.
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[00252] 본원에 기재되고 청구된 모든 방법은 본원 개시내용에 기초하여 과도한 실험 없이 만들어질 수 있고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 당업계의 개념, 의미 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본원에 기술된 방법들, 상기 방법의 단계들 또는 상기 방법 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 사실은 당업계의 숙련자들에게는 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되어 있는 특정 제제의 경우 이들을 사용하여도 동일하거나 유사한 결과가 달성된다면 본원에 기술된 제제를 대체할 수 있음도 명백할 것이다. 당업계의 숙련자들에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 의미, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기의 참고문헌들은, 본원에 기술된 내용에 대하여 예시적인 절차이거나 이를 보충하는 기타 상세한 설명을 제공하는 정도로, 본원에 참고로서 상세하게 포함된다.
Figure pct00008
Figure pct00009
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Claims (155)

  1. 생분해성 스캐폴드상에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)와 함께 광수용체 전구체 세포 (PRP) 및/또는 광수용체 세포 (PR)를 포함하는 조직 대체 이식체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이식체가 한정되고, 제노-프리(xeno-free) 및 피더-프리(feeder-free)인, 조직 대체 이식체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 RPE가 베스트로핀-1(BEST1) 및/또는 ZO-1을 발현하는 성숙한 RPE인, 조직 대체 이식체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE가 양극화된, 조직 대체 이식체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP 및 RPE가 이중층으로 있는, 조직 대체 이식체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 이중층 PR/PRP가 세포-세포 접촉 또는 공유 매트릭스에 대한 부착을 통해 RPE에 부착된, 조직 대체 이식체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생분해성 스캐폴드가 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리락트산(PLLA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(글리세롤 세바케이트(PGS), 폴리피롤(PPy), 폴리비닐 알콜(PVA), 젤라틴, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 피브린, 히울라론산, 실크, 키토산 및/또는 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA)을 포함하는, 조직 대체 이식체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생분해성 스캐폴드가 PLGA를 포함하는, 조직 대체 이식체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 PLGA가 약 1:1의 DL-락티드/글리콜리드 비율을 갖는, 조직 대체 이식체.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 PLGA가 약 1마이크론 미만의 평균 공극 크기를 갖는, 조직 대체 이식체.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PLGA가 약 150 내지 약 650nm의 섬유 직경을 갖는, 조직 대체 이식체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생분해성 스캐폴드가 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질로 코팅된, 조직 대체 이식체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 ECM 단백질이 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐 I, 콜라겐 IV 또는 피브로넥틴을 포함하는, 조직 대체 이식체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 ECM 단백질이 비트로넥틴을 포함하는, 조직 대체 이식체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생분해성 스캐폴드가 약 20 내지 약 30 마이크론 두께인, 조직 대체 이식체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP 및 RPE가 약 2:1 내지 약 30:1의 비율로 존재하는, 조직 대체 이식체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP 및 RPE가 약 1:1 내지 약 5:1의 비율로 존재하는, 조직 대체 이식체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 및/또는 상기 PR/PRP가 만능 줄기 세포 (PSC)로부터 유래된, 조직 대체 이식체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 PSC가 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 또는 배아 줄기 세포 (ESC)인, 조직 대체 이식체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 iPSC가 범용, HLA 매칭 또는 저면역(hypo-immune) iPSC인, 조직 대체 이식체.
  21. 제19항에 있어서, 상기 iPSC가 사람 iPSC(hiPSC)인, 조직 대체 이식체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, PR/PRP가 오가노이드로부터 유래하지 않은, 조직 대체 이식체.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 및/또는 상기 PR/PRP가 이전에 냉동보존된, 조직 대체 이식체.
  24. 제23항에 있어서, 상기 냉동보존된 RPE 및/또는 PR/PRP가 해동되고 적어도 1주동안 배양된, 조직 대체 이식체.
  25. 제23항에 있어서, 상기 냉동보존된 RPE 및/또는 PR/PRP가 해동되고 적어도 1주 미만동안 배양된, 조직 대체 이식체.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE가 약 100,000개의 세포/cm2 내지 약 1,000,000개의 세포/cm2의 밀도로 존재하는, 조직 대체 이식체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE가 약 300,000개의 세포/cm2 내지 약 800,000개의 세포/cm2의 밀도로 존재하는, 조직 대체 이식체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP가 약 100,000개의 세포/cm2 내지 약 10,000,000개의 세포/cm2의 밀도로 존재하는, 조직 대체 이식체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP가 약 300,000개의 세포/cm2 내지 약 5,000,000개의 세포/cm2의 밀도로 존재하는, 조직 대체 이식체.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP가 약 400만개의 세포/cm2의 밀도로 존재하는, 조직 대체 이식체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 및/또는 상기 PR/PRP가 동일한 공여자로부터 기원하는, 조직 대체 이식체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP가 간상 성향인, 조직 대체 이식체.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP가 원추체 성향인, 조직 대체 이식체.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조직 대체 이식체를 포함하는 약제학적 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 나트륨 히알루로네이트를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 히알루로네이트가 약 0.5% 미만의 농도로 존재하는, 약제학적 조성물.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 중탄산나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 제1 인산칼륨, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 및/또는 제2 인산나트륨을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  38. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조직 대체 이식체를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이
    (a) RPE를 생분해성 스캐폴드 상에 씨딩하는 단계;
    (b) 상기 RPE를 양극화된 RPE를 제조하기에 충분한 기간 동안 제1 조직 배양 배지에서 생분해성 스캐폴드 상에서 배양하는 단계;
    (c) PR/PRP를 상기 RPE에 씨딩하여 조직 대체 이식체를 형성하는 단계; 및
    (d) 상기 조직 대체 이식체를 PR/PRP가 RPE에 부착될 수 있게 하기에 충분한 기간 동안 제2 조직 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 스캐폴드가 플라스틱 O-고리에 의해 원위치에 유지되는, 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 양극화된 RPE가 베스트로핀1(BEST1)인, 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조직 배양 배지가 상기 제1 조직 배양 배지와 필수적으로 동일한, 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생분해성 스캐폴드가 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리락트산(PLLA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(글리세롤 세바케이트(PGS), 폴리피롤(PPy), 폴리비닐 알콜(PVA), 젤라틴, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 피브린, 히울라론산(hyularonic acid), 실크, 키토산 또는 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA)을 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 생분해성 스캐폴드가 PLGA를 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 PLGA가 약 1:1의 DL-락티드/글리콜리드 비율을 갖는, 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PLGA가 약 1마이크론 미만의 평균 공극 크기를 갖는, 방법.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PLGA가 약 150 내지 약 650nm의 섬유 직경을 갖는, 방법.
  47. 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생분해성 스캐폴드가 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질로 코팅된, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 ECM 단백질이 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐 I, 콜라겐 IV 또는 피브로넥틴을 포함하는, 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 ECM 단백질이 비트로넥틴을 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 비트로넥틴이 약 0.5 μg/cm2 초과의 농도로 표면에 첨가되는, 방법.
  51. 제49항에 있어서, 상기 비트로넥틴이 약 10 μg/cm2의 농도로 표면에 첨가되는, 방법.
  52. 제38항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE가 약 100,000개의 세포/cm2 내지 약 1,000,000개의 세포/cm2의 밀도로 씨딩되는, 방법.
  53. 제38항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE가 약 300,000개의 세포/cm2 내지 약 800,000개의 세포/cm2의 밀도로 씨딩되는, 방법.
  54. 제38항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP가 약 100,000개의 세포/cm2 내지 약 1000만개의 세포/cm2의 농도로 씨딩되는, 방법.
  55. 제38항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP가 약 300만개의 세포/cm2 내지 약 500만개의 세포/cm2의 농도로 씨딩되는, 방법.
  56. 제38항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP가 약 400만개의 세포/cm2의 농도로 씨딩되는, 방법.
  57. 제38항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 및/또는 상기 PR/PRP가 이전에 냉동보존된, 방법.
  58. 제38항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생분해성 스캐폴드가 조직 배양 삽입체를 갖는 다중 웰 지지체에 위치되는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지가 조직 배양 삽입체를 갖는 다중-웰 지지체의 하부 구획에 첨가되는, 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 제2 조직 배양 배지가 조직 배양 삽입체를 갖는 다중-웰 지지체의 상부 구획에 첨가되는, 방법.
  61. 제38항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지가 타우린 및 하이드로코르티손을 포함하는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지가 트리요오도티로닌을 추가로 포함하는, 방법.
  63. 제38항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지가 합성 배지 또는 무혈청 배지인, 방법.
  64. 제38항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지가 혈청 대체물을 포함하는, 방법.
  65. 제38항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지가 프로스타글란딘 E2 (PGE2)를 추가로 포함하는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 PGE2가 50μM 내지 100μM의 농도로 있는, 방법.
  67. 제38항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지가 RPE-MM 배지인, 방법.
  68. 제38항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조직 배양 배지가 상기 제1 조직 배양 배지와 필수적으로 동일한, 방법.
  69. 제38항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조직 배양 배지가 상기 제1 조직 배양 배지와 상이한, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 제2 조직 배양 배지가 최소 배지(RMN)인, 방법.
  71. 제58항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지가 다중-웰 지지체의 하부 구획에 첨가되고, 상기 제2 조직 배양 배지가 다중-웰 지지체의 상부 구획에 첨가되는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 하부 구획의 배지로부터의 조직 배양 삽입체에 대한 압력이 상부 구획의 배지로부터의 압력보다 높은, 방법.
  73. 제38항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 적어도 약 2주 동안인, 방법.
  74. 제38항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 적어도 약 3주 동안인, 방법.
  75. 제38항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 적어도 약 5일 동안인, 방법.
  76. 제38항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 적어도 약 1주 동안인, 방법.
  77. 제38항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 약 1일 동안인, 방법.
  78. 제38항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PRP가 간상 성향인, 방법.
  79. 제38항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PRP가 원추체 성향인, 방법.
  80. 제38항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지 및 상기 제2 조직 배양 배지가 적어도 5일마다 1회 교환되는, 방법.
  81. 제38항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지 및 상기 제2 조직 배양 배지가 적어도 3일마다 1회 교환되는, 방법.
  82. 제38항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지 및 상기 제2 조직 배양 배지가 적어도 격일마다 1회 교환되는, 방법.
  83. 제38항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 대체 이식체에서 PR/PRP 대 RPE의 비율이 약 2:1 내지 약 30:1인, 방법.
  84. 제38항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 대체 이식체에서 PR/PRP 대 RPE의 비율이 약 1:1 내지 약 5:1인, 방법.
  85. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제38항 내지 제84항 중 어느 한 한의 방법에 따라 제조된 조직 대체 이식체.
  86. PR/PRP-RPE 이중층을 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법이
    (a) 조직 배양 배지 중에 RPE를 조직 배양 삽입체를 갖는 다중웰 지지체의 상부 구획에 씨딩하는 단계;
    (b) 조직 배양 배지 중에 PR/PRP를 RPE와 직접 접촉된 상기 다중-웰 지지체의 상부 구획에 씨딩하는 단계로서, 상기 하부 구획의 중간 압력이 보다 상부 구획의 중간 압력 보다 높은, 단계; 및
    (c) PR/PRP-RPE 이중층을 생성하기에 충분한 기간동안 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 조직 배양 삽입체를 갖는 다중 웰 지지체의 하부 및 상부 구획에 있는 배지가 필수적으로 동일한, 방법.
  88. 제86항에 있어서, 조직 배양 삽입체를 갖는 다중 웰 지지체의 하부 및 상부 구획에 있는 배지가 상이한, 방법.
  89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE가 양극화된 RPE인, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 양극화된 RPE가 BEST1을 발현하는, 방법.
  91. 제86항에 있어서, 상기 RPE가 생분해성 스캐폴드 상에 씨딩되는, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 생분해성 스캐폴드가 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리락트산(PLLA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(글리세롤 세바케이트(PGS), 폴리피롤(PPy), 폴리비닐 알콜(PVA), 젤라틴, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 피브린, 히울라론산, 실크, 키토산 또는 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA)를 포함하는, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 생분해성 스캐폴드가 PLGA를 포함하는, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 PLGA가 약 1:1의 DL-락티드/글리코티드 비율을 갖는, 방법.
  95. 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PLGA가 약 1마이크론 미만의 평균 공극 크기를 갖는, 방법.
  96. 제92항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PLGA가 약 150 내지 약 650nm의 섬유 직경을 갖는, 방법.
  97. 제91항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생분해성 스캐폴드가 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질로 코팅된, 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 ECM 단백질이 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐 I, 콜라겐 IV 또는 피브로넥틴을 포함하는, 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 ECM 단백질이 비트로넥틴을 포함하는, 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 비트로넥틴이 약 0.5 μg/cm2 초과의 농도로 표면에 첨가되는, 방법.
  101. 제99항에 있어서, 상기 비트로넥틴이 약 10 μg/cm2의 농도로 표면에 첨가되는, 방법.
  102. 제86항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE가 약 100,000개의 세포/cm2 내지 약 1,000,000개의 세포/cm2의 밀도로 씨딩되는, 방법.
  103. 제86항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE가 약 300,000개의 세포/cm2 내지 약 800,000개의 세포/cm2의 밀도로 씨딩되는, 방법.
  104. 제86항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP가 약 100,000개의 세포/cm2 내지 약 1000만개의 세포/cm2의 농도로 씨딩되는, 방법.
  105. 제86항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP가 약 300만개의 세포/cm2 내지 약 500만개의 세포/cm2의 농도로 씨딩되는, 방법.
  106. 제86항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP가 약 400만개의 세포/cm2의 농도로 씨딩되는, 방법.
  107. 제86항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 및/또는 상기 PR/PRP가 이전에 냉동보존된, 방법.
  108. 제86항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지가 타우린 및 하이드로코르티손을 포함하는, 방법.
  109. 제108항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지가 트리요오도티로닌을 추가로 포함하는, 방법.
  110. 제86항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지가 합성 배지 또는 무혈청 배지인, 방법.
  111. 제86항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지가 혈청 대체물을 포함하는, 방법.
  112. 제86항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지가 RPE-MM 배지인, 방법.
  113. 제86항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조직 배양 배지가 타우린 및 하이드로코르티손을 포함하는, 방법.
  114. 제113항에 있어서, 상기 제2 조직 배양 배지가 트리요오도티로닌을 추가로 포함하는, 방법.
  115. 제86항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조직 배양 배지가 합성 배지 또는 무혈청 배지인, 방법.
  116. 제86항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조직 배양 배지가 혈청 대체물을 포함하는, 방법.
  117. 제86항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조직 배양 배지가 RPE-MM 배지인, 방법.
  118. 제86항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP가 간상 성향인, 방법.
  119. 제86항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP가 원추체 성향인, 방법.
  120. 제86항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지 및 상기 제2 조직 배양 배지가 적어도 5일마다 1회 교환되는, 방법.
  121. 제86항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지 및 상기 제2 조직 배양 배지가 적어도 3일마다 1회 교환되는, 방법.
  122. 제86항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 배양 배지 및 상기 제2 조직 배양 배지가 적어도 격일마다 1회 교환되는, 방법.
  123. 제86항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 대체 이식체에서 PR/PRP 대 RPE의 비율이 약 2:1 내지 약 30:1인, 방법.
  124. 제86항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 대체 이식체에서 PR/PRP 대 RPE의 비율이 약 1:1 내지 약 5:1인, 방법.
  125. 양극화된 RPE 상에서 배양된 성숙한 PRP의 별개의 이중층을 포함하는 RPE-PR/PRP 이중층 세포 조성물.
  126. 제125항에 있어서, 상기 양극화된 RPE가 베스트로핀 및/또는 ZO-1에 양성인, 조성물.
  127. 제125항 또는 제126항에 있어서, 상기 성숙한 PR/PRP가 페리페린-2 및/또는 신경 망막 류신 지퍼(NRL)에 대해 양성인, 조성물.
  128. 제125항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 별개의 이중층에서 PR/PRP 대 RPE의 비율이 1:1 내지 약 5:1인, 조성물.
  129. 대상체에서 안구 손상 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 유효량의 망막 상피 세포(RPE) 및 PR/PRP(RPE-PR/PRP) 이중층 조성물을 대상체의 눈에 이식하는 단계를 포함하는, 방법.
  130. 제129항에 있어서, 상기 안구 장애가 RPE 기능부전 또는 광수용체 기능부전으로 인한, 방법.
  131. 제129항에 있어서, 상기 안구 장애가 연령 관련 황반 변성, 망막 색소변성증, 원추체-간상 이영양증, 또는 레버 선천성 흑암시인, 방법.
  132. 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE-PR/PRP 이중층 조성물이 대상체의 망막으로 이식되는, 방법.
  133. 제129항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE-PR/PRP 이중층 조성물이 스캐폴드 상에 이식되는, 방법.
  134. 제129항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE-PR/PRP 이중층 조성물이 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조직 대체 이식체 또는 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 포함하는, 방법.
  135. 제134항에 있어서, 상기 조직 대체 이식체가 망막하 공간으로 이식되는, 방법.
  136. 제134항에 있어서, 상기 조직 대체 이식체가 망막하 주사 도구를 사용함에 의해 이식되는, 방법.
  137. 제129항에 있어서, 상기 RPE 및/또는 PR/PRP가 사람 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)로부터 유래되는, 방법.
  138. 제129항에 있어서, 상기 RPE 및/또는 상기 PR/PRP가 이전에 냉동보존된, 방법.
  139. 제129항에 있어서, 상기 RPE가 성숙한 RPE인, 방법.
  140. 제139항에 있어서, 상기 성숙한 RPE가 베스트로핀 및/또는 ZO1에 양성인, 방법.
  141. 제129항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE가 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 코팅된 표면상에 있는, 방법.
  142. 제141항에 있어서, 상기 ECM 단백질이 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐 I, 콜라겐 IV 또는 피브로넥틴인, 방법.
  143. 제141항에 있어서, 상기 ECM 단백질이 비트로넥틴인, 방법.
  144. 제129항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE가 공중합체 스캐폴드상에 있는, 방법.
  145. 제144항에 있어서, 상기 공중합체 스캐폴드가 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리락트산(PLLA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(글리세롤 세바케이트(PGS), 폴리피롤(PPy), 폴리비닐 알콜(PVA), 젤라틴, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 피브린, 히울라론산, 실크, 키토산 또는 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA)을 포함하는, 방법.
  146. 제129항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP가 오가노이드로부터 유래하지 않은, 방법.
  147. 제129항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE-PR/PRP 이중층이 타우린 및 하이드로코르티손을 포함하는 배지에 있는, 방법.
  148. 제147항에 있어서, 상기 배지가 트리요오도티로닌을 추가로 포함하는, 방법.
  149. 제147항 또는 제148항에 있어서, 상기 배지가 합성 배지 또는 무혈청 배지인, 방법.
  150. 제147항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 혈청 대체물을 포함하는, 방법.
  151. 제147항에 있어서, 상기 배지가 RPE-MM 배지인, 방법.
  152. 제129항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PR/PRP가 페리페린-2 및/또는 신경 망막 류신 지퍼(NRL)에 대해 양성인, 방법.
  153. 제129항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 별개의 이중층에서 PR/PRP 대 RPE의 비율이 1:1 내지 약 5:1인, 방법.
  154. 모델 망막으로서 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조직 대체 이식체의 용도.
  155. 기질 성장 조직으로서 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조직 대체 이식체의 용도.





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