KR101252911B1

KR101252911B1 - ｐｅｐ27 유전자 돌연변이를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101252911B1
Application number: KR1020100072581A
Authority: KR
Inventors: 이동권; 김은혜; 최상윤
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2010-07-27
Filing date: 2010-07-27
Publication date: 2013-04-10
Also published as: KR20120010906A

Abstract

본 발명은 pep27 유전자 돌연변이를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주, 폐렴구균 균주의 염색체 DNA에서 pep27 유전자를 결실시키는 단계를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주의 제조방법, 및 상기 폐렴구균 균주를 포함하는 폐렴구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

ｐｅｐ27 유전자 돌연변이를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주 및 이의 용도 {Attenuated Streptococcus pneumococcus comprising mutated pep27 gene and use the same}

폐렴구균(Streptococcus pneumococcus)은 폐렴, 균혈, 수막염과 같은 다양한 잠재적인 생존-위협성 감염을 유발하며, 건강한 개인의 비인두에서 증상없이 진행되고, 이는 폐렴구균 감염을 위한 중요한 저장공간을 제공한다.

폐렴구균에서 폐렴구균의 분해는 자가분해효소인 LytA(N-acetylmuramoyl-L-alanine-amidase)에 의해 조절된다고 보고되고 있다. 주요한 자가분해효소인 LytA는 정지기로 들어선 직후에 과도한 분해를 유발한다고 보고되고 있다. 박테리아 분해가 뉴모라이신(pneumolysin), 중요한 용혈성 독소, 및 핵산 및 단백질과 같은 세포내 성분뿐만 아니라 리포타이코산 및 지질다당류를 포함하는 세포벽 성분을 방출하기 때문에, 선-염증성의 시토킨을 유도하고 이에 따라 염증 및 죽음이 유발된다. 그러므로 박테리아 분해의 조절은 패혈증 조절에서 중요한 인자가 될 수 있다. 상기와 같은 폐렴구균 분해효소인 LytA의 돌연변이체는 약독화된다. 구체적으로 LytA 돌연변이체의 인후 및 복강내 50% 치사량은 모균주(D39)와 비교하여, 각각, 10² 및 10⁵배 증가했으나, LytA 돌연변이체의 백신효과에 대해서는 밝혀진 바 없다. 또한 마우스를 자가분해효소-돌연변이체로 인후 감염시킨 경우, 돌연변이체는 폐에서는 빠르게 제거되고 혈액에서는 관찰되지 않았다. 역시 LytA 돌연변이체로 인한 염증도 관찰되지 않았다. 그러나, 감염 동안 LytA를 조절하는 방법은 알려진 바가 없다.

현재 폐렴구균 질환의 예방을 위해 사용되고 있는 백신은 23가 다당류 백신 및 10 또는 13가 협막 다당류를 갖는 컨쥬게이트 단백질 백신이다. 그러나, 23가 다당류 백신의 유효성은 기억 반응이 없고 이에 따라 항체 생산성이 낮기 때문에 영유아에게는 방어능력을 제공하지 못한다. 10 또는 13가 컨쥬게이트 백신 역시 백신에 포함된 혈청형 감염에 대해서만 보호 항체를 끌어낼 수 있다. 그러므로, 최근에 침입성 질환을 예방하기 위해 성인 및 유아에게 사용하는 백신은 다른 혈청형이 퍼진 나라의 대다수의 폐렴구균 혈청형에 대해 방어하지 못한다는 단점이 있다. 게다가 이러한 백신을 사용한 면역화가 비-백신 혈청형으로 대체되고 있는 것은 컨쥬게이트 백신을 장기간 사용하면 백신의 유효성이 감소할 수 있기 때문이다. 게다가, 항생물질에 내성을 갖는 혈청형이 증가하는 실정이다. 또한, 최근에 사용되고 있는 백신 역시 모두 주사형이고, 인후 점막에서 분비형 IgA보다는 혈청 IgG를 유도하여, 폐렴구균 질환의 초기 단계에 폐렴구균이 서식하기 적합한 지위를 형성한다. 그러므로 다른 항원 제제의 인후 투여는 분비성 점막 면역성을 유도할 수 있고 이에 따라 감염 영역에서 병원균의 억제를 유도할 수 있기 때문에 감염 후 초기 집락형성을 방어하는 점막 면역성을 갖는 새로운 형태의 폐렴구균 백신이 요구된다.

몇몇의 뉴모라이신 비-독성 유도체, 폐렴구균 표면 단백질 A(PspA), PspC, 폐렴구균 표면 부착소 A(PsaA), 폐렴구균 접합 백신 및 폴리아민 운반 단백질 D(PotD)의 하나 또는 그 이상을 포함하는 폐렴구균 독성 인자가 점막 백신 후보로서 대두되고 있다. 그러나, 이러한 점막 백신이 콜레라 독소, 인터류킨-12, 백반(alum), 세포벽 성분 및 프로인드 보조제(Freund's adjuvant)와 같은 보조제를 사용한다는 점은 인간에 사용하기에는 한계가 있다는 것을 시사한다. 이러한 문제를 해결하기 위해서, 완전한 세포 박테리아를 사용한 면역화가 연구되고 있다. 생존능력이 약화된 cps 돌연변이체는 콜로니화할 수 있고 항체-의존적 면역성을 이끌어낼 수 있으며, 인후 접종에 대해 보호할 수 있다. cps 돌연변이체를 이용한 인후 면역화 역시 PspA, PsaA 및 추정상의 프로테나아제 성숙 단백질 A(PpmA)에 해당하는 항체 교차-반응을 이끌어낼 수 있다. 그러나, 상기와 같은 항원이 결핍된 폐렴구균 돌연변이체를 이용한 마우스의 면역화가 여전히 마우스를 방어할 수 있다는 것은, 이러한 항원이 운반에 의해 유도되는 교차-방어를 위해 요구되는 것이 아님을 의미하고 많은 다른 분자들이 방어에 관여될 수 있다는 것을 시사한다. 박테리아 분해는 염증에서 필수적인 역할을 할 수 있다. 그러므로, 본 발명자들은 분해 유전자의 돌연변이는 폐렴구균 분해 내성을 제공할 수 있고, 뒤이어 독성을 약화시킬 수 있을 것으로 예상하였다. 그러나, 백신으로서 LytA 돌연변이체를 포함하는 돌연변이체와 관련된 분해 가능성은 보고된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 LytA 분해를 조절하는 pep27 돌연변이체를 포함하는 약독화된 백신을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 기존에 PCT/KR2009/004428에서 vncR/S 오페론 내에 돌연변이를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주를 개발하여 보고한 바 있다. 그러나 상기 돌연변이체는 pep27 외에 VncRS 오페론(vex1 - vex2 - vex3 -pep27-vncR-vncS)에 포함되는 다른 유전자들의 돌연변이, 즉 vex3 - pep27 - vncR을 더 포함하며, 이러한 여러개의 유전자의 조작으로 인해 유전정보에 따라 제조되는 효소나 펩타이드가 만들어지지 않거나 활성이 소실되어 본래 세포의 기능과 성질이 변화할 가능성이 크므로, 이를 해결하기 위해서는 보다 적은 유전자의 조작이 요구된다. 또한 Vex3이 페니실린 및 반코마이신 내성을 가진다는 보고가 있어 vex3 유전자 붕괴를 하지 않은 폐렴구균 돌연변이체가 요구되고 있다.

특히 폐렴구균은 자연상태에서 형질전환이 일어나며, 이런 형질전환 효율은 돌연변이체를 구축할 때 사용되는 플랫폼 서열(platform sequence) 범위가 클수록 높아지게 된다. 따라서 pep27 이외의 다른 유전자를 포함하는 경우 예상치 않은 형질전환이 일어나 야생형으로 복구될 수 있으므로 돌연변이체 구축에 사용되는 범위는 돌연변이를 일으키고자 하는 유전자로 한정하는 것이 가장 바람직하다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 vex3 유전자의 붕괴 없이 pep27 돌연변이체인 EHpep27를 개발하여, 상기 약독화된 폐렴구균 균주가 상당한 약독화 및 분해 저항성을 가짐을 확인하고, 마우스의 인후 감염 후 비인두에서 24시간 내에 빠르게 제거됨을 확인하였으며, 어떠한 보조제 없이 2회에 걸쳐 면역화한 쥐는 치명적인 인후 접종을 혈청형 비의존적으로 방어함을 입증하여 EHpep27가 점막 백신 후보로서 매우 적합함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 pep27 유전자 돌연변이를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 폐렴구균 균주의 염색체 DNA에서 pep27 유전자를 결실시키는 단계를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 폐렴구균 균주를 포함하는 폐렴구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 pep27 유전자 돌연변이를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "폐렴구균"은 폐구균 또는 폐렴쌍구균(Diplococcus pneumonia)이라고도 명명되는 그람양성(Gram-positive) 세균으로서, 시간이 지나 분열함에 따라 균들이 계속 이어져 사슬 모양이 되는 것이 관찰되어 연쇄상구균과로 분류되며, 폐렴의 주요 원인으로 알려져 있다. 폐렴구균은 기도의 상부를 감염시켜 폐렴을 일으키는데, 세균성 폐렴 중 약70%가 폐렴구균에 의해 발병한다. 이러한 폐렴구균은 기도 뿐만 아니라 신체의 여러 부위에 감염하여 해당 부위에서 질병을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 혈액에 감염되는 경우 균혈증(bacteremia), 뼈에 감염되는 경우 골수염(osteomyelitis), 귀에 감염되는 경우 중이염(otitis media), 위나 십이지장에 간염되는 경우 복막염(peritonitis), 심막(심장의 외막)에 감염되는 경우 심막염(pericarditis), 일반적인 상처부위에 감염되는 경우 봉소염(cellulites)을 일으킨다. 이러한 폐렴구균은 특히 영, 소아기에 빈번하게 감염되며, 상기 질환 외에 폐렴 및 뇌막염의 가장 흔한 원인으로 알려져 있다. 또한 폐렴구균은 심장병, 당뇨병과 같은 만성질환자에게 감염되는 경우, 치명적일 수 있으며, 감염된 개체의 타액이나 콧물을 통해 다른 개체에 전파된다. 본 발명은 이러한 질환을 일으키는 폐렴구균을 예방 또는 치료하기 위한 백신용 조성물을 제공한다.

과거에는 폐렴구균의 치료를 위해 항생제(antibiotics)를 사용하여 치료하여 왔고, 그 대표적인 예로 페니실린(penicillin)을 사용하였다. 그러나 항생제의 과용으로 인하여 대부분의 폐렴균들이 페니실린에 대한 내성을 가지게 되어 더 이상의 치료제로서의 기능을 수행하지 못하게 되었고, 이는 공지의 항생제인 세팔로스파린(cephalosporins), 매크로라이드(macrolides), 테트라사이클린(tetracycline), 퀴놀론(quinolones), 클린다마이신(clindamycin)에 대해서도 마찬가지이다. 현재까지 비교적 유효한 항생제로 밴코마이신(vancomycin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(moxifloxacin)이 있으나, 이 역시 항생제 내성의 문제로 그 사용에 한계가 따른다. 또한 항생제의 경우, 이미 감염된 개체에서 사용할 수 있는 방법이므로, 상기와 같은 질환을 예방하기 위해 효과적인 백신이 필요하다. 이러한 요구에 부응하여 최근 몇 종류의 단백질 백신이 개발되었으나 그 종류 및 효과가 미흡하여 폐렴구균 감염 질환을 원천적으로 차단하기 위한 효과적인 백신의 개발이 요구되고 있다.

바람직하게 본 발명의 폐렴구균은 인간을 포함하는 포유류에 병원성을 일으키는 모든 폐렴구균의 혈청형을 포함한다. 폐렴구균에는 90여 가지가 넘는 다양한 혈청형이 존재하며, 폐렴구균 혈청형의 예로는 D39, R6, G54, CGSP14, TIGR4, 70585, Hungary19A-6 및 Taiwan19F-14등이 있으나, 본 발명의 폐렴구균은 상기 혈청형에 제한되지 않고 개체 내에서 폐렴구균에 의해 감염 질환을 발생시키는 균을 모두 포함한다. 이러한 비-제한은 BLAST search 결과로도 알 수 있는데, 예를 들면 D39 균주(type 2), JJA, 및 ATCC700669(Spain 23F-1)의 pep27 유전자의 아미노산 서열이 비-협막 R6(타입 2; spr0527) 균주와 100% 상동성을 가지고 Hungary19A-6, TIGR4(type 4; SP0602), 및 CGSP14(타입 14; SPCG0563)와는 93% 상동성을 가지는 바, 폐렴구균에서 pep27 유전자가 혈청형 간에 매우 보존성이 높음을 제시하며, 상기와 같은 결과로부터 혈청형 또는 균주 간 높은 서열 상동성을 갖는다면 본 발명의 돌연변이체 제작에 있어서, 그 유전자 또는 펩타이드 명칭에 제한되지 않고 손상 대상 유전자가 될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 폐렴구균은 D39를 사용하였으며, 이를 돌연변이시켜 마우스에 투여한 결과 우수한 백신 효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "pep27" 은 27개의 폴리펩타이드로 구성되어 있으며 vex 전달체(transporter)에 의해 분비되어 생장억제 및 세포 사멸(apoptosis)을 유도하는데, 구체적으로는 막-결합 히스티딘 단백질 카이네이즈(membrane-bound histidine protein kinase)인 vncS 및 세포질 효과기(cytoplasmic effector)인 반응 조절자(response regulator) vncR에 의해 발현이 조절되어 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다(Novak et al., 1999). pep27 은 폐렴구균에 존재하는 반코마이신 저항성 오페론(vex1 , vex 2, vex 3, pep27 , vncR 및 vncS로 구성되어 있는 오페론)의 구성요소이고, 이 중 vex3가 항생제 반코마이신의 저항성에 관여한다. 상기와 같이 pep27 발현은 VncR/S 2-구성요소 시스템(two component system)에 의해 조절되며 VncR 및 VncS의 2-구성요소 시스템은 막-결합 히스티딘 단백질 카이네이즈인 vncS와 세포질 반응 조절자인 vncR로 구성되어있다(Novak et al., 1999, 2000). 또한 pep27 mRNA는 pep27 유전자와 동시전사되는, Vex 운송자에 의해 분비되기 때문에, pep27은 VncSR 오페론의 유도에 의해 분비되는 것으로 보인다. 폐렴구균의 분해는 염증 반응의 원인이 되며, 염증 및 죽음을 유발하는, 주요한 폐렴구균 독성 뉴모라이신 및 세포벽 리포타이코산뿐만 아니라 다른 세포질 성분의 방출을 초래하기 때문에, VncRS는 감염시키는 동안 유도될 수 있고, 연속적으로 pep27을 분비할 수 있다. pep27은 막투과(membrane permeablization)에서 중요한 역할을 하며 항암 효과 있다고 알려져 있으나(Lee et al., 2005), 폐렴구균이 폐세포 침투시에 유도되는 특이적인 인자라는 점은 아직까지 알려진바 없다.

이처럼 폐렴구균의 성장 및 세포 사멸과 같은 세포 주기에 관여하는 기능을 수행하는 pep27 유전자 또는 그로부터 코딩되는 단백질은, 폐렴구균의 혈청형 마다 다른 이름으로 명명되기도 하며, pep27의 유전자 서열 또는 이의 펩타이드 서열의 미차가 존재할 수 있으나, 상기 기술한 바와 같이 본 발명의 pep27 유전자는 실질적으로 pep27과 동일한 기능을 수행하는 유전자이면 혈청형에 제한되지 않고 이를 손상시킴으로서 본 발명의 약독화된 폐렴구균 균주를 제조할 수 있다. 바람직하게 상기 pep27 유전자와 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 폐렴구균의 유전자를 모두 포함한다. 예를 들면 pep27 유전자는 혈청형에 따라 SPCG_0563, spr0527 및 SP_0602 등으로 명명되기도 하며, 실질적으로 pep27 유전자의 기능을 하는 유전자이면 그 명명에 제한되지 않고 모두 본 발명의 목적 유전자에 포함된다. 더욱 바람직하게 본 발명의 pep27 유전자는 서열번호 1로 표시되는 pep27 펩타이드의 아미노산을 코딩하는 유전자가 돌연변이됨으로써 손상될 수 있다.

본 발명의 용어 "약독화"란 독성 있는 균주가 변형 전보다 덜 독성 있는 균주거나 약한 병원균이 되는 방식으로 변형되는 것을 의미하며, 이러한 균주는 숙주안에서 여전히 복제 분열될 수 있는 동안, 임상적 질병을 유발할 수 있는 능력이 현저히 감소된 것을 말한다. 바람직하게 본 발명의 약독화된 균주는, 독성 또는 병원성이 백신용으로 투여를 허용할 수 있을 정도로 감소된 균주이며, 더욱 바람직하게는 균주가 숙주 내에서 여전히 복제할 수 있으면서도 임상적 질병을 유발할 수 없는 정도까지 약독화시키는 것을 의미한다. 또한 약독화 돌연변이는 본 발명의 약독화 돌연변이를 제조하기 위한 다양한 방법, 예를 들어 점 돌연변이, 연관된 바이러스 사이의 서열 교환, 또는 뉴클레오티드 결실에 의해 달성될 수 있다.

본 발명에서 용어, "돌연변이"는, 유전자의 유전적 기능을 변화시키는 모든 행위를 의미하며, 구체적으로는 유전자의 돌연변이는 생물의 여러 가지 변이 중 유전자의 양적 또는 질적인 변화에 의해 생긴 변이를 말한다. 즉, DNA 염기 중 하나 이상이 다른 염기로 치환된 분자 수준의 변화, 즉, DNA의 하나 또는 다수 염기의 치환, 결실, 부가, 역위, 중복 또는 염기 중 1~2개의 삽입 또는 결실에 따른 염기배열의 이동(frame shift)과 같은 분자 수준의 변화를 통해 그 DNA가 갖는 유전정보에 따라 제조되는 효소나 펩타이드가 만들어지지 않거나 활성이 소실되는 변화가 나타나는 것을 의미하는데, 본 발명의 상기 유전자를 손상시키는 돌연변이 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 돌연변이 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 돌연변이는 해당 위치의 유전자가 돌연변이됨으로써 단백질의 기능을 손상시킨 돌연변이이며, 바람직하게는 유전자의 결실에 의해 제조될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 돌연변이체는 pep27 유전자의 전체 또는 일부를 결실시킴으로써 제조할 수 있다. 구체적인 결실 방법 및 결실 부위는 당업자의 적절한 선택에 따라 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 1번 내지 84번을 결실시킴으로써 제조할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 1번 내지 53번을 결실 및 ermB 카세트의 치환을 수행함으로써 제조할 수 있다.

본 발명에서 용어, "ermB" 는 매크로라이드(macrolide)에 내성을 가질 수 있게 하는 유전자를 의미하며, 매크로라이드는 폐렴구균의 치료에 있어서 페니실린의 대체 약제로 사용되어져 온 것으로 에리스로마이신(erythromycin), 클라리스로마이신(clarithromycin), 아지스로마이신(azithromycin) 등이 여기에 속한다. 특히 폐렴구균뿐만 아니라 마이코플라즈마, 클라미디아, 레지오넬라와 같은 비정형 세균에 대해서도 항균력이 높아 이들 세균들에 의한 감염증이 의심되는 경우에 많이 사용되어져 왔다. 본 발명의 목적상 pep27 유전자를 결실시키면서 동시에 상기 결실된 부위에 상기 ermB을 치환시켜 pep27 유전자가 결실된 균주를 손쉽게 선별할 수 있게 한다.

다른 하나의 양태로서 본 발명은 폐렴구균 균주의 염색체 DNA에서 pep27 유전자를 결실시키는 단계를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주의 제조방법에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 제조방법은 (a) 폐렴구균 균주의 염색체에서 ermB 유전자를 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머를 이용하여 증폭시키고, vex3 - pep27 및 ermB의 5'-말단에 위치한 DNA 단편을 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머를 이용하여 증폭시키며, pep27 - vncR 서열 하류 및 ermB의 3'-말단에 위치한 DNA 단편을 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머를 이용하여 각각 증폭시켜 수득하는 단계; (b) 상기 수득된 각 DNA 단편을 주형으로 서열번호 10 및 서열번호 13의 프라이머를 이용하여 pep27 유전자가 결실된 단편을 제작하여 상기 단편을 함유하는 형질전환 벡터를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환 벡터를 폐렴구균 균주의 염색체 DNA에 접합시킨 다음, pep27 유전자가 결실된 폐렴구균 변이균주를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 본 발명의 폐렴구균 균주를 이용하는, 폐렴구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여로 폐렴구균 감염에 의한 질환 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여로 폐렴구균 감염에 의해 이미 유발된 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 돌연변이체를 포함하는 백신용 조성물은 폐렴구균의 감염에 의해 일어나는 모든 질환을 예방 또는 치료할 수 있으며, 상기 질환의 예로는 폐렴(pneumonia), 균혈증(bacteremia), 뇌막염(meningitis), 골수염(steomyelitis), 관절염(arthritis), 중이염(otitis media), 복막염(peritonitis), 심막염(pericarditis), 또는 봉소염(cellulites) 등을 포함하나, 상기 예들에 의해 본 발명의 백신용 조성물이 치료 가능한 질환의 종류가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "백신"이란 감염 질환을 예방하기 위한 면역을 위하여 쓰이는 항원으로서, 약독화시킨 미생물 또는 바이러스로 제조되며, 특정 감염증에 대해 인공적으로 면역원성을 획득하기 위하여 약화시키거나 사멸시킨 병원 미생물을 개체 내에 투여하는 것을 의미한다. 백신에 의해 자극을 받으면 개체 내의 면역 시스템이 작동하여 항체를 생성하게 되고, 그 감수성을 유지하다가 재감염이 일어나는 경우, 빠른 시간 내에 항체를 효과적으로 생성함으로써 질환을 극복할 수 있게 된다.

백신의 종류로는 병원체 자체를 투여하는 백신, DNA만을 제작하여 DNA를 투여하는 DNA 백신 또는 항원성 펩타이드를 투여하여 면역을 유도하는 펩타이드 백신 등이 있으며, 병원체 자체를 투여하는 백신은 다시 병원체를 사멸시켜 제조하는 사백신과, 약독화 시켜 제조하는 생백신이 있다. 이러한 백신은 모두 개체 내에서 세포 면역 및 체액 면역 시스템을 작동시킴으로서 개체의 면역원성을 증가시키게 된다.

바람직하게 본 발명의 조성물은 폐렴구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물로, 혈청형-비의존적으로 면역화시키는 백신 조성물이다.

본 발명에서 혈청형-비의존적으로 면역화시키는 백신 조성물은 항원에 특이적으로 항체를 생산하는 것이 아니라, 항원에 무관하게 항체를 생산하여 면역반응을 일으키는 백신 조성물을 의미한다.

본 발명의 돌연변이체를 포함하는 백신용 조성물을 이용하는 경우, pep27을 손상시킴으로써 폐렴구균이 폐세포에 침투하는 경로를 원천적으로 차단하여, 독성이 약하면서도 개체내에서의 면역원성이 우수하여 효과적인 예방 또는 치료가 가능할 뿐만 아니라, 모든 혈청형에 있어서 폐렴구균의 감염 경로에 작용하는 기전을 차단함으로써 폐렴구균의 혈청형에 제한 받지 않고, 다양한 혈청형에 모두 작용할 수 있다.

구체적인 일구현예에 따르면, 복용량 1 x 10⁷ CFU의 타입 2(D39) EHpep27 돌연변이체로 15마리의 마우스 군에 2주일 간격으로 3회 인후 면역시켰고, 2주 후에 독성 D39 타입 2의 1 x 10⁷ CFU, 또는 독성 타입 4의 1 x 10⁸ CFU, 또는 독성 타입 6B의 2.3 x 10⁸ CFU로 접종한 결과, 이종 혈청형 타입 4 및 타입 6으로 접종한 경우, 타입 2 EHpep27로 면역화시킨 마우스는 각각, P<0.01 및 P<0.05로 상당한 방어효과를 가짐을 알 수 있었다. 상기와 같은 결과로 pep27 돌연변이체를 이용한 인후 면역화는 다른 혈청형을 이용한 치명적인 인후 감염에 대해 방어할 수 있음을 확인하였고, 이는 pep27 돌연변이체가 주사의 불편함을 해결한다는 장점과 함께 폐렴구균 감염을 위한 어떠한 보조제도 없이 적합한 점막 백신이 될 수 있다는 것을 시사하는 결과이다(도 8).

바람직하게 본 발명의 조성물은 폐, 비장, 혈액, 및 뇌에 비침습성인 백신 조성물이다.

본 발명에서 용어, "비침습성"이란 직접적으로 백신 조성물이 투여되는 기관, 조직, 및 세포 이외에 전신의 다른 영역으로 백신 조성물 침투되지 않거나, 혹은 침투되더라도 빠르게 제거되는 것을 의미하며, 이는 백신 조성물이 투여되는 기관, 조직, 및 세포 이외에 전신의 다른 영역으로 침투되어 인체에 손상을 미치는 침투성과 반대되는 의미이다.

구체적인 일 구현예에 따르면, 마우스를 야생형 또는 EHpep27 돌연변이체의 1 x 10⁶ CFU로 비강에 감염시키고 콜로니 형성을 측정한 결과, 돌연변이체의 콜로니 수는 감염 24시간 후에 관찰되지 않았고, 반면에 야생형은 비인두에서 2 x 10⁴ CFU보다 더 많이 관찰되었다. 게다가, 돌연변이체는 감염 24시간 후에 폐 및 혈액에서 관찰되지 않았고, 반면에 야생형은 폐 및 혈액에서, 각각 1 x 10⁶ 및 1 x 10⁸ CFU 보다 더 많이 관찰되었다. 마찬가지로, 돌연변이체는 감염 48시간 후에 관찰되지 않았으나 반면에 야생형은 비인두, 폐 및 혈액에서 상당한 수가 관찰되었다(도 5A). 상기는 돌연변이체가 24시간 내에 빠르게 제거되고, 폐 및 혈액을 침습하지 않음을 보여주는 결과이다. 또한, EHpep27 돌연변이체로 정맥내에 감염시킨 결과, 감염된 마우스는 야생형(D39의 6 x 10⁶ CFU와 EHpep27의 2 x 10⁸ CFU를 비교)보다 33-배 이상 생존하였고 콜로니화가 폐, 비장, 혈액, 및 뇌에서 관찰되었다. 감염 4시간 후, EHpep27 돌연변이체는 비장 및 폐에서는 관찰되었으나 혈액 및 뇌에서는 관찰되지 않았다. 대조적으로, 야생형은 폐, 비장, 혈액, 및 뇌에서 2 x 10⁴ ~ 2 x 10⁶CFU를 보였다(도 5B). 감염 8시간 후, EHpep27 돌연변이체는 비장 및 폐에서, 콜로니화가 각각 4.6배 및 21.0배 증가하였고, 반면에 야생형은 비장 및 폐에서, 콜로니화가 각각 41% 및 15% 감소하였다(도 5B). 상기와 같이 EHpep27 돌연변이체를 비강내 또는 복강내 감염시킨 결과, 야생형에 비해 빠르게 제거되며, 야생형에 비해 폐, 비장, 혈액, 및 뇌에서 관찰되는 양이 적음을 확인하여 본 발명의 백신 조성물이 폐, 비장, 혈액, 및 뇌에 비침습성임을 입증하였다.

본 발명에서 사용되는 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 경막 내, 점막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게 본 발명의 폐렴구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물은 복강 내 또는 점막 내로 투여할 수 있다. 더욱 바람직하게 본 발명의 백신 조성물이 투여되는 경로는 인후 점막이다. 인후 점막을 통한 백신화는 에어로졸 또는 점적 전달 시스템 형태를 사용할 수 있다.

구체적인 일 구현예에 따르면, 본 발명의 돌연변이체를 포함하는 백신용 조성물을 이용하는 경우, 점막으로 투여하는 것으로도 개체 내에서 유효한 면역원성을 나타내므로, 기존에 주사제로 피하에 투여해야 하던 불편을 없앨 수 있을 뿐만 아니라, 주사제로의 투입에 특히 고통을 겪고 있는 영유아에게 백신을 투여하기에 유리하다.

또한 본 발명의 백신용 조성물을 투여할 수 있는 개체는 제한이 없으며, 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물을 포함한다.

본 발명의 조성물의 유효 투여량의 범위는 성별, 체표면적, 질환의 종류 및 중증도, 연령, 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 배출비율, 투여시간, 치료기간, 표적세포, 발현 수준 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직하게 본 발명은 상기 돌연변이체를 투여시, 유효성분 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 면역 보조제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한 본 발명에 사용될 수 있는 면역보조제는 당업계에서 통상적으로 사용되는 면역보조제가 제한 없이 사용될 수 있으며, 바람직하게 상기 면역보조제는 cholera toxin binding unit, aluminum salts, lipid emulsion (MF-59), synthetic detergent (Tween), microspheres, liposomes, mucoadhesive polymers 등을 들 수 있으나, 상기 예에 제한되는 것은 아니며, 이 분야의 새로운 제형이 개발되고 있는바, 이들 또한 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제형화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 pep27 유전자 돌연변이를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주를 포함하는 백신 조성물은 혈청형-비의존적으로 면역화시키므로 다양한 혈청에 있어서 우수한 백신 효과를 가지며, 인후 점막으로 투여하는 것만으로도 효과적인 백신 효과를 가지는 바, 투여 개체의 불편을 최소화할 수 있어 우수한 백신 조성물로 이용될 수 있다.

도 1은 VncRS 오페론 및 pep27 돌연변이체의 제작 과정을 나타내는 도이다. 도 1은 vncRS 2 구성 시스템의 전사 및 vex 운송자, 및 에리스로마이신 내성 카세트(ermB) 삽입결과 및 방향을 보여주며, 도 1에 기재된 번호는 D39 게놈에 있는 뉴클레오타이드 서열 번호를 나타낸다.
도 2는 pep27 돌연변이체(MK0527, 및 EHpep27)의 분해 저항성을 보여주는 결과이다. 구체적으로 도 2의 A 및 B는 MK0527 균주의 정지기에서 돌연변이체의 저항성(A), 데옥시콜레이트에 대한 저항성(B)에 관한 그래프이다. 박테리아 균주는 THY 브로스에서 배양하거나(A), 또는 중간-로그기까지 배양하고 0.05% DOC를 배양물에 첨가하여 생존 세포를 센다(B). 또한, 구체적으로 도 2의 C 내지 E는 EHpep27에 관한 것이다. 중간-로그기까지 배양한 폐렴구균 균주를 수확하고 세포 용해물을 항-LytA 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다(C). 패널 C의 농도계측 분석(Densitometric analysis)은 밴드로 바뀌었다(D). lytA 유전자의 mRNA 수준 역시 RT-PCR로 측정하였다(E).
도 3은 얇은 협막 다당류 및 pep27 돌연변이체(EHpep27)의 밀집된 사슬 형태를 보여주는 도이다. 현미경 분석은 pep27 돌연변이체가 더 작은 콜로니(A), 및 밀집된 사슬 형태(B)를 형성한다는 것을 보여주었다. 팽창 반응(C) 및 면역블롯 분석(D)는 pep27 돌연변이체에서 얇은 협막 다당류를 보여주었다. 타입 2 협막 다당류(CPS) 항혈청을 박테리아 배양물에 첨가하고 팽창반응에 의한 박테리아의 팽창이 관찰되었다(C). 다당류를 폐렴구균 균주로부터 정제하고, 항-타입 2 다당류 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다(D).
도 4는 실험실 내 및 생체 내에서 pep27 돌연변이체(MK0527)의 약독화를 보여주는 도이다. 구체적으로, A-D는 감소한 용혈능 또는 pep27 돌연변이체의 세포독성, 전신 감염 및 인후 감염에서 pep27 돌연변이체의 약독화를 보여준다. A의 D39 또는 돌연변이체는 37℃에서 OD550=0.3까지 배양하였고, 그 후 세포 용해물에 3% 양 혈액 세포를 함유하는 용액을 첨가하였다.연이어, 상기 혼합물을 37℃에서 30분간 배양하였다. 적혈구 세포의 분해로 인해 방출된 헤모글로빈은 흡광도 540 nm에서 측정하였다( * , P<0.05). B는 돌연변이체 감염 후 MTT 어세이를 이용해 A459 인간 폐 세포에서의 세포독성을 측정하였다(*, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001). C 및 E는 열마리 마우스 군을 D39 또는 이의 동질 유전자형의 1 x 10⁴ CFU로 복강내 감염시키거나(C), 2 x 10⁷ CFU로 인후 감염시켰다(D). 각 데이터의 점은 한 마리의 마우스를 나타낸다. 수평선은 각 군의 평균 생존 시간을 나타낸다.
도 5는 인후(A) 및 전신 감염 후에 빠르게 제거되는 pep27 돌연변이체(EHpep27)를 보여주는 도이다. A는 CD1 마우스의 인후 구멍 속에 폐렴구균 균주(D39 및 pep27 돌연변이체의 1 x 10⁶ CFU)를 접종한 후, 비인두, 폐, 및 혈액에서의 생존 세포 수를 24시간 또는 48시간 후에 측정한 결과이다. pep27 돌연변이체는 24시간 이내에 비인두에서 빠르게 제거되었다. B는 D39 또는 D39 pep27 돌연변이체의 100μl를 박테리아 배양물6 x 10⁶ 및 2 x 10⁸ CFU에서 각각, CD1 마우스에 정맥 주사한 후, 마우스를 감염 4시간, 8시간 및 12시간 후에 희생시킨 후 실험한 결과이다. 비인두, 폐, 혈액, 및 뇌를 무균상태로 수집하고 생존 세포 수를 측정하였다.
도 6은 생체 내에서 pep27 돌연변이체(EHpep27)의 비침습성 및 낮은 콜로니화를 보여주는 도이다. 9 마리의 CD1 마우스 군을 D39의 2 x 10⁶ CFU 또는 pep27 돌연변이체의 7 x 10¹⁰ CFU로 인후 면역시켰다. 마우스를 감염 15시간 및 40시간 후 희생시켰다. 비인두, 폐, 혈액, 및 뇌를 무균상태로 수집하고 정제된 PBS를 이용해 연속적으로 희석하였다. D39(젠타마이신-r) 및 pep27 돌연변이체(Em-r)의 콜로니 수를 적절한 항생제를 포함하는 혈액 한천에 복제된 플레이트를 이용해 계산하였다. 각 점은 한 마리의 마우스를 나타내고 각 수평선은 각 군의 생존 평균 기간을 나타낸다.
도 7은 pep27 돌연변이체(EHpep27)로 면역시킨 후 치명적인 접종으로부터의 방어효과를 보여주는 도이다. A는 10마리 마우스 군을 pep27 돌연변이의 약 1 x 10⁷CFU를 사용하여 복강 내에 3회 면역화하고 독성균주 D39를 2 x 10⁴CFU로 복강내 접종하여 방어 능력을 테스트한 결과이다. 각 데이터의 점은 한 마리의 마우스를 나타낸다. 수평선은 각 군의 평균 생존 시간을 나타낸다(**, P<0.01). B는 pep27 돌연변이체로 면역화시킨 것은 치명적인 인후 접종으로부터 마우스를 보호함을 보여준다. 10마리의 CD1 마우스 군을 지시한 돌연변이체(1 x 10⁹)로 2회 인후 면역화하고 2주 후에 독성 균주 D39의 약 2 > 10⁷ CFU로 인후 접종하여 방어능력을 테스트하였다. 각 데이터의 점은 한 마리의 마우스를 나타낸다. 수평선은 각 군의 평균 생존 시간을 나타낸다(**, P<0.01).
도 8은 타입 2 pep27 돌연변이체(EHpep27)로 인후 면역화한 후에 치명적인 인후 접종으로부터의 혈청형 비의존성 보호를 보여주는 도이다. 15마리 마우스 군을 타입 2 D39 pep27 돌연변이체의 약 1 x 10⁷ CFU로 인후에 3회 면역하였다. 마우스를 D39의 1.1 x 10⁷ CFU, 또는 혈청형 4의 1 x 10⁸ CFU, 또는 혈청형 6B의 2.3 x 10⁸ CFU로 접종하였다. 각 데이터의 점은 한 마리의 마우스를 나타낸다. 수평선은 각 군의 평균 생존 시간을 나타낸다(**, P<0.01).
도 9는 pep27 돌연변이체(EHpep27)로 2회 면역화한 것을 통한 치명적인 인후 접종으로부터의 보호를 보여주는 도이다. 구체적으로, 보조 주사의 면역화(A)에 의해 EHpep27 돌연변이체에 대하여 증가하는 혈청 IgG 항체의 증가율(A) 및 치명적인 접종으로부터의 보호(B)를 보여준다. EHpep27 돌연변이체로 인후에 면역화한 마우스(10마리/군)로부터의 항혈청을 안와후(retro-orbitally)에서 수집하였다. 그리고 EHpep27 돌연변이체의 전체 용해물을 항원으로 사용하였고, ELISA 어세이로 항체 역가를 측정하였다(A). 독립적으로, 지정한 것에 의해 4 x 10⁷(1^st) 또는 2 x 10⁸ (2^nd) CFU로 마우스(6/군)를 인후 면역하고, D39의 6.5 x 10⁶ CFU로 치명적인 인후 접종을 하였다. 필요에 따라, 콜라레 독성(4 μg/마우스)를 보조제로서 사용하였다. 치명적인 접종 후에 생존시간을 측정하여 보호효과를 알아보았다.
도 10은 pep27 돌연변이체(EHpep27)와 야생형의 동시감염은 독성을 증가시키지 않음을 보여주는 도이다. 1x10⁶ CFU의 D39(A) 또는 타입 4(B)로 면역화한 CD1 마우스, 감염 24시간 후, 마우스를 1x10⁸ CFU의 EHpep27로 동시감염하였다. 각 점은 한 마리 마우스를 나타낸다. 수평선은 각 군의 평균 생존 시간을 표시한다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이하 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험방법

실시예 1: 박테리아 균주, 세포 배양 조건, 및 동물의 준비

본 발명에서는 표 1에 명시한 박테리아 균주를 사용하였다. 협막 폐렴구균 D39(타입 2, NCTC7466; Avery et al., 1944) 및 이로부터 유래된 돌연변이체인 혈청형 4(ATCC6304) 및 혈청형 6B(ATCC6326)를 뇌 심장 주입 또는 토드 휴이드 브로스(Difco Laboratories)에서 배양하였다. 컴피턴스(Competence)를 적절한 컴피턴스-특이적 펩타이드를 첨가하여 조절하였고(Havarstein et al., 1995), 공지된 방법에 의해 형질전환 하였다(Bricker and Camilli, 1999). 비협막화된 폐렴구균 균주 CP1200 hrcA 돌연변이체(Kim et al., 2001)를 카시톤-트립톤(Casitone-tryptone, CAT)-기본 배지에서 지수성장기의 중간단계까지 배양했다. CAT 기본 배지 1L는 1 g 효소 카세인 가수분해물(enzymatic casein hydrolysate)(Difco Laboratories), 5 g 트립토판(Difco Laboratories), 1 g 효모 추출물(Difco Laboratories), 5 g NaCl, 5 mg 콜린(choline)(Sigma), 0.2 % 글루코오스(Sigma), 16.6 mM 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate)(Sigma)를 함유하였다.

형질전환을 시키기 위하여 뇌 심장 주입 브로스(Difco Laboratories)에 최종 농도 1mM 이 되도록 CaCl₂를 첨가하여 완전한 형질전환 배지를 제조하였다. 그런 후에 약 1 시간 동안 37℃에서 배양하여 흡광도 0.08에서 박테리아 배양물을 수득했다(Ogunniyi et al., 2000). 형질전환이 잘 이루어지도록 하기 위해 CSP-1(competence-stimulating peptide-1을 최종 농도 250 ng 이 되도록 넣고 15 분 배양 한 후 에리스로마이신을 함유한 DNA를 폐렴구균과 섞어 37℃에서 4시간 더 배양 하였다. 폐렴구균 형질전환체를 선별하기 위해, 성장 배지에 에리스로마이신을 2.5 μg/ml의 농도로 첨가하였다.

인간 폐 상피암종 A549 세포주(ATCC TIB-71)를 ATCC(American Type Culture Collection)으로부터 획득하고, 이들을 기본 배지인 글루코오스 4.5㎍/L, 10% 우태아 혈청(Gibco BRL), 및 페니실린 G 100U/ml, 및 스트렙토마이신 100㎍/ml를 함유하는 DMEM(Dulbecco modified Eagle medium, Gibco BRL)에서 37℃, 95%공기-5% CO₂ 하에 배양시켰다. 감염 실험을 위해서 4주령의 CD1 마우스 수컷(Orient, Korea)을 사용하였다. 하기 표 1은 본 발명에서 사용된 폐렴구균을 나타낸다.

균주	특성	참고문헌
CP1200 △hrcA	MalM511 str1 △lacZ :: ermB Em ^r	Kim et al., 2001
D39	협막, 타입 2	Avery et al., 1944
ATCC6304	타입 4	ATCC
ATCC6326	타입 6B	ATCC
MK0527	D39 △vex3, pep27, vncR :: ermB Em ^r	Deleted from D39 genome nucleotide 534499-534918
EHpep27	D39 △pep27 :: ermB Em ^r	Deleted from D39 genome nucleotide 534663~534780

※ Em^r : 에리스로마이신 내성

※ ermB 카세트 삽입 방향; R, 역방향 ; S, 같은 방향

실시예 2: 대장균에서 LytA 의 클로닝 , 발현, 및 정제

LytA의 His6-태그 버전을 발현하는 플라스미드 제작을 위해서, 폐렴구균 D39의 염색체 DNA를 주형으로 하여 LytA를 포함하는 프라이머(5'-CCG GAT CCC ATG GAA ATT AAT GTG AGT AAA TTA-3'(서열번호 2) 및 5'-CCC TCG AGT TAT TTT ACT GTA ATC AAG CCA TC-3'(서열번호 3), 각각, BamHI 및 XhoI 영역을 포함)로 PCR을 수행하였다. 957bp PCR 생산물을 BamHI 및 XhoI으로 절단하고 BamHI 및 XhoI-절단 플라스미드 pET32(b)(Novagen)에 연결하여, pET32(b)-lytA를 얻었다. 재조합 LytA의 발현을 위하여, 하룻밤 배양한 pET32(b)-lytA로 형질전환된 E. coli BL21(DE3) 세포를 카나마이신(30 μg/ml)을 포함하는 LB 브로스에 재접종하고 37℃에서 성장시켰다. 지수성장기 중간단계에서(A₆₀₀, ~0.6), His₆-태그된 LytA 단백질의 발현을 0.1 mM IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 유도하였다. 유도 후 4시간 동안 37℃에서 세포를 배양하였다. 세포를 원심분리를 통해 수득하고, 세포 펠렛은 초음파로 파괴하기 위해 용해 버퍼(50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10% glycerol, 1 mM DTT(dithiothreitol), 1 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride))로 현탁하였다. 모든 정제 단계를 4℃에서 수행하였고, LytA를 Ni-나이트릴로트라이아세트산(Ni-nitrilotriacetic acid) 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 단백질을 SDS-PAGE로 순도 >95%인 것을 확인하였고, 쿠마쉬 브릴리언트 블루 R-250(Coomassie brilliant blue R-250)으로 염색하였다(데이터는 제시하지 않음).

실시예 3: 결실 돌연변이체의 제작

폐렴구균에서 pep27 유전자 자리(locus)(vex3-pep27-vncR::ermB)의 삽입-결실 돌연변이를 제작하기 위해서, 5'-CCG GGC CCA AAA TTT GTT TGA T-3'(서열번호 4) 및 5'-AGT CGG CAG CGA CTC ATA GAA T-3'(서열번호 5)를 이용하여 에리스로마이신 내성 대장균 염색체 DNA로부터 860-bp ermB 카세트(117-976 bp, Vasseghi and Claverys, 1983)를 증폭하였고, pep27 유전자 자리를 붕괴하였다. 왼쪽 상방향(L-상방향)(5'-TCT CTA TCA GCC TCA AGC AG-3'(서열번호 6)) 및 왼쪽 하방향(L-하방향)(5'-ATC AAA CAA ATT TTG GGC CCG G- TTG AAG CAA GCG CCA TAA CG-3'(서열번호 7))을 이용하여 D39 DNA로부터 vex3-pep27 및 ermB의 5' 말단 부분을 포함하는 326-bp 단편(pep27-상방향; 534172~534498 bp)을 증폭하였다. 오른쪽 상방향(R-상방향)(5'-ATT CTA TGA GTC GCT GCC GAC T-GACGGATTGTGGCTATGA-3'(서열번호 8)) 및 오른쪽 하방향(R-하방향)(5'-GTA TCG TAG TAG CGC TTG-3'(서열번호 9)를 이용하여 D39 DNA로부터 pep27-vncR 서열 하류 및 ermB의 3' 말단 부분을 포함하는 222-bp 단편(pep27-하방향; 534919~535221 bp)을 증폭하였다. 상기 3개의 PCR 생산물을 혼합 주형으로 사용하고, L-상방향 및 R-하방향으로 PCR을 수행하여 pep27 유전자자리의 420-bp가 결실(nt 534499~534918)되고 ermB 유전자로 대체된 1.4-kb 단편을 생산하였다. 세 부분으로 이뤄진 1.4-kb 단편을 뒤이어 형질전환에 의해 폐렴구균 D39 균주에 도입하고, 상동 재조합에 의해 염색체 내에 통합된 재조합 단편을 가지는 수용자(recipient) 박테리아를 에리스로마이신에 대한 내성으로 선별하였다. 형질전환체가 올바르게 결실되었는 지를 PCR 및 면역블롯 분석으로 스크리닝 했다(데이터는 제시하지 않음). vex3-pep27-vncR 내에 올바른 결실을 포함하는, D39 pep27 돌연변이체인 MK0527를 향후 실험에 사용하였다.

Δpep27 돌연변이체인 D39(EHpep27)는 pep27 상방향(209 bp; 뉴클레오타이드 영역 534453~534662, 5'-GTC CTT GCC TTG GTT CTA-3'(서열번호 10) 및 5'-ATC AAA CAA ATT TTG GGC CCG G- GAT TTT CAC CAC TGC TTT CG-3'(서열번호 11)) 및 pep27 하방향(216 bp; 뉴클레오타이드 영역 534781~534997, 5'-ATT CTA TGA GTC GCT GCC GAC T-AAG GCC AGC AAG AGA CTA-3'(서열번호 12) 및 5'-GGC CAC CTC ATA GCT AGA A-3'(서열번호 13)) 프라이머 및 117 bp(뉴클레오타이드 534663~534780) 결실을 제외하고는 상기의 MK0527의 제작방법과 같은 방법에 의해 제작하였다.

실시예 4: MTT 어세이에 의한 시험관 내 세포독성 측정

A549 세포주에서 돌연변이체의 세포독성을 측정하기 위해, 공지된 방법에 따른 MTT 어세이에 의해 살아있는 세포의 미토콘드리아 탈수소효소를 측정하였다(Smirnov et al., 1999). 즉, 96 웰 플레이트에 A549 인간 폐 세포 1 x 10⁴을 함유하도록 시딩(seeding)하여 모노레이어(monolayer)가 형성될 때까지 배양하였다. 플레이트를 한번 세척하고 항생제를 함유하지 않은 DMEM 배지를 보충하였다. 뒤이어 세포를 1 x 10⁶ CFU의 폐렴구균(MOI 100: 1)으로 감염시켰다. 감염 4시간 후에, 항생제를 함유한 배지에서 배양하여 폐렴구균을 제거하고 ELISA 리더기(Reader)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 5: 데옥시콜레이트 ( deoxycholate , DOC ) 및 항생제의 존재에 따른 자가분해 분석

DOC 또는 항생제의 존재에 따른 자가분해 경향을 측정하기 위해, 폐렴구균을 OD 0.3 ~ 0.4까지 배양하였고, 배양 배지에 데옥시콜릭 산(deoxycholic acid) 또는 항생제를 첨가하고, 연속 희석(serial dilution) 후에 550 nm에서의 흡광도 변화 또는 생존 세포수를 측정하였다.

실시예 6: 뉴모라이신 ( Pneumolsin ) 어세이 분석

용혈 활성을 공지된 방법(Lock et al., 1996)을 약간 변경하여 측정하였다. 즉, THY 브로스에서 초기-중간 로그기(600nm에서의 흡광도 = 0.05-0.1)까지 성장시킨 폐렴구균을 3900 g에서 10분간 4℃의 원심분리로 수확하였고 PBS(phosphate buffered saline)로 재현탁하였다. 소듐 데옥시콜레이트를 최종 농도 0.1%가 되게 첨가하고, 37℃에서 10분간 배양하였다. 상기 샘플을 원심분리한 후에, 상층액을 제거하고 연속적으로 희석하였다. 96웰 마이크로타이터 플레이트에 1.5% 세척된 말(horse) 또는 양(sheep) 적혈구의 동량과 함께 인큐베이션하여 용혈 활성을 측정하였다. 용혈 역가를 A540 nm에서 적혈구 50%가 용해되는 추정 희석도의 역수로 결정하였다.

실시예 7: 항혈청의 준비

LytA 및 pep27 돌연변이체에 대한 항체를 준비하기 위해, 염수 ml 당 정제된 LytA 단백질 100 μg을 마우스의 복강내에 주사하였다. pep27 돌연변이체에 대한 항체를 준비하기 위해, 10⁸ CFU 돌연변이체를 마우스의 비강에 투여하였다. 보조 주사를 2주 간격으로 투여하였고, 항혈청을 6주 후에 수집하였다.

실시예 8: 협막 다당류의 측정

협막 다당류(Capsular polysaccharide, CPS)를 공지의 방법에 의해 준비하였다(Morona et al., 2003). CPS 준비를 A₅₅₀ = 5가 되게 하기 위해서 150 mM Tris-HCl (pH 7.0)- 1 mM MgSO₄를 포함한 혈액 한천 플레이트에서 배양한 폐렴구균을 현탁하여 준비하였다. 1ml 동량을 원심분리로 펠렛화 하였다. 상기 펠렛을 150mM Tris-HCl (pH 7.0), 1 mM MgSO₄의 0.5ml로 현탁하였다. 박테리아의 자가분해는 0.1% (wt/vol) 데옥시콜레이트(sigma)를 첨가하고 37℃에서 15분 동안 배양하여 유도하였다. 샘플을 100U mutanolysin, DNase I (Roche Applied Science) 50μg, 및 RNase A(Roche Applied Science) 50μg과 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 그 후에, 샘플을 -20℃에 저장하기 전에 프로테나아제 K 50μg으로 56℃에서 4시간 동안 배양하였다. 협막 균주 D39 및 이의 동종유전자형 pep27 돌연변이(EHpep27), 획득한 CPS에 의해 생산된 CPS의 총량을 타입 2 항혈청을 이용한 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.

실시예 9: 단백질 젤 전기영동

세포를 수확하고, 20 ml 용해 버퍼(5 mM Tris[pH 8.0], 30 mM ethylenediamine tetraacetic acid[EDTA], 0.1% Triton X-100, 0.025%[w/v] phenylmethanesulfonyl fluoride [PMSF], 1 mM dithiothreitol)로 현탁하고, 후에 완전하게 공지된 방법에 따른 초음파 처리(차가운 상태)에 의해 분해하였다(Choi et al., 1999). SDS-PAGE(10 또는 15% 폴리아크릴아마이드 겔)를 공지된 방법(Laemmli, 1970) 에 따라 수행하였고, 단백질을 쿠마쉬 브릴리언트 블루 염색법으로 시각화하였다.

실시예 10: 면역블로팅

10% SDS-PAGE로 분리한 단백질을 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막에 전기블롯하고 마우스 폐렴구균 LytA에 대한 항혈청의 1:5000 희석물로 반응시켰다. 2차 항체는 HRP(horseradish peroxidase)(Sigma) 또는 알카리 포스파타제(Bio-Rad)가 컨쥬게이트된 염소 항-래빗 또는 염소 항-마우스 IgG의 1:2,000 희석물을 이용했다.

실시예 11: ELISA 어세이

항체 역가를 측정하기 위해, ELISA(enzyme linked immunosorbant assay)을 수행하였다. 돌연변이체로 면역화한 마우스에서 유래한 마우스 혈청 또는 타액을 풀링하고, 야생형 또는 돌연변이체 세포 용해물과 교차반응을 시켰으며, 각각, ELISA 플레이트에 코팅하였다. TPBS에 든 500 ng/ml의 돌연변이체 세포융해물을 96 웰에 코팅하고 비특이적인 결합을 블로킹하기 위해 37 ℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 1 % BSA로 더 배양하였다. PBS로 플레이트를 세척한 후에, 적절한 희석물을 포함하는 1차 항체를 첨가하고 1시간 동안 배양하였으며, 뒤이어 HRP(horse raddish peroxidase)가 컨쥬게이트된 2차 항체와의 교차반응시켰다. 색소원 TMB(tetramethylbenzidine)를 웰에 첨가하고, ELISA 리더기를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다(Softmax, USA).

실시예 12: 독성 시험

독성이 매우 강한 협막 타입 2 균주(D39) 및 이의 동종유전자형 돌연변이체로 복강내(i.p.) 또는 인후 접종을 수행하여 폐렴구균의 독성에 대한 돌연변이된 pep27 또는 다른 유전자에 의한 영향을 평가하였다. 박테리아를 혈액 한천(필요에 따라 에리스로마이신 보충) 상에서 하룻밤 37℃에서 배양하고 혈청 브로스(10% (vol/vol) 말 혈청을 가한 뇌 심장 주입 브로스(Difco Laboratories) 또는 토드 휴이드 브로스(Difco Laboratories)) 상에서 3시간 동안 37℃에서 배양하여 약 10⁸ CFU/ml의 박테리아 배양물을 수득했다(Ogunniyi et al., 2000). 각 박테리아 배양물을 혈청 브로스로 10⁶ CFU/ml가 되게 희석하고, CD1 마우스 군을 D39 또는 돌연변이체 0.1 mL로 복강내(i.p.) 감염시켰다. 또는 D39 또는 돌연변이체 10 μl로 인후 감염시켰다. 접종된 마우스의 생존여부를 처음 5일 동안은 1일 4회, 다음 5일 동안은 1일 2회, 접종 후 21일째까지는 매일 모니터링 하였다.

인후 접종 후에 다른 기관에서 박테리아의 수를 평가하기 위해, 접종 후 마우스를 희생시키고 혈액, 폐, 비장, 뇌, 및 비인두를 무균상에서 채취하였으며 PBS(140 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM NaH₂P0₄, 1.5 mM KH₂P0⁴, pH 7.3)로 3회 세척하였다. 그 후에 상기 샘플을 PBS에 넣고 균질기(PRO Scientific Inc., Oxford, CT, USA, Model 200 Double insulated)를 사용하여 차가운 상태에서 최대 속도로 균질화하였고, 정제된 PBS로 적절한 정도로 연속적으로 희석하였으며, 적절한 항생제를 포함하는 혈액 한천에 동일하게 2회 플레이팅하였다. 그 다음에, 플레이트를 약 16시간 동안 37℃, 95%공기-5% CO₂ 하에 배양하였고, 후에 복제본 사이에서 콜로니 수를 산출하고 평균내었다.

실시예 13: 현미경 측정

현미경 분석을 위해, 폐렴구균을 항-타입 2 항혈청과 반응시키고, 공초점 현미경으로 관찰하였다(Carl Zeiss LSM 510 META).

실시예 14: 전신 또는 인후 감염 모델에서의 백신 효과

마우스를 약독화된 돌연변이체로 2주마다으로 3회 복강(i . p., 약 1 X 10⁶ ~ 1 x 10⁷) 또는 비강(i. n., 약1 X 10⁷ ~ 1 x 10⁸)내에 면역화시켰다.

3차 접종이 끝나고 2 주 후에, 안와후방 출혈에 의해 혈청 샘플을 채취하였다. 최종 면역 후 2주 째에, 마우스를 매우 독성이 강한, 협막성 타입 2 균주(D39)로 복강내 또는 인후 접종시켰다. 접종 전에, 박테리아를 혈액 한천(적절하게 에리스로마이신을 보충) 상에서 하룻밤 37℃에서 배양하고, 10% 양 혈청을 함유하는 THY 상에서 약 3시간 동안 37℃ 성장시켜 3 X 10⁸CFU/ml의 박테리아 배양물을 수득하였다. 면역화시킨 CD1 마우스(5주령) 군을 공지된 방법(Kwon et al., 2004)에 따른 최종 면역 후 2주 후에 마우스 당 약 1 X 10⁴ CFU로 독성이 강한 협막 타입 2 균주(D39) 100μl로 복강 내 접종시켰다. 또는 면역화시킨 마우스를 마우스 당 약 3 X 10⁷ CFU D39 10μl로 인후 접종시켰다. 혈청형-특이적 협막 생성은 슈타텐스 세럼인스티튜트(Statens Seruminstitut, Copenhagen, Denmark)로부터 구입한 항혈청을 사용한 팽창 반응(quellung reaction)에 의해 확인하였다. 접종 실시 후에, 마우스를 처음 7일 동안 4시간 마다 모니터링한 다음, 21일까지는 매일 모니터링하였고, 각 마우스의 생존 시간을 기록하였다.

실시예 15: 통계적 분석

쌍을 이루거나 또는 쌍을 이루지 않는 스튜던트 T 검정을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 군간의 평균 생존 시간의 차이는 만-휘트니 U 검정(Mann-Whitney U test)(양측)에 의해 분석하였고, 군간의 전체적인 생존율의 차이는 피셔의 정확 검정(Fisher Exact test)에 의해 분석하였다. 제시된 데이터는 2개 내지 4개의 독립 실험에 대한 평균 표준 편차이다. ELISA 데이터를 3개의 웰±SEM의 평균값으로 표현하였다. 통계적으로 유의한 차이는 P < 0.05로 정의하였다.

실험결과

실험예 1: pep27 돌연변이체에서의 분해 저항성 및 낮은 LytA 발현

Pep27은 VncRS 오페론의 일부이고(vex1-vex2-vex3-pep27-vncR-vncS; 도 1) 페니실린과 같은 항생제의 존재 하에서 2-구성요소 시스템 VncR/S을 통한 신호 변환에 의해 폐렴구균 세포사를 개시할 수 있다(Novak et al., 1999; Novak et al., 2000). 독성과 관련한 유전자 자리 1차 스크리닝으로 에리스로마이신 내성 카세트(erythromycin resistance cassette, ermB)를 이용한 교체에 의해 vex3-pep27-vncR 유전자 자리를 붕괴시켰고, vex3 및 vncR이 역방향 전사하여 극성 효과를 막은 MK0527 돌연변이체를 제작하였다(도 1). MK0527 돌연변이체는 야생형에 비해 2시간 긴 정지기를 가지고, 심지어 정지기에서 자가분해가 지체되는 것을 보여주었다(도 2A). 폐렴구균은 데옥시콜레이트(DOC)에 의한 분해가 쉽게 유도되었고, 폐렴구균에서 자가분해 효소 LytA의 발현을 유도하였다(Chastanet A et al., 2001). 지체된 자가분해에 대한 저항성을 조사하기 위해서, 박테리아 분해율을 0.05% DOC의 존재 하에서 측정하였다.

그 결과, 0.05% DOC의 존재 하에서, 야생형이 반으로 분해되는 데는 240초가 소요되는 반면에 pep27 돌연변이는 270초가 소요되었다(데이터는 제시하지 않음). DOC 처리 후에 자가분해를 확인하기 위해, 0.05% DOC를 배양물에 첨가하고 생존세포 수를 측정하였다. 야생형은 5분 후에 완벽하게 분해되었고 단지 10개의 세포가 생존한 반면에, MK0527 돌연변이체는 40분 후에도 10³ CFU가 생존하였다. 이러한 결과는 돌연변이체의 DOC 내성을 나타내는 것이다(도 2B).

Vex3이 페니실린 및 반코마이신 내성과 관련이 있다는 보고 이후로(Haas et al., 2004), 또 다른 pep27 돌연변이체인 EHpep27를 vex3 유전자의 붕괴 없이 다시 제작하였다. 제작된 EHpep27 돌연변이체는 vex3의 하류에 있는 비-코딩 영역(noncoding region)으로부터 pep27 유전자의 2/3까지 결실되어 있다(도 1). pep27 돌연변이체의 지체된 세포사를 확인하기 위해 상기 돌연변이체가 정지기에 도달했을 때, LytA 단백질(도 2C 및 2D) 및 mRNA 수준(도 2E)을 웨스턴 블롯 및 정량적인 RT-PCR로 측정하였다. 결과는 EHpep27 돌연변이체가 낮은 LytA 단백질 수준(도 2C 및 2D) 및 mRNA 수준을 가짐을 보여주었다(도 2E). 이러한 결과는 LytA 발현이 pep27뿐만 아니라 pep27의 일부분에 의해서도 조절됨을 입증하는 것이다. 이전의 보고들과 마찬가지로(Novak et al., 2000), Pep27은 LytA-의존성 및 비의존성 분해를 조절하였다.

실험예 2: 얇은 협막을 가지며 매우 밀집된 형태의 pep27 돌연변이체

pep27 돌연변이체의 형태는 특징이 없기 때문에, 현미경 분석을 하거나 협막 다당류 수준을 조사하였다. MK0527 및 EHpep27 돌연변이체 모두 작은 콜로니(도 3A) 및 짧은 사슬을 형성하였고 야생형에 비해 매우 밀집된 형태였다(도 3B). 게다가, 타입-특이적 항체의 존재하에, 상기 돌연변이체는 야생형에 비해 보다 적은 협막 다당류 수준을 보였다(도 3C). 협막 다당류는 중요한 독성 인자이므로, pep27 돌연변이체에서 보다 낮은 다당류 수준을 확인하기 위해, 협막 다당류를 정제하고 웨스턴 블롯으로 가시화하였다.

그 결과, MK0527 및 EHpep27 모두에서 매우 낮은 수준의 협막 다당류 수준을 확인하였다(도 3D).

실험예 3: pep27 돌연변이체에 의한 약독화

폐렴구균의 분해는 염증을 야기하는 뉴모라이신 및 리포타이코산을 포함한 다양한 세포내 인자를 방출하였다(Jedrzejas MJ, 2001). 만약 pep27이 감염 동안 분해를 유도하는 것이라면, Pep27의 돌연변이는 약독화를 보일 것이다. 상기와 같은 가설을 확인하기 위해, MTT 및 LDH(lactate dehydrogenase) 활성 실험을 통해 T시험관 내에서 약독화를 측정하였다. 인간 폐 세포주 A549에서 MTT 어세이를 사용하여 MK0527 돌연변이체를 정량적으로 측정하였을 때, 야생형에 비해 돌연변이체의 독성이 13% 감소하였다는 것은 돌연변이체가 야생형에 비해 보다 적은 세포독성을 나타냄을 보여주는 것이다(도 4B). EHpep27 돌연변이체도 MK0527 돌연변이체와 같은 결과를 보였다(데이터는 제시하지 않음). 이와 같은 결과는 시험관 내에서 pep27 돌연변이체의 확실한 약독화를 입증하는 것이다.

생체 내에서 MK0527 돌연변이체의 약독화를 다시 시험하기 위해, 감염 후에 마우스의 생존 시간을 평가하였다. D39 및 MK0527 돌연변이체를 1 x 10⁴CFU 복용량으로 복강내 감염시켰을 경우, MK0527 돌연변이체를 이용한 감염에 의해 사망한 마우스는 없는 반면에 D39를 이용하여 감염시킨 마우스는 2일 이내에 사망한 것으로 보아 생체내에서 독성이 상당하게 약해졌음을 알 수 있었다(P<0.0001)(도 4C). 마찬가지로, 마우스를 2 x 10⁷CFU 복용량으로 인후 경로를 통해 감염시켰을 경우, pep27 돌연변이체로 감염시킨 마우스는 감염 후 3주 이내에 사망한 것이 없었으나 D39로 감염시킨 마우스는 111시간 생존하였으므로, pep27 돌연변이체의 독성이 상당히 약화되었음을 알 수 있었다(P<0.001)(도 4D). EHpep27 돌연변이체도 유사한 결과를 보였다(데이터는 제시하지 않음). 이러한 결과는 폐렴구균 pep27이 독성에 필수적이고 숙주 손상에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사하는 것이며, 이로써 pep27 돌연변이체가 약독화를 현저하게 시킴을 입증하는 것이다.

생체 내의 독성을 확인하기 위해, MK0527 돌연변이체로 감염시킨 마우스 모델의 LD₅₀ 수준(50% 치사량)을 측정하였다. 인후 감염 모델의 경우, pep27 돌연변이체는 야생형에 비해 25배 이상 약독화된 반면에 패혈증 모델의 경우(복강내 감염), 야생형에 비해 10⁴배 이상 약독화되었다(표 2). 하기 표 2는 생체 내에서 pep27 돌연변이체의 상당한 약독화를 나타낸다.

돌연변이체 명칭	감염 경로	LD₅₀	Fold attenuation※
MK0527 (Δpep27)	인후 투여	>5 x 10⁸	>25 X
MK0527 (Δpep27)	복강내 주사	>1 x 10⁸	>1 x 10⁴
D39	인후 투여	2 x 10⁷	1
D39	복강내 주사	10⁴	1

※Fold attenuation: pep27 돌연변이체의 LD₅₀ / 야생형의 LD₅₀.

EHpep27 돌연변이체 역시 유사한 독성 약화를 보여주었다(데이터는 제시하지 않음). 그러나, 본 발명자들은 MK0527 및 EHpep27 돌연변이체를 이용한 인후 감염 모델의 경우 돌연변이체가 너무 약화되어 인후 경로를 통해 > 1 X 10⁹ CFU로 투여해야 하기 때문에 약독화를 측정하지 못했다. 이는 Pep27이 자가분해 및 이에 따른 염증에 필요한 중요 인자임을 시사하는 결과이다.

실험예 4: 마우스 감염 후 pep27 돌연변이체의 빠른 제거 및 비- 침습성

비인두에서 pep27 돌연변이체가 콜로니를 형성하는 지 확인하기 위해서, 마우스를 야생형 또는 EHpep27 돌연변이체의 1 x 10⁶ CFU로 비강에 감염시키고, 콜로니 형성을 측정하였다(Jedrzejas MJ, 2001). 돌연변이체의 콜로니 수는 감염 24시간 후에 관찰되지 않았고, 반면에 야생형은 비인두에서 2 x 10⁴ CFU 이상 관찰되었다. 게다가, 돌연변이체는 감염 24시간 후에 폐 및 혈액에서 관찰되지 않았고, 반면에 야생형은 폐 및 혈액에서, 각각 1 x 10⁶ 및 1 x 10⁸ CFU이상 관찰되었다. 마찬가지로, 돌연변이체는 감염 48시간 후에 관찰되지 않았으나 반면에 야생형은 비인두, 폐 및 혈액에서 상당한 수가 관찰되었다(도 5A). 상기와 같은 결과는 돌연변이체가 24시간 내에 빠르게 제거되고, 폐 및 혈액을 침습하지 않음을 나타내는 결과이다.

전신 감염 후에 pep27 돌연변이체의 약독화를 확인하기 위해서, 본 발명자들은 같은 독성 약화를 보이는 MK0527 돌연변이체 대신에 EHpep27를 사용하였다. EHpep27 돌연변이체로 정맥내에 감염시킨 마우스는 야생형(D39의 6 x 10⁶ CFU와 EHpep27의 2 x 10⁸ CFU를 비교)보다 33배 이상이었고 콜로니화가 폐, 비장, 혈액, 및 뇌에서 관찰되었다. 감염 4시간 후, EHpep27 돌연변이체는 비장 및 폐에서는 관찰되었으나 혈액 및 뇌에서는 관찰되지 않았다. 대조적으로, 야생형은 폐, 비장, 혈액, 및 뇌에서 2 x 10⁴ ~ 2 x 10⁶CFU를 보였다(도 5B). 감염 8시간 후, EHpep27 돌연변이체는 비장 및 폐에서, 콜로니화가 각각 4.6배 및 21.0배 증가하였고, 반면에 야생형은 비장 및 폐에서, 콜로니화가 각각 41% 및 15% 감소하였다(도 5B).

pep27 돌연변이체의 빠른 제거를 확인하기 위해, 야생형보다 과량의 돌연변이체를 사용하여 마우스 비강을 감염시켰고, 콜로니화를 측정하였다. 35,000배 과량인 pep27 돌연변이체를 비강에 감염시킨 경우(야생형 2 x 10⁶vs EHpep27 돌연변이체 7 x 10¹⁰ CFU), 감염 15시간 후 야생형은 비인두에서 2.8 x 10² CFU가 관찰되었고, 반면에 돌연변이체는 8 x 10³ CFU였다. 그러나, 감염 40시간 후에 EHpep27 돌연변이체의 CFU는 야생형의 단지 13%가 감소하였다. 마찬가지로, EHpep27 돌연변이체는 폐, 혈액, 및 뇌에서는 관찰되지 않았고, 반면에 야생형은 2 x 10² ~ 10⁶ CFU(도 6)의 범위로 관찰되었다는 점에서 EHpep27 돌연변이체는 생체내에서 인후 접종 후에 빠르게 제거되고, 폐, 혈액, 및 뇌를 침습하지 않는다는 것을 알 수 있었다.

실험예 5: pep27 돌연변이체로 면역화시킨 마우스의 방어 효과

EHpep27 돌연변이체는 빠르게 제거되기 때문에, 본 발명자들은 돌연변이체를 이용한 면역화가 치명적인 접종에 대하여 방어하는 지를 조사하였다. pep27 돌연변이체의 백신 효과를 확인하기 위해, 마우스를 1 X 10⁶~1 X 10⁷ CFU EHpep27 돌연변이체로 2주마다 3회 복강내에 면역화시켰다. 돌연변이체에 대해 증가한 IgG 항체 역가는 6,400이었다(데이터는 제시하지 않음). 면역화시킨 마우스를 D39(2 X 10⁴ CFU)로 복강 내에 접종한 경우, 돌연변이체 면역화의 유무에 따른 마우스 생존이 각각 41.9 및 28.5였다(도 7A). 이러한 결과는 돌연변이체로 복강 내 면역화시킨 경우 생존 시간이 현저하게 증가함을 보여준다 (p,0.01). pep27 돌연변이체를 이용한 인후 면역화가 인후 접종으로부터 방어할 수 있는지 확인하기 위해, 마우스를 EHpep27 돌연변이체(~1 X 10⁹ CFU)로 3회 인후 면역화시켰고, D39(2 X 10⁷ CFU)를 인후 접종하였다. 다시, 높은 혈청 역가(세포 용해물을 기반으로 >6,400 ~12,800)가 관찰되었다(데이터는 제시하지 않음). 놀랍게도, 면역화한 마우스는 인후 접종으로부터 방어되었고, 생존시간이 상당하게 증가하였다(P<0.01)(도 7B). 상기와 같은 결과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 전신 및 인후 감염을 반복하였고 뒤이어 같은 방법으로 접종하였다. 마찬가지로, MK0527 돌연변이체는 EHpep27와 유사한 결과를 보였다(데이터는 제시하지 않음).

이러한 결과는 pep27 유전자만을 결실시킨 EHpep27가 백신으로서 효과가 좋다는 것을 시사하는 것이다.

실험예 6: Pep27 돌연변이체 면역화에 의한 혈청형-타입 비의존성 방어 효과

치명적인 이종 균주의 접종에 대한 교차-방어를 더 조사하기 위해, 복용량 1 x 10⁷ CFU의 타입 2(D39) EHpep27 돌연변이체로 15마리의 마우스 군에 2주일 사이에 3회 인후로 면역시켰고, 2주 후에 독성 D39 타입 2의 1 x 10⁷ CFU, 또는 독성 타입 4의 1 x 10⁸ CFU, 또는 독성 타입 6B의 2.3 x 10⁸ CFU로 접종하였다. 이종 혈청형 타입 4 및 타입 6으로 접종한 경우, 타입 2 EHpep27로 면역화시킨 마우스는 각각, P<0.01 및 P<0.05로 상당한 방어효과를 나타냈다(도 8).

실험예 7: 보조제( adjuvant ) 하에서 pep27 돌연변이체의 면역성

EHpep27의 면역성 및 EHpep27 면역성에 대한 보조제의 효과를 더 확인하기 위해, 마우스를 2주마다 EHpep27 돌연변이체로 인후에 면역시키고, 항체 역가를 측정하였다. 돌연변이체의 1 X 10⁸ CFU로 한번 면역화시킨 마우스의 IgG 항체 역가는 2,300였다. 그러나, 같은 돌연변이체의 CFU를 이용한 두번째 면역화는 항체 역가가 4,100으로 증가하였고, 3번째는 12,450이었다(도 9A). 상기와 같은 결과는 pep27 돌연변이체가 높은 면역성을 가짐을 입증하는 것이다.

보조제, 콜레라 독성 B(cholera toxin B, CTB) 소단위가, EHpep27 돌연변이체의 항원성을 증가시키는 데 유용한 지 더 확인하기 위해, CTB의 존재 또는 부재 하에서 EHpep2D 돌연변이체로 면역화한 후에 생존 시간을 다른 독립적인 실험으로서 관찰하였다. CTB 단독 및 돌연변이체를 이용한 1회 면역화는 치명적인 인후 접종에 대해 상당한 방어효과를 나타내지 못했다(도 9B). 그러나, 돌연변이체로 2회 면역화한 것은 치명적인 접종에 대해 상당한 방어효과를 나타냈고, 생존 시간은 6.5일에서 >21일로 증가하였다(도 9B). 그러나, 돌연변이체 및 CTB의 혼합물로 면역화한 마우스는 상당한 방어효과를 나타내지 못했고(도 9B), 이는 CTB가 보조제로서 유용하지 않음을 보여준다.

실험예 8: 독성을 증가시키지 않는 야생형과 pep27 돌연변이체의 동시 감염

생약화 균주를 이용한 접종은 비인두에서 야생형을 이용한 동시콜로니화 동안 형질전환되거나/야생형으로 복원될 수 있기 때문에, 본 발명자들은 동시감염 실험에 의해 이러한 가능성을 확인하였다. 첫번째, D39 또는 타입 4의 1 x 10⁶CFU를 마우스의 비강에 접종하고, 접종 24시간 후에, EHpep27 돌연변이체의 1 x 10⁸ CFU를 마우스를 더 접종했으며, 다음으로 생존 시간을 측정하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 돌연변이체를 이용한 콜로니화를 하기 전에 타입 2 및 타입 4를 이용한 동시 감염을 한 경우 생존 시간이 상당한 감소되는 것을 관찰하지 못했다(도 10).

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Attenuated Streptococcus pneumococcus comprising mutated pep27 gene and use the same <130> PA100317/KR <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pep27 of Streptococcus pneumoniae D39 <400> 1 atgagaaagg aatttcacaa cgttttatct agtgatcagt tacttacaga caaaaggcca 60 gcaagagact ataatagaaa atag 84 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for LytA <400> 2 ccggatccca tggaaattaa tgtgagtaaa tta 33 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for LytA <400> 3 ccctcgagtt attttactgt aatcaagcca tc 32 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ermB <400> 4 ccgggcccaa aatttgtttg at 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ermB <400> 5 agtcggcagc gactcataga at 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-up primer(pep27-up 534172~534498bp) <400> 6 tctctatcag cctcaagcag 20 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-down primer(pep27-up 534172~534498bp) <400> 7 atcaaacaaa ttttgggccc ggttgaagca agcgccataa cg 42 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-up primer(pep27-down 534919~535221bp) <400> 8 attctatgag tcgctgccga ctgacggatt gtggctatga 40 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-down primer(pep27-down 534919~535221bp) <400> 9 gtatcgtagt agcgcttg 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-up primer(pep27-up 534453~534662bp) <400> 10 gtccttgcct tggttcta 18 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-dowm primer(pep27-up 534453~534662bp) <400> 11 atcaaacaaa ttttgggccc gggattttca ccactgcttt cg 42 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-up primer(pep27-down 534781~534997bp) <400> 12 attctatgag tcgctgccga ctaaggccag caagagacta 40 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-down primer(pep27-down 534781~534997bp) <400> 13 ggccacctca tagctagaa 19

Claims

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서열번호 1로 표시되는 pep27 유전자 핵산서열의 1번 내지 53번의 결실 및 ermB 카세트로 치환한 돌연변이를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주.
폐렴구균 균주의 염색체 DNA에서 서열번호 1로 표시되는 pep27 유전자를 결실시키는 단계 및 ermB 카세트 치환하는 단계를 포함하는, 제5항의 약독화된 폐렴구균 균주의 제조방법.
제5항의 폐렴구균 균주를 포함하는, 폐렴구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제7항에 있어서, 상기 백신 조성물은 혈청형-비의존적으로 면역화시키는 것인 폐렴구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제7항에 있어서, 상기 백신 조성물은 폐, 비장, 혈액 또는 뇌에 비침습성인 것인 폐렴구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제7항에 있어서, 상기 조성물은 복강내 또는 점막내로 투여하기 위한 폐렴구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제10항에 있어서, 상기 점막은 인후 점막인 백신 조성물.
제7항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 면역 보조제를 추가적으로 포함하는 백신 조성물.