KR102114739B1 - 패혈증 치료제 및 이의 스크리닝 방법 - Google Patents

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Abstract

본원은 폐렴구균의 VncRS 오페론 억제제 또는 락토페린 활성 억제제를 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 및 패혈증의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

패혈증 치료제 및 이의 스크리닝 방법{MEDICINE FOR TREATING SEPSIS AND METHOD FOR SCREENING THE SAME}
본원은 폐렴구균의 VncRS 오페론 억제제 또는 락토페린 활성 억제제를 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 및 패혈증의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
폐렴은 심각한 증상과 높은 사망률을 나타내며, 2010 년에는 130 만명 넘는 사망자를 발생시킨 주요 급성 호흡기 질환이다 (Walker et al., 2013). 폐렴의 주요 원인균인 폐렴구균 (Streptococcus pneumoniae)은 비인두에서 무증상으로 서식하다가 패혈증과 수막염과 같은 다양한 생명을 위협하는 감염을 유발시킬 수 있다 (Mandell et al., 2007). 또한 패혈증의 50% 이상이 폐렴 (Munford and Suffredini, 2009)에 의해 발생하지만 폐렴구균이 혈액을 침범하는 방법에 대해서는 잘 알려져 있지 않다.
세균 용해로 인해 방출되는 펩티도글리칸, 지질단백질 및 리포폴리사카라이드 (LPS)와 같은 세포벽 및 세포질 성분은 선천 면역계를 유도하여 혈액 및 뇌에 백혈구 및 세균의 침투를 촉진시키는 호염증성 사이토카인 분비를 유도하여 염증을 일으킨다고 알려져 있다 (Kieser 및 Kagan, 2017; Broz and Monack, 2011; Mook-Kanamori et al., 2011). 따라서, 세균 용해 조절 메카니즘을 이해하는 것이 질병 치료 및 화학 요법제 개발에 중요한 단서를 제공할 것이다. 전체 폐렴구균 중 일부 만이 형질전환 과정에서 분해되며 (Stinmoen et al., 2002), 사람의 폐 시료에 폐렴구균을 시험관 내 감염시킨 후에 폐 대식세포에서 폐렴구균 DNA가 검출된 바 있다 (Xu et al., 2008). 즉, 폐렴구균이 항생제에 의해 용해되면 임상 상황이 더 악화될 수 있기 때문에 균의 용해 없이 폐렴구균성 폐렴을 치료하는 것이 중요하다 (Karlstrom et al., 2011). 그러나 숙주로의 감염 및 침입 중 폐렴구균이 용해되는데 필요한 신호와 그 조절 과정에 대해서는 잘 알려져 있지 않다.
박테리아는 2 가지 구성요소 시스템 (Two component system, TCS; Laub and Goulian, 2007)을 사용하여 환경 변화에 적응하지만, 단순히 TCS을 비활성화시켜서는 중복적으로 존재하는 규제 시스템으로 인해 독성이 크게 약화되지 않을 수 있으며 어떤 TCS가 중추적인 역할을 하는지는 완전히 밝혀지지 않았다.
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세균은 2 가지 구성요소 시스템 (Two component system, TCS; Laub and Goulian, 2007)을 사용하여 환경 변화에 적응하지만, 단순히 이를 비활성화시켜서는 중복적으로 존재하는 규제 시스템으로 인해 세균의 독성이 크게 약화되지 않을 수 있으며 어떤 TCS가 중추적인 역할을 하는지는 완전히 밝혀지지 않았다. 본원은 생쥐에서 격렬한 염증과 패혈증을 일으키는 혈청형 2번 D39 폐렴구균 균주에서 반코마이신 내성 VncRS TCS (Novak et al., 1999)가 숙주 내로의 침입 및 균 용해과정에서 담당하는 역할을 밝혀내고자 하였고, 또한 pep27 돌연변이가 숙주 침입이나 패혈증을 유도할 수 있는지를 분석함으로써 폐렴구균 감염에 의한 패혈증을 예방 또는 치료할 수 있는 후보물질을 탐색하고자 하였다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 폐렴구균의 VncRS 오페론 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 락토페린 활성 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.
본원의 제 3 측면은, (a) 폐렴구균에 시험물질을 처리하는 단계; (b) 상기 폐렴구균에 락토페린을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 폐렴구균의 VncRS 오페론의 유도 여부를 측정하는 단계를 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
본원의 제 4 측면은, (a) 락토페린에 시험물질을 처리하는 단계; (b) 상기 락토페린의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.
펩티도글리칸 (peptidoglycan)과 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide)와 같은 세균의 세포벽 성분이 숙주 면역계에서 인식되면, 호염증성 사이토카인 (proinflammatory cytokines)에 의한 강력한 선천면역이 유도되어 백혈구가 감염 부위로 동원되고 병원균이 혈액으로 침투하여 패혈증을 일으키게 된다. 따라서 세균 용해의 초기 신호 전달은 염증/침입과 패혈증을 극복할 수 있는 중요한 단서를 제공한다.
본원에서는, 폐렴구균에서 혈청 의존적인 VncRS 유도에 의해 분비되는 Pep27에 의해 균이 용해되고 이에 따라 숙주 면역계에서 사이토카인 분비가 활성화되어 패혈증을 일으킨다는 메커니즘을 최초로 밝혀냈으며, 이를 기초로 패혈증의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하였다. 본원의 스크리닝 방법은, VncS 센서 키나아제 또는 VncR 반응조절제는 패혈증에 유의하게 기여하지 않지만, 효과기 Pep27이 숙주에 침투하거나 패혈증을 일으키는데 중요한 요소로 작용한다는 원리를 이용한 것이다. 또한, VncS는 혈액 내 락토페린을 감지하여 VncRS 오페론을 유도하여 균이 용해되고 패혈증을 일으킨다는 사실을 발견하고, 이를 이용해 폐렴구균의 VncRS 오페론 억제제 또는 락토페린 활성 억제제를 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하였다.
도 1은 본원의 일 실시예에 따른 폐렴구균의 혈청 의존적 vncR/S 유도 (a 내지 f), 및 VncS의 자가인산화 및 용해 (g)를 보여주는 도이다.
도 2는 폐렴구균의 pep27이 독성 및 패혈증을 매개한다는 것을 증명하는 도이다.
도 3은 폐렴구균의 pep27이 균의 용해를 유도하는 원인물질임을 증명하는 도이다.
도 4는 폐렴구균의 pep27이 감염 초기 단계에서 균의 용해, 염증성 사이토카인 및 염증을 유도하는 원인물질임을 증명하는 도이다.
도 5는 폐렴구균의 VncS의 리간드인 락토페린이 vncRS 오페론을 유도한다는 사실을 보여주는 도이다.
도 6은 폐렴구균의 VncS의 리간드인 락토페린이 vncRS 오페론 및 세포 용해를 유도한다는 사실을 보여주는 도이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.
이하, 본원의 패혈증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 및 이의 스크리닝 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 1 측면은, 폐렴구균의 VncRS 오페론 억제제 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.
이는 폐렴구균에서 반코마이신 내성 유전자 자리 (vex123-pep27-vncRS)가 혈액 침입 (패혈증) 중 용해를 감지하거나 용해되는 데 필수적인 역할을 한다는 것에 기반한 것이다. 본원의 실시예에 따르면, 생쥐 모델에서 가장 빠르게 패혈증으로 진행되는 폐렴구균 균주 D39 (혈청형 2)가 혈청에 노출되었을 때, VncRS 오페론, Pep27 분비 및 용해가 시험관내 실험에서 유도되었다. 일관되게, 다른 혈청형도 혈청 첨가시 혈청형에 따라 VncRS 오페론이 유도되고 용해되었다. 또한 D39를 정맥주사하면 균이 용해되고, 사이토카인 분비 유도 및 혈액 내에서 성장을 유도하여 감염 초기 단계에서 염증 및 패혈증을 유발시키지만, pep27 돌연변이는 이런 반응이 억제되거나 완전히 소실되었다. 일관되게 pep27 돌연변이체를 면역 결핍된 생쥐 (누드 및 SCID) 및 정상 CD1 생쥐의 복강 내 또는 두개골 내로 주입하더라도 야생형과 대조적으로 침투 및 패혈증이 나타나지 않았다는 발견에 근거한 것이다
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 폐렴구균은 혈청형 D39일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 다른 혈청형의 폐렴구균에 의한 패혈증의 예방 또는 치료에서도 본원의 약제학적 조성물을 이용할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 VncRS 오페론 억제제는 항-락토페린 항체일 수 있으나 이에 제한되지 않을 수 있으며, VncRS 오페론의 작동을 억제하는 물질로서 약제학적 조성물에 사용하기에 적합하다면 특별한 제한 없이 사용할 수 있다.
예를 들어, 본원의 약제학적 조성물은 통상적인 약제학적 담체 또는 부형제와 혼합되어 정제 (tablet), 캡슐 (capsule), 엘릭시르 (elixir), 현탁액 (suspensions), 시럽 (syrup), 및/또는 웨이퍼 (wafers) 등의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 그와 같은 약제학적 조성물들은 약 0.1 내지 90 중량%, 더욱 일반적으로는 약 10 내지 30%의 활성 성분을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 약제학적 조성물들은, 제제시에 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제 외에도 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등이 추가로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 약제학적 조성물은 비경구 투여될 수 있으며, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 비강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여될 수 있다. 상기 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본원의 약제학적 조성물의 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있으나,
본원의 제 2 측면은, 락토페린 활성 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.
이는, 본원의 실시예에서 솔-젤® 분석으로 VncS 리간드가 락토페린(LF)임을 밝히고 LF가 VncRS 오페론, Pep27 분비 및 용해를 유도하는 작용기전을 밝힌 것에 기초한 것이다. 혈청으로 VncRS가 활성화되면 pep27 분비, 박테리아 용해 및 사이토카인 분비가 유도되어 염증 및 침윤 (패혈증)이 유발된다. 폐렴구균에 감염된 생쥐에 LF를 보충하면 치사율이 증가하지만, LF를 없애면 치사율이 감소된 것으로부터 LF가 VncS 리간드임을 입증하였다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 락토페린 활성 억제제는 항-락토페린 항체일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 락토페린의 활성을 직·간접적으로 억제할 수 있는 물질로서 약제학적 조성물에 사용하기에 적합하다면 특별한 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 락토페린 활성 억제제는 VncS의 리간드인 락토페린의 활성을 억제함으로써 VncRS 오페론의 작동을 차단하여 pep27의 분비를 막고, 따라서 박테리아의 용해 및 이에 따른 패혈증 발생을 감소시키거나 억제할 수 있다.
본원의 제 1 측면과 관련하여 기술된 내용은, 특별한 언급이 없는 한 본원의 제 2 측면에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다.
본원의 제 3 측면은, (a) 폐렴구균에 시험물질을 처리하는 단계; (b) 상기 폐렴구균에 락토페린을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 폐렴구균의 VncRS 오페론의 유도 여부를 측정하는 단계를 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 폐렴구균은 혈청형 D39일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 다른 혈청형의 폐렴구균에 의한 패혈증의 예방 또는 치료제의 스크리닝을 위해서도 본원의 방법을 사용할 수 있다.
상기 스크리닝 방법은, 폐렴구균을 실험동물 (예를 들어, 생쥐 또는 토끼 등)에 접종하거나 실험동물 또는 인간의 폐 세포에 접종하여 배양하면서 수행할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 시험물질은 화합물, 미생물 배양액, 미생물 추출물, 핵산, 항체, 단백질, 펩타이드, 압타머 및 천연 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 VncRS 오페론의 유도 여부를 측정하는 것은 폐렴구균의 용해를 측정하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 폐렴구균의 용해를 측정하는 방법은 본원이 속하는 기술분야에서 세균의 용해를 측정할 수 있는 방법으로 알려진 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 세균 세포의 손상에 의해 배양액 내로 방출되는 젖산 탈수소 효소(LDH)를 검출함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 무처리 대조군과 비교하여 상기 폐렴구균의 VncRS 오페론의 유도가 억제되는 경우에 상기 시험물질을 패혈증 예방 또는 치료제의 후보물질로 판단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 1 측면 및 제 2 측면과 관련하여 기술된 내용은, 특별한 언급이 없는 한 본원의 제 3 측면에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다.
본원의 제 4 측면은, (a) 락토페린에 시험물질을 처리하는 단계; (b) 상기 락토페린의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 시험물질은 화합물, 미생물 배양액, 미생물 추출물, 핵산, 항체, 단백질, 펩타이드, 압타머 및 천연 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 락토페린의 활성을 측정하는 것은 VncRS 오페론을 유도하는 락토페린의 활성을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 무처리 대조군과 비교하여 상기 락토페린의 활성이 억제되는 경우에 상기 시험물질을 패혈증 예방 또는 치료제의 후보물질로 판단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 1 측면 내지 제 3 측면과 관련하여 기술된 내용은, 특별한 언급이 없는 한 본원의 제 4 측면에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예]
재료 및 방법
세균 균주
폐렴구균 협막을 가지는 균주 D39 (type 2, NCTC7466)와 무협막 균주 CP1200은 Todd Hewitt 배지 또는 Casitone-tryptone (CAT) 기반의 배지에서 이전에 언급된 대로 배양하였다 (Kwon et al., 2003). 완전한 형질전환 배지는 CaCl2 147 mg 및 소 혈청 알부민 (분획 V; 시그마) 2 g을 (1 리터당) 첨가하여 CAT 배지로부터 제조하였다. 형질전환은 앞서 기술 한 바와 같이 형질전환 유도 펩타이드 -1을 적절하게 첨가하여 유도하였다 (Bricker and Camilli, 1999).
세포 배양
사람의 폐 상피세포 암종인 A549 세포주를 American Type Culture Collection (ATCC TIB-71)에서 구입 후, Dulbecco modified Eagle 배지 (DMEM)에 4.5g/l 포도당, 10% 태아 소 혈청 (Gibco BRL), 100 U/ml 페니실린 G 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 첨가한 것을 기본배지로 하고 소 태아 혈청을 10% 농도로 첨가하여 95% 공기-5% CO2 존재하에 37℃에서 배양하였다.
결손 돌연변이체 구축
폐렴구균에 vncRS 유전자 자리의 돌연변이체를 구축하기 위해, 관심 유전자 자리에 전사 방향과 반대방향으로 에리스로마이신 내성 카세트 (ermB)를 삽입하여 표적유전자를 결손시키고 대신 ermB DNA 단편을 함유하도록 하는 DNA 절편을 중합 PCR로 생성하고 이를 폐렴구균에 형질전환시켜 상동성 재조합에 의해 염색체로 삽입시켰다 (Kim et al., 2012). 형질전환체(Transformant)는 2.5 ㎍/ml 에리스로마이신에 저항성인 것을 선택하였고 PCR, 면역블랏 분석 및 시퀀싱에 의해 정확하게 탈락된 변이주를 검색하였다. 이 연구에서 사용된 세균 균주는 tripartite PCR에 의해 생성되었으며 아래의 표 1 및 표 2에 제시되어 있다.
Figure 112017060156886-pat00001
Figure 112017060156886-pat00002
단백질 정제
전체 VncS (아미노산 1-442)을 VncS-F (GGGCCC GGATC CGATGAAACGAACAGGTTTATTTGC, 여기서 이탤릭체로 된 부위가 BamHI 자리) 및 VncS-R (GGCCCG CTCGAG CTAGTCTTGGACGACTTTTGG, 여기서 이탤릭체로 된 부위가 XhoI 자리) 및 폐렴구균 D39 염색체 DNA를 주형으로 이용하였다. 키나아제 도메인 vncS (아미노산 194-442)는 VncS 194F (CGC GGATCC AAGGATGAGAT AGGTAATCTCAAG, 이탤릭체로 된 부위가 BamHI 자리) 및 VncS R을 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 증폭된 DNA를 대장균 XL1-blue 에서 pHis Parallel 2 벡터의 BamHI / XhoI 자리에 클로닝하고 이어서 과발현 균주 E. coli BL21 (DE3)에 옮겼다.
단백질을 정제하기 위해, 재조합 균주를 50 ㎍ ml-1 암피실린을 함유하는 LB배지에서 OD600이 0.6에서 0.8로 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 단백질 발현을 유도하기 위해 이소 프로필 β-D-1- 티오갈락토피라노시드(IPTG)를 최종 농도가 0.5 mM이 되도록 배지에 첨가하였다. 세포를 IPTG 처리 후 24 시간 동안 25℃에서 지속적으로 배양하고, 3,382g에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포를 수집하고 기본 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM β-머캅토에탄올 및 1 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)로 희석하고 얼음에서 초음파 처리하여 용해시킨 후 세포 파편과 불용성 단백질을 16,000 g에서 1 시간 동안 원심분리하여 제거하였다. 상등액 단백질 분획을 이전처럼 Ni-NTA 수지 (Qiagen) 를 이용하여 정제하였다 (Sheffield et al, 1999). 필요한 경우 4℃에서 100 U의 담배 에칭 바이러스 프로테아제와 1 mM EDTA와 1 mM dithiothreitol을 첨가한 1 ℓ의 기본 완충액에서 투석하면서 6 His 태그를 제거하고 Ni-NTA 칼럼으로 6 His 단편과 절단되지 않은 단백질을 제거하였다. 단백질을 이온 교환 (mono-Q) (50 mM Tris buffer, 0.5% Triton X-100 및 1 M NaCl 구배)과 완충액 B (50 mM Tris 완충액, 0.5 % Triton X-100 및 1M NaCl 구배)로 평형화 된 Superdex-200 크기 배제 칼럼 (GE HealthCare)을 이용하여 더 정제하였다. 정제에 사용된 완충액은 완충액 C (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT 및 1 mM EDTA, 0.5 % Triton X-100)를 사용하였다. 정제된 단백질 순도를 SDS-PAGE상에서 측정하고 Centricon (Millipore)을 사용하여 10 mg ml-1로 농축시켰다.
VncR 전체를 함유하는 단백질을 pHis Parallel vector 에 클로닝하고 유사한 방식으로 정제하였다.
VncS의 자가 인산화
키나아제 도메인을 이용한 VncS 인산화 분석은 이전 보고서 (Okada et al., 2007)를 수정하여 실험하였다. 인산화반응 분석은 0.25 μM의 [γ-32P] ATP (비 활성 3,000 Ci / mmol), 24.75 μM의 ATP 및 10 ㎕의 인산화 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.8, 200 mM KCl) 및 1 ㎍의 VncS (아미노산 194-442)를 포함하는 최종 25 ㎕ 부피로 실온에서 30 분 동안 수행하였다. 반응을 종결시키기 위해 5 × SDS 샘플 완충액을 첨가한 후, 15% 폴리아크릴 아미드겔에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하고, 표지된 단백질은 PhosphorImager 필름 (Agfa, Belglum)에 24 시간 노출시켜 검출하였다.
혈청에 의해 VncS가 자가 인산화되는지 측정하기 위해, 1 ㎍의 VncS (194-442 도메인)에 10% 혈청 및 0.25 μM의 [γ-32P] ATP를 첨가하여 인산화 반응이 시작되도록 하였다.
Sol-gel 분석에 의한 VncS 리간드의 스크리닝
인간 혈청에서 VncS 리간드를 확인하기 위해 정제된 VncS를 겔에 접합시키고 24 시간 동안 인간 혈청과 함께 배양 한 다음 갇힌 리간드를 겔에서 회수하였다 (Sol-gel® 방법, PCL Inc., 대한민국) (Ahn et al., 2012). 이후의 SDS-PAGE 및 질량-질량 분석으로 VncS 결합 단백질을 확인했다.
RNA 분리 및 역전사 (RT)-PCR
mRNA 수준에서 유전자 발현을 측정하기 위해, 대수기 (OD550 = 0.30) 에 있는 폐렴구균을 일정시간 동안 혈청 또는 인간 락토페린 (6 mM 및 30 mM)에 노출시키고, Trizol 방법 (Invitrogen , 미국)으로 RNA를 정제하였다. 분리된 RNA (1-2 ㎍)를 제조자의 제안 (Enzymonics, Korea)대로 cDNA 제조의 주형으로 사용하였다. qRT-PCR 반응은 50 ng의 cDNA, 10 pmol의 각 프라이머 (표 3) 및 SYBR Green master mix (Elpis, Korea)를 포함하는 최종 부피 20 ㎕에서 StepOne Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행되었다. PCR 반응은 95℃에서 10 분간, 이어서 95℃에서 15 초, 55℃에서 30 초, 72℃에서 30 초간 40회를 반복하였다. 모든 real-time PCR 데이터는 내부 대조군으로 16s rRNA 유전자의 mRNA 수준으로 정상화되었다. 전사된 mRNA양은 내부 대조군 유전자 (2- ΔCT, ΔCT는 표적과 내부 대조군 유전자 사이의 역치 사이클의 변화를 의미함)에 대한 n 배의 변화로 표시되었다.
Figure 112017060156886-pat00003
시험관내 세포독성 분석
A549 세포에 대한 돌연변이체의 세포독성을 측정하기 위해, 세포손상에 의해 상등액으로 방출되는 젖산 탈수소 효소 (LDH)를 LDH 세포독성 검출 키트 (Takara Bio Inc., Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다.
웨스턴 블랏팅
세균 침전물 또는 상층액 중의 단백질을 SDS-PAGE로 전개하였다. 분리된 단백질은 PVDF 막으로 전기에 의해 전이된 후 폴리클로날 생쥐 항-Pep27 항체 (1 : 2000), 항-VncS 항체 (1 : 3000) 또는 항-VncR 항체 (1 : 3000)를 탐침으로 이용하여 반응하는 단백질을 검출하였다. 이어서 막을 1 : 4000의 희석된 염소 항-생쥐 IgG 양고추냉이 퍼옥시다아제-결합 2차 항체 (Santa Cruz Biotechnology, USA)와 반응시켰다. 표지된 밴드는 제조회사의 프로토콜대로 ECL 시약 (Gendepot, USA)을 사용하여 검출하였다.
용해 검출
용균된 세균을 검출하기 위해, 상등액으로 방출된 세균 염색체 DNA를 21,000 g에서 10 분 동안 원심 분리하여 모든 용해되지 않은 세균을 침전시킨 후 상등액을 수확하였다. 세균 염색체 DNA는 16s rRNA 프라이머 (16S-F; 5'-CTGTGGCTTAACCATAGTAG-3 '및 16S-R; 5'-CTAGCACTCATCGTTTACA-3')를 사용하여 RT-PCR로 검출하였다.
생체 내에서 세균 용해를 측정하기 위해, CD1 생쥐 (n=3/그룹)에 D39 (7.2 x 107 개) 또는 pep27 변이주 (3.7 x 107 개)를 정맥 내 주입하여 (i.v.) 감염시켰다. 혈액 샘플을 원심분리 (1,500 g, 10 분간)하여 숙주세포에 결합된 세균 (침전물)과 결합하지 않은 세균 (상청액)으로 분리하였다. 이어서 샘플을 적절히 희석하고 혈액 한천배지에 도말하여 생존 세균수를 세었다.
생체 내 감염 연구
생체 내 감염 연구를 위해 4 주 된 수컷 CD1 또는 Balbc (Orient Bio Inc., Korea), 누드 또는 SCID 마우스 (Charles River Laboratories, Japan)를 사용하였다. 폐렴구균 균주의 독성을 측정하기 위해, 이전과 같이 고도의 독성을 가지는 타입 2 (D39) 또는 이로부터 유래된 변이주를 복강 내 (i.p), 비강 내 (i.n) 또는 두개 내 (i.c.v) 로 감염시켜 실험하였다 (Kim et al., 2012 ). 감염 연구에 사용된 동물은 한국 동물 보호법의 지침에 따라 성균관대학교 동물 윤리위원회에서 승인되었다.
사이토카인 측정
생체 내 사이토카인 분비를 평가하기 위해, Balb/c 마우스 (6 내지 8 주령의 수컷)에게 2 x 108 개의 폐렴구균 D39 및 그 결실 돌연변이체를 감염시키고, 6 시간 및 24 시간 후에 폐 균질물을 수집 하였다. 이들 조직에서 IL-6, IL-1β 및 TNF-α가 분비되는 양을 측정하기 위해 상업적으로 이용 가능한 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA) 키트 (eBioscience, USA)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다.
시험관내 락토페린 고갈 실험
락토페린 (LF)이 고갈된 사람 혈청을 제조하기 위해 100 ㎕의 사람 혈청 (Sigma-Aldrich, USA)에 폴리클론 항-LF 항체 (Abcam, UK) 1 ㎍ 또는 5 ㎍을 첨가하고 4℃에서 부드럽게 교반하면서 밤새 배양하였다. 이후 면역 복합체를 100 ㎕의 단백질 A/G-PLUS 아가로오스 비드 (Santa Cruz Biotechnology, USA)로 풀다운하여 제거한 후 상등액을 LF가 고갈된 사람 혈청으로 사용하였다.
생체 내 LF 실험
LF에 대한 독성을 평가하기 위해, Balb/c 마우스 (6 내지 8 주령의 수컷)에게 폐렴구균을 감염시키기 6 시간 전에 LF를 경구 투여한 후, 2 x 104 개의 폐렴구균 D39 균주를 복강 내로 감염시켜 생존율을 모니터링 하였다.
생체 내에서 LF 고갈 실험을 하기 위해, 감염하기 1 일 전에 Balb/c 생쥐에 LF 중화 IgG 항체 (anti-mLactoferrin)를 복강 내 (0, 100, 200 및 400 ng/kg) 및 비강 내 (0, 25, 50 및 100 ng/kg) AVIVA SYSTEMS BIOLOGY, USA)로 투여하였고 대조군으로는 iso 생쥐 IgG 대조군을 투여하였다. 이후 2 x 108 개의 D39 균주를 비강 내 감염시킨 후 생존율을 모니터링 하였다.
Deoxycholate (DOC) 및 항생제 존재하에서의 자가 분해
항생제 또는 세제로 유도되는 용해에 대한 혈청의 효과를 확인하기 위해 THY broth에서 대수기 초기 (OD550 0.15-0.17)까지 배양한 균 배양액에 10% 혈청과 sodium deoxycholate (100 ㎍/ml) 또는 반코마이신 (0.4 ㎍/ml) 을 첨가하고 배양 물의 광학 밀도 또는 생균 수를 결정하였다.
통계
그룹의 중앙값 사이의 통계적 차이는 Mann-Whitney U test (two-tailed unpaired)로 분석하였고 그룹 간의 전반적인 생존율 차이는 Fisher Exact test로 분석하였다. 제시된 데이터는 2 내지 4 회의 독립적인 실험에 대한 평균의 평균 표준 편차이다. ELISA 데이터는 3 개의 웰 ÷ SEM의 평균으로 나타낸다. 통계적으로 유의한 차이는 P <0.05로 정의되었다.
실험 결과
혈청 노출에 의한 VncRS operon의 발현 유도
Pep27은 LytA 의존적이거나 독립적으로 균을 용해하고 (Novak et al., 2000), Pep27 변이주는 비강 내 감염 후 혈액과 뇌에서 검출되지 않아 독성이 현저히 감소되었으므로 (Kim et al., 2012) 혈청 존재시 폐렴구균이 용해되어 Pep27이 숙주 침입에서 중요한 역할을 함을 제시한다. 이런 가능성을 확인하기 위해, VncS 센서 키나아제, VncR 반응 조절제, Vex123 트랜스포터 및 용해 유도제 Pep27 (Novak 등, 2000)을 포함하는 vncRS 오페론 (vex123-pep27-VncRS)의 유전자 발현을 생쥐에서 급격히 패혈증을 유도하는 D39 균주를 이용하여 측정하였다. 대수기 중간 (OD550=0.3)까지 THY 배지에서 배양된 D39에 일정 농도의 혈청을 첨가하고 20 분 배양하거나 10% 혈청을 첨가한 후 각각 다른 시간 동안 배양하여 유전자 발현을 qRT-PCR로 측정하였다.
구체적으로, 도 1의 a 내지 d는 혈청에 노출된 후 vncR/S 오페론 (a 및 b) 및 Pep27 (c 및 d)의 용량 및 시간 의존적 유도를 보여주는 그래프이다. D39 야생형을 THY 배지에서 대수기까지 배양한 다음 인간 혈청과 5 분 (a 및 c) 또는 10% 인간 혈청과 명시된 시간 (b 및 d) 동안 배양하였다. mRNA 수준을 qRT-PCR (a 및 b)로 분석하거나 Pep27 단백질 수준을 웨스턴 블랏 (c 및 d)으로 측정하였다. 도 1의 e는 혈청에 의한 VncS 유도를 보여주는 것으로서, THY 배지에서 대수기까지 배양한 D39 야생형 (wild type)에 10% 인간 혈청을 첨가하고 일정 시간 동안 배양했을 때의 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 측정한 것이다. 도 1의 f는 대수기의 D39에 10% 인간 혈청을 첨가하여 일정 시간 동안 배양하였을 때, 배양 상등액으로 방출된 염색체 DNA를 16S rRNA 프라이머를 사용하여 PCR로 검출한 결과이다. 도 1의 g는 VncS의 혈청 의존적 자가인산화를 보여주는 것으로서, [γ-32P] ATP 존재하에 자가 인산화를 분석하기 위해 대장균에서 발현된 VncS (pHis-VncS) 또는 삽입물이 없는 플라스미드 벡터 (Vec, 대조군)를 사용하였다. 항 -His6 항체를 사용하여 넣어준 VncS 단백질의 양을 면역 블랏팅법으로 측정하였다. 도 1의 c, d, e, f 및 g는 적어도 3 번의 독립적 실험의 대표적인 것을 사용하였고, 도 1의 a 및 b의 데이터는 4 개의 시료를 사용하여 3 회 실험한 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 나타내었다. * 그룹간 비교시 P <0.05 (일원 분산 분석)
실험 결과 vncS, vncR 및 pep27의 mRNA 수준이 혈청에 의해 시간 및 농도 의존적으로 유도되었다 (도 1의 a 및 b). 그러나, ΔvncR 및 ΔvncS에서는 pep27이 유의하게 유도되지 않았다 (데이터 미도시). 단백질 수준에서도 이런 유전자 발현 유도 현상이 나타나는지 확인하기 위해 10% 혈청을 대수기 중간 단계의 균 배양액에 첨가하고 웨스턴 블랏을 수행하였다. 실험결과 혈청 첨가에 의해 Pep27 (도 1의 c 및 d) 및 VncS (도 1의 e)가 유도되었다. 일단 VncRS가 활성화되면 Pep27이 분비되고 (Novak et al., 2000) 균이 용해될 것이다. 따라서 VncRS 유도가 되는지 뒷받침하기 위해 대수기까지 배양된 D39 야생형 (WT)에 10% 혈청을 첨가하고 16s rRNA를 프라이머로 사용하여 PCR로 균 용해시 배양 상등액으로 방출되는 염색체 DNA를 측정하였다. 일관되게, 혈청 첨가 후 상층액에서 염색체 DNA가 검출되었다 (도 1의 f).
혈청에 의해 다른 혈청형의 vncRS 오페론도 유도되는지를 확인하기 위해 대수기에 있는 배양액에 사람 혈청을 10%까지 첨가하고 vncS 발현 및 Pep27 분비를 측정하였다. 검사한 모든 혈청형이 혈청형 의존적으로 단백질과 mRNA 수준 모두에서 VncS 발현이 유도되었다 (데이터 미도시). 일관되게 혈청형 의존적으로 배양상등액에서 염색체 DNA 가 검출되어 균이 용해되었음을 확인하였고 (데이터 미도시) 이런 결과는 폐렴구균 집단 중에서 일부의 균이 용해되도록 혈청에 의해 혈청형 의존적으로 유도됨을 나타낸 것이다.
폐렴구균 (Pneumococci)은 숙주 침입시 인간 혈청에 노출된다. TCS는 리간드와 접촉하면 자가 인산화된다 (Laub and Goulian, 2007). 폐렴구균 VncS에 대한 생화학적 특성이 밝혀지지 않았기 때문에 먼저 VncS 인산화 조건을 최적화하였고, 혈청 또는 Pep27을 [γ-32P] ATP 존재하에 VncS 자가인산화가 측정하였다 (데이터 미도시). 실험 결과 10% 혈청 첨가시 VncS가 인산화되었으며 (도 1의 g) 이는 VncS 센서가 숙주 혈청 신호를 인지하고 VncS를 자가인산화 함을 제시하는 것이다.
Pep27은 독성과 패혈증을 매개
vncRS 오페론이 독성에서 중요한 역할을 하는지 확인하기 위해 vncRS 오페론의 결실 돌연변이체를 제작하여 시험관 내 세포독성 및 생체 내 독성시험에 사용하였다 (도 2의 a). 구체적으로, 변이주의 제작시 극성효과를 방지하기 위해 상동성 재조합에 의해 표적 유전자를 삭제하고 에리스로마이신 내성 카세트 ermB로 전사와 반대 방향으로 삽입하였다. 인간 폐 세포 A549에 대한 시험관 내 감염실험에서 Δpep27이 ΔvncS 및 ΔvncR 보다 유의하게 매우 낮은 세포독성을 나타냈다 (도 2의 b). 이는 시험관내에서 Δpep27는 세포독성을 감소시킨다는 점을 증명하기 위해 A549 세포를 돌연변이체로 감염시키고, 세포독성에 의해 상등액으로 분비되는 락테이트데하이드로게나제 (LDH)활성을 분석하여 측정한 결과이다. 생체 내에서도 세포 독성이 감소되는지 확인하기 위해, 생쥐 (n=10)에 D39 또는 돌연변이체로 1 내지 2 x 107 개를 비강내 (i.n) 감염시키고 생존시간을 측정하였다. Pep27은 생체내 독성을 나타내는데 필수적이라는 점을 증명하기 위해, 생쥐 (n = 10/군)에 1 내지 2 x 107개의 D39 또는 이로부터 유래된 돌연변이체로 비강 내 (i.n) 감염시키고 생존시간을 측정하였다. 모든 돌연변이 중 Δpep27은 생체 내에서 ΔvncR, ΔvncS, Δvex, Δvex-vncRS (오페론 전체 결실)와 비교하였을 때 가장 현저하게 독성이 감소되었다 (도 2의 c). Δpep27에 의한 독성 감소를 확인하기 위해, Δpep27 복귀돌연변이체 (revertant)를 제작하여, 독성 연구에 사용하였다. Δpep27 복귀돌연변이체는 Δpep27과 비교시 시험관 내 및 생체 내에서 야생형만큼 높은 세포독성을 나타내어 (도 2의 b 및 c), 독성에서 pep27 이 필수적으로 요구됨을 나타낸다. VncRS 오페론 (Δvex-vncRS)이 전체 결실되어도 독성의 일부가 유지되기 때문에 (도 2의c), 독성은 VncRS 뿐만 아니라 다른 중복 경로에 의해서도 조절될 수 있음을 제시한다. 생체 내에서의 독성 감소를 뒷받침하기 위해, 돌연변이체를 비강내 감염시킨 후 생균수를 측정하였다. 구체적으로, Δpep27은 숙주내로 침입할 수 없음을 증명하기 위해 D39 야생형과 다양한 돌연변이체를 i. n. 감염 후 24 또는 48 시간 후에 생존 균수를 측정하였다. Δpep27로 감염시키고 24 시간 후 폐 및 혈액에서 생균수가 관찰되지 않았으나 ΔvncR 및 ΔvncS는 많은 수의 균이 관찰되었다 (도 2의 d). 염증을 확인하기 위해 호산구 동원을 hematoxylin-eosin 염색으로 분석하였다. 구체적으로, 생쥐를 야생형 (1 × 107개) 또는 Δpep27 (2 × 108개)로 기관 내 감염시키고 감염 1 ~ 2 일 후 폐 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 일관되게, Δpep27 감염은 폐 염증 및 호중구 침윤이 없어 둥글고 크며 규칙적인 간격을 갖는 폐포 (화살표)를 나타내었다. 이와 대조적으로, 야생형 감염은 심한 염증으로 인해 변이주 감염시보다 훨씬 더 큰 염증성 세포가 침투되어 있었다 (화살표) (도 2의 e). Δpep27 정맥 주사 (iv) 로 감염시켜도 생쥐가 치사되지 않고 비강 감염 24 시간후에 Δpep27가 검출되지 않았음 (Kim et al., 2012)은 Δ비인두로부터 폐나 혈액내로 침입할 수 없음을 시사한다. 이 개념을 확인하기 위해 생쥐에 Δpep27을 i.n으로 감염시킨 후 감염 초기 단계의 균 집락 형성을 측정하였다.
구체적으로, D39 (5 x 103), Δpep27 (1 x 104) 또는 R6 (7 x 103)개를 생쥐 뇌정맥내로 주입(i.c.v.)하여 감염시키고 생균 수를 측정하였다. 누드 (T 세포 결함) 또는 SCID (B 및 T 세포 결함 모두) 생쥐 (n = 5)에 각각 1 x 104 개 및 1 x 107 개의 균을 복강 내 (i.p.) 또는 i.n. 감염시키고 생존시간을 측정하였다. 각 데이터 포인트는 생쥐 한마리를 나타낸다.
일관되게 Δpep27은 감염 3 시간 및 6 시간 후 혈액에서 검출되지 않아 신속히 제거되었으나 야생형은 시간이 지남에 따라서 혈액 내에서 크게 증가되어 전형적인 침투 / 패혈증 증세를 나타내었다 (데이터 미도시). 또한 정상생쥐 뿐만 아니라 누드 생쥐 (T 세포 결핍) 및 SCID 생쥐 (B 세포 및 T 세포 결핍 모두)와 같은 면역 손상 생쥐를 이용한 일련의 실험에서도 Δpep27은 침입하지 못하거나 독성이 없음을 입증하는 강력한 증거를 제공하였다 (도 2의 f 내지 h). 이런 결과들은 Pep27이 염증, 침입 및 패혈증에 필요함을 뒷받침한다.
도 2의 a 및 e를 제외하고, 데이터는 평균 ± 표준 오차 (3 회 실험 평균)를 나타낸다. * 그룹간 비교시 P <0.05 (일원 분산 분석). (e)는 적어도 3 번의 독립적인 실험 결과 중 대표적인 데이터이다.
Pep27은 감염 초기 단계에서 균 용해, 염증성 사이토카인 및 염증을 유도
폐렴구균은 용해되면 펩티도글리칸 (peptidoglycan)과 뉴몰리신 (pneumolysin) (주요 폐렴구균 독소)이 방출되어, 그로 인해 숙주세포가 파괴하고 염증을 유발한다 (Kadioglu et al., 2008). 이전 논문에서, Δpep27 (2 x 108개)을 생쥐에 정맥주사 하였을 때, 폐 및 비장에서 12 시간 이내에 신속하게 제거되었지만, 혈액 및 뇌에서는 검출되지 않았다 (Kim et al., 2012). Pep27은 용해를 유도하는 것으로 알려져 있기 때문에 (Novak et al., 2000), Δpep27에 의해 독성이 소실되는 것은 용균 내성과 그로 인해 염증이 감소되기 때문일 수 있다. 이런 가능성을 확인하기 위해 Δpep27의 용해를 측정하였다. Δpep27은 정체기에서조차도 자가분해가 지연되었다 (데이터 미도시). 용해 저항성을 확인하기 위해, 자가분해 유도제 (Avery and Cullen, 1923) 인 deoxycholate (DOC)를 배지에 첨가하고 용해를 측정하였다.
구체적으로, THY 배지에서 대수기까지 배양한 D39 야생형 (도 3 의 a 및 b) 및 pep27 결실 돌연변이체 (도 3의 c 및 d) 배양액에 혈청 및/또는 용해 유도제를 첨가하고 광학 밀도를 모니터링 하였다. 용해 유도제로 deoxycholate (DOC, 100 ㎍/mL)와 반코마이신 (0.4 ㎍/mL)을 사용하였다.
혈청 존재하에서 DOC 처리를 하면 야생형의 광학밀도 (OD)가 크게 감소되었으나 Δpep27은 감소되지 않았다 (도 3의 a 및 c). 일관되게, 반코마이신을 첨가하면 배양액의 OD가 감소되었다 (도 3의 b 및 d). 그러나, ΔvncR과 ΔvncS는 DOC 또는 반코마이신 처리에 의한 OD의 급격한 감소가 관찰되지 않았다 (데이터 미도시). 용해 저항성을 확인하기 위해, 폐렴구균의 주요 autolysin 인 LytA의 발현을 웨스턴 블랏 및 qRT-PCR로 분석하고, 여러 변이주의 생균수를 측정하였다. 실험 결과 Δpep27는 야생형보다 LytA 단백질 및 mRNA 발현이 현저히 손상되어 (데이터 미도시) Pep27이 LytA 발현을 조절한다는 것을 입증하였다.
모든 데이터는 최소 3 회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 표시하였다 (오차 막대는 여기 사용 된 기호보다 작음). * 그룹간 비교시 P <0.05 (일원 분산 분석).
생체 내에서 균 용해를 확인하기 위해, D39 야생형 (7 x 107 개) 또는 Δpep27 (1 x 108개)을 생쥐의 정맥내로 주입하고, 세균 수 및 균 용해를 측정하였다. 혈구와 결합된 세균은 원심분리하여 분리하였다.
구체적으로, CD1 마우스 (n = 3/그룹)에 야생형 (7 × 107개) 또는 Δpep27 (1 × 108 개)를 정맥 내 (i.v.) 감염시켰다. 혈액 샘플을 차별적으로 원심 분리하여 숙주 세포와 결합한 균 (펠렛) 또는 결합하지 않은 균 (상청액)으로 분리하고, 박테리아 수를 혈액 한천배지 (도 4의 a)에 도말하여 세었다. 용해된 세균을 검출하기 위해 16s rRNA를 프라이머로 사용하여 PCR로 염색체 DNA를 검출하였다 (도 4의 b). Balb/c 마우스 (n = 7 / 군)에 2 x 108 개의 폐렴구균 균주를 감염시킨 다음, 폐 균질물을 ELISA에 의한 사이토카인 측정에 사용하였다 (도 4의 c 내지 e).
야생형은 시간이 지남에 따라 현저히 증가되었으나 대조적으로 Δpep27은 주사 4 시간 후에 숙주세포와 결합된 세균을 함유하는 혈액 침전물에서는 검출되지 않았다. 일관되게, 야생형은 균이 계속 자라서 균수가 상당히 증가되었으며 이와 대조적으로 Δpep27는 주입 1 시간 후에 결합되지 않은 균을 포함하는 혈액 상등액에는 균이 없었다 (도 4의 a). 이런 결과는 Δ혈액 내에서 4 시간 이내에 신속히 제거되지만 야생형은 상당히 증가됨을 나타낸다. 용균된 세균은 상등액으로 염색체 DNA가 방출되기 때문에 모든 용균되지 않은 세균을 침전시킨 후 상등액 중의 염색체 DNA를 PCR로 검출하였다. 예상대로 야생형은 주사 4 시간 후에 상등액에서 모두 염색체 DNA가 검출되었으나 Δpep27 주사 시에는 염색체 DNA가 거의 검출되지 않았으므로 (도 4의 b) Δpep27이 신속하게 제거되고 용해에 비교적 내성인 것을 입증하고 있다. 용해 저항성을 뒷받침하기 위해, 패혈증 쇼크에서 관찰되는 호염증성 사이토카인 (Hotchkiss and Karl, 2003) 발현을 인후 감염후 측정하였다. 야생형 감염 6 시간 후에 사이토카인이 유의성 있게 유도되었으나 Δ사이토카인이 거의 유도되지 않았다 (도 4의 c 내지 e). 이와 대조적으로, Δpep27 감염시에는 생쥐가 한 마리도 죽지 않았지만 24 시간 후에는 야생형보다 현저히 높은 사이토카인 수준을 나타내었으므로 감염 초기 단계의 사이토카인에 의해 그 운명이 결정되는 것으로 보였다. 도 4의 b를 제외하고, 데이터는 4 개의 시료를 사용하여 3 회 반복실험하여 실험의 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 표시하였다. 그룹 간 비교에서 * P <0.05 (a : 일원 분산 분석, c - e : 양방향 분산 분석). 도 4의 b는 적어도 3 번의 독립적인 실험의 대표적인 프로파일이다.
VncS 리간드 및 락토페린 에 의한 vncRS, Pep27 및 용해 유도
혈청에 의한 vncRS 유도는 VncS가 혈청 성분을 감지하여 독성을 조절한다는 것을 나타낸다. 먼저 VncS 리간드를 스크리닝하기 위해 혈청을 3 차원 Sol-gel® bed에서 VncS와 함께 배양하였다. 이어서, VncS 리간드를 Sol-gel® bed로부터 해리시키고, SDS-PAGE를 수행하였다. 질량 분석을 실시하여 VncS 결합 단백질이 마크로글로불린, 트랜스페린 및 항-트립신임을 확인했다.
구체적으로, Sol-gel® 3 차원 상에 결합된 정제된 6His-VncS 단백질을 인간 혈청과 배양하여 리간드를 스크리닝하고, 이어서 결합된 리간드를 SDS-PAGE 및 질량 분석하였다. D39 야생형을 THY 배지에서 대수기까지 배양한 후 다양한 농도의 락토페린과 함께 5 분 (도 5의 b 및 c) 또는 30 mM 락토페린과 함께 일정 시간 (도 5의 d) 동안 배양하였다. 이후 웨스턴 블랏 (도 5의 b), qRT-PCR (도 5의 c) 또는 방출된 염색체 DNA 정량 (도 5의 d)에 사용하였고, 게놈 DNA (gDNA)를 대조군으로 사용하였다. 인간 혈청에 1 ㎍ 또는 5 ㎍의 LF 항체를 첨가하여 락토페린 (LF) 고갈시킨 인간 혈청을 준비한 후 D39 배지에 첨가하여 5 분간 배양하였다. mRNA 수준은 qRT-PCR로 측정하였다.
그러나 이들 단백질은 Sol-gel® bed 자체에는 결합하지 않았다 (도 5의 a). 이들 리간드로 추정되는 물질을 배양액에 첨가하고 Pep27이 유도되는지 측정하였을 때 락토페린 (LF)만이 Pep27 발현을 유도하여 (도 5의 b), LF가 VncS 리간드임을 제시하였다.
LF가 vncRS 오페론을 유도하여 균을 용해시키는지 확인하기 위해, LF를 배양액에 첨가하고 qRT-PCR 로 vncRS가 유도되는지 측정하였다. 예상한 대로 LF는 vncRS 오페론을 유도하였다 (도 5의 c). 더욱이, 배양액에 대한 LF를 첨가하면 균의 용해를 유도하고 염색체 DNA를 상등액으로 방출시켰다 (도 5의 d). LF가 VncS 리간드임을 확인하기 위해, LF 고갈된 혈청을 사용하여 vncRS 발현을 측정하였다. qRT-PCR 분석 결과 LF 결핍으로 vncRS 가 유도되는 현상이 소실되었다 (도 5의 e).
도 5의 c와 e를 제외한 모든 데이터는 최소 3 회의 독립적인 실험결과의 대표적인 것이다. 도 5의 c와 e에서 데이터는 4 개의 시료를 사용한 실험을 3 회 반복한 실험 데이터의 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 표시한 것 이다. * 그룹간 비교시 P <0.05 (일원 분산 분석).
LF가 생체 내에서도 VncS 리간드로 작용하는지 확인하기 위해, D39 (패혈증 모델)로 복막 내 (i.p.) 감염시키기 6 시간 전에 LF를 생쥐에게 경구 투여하고 생존율을 기록하였다.
구체적으로, 생쥐 (n = 15/그룹)에 감염 6 시간 전에 락토페린을 경구 투여한 후 치명적인 D39 (2 × 104 개) 균주를 복강 내 (i.p.) 주입하여 감염시키고, 생존율을 매시간 기록하였다. 또한, 락토페린 항체를 D39 (2 × 108 개) 감염 24 시간 전에 생체 내 (100, 200 및 400 ng/생쥐) i.p. 주입하고 이 주입량의 4 분의 1을 비강 내 투여한 후 (각각 25, 50 및 100 ng/생쥐) 생존율을 모니터링하였다.
LF를 생쥐에게 경구 투여한 결과 사망률이 유의하게 증가되었다 (도 6의 a). 일관되게, D39 감염 전 LF를 고갈시킨 생쥐에 비인두 감염시켰을 때 (폐렴 모델) 용량 의존적으로 사망률이 감소되었으므로 (도 6의 b) LF가 패혈증을 일으키는데 필요한 VncS 리간드임이 입증되었다. 데이터는 평균 ± 3 회 실험의 평균 표준 오차 (SEM)로 나타내었다. * 그룹간 비교시 P <0.05 (일원 분산 분석).
결과 분석
폐렴구균이 분해되면 면역계 및 염증 유발 사이토카인 생성을 유발하는 뉴몰리신, 세포벽 및 형질전환 DNA (Steinmoen et al., 2002)를 방출하며, 이들 물질은 면역계를 가동시키고 호 염증성 사이토카인 (proinflammatory cytokines) 생성을 유도하여 결국 염증과 사망을 초래한다 (Tuomanen et., 1995). Pep27에 대한 연구는 항생제 내성 및 항생제 의존성 용해에 초점이 맞추어졌었다 (Haas et al., 2004; Robertson et al., 2002; Novak et al., 2000). 반코마이신 내성 폐렴구균 균주는 선택적 항생제 압박 하에서 정체기에 pep27 발현을 억제함으로써 높은 항생제 농도에 견뎌내어 숙주에서 생존하여 항생제 치료가 실패하게 된다 (Olivares et al., 2011). 이전 논문에 의하면 시험관 내에서 인간 폐 표본에 감염 후 인간 폐 대식세포 및 폐 상피세포에서 폐렴구균 DNA가 검출되고 이어서 염증성 사이토카인 발현이 증가되었고 (Xu et al., 2008), 자가분해를 억제하면 식균작용과 사이토카인 생성이 방지될 수 있었다 (Martner et. al., 2009). 그러나 Pep27 자체는 사람의 적혈구에 어떠한 세포 독성도 나타내지 않았다 (Sung et al., 2007). 따라서 폐렴구균 감염시 사이토카인 분비와 염증은 균용해에 의존하는 것으로 보이며 pep27 돌연변이에 의한 용해 억제로 사이토카인 생산과 염증이 저해되어 독성이 약화되고 혈액 내 침투 및 패혈증 유도가 억제된다.
Δpep27과 유사하게 ftsY 돌연변이체는 비인두에 집락을 형성할 수 있었으나 야생형과 비교하였을 때 혈액 내 침입이 불가하고 숙주를 죽이지 않는 특성을 나타내어 ftsY 돌연변이체가 환경에 대한 감지 기능이 없어 혈액내로 전혀 침투할 수 없음을 나타낸다 (Rosch et al., 2014). 또한, ftsY 돌연변이체를 복강내로 주사하여도 패혈증을 유도하지 않았고 인후감염 시켜도 야생형보다 폐와 부비동 모두에서 염증을 일으킬 수 없었다 (Rosch et al., 2014). 그러나 기본적인 기전은 해결되지 않았다. 본원은, 패혈증과 깊은 상관관계가 있는 LF (Horl et al., 1990; Nuijens et., 1992; Zeerleder et al., 2003)가 첫번째로 들어오는 신호이며 전체 균수 중에서 작은 백분율 (<1 %)의 세균이 용해됨으로써 염증 및 패혈증 유도에서 중요한 역할을 하는 것을 밝혔다. 따라서, 전체에서 일부분만 용해되어도 백혈구 및 병원균을 동원하는데 충분한 염증반응을 제공하여 병원체의 확산, 패혈증 및 사망을 야기하는 것으로 생각된다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

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  6. (a) 폐렴구균에 시험물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 폐렴구균에 락토페린을 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 폐렴구균의 VncRS 오페론의 유도 여부를 측정하는 단계를 포함하는,
    패혈증의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 폐렴구균은 혈청형 D39를 포함하는 폐렴구균인 것인, 스크리닝 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 시험물질은 화합물, 미생물 배양액, 미생물 추출물, 핵산, 항체, 단백질, 펩타이드, 압타머 및 천연 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 스크리닝 방법.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 VncRS 오페론의 유도 여부를 측정하는 것은 폐렴구균의 용해를 측정하는 것을 포함하는 것인, 스크리닝 방법.
  10. 제 6 항에 있어서,
    무처리 대조군과 비교하여 상기 폐렴구균의 VncRS 오페론의 유도가 억제되는 경우에 상기 시험물질을 패혈증 예방 또는 치료제의 후보물질로 판단하는 것인, 스크리닝 방법.
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