KR20100034201A

KR20100034201A - ｓｐｒ0526, ｓｐｒ0527, 및 ｓｐｒ0528 유전자가 손상된 변이주를 이용한 폐렴구균을 치료하기 위한 약독화 백신 및이의 진단 방법

Info

Publication number: KR20100034201A
Application number: KR1020080093216A
Authority: KR
Inventors: 이동권; 권민경; 김은혜
Original assignee: 성균관대학교산학협력단; 대한민국(관리부서 질병관리본부장)
Priority date: 2008-09-23
Filing date: 2008-09-23
Publication date: 2010-04-01
Also published as: WO2010035954A2; WO2010035954A3

Abstract

본 발명은 폐렴구균이 인간 폐 세포 감염 시 발현되는 spr0526, spr0527, 및 spr0528의 유전자 기능이 손상된 돌연변이체를 이용한 백신 및 폐렴구균 진단 방법에 대한 것이다. 본 발명에 따라 이들 유전자 돌연변이체를 항원으로 사용하여 생쥐에 접종하였을 때 인후감염뿐만 아니라 전신감염 모델에서도 현저히 약독화 됨을 관찰할 수 있었다. 또한 본 발명에서 개발된 백신은 인후 접종하였을 때에 폐렴구균 질환을 예방할 수 있었다. 따라서 본 발명의 spr0526에서부터 spr0528의 일부를 포함하는 유전자의 돌연변이체는 신규한 폐렴구균 백신 및 진단, 치료제 개발에 이용될 수 있다.

폐렴구균, 백신, 약독화, spr0526, spr0527, spr0528 유전자, 돌연변이체

Description

ｓｐｒ0526, ｓｐｒ0527, 및 ｓｐｒ0528 유전자가 손상된 변이주를 이용한 폐렴구균을 치료하기 위한 약독화 백신 및 이의 진단 방법{Attenuated vaccine and diagnostic method thereof for treating Streptococcus pneumonia using mutants including mutated spr0526, spr0527, and spr0528 genes}

본 발명은 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)의 인간 폐 세포 감염시 발현되는 spr0526, spr0527 및 spr0528 유전자가 손상된 돌연변이체를 이용한 약독화 백신 및 이의 진단방법에 관한 것이다.

폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)은 형질전환 가능한 그램양성 세균으로서 사람 및 동물에서 다양한 감염증, 예를 들어 세균성 폐렴, 중이염, 균혈증, 및 수막염을 일으킨다[Willett, H. P. 1992. Streptococcus pneumoniae. In Zinsser Microbiology. Joklik, W.K., Willet, H.P., Amos, D.B. and Wilfert, C.M., (eds). Prentice-Hall International, London, pp. 432-442]. 폐렴구균에 의한 감염은 다제내성균의 등장으로 항생제에 의한 치료가 어려운 실정이다. 폐렴구균 감염증을 예방하기 위하여 현재 시판되고 있는 23가 다당류 백신[Pneumovax 23 (Merck) 및 Pnu-Imune 23 (Wyeth-Lederle)]은 협막 다당류(APS)를 유효 항원으로 하고 있으나 영유아에서는 항체 생성율이 낮아 효과가 없고 기억반응(memory response)이 없다는 단점이 있다. 이러한 23가 백신의 단점을 해결하기 위해 개발된 7가 콘쥬게이트 백신[Prevnar (Wyeth-Lederle사)]은 7종의 캡슐형 다당류(CPS)를 담체 단백질에 콘쥬게이션하여 제조한 것이나, 고가이고 95개 이상의 폐렴구균 중에서 단지 7가지 타입의 폐렴구균에 대해서만 방어효과가 있으므로 폐렴구균 감염증의 예방백신으로서 사용이 매우 제한적이다.

또한 현재 사용되는 폐렴구균 백신은 모두 피하 주사용(혈청 내 IgG 유도)이므로 인후점막으로 침투하는 폐렴구균을 초기에 효과적으로 방어할 수 없다.

따라서, 폐렴구균 감염증을 예방하기 위해 점막 백신이나 항원성이 높은 단백질을 이용한 백신을 개발하려는 시도가 이루어지고 있다. 폐렴구균의 독성 인자로서 숙주세포의 콜레스테롤과 결합하여 구멍을 내는 뉴모라이신(pneumolysin: Ply) 톡소이드가 알려져 있으며, 약독화된 뉴모라이신 (PdB)을 백신으로 개발하려는 시도가 있었다. 그러나, 뉴모라이신은 생체내 및 시험관내에서 독성이 매우 강하고, PdB 단독으로는 효과가 없어 다른 독성 인자들인 폐렴구균 표면 단백질 A(PspA), 콜린 결합 단백질(CbpA), 폐렴구균 표면 부착소 A(PsaA), LytA 등과 같이 투여하는 경우에만 폐렴구균 감염증에 대한 생존율이 증가하였다[Ogunniyi, A. D. et al., 2000, Immunization of mice with combinations of pneumococcal virulence proteins elicits enhanced protection against challenge with Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 68:3028-3033]. 이와 같이, 기존의 폐렴구균 감염증 예방 백신의 후보 항원 단백질들이 면역원성이 낮거나 모든 혈청형 에 대하여 방어효능을 갖지 못하며 주사용이므로 현재까지 인후점막에 작용하는 백신은 없는 상태이다. 따라서 감염초기에 인후점막에서 균의 침입을 방어할 수 있는 단백질 후보물질 또는 약독화 백신 개발이 요구된다.

폐렴구균은 건강한 개체의 비인두에 존재하며, 이것은 폐렴구균 감염증에 대한 주된 저장소이다. 폐렴구균은 생체내에서 다양한 환경적 스트레스를 받는다. 폐렴구균이 비인두에서 혈류로 침투하는 것과 같이, 숙주에서 환경적인 적소(niche)의 변화는 유전자 발현의 변화 뿐만 아니라 급격한 형태적인 변화를 유발한다(상변이: Phase variation). 예를 들어, 비인두의 폐렴구균은 주로 투명한 콜로니 표현형이며 소량의 협막 및 다량의 콜린 결합 단백질 A(CbpA)를 발현시키는 경향이 있는 것으로 입증되었다. 한편, 혈류 중의 폐렴구균은 주로 불투명한 콜로니 형태이며 다량의 협막 및 소량의 CbpA를 생성시키는 경향이 있다[Kim, J. O. et al., 1998, Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 177:368-377].

최근 STM(signature-tagged mutagenesis), 마이크로어레이(microarray) 및 게놈 기반 독력 유전자(genome-based virulence gene) 연구에서 폐렴구균을 복강내로 주사하거나 정맥내로 주사하여 유발되는 전신감염과 인후점막을 통해 감염시킬 경우에 각각 다른 유전자들이 발현되며[Hava & Camilli, 2002; Orihuela et al.,　 2003; Adamou et al.,　 2001; Paton et al.,　 2001; Polissi et al., 1998; Wizemann et al.,　 2001; Throup et al.,　 2000], 폐렴구균이 침투할 때 경유하는 조직 (인후- 폐 - 혈액- 뇌)에 따라서 특이한 유전자가 발현되었다[Orihuela et al., 2004; Hava & Camilli, 2002]. 또한 폐렴구균 감염시 혈액내에서 발현되는 유전자와 조직 내에서 발현되는 유전자가 다르며[Oggioni et al., 2006], 폐렴구균이 인간 폐 세포주를 침입할 때 혈청형에 무관하게 다당류 협막이 없어지고[Hammerschmidt S et al. 2005, Illustration of pneumococcal polysaccharide capsule during adherence and invasion of epithelial cells. Infect Immun 73:4653-67], 숙주세포에 부착하여 침입하기 위해 세포표면의 두꺼운 협막이 얇아지고 여러 인자들의 발현이 유도되었다[Bergmann S, Hammerschmidt S. 2006, Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152(Pt 2):295-303].

폐렴구균(Streptococcus pneumoniae) 은 인후부에서는 투명형(transparent type)으로 존재하지만 일단 혈액안으로 침투하면 불투명형(opaque type)으로 상전환을 한다. 블투명형과 투명형은 지방산 조성에 차이가 있으며[Aricha 등, 2004], 블투명형에서는 PspA 가 다량 발현되지만 투명형에서는 CbpA 와 LytA 가 다량 발현된다[Kim and Weiser, 1998 Rosenow 등, 1997; Weiser 등, 1996]. 불투명형에서는 연장인자(elongation factor) Ts 의 발현이 증가되지만 펩티딜-프롤릴 시스/트랜스 이성질화효소(peptidyl-prolyl cis/trans isomerase) 에 속하는 프로테이나아제 성숙 단백질(proteinase maturation protein)PrtM 과 피루브산 산화효소(pyruvate oxidase) SpxB 발현은 억제되었다[Overweg 등, 2000]. 한편 투명형에서는 프로테이 나아제 성숙 단백질 A(PpmA) 단백질 발현이 증가하여 폐렴구균의 표면에 존재하여 표면단백질 또는 분비되는 단백질의 성숙에서 중요한 역할을 한다. spxB-결핍 돌연변이체는 인후부에서 콜로니형성능이 감소되는데[Spellerberg B.,Cundell D. R., Sandros J., Pearce B. J., Idanpaan-Heikkila I.,Rosenow C., and Masure H. R., 1996. Mol. Microbiol. 19:803-813,1996] 그 이유는 인후부의 폐렴구균(투명형) 생장에 SpxB 가 필요하며 이때 SpxB를 이용하여 과산화수소를 생성하며 생활하기 때문이다[Overweg 등, 2000]. 그러나 현재까지 폐 세포 침입시 관련된 유전자 검색은 보고된바 없다. 따라서 본 연구는 폐렴구균이 인간 폐세포 침입시 유도되는 유전자를 검색하고 이들 유전자 돌연변이주가 in vivo 에서 독성이 현저히 감소됨을 입증한 최초의 보고이다. 폐 감염시 유도되는 유전자는 폐렴구균이 폐 세포를 침입할 때 상변이가 유도되어 다당류 협막이 없어지고[Infect Immun 2005;73:4653-67] 다른 여러 가지 인자들의 발현이 변화되므로 [Microbiol 2006;152: 295-303], 폐 세포 감염 시 유도되는 유전자 들은 상변이에 관여할 것으로 예상된다.

따라서, 본 발명자들은 폐렴구균이 인간 폐세포에 침입시에 유도되는 인자들을 발굴하여 이들 인자를 폐렴구균 질환 진단마커 개발, 이들 인자의 억제에 의한 폐렴구균 치료제 검색, 변이주를 약독화된 백신으로 개발하기 위하여 본 연구에 착수하였다. 먼저 폐렴구균이 인간 폐세포에 침입시에 유도되는 인자들을 마이크로어레이(microarray) 검색으로 발굴하였다. 또한 이들 유전자의 발현을 역전사(RT)-PCR 로 재확인한 후 이들 유전자의 변이주를 구축하여 생장 특성, 데옥시콜레이 트(deoxycholate) 및 항생제에 의한 용혈반응(용균)을 측정하였다. 또한 실험관내에서 인간 폐세포주에 대한 세포독성 및 용혈반응을 측정하여 약독화됨을 확인하였으며 생쥐를 이용한 전신 및 인후 감염 모델에서 약독화됨을 재확인하였고 변이주에 의한 면역화가 독성 폐렴구균에 의한 인후 접종(challenge)에 대해 마우스를 보호할 수 있는지 여부를 평가함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 약독화된 생백신으로서 폐렴구균의 손상된 spr0526, spr0527 및 spr0528 유전자를 포함하는 돌연변이체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 또한 폐렴구균 spr0526, spr0527 및 spr0528에 의해 암호화되는 단백질 및 돌연변이체를 약독화된 생백신을 면역학적 유효량으로 사람 또는 동물에 투여하여 사람 또는 동물을 폐렴구균 감염증에 대해 면역화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 spr0527 유전자의 발현 여부를 확인하여 폐렴구균 감염 여부를 진단하는 키트 및 이의 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 spr0526(GenBank accession number NP_358120), spr0527(GenBank accession number NP_358121) 및 spr0528 (GeneBank accession number NP_358122) 유전자의 기능을 손상시키는 폐렴구균 돌연변이 유발용 DNA 및 돌연변이 유발용 DNA를 제조하기 위 한 서열번호 2 내지 7로 표시되는 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 상기 돌연변이 유발용 DNA가 도입되어 형질전환된 폐렴구균 돌연변이체를 제공한다.

상기 돌연변이체는 폐렴구균 전체 유전자의 534172번부터 535222번까지가 결실된 것이 바람직하다.

돌연변이체 제작를 위한 폐렴구균은 D39를 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 돌연변이체를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 폐렴 구균 치료용 백신 조성물을 제공한다.

상기 백신으로 사용하기 위해 spr0527유전자로 코딩되어 있는 펩타이드를 제공한다.

상기 백신 조성물은 복강 또는 인후 점막을 통해 투여할 수 있다.

인후 점막을 통한 백신화는 에어로졸 또는 점적 전달 시스템 형태를 사용할 수 있다.

상기 백신 조성물은 세균성 폐렴, 중이염, 균혈증 또는 수막염 등의 폐렴구균 감염증의 면역화에 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 spr0527 유전자의 단편, 이들로부터 유래되는 펩타이드 및 펩타이드에 대한 항체로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나를 포함하는, 폐렴구균 진단용 키트를 제공한다.

또한, 폐렴구균 감염시 발현량이 증가하는 것이 특징인, 폐렴구균 감염 진단 용 바이오 마커 spr0527 유전자를 제공한다.

또한, 사람 또는 동물로부터 채취한 세포에 대하여 spr0527 유전자 가 발현 여부를 확인하여 폐렴구균 감염여부를 진단하는 방법을 제공한다.

상기 폐렴구균 감염여부를 진단하기 위해서 웨스턴 블롯, RT-PCR 및 실시간 PCT(real PCR)방법을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 폐렴구균 spr0526, spr0527 및 spr0528의 일부를 포함하는 유전자를 이용한 백신은 감염시 폐렴구균에서 유도되는 단백질을 표적으로 돌연변이체를 제작하여, 모든 폐렴구균형에 적용 가능한 백신이며, 인후점막으로 침투하는 폐렴구균을 초기에 효과적으로 방어할 수 있는 인후점막에 작용하는 백신이다. 또한 폐렴구균 감염시 과발현되는 0527 를 포함하는 유전자 및 이들로부터 유래되는 펩타이드 및 이러한 펩타이드의 항체는 폐렴구균의 진단에 이용될 수 있다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이하 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 기술된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.

하기 실시예의 실험결과에 대한 통계학적 분석은 student’s　 t-test (paired or unpaired Student's t test) 을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 제시된 데이터는 2개 내지 4개의 독립 실험에 대한 평균 ± 표준 편차이다. 군간의 평균 생존 시간의 차이는 만-휘트니 U 검정(양측) (2-tailed)에 의해 분석하였고, 군간의 전체적인 생존율의 차이는 피셔의 정확 검정 (Fisher Exact test)에 의해 분석하였다. (P < 0.05;*, P < 0.01; **, P < 0.001; ***)).

실시예

실시예 1: 폐렴구균 감염시 유도되는 과발현 유전자 검색

i) 세균, 세포주, 실험동물 및 형질전환

본 실시예에서 사용된 폐렴균은 표 1 에 명시된 균주들을 사용하여 실험하였다. 폐렴구균 균주 D39(타입 2) 및 이로부터 유래된 돌연변이체를 토드 휴이트 (Todd Hewitt: THY) 브로쓰에서 배양했다.

D39 균주의 형질전환을 위해 카시톤-트립톤(Casitone-Tryptone: CAT) 기본 배지에서 지수성장기의 중간 단계까지 배양했다: CAT 기본배지 1L는 10 g 효소 카세인 가수분해물(enzymatic casein hydrolysate) (Difco Laboratories, USA), 5 g 트립토판(Difco Laboratories), 1 g 효모 추출물 (Difco Laboratories), 5 g NaCl, 5 mg 콜린(choline) (Sigma, USA), 0.2 % 글루코오스(Sigma, USA), 16.6 mM 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate)(Sigma, USA) 를 함유하였다. CAT 브로쓰에 리터당 147 mg의 CaCl₂ 및 2 g의 우태아 혈청(분획 V; Sigma)을 첨가하여 완전한 형질전환 배지를 제조하였다. 컴피턴스(competence)를 컴피턴스 특이적 펩티드의 첨가에 의해 조절하고 종래 문헌[Havarstein, L. S.et al., 1995,An unmodified heptadecapeptide pheromone induces competence for genetic transformation in Streptococcus pneumoniae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:11140-11144]에 기술된 바와 같이 배양 배지에서 세포를 DNA에 노출시킨 후 수득한 에리스로마이신 저항성 형질전환체로서 정량화하였다. 협막 균주 D39(타입 2)를 뇌 심장 주입 브로쓰(Difco Laboratories, USA) 또는 토드 휴이트(Todd Hewitt) 브로쓰(Difco Laboratories, USA) 에서 성장시키고 종래 문헌[Bricker, A. L. et al., Transformation of a type 4 encapsulated strain of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol. Lett.172:131-135]에 기재된 바와 같이 형질전환시켰다. 폐렴구균 형질전환체를 선별하기 위하여, 에리스로마이신 을 성장 배지에 각각 2.5㎍/ml 의 농도로 첨가하였다.

ii) 인간 폐 세포배양

인간 폐 상피암종 A549(ATCC CCL-185) 세포주(ATCC TIB-71)를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 구입하고 이들을 37℃에서 5% CO₂하에 배양시켰다. A549 세포를 글루코오스 4.5㎍/L, 10% 우태아 혈(FBS; Gibco BRL, Gaithersburg, Md.), 및 페니실린 G 100U/ml, 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)(Gibco BRL, Gaithersburg, Md)에서 배양시켰다. 감염실험에 사용된 생쥐는 4주령의 ICR mouse(Orient, Korea) 수컷을 사용 하였다.

iii) 독성 시험

독성이 매우 강한 협막 타입 2 균주(D39) 및 이의 동종유전자형 돌연변이체로 복강내(i.p.) 또는 인후 접종을 수행하여 폐렴구균의 독성에 미치는 표적 유전자의 돌연변이의 영향을 평가하였다. 세균을 10% [vol/vol] 말혈청을 가한 뇌 심장 주입 한천(Difco Laboratories, USA) 또는 토드 휴이트(Todd Hewitt) 한천(Difco Laboratories, USA)(필요에 따라 에리스로마이신 보충)상에서 밤새 37℃에서 배양한 다음 혈청 브로쓰(10% [vol/vol] 말혈청을 가한 뇌 심장 주입 브로쓰(Difco Laboratories, USA) 또는 토드 휴이트Todd Hewitt) 브로쓰(Difco Laboratories, USA)) 에서 37℃에서 3시간 동안 성장시켜 약 10⁸ CFU/ml의 세균 배양물을 수득했다 [Ogunniyi, A. D.et al., 2000]. 다음 각 세균 배양물을 혈청 브로쓰로 희석하거나 농도를 조절하여 10마리의 CD1 마우스군을 0.1 ml 부피의 D39, 또는 돌연변이체로 복강내 감염시키거나 10 ul 의 D39 또는 돌연변이체로 인후 감염시켰다. 접종된 마우스의 생존여부를 처음 5일 동안은 1일 4회, 다음 5일 동안은 1일 2회, 접종후 21일째까지는 매일 모니터링하였다.

표 1. 본 발명에 사용된 폐렴구균 계통

계통	관련특성	공급원 또는 문헌
CP1200 △hrcA	MalM511 str1 △lacZ :: ermB Em ^r	Kim　 et al., 2001
D39	Encapsuled, type2 parent, S type	Avery et al., 1944
MK0527R	D39 △vex3, pep27, vncR :: ermB Em ^r

※ Em^r : 에리스로마이신 내성 (Erythromycin resistance)

※ ermB 카세트(cassette) 삽입 방향; R, 역방향 ; S, 동일방향

iv) RNA 분리 및 Microarray 분석

Orihuela 등 (2004)의 방법을 사용하여 폐렴구균으로 감염된 A549 세포로부터 세균의 RNA 를 분리 하였다. 즉 DMEM 배지에서 배양한 4 x10⁸　 CFU/mL 폐렴구균을 인간 폐세포주 A549(4 x10⁶, MOI 100:1)에 감염시킨 다음 37 °C에서 10 분 또는 2 시간 배양하였다. 일정시간 후에 세포에 부착되지 않은 균을 세척하여 제거하고 세균 RNA를 보호하기 위해 RNAprotect™(Qiagen, Valencia, Calif.)액을 첨가한 상태에서 세포를 수확하여 5 분간 초음파 세척기(Sonorex ultrasonic cleaners Model RK52H, Bandelin, Germany)를 사용하여 세균은 깨지지 않고 세포만 깨진 상태로 만든다. 이 세포 용해액을 800 g에서 5 분간 원심 분리하여 세포의 잔해를 제거하고 4,600g에서 10분 원심분리하여 세균을 수확한다. RNeasy minikit™(Qiagen)을 사용하여 펠렛(bacterial/eukaryotic pellet)으로부터 RNA를 분리한다. 진핵 유래 RNA(Eukaryotic RNA)를 제거하기 위해 펠렛으로부터 MICROBEnrich™(Ambion, Austin, Tex.)를 사용하여 세균 RNA을 증폭(enrich)하고 여기서 분리된 RNA를 OD260 에서 O.D를 측정하여 정량 한 후 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기 영동하여 RNA의 상태를 점검하였다.

분리된 RNA를 마이크로어레이(microarray)분석하기 위해 A549 세포에 감염시키지 않은 폐렴균을 대조군으로 사용하여 독성이 있는 폐렴구균 D39 을 인간 폐 세포주 A549에 10분, 2시간 감염시킬 때 발현 변화되는 폐렴구균 전사체를 폐렴구균 유전자 칩 마이크로어레이(Genomic Tree, Korea )를 이용하여 분석하였다.

실시예 2: 폐렴구균 돌연변이체의 제작

Rubin 등(2004)의 방법을 사용하여 폐렴구균 염색체 DNA를 D39 균주와 hrcA 균주로부터 분리하였다. PCR에 의한 돌연변이를 일으키는 DNA 절편(mutagenic DNA fragment)을 작성하기 위하여, 폐렴구균 표적 유전자의 일부를 탈락시키고 대신 ermB(에리스로마이신(erythromycin)에 저항성인 유전자 카세트)로 치환시킨 DNA 절편을 PCR 방법으로 작성하고 이렇게 작성된 DNA 절편을 폐렴구균에 형질전환시켜 돌연변이체를 얻었다. 즉 폐렴구균 유전자의 중간부분을 제거하고 대신 에리스로마이신 저항성 유전자(ermB)가 삽입된 돌연변이체를 본 연구실에서 이미 구축된 Tripartite PCR 방법[Kwon 등, 2003; Lau 등, 2002]으로 제작하였다. 이를 위해 폐렴구균 염색체 DNA를 주형으로 사용하여 타겟 유전자의 중간부위를 제외한왼쪽 팔(left arm)과 오른쪽 팔(right arm)부위를 증폭시키고 ermB 유전자가 발현되는 hrcA 돌연변이체의 염색체 DNA를 주형으로 사용하여 ermB 유전자(860 bp)를 증폭시켰다(표 2). 이때 사용되는 타겟 유전자 왼쪽 팔 DNA 절편의 3’말단의 프라이머는 ermB의 5’말단 프라이머 시퀀스를 완전히 포함하도록 제작하였으며 타겟 유전자 오른쪽 팔 DNA 절편의 5’말단 의 프라이머는 ermB 의 3’ 말단 프라미어 시퀀스를 완전히 포함하도록 제작하여 1 차 PCR 반응결과 얻어진 DNA 절편은 타겟 유전자 왼쪽 팔 DNA 절편의 3’ 말단 와 ermB　 5’말단 서로 오버랩되어서, ermB 3' 말단 와 타겟 유전자 오른쪽 팔 DNA 절편의 5’말단이 서로 중첩되는 구조물이 얻어지도록 하였다. 따라서 두 번째 PCR 반응은 3 개의 DNA절편, 즉 타겟 유전자 왼쪽 팔, ermB, 타겟 유전자 오른쪽 팔 DNA 절편을 하나의 튜브에 넣고 이미 사용했던 타겟 유전자 왼쪽 팔 DNA 절편을 확보하는데 사용했던 5‘ 프라이머와　 오른쪽 팔 DNA 절편을 확보하는데 사용했던 3’ 프라이머를 다시 이용하여 PCR 반응을 함으로써 3개의 DNA 절편이 하나로 연결되게 제작하였다 (도 1, 표 3).

작성된 돌연변이성 DNA 템플레이트(template)를 컴피턴스　 스티뮬레이팅 펩타이드-1(competence stimulating peptide-1)을 이용한 Havarstein 등의 방법 (1995)으로 폐렴구균에 형질전환하여 에리스로마이신 1 ug/ml 포함된 CAT 아가(agar)에서 에리스로마이신 저항성인 콜로니를 선별하였다. 선별된 에리스로마이신 저항성인 돌연변이체가 올바른 결실 부분을 함유하고 있는지 확인하기 위해 콜로니(colony) PCR 을 실시하였다. 참고로, 제작된 돌연변이체는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호:KCTC 11375BP).

표 2. ermB 카세트(cassette) 증폭산물(amplicon) 시퀀스

ermB　 orientation	Direction : 5’ → 3’	서열번호 또는 Ref
Reverse orientation　 F	ACGCACGAACCTGTCGGATCAA	Kim et al., 2001
Reverse orientation　 R	CTCAGACTTTTCAGGAGTTGTTTC	Kim et al., 2001
Same orientation　 F	AGTCGGCAGCGACTCATAGAAT	2
Same orientation　 R	CCGGGCCCAAAATTTGTTTGAT	3

※ F, Forward primer ; R, Reverse primer

표 3. 돌연변이체 제작을 위한 프라이머 시퀀스

Primer sequence (5’ → 3’)/ MK0527R		서열번호
L up	tctctatcag cctcaagcag	4
L dn	atcaaacaaa ttttgggccc ggttgaagca agcgccataa cg	5
R up	attctatgag tcgctgccga ctgacggatt gtggctatga	6
R dn	gtatcgtagt agcgcttg	7

※밑줄 친 부분은 에리스로마이신(ErmB) 카세트 위치의 상보적인 뉴클레오티드 시퀀스임. L, 왼쪽 팔 프라이머 ; R, 오른쪽 팔 프라이머

실시예 3: 돌연변이체의 특성 측정

1) 돌연변이체의 특성 측정 방법

적혈구 용혈능 측정 [Lock RA et al., 1996]

돌연변이체의 적혈구 용혈능을 측정하여 야생형에 비해 독성이 어느 정도 약화되었는지 Lock 등의 방법(1996)으로 측정하였다. 즉 돌연변이체를 THY 브로쓰에 OD550 0.3에 도달할 때 까지 배양후 원심분리하여 모아진 균체를 라이시스 버퍼(용균 buffer) (50 mM Tris-Cl, 1 mM DTT, 0.1% Triton X-100)로 현탁시키고 1 mM PMSF와 0.1 % 데옥시콜릭 산 (DOC)를 가하고 37 °C에서 5 분간 배양 후, 초음파처리하여 세포를 부순다. 샘플을 원심분리한 후에, 상층액을 회수하고 연속적으로 희석시켰다. 96웰 마이크로타이터 플레이트에 1.5%의 세척된 양(sheep) 또는 말(horse) 적혈구의 등량과 함께 인큐베이션하여 용혈 활성을 결정하였다. 용혈 역가는 540 nm에서 적혈구 50%가 용해되는 추정 희석도의 역수로 결정하였다[Lock, R. A. et al., 1996, Sequence variation in the Streptococcus pneumoniae pneumolysin gene affecting haemolytic activity and electrophoretic mobility of the toxin. Microb. Pathog. 21:71-83].

MTT 분석에 의한 세포독성 측정 [Smirnov, 1999]

돌연변이체에 의한 세포독성을 측정하기 위해 살아있는 세포의 미토콘드리아 탈수소효소(mitochondrial dehydrogenase)와 MTT 시약이 반응을 하여 푸른 색(formazan)을 형성하는 원리를 이용하는 MTT 어세이(assay) [Smirnov, 1999]를 이용하였다. 즉 96 웰(well)에 A549 세포(human lung cell)을 1 x 10⁴ 세포을 함유하도록 시딩(seeding)하여 모노레이어 (monolayer)가 형성되면 항생제가 함유되지 않은 DMEM 배지로 교체하고 1 x 10⁶ CFU의 폐렴균으로 감염(MOI 100: 1) 시킨다. 감염 4시간 후 항생제가 함유된 DMEM배지로 교체한 후 ELISA 리더기(Reader)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

데옥시콜레이트(DOC, Deoxycholate) 및 항생제에 의한 자가분해(자가분해)

흡광도가 0.3 ~ 0.4 인 돌연변이체 배양액에 0.05 % 데옥시콜릭 산(deoxycholic acid) 또는 항생제를 첨가하여 배양할 때 550 nm에서 흡광도 변화 또는 생균수를 측정하였다.

ELISA 어세이(assay)

항체의 역가를 측정하기 위해 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA) 어세이(assay)를 하였다. 즉 돌연변이체로 면역화 시킨 마우스의 혈청 또는 타액을 군별로 풀링하고 D39 또는 돌연변이체 의 전체 세포 용해물(cell lysate)로 코팅된 ELISA 플레이트를 이용하여 역가를 측정한다. 즉 돌연변이체 세포융해체(cell lysate)를 500 ng/ml의 농도로 TPBS와 혼합하여 96 웰에 코팅하고 37 °C 인큐베이터에서 1시간 동안 1 % BSA로 블로킹(blocking)하고 세척 후, 1차 항체를 다단희석 하여 37 °C 인큐베이터에서 1시간 배양후 다시 세척하고 2차 항체인 IgG-HRP 와 반응시킨 다음 발색 시약인 TMB를 가하여 반응시켰을 때 나타나는 흡광도를 540 nm에서 ELISA 리더기(Softmax, USA)로 측정하였다.

2) 돌연변이체의 특성 측정 결과

i) 인간 폐세포 감염시 유도되는 폐렴구균 유전자 돌연변이체의 생장 특성

인간 폐세포주 A549 에 D39 야생형 균주를 감염시키고, 10분, 2시간 후 RNA를 각각 분리 하여 마이크로어레이를 수행하였을 때 대조군에서는 발현되지 않고 D39에 감염되었을 때 발현되는 유전자 중 3 배 이상 발현이 증가된 유전자(표 4)를 선택하여 그중 일부 유전자에 대해 RT-PCR로 유전자 발현을 재차 확인하였다(도 2).

표 4. 마이크로어레이에 의해 선택된 A549세포에 감염시 발현되는 폐렴구균 유전자

유전자 명칭	10분 감염	2 시간 감염	기능
spr0527 (pep27)	9.97	97.08	VncR/S에 의해서 신호가 인지되는 분비단백질
Spr0528 (VncR)	18.40	18307	사이토플라스믹 이펙터(cytoplasmic effector) 인 응답 조절자(response regulator) vncR

각각의 돌연변이체의 생장 곡선을 측정하였을 때 MK0527R 은 야생형보다 정지기(stationary phase)가 약 2시간 이상 연장되어 정지기에서도 자가분해 가 지연되었다 (도. 3).

ii) 항생제에 의한 용균

일부 돌연변이체 는 정지기 에 도달후에도 사멸이 지연되었으므로 이를 재차 확인하기 위해 항생제 첨가시의 자가분해를 측정하였다. 즉 폐렴구균은 항생제 페니실린(penicillin) G에 의해 자가분해가 유도되므로 페니실린 G　 첨가시 생장곡선을 측정하였으며 (도 4), 이를 재차 확인하기 위해 D39 야생형 균주를 세팔로스포린(Cephalosporin) 계열 항생제인 세포탁심(cefotaxime)을 첨가하였을 때 용균 되 는 속도를 측정하였다. 배양액에 세포탁심을 첨가 후 흡광도를 측정하였을 때 흡광도가 절반으로 감소되는 시간은 D39의 경우 90분이었으나, MK0527R의 경우는 오히려 자가분해 에 저항성을 나타내어 흡광도가 절반으로 감소되는데 110분이 소요되었다(도 5).

iii) 데옥시콜릭 산(DOC) 에 의한 자가분해

폐렴구균은 DOC 에 민감하게 자가분해 되므로 항생제에 의한 자가분해 저항성을 재확인하기 위해 0.05% DOC 첨가시, 균 용해 속도를 측정하였다. DOC 첨가 후 흡광도가 절반으로 감소되는데 소요되는 시간을 측정하였을 때 야생형 240초, MK0527R 은 270초였다. (도 6).

또한 DOC를 첨가하고 생균수를 측정하였을 때, 야생형 D39는 DOC처리 5분 후 10개가 관찰되었고, MK0527R 돌연변이체 는 DOC처리 40분 후에도 1 X 10³개 이상의 생균수가 관찰 되어DOC 에 대한 저항성을 나타내었다(도 7).

iv) 돌연변이체의 적혈구 용혈능 측정

돌연변이체 가 약독화되었는지 규명하기 위해 적혈구 용혈능을 측정하였다. 감염시 심한 세포손상을 유도하는 야생형의 경우 세포손상으로 인해 많은 헤모글로빈 이 방출되어 흡광도가 증가되어 OD₅₅₀에서 0.29 를 나타내었으며, 이 수치를 100%로 하였을 때, MK0527R 돌연변이체 균주의 경우 용혈능력이 현저히 감소되어 야생형의 63 % 와 55 %를 나타내었다(도8).

　 v) MTT 어세이(assay)를 이용한 세포독성 측정

돌연변이체 균주의 인간 폐 세포(human lung cell) A549 에 대한 세포독성을 측정하기 위해 살아있는 세포의 미토콘드리아 탈수소효소가 MTT 시약과 반응하여 푸른색(formazan)을 형성하는 원리를 이용하여 세포 독성을 정량하였다(도 9). D39는 다른 돌연변이체 균주보다 독성이 강해 흡광도가 0.477로 나타났다. 그러나 돌연변이체 MK0527R 은 D39보다 13 % 증가되어 세포독성이 감소되었음을 나타내었다.

　 vi) 각 돌연변이체 의 LD ₅₀

돌연변이체의 백신 안전성을 확보하기 위해 각각의 돌연변이체의 생쥐에 대한 치사량을 측정하였다. 전신감염 모델(복강 주사) 및 인후 감염 모델에서 50% 치사량은 표 5과 같다. 인후 감염일 경우 야생형 D39보다 MK0527R은 25배 이상 감소 되었고, 전신 감염의 경우 10⁴배 이상 독성이 감소되었다. 특히 MK0527R균주의 경우, 너무 약독화 되어 LD₅₀를 측정시 1 X 10⁹CFU 이상으로 투여해야 하기 때문에 정확한 치사량 측정이 불가능하였다.

표 5. 돌연변이체의 LD₅₀

돌연변이체 명칭	Injection type	LD₅₀	Fold attenuation^※
MK0527R (0526, 0527, 0528 유전자 결손)	인후 접종	>5 X 10⁸	>25
MK0527R (0526, 0527, 0528 유전자 결손)	복강내 접종	>1 X 10⁸	>1 X 10⁴
D39	인후 접종	2 X 10⁷	1
D39	복강내 접종	10⁴	1

※Fold attenuation : 돌연변이체의 LD₅₀　/ 야생형의 LD₅₀　

실시예 4: 백신 효과 측정

1) 백신 효과 측정 방법

전신감염 모델에서 백신효과 측정

마우스를 종래 문헌[Ogunniyi, A. D. et al, 2000]에 기재된 바에 따라 복강내 면역시켰다. 약독화 된 돌연변이체균주를 2주에 한번 LD₁₀정도의 균수(대략 1 X 10⁶∼ 1 X 10⁷)로 3회 복강내 면역시켰다. 3차 접종이 끝나고 2 주후 면역화 된 mouse 의 안와후방 출혈에 의해 마우스로부터 혈청을 채취하였다. 최종 면역후 2주째에 면역된 마우스를 매우 독성인 협막성 타입 2 균주 (D39)로 복강내 접종시켰다. 접종 실시 전에, 면역 세균을 혈액 한천상에서 밤새 37℃에서 성장시킨 다음, 육류 추출 브로쓰(뇌 심장 주입 브로쓰, Difco Laboratories, USA) 또는 토드 휴이트 (Todd Hewitt) 브로쓰(Difco Laboratories, USA))에 10% (v/v) 양 혈청을 첨가한 혈청 브로쓰에 접종시켰다. 다음, 세균을 37℃에서 3시간 동안 정적으로 성장시켜 약 10⁸CFU/ml의 세균을 얻고, 접종물을 접종 용량당 1 X 10⁴ CFU로 조정하였다. 혈청타입 특이적 협막 생성은 슈타텐스 세럼인스티튜트(Statens Seruminstitut, Copenhagen, Denmark)로부터 구입한 항혈청을 사용하여 팽창 반응(quellung reaction)에 의해 확인하였다. 접종 실시 후에, 마우스를 처음 7일 동안 4시간 마다 모니터링한 다음, 21일까지는 매일 모니터링하였고, 각 마우스의 생존 시간을 기록하였다.

인후 감염 모델에서 백신효과 측정

약독화된 돌연변이체 균주를 2주에 한번씩 LD₁₀정도의 균수(대략 1 X 10⁷ ∼ 1 X 10⁸)로 3번 인후 점막에 감염시켜 면역화 하고 마지막 접종 2 주후에 독성이 있는 D39 균주를 3 X 10⁷ CFU로 인후 감염하였을 때 상기와 같이 생존시간을 측정하였다.

2) 백신 효과 측정

i) 각 돌연변이체의 in vivo 약독화 측정

각각의 돌연변이체 가 약독화 되었는지 재확인하기 위해 돌연변이체감염 후 생쥐의 생존시간을 측정하였다. 즉 D39와 돌연변이체를 1 X 10⁴ CFU로 복강 주사하고 생존시간을 측정하였을 때 MK0527R돌연변이체의 경우 한 마리도 죽지 않아 1 X 10⁴ CFU 에서 독성이 현저히 감소되었음을 확인하였다(P<0.0001) (도 10).

전신감염모델로 사용된 복강 내 접종은 폐렴구균의 정상적인 감염경로가 아니므로[Salyers AA and Whitt DD, 1994] 폐렴구균을 2 X 10⁷으로 인후 접종후 생쥐의 생존률을 측정하였다. D39 는 생존시간이 111시간이었고 MK0527R은 현저히 약독화되어 감염 후 2주 동안 모두 한 마리도 죽지 않아 독성이 현저히 감소됨을 나타냈다(P<0.001) (도 11).

ii) 전신 면역화(Intraperitoneal immunization) 후의 항체 역가 및 방어

In vitro 와 in vivo실험 결과 약독화된 균주 MK0527R을 10마리 생쥐를 한 군으로 하여 복강 내로 1 X 10⁶∼1 X 10⁷CFU로 2주 간격으로 3번 면역화하고, IgG 항체 역가를 측정하였을 때 MK0527R 은 6400이었다.

마지막 접종 후 10 일째에 독성이 있는 D39를 2 X 10⁴CFU로 전신 접종(intraperitoneal challenge)하였을 때 D39와 MK0527R 은 생존시간이 각각 30 시간, 29 시간(P>0.05)이었다.

　 iii) 인후 면역화(Intranasal immunization)후의 항체역가 및 방어

인후 감염에 대한 백신 효과를 측정하기 위해 약독화된 MK0527R을 1 X 10⁷∼1 X 10⁸CFU 로 2 주 간격으로 3 회 인후 접종하고, 마지막 3번째 접종일로부터 10일 후 독성이 있는 야생형 인 D39균주를 3 X 10⁷CFU로 인후 접종(intranasal challenge) 하였을 때 MK0527R 돌연변이체로 면역화된 생쥐는 평균 생존율이 현저히 증가되었다(P<0.05) (도 13).

D39 균주(type 2)의 pep27(spr0527) 유전자 핵산 염기서열을 BLAST 검색하면 R6 균주와는 100% 일치하며 Hungary19A-6, TIGR4(type 4)와는 96% 동일하였으므로 폐렴구균 내에서 유사성이 높을 것으로 예상된다. pep27은 반코마이신(vancomycin) 내성 유전자 VncR/S 오페론의 일부로서 17개의 폴리펩티드로 구성되어 있으며(84개의nucleotide) 막결합 히스티딘 단백질 키나아제(membrane-bound histidine protein kinase)인 vncS 와 사이토플라스믹 이펙터(cytoplasmic effector)인 응답 조절자(response regulator) vncR 에 의해 발현이 조절되어 폐렴구균의 세포사멸을 유도한다[Novak et al., 2000]. Pep27은 막투과(membrane permeablization)에 중요한 역할을 하며 항암 효과가 있다[Lee　 et al., 2005]. 또한 MK0527R 돌연변이체 는 야생형 보다 용혈반응이 37 % 감소하였고, MTT 어세이(assay)에서도 세포독성이 13 % 감소하였다. 또한 In vivo 에서도 전신감염 모델에서 10⁴ 배, 인후 감염 모델에서 25 배 독성이 약화되었다.

폐렴구균은 DOC 에 의해 자가분해 효소 LytA 발현을 유도하여 자가분해 되어[Chastanet A et al., 2001] lytA 의존적으로 뉴모라이신(pneumolysin)을 방출하므로[Mitchell TJ et al., 1997], 야생형 보다 MK0527R (vex3-pep27-vncR 유전자 탈락) 돌연변이체가 용균이 느리게 진행되는 것은 이들 유전자 돌연변이에 의해서 자가분해가 억제됨을 나타내고 있다. 특히 인 비트로(in vitro)에서 DOC 처리 5 분 후 야생형은 모두 용혈 되지만 MK0527R돌연변이체 는 40 분 후에도 10³CFU 의 생균수를 나타내어 균의 용해가 현저히 느리게 일어남을 입증하고 있다. 폐렴구균이 용균(lysis)되면 폐렴구균의 주된 독소인 뉴모라이신을 비롯한 세포내 여러 가지 성분 이 방출되어 숙주세포를 파괴할 뿐만 아니라 세포벽 성분인 리포테이코익산(lipoteichoic acid)는 염증을 유발한다[Jedrzejas MJ, 2001]. 따라서 이들 돌연변이체 에서 용균이 억제되는 것은 생쥐 감염모델에서 현저히 독성이 감소되는 결과와 일치한다. 특히 Pep27 은 LytA 의존 및 독립으로 용균을 유도하므로[Novak 등, 마우스] pep27 돌연변이체가 약독화된 것은 LytA 에 의한 용균작용을 억제하기 때문으로 추정되지만 다른 2 개의 돌연변이체 는 어떤 기전으로 약독화되는지 더 규명되어야 할 것이다.

MK0527R 돌연변이체 는 LD₅₀를 측정할 수 없을 만큼 약독화 되어 1 X 10⁸으로 복강 주사하여도 모두 생존하였다. 따라서 이들 돌연변이체를 약독화 균주로 사용하여 3 차례 복강 내 접종하였을 때 IgG 항체가 생성되었으나 낮은 방어효과를 나타내었다. 즉 마우스(mice)의 평균생존 시간이 MK0527R 돌연변이체 는 대조군과 차이가 없었다. 그러나 MK0527R 돌연변이체를 인후 접종시에는 유의성 있게 방어효과를 나타냈다. 이런 현상은 MK0527R 돌연변이체를 복강내 접종(전신감염) 시에 유도된 IgG 항체에는 복강내로 challenge 된 D39 에 대한 방어 항체 성분이 함유되지 않았지만 MK0527R 돌연변이체를 인후 접종시에 생성된 항체 성분에는 D39 에 대해 방어 성분이 함유되어 방어효과를 나타낸 것을 제시한다. 따라서 이런 결과는 다음과 같은 가설로 설명될 수 있을 것이다. D39 를 THY 액체배지에서 배양하면 대부분이 불투명형으로 존재하며 복강내로 접종하더라도 바로 혈액내로 유입되어 불투명형으로 계속 생존하게 되므로 상변이가 유도되지 않는다. 그러나 D39 균주를 인후 감염시키면 인후부에서는 투명형으로 존재하다가 일단 혈액내로 침투하면 불투명형으로 상변이가 유도된다. 따라서 인후 감염은 상변이 관련 단백질 발현을 유도하지만 전신(복강내) 감염은 상변이를 유도하지 않을 것이다. 본 연구에서 폐 세포 감염시 유도되는 유전자들은 아마도 상 변이에 관련된 유전자일 가능성이 있으며 따라서 이들 유전자 돌연변이체는 상변이가 일어나지 않아 불투명형(또는 투명형) 상 태로 계속 생장하여 용균에 저항성을 나타내면서 세포안으로는 침투하지 못하게 된다. 또한 이들 돌연변이체 에 대한 항체는 모두 불투명형(또는 투명형) 에 대해 작성된 것이므로 인후감염시 혈액안으로 침투한 불투명형(또는 투명형) 폐렴구균 을 효과적으로 방어하지만 투명형(또는 불투명형)은 직접 방어하지 못할 것으로 생각된다.

종합 해보면 폐렴균에서의 0526, 0527, 및 0528 의 유전자가 결손된 돌연변이는 오토라이신(autolysin)발현에 양성 조절자(positive regulator)로써 작용하여, 돌연변이가 일어난 균주에서는 용균 가 억제되어서 세포독성(cytotoxicity)이 감소된 것으로 생각된다.

본 발명에 따른 폐렴구균 감염시 유도되는 유전자는 폐렴구균 감염 진단 시약 바이오마커(biomarker)로 사용될 수 있으며 이들 유전자를 돌연변이 시키면 약독화되므로 약독화 백신으로 사용 가능하다. 또한 이들 유전자 산물의 구조를 확인하면 특이적인 억제제의 개발이 가능하여 새로운 치료제 개발이 가능하다. 특히 현재까지의 모든 백신은 주사용이지만 본 연구 결과는 주사의 통증이 없이 인후점막에서 균을 방어할 수 있어서 효과적으로 폐렴구균 감염증에 대한 면역 보호효과를 나타낼 수 있다.

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도 1은 본 발명에 따른 삽입 결실 돌연변이의 개략도이다.

도 2는 A549세포에 폐렴구균 감염 후 유도되는 유전자의 mRNA 농도를 나타낸 도면이다.

도 3는D39와 그것의 돌연변이체의 생장을 나타내는 도면이다.

도 4돌연변이체의 페니실린에 의해 유도된 자가분해의 그래프이다.

도 5는 돌연변이체의 세포탁심(Cefotaxime)에 의해 유도된 자가분해의 그래프이다.

도 6은 돌연변이체의 DOC에 의해 유도된 자가분해의 그래프이다.

도 7은 DOC처리 후, 돌연변이체의 생존율을 나타낸 그래프이다.

도 8은 돌연변이체의 적혈구 용혈능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 9는　A549세포에 대한 돌연변이체의 세포독성을 MTT 어세이로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 10은 복강 내 감염 후, 돌연변이체의 약독화 측정 결과를 나타낸 도면이다.

도 11은 인후 감염 후, 돌연변이체의 약독화 측정 결과를 나타낸 도면이다.

도 12는 전신 접종 후, 생쥐의 생존시간을 측정한 그래프이다.

도 13은 인후 접종 후, 생쥐의 생존시간을 측정한 그래프이다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Attenuated vaccine and diagnostic method thereof for treating Streptococcus pneumonia using mutants including mutated spr0526, spr0527 and spr0528 genes <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1490 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 1 tctctatcgg cctcaagcag gcaagtatct tgggtcaatt catcaccgaa tctatcttga 60 ttgctatccc tgctctagtt tctgcttact tcctagctaa ttacactgcc cgtgcaattg 120 gaaacactgt ccttgccaat gtgacttcag gtgttgccaa acaggctagt aaggcggctc 180 aagcctctaa ccttggtggt ggtgcagaag tagatggctt tagcaagacc ttgtcgagcc 240 tagacatttc tattcagaca tcagacttta tcatcatttt tgtccttgcc ttggttctag 300 tggttctcgt tatggcgctt gcttcaactg ggcccaaaat ttgtttgatt tgtatcttaa 360 aattttgtat aataggaatt gaagttaaat tagacgctaa aaatttgtaa ttaagaagga 420 gtgattacat gaacaaaaat ataaaatatt ctcaaaactt tttaacgagt gaaaaagtac 480 tcaaccaaat aataaaacaa ttgaatttaa aagaaaccga taccgtttac gaaattggaa 540 caggtaaagg gcatttaacg acgaaactgg ctaaaataag taaacaggta acgtctattg 600 aattagacag tcatctattc aacttatcgt cagaaaaatt aaaactgaat actcgtgtca 660 ctttaattca ccaagatatt ctacagtttc aattccctaa caaacagagg tataaaattg 720 ttgggagtat tccttaccat ttaagcacac aaattattaa aaaagtggtt tttgaaagcc 780 atgcgtctga catctatctg attgttgaag aaggattcta caagcgtacc ttggatattc 840 accgaacact agggttgctc ttgcacactc aagtctcgat tcagcaattg cttaagctgc 900 cagcggaatg ctttcatcct aaaccacaag taaacagtgt cttaataaaa cttacccgcc 960 ataccacaga tgttccaggt aaatattgga agctatatac gtactttgtt tcaaaatggg 1020 tcaatcgaga atatcgtcaa ctgtttacta aaaatcagtt tcatcaagca atgaaacacg 1080 ccaaagtaaa caatttaagt accgttactt atgagcaagt attgtctatt tttaatagtt 1140 atctattatt taacgggagg aaataattct tgagtcgctg ccgactagac ggattgtggc 1200 tatgaaacta ttgaggcagc ggacggtcag gaagctctgg agcaattttc tagctatgag 1260 gtggccctgg ttttactgga tatccagatg cccaagctta acggcttaga agttctagct 1320 gagattcgta aaaccagtca ggttcctgtc ttgatgttga cagcttttca ggatgaggaa 1380 tacaagatga gtgcctttgc ctctttggca gatggctatc tggaaaaacc tttctccctc 1440 tccctcttaa aagtgagggt ggacgcgatt ttcaagcgct actacgatac 1490 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The forward primer for erm cassette <400> 2 agtcggcagc gactcataga at 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The reverse primer for erm cassette <400> 3 ccgggcccaa aatttgtttg at 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The forward primer for left arm <400> 4 tctctatcag cctcaagcag 20 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The reverse primer for left arm <400> 5 atcaaacaaa ttttgggccc ggttgaagca agcgccataa cg 42 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The forward primer for right arm <400> 6 attctatgag tcgctgccga ctgacggatt gtggctatga 40 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The reverse primer for right arm <400> 7 gtatcgtagt agcgcttg 18

Claims

spr0526. spr0527, 및 spr0528 유전자의 기능이 손상된 폐렴구균 돌연변이체.
제1항에 있어서, 결실되는 부위는 폐렴구균 전체 유전자의 534172번부터 535222번까지임을 특징으로 하는 폐렴구균 돌연변이체.
서열번호 1로 표시되는 spr0526, spr0527, 및 spr0528유전자의 기능을 손상시키는 폐렴구균 돌연변이 유발용 DNA.
제3항의 돌연변이 유발용 DNA를 제조하기 위한 서열번호 2 내지 7로 표시되는 프라이머 세트.
제 3항의 DNA가 도입되어 형질전환된 폐렴구균 돌연변이체 .
제1항, 제2항 및 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 폐렴구균은 D39임을 특징으로 하는 돌연변이체.
제 1항, 제2항, 및 제 5항 중 어느 하나의 항의 돌연변이체를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 폐렴 구균 치료용 백신 조성물.
제 7항에 있어서, 복강을 통하여 백신화시키는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 7항에 있어서, 인후 점막를 통해 점막에 투여하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제9항에 있어서, 에어로졸 또는 점적 전달 시스템의 형태로투여하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제7항에 있어서, 사람 또는 동물을 폐렴구균 감염증에 대해 면역화시키기 위한 것임을 특징으로 하는 백신 조성물.
제11항에 있어서, 폐렴구균 감염증이 세균성 폐렴, 중이염, 균혈증 또는 수막염임을 특징으로 하는 백신 조성물.
spr0527 유전자의 단편, 이들로부터 유래되는 펩타이드 및 펩타이드에 대한 항체로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나를 포함하는, 폐렴구균 진단용 키트.
폐렴구균 감염시 발현량이 증가하는 것이 특징인, 폐렴구균 감염 진단용 바이오 마커 spr0527 유전자.
사람 또는 동물로부터 채취한 세포에 대하여 spr0527 유전자 가 발현 여부를 확인하여 폐렴구균 감염 여부를 진단하는 방법.
제15항에 있어서, 웨스턴 블롯, RT-PCR 및 실시간 PCT(real PCR)방법으로 단백질 또는 유전자의 발현 여부를 진단하는 방법.
폐렴 구균에 대한 백신으로 사용하기 위한 제 14항의 유전자로 코딩되어 있는 펩타이드.