KR102643701B1 - 형질전환 불능 폐렴구균 변이주 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents
형질전환 불능 폐렴구균 변이주 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본원은 pep27 유전자 및 comD 유전자의 돌연변이를 포함하는 형질전환능이 제거된 약독화된 폐렴구균 균주, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 폐렴구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
Description
본원은 pep27 유전자 및 comD 유전자의 돌연변이를 포함하는 형질전환능이 제거된 약독화된 폐렴구균 균주, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 폐렴구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
폐렴구균 (Streptococcus pneumoniae, pneumococcus)는 비 운동성 그람 양성 다당류 협막을 갖고 있는 균이다. 폐렴구균은 인간의 상부 호흡기에 정상세균총으로 공생하고 있다가, 인후감염뿐만 아니라 폐렴, 패혈증 및 수막염과 같은 다수의 침입성 질환을 유발한다. 폐렴구균으로 인한 사망률은 세계에서 가장 높고 (1-3), 2010년 411,000명이 2015년 335,000 명의 5 세미만 영아가 사망하여 (4) 폐렴구균은 "모든 사람들의 죽음의 수장"으로 보고되었다 (5).
현재 판매되고 있는 폐렴구균 23가 다당류 백신 (PPV23) 및 폐렴구균 접합백신 (PCVs) 은 폐렴구균 질병을 어느 정도 효과적으로 방어하고 있다 (6). 그러나 PPV23는 2 세 미만의 어린이에서 항체 생산을 유도하지 못할 뿐만 아니라, 전 연령대에서도 급성 중이염 (AOM)과 부비동염을 효과적으로 예방하지 못하였다 (7). PPV23 및 PCV 백신 접종은 백신에 포함된 다당류 혈청형만 방어하며 혈청 면역글로불린 G (IgG)가 생산되어 침입성 질환인 수막염이나 패혈증과 같은 침입성 질환을 예방한다 (8). 그러나 PPV23와 PCV 는 폐렴구균이 인후 점막 표면에서 집락 형성을 억제하는 IgA 항체를 유도하지 못하기 때문에 중이염과 폐렴을 방어할 수 없었다 (7, 9, 10). 최근 인플루엔자 바이러스 감염 후 2 차 폐렴구균 감염모델에서 PCV13 백신에 포함된 혈청형의 폐렴구균 감염을 효과적으로 방어하지 못함이 밝혀져 (11) 현재 사용되는 백신이 인플루엔자 바이러스 유행시에는 폐렴구균을 제대로 방어할 수 없음을 제시하였다. 따라서 이러한 문제점을 극복하고 90 가지 이상의 혈청형 (serotypes)을 갖고 있는 폐렴구균 (pneumococcus)을 광범위하게 방어하기 위해서는 기존 백신보다 개선된 백신이 필요한 실정이다.
폐렴구균 독성인자 중 하나인 pep27은 폐렴구균의 병인에 크게 기여하는 LytA-의존적인 용해뿐만 아니라 LytA-비의존적 용해에도 매개하여 균의 사멸에 관여한다 (12). 종래의 보고에 따르면 폐렴구균 pep27 유전자 돌연변이는 비강 감염 후 독성이 완전히 없어지고 24 시간 이내에 폐와 혈액으로 침입하지 못하고 신속하게 제거되었다. 또한 폐렴구균 혈청형에 무관하게 방어 효과를 나타내었다. 뿐만 아니라 pep27 변이주의 접종에 의해 사이토카인의 생산이 촉진되고 장시간 후에도 면역력을 나타내는 효과를 나타내었다 (13). 특히, 최근 pep27 변이주는 인플루엔자 전염병 발생시 폐렴구균 2 차 감염도 예방하였다 (14). 그러나 폐렴구균은 형질전환 능력이 잘 발달되어 있어서 (15) 약독화 Δpep27 변이주도 형질 전환을 통해 야생형 (WT)으로 복귀되어 독성을 나타낼 수 있다는 문제점이 여전히 존재하였다.
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본원에서는, 형질전환이 불가능한 폐렴구균 변이주를 제작하여, pep27의 돌연변이로 약독화된 폐렴구균이 야생형으로 복귀될 수 없도록 함으로써 약독화된 폐렴구균 균주의 안전성을 확보하고자 하였으며, 이를 이용하여 폐렴구균 및 기타 호흡기 질환을 예방 및 치료할 수 있는 약제학적 조성물을 제공하고자 하였다. 구체적으로는, 독성을 나타내는 pep27 외에도 폐렴구균의 형질전환에 필수적인 유전자 comD를 무력화함으로써, pep27과 comD의 발현이 모두 결핍된 폐렴구균 변이주를 제작하고 이의 안정성을 확인하고자 하였다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, pep27 유전자 돌연변이 및 comD 유전자 돌연변이를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주를 제공할 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 폐렴구균 균주의 염색체 DNA에서 pep27 유전자 및 comD 유전자를 돌연변이 시키는 단계를 포함하는, 약독화된 폐렴구균 균주의 제조방법을 제공할 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 제 1 측면에 따른 약독화된 폐렴구균 균주를 포함하는, 호흡기 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현 예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.
본원발명은, 형질전환능이 저하되거나 제거되어 야생형으로 복귀할 수 없는, 안전성이 높은 약독화된 폐렴구균 균주, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약제학적 조성물을 제공할 수 있다. 본원발명에 따른 약독화된 폐렴구균 균주는 pep27 유전자 돌연변이 외에도, 형질전환에 필수적인 유전자인 comD의 돌연변이를 포함함으로 인해 형질전환능이 제거되었음이 실험적으로 입증되었다. 또한, 본원발명에 따른 약독화된 폐렴구균 균주는 혈청형이 확인된 폐렴구균 균주뿐만 아니라 혈청형을 식별할 수 없는 폐렴구균 균주에 대해서도 방어능을 나타내었으며, 다양한 사이토카인 분비를 증가시킴으로써 폐렴구균에 의한 감염질환 외에도 원래의 변이체 (parental strain)인 pep27 변이주의 특성은 유지되어 다른 호흡기 질환의 예방 또는 치료 효과를 제공할 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 본원의 일 실시예에 따른 형질전환 불능 Δpep27 균주 구축 공정의 개략도이며, 도 1d는 이에 의해 구축된 균주를 확인한 결과이다.
도 2a 내지 도 2h는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 형질전환 불능 Δpep27ΔcomD 변이주의 정상 및 면역기능 부전 생쥐에서의 안전성을 확인한 실험 결과이다.
도 3a 내지 도 3d는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 Δpep27ΔcomD를 이용한 면역화에 의한 IgG 역가 상승 및 혈청형 비특이적인 방어 유도를 확인한 실험 결과이다.
도 4a 내지 도 4c는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 Δpep27ΔcomD의 접종이 폐렴구균 혈청형에 무관하게 균 집락 형성을 억제하였음을 보여주는 실험 결과이다.
도 5a 및 도 5b는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 Δpep27ΔcomD 접종이 사이토카인 분비를 증가시켰음을 보여주는 실험 결과이다.
도 6a 내지 도 6e은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 Δpep27ΔcomD 의 접종이 감염으로부터의 장기간의 면역을 제공하였음을 보여주는 실험 결과이다.
도 7은 Δpep27ΔcomD 면역화에 의해 호중구의 식세포 활성이 증가하였음을 보여주는 실험 결과이다.
도 8a 및 도 8b는 Δpep27ΔcomD 접종에 의해 다양한 호흡기 병원체 감염 방어가 가능함을 보여주는 실험 결과이다.
도 2a 내지 도 2h는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 형질전환 불능 Δpep27ΔcomD 변이주의 정상 및 면역기능 부전 생쥐에서의 안전성을 확인한 실험 결과이다.
도 3a 내지 도 3d는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 Δpep27ΔcomD를 이용한 면역화에 의한 IgG 역가 상승 및 혈청형 비특이적인 방어 유도를 확인한 실험 결과이다.
도 4a 내지 도 4c는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 Δpep27ΔcomD의 접종이 폐렴구균 혈청형에 무관하게 균 집락 형성을 억제하였음을 보여주는 실험 결과이다.
도 5a 및 도 5b는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 Δpep27ΔcomD 접종이 사이토카인 분비를 증가시켰음을 보여주는 실험 결과이다.
도 6a 내지 도 6e은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 Δpep27ΔcomD 의 접종이 감염으로부터의 장기간의 면역을 제공하였음을 보여주는 실험 결과이다.
도 7은 Δpep27ΔcomD 면역화에 의해 호중구의 식세포 활성이 증가하였음을 보여주는 실험 결과이다.
도 8a 및 도 8b는 Δpep27ΔcomD 접종에 의해 다양한 호흡기 병원체 감염 방어가 가능함을 보여주는 실험 결과이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "폐렴구균"은 폐구균 또는 폐렴쌍구균(Streptococcus pneumoniae)이라고도 명명되는 그람양성(Gram-positive) 세균으로서, 시간이 지나 분열함에 따라 균들이 계속 이어져 사슬 모양이 되는 것이 관찰되어 연쇄상구균과로 분류되며, 폐렴의 주요 원인으로 알려져 있다.
본원 명세서 전체에서, "pep27" 은 27 개의 폴리펩타이드로 구성되어 있으며 vex 전달체(transporter)에 의해 분비되어 생장억제 및 세포 사멸(apoptosis)을 유도하는데, 구체적으로는 막-결합 히스티딘 단백질 카이네이즈(membrane-bound histidine protein kinase)인 vncS 및 세포질 효과기(cytoplasmic effector)인 반응 조절자(response regulator) vncR에 의해 발현이 조절되어 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다(Novak et al., 1999). pep27 유전자 또는 그로부터 코딩되는 단백질은 폐렴구균의 혈청형 마다 다른 이름으로 명명되기도 하며, pep27의 유전자 서열 또는 이의 펩타이드 서열의 미차가 존재할 수 있으나, 상기 기술한 바와 같이 본 발명의 pep27 유전자는 실질적으로 pep27과 동일한 기능을 수행하는 유전자이면 혈청형에 제한되지 않고 이를 손상시킴으로서 본 발명의 약독화된 폐렴구균 균주를 제조할 수 있다. 바람직하게 상기 pep27 유전자와 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 폐렴구균의 유전자를 모두 포함한다. 더욱 바람직하게 본 발명의 pep27 유전자는 서열번호 1로 표시되는 pep27 펩타이드의 아미노산을 코딩하는 유전자가 돌연변이됨으로써 손상될 수 있다.
본원 명세서 전체에서, "약독화"란 독성 있는 균주가 변형 전보다 덜 독성 있는 균주거나 약한 병원균이 되는 방식으로 변형되는 것을 의미하며, 이러한 균주는 숙주안에서 여전히 복제 분열될 수 있는 동안, 임상적 질병을 유발할 수 있는 능력이 현저히 감소된 것을 말한다. 바람직하게 본 발명의 약독화된 균주는, 독성 또는 병원성이 백신용으로 투여를 허용할 수 있을 정도로 감소된 균주이며, 더욱 바람직하게는 균주가 숙주 내에서 여전히 복제할 수 있으면서도 임상적 질병을 유발할 수 없는 정도까지 약독화시키는 것을 의미한다. 또한 약독화 돌연변이는 본 발명의 약독화 돌연변이를 제조하기 위한 다양한 방법, 예를 들어 점 돌연변이, 연관된 바이러스 사이의 서열 교환, 또는 뉴클레오티드 결실에 의해 달성될 수 있다.
본원 명세서 전체에서, "돌연변이"는 유전자의 유전적 기능을 변화시키는 모든 행위를 의미하며, 구체적으로는 유전자의 돌연변이는 생물의 여러 가지 변이 중 유전자의 양적 또는 질적인 변화에 의해 생긴 변이를 말한다. 즉, DNA 염기 중 하나 이상이 다른 염기로 치환된 분자 수준의 변화, 즉, DNA의 하나 또는 다수 염기의 치환, 결실, 부가, 역위, 중복 또는 염기 중 1~2개의 삽입 또는 결실에 따른 염기배열의 이동(frame shift)과 같은 분자 수준의 변화를 통해 그 DNA가 갖는 유전정보에 따라 제조되는 효소나 펩타이드가 만들어지지 않거나 활성이 소실되는 변화가 나타나는 것을 의미하는데, 본원의 돌연변이 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 돌연변이 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 바람직하게 본원의 돌연변이는 해당 위치의 유전자가 돌연변이됨으로써 단백질의 기능을 손상시킨 돌연변이이며, 바람직하게는 유전자의 결실 또는 삽입에 의해 제조될 수 있다. 구체적으로 본원의 돌연변이체는 pep27 및/또는 comD 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키거나 외부 유전자를 삽입시킴으로써 제조할 수 있다. 구체적인 돌연변이 방법 및 부위는 당업자의 적절한 선택에 따라 이루어질 수 있다.
본원 명세서 전체에서, "예방"이란 조성물의 투여에 의해 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "치료"란 조성물의 투여에 의해 이미 유발된 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "백신"이란 감염 질환을 예방하기 위한 면역을 위하여 쓰이는 항원으로서, 약독화시킨 미생물 또는 바이러스로 제조되며, 특정 감염증에 대해 인공적으로 면역원성을 획득하기 위하여 약화시키거나 사멸시킨 병원 미생물을 개체 내에 투여하는 것을 의미한다. 백신에 의해 자극을 받으면 개체 내의 면역 시스템이 작동하여 항체를 생성하게 되고, 그 감수성을 유지하다가 재감염이 일어나는 경우, 빠른 시간 내에 항체를 효과적으로 생성함으로써 질환을 극복할 수 있게 된다. 다만 본원발명에 따른 약독화된 폐렴구균을 포함하는 백신은 면역관용 원리에 의하여 기존의 백신과 달리 특정 항원 성분에 대한 방어만이 아니라 바이러스 및 세균 감염성 질환을 포함하는 광범위한 질병의 예방 및 치료 효과를 가질 수 있다.
본원 명세서 전체에서, "ermB" 는 매크로라이드(macrolide)에 내성을 가질 수 있게 하는 유전자를 의미하며, 매크로라이드는 폐렴구균의 치료에 있어서 페니실린의 대체 약제로 사용되어져 온 것으로 에리스로마이신(erythromycin), 클라리스로마이신(clarithromycin), 아지스로마이신(azithromycin) 등이 여기에 속한다.
이하, 본원의 약독화된 폐렴구균 균주를 포함하는 약제학적 조성물, 및 이의 염증성 질환, 호흡기 바이러스 감염 또는 세균 감염성 질환의 예방 또는 치료를 위한 용도에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 1 측면은, pep27 유전자 돌연변이 및 comD 유전자 돌연변이를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주에 관한 것이다.
본원의 약독화된 폐렴구균 균주는, pep27 유전자 돌연변이를 가지는 약독화된 폐렴구균 균주를 이용한 Δpep27 백신의 안전성을 추가로 확보하기 위해, 폐렴구균의 형질전환을 유도하는 중요한 단백질 중 하나인 comD를 불활성화함으로써 특히 점막백신으로서 안전성이 확보된 이중 변이주 (Δpep27ΔcomD)를 구축한 것이다. Δpep27ΔcomD를 동물에 접종하면 이종 혈청형 폐렴구균으로 감염시켜도 동물의 생존 시간을 증가시킬 수 있고, 혈청형을 식별할 수 없는 폐렴구균 균주 (예를 들어, NCC1)를 포함하는 다양한 유형의 폐렴구균 균주에 의한 감염시에도 균의 증식을 효과적으로 억제할 수 있다. 더욱이, 본원의 약독화된 폐렴구균 균주는 형질 전환 능력이 제거되었으므로 정상적인 동물 및 면역이 손상된 동물에서도 안전하게 사용될 수 있다. 즉, 상기 약독화된 폐렴구균 균주는 돌연변이에 의해 pep27 및 comD 유전자의 기능이 상실 내지 제거된 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 pep27 유전자는 서열번호 1로 표시되는 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 comD 유전자는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 pep27 유전자 돌연변이 또는 comD 유전자 돌연변이는 치환, 결실, 부가, 역위, 중복, 삽입 및 교체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 의해서 유발된 것일 수 있고, 그러한 돌연변이로 인해 comD 유전자의 기능이 상실, 불활성화, 감소 내지 차단될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 약독화된 폐렴구균 균주는 pep27 유전자 또는 comD 유전자의 일부 또는 전부가 결실되거나, 외부 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약독화된 폐렴구균 균주는 서열번호 1로 표시되는 pep27 유전자 핵산서열의 1번 내지 53번이 결실된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 약독화된 폐렴구균 균주는 서열번호 1로 표시되는 pep27 유전자 핵산서열의 1번 내지 53번의 결실 및 ermB 카세트로 치환한 돌연변이를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주일 수 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1252911호에 개시된 pep27 돌연변이를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약독화된 폐렴구균 균주는 서열번호 2로 표시되는 comD 유전자 핵산서열의 554번 내지 857번이 결실된 것이다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약독화된 폐렴구균 균주는 서열번호 2로 표시되는 comD 유전자 핵산서열 내부에 외래 유전자가 삽입된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 여기서 상기 외래 유전자는 당업계에 알려진 유전자일 수 있고, 구체적으로 선별을 위한 항생제 저항 유전자 또는 추후 comD 유전자의 일부와 함께 제거가 용이하도록 제작된 인공 서열일 수 있으나 이에 제한되지 않을 수 있으며, comD 유전자의 기능을 저하 내지 상실시킬 수 있는 외인성 유전자 중에서 특별한 제한 없이 선택될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약독화된 폐렴구균 균주는 형질전환능이 저하되거나 제거된 것이다. 이러한 형질전환능의 제거는 comD 유전자의 기능 상실로 인한 것일 수 있다.
본원의 일 실시예에 따른 폐렴구균 균주는 2017. 09. 12. 자로 한국종균협회에 기탁되었으며, 에리스로마이신에 저항성인 TL△pep27△comD::ermB 균주는 KCCM12106P, 항생제 내성 마커가 없는 TL△pep27△comD 균주는 KCCM12105P의 수탁번호로 기탁되었다.
본원의 제 2 측면은, 폐렴구균 균주의 염색체 DNA에서 pep27 유전자 및 comD 유전자를 돌연변이시키는 단계를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주의 제조방법에 관한 것이다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 돌연변이가 치환, 결실, 부가, 역위, 중복, 삽입 및 교체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 상기 약독화된 폐렴구균 균주를 포함하는 호흡기 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 호흡기 감염 질환은 폐렴구균 감염 질환 이외에도, 폐렴구균 외의 세균성 호흡기 감염질환 또는 바이러스성 호흡기 감염질환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 약제학적 조성물은 호흡기 감염 질환 예방용 백신 조성물일 수 있다.
예를 들어, 상기 세균성 호흡기 감염 질환은 그람 양성균 감염성 질환, 그람 음성균 감염성 질환 및 기타 감염성 세균 질환으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 세균 감염성 질환의 예방 또는 치료는 그람 양성균 및/또는 그람 음성균의 감염 억제에 따른 효과일 수 있다. 예를 들어, 상기 그람 양성균은 포도상구균, 연쇄상구균, 파상풍균 및 탄저균으로부터 선택되고, 상기 그람 음성균은 살모넬라균, 이질균, 폐렴간균, 대장균 및 콜레라균으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 그람 양성균은 황색포도상구균일 수 있다.
예를 들어, 상기 바이러스성 호흡기 감염질환은 메타뉴모바이러스, 코로나바이러스, 엔테로바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 아데노바이러스, 보카바이러스, 리노바이러스 및 인플루엔자 바이러스로부터 선택되는 바이러스에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 바이러스성 호흡기 감염 질환의 예방 또는 치료는 바이러스의 복제 억제에 따른 효과일 수 있다. 예를 들어, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 형, B 형 또는 C 형일 수 있으며, 구체적인 아형의 종류에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 본원의 약제학적 조성물은 바이러스 비특이적 방어 기능도 제공할 수 있는데, 이 경우 인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스 (Respiratory syncytial virus) 및 코감기 바이러스 (Rhinovirus)를 포함하는 바이러스에 대한 방어 기능도 제공할 수 있다. 이러한 비특이적 방어는 다양한 사이토카인 분비 촉진에 의해 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 호흡기 감염 질환은 인두염, 후두염, 편도염, 급성기관지염, 폐렴 및 만성호흡기 병변의 2차 감염을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 호흡기 감염 질환이 폐렴구균 감염 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 약제학적 조성물은 폐렴구균에 혈청형-비의존적으로 면역화시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 혈청형-비의존적으로 면역화시키는 약제학적 조성물은 항원에 특이적으로 항체를 생산하는 것이 아니라, 항원에 무관하게 항체를 생산하여 면역반응을 일으키는 약제학적 조성물을 의미한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 폐, 비장, 혈액 또는 뇌에 비침습성일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 "비침습성"이란 직접적으로 약제학적 조성물이 투여되는 기관, 조직, 및 세포 이외에 전신의 다른 영역으로 약제학적 조성물이 침투되지 않거나, 혹은 침투되더라도 빠르게 제거되는 것을 의미하며, 이는 약제학적 조성물이 투여되는 기관, 조직, 및 세포 이외에 전신의 다른 영역으로 침투되어 인체에 손상을 미치는 침투성과 반대되는 의미이다. 용어 "투여"란 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본원발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본원발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 경막 내, 점막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 복강내 또는 점막내로 투여하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 점막의 위치는 특별히 제한되지 않으며, 당업계에서 점막 투여를 위해 사용되는 신체 위치들 중에서 당업자가 적절히 선택하여 투여할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 인후 점막내로 투여하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 인후 점막을 통한 백신화는 예를 들어 에어로졸 또는 점적 전달 시스템 형태를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원발명에 따른 약제학적 조성물을 투여할 수 있는 개체는 특별한 제한이 없으며, 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본원발명에 따른 조성물의 유효 투여량의 범위는 성별, 체표면적, 질환의 종류 및 중증도, 연령, 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 배출비율, 투여시간, 치료기간, 표적세포, 발현 수준 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 면역 보조제를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 담체로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원발명에서 사용될 수 있는 면역보조제로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 면역보조제가 제한 없이 사용될 수 있으며, 상기 면역보조제는 cholera toxin binding unit, aluminum salts, lipid emulsion (MF-59), synthetic detergent (Tween), microspheres, liposomes, mucoadhesive polymers 등을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이 분야의 새로운 제형이 개발되고 있는바, 이들 또한 사용될 수 있다.
본원발명에 따른 약제학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되고, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있으며, 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않을 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 스프레이제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함될 수 있으며, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않을 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예]
1. 재료 및 방법
1.1. 세균 균주
본 실시예에서 사용된 균주는 아래의 표 1에 제시되어 있으며, 각각의 폐렴구균은 Todd-Hewitt 브로스(broth)에서 37℃에서 0.5% 효모 추출물 (THY; Difco Laboratories)를 첨가하여 배양하였다.
| 균주 (혈청형) | 출처 또는 참고문헌 |
| D39 (2) | (35) |
| ST180 (3) | 삼성서울병원 (Samsung Medical Center) |
| NCCP10225 (4) | 대한민국 질병관리본부 (Korea Centers for Disease Control & Prevention) |
| BG7322 (6A) | 삼성서울병원 |
| KUI (10A) | 고려대병원 (Korea University Hospital) |
| ST83 (15) | 삼성서울병원 |
| ST320 (19A) | 삼성서울병원 |
| ST4467 (19F) | 삼성서울병원 |
| ST880 (23F) | 삼성서울병원 |
| NCC1 (혈청형 식별불가) | (36) |
| ST1160 (혈청형 식별불가) | 삼성서울병원 |
| THpep27 (D39 Δpep27:: Cheshire ermBEmr) | (37) |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC 9997 |
| Staphylococcus aureus | ATCC 25923 |
다른 병원균, 즉 황색포도상구균 (S. aureus ATCC 25923) 및 폐렴간균 (K. pneumoniae ATCC 9997)은 한국종균협회 (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에서 구입하여 THY 배지에서 배양하였다.
1.2. 형질전환 불능 항생제 내성 균주 (TL
Δpep27ΔcomD
:: ermB 변이주)의 제작
형질전환 불능 Δpep27 변이주 (TLΔpep27ΔcomD :: ermB 변이주)를 제작하기 위해 THΔpep27 변이주의 comD 유전자 (GeneBank : ABJ53801.1)에 ermB 카세트를 삽입하였다. 도 1a 내지 도 1c는 pep27 변이주의 spd_2063 와 spd_2065 사이의 comD를 제거하고 대신 에리스로마이신 저항성 유전자 (ermB cassette) (도 1a 및 1b) 또는 체셔 카세트(Cheshire cassette) (도 1c)로 치환시킨 형질전환 불능 이중변이주를 상동염색체 재조합으로 삽입시킨 TLΔpep27ΔcomD :: ermB (도 1a) 및 에리스로마이신 저항성 마커를 없앤 이중변이주 TLΔpep27ΔcomD (도 1c)를 구축하는 공정을 나타낸다. D39WT 게놈에서의 핵산염기 서열 번호를 기재하였다. ermB 카세트는 서열번호 2로 표시되는 comD 유전자의 1-560 bp 부분과 548-1326 bp 부분의 사이에 삽입된다 (도 1b).
ermB 카세트는 prs3 및 prs4 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. comD 유전자 및 ermB 카세트의 일부를 함유하는 좌측 절편을 D39 게놈을 주형으로 이용하고 ermB:: comD-1 및 ermB:: comD-2 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. comD 유전자 및 ermB 카세트의 일부를 포함하는 오른쪽 절편은 D39 게놈을 주형으로 하여 ermB :: comD-3 및 ermB :: comD-4 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. 좌측 절편, ermB 카세트 및 우측 절편을 ermB :: comD-1 및 ermB :: comD-4 프라이머를 사용하여 3 중 결합 PCR반응으로 연결하였다. 사용된 프라이머들의 서열이 아래의 표 2에 나타나 있으며, 트리플 PCR 프로그램은 다음과 같았다: 변성 단계 (95℃ 2분); 신장 단계 (95 ℃에서 30 초 동안 변성, 55 ℃에서 45 초 동안 어닐링, 72 ℃에서 2 분 30 초 동안 연장)를 30 사이클; 신장 단계 (72℃에서 5 분); 40℃ 유지.
PCR 증폭에는 모두 nPFU-Forte DNA 중합효소 (Enzymnomics, Seoul, Korea)를 이용하였다. PCR 산물을 PCR 정제 키트 (PCR Purification Kit, Cosmogenetech, Seoul, Korea)로 정제하였고 폐렴구균의 형질전환을 유도하기 위해 컴피턴스 신호 펩타이드 1 (competence signal peptide 1) 을 첨가하였다. 이어서, 정제된 DNA를 THΔpep27에 첨가하여 형질전환시켜 상동 염색체 재조합을 통해 게놈에 ermB가 삽입된 이중 TLΔpep27ΔcomD:: ermB 변이체를 얻었다. 형질전환체를 선별하기 위해 2.5 μg/ml의 에리스로마이신 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 함유 배지에 플레이팅 하였다. 에리스로마이신에 저항성인 집락에서 ermB 카세트가 존재하는지를 프라이머 prs3 및 prs4을 이용한 PCR 반응으로 확인하였다. 근본적으로, 돌연변이체 내에서 comD 유전자가 파괴되었는지 확인하기 위해 핫-페놀 (hot-phenol) 방법을 사용하여 박테리아의 총 RNA를 분리하고 comD 및 pep27 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다.
1.3. 항생제 내성 마커 없는 이중 TL
Δpep27ΔcomD
돌연변이체의 제작
항생제 내성 마커가 없는 이중 TLΔpep27ΔcomD 돌연변이체를 제조하기 위해서 THΔpep27 돌연변이체의 comD 유전자 (GeneBank: ABJ53801.1) 발현 저지 목적으로 체셔 (Cheshire) 카세트를 삽입시켰다 (도 1). 임시 선택 마커로 사용할 수 있는 에리스로마이신 내성 마커 (ermAM)를 갖고 있는 체셔 (Cheshire) 카세트 (Genbank: FJ981645)를 Donald Morrison 박사 (University of Illinois, Chicago)로부터 친절하게 제공받았다. 카세트는 프라이머 Cheshire-F 및 Cheshire-R 을 사용하여 증폭하였다. 폐렴구균 THΔpep27 돌연변이체 DNA 게놈의 양 옆에 있는 2 개의 팔은 다음과 같이 연결하였다: 좌측 팔은 comD 시작 코돈에서 시작하여 Cheshire :: comD-1 및 Cheshire :: comD-2 프라이머를 사용하여 체셔 카세트의 일부를 포함하도록 하였다; 우측 팔은 체셔 카세트의 일부를 함유하고 Cheshire :: comD-3 및 Cheshire :: comD-4 프라이머 (표 2)를 사용하여 comD 정지 코돈에서 끝나도록 하였다. 3 중 결합 PCR 반응에 좌측 절편 체셔 (Cheshire) 카세트 및 우측 절편을 Cheshire:: comD-1 및 Cheshire:: comD-4 프라이머 (표 2)를 사용하여 연결하였다. 트리플 PCR 프로그램은 다음과 같았다: 변성 단계 (95℃에서 2 분); 신장 사이클 단계 (95 ℃에서 30 초 동안 변성, 55 ℃에서 60 초 동안 어닐링, 72℃에서 4 분 15 초 연장)를 30 사이클; 신장 단계 (72 ℃에서 5 분); 40℃ 에서 보존. PCR 증폭은 모두 nPFU-Forte DNA 중합효소 (Enzymnomics, Seoul, Korea)를 이용하여 수행하였다. PCR 정제 키트 (Cosmogenetech, Seoul, Korea)을 사용하여 PCR 산물을 정제하였다. 컴피턴스 신호 펩타이드 1을 첨가하여 폐렴구균의 형질전환을 유도하였다. Cheshire 카세트는 상동 염색체 재조합을 통해 게놈에 삽입되었다. 이어서, 정제 DNA를 THΔpep27 돌연변이체에 형질전환시켜 상동염색체 재조합을 통해 게놈에 체셔 카세트가 삽입된 이중 TLΔpep27ΔcomD:: Cheshire 변이체를 얻었다. 형질전환체는 0.1 μg/ml 에리스로마이신 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 저항성을 나타내어 선별되었다. 각각의 집락에서 카세트가 존재하는지를 Cheshire-F 및 Cheshire-R 프라이머를 이용한 PCR 반응으로 확인하였다. 얻어진 각각의 집락은 시퀀싱 (Cosmogenetech, Seoul, Korea) 방법으로 핵산 염기를 결정하여 재확인 하였다.
체셔 카세트 절단을 유도하기 위해 1.0 % L-푸코스 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 첨가하였다. 푸코스 처리 된 배양물을 연속 희석하여 THY 한천배지 상에 도말하여 단일 집락을 얻었다. 각각의 집락은 Cheshire-F 및 Cheshire-R 프라이머로 PCR 증폭하여 체셔 카세트의 존재를 확인하였다. 동시에, 비 체셔 집락은 0.1 μg/ml 에리스로마이신이 존재 또는 부재하에 THY 혈액 한천배지에 도말하였다. 0.1 μg/ml 에리스로마이신을 함유한 THY 한천 평판에서 성장할 수 없는 집락을 비 에리스로마이신 THY 혈액 한천 평판으로부터 얻었다. 마지막으로, 돌연변이체 내에서 comD 유전자가 파괴되었는지 확인하기 위해 핫-페놀 방법으로 균의 총 RNA를 분리하고 comD 및 pep27 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 도 1d는 형질전환 불능 이중변이주에서 mRNA 발현을 RT-PCR 로 확인한 결과이다.
1.4. 형질 전환 분석
완전 형질전환 배지는 THY 배지에 0.1 mM CaCl2를 첨가하여 만들었다. 배양액을 O.D550이 약 0.05-0.1에 도달할 때까지 37℃에서 배양한 다음, 25 ng/ml의 컴피턴스 자극 펩타이드 (competence stimulating peptide 1, CSP-1)에 15 분 동안 노출시킨 후 200 ng의 5MC 도너 DNA를 첨가하였다. 형질전환 혼합물을 37℃에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 형질전환체 선택을 위한 10 ㎍/ml의 노보비신으로 중층된 THY 한천에 배양물을 도말하였다. 이어서, 플레이트를 95%공기-5% CO2 조건에서 37℃에서 밤새 배양한 후, 형질전환 된 집락 수를 계수하고, 형질전환 수율을 측정하기 위해 전체 집락 수로 나누었다.
1.5. 생체 내 안전성 시험
10 마리의 CD1 및 SCID 생쥐 그룹을 D39 또는 동종 Δpep27ΔcomD 으로 i.n., i.p., i.c.v. 감염시키고 생존율을 매일 기록하였다.
폐렴구균 Δpep27 ΔcomD 변이주가 신속히 제거되는지 확인하기 위해, 생쥐 (4 마리/그룹)에 D39 또는 동종 Δpep27 ΔcomD 변이주로 i.n. 감염시키고 6, 12, 24 시간 후에 생쥐를 희생시켜, 호모제나이저 (PRO Scientific Inc., Oxford, CT, USA, Model, 모델)를 사용하여 혈액, 폐, 비인두 조직을 수확하여 혈액을 제외한 나머지 조직은 1 ml의 PBS 용액에 넣고 얼음 위에서 호모지나이저로 갈은 후 연속 희석하여, 5%의 피브린을 제거한 양 혈액 (MB Cell, 미국)이 첨가된 THY 한천 상에 도말하였다. 폐렴구균 D39의 경우 젠타마이신 (Sigma Aldrich, USA) 10 μg/ml 또는 Δpep27ΔcomD의 경우 에리스로마이신 (Sigma Aldrich, USA) 2.5 μg/ml을 한천에 첨가하여 선별하였다. 이어서, 플레이트를 95% 공기-5 % CO2 조건에서 37℃에서 약 18 시간 동안 배양한 후, 집락 수를 측정하고 평균치를 산출하였다.
1.6. 면역 실험
4 주령 생쥐 (CD1, 수컷)는 Koatech (평택, 한국)에서 구입했다. 백신 효과를 측정하기 위해, 생쥐를 케타민-실라진 혼합물 (케타민 10 ml, 실라진 2.5 ml, PBS 12.5 ml)로 마취하고 Δpep27ΔcomD 변이주를 매주 한번씩 4 회 접종하였다. 동물 실험은 한국 동물 보호법의 지침을 따랐다.
1.7. IgG 역가 측정
최종 면역 접종 후 6 일 후에 생쥐의 안구로부터 채혈하여 면역 혈청을 수집하였다. 실험 첫날 96 웰 면역 플레이트를 D39 용해액으로 코팅하고 다음 날 완충액 PBST 용액 (0.05% 트윈 20을 첨가한 PBS)으로 3 회 세척하였다. 소 혈청 알부민 (BSA, Sigma Aldrich, USA)을 1% 함유한 차단 완충액으로 1 시간 동안 비특이적 반응을 블로킹한 후, 수집된 면역 혈청을 플레이트에 첨가하고 2 시간 동안 실온에서 배양하였다. 이어서, 2 차 항체로서 홀스 래디쉬 페록시다제 (horse radish peroxidase)(비율 1: 3000, GeneTex, USA)를 함유하는 생쥐 IgG 항체를 사용하였다. ECL 완충액을 처리한 후, 450 nm의 파장에서 마이크로 플레이트 판독기 (Molecular Device, USA)를 사용하여 항체의 역가를 계산하였다.
1.8. 생존율 측정
CD1 생쥐에 폐렴구균 Δpep27ΔcomD로 마지막 접종을 하고 일주일 후에 케타민-실라진 혼합물로 마취시킨 후 D39 또는 6A 균주로 i.n. 감염시켰다. 감염 후 15 일 동안 생쥐의 생존율을 측정하였다.
1.9. 집락 형성 측정
CD1 생쥐에 4 회 접종하고 7 일 후 마취시키고 D39, 6A 및 NCC1균주로 감염시켰다. 24 시간 후, 생쥐를 희생시켜 혈액, 비강 세정액 및 폐를 수집하였다. 그리고 나서 각 시료를 희석하고 THY 한천 배지에 도말하여 형성된 집락 수를 측정하였다
1.10. 사이토카인 분석
마지막 접종 7 일 후에 CD1 생쥐로부터 혈액, 기관지 폐포 세척액 (BAL) 및 비장세포를 수집하였다. ELISA 키트 (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 이용하여 인터루킨-17, 종양 괴사인자-α (TNF-α), 인터페론-γ (IFN-γ), IL-4 및 IL-10의 농도를 분석하였다.
1.11. 옵소닌 식균작용 분석 (Opsonophagocytosisassay, OPA)
OPA는 이전에 기술된 방법에 따라 수행하였다 (13) (Kim et al., 2016). 간략하게 기술하면, 해동된 폐렴구균 세포를 HBSS 용액으로 1 x 103 개/ml 농도가 되도록 희석하였다. 또한 열로 불활성화 된 항체를 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution) 로 희석하여, 항체:박테리아의 비가 1:100 이 되도록 박테리아를 첨가하고 천천히 37℃에서 30 분간 교반하였다. 그 후 1 x 106 개의 호중구를 첨가하였다. 이 시료 20 μl를 37℃에서 1 시간 배양한 후 5% 양 혈액을 첨가한 THY 한천 배지에 떨어뜨렸다. 그 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2 조건에서 밤새 배양하였을 때의 살아남은 세균수를 다음날 측정하였다. 실험군에서 살아남은 세균 수의 백분율을 대조군에서 살아남은 세균 수로 나누어 계산하였다.
1.12. 통계
실험 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다. 생존율 분석은 Log-rank (Mantel-Cox) 테스트를 사용하였고, 사이토카인 및 집락 형성 분석에는 독립 표본 t 검정 (unpaired t test)을 이용하였으며, ELISA 데이터는 이원분산분석 (2-way ANOVA) 방법을 사용하였다. P <0.05이면 유의한 차이가 있다고 판단하였다.
2. 결과
2.1.
Δpep27
돌연변이체의 형질전환능 제거로 생체 내 독성이 약화됨
종래의 Δpep27의 독성이 경감된 pep27 돌연변이체가 생체 내에서 폐렴구균 감염으로부터 숙주를 보호할 수 있었지만 (17), 이 균주가 독성이 있는 야생형 (WT)으로 형질전환될 가능성을 배제할 수는 없었다. 이러한 복귀 가능성을 피하기 위해 폐렴구균으로부터 형질전환에 필요한 유전자 comD를 제거하여 Δpep27ΔcomD 균주를 만들고 이의 형질전환 능력을 측정하였다.
도 2a는 컴피턴스 특이적 펩타이드(competence specific peptide, CSP-1)로 형질전환을 유도한 후 노보바이오신 내성 형질전환체를 계수함으로써 Δpep27ΔcomD 이중 변이주의 형질 전환 불능을 확인한 결과이다. 모 균주 D39 및 Δpep27 균주는 형질전환체가 검출되었으나, Δpep27ΔcomD 균주에서는 형질전환체가 검출 되지 않았다 (도 2a). 이 결과는 Δpep27ΔcomD 균주의 형질전환 능력이 성공적으로 없어졌음을 나타내는 것이다.
Δpep27ΔcomD 균주의 독성이 경감되었는지 측정하기 위해, Δpep27ΔcomD 균주를 3 가지 상이한 경로로 생쥐에 감염시켰다. 10 마리의 마우스를 한 군으로 하여 비강 내 (i.n.)에 0.6 ~ 1 × 104 개 (도 2b) 또는 복강 내 (i.p.)에 1 ~ 1.5 × 104 개 (도 2c) 또는 대뇌 (i.c.v.) 안에 D39 균주를 0.5 × 103 개 (도 2d) 또는 면역기능 부전 생쥐 (SCID) 비강에 Δpep27ΔcomD 변이주로 감염시켰다. SCID 마우스에 i.n. 1 x 104 개의 D39 또는 Δpep27ΔcomD 변이주로 감염시키고 (도 2e) 생존율을 매일 또는 매 시간마다 기록하였다. 또한, 4 마리의 마우스를 한 군으로 비강 내 (i.n.)에 1 ~ 3 x 108 개의 D39 또는 Δpep27ΔcomD 변이주로 감염시켰다. 감염 후 6, 12, 24 시간 후에 혈액, 폐, 비인두 조직에 있는 생존 균수를 세었다 (각각 도 2f, 도 2g 및 도 2h). 형질전환 및 집락형성 실험에서 통계적 유의성은 unpaired t test로 분석하고 생존율 측정 실험에서의 유의성은 Mantel-Cox test (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, D39 감염 군과 비교)로 분석하였다. 실험 결과, Δpep27ΔcomD 균주로 감염된 생쥐는 성공적으로 살아남았으나, D39 야생형 균주로 감염된 생쥐는 높은 사망률을 보였다 (도 2b 내지 도 2c). 더욱이, Δpep27ΔcomD로 감염된 면역 저하된 SCID 생쥐 역시 한 마리도 죽지 않았다 (도 2e). pep27 돌연변이체가 i.n. 감염 시 혈액에서 전혀 검출되지 않았음은 종래 확인된 바 있다 (17). Δpep27ΔcomD 변이체가 다른 조직으로 침투할 수 있는지 확인하기 위해 혈액, 폐 및 비인두 내의 세균수를 측정하였다. 실험 결과 Δpep27ΔcomD는 혈액 및 폐에서 검출되지 않았지만 D39 야생형은 많은 수의 균이 상기 조직들에서 점차 증가함을 확인하였다 (도 2f 및 도 2g). 비인두에서는 이중 돌연변이체 감염균이 검출되었으나 24 시간 이내에 신속하게 제거되었다. 반면, D39 야생형은 24 시간 후에도 현저히 많은 박테리아 수를 보였다 (도 2h). Δpep27ΔcomD는 i.p. 및 i.n. 감염모델에서 Δpep27 (17)과 유사하게 생쥐를 한 마리도 죽이지 못했다. 이런 결과는 Δpep27ΔcomD 균주가 약독화 백신으로 사용하기에 충분히 안전하다는 것을 나타낸다.
2.2.
Δpep27ΔcomD
접종으로 IgG가 유도되며, 폐렴구균 혈청형에 무관하게 방어가 가능함.
IgG는 다당류백신 또는 접합백신 과 같은 폐렴구균 백신 접종으로 생산되는 주요 항체이다 (7). 기억 B 세포로부터 생산된 항체가 다당류와 강력하게 결합 하여 폐렴구균 감염을 방어한다 (18).
Δpep27ΔcomD 변이주가 폐렴구균의 혈청형에 무관하게 방어를 제공하는지 확인하기 위해, 마우스 (n = 5 / 군) 인후에 1 x 108 개의 Δpep27ΔcomD 변이주를 매주 접종하여 총 4 회 접종하였다. 면역화 6 일 후 안와 채혈하여 항체 역가를 D39 용해물 (도 3a) 또는 PspA (도 3b)로 코팅된 플레이트를 이용하여 ELISA 방법으로 측정하였다. 또한, 면역화 된 마우스 (n = 15 / 군)에 D39 (타입 2) (도 3c) 7 x 107 개, 또는 BG7322 (타입 6A) (도 3d) 3 x 108 개로 감염시킨 후 생존율을 매일 측정하였다. 항체가의 유의 한 차이는 독립 표본 t 검정으로 분석하였고 생존은 Mantel-Cox test (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, D39 감염 군과 비교)로 분석하였다.
실험 결과, Δpep27ΔcomD i.n. 접종에 의해 D39 세포 용해물에 대한 IgG 역가가 유의하게 증가되었으며, 4 회 접종 후의 IgG 역가가 1 회 접종시에 비해 50 배 이상 증가되었음을 확인하였다 (도 3a). 이와 일관되게, Δpep27ΔcomD 접종으로 인해 PspA 특이적인 IgG 도 유도되었음을 확인하였다 (도 3b).
Δpep27ΔcomD 접종으로 혈청형 비특이적으로 폐렴구균 방어가 가능한지 확인하기 위해, 생쥐에 매주 한번씩 Δpep27ΔcomD를 i.n. 접종하여 총 4 회 접종한 후, 마지막 접종 1 주일 후에 D39 또는 6A 균주로 생쥐를 감염시켰다. 실험 결과 혈청형 2 번 (D39) 또는 6A 로 감염시킨 경우에도 혈청형에 상관없이 면역화된 실험군이 대조군 보다 유의하게 생존율이 증가되었다 (도 3c 및 도 3d).
2.3.
Δpep27ΔcomD
접종에 의한 혈청형 비특이적 균 증식 억제
Δpep27ΔcomD를 이용한 예방 접종으로 인한 생존율 증가가 세균 증식을 억제하였기 때문인지 확인하기 위해, 독성이 있는 균으로 감염시키고 24 시간 후 생존 균수를 측정하였다. 마우스 (n = 3 / 그룹)에 매주 108 개의 Δpep27ΔcomD 로 4 회 접종하였다. 생쥐는 1 x 108 개의 D39 (혈청형 2 번), 3 x 108 개의 BG7322 (혈청형 6A), 또는 1 x 108 개의 혈청형을 식별할 수 없는 균주 NCC1으로 감염시켰다. 혈액, 폐 균질물 및 비강 세정액의 균수를 THY 한천에 도말하여 측정하였다. 대조군과 비교하여 unpaired t test (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001)로 유의 한 차이를 분석하였다.
혈청형 2 번 (D39), 6A 또는 혈청형을 식별할 수 없는 NCC1으로 감염 시켰을 때, Δpep27ΔcomD가 미리 접종된 실험군의 혈액, 비강 세정물 및 폐 균질물에서 균수가 현저하게 억제되었다 (각각 도 4a, 도 4b 및 4c).
2.4.
Δpep27ΔcomD
접종에 의한 사이토카인 발현 유도
분비성 IgA 항체는 백신 접종으로 유도되어 T 헬퍼 세포 (TH 세포), 특히 TH1 (IFN-γ 및 TNF-α) 및 TH2 (IL-4 및 IL-10)의 분화를 유도함으로써 점막 표면으로 침입하는 병원성 미생물로부터 숙주를 보호한다. 또한 TH17 (IL-17)은 집락 형성 기간을 줄이는데 필수적으로 요구된다 (19). 따라서, 본 실시예에서는 Δpep27ΔcomD 접종에 의해 이들 사이토카인이 유도되는지를 조사하였다. 마우스 (n = 6 / 그룹)에 1 x 108 개의 Δpep27ΔcomD로 1 주일 간격으로 4 회 접종하고 최종 면역화 1 주일 후에 생쥐의 BAL 액 (A) 및 비장 세포 (B)에서의 사이토카인 수준을 ELISA 방법으로 정량하였다. 대조군과 비교하여 unpaired t test (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001)로 유의 한 차이를 분석 하였다.
실험 결과 비장 세포에서의 IL-4를 제외한 모든 시료에서 IL-17, TNF-α, IFN-γ, IL-10 및 IL-4 사이토카인들의 발현 수준이 유의하게 증가되었다 (도 5a 및 도 5b).
2.5.
Δpep27ΔcomD
접종은 치명적 감염으로부터 장기간의 면역을 제공함
백신을 점막 표면에 접종한 후 점막 면역이 유도되면 방어 면역 지속성에서 중요한 역할을 한다 (20, 21). 또한, 장기간 항체를 생산할 수 있게 되면 협막을 갖고 있는 세균 감염을 장시간 방어할 수 있다. 따라서 본 실시 예에서는 Δpep27ΔcomD 접종이 지속성 IgG를 충분히 유도할 수 있는지 조사하였다.
Δpep27ΔcomD를 최종 접종하고 2 개월 후에 면역 혈청을 수집하고, IgG 역가를 ELISA로 검출한 결과 Δpep27ΔcomD 접종에 의해 D39 용해물뿐만 아니라 PspA 단백질에 대해서도 수명이 긴 점막 특이적 IgG 항체 생성이 유도되었다 (도 6a 및 도 6b).
이어서, Δpep27ΔcomD을 접종하고 오랜 기간 후에도 세균을 제거할 수 있는지 확인하였다. 생쥐를 최종 면역화 후 2 개월 후에 D39, 6A 및 NCC1로 감염시킨 후 폐의 생존 균수를 측정하였다. Δpep27ΔcomD 접종군은 혈청형 2번 D39 뿐만 아니라 혈청형을 판단할 수 없는 NCC1 균주 감염군에서도 세균 수가 유의하게 감소되었으나 (도 6c 및 도 6e), 혈청형 6A (BG7322) 감염에서는 유의성이 없었다 (도 6d). 즉, Δpep27ΔcomD 접종에 의해 폐렴구균 감염에 대한 장기간 면역이 제공됨을 확인하였다.
2.6.
Δpep27ΔcomD
접종에 의한 식균 활성 증가
호중구는 그람양성균인 폐렴구균을 방어하는데 중요한 역할을 하는 숙주의 면역 세포로 알려져 있다. Δpep27이 IL-17을 효과적으로 유도하여 호중구를 현저하게 활성화시키고 궁극적으로는 세균 제거를 유도한다는 사실은 이미 입증된 바 있다 (13). 본 실시예에서는 마커리스 Δpep27ΔcomD 접종이 호중구의 식균 파괴 활성을 증가시킬 수 있는지 조사하였다. 면역화된 생쥐로부터 혈청 및 호중구를 분리하고 혼합하여 여러가지 유형의 폐렴구균 (혈청형 2, 3, 4, 5, 6A, 10A, 15, 19A, 19F, 23F 및 비혈청형 균주 ST1160, NCC1)에 대한 살균 활성을 측정하였다. 마우스 (n = 4 / 군)에 Δpep27ΔcomD 이중변이주로 4 번 접종하고, 최종 접종하고 1 주 후에 호중구 활성화를 위해 D39로 감염시켰다. D39 감염 1 일 후 호중구를 추출하여 다양한 혈청형의 폐렴구균을 혈청과 1 시간 동안 배양했을 때 생존 균수를 THY 한천배지에 도말하여 측정하였다. 실험군에서 살아남은 세균의 생존율은 대조군에서 살아남은 균수로 나누어 측정하였다. 세 번의 실험을 수행하여 유의한 차이를 대조군과 비교하여 unpaired t test (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001)로 분석 하였다.
그 결과, Δpep27ΔcomD 로 면역화된 생쥐의 호중구가 대부분의 폐렴구균 혈청형에 대해 상당히 증가된 살상능력을 나타내므로 (도 7), 마커리스 Δpep27ΔcomD 접종으로 식균작용이 증가되어 다양한 혈청형의 폐렴구균 감염을 예방할 수 있음을 확인하였다.
2.7.
Δpep27ΔcomD
접종에 의한 여러 가지 호흡기 병원체 감염 방어
Δpep27로 면역화된 생쥐는 다른 호흡기 바이러스 (14) 및 병원체 (38) 를 방어하였다. 따라서 Δpep27ΔcomD 로 면역화된 생쥐에서 다른 병원체에 대한 방어효과가 있는지 확인하기 위해 감염 방어 실험을 하였다. 즉 1 x 108 개/ 50 μl의 Δpep27 ΔcomD를 매주 마우스 (Balb/c 수컷, n = 3/군)에 4 회 접종하고 최종 접종 1 주 후에 폐렴간균 (Klebsiella pneumoniae , 그람 음성, 6 x 106 개/ 50 μl) 또는 포도상구균 (S. aureus, 그람 양성, 1 x 109 개/ 50 μl)을 마우스에 감염시켰다. 감염 후 24 또는 48 시간 후에 혈액, 비강 세척액, 폐의 세균수를 THY 한천에 도말하여 측정하였다. 유의 한 차이는 t test (*, P <0.05; **, P <0.01; 대조군과 비교)로 분석 하였다. 실험 결과 폐렴간균 감염 24 시간 후에 혈액, 폐에서 유의성 있게 균수가 감소되었고, 48 시간 이후에도 감소되는 경향을 나타내었으나 통계적 유의성은 없었다 (도 8a). 또한 황색포도상구균을 감염시키고 24 시간 및 48 시간 후에 각각 폐 및 비강세척액에서 균수가 유의성있게 억제되었다 (도 8b). 이러한 결과는, Δpep27 로 면역화시켰을 때에 나타나는 방어 효과가 Δpep27ΔcomD 의 접종에 의해서도 나타남을 입증하는 것이다.
3. 검토
Δpep27 돌연변이체를 이용한 예방 접종이 혈청형과 무관하게 폐렴구균에 대한 효과인 방어를 제공한다는 사실이 종래 보고된 바 있다 (13, 17). 그러나, 이 Δpep27 돌연변이체는 상당한 형질전환 능력이 있음이 확인되었다 (도 2a). 형질전환능이 있는 상태에서 폐렴구균은 자연적 형질전환에 의해 유전자 교환이 일어난다 (15). 이러한 변화는 세포 외 폴리펩타이드인 형질전환 유도 펩타이드 (competence-stimulating peptide, CSP)에 의해 시작되어 결국 새로운 유전자가 염색체에 삽입되게 한다 (15). comD는 com 오페론의 구성 요소 중 하나이며, 형질전환의 시작에서 중요한 역할을 한다 (22, 23). comD의 돌연변이가 형질전환을 차단한다는 것이 알려져 있다 (15). 따라서, 본 실시 예에서는 pep27 변이주에서 comD를 돌연변이시켜 pep27 변이주가 야생형으로 복귀될 수 없도록 하였다. 폐렴구균 Δpep27ΔcomD 이중변이주의 형질전환 정도는 D39야생형 및 Δpep27 변이주보다 유의하게 감소되었다 (도 2a). 또한, 폐렴구균 Δpep27ΔcomD으로 감염시킨 생쥐는 전혀 죽지 않았다 (도 2a 내지 2e). 뿐만 아니라 이 이중변이주는 독성이 완전히 없어져 감염 6, 12, 24 시간 후 혈액 및 폐에서 전혀 검출되지 않았고 (도 2f 및 도 2g) 감염 24 시간 후에는 비인두에서 조차 완전히 사라졌다 (도 2h). 따라서 Δpep27ΔcomD 돌연변이체는 형질전환을 억제하여 기존의 Δpep27돌연변이와 독성을 경감시키는데 상승 작용을 나타내었다. 종합하면, Δpep27ΔcomD는 약독화된 형질전환 불능의 점막 면역 기능을 갖고 있는 백신으로 개발될 가능성이 매우 높다.
Roche 등은 이미 단일 cps 돌연변이체를 어떠한 면역증강제 없이 2 회 접종하여 점막을 보호할 수 있다고 보고하였다 (24). 6Acps 돌연변이체를 인후 접종하여 생성된 IgG 및 IgA 항체는 치명적인 감염을 예방하였다 (24). 본 실시 예에서 이중 돌연변이 백신 접종 횟수가 증가함에 따라 유의하게 높은 IgG 수준과 생존율이 관찰되었고 (도 3a 및 도 3b) 독성 균주로부터의 감염을 예방하였다 (도 3c 및 도 3d).
특정 혈청형 폐렴구균이 인후부에서 집락을 형성하는 빈도는 침습성 폐렴구균 질환의 역학적 변화와 연관이 있다 (25). 그러므로, 인후부에서의 균수를 경감시키는 백신 효과는 집단 면역 (herd immunity)에서 매우 중요하다 (26). 현재 사용 가능한 PCV13 백신은 그 안에 포함된 혈청형에 대해서만 방어할 수 있으나 인후부에서 집락 형성을 억제할 수는 없었다. 그러나 Δpep27 백신은 다양한 폐렴구균 혈청형으로 감염된 여러 조직에서 균수를 현저하게 감소시켰다 (13). 일관되게, 본원에 따른 신규한 Δpep27ΔcomD 백신을 접종하면 혈청형 2 및 6A 뿐만 아니라 (도 4a 내지 도 4c) 혈청형을 식별할 수 없는 (non-typeable) NCC1 균주로 감염 24 시간 후에도 혈액, 폐 및 비강 세정액에서 세균 수가 유의하게 감소되었다 (도 4). 이러한 결과는 Δpep27ΔcomD 접종이 다양한 폐렴구균 혈청형에 의한 감염을 효과적으로 예방할 수 있음을 제시한다.
Th17은 CD4 T 세포의 하위집합 중 하나로서 병원균으로부터 숙주를 보호하기 위해 호중구 동원을 증가시키고 상피 세포로부터 항균 펩타이드를 생산함으로써 면역을 증가시키는 데에 중요한 역할을 한다 (27). 특히, 전균 백신 (whole cell vaccine; WCV)을 접종한 생쥐는 IL-17 분비가 촉진되고 호중구의 살상 능력이 높아져 폐렴구균 집락 형성을 효과적으로 방어한다 (28, 29). 또한 IL-17을 중화하면 폐렴구균에 대한 방어력이 크게 감소되었다 (30). 이러한 보고와 일치하게, 폐렴구균 Δpep27ΔcomD 백신을 접종하면 BALF 및 비장세포로부터 IL-17 사이토카인 분비가 증가되었다 (도 5). 따라서 IL-17 분비 증가에 의해 폐렴구균 집락 형성이 억제되고 생존율이 높아진 것으로 분석된다.
IgA는 박테리아가 점액으로 들어가는 것을 포획하여 박테리아가 점막 표면으로 이동하는 것을 방지한다 (31). 따라서 IgA 분비는 점막면역 반응에 필수적이다 (32). Th1과 Th2 세포의 주요 역할은 IgA를 생산하는 것이다. 또한, Th1 세포에 의해 생성된 IFN은 호중구 동원을 촉진하고, NK 세포의 세포 독성을 높여, 병원균이 감염된 대식세포의 살상 능력을 활성화시키는 주요 인자이다. 또한 IFN-γ 을 복강에 주입하면 폐에서 박테리아 수가 감소되었다 (33). 그리고 IFN-γ 유전자가 없는 생쥐는 폐렴으로 인한 치사율이 증가되었다 (34). 즉 IFN-γ는 숙주가 병원균을 방어하는데 결정적인 역할을 한다는 것을 의미한다. 본 실시예에서는 Δpep27ΔcomD 로 면역화된 생쥐의 BALF와 췌장 세포에서 IFN-γ와 TNF-α (Th1에 의해 분비됨), IL-4와 IL-10 (Th2에 의해 분비됨) 생성이 유의하게 증가되었음을 확인하였다 (도 5a 및 도 5b). 이런 결과는 Δpep27ΔcomD 접종으로 Th17뿐만 아니라 Th1 및 Th2 세포가 효율적으로 활성화되었음을 나타낸다.
접합 백신은 T 세포를 활성화시켜 오래 생존하는 플라즈마 세포와 기억 B 세포로 분화되도록 하여 많은 양의 IgG 항체 생산을 유도한다 (18). 폐렴구균 Δpep27 백신은 접종 3 개월 후까지 폐렴구균 감염에 대한 생존률과 IgG 생성량을 모두 증가시킨다는 사실이 이전에 확인된 바 있다 (13). 본 실시예에서도 이와 유사하게, Δpep27ΔcomD 접종 2 개월 후에도 지속 가능한 장기간 면역성을 나타내어 높은 IgG 역가가 유지되었으며 폐에서 세균 수를 억제하였다 (도 6). 이와 유사하게 본 실시예에서는 마커리스 Δpep27ΔcomD 접종에 의해 여러가지 혈청형의 폐렴구균뿐만 아니라 혈청형을 식별할 수 없는 균주에 대해서도 균수가 유의하게 감소되었음이 확인되었다 (도 7). 또한 다른 호흡기 전염 병원체인 황색포도상구균 및 폐렴간균의 감염도 예방하였다 (도 8a 및 도 8b). 따라서 폐렴구균 Δpep27ΔcomD 백신은 폐렴구균 감염뿐만 아니라 다른 호흡기 전염 병원체도 효과적으로 방어하는 유용한 백신이 될 수 있다는 가능성을 확인하였다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration
<120> NON-TRANSFORMABLE PNEUMOCOCCAL MUTANT AND PHARMACEUTICAL
COMPOSITION CONTAINING THE SAME
<130> 1
<160> 20
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pep27 of Streptococcus pneumoniae D39
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gcaagagact ataatagaaa atag 84
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> comD
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cattttattt gtaaaggtca aataaataga aaagaattat tcgtttttgg tgcttataca 120
ttactaacag aaatagtatt tgattttccc ttatatattc tatatttaga tgggttaggg 180
attgaaagat ttttatttcc tttgggatta tattcctatt ttcgatggat gaaacagtat 240
gagagggata gaggactatt cctaagttta ctactatctc ttttatatga gagcactcat 300
aactttctgt ccgtaacttt ctcctctata acaggagata attttgtttt acaatatcat 360
ttcccattct ttttcgttgt gacggtgtta acctattttg ttacattaaa aatcatttac 420
tatttccatt tggaactagc ctattttgac gaggactacc tttatccttt cttgaaaaaa 480
gtattttttg ctttactatt gctacatatt gtatctttcg tttcagatat ggtaagtacg 540
attaaacatt tgaatagttt tggaagtatt ttgtcatcta ttgtctttat ctctctcctt 600
ttgaccttct ttgcaatgaa ttctcataaa gttcaaatgg agaaagagat tgctttgaag 660
cagaagaaat ttgaacagaa acatttacag aattacacag atgaaattgt tggtctgtat 720
aatgaaatcc gtggttttcg acatgattat gctggaatgc ttgtcagcat gcagatggca 780
attgacagtg gtaatttaca ggaaattgac agaatttaca atgaagtttt agtcaaagca 840
aatcataaat tgcgttcaga taagtacact tactttgatt tgaacaacat agaagactca 900
gctttacgaa gtttggttgc tcagtcaatt gtctatgctc gaaataatgg tgtagagttt 960
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aaaatgacga tgactccttc aggagatcta tttgccttag gattctccac taagggaaga 1200
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acggtcgcag gttcgaatcc 20
Claims (16)
- pep27 유전자 돌연변이 및 comD 유전자 돌연변이를 포함하고,
상기 pep27 유전자 돌연변이는 서열번호 1로 표시되는 pep27 유전자 핵산서열의 1번 내지 53번이 결실된 것이며,
상기 comD 유전자 돌연변이는 서열번호 2로 표시되는 comD 유전자 핵산서열의 554번 내지 857번이 결실되어 형질전환능이 저하되거나 제거된 것인, 약독화된 폐렴구균 균주.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 약독화된 폐렴구균 균주는 서열번호 2로 표시되는 comD 유전자 핵산서열 내부에 외래 유전자가 삽입된 것인, 약독화된 폐렴구균 균주.
- 삭제
- 폐렴구균 균주의 염색체 DNA에서 pep27 유전자 및 comD 유전자를 돌연변이시키는 단계를 포함하는, 제 1 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 약독화된 폐렴구균 균주의 제조방법.
- 제 9 항에 있어서,
상기 돌연변이가 치환, 결실, 부가, 역위, 중복, 삽입 및 교체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 약독화된 폐렴구균 균주의 제조방법.
- 제 1 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 약독화된 폐렴구균 균주를 포함하고, 폐렴구균, 폐렴간균 또는 포도상구균으로 감염되는, 호흡기 감염 질환 예방용 백신 조성물.
- 삭제
- 제 11 항에 있어서,
폐, 비장, 혈액 또는 뇌에 비침습성인, 호흡기 감염 질환 예방용 백신 조성물.
- 제 11 항에 있어서,
복강내 또는 점막내로 투여하기 위한, 호흡기 감염 질환 예방용 백신 조성물.
- 제 14 항에 있어서,
인후 점막내로 투여하기 위한, 호흡기 감염 질환 예방용 백신 조성물.
- 제 11 항에 있어서,
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 면역 보조제를 더 포함하는, 호흡기 감염 질환 예방용 백신 조성물.
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