CN110573179A - 包含弱毒化的肺炎链球菌菌株的药剂学组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含弱毒化的肺炎链球菌菌株的药剂学组合物及其用于预防或治疗炎症性疾病、呼吸道病毒感染、细菌感染性疾病或过敏性疾病的用途。

Description

包含弱毒化的肺炎链球菌菌株的药剂学组合物及其用途
技术领域
本发明涉及包含弱毒化的肺炎链球菌菌株的药剂学组合物及其用于炎症性疾病、呼吸道病毒感染或细菌感染性疾病的预防或治疗的用途。
并且，本发明涉及包含弱毒化的肺炎链球菌菌株的药剂学组合物及其用于过敏性疾病的预防或治疗的用途。
背景技术
众所周知，当以鼻腔(nasal)或口服(oral)的方式将抗原进行投放时，诱导调节T(regulatory T，Treg)细胞，由此，在靶器官中，诱导出粘膜免疫耐受(Faria及Weiner，2005)。据报告，当在小鼠中，诱导出粘膜免疫耐受时，会抑制包含动脉粥样硬化症(Maron等，2002)在内的多种自身免疫疾病(Faria及Weiner，2005)。因此，粘膜免疫耐受原理可应用于动物及人类。当多次将抗原进行投放来刺激粘膜时，T细胞诱导IL-10或TGF-β1之类的抗炎症性细胞因子分泌来防御组织，从而诱导粘膜免疫耐受(Faria及Weiner，2005、Weiner，2001)。为了维持粘膜表面的免疫耐受，特定类型的Treg细胞优先被诱导，但诱导机制未被明确告知。
只是，就当前的粘膜疫苗而言，实情是：在无免疫增加剂的情况下，功效不足以诱导充分的粘膜免疫反应。粘膜免疫增加剂(Mucosal adjuvants)仅通过抗原投放则在免疫耐受诱导效率低的情况下使用，例如，其中一例为霍乱毒素B亚基(cholera toxin Bsubunit，CTB)(Faria及Weiner，2005)。但是，咽喉接种后出现的霍乱毒素的免疫增加效果表示识别细菌来进行介导(Kim等，2016)，从而微生物界起到必要作用，因而优选地，需要时，将弱毒化的细菌用作免疫增加剂。即，无免疫增加剂的粘膜疫苗的概念至今未得到证明。
并且，尚未有报告说粘膜疫苗是否还可对除了与用于制备疫苗的抗原直接相关的病症之外的多种病症呈现效果，当前使用的免疫疗法仅对用于预防接种的抗原进行防御。尤其，为了预防肺炎链球菌病症，使用23价多糖类疫苗或13价接合疫苗，但23价多糖类疫苗无记忆反应，13价接合疫苗仅可对90种以上的血清型中的13种血清型进行防御(Kalin，1998)。
哮喘为全球儿童和成人中均最常见的慢性疾病中之一(Anandan等，2010)，全球哮喘患者数为大致3亿名，由此，支出巨大的医疗费用(WHO，2007)。在全世界范围内，哮喘患者数每年增加，预测至2025年，会进一步增加1亿名以上。根据美国疾病管理本部的统计，美国哮喘患者比率从1980年3.1％增加至2010年8.4％，仍处于增加趋势(https://www.cdc.gov/asthma)。并且，70％的哮喘患者患过敏[GINA guidelines，2016]。2015年韩国的哮喘患者为166万名(健康保险审查评价院2015年统计)，相当于韩国人口中10多岁慢性疾病中的病症负担排行第6位。
哮喘及其他过敏性疾病的发病与来自西欧生活方式的环境变化及城市化增加密切相关(GINA guidelines，2016)。哮喘为发病原因多样的异质性病症，但主要由炎症引起。哮喘患者呈现相似的症状，但其作用机制可能分别不同(GINA guidelines,2016；NationalAsthma Education and Prevention Program,2007)。并且，气道的炎症形态根据哮喘种类而不同(GINA guidelines，2016)。哮喘的典型病因机制为由免疫球蛋白E(IgE)介导而出现的嗜酸性粒细胞性气道炎症，病理学及哮喘研究的很多研究结果聚焦于Th2相关后天性免疫反应(GINA guidelines，2016)。但是，最近研究集中于先天性免疫和微生物组及体内的微生物等(Bjorksten等，2001、Kalliomaki等，2001、Penders等，2007、Hilty等，2010、Green等，2014、Ozturk等，2017)。
根据美国哮喘及过敏基金会(Asthma and Allergy Foundation of America,http://www.aafa.org/)，当前使用的哮喘相关药物仅可减轻症状来进行管理，但无法治愈哮喘。哮喘的特征为过敏性超敏反应(airway hyper-responsiveness，AHR)，发生过度的支气管收缩反应。虽然，通过规律性地使用吸入糖皮质激素来使得死亡率在前几年有明显减少，但每年约250000名仍然因哮喘而死亡，在全世界范围内，哮喘引起的负担相当大(Suissa等，2000)。哮喘根据发病次数分为轻症(一个月发生1-2次)、中轻症(一周发生1-2次)及重症(每天发生哮喘)，重症时，应每天服用3-4个药，轻症时，也需要定期服药。哮喘因呼吸道炎症而使支气管收缩，从而当呼吸困难时，应立即喷射气道扩张用吸入剂。并且，哮喘患者及重症哮喘患者的一部分对肾上腺皮质激素根本没有反应，导致无法体验临床效果，从而有可能因疾病而受苦或死亡(Durham等，2011)。最近上市的抗IL-5制剂可4周注射一次来缓解哮喘症状。但是，可治愈或可预防哮喘的药物尚未被开发或被报告。
发明内容
技术课题
曾开发出包含肠疾病、感染、动脉粥样硬化症及上皮病变之类的炎症性因子的炎症性疾病的预防及治疗方法，但其局限于仍然利用引起炎症或诱发病症的特定标志物。与其相关地，预想到粘膜免疫抑制粘膜相关疾病及炎症性疾病，因而在本发明中，新提示对于利用肺炎链球菌栓菌疫苗的粘膜免疫的多种病症的抗炎症疗法及对于其他疾病的防御方法。并且，证明利用粘膜免疫的免疫耐受特性的粘膜投放疫苗可成为预防或治疗肠炎症及感染疾病等的新方法。
并且，在本发明中，要开发出通过将肺炎链球菌栓菌疫苗接种于粘膜，不仅可保护诱发成广泛的炎症性疾病，例如，肠的炎症、呼吸道感染及炎症的病变，还保护呼吸道病毒及细菌感染性疾病的新的方法。
并且，当前使用的哮喘药分为使变窄的支气管扩张的症状缓解剂(支气管扩张剂)和抑制支气管炎症来预防哮喘发作的病症调节剂(抗炎症剂)，但这些不能治愈或预防哮喘。因此，在本发明中，作为可预防或治疗包含哮喘的过敏性疾病的新的方法，提供包含肺炎链球菌的药剂学组合物。尤其，当将肺炎链球菌用于疫苗等的药剂学组合物时，为了改善因毒性强而使用非活性化的菌或仅分离纯化菌的特定成分来使用的缺点，提供包含弱毒化肺炎链球菌菌株的药剂学组合物，其充分进行弱毒化而当咽喉感染、腹腔内注入及血液内注入时也可确保安全性。
但是，本发明所要解决的课题不局限于以上提及的课题，本发明所属技术领域的普通技术人员可从以下记载内容中明确理解未提及的其他课题。
解决课题的手段
本发明提供包含弱毒化的肺炎链球菌菌株的药剂学组合物，上述药剂学组合物用于预防或治疗炎症性疾病、呼吸道病毒感染疾病或除了肺炎链球菌之外的细菌感染性疾病。
并且，本发明提供因pep27基因的变异而弱毒化的肺炎链球菌菌株的、预防或治疗包含过敏性呼吸道疾病的多种过敏性疾病的用途及用于其的药剂学组合物。
上述解决课题的方案仅是例示性的，不应解释为限制本发明的意图。除了上述的例示性的实例之外，可存在有附图及发明内容中记载的追加实例及实施例。
发明的效果
根据本发明，通过将肺炎链球菌栓菌疫苗接种于粘膜，可利用在肺及脾脏中以进行免疫诱导的多种基因来预防和/或治疗炎症相关疾病。
尤其，以往的疫苗可仅提供对于特定抗原成分的防御，但根据本发明，当使用肺炎链球菌粘膜疫苗时，可期待包括病毒及细菌感染性疾病以及其他器官的炎症疾病的防御能力的广泛的病症预防和/或治疗效果。并且，当投放于粘膜时，本发明的肺炎链球菌栓菌疫苗与以往的粘膜疫苗不同，不使用免疫助剂(adjuvant)，也可对多种疾病提供防御效果。
本发明可提供利用肺炎链球菌pep27变异体来预防或治疗包括哮喘在内的过敏疾病的方法。尤其，通过肺炎链球菌pep27变异体的接种，除了包括哮喘、过敏性鼻炎、鼻窦炎及慢性阻塞性肺疾病等的过敏性呼吸道疾病之外，还可预防或治疗荨麻疹、结膜炎、花粉过敏症及遗传性过敏症等的其他过敏性疾病。
进而，本发明的肺炎链球菌pep27变异体具有因充分弱毒化而当咽喉感染、腹腔内注入及血液内注入时，也确保安全性的优点。
附图说明
图1及图2为本发明一实施例的肺(图1)及脾脏(图2)中的通过系统生物学分析得出的肺炎链球菌疫苗功能分析结果的简图。针对小鼠用THpep27突变体(Δpep27)以2周的间隔进行3次免疫，最终进行免疫2周后，得到肺及脾脏，之后，提取总核糖核酸(RNA)来实施高速大量排序，之后，通过独创性途径分析(Ingenuity Pathway Analysis)来分析基因表达。在图1中，进行免疫的肺组织的基因提示对胃肠炎及大肠的异常进行抑制，在图2中，脾脏的基因表示对于流感病毒感染的保护效果。
图3为本发明一实施例的肺中的系统生物学分析结果的简图。针对小鼠以2周的间隔将Δpep27变异体3次接种于咽喉，在最后疫苗接种后的第七天，从肺分离信使核糖核酸(mRNA)，并实施高速大量排序。表示对于肺的序列数据的独创性途径分析(IPA)网络分析，是指诱导IL-6、IL-23R、MUC2、IFN type 1、TGF beta等，但CCR3却得到抑制。
图4至图6为根据本发明的一实施例将Δpep27接种于小鼠来确认Treg细胞是否被诱导的实验结果。在图4中，针对小鼠(n＝3)以2周的间隔将Δpep27以3次接种于咽喉，并在最后疫苗接种后的第七天，分离脾脏细胞，由对于Th1(CD4，Tbet)、Th2(CD4，GATA3)、Th17(CD4，RORγt)及Treg(CD4，Foxp3)的荧光细胞标志物进行标记。之后，利用流式细胞术来检测标志物。图5及图6为在最后疫苗接种后的第七天，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)来测定脾脏细胞(图5)或血清(图6)的细胞因子的结果。通过方差分析(ANOVA)来分析统计显著性。*，P＜0.05、**，P＜0.01。
图7及图8为根据本发明的一实施例将Δpep27接种于小鼠来诱导IL-10及IL-17的实验结果。针对小鼠(n＝3)以2周的间隔将Δpep27以3次疫苗接种于咽喉，并在最后疫苗接种后的第七天，从肺分离信使核糖核酸，从而利用qPCR来用于测定IL-17(图7)和IL-10(图8)基因水平表达。通过方差分析来分析统计显著性。*，P＜0.05。
图9为根据本发明的一实施例将Δpep27接种于小鼠来在脾脏中激活中央记忆T细胞和记忆Tfh细胞的实验结果。针对小鼠(n＝3)以2周的间隔将Δpep27以3次接种于咽喉，并在最后预防接种7天后，分离脾脏细胞来由对于中央记忆T细胞(CD4、CCR7、CD62L)及记忆Tfh细胞(CD4、CXCR5、CCR7)的荧光细胞标志物进行标记。之后，利用流式细胞术来检测荧光标志物。通过方差分析来分析统计显著性。*，P＜0.05。
图10及图11为根据本发明的一实施例将Δpep27接种于小鼠来诱导多种免疫球蛋白亚型的实验结果。针对小鼠(n＝6)以2周的间隔将Δpep27以3次接种于咽喉，并在最后疫苗接种后的第七天，测定血清(图10)和支气管肺泡清洗液BAL(图11)中对于三个类型的肺炎链球菌总细胞的抗体滴度。通过方差分析来分析统计显著性。*，P＜0.05、**，P＜0.01。
图12至图15为根据本发明的一实施例确认Δpep27接种是否可防御流感感染之后的第二次肺炎链球菌感染的实验结果。针对小鼠(9-10/组)以1周的间隔用Δpep27进行咽喉接种，并在最终进行免疫1周之后，使小鼠咽喉受到流感病毒的感染，之后，进行眼窝采血来分析细胞因子(图12)，在最终进行免疫1周后，从小鼠回收血清，从而通过酶联免疫吸附实验来测定对于特定抗原(图13)的IgG水平。通过非配对t测试(unpaired t-test)来分析两组之间的显著差异。***p＜0.001。流感感染10天后，使肺炎链球菌D39通过鼻腔内途径来受到感染之后，将生存监控14天(图14)。通过门特尔考克斯测试(Mentel-cox test)来分析统计显著性。**p＜0.005。肺炎链球菌D39感染24小时后，在血清中培养肺匀浆来测定细菌数(图15)。通过单向方差分析(One way ANOVA)来分析统计显著性。
图16及17为根据本发明的一实施例Δpep27疫苗抑制流感病毒复制来防御的效果的实验图。使小鼠(10只/组)咽喉受到流感病毒的感染之后，将小鼠的体重观察11天(图16)。通过单向方差分析来分析统计显著性。***p＜0.001。流感感染5天后，得到肺匀浆上清液，之后，将各个组的病毒滴度测定为TCID50/ml(图17)。通过单向方差分析来分析显著性。***p＜0.001。
图18为根据本发明的一实施例Δpep27接种是否可预防革兰氏阴性细菌感染的实验结果。通过小鼠(3只/组)鼻腔途径将Δpep27接种3次，并在最终进行免疫10天后，使小鼠受到肺炎杆菌(K.pneumoniae)的感染。肺炎杆菌感染24小时后，通过涂抹培养于血液琼脂来确定各个器官的菌数。**P＜0.01。
图19为根据本发明的一实施例Δpep27接种是否可预防革兰氏阳性细菌感染的实验结果。向小鼠(3只/组)鼻腔将Δpep27进行免疫3次，并在最终进行免疫10天后，使小鼠受到黄色葡萄球菌的感染。颜色葡萄球菌感染24小时后，通过涂抹培养于血液琼脂来测定各个器官的菌数。*P＜0.05。
图20及图21为根据本发明的一实施例Δpep27接种在利用硫酸葡聚糖钠(DSS)来诱导的炎症性肠疾病中是否抑制体重减少的实验结果。将Δpep27变异体3次接种于小鼠(n＝5只/组)鼻腔之后，在通过口服途径向饮用水将5％硫酸葡聚糖钠进行投放来诱导的大肠炎(炎症性肠疾病)中，体重减少得到缓解(图20)。在利用硫酸葡聚糖钠来处理9天的期间，观察基础体重减少百分比的时间经过。针对统计显著性，通过单向方差分析来进行分析之后，执行邦费罗尼测试(Bonferroni’s test)。在第九天直到治疗中断为止，每天评价临床病症活动指数(图21)。测定体重减少、粪硬度、直肠出血和/或大便中的血液量来评价大肠炎的进行情况。还每天观察小鼠的病态(毛发直立[piloerection]，昏迷状态)。
图22及图23为根据本发明的一实施例Δpep27接种是否可预防利用硫酸葡聚糖钠(DSS)来诱导的结肠炎症的实验结果。将Δpep27变异体3次接种于生(n＝5只/组)鼻腔之后，在通过口服途径向饮用水添加5％硫酸葡聚糖钠来进行投放而被诱导的大肠炎(炎症性肠疾病)中，体重减少得到缓解(图20)。在硫酸葡聚糖钠处理第九天，检查结肠。在硫酸葡聚糖钠处理第九天，测定结肠长度(图22)及重量(图23)。
图24为根据本发明的一实施例Δpep27接种是否在大肠中抑制炎症性细胞因子基因表达的实验结果。针对Balb c小鼠，14天在饮用水中添加5％硫酸葡聚糖钠来诱导炎症性肠疾病。将磷酸盐缓冲液(PBS)+水用作阴性对照组。使用实时定量聚合酶链式反应(PCR)来测定IL-1β、IL-6、IL-17A及TNF-α的信使核糖核酸表达。实验值由平均+标准误(SEM)表示，P＜0.05视为具有显著性。
图25为本发明一实施例的Δpep27变异体的过敏疾病预防效果实验的流程图(A)及表示多种过敏诱发细胞因子分泌抑制效果的实验结果(B)。
图26为示出本发明一实施例的Δpep27变异体的过敏疾病预防效果的组织化学染色结果。
图27为本发明一实施例的Δpep27变异体的过敏疾病治疗效果实验的流程图(A)及表示多种过敏诱发细胞因子分泌抑制效果的实验结果(B)。
图28为示出本发明一实施例的Δpep27变异体的过敏疾病治疗效果的组织化学染色结果。
具体实施方式
以下，参照附图，详细说明本发明的实施例，可使本发明所属技术领域的普通技术人员容易实施。但是，本发明能够以多种不同的形态实现，不局限于在此说明的实施例。并且，图中，为了明确说明本发明，省略与说明无关的部分。
在本发明说明书全文中，当一个部分“包括”另一个结构要素时，除非有特别反对的记载，则是指还可包括其他结构要素，而不是将其他结构要素排除在外。
当提示提及的含义中固有的制备及物质允许误差时，在本发明说明书全文中使用的程度的术语“约”、“实质上”等用为从其数值或接近于其数值的含义，用于防止昧良心的侵权人员不正当地利用为了有利于理解本发明而提及准确或绝对数值的公开内容。本发明说明书全文中使用的程度的术语“～(的)步骤”或“～的步骤”不指“用于～的步骤”。
在本发明说明书全文中，马库什形式的表述中包括的“它们的组合”这一术语是指选自由马库什形式的表述中记载的多个结构要素组成的组中的一种以上的混合或组合，是指包括选自由上述多个结构要素组成的组中的一种以上。
在本发明说明书全文中，“A和/或B”这一记载是指“A、B或A及B”。
在本发明说明书全文中，众所周知，“肺炎链球菌”作为被命名为肺球菌或肺炎双球菌(Streptococcus pneumoniae)的革兰氏阳性(Gram-positive)细菌，观察到随着时间的经过而分裂，继续出现多种菌，从而成为链状，分为链球菌科，成为肺炎的主要原因。
在本发明说明书全文中，“pep27”由27个多肽构成，利用vex传递体(transporter)来进行分泌，从而诱导生长抑制及细胞凋亡(apoptosis)，具体地，利用作为膜结合组氨酸蛋白激酶(membrane-bound histidine protein kinase)的vncS及作为细胞质效应器(cytoplasmic effector)的反应调节因子(response regulator)vncR来调节表达，从而诱导细胞凋亡(Novak等，1999)。pep27基因或从其编码的蛋白质也根据肺炎链球菌的每个血清型命名为其他名称，可存在有pep27的基因序列或其的肽序列的微差，但如上所述，作为本发明的pep27基因，只要是实质上执行与pep27相同的功能的基因，就可不受血清型限制地通过使其受损来制备本发明的弱毒化的肺炎链球菌菌株。优选地，全部包含执行实质上与上述pep27基因相同的功能的肺炎链球菌的基因。更优选地，本发明的pep27基因有可能因对由序列号1表示的pep27肽的氨基酸进行编码的基因突变而受损。
在本发明说明书全文中，“弱毒化”是指具有毒性的菌株以成为具有比变形前少的毒性的菌株或弱病原菌的方式进行变形，是指这种菌株在宿主内可仍然复制分裂的期间可诱发临床病症的能力显著减少。优选地，本发明的弱毒化的菌株为毒性或病原性以可作为疫苗允许投放的程度减少的菌株，更优选地，指菌株可在宿主内仍然进行复制，而不能诱发临床病症的程度为止进行弱毒化。并且，弱毒化突变可通过用于制备本发明的弱毒化突变的多种方法，例如，点突变、相关的病毒之间的序列交换或核苷酸缺失来实现。
在本发明说明书全文中，“突变”是指改变基因的遗传功能的所有行为，具体地，基因的突变是指生物的多种变异中因基因的量变或质变而产生的变异。
在本发明说明书全文中，“过敏”是指由对于人体的一种物质的过敏症，即，对于来自外部的物质的身体免疫系统的过度反应诱发的多种疾病、病症或异常状态。作为应用于本发明的组合物的过敏疾病，优选为第Ⅰ型即使型过敏反应及第Ⅳ型延迟型过敏反应。第Ⅰ型即使型过敏反应可包括支气管哮喘、鼻炎、遗传性过敏症性皮肤炎、结膜炎、中耳炎、荨麻疹及过敏性休克(anaphylatic shock)，第Ⅳ型延迟型过敏反应可包括接触性过敏症、接触性皮肤炎、细菌过敏症、真菌过敏症、病毒过敏症、药物过敏症、甲状腺炎及过敏性脑炎。第Ⅰ型即使型过敏反应分为两个步骤，在第一步骤中，通过过敏原的体内侵入来抑制IgE及IgG1的分泌，当生产使IgG2a的分泌增加的IL-12及IFN-γ的Th1细胞反应和生产IL-4、IL-5及IL-13等的Th2细胞反应的均衡倾向于Th2侧时，通过Th2的过度免疫反应来分泌IL-4及IL-13等，且因受到其影响，B细胞生产的多种IgE特异性抗体附着于肥大细胞(mast cell)及嗜碱性粒细胞(basophil)的表面，从而准备过敏发症。将这种情况称为被过敏原致敏(sensitization)。过敏发症的第二步骤分为初始反应和后期反应，在初始反应中，过敏原再次侵入体内来刺激肥大细胞，并诱发脱粒反应，从而发生此时释放的组胺、脂质代谢物、细胞因子等引起的血管扩张等，在后期反应中，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、Th2细胞、嗜碱性粒细胞等向相应的组织浸润来激活，从而诱发炎症来发生遗传性过敏症皮肤炎、鼻炎、哮喘等。
在本发明说明书全文中，“预防”是指通过组合物的投放来抑制或延迟疾病的发病的所有行为。
在本发明说明书全文中，“治疗”是指通过组合物的投放来使已诱发的疾病的症状好转或变得有利的所有行为。
在本发明说明书全文中，“疫苗”作为用于预防感染疾病的免疫的抗原，由弱毒化的微生物或病毒制备，是指为了对特定感染症以人工的方式得到免疫原性，将弱化或杀灭的病原微生物投放于个体内。当因疫苗而受到刺激时，个体内的免疫系统工作来生成抗体，当在维持其感受性的过程中发生再次感染时，可在短时间内有效生成抗体来克服疾病。只是，包含本发明的弱毒化的肺炎链球菌的疫苗根据免疫耐受原理与以往的疫苗不同，不仅可防御特定抗原成分，还具有包括病毒及细菌感染性疾病的广泛的病症的预防及治疗效果。
在本发明说明书全文中，“ermB”是指可对大环内酯(macrolide)具有耐性的基因，大环内酯在肺炎链球菌的治疗中用作青霉素的替代药剂，其包括红霉素(erythromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、阿奇霉素(azithromycin)等。
以下，参照实例及实施例和附图，对包含本发明的弱毒化的肺炎链球菌菌株的药剂学组合物及用于预防或治疗其的炎症性疾病、呼吸道病毒感染或细菌感染性疾病的用途进行具体说明。但是，本发明不局限于这种实例及实施例和附图。
本发明的第一方面可提供药剂学组合物，上述药剂学组合物包含弱毒化的肺炎链球菌菌株，用于预防或治疗炎症性疾病、呼吸道病毒感染疾病或除了肺炎链球菌之外的细菌感染性疾病。例如，上述药剂学组合物可包含疫苗组合物。
根据本发明的一实例，在上述弱毒化的肺炎链球菌菌株中，pep27基因的一部分或全部可缺失，例如，由序列号1表示的pep27基因核酸序列的1号至53号可缺失，但可不局限于此。
根据本发明的一实例，上述弱毒化的肺炎链球菌菌株可以为包含由序列号1表示的pep27基因核酸序列的1号至53号的缺失及由ermB卡带取代的突变的弱毒化的肺炎链球菌菌株，但可不局限于此。例如，上述弱毒化的肺炎链球菌菌株可以为包含韩国授权专利第10-1252911号中公开的pep27突变的弱毒化的肺炎链球菌菌株。
根据本发明的一实例，上述炎症性疾病可选自哮喘、支气管炎、鼻炎、炎症性肠疾病、胃肠炎、大肠炎、克罗恩病、胰腺炎、动脉粥样硬化症及关节炎，但可不局限于此。例如，炎症性疾病的预防或治疗可以为基于大肠炎症基因之类的炎症相关基因的表达抑制的效果。例如，上述炎症性疾病可与肠及呼吸道感染疾病相关，但可不限于此。
例如，上述呼吸道病毒可选自偏肺病毒、冠状病毒、肠道病毒、呼吸道细胞融合病毒、腺病毒、博卡病毒、鼻病毒及流感病毒。上述呼吸道病毒感染疾病的预防或治疗可以为基于病毒的复制抑制的效果。
例如，上述流感病毒可以为流感A型、B型或C型，可不局限于具体的亚型的种类。
并且，本发明的药剂学组合物还可提供病毒非特异性防御功能，此时，不局限于如流感及病毒，但还可提供对于包含呼吸道细胞融合病毒(Respiratory syncytial virus)及鼻病毒(Rhinovirus)的病毒的防御功能。
根据本发明的一实例，上述细菌感染性疾病可选自革兰氏阳性菌感染性疾病、革兰氏阴性菌感染性疾病及其他感染性细菌疾病。但可不局限于此。例如，细菌感染性疾病的预防或治疗可以为基于革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌的感染抑制的效果。
根据本发明的一实例，上述革兰氏阳性菌可选自葡萄球菌、链球菌、破伤风梭菌及炭疽杆菌中，上述革兰氏阴性菌可选自沙门氏菌、志贺氏菌、肺炎杆菌、大肠杆菌及霍乱弧菌中，但可不局限于此。例如，上述革兰氏阳性菌可以为黄色葡萄球菌。
根据本发明的一实例，上述药剂学组合物能够以血清型-非依赖性进行免疫，但可不局限于此。以上述血清型-非依赖性进行免疫的药剂学组合物不以特异性对抗原生产抗体，而是指与抗原无关地生产抗体来发生免疫反应的药剂学组合物。
根据本发明的一实例，上述过敏性疾病可以为选自哮喘、过敏性鼻炎、鼻窦炎及慢性阻塞性肺疾病中的过敏性呼吸道疾病，但可不局限于此。
根据本发明的一实例，上述过敏性疾病除了选自荨麻疹、结膜炎、花粉过敏症及遗传性过敏症中的过敏性疾病之外，还可包含食品过敏症、过敏性中耳炎、过敏性休克、接触性过敏症、过敏性接触性皮肤炎、细菌过敏症、真菌过敏症、病毒过敏症、药物过敏症及过敏性脑炎等，但可不局限于此。
本发明的药剂学组合物可抑制与免疫过敏反应相关的Th1细胞因子和/或Th2细胞因子的生成。其中，上述Th1细胞因子可选自干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白细胞介素-12(IL-12)中，上述Th2细胞因子可选自白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)及白细胞介素-13(IL-13)中，但可不局限于此。
上述Th1细胞因子和/或Th2细胞因子的水平可从肺支气管清洗液(肺泡液)或血清之类的体液进行测定，可不局限于此。
根据本发明的一实例，上述药剂学组合物可对肺、脾脏、血液或脑具有非侵袭性，但可不局限于此。上述“非侵袭性”是指除了直接将药剂学组合物进行投放的器官、组织及细胞之外，药剂学组合物不渗透到全身的其他区域，或即使渗透，也快速被去除，这与除了将药剂学组合物进行投放的器官、组织及细胞之外，向全身的其他区域渗透，以使人体受损的渗透性相反。
术语“投放”是指以一种适当的方法向对象导入本发明的组合物，本发明的组合物的投放途径只要可达到目的组织，就可以通过一种常规途径进行投放。可实现口服投放、腹腔内投放、静脉内投放、肌肉内投放、皮下投放、皮内投放、鼻内投放、肺内投放、直肠内投放、腔内投放、硬膜内、粘膜内投放，但可不局限于此。
根据本发明的一实例，上述药剂学组合物可用于向腹腔内或粘膜内进行投放，但可不局限于此。上述粘膜的位置不受特别限制，本发明所属技术领域的普通技术人员可从本领域中用于粘膜投放的身体位置中适当选择来进行投放。
根据本发明的一实例，上述药剂学组合物可用于向咽喉粘膜内进行投放，但可不局限于此。通过咽喉粘膜的疫苗化例如可使用气溶胶或点滴传递系统形态，但可不局限于此。
当利用本发明的药剂学组合物时，向粘膜进行投放也在个体内呈现有效的免疫原性，因而不仅可以消除以往利用注射剂来向皮下进行投放的不便，还可有利于向因用注射剂投入而尤其感到痛苦的婴幼儿进行投放，但可不局限于此。可将本发明的药剂学组合物进行投放的个体不受限制，可包括大鼠、小鼠、家畜、人类等的哺乳动物，但可不局限于此。本发明的组合物的有效投放量的范围可根据性别、体表面积、疾病的种类及重症度、年龄、对于药物的敏感度、投放途径及排泄比率、投放时间、治疗期间、靶细胞、表达水平等其他医学领域中众所周知的多种因素而不同，可由本发明所属技术领域的普通技术人员容易确定。
根据本发明的一实例，上述药剂学组合物还可包含药剂学上可接受的载体或免疫助剂，但可不局限于此。
作为可包含在本发明的药剂学组合物的载体，可例举乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油，但可不局限于此。
作为本发明中可使用的免疫助剂，可不受限制地使用本领域中通常使用的免疫助剂，作为上述免疫助剂，可例举霍乱毒素结合单位(cholera toxin binding unit)、铝盐(aluminum salts)、脂质乳剂(lipid emulsion)(MF-59)、合成洗涤剂(syntheticdetergent)(吐温，Tween)、微球(microspheres)、脂质体(liposomes)、粘膜粘附聚合物(mucoadhesive polymers)等，但不限于此，正在开发本领域的新的剂型，同样可使用这些。
本发明的药剂学组合物可根据通常的方法来以散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆、气溶胶等的口服型剂型、外用剂、栓剂或灭菌注射溶液的形态剂型化而使用，但可不局限于此。详细地，当进行剂型化时，可使用通常使用的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂来进行调配，但可不局限于此。
例如，用于口服投放的固体制剂包含片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体制剂可通过在上述化合物中混合至少一种赋形剂，例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等来进行调配。并且，除了单纯赋形剂之外，还可使用硬脂酸镁、滑石之类的多种润滑剂，相当于液态制剂的有悬浮剂、内服溶液剂、乳剂、糖浆剂等，除了作为普遍使用的单纯稀释剂的水、液体石蜡之外，可包含多种赋形剂，例如，湿润剂、甜味剂、芳香剂、保鲜剂等，但可不局限于此。
用于非口服投放的制剂可包含灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冷冻干燥制剂及栓剂，作为非水性溶剂、悬浮剂，可使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油之类的植物油、油酸乙酯之类的可注射的酯等，但可不局限于此。
优选实施例
以下，通过实施例更详细说明本发明，但以下实施例仅用于说明的目的，并不限定本发明的范围。
【实施例1】弱毒化的肺炎链球菌菌株THpep27的炎症性疾病、呼吸道病毒感染疾病或除了肺炎链球菌之外的细菌感染性疾病的抑制能力分析
1.材料及方法
弱毒化的肺炎链球菌菌株THpep27的制备
作为在本发明的实施例中使用的肺炎链球菌菌株的THpep27变异体为Choi SY等(Inactivated pep27mutant as an effective mucosal vaccine against a secondarylethal pneumococcal challenge in mice.Clin Exp Vaccine Res.2013)的文献中报告的菌株，除了在韩国授权专利第10-1252911号中公开的pep27突变肺炎链球菌菌株中不具有用于筛选的红霉素耐性标志物(ermAM)之外，是相同的菌株。
针对具有可用作用于选择的临时标志物的红霉素耐性标志物(ermAM)的Cheshire卡带(Genbank登记号(accession No)FJ981645)，利用从唐纳德·莫里森(DonaldMorrison)博士(芝加哥伊利诺伊大学，University of Illinois of Chicago)得到的引物(5'-TGG CTT ACC GTT CGT ATA G-3'(序列号2)和5'-TCG ATA CCG TTC GTA TAA TGT-3'(序列号3))，并作为扩增上游及下游序列的引物(5'-TCT CTA TCG GCC TCA AGC AG-3'(序列号4)和5'-CTA TAC GAA CGG TAA GCC A GAT TTT CAC CAC TGC TTT CG-3'(序列号5)及5'-ACA TTA TAC GAA CGG TAT CGA AAG GCC AGC AAG AGA CTA-3'(序列号6)和5'-CTGCGA GGC TTG CAC TGT AG-3'(序列号7)，将D39基因组脱氧核糖核酸(DNA)用作模板来通过聚合酶链式反应(PCR)进行连接。接着，使连接的生成物转化为D39来生成pep27突变体。
Cheshire卡带切割通过添加1％L-岩藻糖(fucose)(美国密苏里州圣路易斯西格玛，(Sigma,St.Louis,MO,USA))来进行诱导。将用岩藻糖处理的培养物涂抹于THY血液琼脂培养基来得到单一菌落。在各个菌落中，Cheshire卡带的存在使用下一个引物来通过聚合酶链式反应进行确认：5′-TCT CTA TCG GCC TCA AGC AG-3′(序列号8)和5′-CTG CGA GGCTTG CAC TGT AG-3′(序列号9)。突变体(THpep27)序列不仅利用Pep27抗体来通过免疫印迹分析进行确认，还通过核苷酸排序(韩国首尔Cosmo，(Cosmo,Seoul,Korea))来进行确认(未图示)。
为了在核糖核酸水平中确认THpep27突变体，使用之前记述的热酚方法来从处于初始对数期的细菌分离核糖核酸。利用DNase I(日本东京Takara(Takara,Tokyo,Japan))来去除脱氧核糖核酸之后，使用随机引物(Takara)来使1微克的细菌核糖核酸反转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)。反转录聚合酶链式反应使用提倡引物来根据制造人员的指针(Super Bio,American Building Restoration Products Inc.,Franklin,WI,USA)执行。
其他细菌菌株的准备
在本发明中试验的肺炎链球菌菌株示于下列表1中。
表1
以实验室中使用的方法培养肺炎链球菌(S.pneumoniae)血清型2号(D39)野生型菌株、血清型3号(A66.1)、血清型6B(BG7322)及THpep27变异体(D39Δpep27)来使用(Kim等,2012)。对于肺炎链球菌，在37℃温度下，在血液琼脂平板中培养一宿之后，在添加0.5％酵母提取物(THY，Difco实验室(Laboratories))的托德·休伊特(Todd-Hewitt)肉汤中，在37℃温度下，培养3小时。适当稀释各个细菌培养液，使CD1小鼠咽喉(i.n.)受到10μl的肺炎链球菌菌株的感染。
黄色葡萄球菌(S.aureus ATCC 25923)和肺炎杆菌(K.pneumoniae,ATCC 9997)从韩国微生物保存中心(KCCM，韩国首尔)进行购买，来在添加脱纤维素阳血液的脑心脏提取(brain heart infusion，BHI)培养基中在37℃温度下培养一宿之后，接种于脑心脏提取培养液来在37℃温度下进行培养，直到OD550＝0.5。
流感病毒A/加利福尼亚(California)/04/2009(H1N1)菌株以之前使用的方法在鸡蛋中进行培养(Shim等，2013)。
生物体内感染研究
将4周的雄性CD1、BALB/c小鼠(东方，韩国)用于感染实验中。在本实施例中使用动物是在韩国成均馆大学动物伦理委员会中根据韩国动物保护法的指针得到承认的。
在疫苗有效性评价中，在生存日数测定实验中，以2周或1周的间隔将1×107至1×108个Δpep27菌株3次接种于小鼠的咽喉(i.n.)。最终进行免疫1周至2周之后，利用1×107至1×108个毒性菌株D39或6B来使小鼠咽喉受到感染。对于如此感染的小鼠的存活，最初5天每天观察4次，之后5天每天观察2次，之后，每天观察来进行监控，直到感染后14天。
为了评价集落形成抑制能力，每2周将约1×107～1×108个Δpep273次接种于小鼠的咽喉，并在最终接种1周至2周之后，使小鼠受到约5×106～1×107个肺炎链球菌的感染。使小鼠在指示时间牺牲，并以无菌的方式去除咽喉部之后，使用均质机(PRO ScientificInc.,Oxford,CT,USA，型号200双重绝缘(Model 200 Double insulated))来在1ml的磷酸盐缓冲液(除了血液之外)中在冰上以最大速度进行均质化，并利用灭菌磷酸盐缓冲液来连续进行稀释，从而接种于包含5～10μg/ml的庆大霉素(gentamycin)的血液琼脂培养基来筛选肺炎链球菌。接着，反复两次在37℃温度下，在包含95％空气-5％CO2的状态下，将板培养约18小时来数集落数的实验，从而使用平均值。
为了调查是否可利用Δpep27疫苗来防御黄色葡萄球菌及肺炎杆菌(K.pneumoniae)感染，将Δpep27以3次接种于小鼠的咽喉，并在最终将Δpep27接种10天之后，分别将1×108个或2×106个的黄色葡萄球菌或肺炎杆菌悬浮于50μl的磷酸盐缓冲液来使咽喉受到感染。接着，在感染24小时及48小时之后，收集肺及鼻腔清洗水，并进行均质化来适当连续稀释后，涂抹于脑心脏提取血液琼脂培养基来在37℃温度下培养一宿，从而数菌数。
病毒及肺炎链球菌感染实验
将约1×108个Δpep27悬浮于50μl的磷酸盐缓冲液来以1周的间隔3次接种于小鼠(BALB/c雌性,6-8周龄,韩国Koatech)，并在最后接种10天之后，在50μl的磷酸盐缓冲液中以成为0.02致死量(LD)的方式准备H1N1流感病毒来使咽喉受到感染，从而每天监控体重。在流感感染后10-12天之后，将1×108个D39悬浮于50μl的磷酸盐缓冲液来使小鼠咽喉受到感染之后，测定生存率。
脾脏细胞分离
每2周以1×107至1×108个将Δpep27(THpep27变异体)3次接种于小鼠咽喉。并在最终接种1周之后，取出脾脏，并对为了刺激T淋巴细胞而分离的脾脏细胞利用抗-CD3e(5μl/ml，eBioscience)及抗-CD28(3μl/ml，eBioscience)抗体来进行处理(Bashour等，2014)。在培养24小时之后得到，从而测定培养基的细胞因子水平。
细胞因子的测定
在支气管肺泡清洗液(bronchoalveolar lavage，BAL)、血清及脾脏细胞中，白细胞介素(Interleukin，IL)-17、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、白细胞介素-4及白细胞介素-10的浓度使用市场上销售中的酶联免疫吸附分析(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)试剂盒(BD Biosciences,San Diego,CA,USA)来根据制造商的指示进行测定。
IgG抗体滴度及Ig亚型的确定
每2周将1×107至1×108个Δpep273次接种于小鼠咽喉。在最终接种7天之后，通过眼窝采血得到血清来在-80℃温度下保管至酶联免疫吸附实验为止。如之前所记述，对抗体进行滴定(Roche等，2007、Kim等，2012、Cohen等，2013)，Ig亚型利用小鼠Ig同种型酶联免疫吸附实验试剂盒(eBioscience，USA)来进行测定。
在同时感染研究中，血清中的IgG滴度使用在由肺炎链球菌菌溶解物(D39、A66.1、BG7322)或血清型2号胶囊涂敷的96孔免疫板或磷酸盐缓冲液溶液中纯化的PspA蛋白质(1μg/ml)并通过酶联免疫吸附实验方法来进行测定(Kim等，2012、Cohen等，2013)。
肺中病毒及菌数的测定
利用Δpep27来对小鼠(BALB/c4只/组)进行咽喉接种，如上所述，在用H1N1或H3N2流感病毒进行感染之后，收集肺样品，并按已报告的方法进行分析(Shim等，2013)。
在流感病毒感染5天之后，使小鼠肺通过70μm的过滤器(strainer)，并进行离心分离来在-80℃温度下将上清液保管至测定到滴度。为了测定病毒滴度(titer)，以MEM(无1％IgG的牛血清白蛋白(BSA)、1X青霉素-链霉素)培养基将MDCK细胞(2×104细胞/孔)播种于96孔板之后，在37℃温度下将板培养4小时。之后，利用连续稀释2倍的肺均质化物上清液来使培养的细胞感染，并培养一宿。接着，扔掉上清液，利用抗流感A抗体并利用TCID50/ml来进行测定(Wu等，2015)。
实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)
分离腹腔巨噬细胞来进行培养之后，使用RNAiso plus(日本(Japan)TAKARA)来提取总核糖核酸。逆转录(RT)-聚合酶链式反应(PCR)使用一步法逆转录实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)试剂盒(韩国(Korea)Enzynomics)来执行。基因特异引物序列如下所示：将IL-10基因(Forward[F]：5'-AGC CAC CTC ATG CTA GAG C(序列号10)、Reverse[R]：5'-GCC TGG TCT GGC ATC ACT AC(序列号11))、IL-1β的基因(F：5'-CTG GTG TGT GAC GTTCCC AT(序列号12)、R：5'-TGT CGT TGC TTG GTT CTC CT(序列号13))、TNF-a基因(F：5'-CAC AAG ATG CTG GGA CAG TGA(序列号14)、R：5'-TCC TTG ATG GTG GTG CAT GA(序列号15))、GAPDH基因(引物F：5'-TGC ATC CTG CAC CAC CAA(序列号16)、R：5'-TCC ACG ATGCCA AAG TTG TC(序列号17))作为对照组。
聚合酶链式反应程序执行如下：维持(Holding，在95℃温度下10分钟)；在40个周期期间，每个周期(在95℃温度下15秒钟、在55℃温度下30秒钟、在72℃温度下30秒钟)；熔体曲线(在95℃温度下15秒钟、在60℃温度下1分钟、在95℃温度下15秒钟)。
高通量测序(High Throughput Sequencing)
为了在Δpep27接种之后，测定在肺及脾脏中诱导的基因表达，在不麻醉的情况下，以2周的间隔将1×107-1×108个肺炎链球菌Δpep27(THpep27：Choi等，2013)3次接种于小鼠(Balb/c4周龄)咽喉(i.n.)。在肺及脾脏中使用Trizol试剂(英杰(Invitrogen))来提取核糖核酸，并利用500ng的总核糖核酸来构建排序库。之后，为了排序，利用LEXOGENQuant-Seq库准备试剂盒(Cat#001.24)来根据标准方案构建核糖核酸库。基因表达通过使用Illumina NextSeq 500的高速大量(high-throughput)排序来进行测定。
脱氧核糖核酸(DNA)处理步骤
在序时碱基响应(base call)中使用Illumina Casava1.8软件。序列阅读为了接头序列而被整顿，使用fastx_trimmer来不再对低复杂性或低品质序列进行处理之后，使用Bowtie2来映射于mm10总基因组。读取次数提取及正规化使用edgeR来执行。利用独创性途径分析的实验及系统生物学分析在e-biogen(韩国首尔(Seoul，Korea))中执行。
基因表达分析数据寄托于NCBI[GEO登记号(accession number)GSE93718](http://www.ncbi.nlm.nih.gov.proxy.konkuk.ac.kr:8080/geo/)。
对于肠炎症性疾病的防御能力的测定
向小鼠(C57BL/6雄性，4周龄)的腹腔内注入100μl的氯胺酮来麻醉之后，以1周一次的间隔将1×107至1×108个△pep27进行3次咽喉接种。测定小鼠的体重，并随机按每个实验组使用2只来分为4个实验组。在各个一系列的实验中使用的小鼠实验组如下：不处理硫酸葡聚糖钠(DSS)的对照组、仅将5％硫酸葡聚糖钠投放的实验对照组、仅接种Pep27的实验组及将Pep27+5％硫酸葡聚糖钠投放的组。使小鼠连续14天喝平均分子量为5000(美国密苏里州圣路易斯西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Missouri,USA))的硫酸葡聚糖钠(5％、w/v)来诱导大肠炎(Wirtz等，2007)。每天准备新的硫酸葡聚糖钠溶液。使对照组小鼠仅喝自来水。
所有对照组及实验对照组在研究期间将以与硫酸葡聚糖钠投放组相同的方式投放的等量的溶剂(vehicle，盐水)进行投放。
<△基于Pep27疫苗接种的小鼠中的硫酸葡聚糖钠诱导肠炎抑制实验>
肠疾病(IBD)试样采集
在将5％硫酸葡聚糖钠投放14天之后，以用CO2窒息的方式牺牲实验动物，并施行死后开腹术。去除盲肠至肛门的整个大肠，分为近位部、中间部及末端部，并分离选择出的组织来用磷酸盐缓冲液(PBS)进行清洗之后，在-80℃温度下，进行保管，直到进行分析。
结肠切片的定量组织学(病症活动指数(Disease activity index，DAI))
测定饮用量和体重减少、粪硬度、直肠出血及大便中的总血液的存在来每天评价大肠炎的进行情况，还评价临床症状。还每天监控小鼠的病态(无聊感、无力)。
这每个变量根据以下提示的基准来定分数，其按照已报告的论文中提示的内容来计算各个动物的平均每天病症活动指数(DAI)(Wirtz等，2007、Jawhara及Poulain，2007)。
并且，大肠炎症通过肉眼测定在原状态下的未牵拉的旋转型接合部至肛门边界的结肠的长度来进行评价。按各个组详细记录病理学见解，为了评价炎症最严重的器官中发生变化的时期和其程度，使用以视觉的方式从0至5分对组织定分数的体系。
使用将之前得到验证的病理学分数等级系统(Jawhara及Poulain，2007、Xu等，2007)进行变形来评价大肠炎的程度的方法。将所有实验至少反复两次来在所有组中计算如下。
1)体重减少，无变化，0；＜5％、1；6-10％、2；11-20％、3；＞20％、4；
2)粪硬度(Stool consistency)、正常或形成好的颗粒＝0；未附着于肛门的揉团形状的贴膏＝1；以附着于肛门的状态残留的液体便2；以少量的血有粘性，3；完整液体或有血，或10分钟后也不排泄；4；
3)无直肠出血、血球血液，0；肛门可见血液，1；毛可见血液，2；直肠大出血，4分
4)一般的外观，正常，0；粘液质，1；无力且毛发直立(piloerect)，2；无力且弯曲，3；未动且疼，4.
统计分析
所有数据由两次的独立实验值的平均±标准偏差表示。统计学比较使用单向方差分析并通过邦费罗尼测试(Bonferroni’s test)来执行。小于0.05的P值视为统计学上显著。
2.结果
2-1.事例#1：HTS和系统生物学分析提示来自主要病变的防御功能
2-1-1.Δpep27接种从多种病变防御小鼠
肺中的系统生物学分析提示Δpep27咽喉接种防御胃肠炎及大肠异常变化(图1)。并且，脾脏中的系统生物学分析表示因Δpep27接种而从流感病毒感染得到防御(图2)。
2-1-2.Δpep27接种诱导Treg细胞
肺中的系统生物学分析还表示因Δpep27的接种而在肺中诱导TGF-β(图3)。在图3中，绿色表示基因表达得到抑制，红色表示基因得到诱导。为了确认利用Δpep27接种来诱导Treg，对接种的小鼠的脾脏细胞进行流式细胞荧光分选技术(FACS)分析。最终，当进行Δpep27接种时，Th2、Th17及Treg细胞集团增加，但Th1细胞未增加(图4)，启示如此诱导的Treg细胞可在免疫耐受中起到某种作用。为了支持Treg得到诱导，测定脾脏细胞及血清的细胞因子水平。一贯性地，在脾脏中，干扰素(IFN)-γ、IL-4、IL-17及IL-10显著诱导(图5)。并且，在血清中，IFN-γ、IL-17及IL-10也显著诱导，但IL-4水平未显著变化(图6)。这种结果提示通过Treg细胞诱导来诱导抗炎症性细胞因子IL-10的生产，从而加强免疫耐受。
2-1-3.基于Δpep27接种的IL-10诱导
为了支持免疫耐受反应，在肺及支气管肺泡清洗液(BAL)中，测定IL-10及IL-17信使核糖核酸水平。一贯地，由于Δpep27接种，在肺中，IL-10和IL-17信使核糖核酸水平均显著增加(图7及图8)。
2-1-4.基于Δpep27接种的记忆反应诱导
为了确认咽喉接种是否可引起记忆反应，得到来自接种的小鼠的脾脏细胞，并测定记忆反应。根据实验结果，由于Δpep27接种，在脾脏中，中央记忆T细胞(CD4、CCR7、CD62L)和记忆Tfh细胞(CD4、CXCR5、CCR7)增加(图9)。
为了再次确认记忆反应，测定多种血清免疫球蛋白亚型的抗体滴度。如预想，Δpep27疫苗接种诱导IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3之类的多种免疫球蛋白亚型(图10)。并且，对于3个类型的肺炎链球菌总细胞的IgG抗体水平也因疫苗接种而显著增加(图11)。因此，确认到咽喉疫苗接种诱导记忆反应。
2-2.事例2：流感病毒的同时感染防御
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感A病毒(IAV)为呼吸道感染的主要原因菌(Bosch等，2013、Shak等，2013)。肺炎链球菌或流感A病毒本身引起呼吸道疾病，但在流感病毒感染后，发生第二次感染，从而增加死亡率(Mina及Klugman，2013)。但是，当前可利用的肺炎链球菌多糖类接合疫苗PCV13无法有效防御第二次肺炎链球菌感染(Metzger等，2015)。
2-2-1.防御基于Δpep27接种的第二次肺炎链球菌感染
在之前的研究中，确认到当将Δpep27咽喉接种于小鼠时，诱导IgG，并从异种肺炎链球菌感染得到防御(Kim等，2012)。在本发明中，确认到Δpep27接种是否不仅增加栓菌(whole bacterial cells)，还增加对于特定抗原的抗体滴度。实验结果表明利用Δpep27咽喉接种来不仅增加血清型2号(D39)栓菌，还对血清型3号及6B增加IgG滴度，从而同种及异种型肺炎链球菌均比非免疫对照组诱导显著高的体液免疫(图11)。并且，当测定流感感染之后的细胞因子水平时，进行了免疫的实验组中INF-γ、TNF-α、IL-1β水平全部比非免疫对照组显著低，从而提示存在免疫耐受现象(图12)。并且，当通过进行免疫来测定对于特定抗原、PspA蛋白质及血清型2号多糖类荚膜的IgG滴度时，Δpep27接种增加PspA滴度，但未增加对于多糖类荚膜的滴度(图13)。
为了调查是否利用Δpep27咽喉接种来从第二次肺炎链球菌感染得到防御，以0.02致死量(lethal dose，LD)使小鼠受到H1N1流感病毒的感染。流感病毒感染10天之后，使小鼠受到毒性肺炎链球菌D39菌株的感染，并测定生存率。D39感染之后未接种疫苗的小鼠(磷酸盐缓冲液/H1N1)得肺炎，相反，咽喉接种的大部分小鼠(THpep27/H1N1)成功生存(图14)，这种结果提示当将Δpep27咽喉接种于小鼠时，不仅可从流感病毒感染得到防御，还可从第二次肺炎链球菌感染得到防御。
并且，咽喉接种之后感染肺炎链球菌之后测定菌数，其结果，在接受疫苗接种的所有小鼠肺中，与未接种的对照组相比，检查到更少数的菌(图15)，其表示因Δpep27咽喉接种而小鼠受到流感感染之后也从第二次肺炎链球菌感染成功得到防御。
2-2-2.基于Δpep27接种的肺的病毒及细菌数的减少
为了调查是否因Δpep27接种而减少流感病毒数，测定流感病毒感染之后体重是否减少。有趣的是，接种Δpep27疫苗的所有小鼠在流感感染之后体重也不减少，但未接种疫苗的小鼠的体重显著减少(图16)。通过Δpep27疫苗接种来抑制流感病毒感染引起的体重减少，因而追加地，为了确认因Δpep27疫苗接种而在肺中流感病毒复制所受的影响，利用TCID50来测定流感感染的小鼠肺中的病毒数。惊人的是，接种疫苗的小鼠与未接种疫苗的对照组相比，呈现显著低的病毒数(图17)。其结果表示因Δpep27咽喉疫苗接种而不仅减少肺炎链球菌感染，也显著减少流感病毒感染。
2-3.事例3：基于Δpep27接种的其他细菌感染防御
2-3-1.基于Δpep27接种的革兰氏阴性细菌感染防御
为了确认是否可通过Δpep27疫苗接种来防止其他细菌感染的固定，将Δpep27疫苗接种于小鼠之后，使作为革兰氏阴性菌的肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)感染来测定组织内菌数。在疫苗接种组中，感染24小时之后，肺及血液内肺炎杆菌数与未接种疫苗的对照组相比，显著减少(图18)，因而证明可通过Δpep27疫苗接种来预防革兰氏阴性细菌感染。
2-3-2.基于Δpep27接种的革兰氏阳性细菌感染防御
为了再次确认Δpep27疫苗接种是否可防止其他细菌感染的固定，将Δpep27疫苗接种于小鼠之后，使作为革兰氏阳性菌的黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染来测定组织内生产细菌数。有趣的是，在Δpep27疫苗接种组中，小鼠的肺及鼻清洗液中的细菌集落数与未接种疫苗的对照组相比，显著减少(图19)。其结果证明Δpep27疫苗接种可预防革兰氏阳性细菌之类的其他细菌感染。
2-4.事例4：肠炎症性疾病防御
口服免疫耐受现象从人类的类风湿性关节炎(RA)、过敏性疾病、糖尿病、动脉硬化症、大肠炎疾病等得到研究(Faria及Weiner，2005)。将来源于沙门氏菌的分泌蛋白质(SseB)进行咽喉接种来诱导内脏及全身IgA、Th1及Th17反应，即使以口服的方式进行致命的感染，肠组织及脾脏中的细菌数也减少(Pigny等，2016)。但是，尚未有防御肠内炎症性疾病的咽喉疫苗的报告。
2-4-1.基于Δpep27疫苗接种的肠炎症性疾病防御
为了确认Δpep27疫苗接种是否可抑制肠炎症性疾病，将疫苗接种于小鼠的咽喉，并利用硫酸葡聚糖钠来诱导大肠炎。实验结果表明将5％硫酸葡聚糖钠添加于饮用水之后的第九天开始病症指数恶化，且体重也显著减少。在仅单独处理5％硫酸葡聚糖钠的小鼠中，体重显著减少，但接种Δpep27并处理5％硫酸葡聚糖钠的实验组与硫酸葡聚糖钠单独处理组相比，体重显著少减少(图20)。
当比较整体的临床疾病活动指数分数(p＜0.05，单向方差分析之后邦费罗尼检查，硫酸葡聚糖钠处理6-9天)时，5％硫酸葡聚糖钠单独处理组与Δpep27+5％硫酸葡聚糖钠实验组相比，大便一贯性分数显著高(图21)。即，提示利用硫酸葡聚糖钠来诱导的大肠炎症恶化，从而在硫酸葡聚糖钠单独处理组中，临床活动指数高，但疫苗投放组与正常组相似地大肠炎症低。
结肠长度变短，在诱发硫酸葡聚糖钠的大肠炎模型中用作炎症标志物，实际上，在硫酸葡聚糖钠投放组中，结肠的长度显著变短(图22)。因此，在硫酸葡聚糖钠组中，结肠重量/结肠长度的比率显著增加，但Δpep27疫苗接种组与硫酸葡聚糖钠组相比，表示几乎接近于正常的比率(图23)。
2-4-2.基于Δpep27疫苗接种的炎症性细胞因子水平抑制
为了确认Δpep27疫苗接种减少肠炎症，测定大肠中的细胞因子信使核糖核酸水平。实验结果表明在Δpep27疫苗接种组中，促炎性IL-1β信使核糖核酸水平与非免疫的对照组相比，显著减少(图24)。并且，通过咽喉疫苗接种，IL-17A、TNF-α及IL-6的信使核糖核酸水平也与非免疫的对照组相比，更加得到抑制(图24)，因而证明咽喉粘膜疫苗接种抑制细胞因子表达的事实。
【实施例2】弱毒化的肺炎链球菌菌株THpep27的过敏性疾病的抑制能力分析
1.材料及方法
1.1.弱毒化的肺炎链球菌菌株THpep27
Δpep27肺炎链球菌菌株(THpep27,D39Δpep27::Cheshire)为Choi SY等(Inactivated pep27mutant as an effective mucosal vaccine against a secondarylethal pneumococcal challenge in mice.Clin Exp Vaccine Res.2013)的文献中报告的菌株，除了在韩国授权专利第10-1252911号中公开的pep27突变肺炎链球菌菌株中不具有用于筛选的红霉素耐性标志物之外，是相同的菌株。
针对具有可用作用于选择的临时标志物的红霉素耐性标志物(ermAM)的Cheshire卡带(Genbank登记号(accession No)FJ981645)，利用从唐纳德·莫里森博士(芝加哥伊利诺伊大学)得到的引物(5'-TGG CTT ACC GTT CGT ATA G-3'(序列号2)和5'-TCG ATA CCGTTC GTA TAA TGT-3'(序列号3))，并作为扩增上游及下游序列的引物(5'-TCT CTA TCGGCC TCA AGC AG-3'(序列号4)和5'-CTA TAC GAA CGG TAA GCC A GAT TTT CAC CAC TGCTTT CG-3'(序列号5)及5'-ACA TTA TAC GAA CGG TAT CGA AAG GCC AGC AAG AGA CTA-3'(序列号6)和5'-CTG CGA GGC TTG CAC TGT AG-3'(序列号7))，将D39基因组脱氧核糖核酸用作模板来通过聚合酶链式反应进行连接。接着，使连接的生成物转化为D39来生成pep27突变体。
Cheshire卡带切割通过添加1％L-岩藻糖(美国密苏里州圣路易斯西格玛)来进行诱导。将用岩藻糖处理的培养物涂抹于THY血液琼脂培养基来得到单一菌落。在各个菌落中，Cheshire卡带的存在使用下一个引物来通过聚合酶链式反应进行确认：5′-TCT CTATCG GCC TCA AGC AG-3′(序列号8)和5′-CTG CGA GGC TTG CAC TGT AG-3′(序列号9)。突变体(THpep27)序列不仅利用Pep27抗体来通过免疫印迹分析进行确认，还通过核苷酸排序(韩国首尔Cosmo)来进行确认(未图示)。
为了在核糖核酸水平中确认THpep27突变体，使用之前记述的热酚方法来从处于初始对数期的细菌分离核糖核酸。利用DNase I(日本东京Takara)来去除脱氧核糖核酸之后，使用随机引物(Takara)来使1微克的细菌核糖核酸反转录为互补脱氧核糖核酸。反转录聚合酶链式反应使用提倡引物来根据制造人员的指针(Super Bio,American BuildingRestoration Products Inc.,Franklin,WI,USA)执行。
在37℃的THY肉汤(包含0.5％酵母提取物的托德·休伊特肉汤，Difco实验室)中，对制备的THpep27突变肺炎链球菌菌株进行培养，直到OD550值成为0.3(1×108CFU/ml)。利用磷酸盐缓冲液来清洗培养的菌之后，利用过滤的磷酸盐缓冲液来稀释成最终浓度1×108CFU/50μl，从而用于进行免疫。
1.2.实验动物
购买BALB/c雌性小鼠(5周龄，韩国东方)之后，在动物室中驯化7天来稳定之后使用。以4：1混合氯胺酮(氯胺酮注射，柳韩洋行，韩国)和水杨嗪(伦品，拜耳韩国公司(BayerKorea Ltd)，韩国)之后，将100μl的用磷酸盐缓冲液稀释两倍的溶液注射于小鼠腹腔，以进行麻醉。在攻击(challenge)及疫苗投放之前进行麻醉，利用实验动物的实验根据韩国成均馆大学动物伦理委员会的指南进行。
1.3.Δpep27突变体的哮喘预防效果的测定
1)将小鼠分为3组(n＝7/组)来区分为提供灭菌数(磷酸盐缓冲液)的正常组、利用卵清蛋白(OVA，Ovalbumin)诱导哮喘之后提供灭菌数的哮喘诱导组及pep27变异体(Δpep27)疫苗投放之后的哮喘诱导组。
2)在实验开始第0天、第7天、第14天麻醉小鼠，并将1×108CFU/50μl的Δpep27进行咽喉(I.N)接种来进行免疫。在实验开始第38天和第49天将50μg的卵清蛋白(美国西格玛化学公司鸡卵清蛋白(Albumin from chicken egg white,Sigma Chemical Co.,USA))和2mg的Alum(美国赛默公司氢氧化铝水合物(Aluminum hydroxide hydrate,Thermo Co.,USA))添加于100μl的0.9％盐水(pH4.0，韩国dynebio)，并向腹腔内注射在4℃温度下涡旋4小时来以溶解的方式制备的致敏液100μl，以进行致敏。之后，从第59天至第64天，每天以成为0.4mg/ml的方式将卵清蛋白溶解于生理盐水6天，从而以分别12.5μl的方式向咽喉两侧点滴25μl来进行攻击(最终注入量卵清蛋白10μg/只)，以诱导哮喘。在最后卵清蛋白攻击24小时之后，牺牲实验动物来采集肺支气管清洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，以测定细胞因子，并分离肺组织来进行固定之后，执行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin，H&E)染色(图25及图26)。
1.4.哮喘治疗效果的测定
1)将小鼠区分为3组(n＝7/组)来区分为提供灭菌数(磷酸盐缓冲液)的正常组、将卵清蛋白进行投放的哮喘组(哮喘诱导组)及卵清蛋白投放之后的Δpep27变异体疫苗投放组(哮喘治疗实验组)。
2)哮喘诱导组：具体地，在实验开始第0天及第10天，在除了正常组之外的所有组中，将50μg的卵清蛋白(Albumin from chicken egg white,Sigma Chemical Co.,USA)和2mg的Alum(Aluminum hydroxide hydrate,Thermo Co.,USA)添加于100μl的0.9％盐水(pH4.0，韩国dynebio)，并向腹腔内注射在4℃温度下涡旋4小时来制备的致敏液100μl，以进行致敏。之后，在6天期间，即，从经过10天的20天至25天，针对两侧咽喉(Intranasal，I.N)，以12.5μl的方式用以成为0.4mg/ml的方式将卵清蛋白溶解于生理盐水的溶液25μl(最终注入量10μg/只)进行攻击。在正常组中，仅将生理盐水进行投放(图27A)。
3)哮喘治疗实验组：在受到如上述2)中的卵清蛋白的攻击一周之后，1周1次将1×108的CFU/50μl的Δpep27进行3次咽喉接种来将小鼠进行免疫。在3周的治疗期间，从疫苗投放之前3天开始，1周1次将10μg/25μl的卵清蛋白进行3次(共9次)I.N.攻击来诱导哮喘。最后疫苗投放1周之后，进行最后卵清蛋白攻击，并在24小时之后，牺牲小鼠(图27B)。
1.5.组织化学检查
分离肺及支气管组织来利用10％(v/v)甲醛溶液进行固定之后，执行石蜡固定(paraffin block)。以4μm的厚度切割上述石蜡固定的组织之后，实施苏木精-伊红染色。利用光学显微镜来对苏木精-伊红染色的组织进行拍摄。组织化学检查委托韩国诺特公司(KNOTUS Co.,Ltd.)来进行实施(图28)。
1.6.细胞因子分析
采集肺支气管清洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)来测定细胞因子水平。具体地，打开小鼠的气道，并连接装有肺支气管清洗用磷酸盐缓冲液的导管之后，将1.0ml的磷酸盐缓冲液慢慢推入肺支气管，并抽出0.9ml左右之后，将保持不变地再次推入并抽出的过程反复两次，来得到总0.8ml的肺支气管清洗液。在4℃温度下，以3000rpm将上述采集的肺支气管清洗液离心分离10分钟之后，在-70℃温度下，将上清液进行冷冻保管，直到用细胞因子测定用肺支气管清洗液分离来使用为止。肺支气管清洗液的细胞因子水平利用酶联免疫吸附实验试剂盒(ELISA Ready-SET-Go！,eBioscience,San Diego)来进行测定。
1.7.统计
实验数据由平均±标准偏差表示。对于细胞因子测定的统计处理通过单向方差分析执行。各个组的比较利用邦费罗尼测试(Bonferroni test)来执行(*，P≤0.05、**，P≤0.01、***，P≤0.001)。判断为当P＜0.05时，具有显著差异。
2.结果
2.1.Δpep27突变体的哮喘预防功效
2.1.1.由基于Δpep27疫苗接种的哮喘诱导的细胞因子分泌抑制
当利用酶联免疫吸附实验试剂盒来测定肺泡中的细胞因子水平时，Δpep27疫苗接种组与哮喘组相比，过敏诱发细胞因子(Th2 cytokine，Cho等，2002)IL-4、IL-5、IL-13的水平分别显著减少，从而以与正常对照组类似的水平减少(图25)。
2.1.2.基于Δpep27疫苗接种的哮喘中的气道浮肿抑制
就气道过敏疾病而言，当进行过敏诱发物质投放时，由于炎症，气道显著变厚(图26，哮喘组)。当对炎症(Hematoxylin-eosin，HE)及杯状细胞(goblet cells)(Periodicacid Schiff，PAS)进行组织学免疫化学染色来以400倍观察时，Δpep27疫苗投放组与哮喘组相比，显著地抑制炎症，从而呈现与对照组类似的水平(图26，疫苗投放组)。
2.2.Δpep27突变体的哮喘治疗功效
2.2.1.基于Δpep27疫苗的哮喘相关细胞因子抑制的治疗功效
当以1周的间隔将Δpep27疫苗接种3次，并在最终进行免疫1周之后，对小鼠的肺泡液中的细胞因子水平进行定量时(图27A)，在哮喘组中，Th2细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)水平显著增加，但在疫苗投放组中，呈现与正常组类似的水平(图27B)。
2.2.2.当Δpep27疫苗投放时基于肺的炎症抑制的治疗功效
当进行苏木精-伊红染色来观察实验的小鼠的肺时，Δpep27疫苗投放组(C)与哮喘诱发组(B)相比，显著地抑制炎症。尤其，在疫苗投放组中，抑制支气管和血管周边的炎症细胞浸润及粘液分泌，从而呈现与正常对照组(A)几乎类似的形态(图28)。
3.讨论
至今，利用微生物的哮喘预防/治疗相关论文仅涉及如下：当吸入非活性化草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)时，在中等程度的儿童哮喘患者中，支气管过敏反应得到抑制(Ming等，2013)，因吸入非活性化的草分枝杆菌而抑制IL-23R表达，从而抑制由IL-17生成γδT细胞介导的气道炎症，以有利于哮喘治疗(Ming等，2017)。并且，据报告，将弱毒化百日咳菌株BPZE1接种于小鼠咽喉来减少过敏性气道炎症和接触性皮肤过敏反应，从而可用于这些疾病的预防及治疗(Li等，2012)，据报告，在小鼠模型中，当将白喉和破伤风弱毒化毒素单独或与百日咳栓菌疫苗一同接种时，抑制因过敏而诱导的Th2免疫反应，从而可用于气道炎症或过敏反应抑制(Grüber等，2006)。
并且，当感染肺炎链球菌时，诱导调节T-细胞来抑制过敏性气道疾病(Preston等，2011)。不仅如此，若将当前市场上销售中的肺炎链球菌接合疫苗进行咽喉接种，则抑制向气道过敏疾病发展，但当进行肌肉注射时，没有效果(Thorburn等，2010)。因此，表明如下：当将作为肺炎链球菌成分的多糖类和弱毒化毒素注入于气道时，抑制过敏性气道疾病，并诱导用于抑制过敏性气道疾病的产生的调节T细胞，从而回避对于过敏诱发物质的免疫反应，并进行抑制(Thorburn等，2013)。但是，就利用细菌的哮喘的预防及治疗方法而言，除了弱毒化的百日咳菌之外，大部分毒性强，从而全部只能使用非活性化的菌或特定成分。并且，据报告，咽喉接种方法与皮下接种方法相比，在抑制气道过敏反应方面更有效(Takabayashi等，2003)。
百日咳菌感染在小鼠过敏气道疾病模型中还可诱导Th1反应(IFN-γ水平增加)来使炎症恶化(Ennis等，2004、Cho等，2002、Kumar等，2004)。因此，IFN-γ水平不被诱导，需要抑制过敏反应。当将肺炎链球菌死菌注入于气道来测定哮喘预防效果时，IL-5、IL-13水平未显著性地得到抑制，诱导Th1反应来显著性地增加IFN-γ水平(Preston等，2007、Gibson等，2012、美国专利8226959)。即，即使诱导Th1反应来抑制Th2反应，也无法排除炎症恶化的可能性。因此，Gibson等(2012，美国专利8226959)分离肺炎链球菌成分来聚焦于过敏性气道疾病抑制功效。
但是，当使用本发明的弱毒化的Δpep27变异体时，不仅是Th2细胞因子(IL-13及IL-4)，Th1细胞因子(IFN-γ)的水平也具有显著性地进行抑制，从而呈现正常水平，在组织学见解上，也与正常组相似。因此，期待包含本发明的弱毒化的肺炎链球菌菌株的药剂学组合物可成为比以往的疫苗或医药更安全的过敏疾病预防或治疗剂。
上述的本发明的说明用于例示，本发明所属技术领域的普通技术人员应当理解在不变更本发明的技术思想或必要特征的情况下能够以不同的具体形态容易进行变形。因此，应当仅理解为以上记述的多个实施例在所有方面是例示性的，而非限定。例如，以单一型说明的各个结构要素还可分散地实施，同样，分散说明的多个结构要素也能够以结合的形态实施。
本发明的范围由所附的发明要求保护范围表示，而不是上述详细说明，应解释为发明要求保护范围的含义及范围以及从其等同概念导出的所有变更或变形形态包括在本发明的范围。
<110> 成均馆大学校产学协力团
<120> 包含弱毒化的肺炎链球菌菌株的药剂学组合物及其用途
<130> 1
<150> KR 1020170053512
<151> 2017-04-26
<150> KR 1020180029765
<151> 2018-03-14
<160> 17
<170> KoPatentIn 3.0
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<223> IL-1b primer R
<400> 13
tgtcgttgct tggttctcct 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF-a primer F
<400> 14
cacaagatgc tgggacagtg a 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF-a primer R
<400> 15
tccttgatgg tggtgcatga 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH primer F
<400> 16
tgcatcctgc accaccaa 18
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH primer R
<400> 17
tccacgatgc caaagttgtc 20

Claims (19)

1.一种炎症性疾病、呼吸道病毒感染疾病、除了肺炎链球菌之外的细菌感染性疾病或过敏性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其中，包含弱毒化的肺炎链球菌菌株。
2.根据权利要求1所述的药剂学组合物，其中，在所述弱毒化的肺炎链球菌菌株中，由序列号1表示的pep27基因核酸序列的1号至53号缺失。
3.根据权利要求1所述的药剂学组合物，其中，所述炎症性疾病选自哮喘、支气管炎、肺炎、败血症、鼻炎、炎症性肠疾病、胃肠炎、大肠炎、克罗恩病、胰腺炎、动脉粥样硬化症及关节炎。
4.根据权利要求1所述的药剂学组合物，其中，所述呼吸道病毒选自偏肺病毒、冠状病毒、肠道病毒、呼吸道细胞融合病毒、腺病毒、博卡病毒、鼻病毒及流感病毒。
5.根据权利要求1所述的药剂学组合物，其中，所述细菌感染性疾病选自革兰氏阳性菌感染性疾病及革兰氏阴性菌感染性疾病。
6.根据权利要求5所述的药剂学组合物，其中，所述革兰氏阳性菌选自葡萄球菌、链球菌、破伤风梭菌及炭疽杆菌，所述革兰氏阴性菌选自沙门氏菌、志贺氏菌、肺炎杆菌、大肠杆菌及霍乱弧菌。
7.根据权利要求1所述的药剂学组合物，其种，所述过敏性疾病为选自哮喘、过敏性鼻炎、鼻窦炎及慢性阻塞性肺疾病的过敏性呼吸道疾病。
8.根据权利要求1所述的药剂学组合物，其中，所述过敏性疾病选自荨麻疹、过敏性结膜炎、花粉过敏症、遗传性过敏症、食品过敏症、过敏性中耳炎、过敏性休克、接触性过敏症、过敏性接触性皮肤炎、细菌过敏症、真菌过敏症、病毒过敏症、药物过敏症及过敏性脑炎。
9.根据权利要求1所述的药剂学组合物，其中，该药剂学组合物以血清型-非依赖性进行了免疫。
10.根据权利要求1所述的药剂学组合物，其中，所述弱毒化的肺炎链球菌菌株对Th1细胞因子或Th2细胞因子的生成进行抑制。
11.根据权利要求10所述的药剂学组合物，其中，所述Th1细胞因子选自干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白细胞介素-12(IL-12)，所述Th2细胞因子选自白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)及白细胞介素-13(IL-13)。
12.根据权利要求1所述的药剂学组合物，其中，该药剂学组合物对肺、脾脏、血液或脑具有非侵袭性。
13.根据权利要求1所述的药剂学组合物，其中，该药剂学组合物用于向腹腔内或粘膜内进行投放。
14.根据权利要求13所述的药剂学组合物，其中，该药剂学组合物用于向咽喉粘膜内进行投放。
15.根据权利要求1所述的药剂学组合物，其中，该药剂学组合物还包含药剂学上可允许的载体或免疫助剂。
16.一种炎症性疾病、呼吸道病毒感染疾病、除了肺炎链球菌之外的细菌感染性疾病或过敏性疾病的治疗方法，其中，包括将包含弱毒化的肺炎链球菌菌株的组合物投放于个体的步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，在所述弱毒化的肺炎链球菌菌株中，由序列号1表示的pep27基因核酸序列的1号至53号缺失。
18.一种弱毒化的肺炎球菌菌株的用途，其用于制备炎症性疾病、呼吸道病毒感染疾病、除了肺炎链球菌之外的细菌感染性疾病或过敏性疾病治疗用药剂。
19.根据权利要求18所述的用途，其中，在所述弱毒化的肺炎链球菌菌株中，由序列号1表示的pep27基因核酸序列的1号至53号缺失。
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