BR112019022371A2

BR112019022371A2 - Composição farmacêutica compreendendo cepas atenuadas de streptococcus pneumoniae e uso da mesma

Info

Publication number: BR112019022371A2
Application number: BR112019022371-1A
Authority: BR
Inventors: Rhee Dong-Kwon; Seon Seung-Han; Kim Bo-Gyung
Original assignee: Doknip Biopharm Co.
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2018-04-25
Publication date: 2020-05-26
Also published as: US20210379175A1; EP3616715A1; US11826413B2; CN110573179A; RU2019137964A; AU2018257122B2; JP7050360B2; AU2021245231A1; WO2018199628A1; RU2019137964A3; CN110573179B; CA3060722A1; AU2018257122A1; EP3616715A4; JP2020517744A; US11135278B2; US20200282039A1

Abstract

a divulgação se refere a uma composição farmacêutica compreendendo cepas atenuadas de streptococcus pneumoniae e o uso da mesma para a prevenção ou para o tratamento de doenças inflamatórias, infecções virais respiratórias, doenças infecciosas bacterianas ou doenças alérgicas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO CEPAS ATENUADAS DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE E USO DA MESMA

CAMPO TÉCNICO

[001] A divulgação se refere a uma composição farmacêutica compreendendo uma cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae e ao uso da mesma na prevenção ou no tratamento de doenças inflamatórias, infecções virais respiratórias ou doenças infecciosas bacterianas.

[002] Além disso, a divulgação diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo uma cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae e uso da mesma na prevenção ou no tratamento de doenças alérgicas.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[003] De acordo com relatos, a administração intranasal ou oral de antígenos induziu as células T reguladoras (Treg) que, por sua vez, induzem a tolerância à mucosa nos órgãos alvos (Faria and Weiner, 2005) . Também segundo relatos (Faria and Weiner, 2005), a indução da tolerância da mucosa suprimiu várias doenças autoimunes, incluindo a aterosclerose em camundongos (Maron et al, 2002) . Consequentemente, o princípio da tolerância da mucosa pode ser aplicado a animais e humanos. Múltiplos estímulos da mucosa por administração de antígeno induzem as células T a secretar as citocinas anti-inflamatórias, como IL-10 ou TGF

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2/68 βΐ, para proteger os tecidos e induzir a tolerância à mucosa (Faria and Weiner, 2005; Weiner, 2001) . A fim de manter a tolerância imunológica na superfície da mucosa, um certo tipo de células Treg é preferencialmente induzido, mas o mecanismo de indução permanece incerto.

[004] Entretanto, as vacinas de mucosa atualmente usadas são muito fracas em potência para induzir respostas imunológicas suficientes sem adjuvantes. Os adjuvantes da mucosa são utilizados para antígenos que induzem baixa tolerância imunológica quando administrados isoladamente. A subunidade da toxina B da cólera (CTB) pode ser exemplificada como um adjuvante da mucosa (Faria and Weiner, 2005) . No entanto, o efeito de aumento da imunidade da toxina da cólera após a inoculação intranasal é responsável pelo reconhecimento e pela mediação bacteriana (Kim et al, 2016) e, portanto, o papel essencial dos micro-organismos na potencialização, implicando que é preferencial que as bactérias atenuadas possam ser usadas como adjuvante conforme necessário. Ou seja, o conceito de vacinas de mucosas livres de adjuvante ainda não foi comprovado até o momento.

[005] Além disso, em nenhum lugar foi relatado em documentos anteriores se as vacinas da mucosa também podem exibir efeito em várias outras doenças, além de doenças diretamente relacionadas aos antígenos utilizados nas

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3/68 vacinas. Atualmente, a imunoterapia disponível protege apenas os antígenos utilizados na vacinação. Especificamente para prevenção da doença pneumocócica, são utilizadas vacinas de polissacarídeo 23-valente ou vacinas conjugadas 13-valente. No entanto, a vacina polissacaridica 23-valente não pode induzir a produção de células de memória imunológica e a vacina conjugada 13-valente pode proteger contra apenas 13 sorotipos entre 90 ou mais sorotipos (Kalin, 1998).

[006] A asma é uma das doenças crônicas mais comuns em crianças e adultos no mundo (Anandan et al., 2010). Cerca de 300 milhões de pessoas em todo o mundo são afetadas pela asma, custando extensas despesas médicas (OMS, 2007). Prevêse que o número global de pacientes com asma aumente a cada ano, com mais 100 milhões de pessoas sofrendo da doença até 2025. De acordo com estatísticas dos Centros dos EUA para Controle e Prevenção de Doenças, os pacientes com asma atingiram 3,1% da população nos Estados Unidos em 1980 e aumentaram até 8,4% em 2010, com uma tendência crescente em andamento (https://www.cdc.gov/asma). Além disso, 70% dos pacientes com asma também sofrem de alergias [GINA guidelines 2016]. Em 2015, a asma foi diagnosticada em 1,66 milhão de pessoas da Coréia do Sul (estatísticas de 2015 do Health Insurance Review & Assessment Service), ocupando a sexta posição em termos de carga de doenças entre as dez principais doenças crônicas na população da Coréia do Sul.

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[007] O aparecimento de asma e outras doenças alérgicas está em estreita associação com mudanças ambientais em relação ao estilo de vida e urbanização ocidentais (GINA guidelines, 2016) . A asma é uma doença heterogênea com várias causas, geralmente causada por inflamação. Os pacientes com asma apresentam sintomas semelhantes, mas com mecanismos subjacentes diferentes entre si (GINA guidelines, 2016; National Asthma Education and Prevention Program, 2007) . Além disso, as modalidades de inflamação das vias aéreas são diferentes entre si, dependendo dos tipos de asma (GINA guidelines, 2016) . Um mecanismo patogênico típico da asma é a inflamação das vias aéreas eosinofílicas mediadas por imunoglobulina E (IgE) e muitos resultados de estudos de patologia e asma têm se concentrado nas respostas imunológicas adquiridas relacionadas ao Th2 (GINA guidelines, 2016) . No entanto, estudos recentes têm se concentrado na imunidade inata, microbiomas, micróbios no corpo e semelhantes (Bjorksten et al. , 2001; Kalliomaki et al. , 2001; Penders et al. , 2007; Hilty et al., 2010; Green et al., 2014; and Ozturk et al., 2017) .

[008] De acordo com a Asthma and Allergy Foundation of America (http://www.aafa.org/), os medicamentos relacionados à asma atualmente disponíveis podem reduzir os sintomas apenas no manejo da asma, mas não podem curar completamente

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5/68 a asma. A asma é caracterizada pela hiper-responsividade das vias aéreas (AHR), que leva a episódios de broncoconstrição excessiva. Embora a medicação regular com glicocorticosteróide inalado tenha reduzido significativamente a mortalidade nos últimos anos, a asma ainda é uma causa mundial de cerca de 250.000 mortes em cada ano e tem uma carga significativa de doenças (Suissa et al., 2000) . De acordo com a frequência dos sintomas, a asma é classificada como leve (1 a 2 vezes por mês), moderada (1 a 2 vezes por semana) e grave (sintomas diários de asma). Para sintomas graves, é necessária a administração diária de 3 a 4 medicamentos. Mesmo um sintoma leve precisa de medicação regular. Como a asma é a inflamação das vias aéreas para causar broncoconstrição, os pacientes com asma precisam aplicar um inalador de broncodilatação nas gargantas imediatamente quando sofrem de dispnéia. Além disso, alguns pacientes com asma e pacientes com asma grave não respondem aos hormônios corticais adrenals, de modo que possam sofrer da doença durante toda a vida ou morrer sem sofrer efeitos clínicos (Durham et al., 2011). Os agentes anti-IL-5 recentemente comercializados podem aliviar os sintomas asmáticos ao serem injetados uma vez a cada quatro semanas. No entanto, medicamentos ou terapias que podem curar completamente ou prevenir a asma ainda não foram desenvolvidos ou relatados até o momento.

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DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

PROBLEMA TÉCNICO

[009] Métodos profiláticos e terapêuticos para as doenças inflamatórias atribuídas aos fatores inflamatórios, como as doenças intestinais, infecções, aterosclerose e lesões epiteliais foram desenvolvidos, mas estão restritos ao uso de certos marcadores causadores de inflamação ou doenças. A este respeito, como é esperado que a imunidade da mucosa previna as doenças relacionadas à mucosa e as doenças inflamatórias, a presente divulgação sugere uma nova terapia anti-inflamatória e de proteção contra várias doenças, tirando proveito da imunidade da mucosa das vacinas pneumocócicas de células inteiras. Além disso, está provado na presente divulgação que uma vacina que é administrada à mucosa utilizando a tolerância imunológica da imunidade da mucosa pode ser uma nova terapia para prevenir ou tratar a inflamação intestinal e as doenças infecciosas.

[010] Além disso, a presente divulgação desenvolve um novo método para a proteção contra um amplo espectro de doenças inflamatórias, incluindo as doenças infecciosas virais e as bacterianas respiratórias, bem como lesões causadas por inflamação intestinal e infecção respiratória e inflamação inoculando uma vacina de célula inteira pneumocócica na membrana mucosa.

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[Oil] Além disso, os medicamentos atualmente disponíveis para asma são divididos em agentes que aliviam os sintomas para dilatar as vias aéreas estreitas (broncodilatadores) e controladores de doenças para suprimir a inflamação das vias aéreas e evitar os ataques asmáticos (agentes anti-inflamatórios) . Os medicamentos, no entanto, não podem curar perfeitamente nem prevenir a asma. Portanto, a presente divulgação fornece como um meio para prevenir ou tratar as doenças alérgicas, incluindo a asma, uma composição farmacêutica compreendendo Streptococcus pneumoniae e, particularmente, uma composição farmacêutica compreendendo uma cepa de Streptococcus pneumoniae que é atenuada o suficiente para garantir a segurança, mesmo após a administração intranasal, a injeção intraperitoneal e a injeção intravenosa, a fim de superar a desvantagem de que o uso de Streptococcus pneumoniae em composições farmacêuticas, como vacinas, exige a inativação de Streptococcus pneumoniae ou o uso de componentes particulares de separação e purificação de Streptococcus pneumoniae devido à alta toxicidade da bactéria.

[012] No entanto, os objetivos a serem alcançados na presente divulgação não se limitam ao precedente, e outros objetivos não mencionados podem ser entendidos pelos especialistas na técnica a partir da descrição a seguir.

SOLUÇÃO TÉCNICA

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[013] A presente divulgação fornece uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar as doenças inflamatórias, as doenças infecciosas virais respiratórias ou as doenças infecciosas de bactérias diferentes de Streptococcus pneumoniae, que compreendem uma cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae.

[014] Além disso, a presente divulgação fornece um uso de uma cepa de Streptococcus pneumoniae atenuada pela mutação do gene pep27 na prevenção ou no tratamento de várias doenças alérgicas, incluindo a doença respiratória alérgica, e uma composição farmacêutica utilizada para isso.

[015] As soluções apresentadas acima são apenas ilustrativas e não devem ser interpretadas para limitar a presente invenção. Além das modalidades exemplares descritas acima, pode haver modalidades e exemplos adicionais que são explicados nos desenhos e na descrição.

EFEITOS BENÉFICOS

[016] De acordo com o presente divulgação, a inoculação da mucosa pela vacina pneumocócica de células inteiras induz a expressão de imunização relacionada aos genes no pulmão e no baço, prevenindo e/ ou tratando as doenças relacionadas à inflamação.

[017] Particularmente, embora as vacinas convencionais possam fornecer proteção apenas contra ingredientes antigênicos específicos, espera-se gue o uso da vacina

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9/68 pneumocócica da mucosa, de acordo com a presente divulgação, exiba uma ampla gama de efeitos profiláticos e terapêuticos, incluindo potenciais de proteção contra as doenças inflamatórias de outro órgão, bem como as doenças infecciosas virais e as bacterianas. Além disso, quando administrada à membrana mucosa, a vacina de célula inteira pneumocócica, de acordo com a presente divulgação, pode fornecer efeitos protetores contra uma variedade de doenças, mesmo sem qualquer adjuvante, em contraste com as vacinas mucosas convencionais.

[018] A presente divulgação pode fornecer um método para prevenir ou tratar as doenças alérgicas, incluindo asma, usando um mutante pep27 de Streptococcus pneumoniae. Particularmente, a vacinação com o mutante pep27 de Streptococcus pneumoniae pode levar à prevenção ou ao tratamento de doenças respiratórias alérgicas, incluindo asma, a rinite alérgica, a sinusite e a doença pulmonar obstrutiva crônica e outras doenças alérgicas, incluindo a urticária, a conjuntivite, a alergia ao pólen e a atopia.

[019] Além disso, o mutante pep27 de Streptococcus pneumoniae, de acordo com a presente divulgação, tem a vantagem de garantir segurança mesmo após a administração intranasal, a injeção intraperitoneal e a injeção intravenosa porque o mutante é suficientemente atenuado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

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[020] As FIGS. 1 e 2 são diagramas esquemáticos que mostram os resultados da análise das funções da vacina Streptococcus pneumoniae no pulmão (FIG. 1) e no baço (FIG. 2) conforme medido pela análise biológica do sistema, de acordo com uma modalidade da presente divulgação. Os camundongos foram imunizados com mutante THpep27 (Apep27) de duas em duas semanas durante um total de três vezes. Duas semanas após a última imunização, os pulmões e baços foram excisados e o RNA total foi extraído. A expressão gênica foi determinada por sequenciamento de alto rendimento, seguido de análise usando Ingenuity Pathway Analysis. Na FIG. 1, os genes do tecido pulmonar imunizado são mostrados ao suprimirem a gastroenterite e a anormalidade do intestino grosso enquanto a FIG. 2 descreve o efeito protetor do gene do baço na infecção pelo vírus influenza.

[021] FIG. 3 é um diagrama esquemático de um resultado da análise biológica do sistema no pulmão, de acordo com uma modalidade da presente divulgação. Os camundongos foram inoculados por via intranasal com a cepa mutante Apep27 de duas em duas semanas durante um total de três vezes. No dia 7 após a última imunização, o mRNA foi isolado do pulmão e submetido ao sequenciamento de alto rendimento. A análise de rede IPA para os dados de sequência no pulmão é representada, respondendo pela indução de IL-6, IL-23R, MUC2, IFN tipo 1 e TGF beta, mas a regulação negativa do CCR3.

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[022] As FIGS. 4 a 6 mostram os dados de um experimento para examinar se a imunização com Apep27 podería induzir as células Treg em camundongos, de acordo com uma modalidade da presente divulgação. Na FIG. 4, os camundongos (n = 3) foram imunizados por via intranasal com Apep27 a cada duas semanas por um total de três vezes e, no dia 7 após a última imunização, as células do baço foram isoladas e marcadas com marcadores de células de fluorescência contra Thl (CD4, Tbet) Th2 (CD4, GATA3), Thl 7 (CD4, RORyt) e Treg (CD4, Foxp3) e depois detectados por citometria de fluxo. As FIGS. 5 e 6 mostram níveis de citocinas em esplenócitos (FIG. 5) e soros (FIG. 6) obtidos no dia 7 após a última imunização, conforme medido por ELISA. A significância estatística foi analisada por ANOVA; *, P <0,05, **, P <0,01.

[023] As FIGS. 7 e 8 mostram dados de um experimento em que os camundongos foram imunizados com Apep27 para induzir IL-10 e IL-17, de acordo com uma modalidade da presente divulgação. Os camundongos (n = 3) foram imunizados inoculando por via intranasal com Apep27 a cada duas semanas durante um total de três vezes. No dia 7 após a última imunização, o mRNA foi isolado do pulmão e usado para medir os níveis de expressão de genes de IL-17 (FIG. 7) e IL-10 (FIG. 8) por qPCR. A significância estatística foi analisada por ANOVA; *, P <0,05.

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[024] FIG. 9 mostra dados de um experimento em que camundongos foram imunizados com Apep27 para ativar as células T de memória central e células Tfh de memória no baço, de acordo com uma modalidade da presente divulgação. Os camundongos (n = 3) foram imunizados por via intranasal com Apep27 a cada duas semanas durante um total de três vezes. No dia 7 após a última imunização, os esplenócitos foram isolados e marcados com marcadores de células fluorescentes contra células T de memória central (CD4, CCR7, CD62L) e células Tfh de memória (CD4, CXCR5, CCR7). Posteriormente, os marcadores fluorescentes foram detectados por citometria de fluxo. A significância estatística foi analisada por ANOVA; *, P <0,05.

[025] As FIGS. 10 e 11 mostram os dados de um experimento em que os camundongos foram imunizados com Apep27 para induzir a expressão de vários subtipos de imunoglobulina, de acordo com uma modalidade da presente divulgação. Os camundongos (n = 6) foram imunizados por via intranasal com Apep27 a cada duas semanas durante um total de três vezes. No dia 7 após a última imunização, os soros (FIG. 10) e líquido de lavagem bronco-alveolar (LBA) (FIG. 11) foram medidos para titulações de anticorpos contra células inteiras pneumocócicas de três tipos. A significância estatística foi analisada com ANOVA; * P <0,05, **, P <0,01.

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[026] As FIGS. 12 a 15 mostram os dados de um experimento para examinar se a imunização com Apep27 poderia proteger contra a infecção pneumocócica secundária após a infecção por influenza, de acordo com uma modalidade da presente divulgação. Os camundongos (9-10/ grupo) foram imunizados por via intranasal com Apep27 semanalmente durante um total de três vezes. Uma semana após a última imunização, os camundongos foram infectados por via intranasal com o virus influenza. Amostras de sangue obtidas por sangramento retro-ocular foram então analisadas quanto a citocinas (FIG. 12), ou uma semana após a última imunização os soros foram coletados dos camundongos e analisados quanto aos níveis de IgG para antígenos específicos por ELISA (FIG. 13). as diferenças significativas entre os dois grupos foram analisadas pelo teste t não pareado; *** p <0,001. Dez dias após a infecção por influenza, os camundongos foram infectados com Streptococcus pneumoniae D39 por via intranasal e depois monitorados quanto à sobrevivência por 14 dias (FIG. 14). A significância estatística foi analisada pelo teste de Mentel-cox; ** p <0,005. Vinte e quatro horas após a infecção por Streptococcus pneumoniae D39, os homogenatos pulmonares foram incubados no soro para contagem de bactérias (FIG. 15) . A significância estatística foi analisada por ANOVA de uma via.

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[027] As FIGS. 16 e 17 mostram os dados de um experimento na qual uma vacina Apep27 foi testada quanto à atividade inibitória contra a replicação do virus influenza, de acordo com uma modalidade da presente divulgação. Os camundongos (10/ grupo) foram imunizados por via intranasal com o virus influenza e depois monitorados quanto ao peso corporal por 11 dias (FIG. 16). A significância estatística foi analisada por ANOVA de uma via; *** p <0,001. Cinco dias após a infecção por influenza, os sobrenadantes do homogenato pulmonar foram coletados e depois medidos para as titulações de vírus em cada grupo, determinando TCID50/ ml (FIG. 17) . A significância foi analisada por ANOVA de uma via; *** p <0,001.

[028] FIG. 18 mostra os dados de um experimento para examinar se a imunização com Apep27 podería prevenir a infecção por bactéria Gram negativa, de acordo com uma modalidade da presente divulgação. Os camundongos (3/ grupo) foram imunizados por via intranasal com Apep27 três vezes. Dez dias após a última imunização, os camundongos foram infectados com K. pneumoniae. As contagens bacterianas em órgãos individuais foram determinadas 24 horas após a infecção por K. pneumonia por espalhamento em placas de ágarsangue; ** P <0,01.

[029] FIG. 19 mostra os dados de um experimento para examinar se a imunização com Apep27 podería prevenir a

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15/68 infecção por bactéria Gram positiva, de acordo com uma modalidade da presente divulgação. Os camundongos (3/ grupo) foram imunizados por via intranasal com Apep27 três vezes. Dez dias após a última imunização, os camundongos foram infectados com Staphylococcus aureus. As contagens

bacterianas	em órgãos	individuais foram	determinadas	24
horas após	a infecção	por S. aureus por	espalhamento	em
placas de ágar-sangue; [030] As FIGS.	* P <0,05. 20 e 21 mostram	os dados de	um

experimento para examinar se a imunização com Apep27 podería inibir contra a perda de peso resultante da doença inflamatória intestinal induzida por dextrano sulfato de sódio (DSS), de acordo com uma modalidade da presente divulgação. Os camundongos (n = 5/ grupo) foram imunizados por via intranasal com a cepa mutante Apep27 três vezes e depois administrados com 5% de DSS em água potável por via oral para induzir a colite (doença inflamatória intestinal) na mesma. Observou-se que os camundongos imunizados sofreram perda de peso reduzida (FIG. 20). Nesse sentido, os percentuais de perda de peso basal foram monitorados por 9 dias após o tratamento com DSS. A significância estatística foi analisada por ANOVA de uma via, seguida pela realização do teste de Bonferroni. O índice de atividade clinica da doença foi avaliado diariamente até o término da terapia no dia 9 (FIG. 21) . A progressão da colite foi avaliada através

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16/68 da medição da perda de peso, consistência das fezes, sangramento retal e/ ou quantidade de sangue total nas fezes. Além disso, os camundongos foram monitorados diariamente quanto à morbidade (piloereção e letargia).

[031] As FIGS. 22 e 23 mostram os dados de um experimento para examinar se a imunização com Apep27 poderia impedir a colite induzida por dextrano sulfato de sódio (DSS) de acordo com uma modalidade da presente divulgação. Os camundongos (n = 5/grupo) foram imunizados por via intranasal com Apep27 três vezes e depois administrados DSS a 5% em água potável por via oral para induzir a colite (doença inflamatória intestinal). Observou-se que os camundongos imunizados sofreram perda de peso reduzida (FIG. 20) . O cólon foi examinado no dia 9 após o tratamento com DSS. Comprimento do cólon (FIG. 22) e peso (FIG. 23) foram medidos no dia 9 após o tratamento com DSS.

[032] FIG. 24 mostra os dados de uma modalidade para examinar se a imunização com Apep27 poderia suprimir a expressão de genes de citocinas inflamatórias no intestino grosso, de acordo com uma modalidade da presente divulgação. Camundongos Balb c foram alimentados com DSS a 5% em água potável por 14 dias para induzir a doença inflamatória intestinal. DBS + água foi usado para um controle negativo. Os níveis de expressão de mRNA de IL-Ιβ, IL-6, IL-17A e TNFα foram medidos por PCR quantitativo em tempo real. Os dados

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17/68 experimentais foram expressos como média ± SEM. P <0,05 foi considerado significativo.

[033] FIG. 25 mostra um cronograma para um teste para o efeito preventivo da cepa mutante Apep27 na doença alérgica (A) e dados de teste explicando os efeitos inibitórios da cepa mutante Apep27 na secreção de várias citocinas alérgicas (B) , de acordo com uma modalidade da presente divulgação.

[034] FIG. 26 mostra os resultados da coloração histoquimica, responsáveis pelo efeito preventivo da cepa mutante Apep27 na doença alérgica, de acordo com uma modalidade da presente divulgação.

[035	] FIG. 27 mostra	um	cronograma	para um	teste para
o efeito	terapêutico da	cepa mutante	Apep27	na doença
alérgica	(A) e dados de	te	ste que explicam	os efeitos
inibitório	s da cepa mutante	Apep27 na	secreção	de várias
citocinas	alérgicas (B) ,	de	acordo com	uma modalidade da

presente divulgação.

[036] FIG. 28 mostra os resultados da coloração histoquimica, responsáveis pelo efeito terapêutico da cepa mutante Apep27 na doença alérgica, de acordo com uma modalidade da presente divulgação.

MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO

[037] As modalidades exemplificativas da presente invenção serão descritas mais detalhadamente com referência aos desenhos anexos. A invenção pode, no entanto,

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18/68 ser realizada de várias formas diferentes e não deve ser interpretada como sendo limitada às modalidades aqui estabelecidas; em vez disso, essas modalidades são fornecidas para que esta divulgação seja minuciosa e completa e transmita totalmente o conceito da invenção aos especialistas na técnica. Nos desenhos, elementos irrelevantes para a descrição serão omitidos para maior clareza.

[038] Ao longo da especificação, a menos que seja explicitamente descrito o contrário, a palavra compreender e variações como compreende ou compreendendo serão entendidas como implicando a inclusão de elementos declarados, mas não a exclusão de outros elementos.

[039] Palavras de grau, como cerca de, substancialmente e semelhantes são usadas na presente especificação no sentido de em, ou quase em, quando atendidas as tolerâncias de fabricação, concepção e material inerentes às circunstâncias declaradas e são usados para impedir que o infrator inescrupuloso se aproveite injustamente da divulgação da invenção, onde valores exatos ou absolutos são indicados como um auxílio para a compreensão da invenção. Os termos uma etapa de, que são usados Ao longo da descrição, não significa uma etapa para.

[040] Ao longo da descrição, o termo combinação de incluído na descrição do tipo Markush significa a mistura ou

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19/68 a combinação de um ou mais componentes, etapas, operações e/ ou elementos selecionados de um grupo que consiste em componentes, etapas, operação e/ ou elementos descritos em tipo Markush e, desse modo, significa que a presente invenção inclui um ou mais componentes, etapas, operações e/ ou elementos selecionados do grupo Markush.

[041] Ao longo da descrição, a expressão A e/ ou B significa A, B ou A e B.

[042] Ao longo da descrição, Streptococcus pneumoniae, também chamada pneumococo, é uma bactéria Gram positiva do gênero Streptococcus e é classificada na família de Streptococcus porque as bactérias parecem formar cadeias pois a divisão celular ocorre ao longo de um único eixo ao longo do tempo. A bactéria é conhecida como uma das principais causas de pneumonia.

[043] Ao longo da descrição, Pep27, que é composto por 27 resíduos de aminoácidos, é secretado por um sistema transportador vex para induzir a inibição do crescimento e apoptose. Em detalhes, a expressão de pep27 induz a morte celular programada em S. pneumoniae através da transdução de sinal desencadeada através da proteína quinase vncS da histidina ligada à membrana e do regulador de resposta vncR, que é um efetor citoplasmático (Novak et al. , 1999) . Os genes ou proteínas Pep27 codificados por esse meio podem ser designados diferentemente de um sorotipo de Streptococcus

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20/68 pneumoniae para outro e pode haver uma pequena diferença na sequência de nucleotídeos ou na sequência de peptídeos de pep27. No entanto, contanto que desempenhe substancialmente a mesma função que é descrita acima, qualquer gene pep27 pode ser mutado e utilizado independentemente dos sorotipos para preparar a cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae da presente invenção. Particularmente, qualquer gene de Streptococcus pneumoniae que seja funcionalmente o mesmo que o gene pep27 pode ser empregado na presente divulgação. Mais particularmente, o gene pep27 da presente divulgação pode ser danificado pela mutação de um gene que codifica a sequência de peptídeos pep27 representada pela SEQ ID NO: 1.

[044] Conforme usado aqui, o termo atenuação pretende se referir à modificação de uma cepa virulenta em uma cepa menos virulenta ou em um patógeno mais fraco antes da modificação. Esta cepa atenuada se refere a uma cepa que é significativamente reduzida na virulência relacionada às doenças clínicas enquanto ainda se replicando dentro de um hospedeiro. Particularmente, a cepa atenuada da presente divulgação tem uma virulência ou patogenicidade tão baixa, de modo a permitir que seja administrada como uma vacina. Mais particularmente, as cepas pneumocócicas da presente invenção são atenuadas na medida em que não podem causar doenças clínicas enquanto permanecem replicáveis nos hospedeiros. O mutante atenuado pode ser obtido usando uma

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21/68 variedade de métodos diferentes, como mutação pontual, troca de sequência entre vírus relacionados ou exclusão de nucleotídeos.

[045] Ao longo da descrição, conforme aqui utilizado, o termo mutação pretende significar todas as ações que causam uma alteração na função genética de um gene. Em detalhes, mutação se refere à mudança quantitativa ou qualitativa em um gene entre diversas variações biológicas.

[046] Ao longo da descrição, o termo alergia, como aqui usado, se refere aos vários distúrbios, doenças ou condições anormais causadas pela hipersensibilidade do sistema imunológico a certas substâncias, ou seja, uma reação excessiva do sistema imunológico a substâncias estranhas. As doenças alérgicas às quais a composição da presente divulgação é aplicada são aquelas resultantes particularmente da hipersensibilidade imediata do tipo I e da hipersensibilidade tardia do tipo IV. Exemplos de hipersensibilidade imediata do tipo I incluem asma brônquica rinite, dermatite atópica, conjuntivite, timpanite, urticária e choque anafilático. Hipersensibilidade ao contato, dermatite de contato, alergia bacteriana, alergia fúngica, alergia viral, alergia a medicamentos, tireoidite e encefalite alérgica se enquadram no escopo da hipersensibilidade retardada do tipo IV. A hipersensibilidade imediata do tipo I é dividida em dois

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22/68 estágios: No estágio 1, a exposição a um alérgeno reduz o equilíbrio entre uma resposta Thl, que é caracterizada pela produção de IL12 e IFN-γ, que regulamenta negativamente a secreção de IgE e IgGl e aumentam a secreção de IgG2a e uma resposta Th2, o que leva à produção de IL-4, IL-5 e IL-13, no viés de Th2, de modo que IL-4 e IL-13 produzidos em resposta a uma resposta imunológica dominada por Th2 induzem as células B a produzir IgE específica de alérgenos que, por sua vez, se liga à superfície dos mastócitos e basófilos, preparando-se para o desenvolvimento das alergias. Mastócitos e basófilos revestidos por IgE são, assim chamados sensibilizados a um alérgeno; o estágio 2 do desenvolvimento da alergia é classificado em resposta precoce e resposta tardia. Na resposta inicial, os mastócitos ativados após a exposição a um alérgeno sofrem degranulação, durante a qual as células liberam histamina, metabólitos lipídicos, citocinas etc. de seus grânulos, causando vasodilatação etc. Na resposta tardia, neutrófilos, eosinófilos , macrófagos, células Th2, basófilos etc. se infiltram nos tecidos correspondentes para provocar inflamação, causando dermatite atópica, rinite, asma e semelhantes.

[047] Ao longo da descrição como aqui utilizada, o termo prevenção significa todas as ações que inibem ou atrasam o aparecimento de uma doença pela administração de uma composição, de acordo com a presente divulgação.

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[048] Ao longo da descrição como aqui utilizado, o termo tratamento ou tratar significa todas as ações que visam melhorar ou alterar beneficamente um sintoma associado à doença, administrando uma composição, de acordo com a presente divulgação.

[049] Ao longo da descrição, como aqui utilizado, o termo vacina se refere a uma preparação biológica compreendendo uma substância antigênica que se assemelha a um micro-organismo ou vírus causador de doença, de modo a fornecer imunidade adquirida ativa para a prevenção da doença causada por ele. Uma vacina é frequentemente feita a partir de bactérias ou vírus atenuados ou mortos. A administração de vacinas é chamada de vacinação, que se destina a adquirir imunogenicidade artificialmente contra uma infecção específica. Quando estimulado pela vacina, o sistema imunológico do indivíduo é ativado para gerar anticorpos. A sensibilização é mantida e, quando ocorre a reinfecção, os anticorpos podem ser efetivamente gerados em pouco tempo, superando a doença. Enquanto isso, graças ao seu princípio de tolerância imunológica, a vacina compreendendo Streptococcus pneumoniae atenuada, de acordo com a presente divulgação, pode não apenas proteger contra determinada substância antigênica, mas também exibir efeitos profiláticos e terapêuticos em um amplo espectro de doenças,

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24/68 incluindo doenças infecciosas virais e bacterianas, em contraste com as vacinas convencionais.

[050] O termo ermB, como aqui usado, significa um gene que permite a resistência aos macrolídeos. Os macrolídeos são uma classe de substitutos da penicilina na terapia de doenças causadas por Streptococcus pneumoniae e incluem eritromicina, claritromicina e azitromicina.

[051] A seguir, será fornecida uma descrição detalhada da composição farmacêutica que compreende uma cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae, de acordo com a presente divulgação, e o uso da mesma na prevenção ou no tratamento de doenças inflamatórias e doenças infecciosas virais ou bacterianas respiratórias com referência às modalidades exemplares e aos desenhos. No entanto, a presente divulgação não deve ser entendida como limitada às modalidades e aos desenhos exemplares.

[052] Um primeiro aspecto da presente divulgação pode fornecer uma composição farmacêutica para a prevenção ou o tratamento das doenças inflamatórias, doenças infecciosas virais respiratórias, doenças infecciosas causadas por bactérias diferentes de Streptococcus pneumoniae, a composição compreendendo uma cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae. Por exemplo, a composição farmacêutica pode incluir uma composição de vacina.

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[053] De acordo com uma modalidade, a cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae pode ser aquela na qual uma parte ou a totalidade do gene pep27 é deletada. Por exemplo, resíduos de nucleotídeos das posições 1 a 53 na sequência de nucleotídeos pep27 representada pela SEQ ID NO: 1 podem ser deletados, mas não estão limitados a estes.

[054] De acordo com uma modalidade, a cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae pode compreender um gene pep27 mutante no qual os resíduos de nucleotídeos nas posições 1 a 53 na sequência de nucleotídeos pep27 representada pela SEQ ID NO: 1 são deletados e substituídos por um cassete ermB, mas a presente divulgação não é limitada a estes. A título de exemplo, a cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae pode ser a cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae compreendendo um gene mut27 pep27, divulgado na Patente Coreana No. 10-1252911.

[055] De acordo com uma modalidade da presente divulgação, as doenças inflamatórias podem ser selecionadas entre a asma, a bronquite, a rinite, as doenças inflamatórias intestinais, a gastroenterite, a colite, a doença de Crohn, a pancreatite, a aterosclerose e a artrite, mas não estão limitadas a estas. Por exemplo, a prevenção ou o tratamento das doenças inflamatórias pode ser o efeito resultante da regulação negativa da expressão de um gene relacionado à inflamação, como um gene relacionado à inflamação do

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26/68 intestino grosso. As doenças inflamatórias podem estar relacionadas a, por exemplo, as doenças infecciosas intestinais e respiratórias, mas não estão limitadas a estas.

[056] As doenças infecciosas respiratórias podem ser causadas por um vírus respiratório que pode ser selecionado entre, por exemplo, metapneumovirus, coronavirus, enterovirus, vírus sincicial respiratório, adenovirus, bocavírus, rinovírus e vírus da influenza. A prevenção ou o tratamento de doenças infecciosas causadas pelo vírus respiratório pode ser um efeito resultante da supressão da replicação dos vírus.

[057	] Por	exemplo,	o	vírus da influenza	pode ser
influenza	A, B	ou C e	não	é limitado por seus	subtipos
concretos.
[058	] Além	disso,	a	composição farmacêutica da

presente divulgação pode fornecer uma função protetora não específica do vírus. Nesse contexto, a composição farmacêutica pode fornecer uma função protetora contra o vírus da influenza e outros vírus, como, mas não limitado ao vírus sincicial respiratório e rinovírus.

[059] De acordo com uma modalidade da presente divulgação, as doenças infecciosas bacterianas podem ser selecionadas entre as doenças causadas pela infecção de bactérias Gram positivas, bactérias Gram negativas e outras bactérias infecciosas, mas não estão limitadas a estas. Por

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27/68 exemplo, a prevenção ou o tratamento das doenças infecciosas bacterianas pode ser um efeito resultante da supressão da infecção por bactérias bacterianas Gram positivas e/ ou bactérias Gram negativas.

[060] De acordo com uma modalidade da presente divulgação, as bactérias Gram positivas podem ser selecionadas de Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Clostridium tetani, e Bacillus anthracis enquanto as bactérias Gram negativas podem ser selecionadas de Salmonella spp. Shigella, Klepsiella pneumoniae, E. coli, e Vibrio cholerae, mas não estão limitadas a estas. Por exemplo as bactérias Gram positivas podem ser Staphylococcus aureus.

[061] De acordo com uma modalidade da presente divulgação, a composição farmacêutica pode permitir a imunização de uma maneira independente de sorotipo, mas não está limitada a esta. Como aqui utilizado, a composição farmacêutica que permite a imunização de maneira independente de sorotipo se refere a uma composição farmacêutica que é projetada para produzir anticorpos independentemente de antígenos, mas não para produzir anticorpos específicos para antígenos específicos.

[062] De acordo com uma modalidade da presente divulgação, a doença alérgica pode ser uma doença respiratória alérgica selecionada entre asma, rinite

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28/68 alérgica, sinusite e doença pulmonar obstrutiva crônica, mas não está limitada a estas.

[063] De acordo com uma modalidade da presente divulgação, exemplos da doença alérgica incluem alergia alimentar, timpanite alérgica, choque anafilático, hipersensibilidade ao contato, dermatite alérgica de contato alergia bacteriana, alergia fúngica, alergia viral, alergia a medicamentos e encefalite alérgica, além de urticária, conjuntivite, alergia ao pólen e atopia, mas não se limitam a estas.

[064] A composição farmacêutica da presente divulgação pode suprimir a produção de uma citocina Thl e/ ou uma citocina Th2 que são responsáveis pela hipersensibilidade imunológica. Aqui, a citocina Thl pode ser selecionada a partir de interferon-gama (IFN-γ), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina-12 (IL-12) e a citocina Th2 pode ser selecionada interleucina-4 (IL- 4), interleucina-5 (IL5) e interleucina-13 (IL-13), sem limitações.

[065] Os níveis da citocina Thl e/ ou citocina Th2 podem ser medidos a partir de fluidos corporais, como soro ou fluido de lavagem bronco-alveolar, sem limitações.

[066] De acordo com uma modalidade da presente divulgação, a composição farmacêutica pode ser não invasiva para o pulmão, o baço, o sangue ou o cérebro, sem limitações. Como aqui usado, o termo não invasivo pretende significar

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29/68 que a composição farmacêutica não invade outras regiões sistêmicas que não sejam os órgãos, tecidos e células nas quais a composição farmacêutica é diretamente administrada ou é rapidamente eliminada a partir de regiões sistêmicas apesar de invadir as regiões, em oposição a invasivo que pertence à penetração em outras regiões sistêmicas que não sejam órgãos, tecidos e células administradas diretamente a composição farmacêutica, assim, prejudicando o corpo humano.

[067] Conforme usado neste documento, o termo administração pretende se referir à introdução da composição da presente divulgação a um sujeito de uma certa maneira adequada. Contanto que seja liberado a um tecido alvo, qualquer via pode ser usada para administração da composição da presente divulgação. Por exemplo, a administração pode ser realizada por via oral, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, intranasal, intrapulmonar, intraretal, intravesicular, transdérmica e intramucosa, mas não está limitada a estas.

[068] De acordo com uma modalidade da presente divulgação, a composição farmacêutica pode ser administrada através de uma via intraperitoneal ou intramucosa, mas sem limitações à mesma. A posição da membrana mucosa à qual a composição farmacêutica deve ser administrada não é particularmente limitada. Um especialista na técnica pode

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30/68 selecionar adequadamente uma posição dentre os locais do corpo para administração na mucosa.

[069] De acordo com uma modalidade da presente divulgação, a composição farmacêutica pode ser configurada para seguir uma rota da membrana mucosa da nasofaringe para administração, mas sem limitações à mesma. A vacinação via membranas mucosas da nasofaringe pode utilizar, por exemplo, um aerossol ou sistema de administração de gotas, mas não está limitado a estes.

[070] Quando a composição farmacêutica da presente divulgação é usada, exibindo imunogenicidade eficaz em um sujeito mesmo após a administração da mucosa, a composição farmacêutica da presente divulgação pode eliminar o inconveniente de composições convencionais que devem ser administradas por via subcutânea com o auxílio de uma seringa e é vantajoso em relação às composições convencionais em termos de administração a lactentes, que temem a injeção com uma seringa, mas sem limitações. Nenhuma limitação é dada ao sujeito ao qual a composição farmacêutica da presente divulgação pode ser administrada. Mamíferos, incluindo humanos, ratos, camundongos, aves domésticas, etc. podem ser o sujeito, mas sem limitações. Além disso, a composição da vacina da presente invenção deve ser administrada em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. A quantidade farmaceuticamente eficaz da composição da presente

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31/68 divulgação varia dependendo do sexo, área da superfície corporal e idade do paciente, tipo e gravidade de uma doença, sensibilidade ao fármaco, via e frequência de administração, taxa de excreção, o tempo de administração, duração do tratamento, células alvo, níveis de expressão e outros fatores bem conhecidos na técnica farmacêutica, que podem ser facilmente determinados pelos técnicos especialistas.

[071] De acordo com uma modalidade da presente divulgação, a composição farmacêutica pode ainda compreender um carreador farmaceuticamente aceitável ou um adjuvante, sem limitações ao mesmo.

[072] Exemplos do carreador útil na composição farmacêutica da presente divulgação incluem lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, goma acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metil celulose, celulose amorfa, polivinilpirrolidona, água, metil hidroxibenzoato, propil hidroxibenzoato, talco, estearato de magnésio e óleo mineral, mas não estão limitados a estes.

[073] Qualquer adjuvante tipicamente usado na técnica pode ser usado na presente divulgação sem limitações. Exemplos do adjuvante incluem uma unidade de ligação à toxina do cólera, sais de alumínio, emulsão lipídica (MF-59), um detergente sintético (Tween), microesferas, lipossomas e polímeros mucoadesivos, mas não estão limitados a estes.

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Novas formas adjuvantes, se desenvolvidas, também podem ser usadas.

[074] A composição farmacêutica, de acordo com a presente divulgação, pode ser formulada em formas de dosagem, por exemplo, formas de dosagem oral como pós, grânulos, comprimidos, cápsulas, suspensões, emulsões, xaropes, aerossóis etc., aplicações externas, supositórios ou injeções estéreis de acordo com o método convencional, mas não se limitam a estas. Em detalhes, para a formulação, um diluente ou excipiente, como um agente de enchimento, um expansor, um aglutinante, um umectante, um desagregante, um surfactante, etc., como usado convencionalmente, pode ser empregado, sem limitações.

[075] Por exemplo, agentes sólidos destinados à administração oral da composição da presente divulgação podem estar na forma de comprimidos, pílulas, pós, grânulos, cápsulas e semelhantes. Esses agentes sólidos são formulados em combinação com pelo menos um excipiente, como amido, carbonato de cálcio, sacarose, lactose ou gelatina. Além disso, um lubrificante, como estearato de magnésio, talco e semelhantes, além de excipiente simples, também pode ser adicionado. Os agentes líquidos destinados à administração oral incluem suspensões, soluções de uso interno, emulsão, xaropes e semelhantes. Além de um diluente simples, como água ou parafina líquida, como usado convencionalmente,

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33/68 vários excipientes, como umectantes, adoçantes, aromáticos, conservantes e semelhantes, podem ser compreendidos nos agentes líquidos para a administração oral da composição da presente divulgação, sem limitações.

[076] As formas de dosagem parenteral da composição da presente divulgação podem incluir soluções aquosas estéreis, soluções não aquosas, suspensões, emulsões, agentes liofilizados e supositórios. No que se refere às soluções e suspensões não aquosas, elas são fabricadas a partir de propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais como azeite ou ésteres injetáveis como oleato de etila, sem limitações.

MODO DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[077] Um melhor entendimento da presente divulgação pode ser obtido através dos seguintes Exemplos, que são apresentados para ilustrar, mas não deve ser interpretado como limitante da presente divulgação.

[EXEMPLO 1] Ensaio do potencial inibitório da cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae THpep27 contra doenças inflamatórias, doenças infecciosas virais respiratórias ou doenças infecciosas causadas por bactérias que não sejam Streptococcus pneumoniae

1. Materiais e métodos

Preparação da cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae THpep27

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[078] A cepa mutante de Streptococcus pneumoniae THpep27 usada nos Exemplos da presente divulgação é a cepa relatada por Choi SY et al. (Inactivated pep27 mutant as an effective mucosal vaccine against a secondary lethal pneumococcal challenge in mice. Clin Exp Vaccine Res. 2013), que é o mesmo que o Streptococcus pneumoniae mutado em pep27 divulgado na Patente Coreana No. 10-1252911, com a exceção de que o marcador resistente à eritromicina (ermAM) para seleção não está incluído.

[079] Um cassete Cheshire (número de acesso GenBank FJ981645) com o marcador de resistência à eritromicina (ermAM) , que pode ser usado como marcador temporário para seleção, foi amplificado usando iniciadores (5'-TGG CTT ACC GTT CGT ATA G-3’ (SEQ ID NO: 2) e 5’-TCG ATA CCG TTC GTA TAA TGT-3' (SEQ ID NO: 3)), 3)), que foram concedidas pelo Dr. Donald Morrison (Universidade de Illinois em Chicago) e ligadas por reação em cadeia da polimerase (PCR), com sequências a montante e a jusante amplificadas com iniciadores (5’-TCT GTA TCG GCC TCA AGO AG-3’ (SEQ ID NO: 4) e 5’-GTA TAG GAA CGG TAA GCC A GAT TTT GAG GAG TGC TTT Ges’ (SEQ ID NO: 5), e 5’-AGA TTA TAG GAA CGG TAT CGA AAG GCC AGC AAG AGA CTA-3’ (SEQ ID NO: 6) e 5’-CTG CGA GGC TTG CAC TGT AG-3’ (SEQ ID NO: 7) a partir do DNA genômico de D39, que serviu de modelo. Subsequentemente, o produto ligado foi então transformado em D39 para criar um mutante pep27.

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[080] A excisão do cassete de Cheshire foi induzida pela adição de 1% de L-fucose (Sigma, St. Louis, MO, EUA) . As culturas tratadas com fucose foram então espalhadas em placas de THY ágar no sangue para formar colônias únicas. A presença dos cassetes Cheshire em cada colônia foi confirmada por POR usando os seguintes iniciadores: 5-TCT OTA TOG GCC TCA AGC AG-3' (SEQ ID NO: 8) and 5'-CTG CGA GGC TTG CAC TGT AG-3' (SEQ ID NO: 9) . A sequência mutante (THpep27) foi confirmada por sequenciamento de nucleotídeos (Cosmo, Seul, Coréia), bem como por análise de immunoblot com anticorpo Pep27 (dados não mostrados).

[081] Para confirmar o mutante THpep27 no nível do RNA, o RNA foi isolado de bactérias na fase exponencial inicial usando o método convencional de fenol quente. Após remoção do DNA pela DNase I (Takara, Tóquio, Japão), um micrograma de RNA bacteriano foi transcrito reversamente em cDNA usando iniciadores aleatórios (Takara). A POR de transcrição reversa foi realizada usando o iniciador recomendado de acordo com as instruções do fabricante (Super Bio, American Building Restoration Products Inc., Franklin, WI, EUA).

Preparação de outras cepas bacterianas

[082] As cepas de Streptococcus pneumoniae usadas na presente divulgação estão resumidas na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1

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Cepa	Características	Citação
D39	tipo encapsulado, sorotipo 2	(Avery et ai., 1944)
A6 6.1	Sorotipo 3	(McDaniel et ai., 1984)
TIGR4	Sorotipo 4	(Aaberge et ai., 1995)
BG7322	Sorotipo 6B	(Briles et ai., 1992)
THpep27	D39 Apep27:: Cheshire ermB Em^r	(Choi et ai., 2013)

[083] A cepa do tipo selvagem de S. pneumoniae sorotipo 2 (D39), sorotipo 3 (A66.1), sorotipo 6B (BG7322) e cepa mutante THpep27 (D39 Apep27) foram cultivadas da maneira normalmente usada no laboratório (Kim et ai., 2012). O Streptococcus pneumoniae foi cultivado durante a noite a 37 °C em placas de ágar-sangue e depois a 37 °C por 3 horas em caldo Todd-Hewitt suplementado com extrato de levedura a 0,5% (THY; Difco Laboratories) . Cada uma das culturas das cepas de Streptococcus pneumoniae foi adequadamente diluída e infectada por via intranasal (i.n.) em uma quantidade de 10 mL em camundongos GDI.

[084] S. aureus (ATCC 25923) e K. pneumoniae (ATCC 9997), que foram adquiridos no Centro de Cultura Coreano de Micro-organismos (KCCM, Seul), foram cultivados durante a noite a 37 °C em infusão de coração e cérebro de ovelha desfibrinada suplementada com sangue de cordeiro (BHI) e

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37/68 depois transferidos para o caldo BHI fresco, no qual a bactéria foi cultivada a 37 °C até DO550 = 0,5.

[085] A cepa do vírus Influenza A/California/04/2009(H1N1) foi cultivada em ovos como descrito anteriormente (Shim et al, 2013) .

Estudos de infecção in vivo

[086] Camundongos machos GDI, BALB/ c de quatro semanas de idade (Orient, Coréia) foram utilizados para experimentos de infecção. O uso de animais nos experimentos foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Sungkyunkwan, de acordo com as diretrizes da Lei de Proteção Animal da Coréia.

[087] Em um ensaio de eficácia da vacina, os camundongos foram vacinados por via intranasal (i.n.) com IxlO⁷ a IxlO⁸ CFU da cepa Apep27 a cada uma ou duas semanas durante um total de três vezes para medir o tempo de sobrevivência. Uma a duas semanas após a imunização final, os camundongos foram desafiados por via intranasal com IxlO⁷a IxlO⁸ cepas virulentas de D39 ou 6B. Os camundongos desafiados foram monitorados quanto à sobrevivência quatro vezes ao dia nos primeiros cinco dias, duas vezes ao dia pelos próximos cinco dias e uma vez ao dia por até 14 dias após serem desafiados.

[088] Para avaliar a capacidade de inibição da colonização, os camundongos foram inoculados por via

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38/68 intranasal com 1 x 10⁷ a 1 x 10⁸ CFU da cepa Apep27 a cada duas semanas, por um total de três vezes. Uma a duas semanas após a vacinação final, os camundongos foram infectados com 5 x 10⁶ a 1 x 10⁷ UFC de Streptococcus pneumoniae. Após o sacrifício dos camundongos em horários predeterminados, as laringes foram removidas assepticamente e homogeneizadas usando um homogeneizador (PRO Scientific Inc., Oxford, CT, EUA, Modelo 200 duplo isolado) a uma velocidade máxima em 1 ml de PBS (exclusivo de sangue) em gelo e diluído em série em PBS estéril. As diluições foram espalhadas em placas de ágar-sangue contendo 5-10 pg/ ml de gentamicina, de modo a selecionar Streptococcus pneumoniae. Posteriormente, as placas foram incubadas a 37 °C por cerca de 18 horas na atmosfera de 95 % de ar e 5 % de CO2 para contar as colônias formadas. Este experimento foi conduzido duas vezes e foram utilizadas medições médias dos experimentos.

[089] A fim de examinar se a vacina Apep27 podería proteger contra a infecção por S. aureus e K. pneumoniae, os camundongos foram imunizados por via intranasal três vezes com Apep27. Dez dias após a última imunização com Apep27, os camundongos foram infectados por via intranasal com uma suspensão de 1 x 10⁸ ou 2 x 10⁶ UFC de S. aureus ou K. pneumoniae em 50 μΐ de PBS. Posteriormente, nos tempos de 24 e 48 horas após a infecção, as lavagens pulmonares e nasais foram coletadas, homogeneizadas e diluídas em série em

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39/68 extensão adequada. As diluições em série foram espalhadas em placas de ágar-sangue BHI e cultivadas durante a noite a 37°C para a contagem de células.

Experimento para infecção com vírus e Streptococcus pneumoniae

[090] Os camundongos (BALB/ c do sexo masculino, 6 a 8 semanas de idade, Koatech, Coréia) foram imunizados com uma suspensão de cerca de 1 x 10⁸ UFC de Apep27 em 50 μΐ de BBS semanalmente por um total de três vezes. Dez dias após a última imunização, os camundongos foram infectados por via intranasal com uma suspensão do vírus influenza H1N1 em 50 μΐ de BBS em uma dose letal (LD) de 0,02, seguida pelo monitoramento dos pesos corporais diariamente. De 10 a 12 dias após a infecção pelo influenza, os camundongos foram infectados por via intranasal com uma suspensão de 1 x 10⁸UFC de D39 em 50 μΐ de BBS e medidos quanto à taxa de sobrevivência.

Isolamento de esplenócitos

[091] Os camundongos foram imunizados por via intranasal com 1 x 10⁷ a 1 x 10⁸ UFC de Apep27 (cepa mutante THpep27) de duas em duas semanas durante um total de três vezes. Uma semana após a última imunização, o baço foi excisado e os esplenócitos assim obtidos foram tratados com anticorpos anti-CD3e (5 μΐ/ ml; eBioscience) e anti-CD28 (3μ1/ ml; eBioscience) para estimular os linfócitos T

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40/68 (Bashour et al., 2014) . Após 24 horas de incubação, as células foram coletadas e o meio de cultura foi medido quanto aos níveis de citocinas.

Medição de citocinas

[092] Os níveis de interleucina (IL)-17, fator de necrose tumoral (ΤΝΕ)-α, interferon (ΙΕΝ)-γ, IL-4 e IL-10 no lavado bronco-alveolar (LBA), soros e esplenócitos foram medidos usando um kit de ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

Titulação de anticorpo IgG e determinação de subtipo ig

[093] Os camundongos foram imunizados por via intranasal com 1 x 10⁷ a 1 x 10⁸ UFC de Apep27 a cada duas semanas por um total de três vezes. Sete dias após a última imunização, as amostras de soro foram obtidas por sangramento retro-ocular e armazenadas a -80°C até a realização do ELISA. Os anticorpos foram titulados conforme descrito anteriormente (Roche et al., 2007; Kim et al., 2012; Cohen et al. 2013) e os subtipos de Ig foram determinados usando um kit ELISA de isotipagem de Ig de camundongo (eBioscience, EUA) .

[094] Nos estudos de coinfecção, os títulos de IgG dos soros foram medidos pelo método ELISA usando imunoplacas de 96 poços revestidas com Usados de Streptococcus pneumoniae

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41/68 (D39, A66.1 e BG7322) ou cápsulas de sorotipo 2 ou proteína PspA (1 gg/ ml) purificadas em PBS (Kim et al., 2012; Cohen et al., 2013).

Contagem de virus e bactérias no pulmão

[095] Após imunização intranasal com Apep27, os camundongos (BALB/ c quatro/ grupo) foram infectados com o vírus da gripe H1N1 ou H3N2 como descrito acima. Posteriormente, as amostras pulmonares foram coletadas e analisadas conforme relatado anteriormente (Shim et al, 2013).

[096] Cinco dias após a infecção pelo vírus influenza, os pulmões murinos foram passados através de um filtro de 70 pm, seguido de centrifugação. O sobrenadante assim obtido foi armazenado a -80 °C até a titulação. Para a titulação viral, uma suspensão de células MDCK em meio MEM (BSA 1% livre de IgG, Ix penicilina-estreptomicina) foi semeada a uma densidade de 2 x 10⁴ células/ poço em placas de 96 poços que foram incubadas a 37 °C por 4 horas. Posteriormente, as células cultivadas foram infectadas com diluições em série 2 vezes do sobrenadante do homogenato pulmonar e incubadas durante a noite. Então, depois que o sobrenadante foi descartado, o título do vírus foi determinado usando o anticorpo anti-influenza A com TCID50/ ml (Wu et al, 2015).

PCR em tempo real

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[097] A partir dos macrófagos peritoneais que foram isolados e cultivados, o RNA total foi isolado usando RNAiso plus (TAKARA, Japão) . A RT-PCR foi realizada usando o kit qPCR RT de uma etapa (Enzynomics, Coréia) . As sequências iniciadoras especificas do gene foram as seguintes: Gene IL10 (direto [F]: 5’- AGC CAC CTC ATG CTA GAG C (SEQ ID NO:

10) , Reverso [R]: 5’- GCC TGG TCT GGC ATG ACT AC (SEQ ID NO:

11) ); gene IL-Ιβ (F: 5’- CTG GTG TGT GAG GTT GCC AT (SEQ ID

NO: 12), R: 5’- TGT CGT TGC TTG GTT CTC CT (SEQ ID NO: 13)); e gene TNF-α (F : 5’- GAG AAG ATG CTG GGA GAG TGA (SEQ ID NO: 14), R: 5’- TGC TTG ATG GTG GTG CAT GA (SEQ ID NO: 15)). A gene GAPDH (iniciador F: 5’- TGC ATG CTG GAG CAC CAA (SEQ ID NO: 16), R: 5’- TGC ACG ATG GGA AAG TTG TC (SEQ ID NO: 17)) foi usado como controle.

[098] O programa de PCR foi realizado da seguinte forma: Mantendo; 95°C, 10 min; 40 ciclos de 95 °C, 15 s; 55 °C, 30 s, e 72 °C, 30 s; curva de fusão (95 °C 15 s; 60 °C, 1 min; 95 °C, 15 s).

Sequenciamento de alto rendimento

[099] Para medir a expressão gênica induzida no pulmão e no baço após a imunização com Apep27, os camundongos (Balb/ c com 4 semanas de idade) foram vacinados por via intranasal com 1 x 10⁷ a 1 x 10⁸ UFC de Streptococcus pneumoniae Apep27 (THpep27: Choi et al., 2013) sem anestesia a cada duas semanas, totalizando três vezes. O RNA foi isolado dos

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43/68 pulmões e baços com o auxilio do reagente Trizol (Invitrogen) e as bibliotecas de sequenciamento foram construídas usando 500 ng do RNA total. Para uso no sequenciamento subsequente, uma biblioteca de RNA foi construída usando um kit de preparação da biblioteca LEXOGEN Quant-Seq (Cat # 001.24) de acordo com o protocolo padrão. A expressão gênica foi medida por sequenciamento de alto rendimento usando Illumina NextSeq 500.

Etapa de tratamento de DNA

[0100] A chamada de base foi realizada usando o software Illumina Casaval.8. As leituras de sequência foram organizadas para as sequências do adaptador, seguidas por filtragem de leituras de sequência de baixa complexidade e baixa qualidade com a ajuda do fastx_trimmer. As leituras resultantes foram mapeadas para o genoma mmlO completo, usando Bowtie2. A extração da contagem de leitura e a normalização dos dados foram implementadas usando o edgeR. Experimentos e análises de biologia de sistemas usando Ingenuity Pathway Analysis foram realizados em e-Biogen (Seoul, Coréia).

[0101] Os dados da análise da expressão gênica foram depositados no NCBI [número de acesso GEO GSE93718] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

Medição do potencial de proteção contra a Doença Inflamatória Intestinal

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[0102]

Após serem anestesiados por inj eção intraperitoneal de 100 μΐ de cetamina, os camundongos (C57BL/ 6 machos, com 4 semanas de idade) foram vacinados por via intranasal com 1 χ 10⁷ a 1 χ 10⁸ UFC de Apep27 semanalmente, por um total de três vezes. Os camundongos foram medidos quanto ao peso corporal e divididos aleatoriamente em quatro grupos experimentais de dois por grupo. Os grupos experimentais de camundongos usados em uma série de experimentos foram os seguintes: um controle não tratado com sulfato de dextrano sódico (DSS), um controle experimental tratado apenas com DSS a 5%, um grupo experimental imunizado apenas com Pep27 e um grupo ao qual Pep27 + DSS a 5% foram administrados. Os camundongos foram alimentados com DSS (5%, p/ v) com um peso molecular médio de 5000 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, EUA) por 14 dias consecutivos para induzir enterocolite (Wirtz et al, 2007) . Nesse sentido, a solução DSS foi trocada diariamente por uma nova. Os camundongos do grupo controle foram autorizados a beber apenas água da torneira.

[0103]

Todos os camundongos do grupo controle e do grupo experimental receberam um veículo (solução salina) em quantidades equivalentes às do grupo administrado com DSS da mesma maneira que o grupo administrado com DSS pela duração do estudo. CAMUNDONGO

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Inoculação intranasal

DSS com APep27 com PBS sem

DSS

DSS sem

DSS <Ensaio de Imunização APep27 para Inibição contra

Enterocolite Induzida por DSS em Camundongos>

Amostragem de Doença Inflamatória Intestinal (DII)

[0104]

Quatorze dias após a administração de DSS a 5%, os animais experimentais foram sacrificados por asfixia com CO2, seguida de laparotomia. Todo o intestino grosso que varia do ceco ao ânus foi removido e dividido em porções proximal, média e terminal. Os tecidos selecionados foram separados, lavados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e armazenados a -80°C até a análise.

Quantificação de Fragmentos de Cólon (índice de atividade da doença:

DAI)

[0105] progressão da colite foi avaliada diariamente, medindo a quantidade de bebida, perda de peso, consistência das fezes, sangramento retal, presença de sangue total nas fezes. Além disso, os sintomas clínicos foram avaliados.

Os camundongos também foram monitorados diariamente quanto a morbidade (cansaço e letargia).

[0106]

Esses parâmetros foram pontuados de acordo com os critérios sugeridos abaixo, que foram usados para

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46/68 calcular o índice médio diário de atividade de doenças (DAI) para cada animal, conforme sugerido nos relatórios anteriores (Wirtz et al, 2007; Jawhara e Poulain, 2007) .

[0107] Além disso, a inflamação do intestino grosso foi avaliada medindo-se a olho nu o comprimento do cólon que permaneceu não esticado e variou da junção sigmoide à margem anal. Opiniões patogênicas detalhadas foram dadas para cada grupo. Um sistema no qual os tecidos foram visualmente pontuados de 0 a 5 pontos foi usado para avaliar o tempo em que o órgão afetado pela inflamação mais grave passou por uma alteração e a extensão da alteração.

[0108] O sistema de pontuação patológica verificado anteriormente (Jawhara e Poulain, 2007; Xu et al, 2007) foi modificado para avaliar a colite. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos duas vezes e calculados para todos os grupos da seguinte maneira:

1) Perda de peso: sem alteração, 0; <5%, 1; 6 a 10%, 2; 11 a 20%, 3; > 20%, 4;

2) Consistência das fezes: sedimento normal ou bem formado, 0; ataduras em forma de massa, formas que não grudam no ânus (não grudentas, pastosas, semi-formadas), 1; líquido pegajoso que permanece preso ao ânus, 2; pegajoso com um pouco de sangue, 3; completamente líquido, ensanguentado ou incapaz de defecar após 10 minutos, 4;

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3) Sangramento retal: sem sangramento, 0; sangue visível no ânus ou reto, 1; sangue visível na pele, 2; sangramento significativo do reto, 4;

4) Aparência geral: normal, 0; mucosa 1; letárgico e piloereto, 2; letárgico e curvado, 3; imóvel e doente, 4.

Análise Estatística

[0109] Todos os dados foram expressos como os valores médios das medições duplicadas independentes ± desvio padrão. A comparação estatística foi realizada por ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni. Todos os valores de p <0,05 foram considerados significativos.

2. Resultados:

2-1. Caso 1: A análise de HTS e biológica do sistema indica uma função protetora contra as principais lesões.

2-1-1. A imunização com Apep27 protegeu camundongos contra várias lesões.

[0110] A análise da biologia do sistema no pulmão indica que a imunização intranasal com Apep27 protege contra gastroenterite e impede que o intestino grosso se torne anormal (FIG. 1) . Além disso, a análise da biologia do sistema no baço mostra que a imunização com Apep27 protege contra a infecção pelo vírus influenza (FIG. 2).

2-1-2. Células Treg induzidas por imunização com Apep27.

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[0111] A análise biológica do sistema no pulmão também mostra que a imunização com Apep27 induz a expressão de TGF-β no pulmão (FIG. 3). Na FIG. 3, o verde é responsável pela supressão da expressão gênica, enquanto o vermelho significa a indução da expressão gênica. Para confirmar a indução de Treg por inoculação com Apep27, os esplenócitos dos camundongos inoculados foram analisados por FACS. Como pode ser visto, a imunização com Apep27 aumentou as populações de células Th2, Thl7 e Treg, mas as células Thl permaneceram quase inalteradas (FIG. 4), sugerindo que essas células Treg induzidas desempenham certo papel na tolerância imunológica. Para apoiar a indução de Treg, foram medidos os níveis de citocinas nos esplenócitos e soros. Consistente com o exposto, foi feita uma indução significativa de interferon (IFN) -γ, IL-4, IL-17 e IL-10 no baço (FIG. 5) . Além disso, a indução significativa de IFN-γ, IL-17 e IL-10 também foi observada nos soros, mas sem alterações significativas no nível de IL-4 detectadas (FIG. 6). Estes resultados implicam que a indução de células Treg leva à produção da citocina anti-inflamatória IL-10, reforçando a tolerância imunológica.

2-1-3. Indução de IL-10 por imunização com Apep27

[0112] A fim de apoiar a resposta da tolerância imunológica, o líquido de lavagem pulmonar e bronco-alveolar (LBA) foi medido para os níveis de mRNA de IL-10 e IL-17.

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Consistentemente, a imunização com Apep27 aumentou significativamente os niveis de mRNA de IL-10 e IL-17 no pulmão (FIGS. 7 e 8).

2-1-4. Indução da resposta da memória pela imunização com Apep27

[0113] Para examinar se a vacinação intranasal evoca uma resposta de memória, os esplenócitos foram coletados de camundongos imunizados e analisados quanto à respostas de memória. Como resultado, a imunização com Apep27 aumentou populações de células T de memória central (CD4, CCR7, CD62L) e células de memória Tfh (CD4, CXCR5, CCR7) no baço (FIG. 9).

[0114] Para confirmar a resposta de memória novamente, foram medidos os titulações de anticorpos de vários subtipos de imunoglobulina sérica. Como esperado, a imunização com vacina Apep27 induziu a expressão de vários subtipos de imunoglobulina, como IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3 (FIG. 10) . Além disso, o nível de anticorpos IgG contra células inteiras pneumocócicas de três tipos também foi significativamente aumentado pela vacinação (FIG. 11). Portanto, a vacinação intranasal foi confirmada por induzir uma resposta de memória.

2-2. Caso 2: Proteção contra a coinfecção por vírus influenza

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[0115] Streptococcus pneumoniae e virus influenza A (IAV) são as principais causas de infecção respiratória (Bosch et al, 2013, Shak et al, 2013) . 0 Streptococcus pneumoniae ou o próprio IAV causam uma doença respiratória, mas a mortalidade é aumentada por infecções secundárias após a infecção pelo vírus influenza (Mina e Klugman, 2013) . No entanto, a vacina conjugada com polissacarídeo pneumocócico atualmente disponível, PCV 13, falha na proteção eficaz contra a infecção pneumocócica secundária (Metzger et al, 2015).

2-2-1. Proteção por imunização com Apep27 contra infecção pneumocócica secundária

[0116] Anteriormente, foi demonstrado que a inoculação intranasal com Apep27 podería induzir IgG e proteger camundongos da infecção pneumocócica heteróloga (Kim et al, 2012) . Nesta divulgação, foi feita análise para verificar se a imunização com Apep27 podería aumentar os títulos de anticorpos contra as células bacterianas inteiras bem como antígenos específicos. Os resultados mostraram que a inoculação intranasal com Apep27 aumentou os títulos de IgG contra cepas dos sorotipos capsulares 3 e 6B, bem como células inteiras do sorotipo 2 (D39). Este aumento foi significativamente maior do que nos controles não imunizados indicando que a imunização com Apep27 induziu imunidade humoral contra cepas pneumocócicas homólogas e heterólogas

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51/68 (FIG. 11). No que diz respeito aos níveis de citocinas após a infecção por influenza, todos os níveis de INF-γ, TNF-α e IL-Ιβ foram medidos como significativamente mais baixos nos grupos experimentais imunizados do que aqueles em controles não imunizados, indicando que a imunização com Ape27 induziu a tolerância imunológica (FIG . 12) . Quando os títulos de IgG contra antígenos específicos, como a proteína PspA e o polissacarídeo capsular do sorotipo 2, foram determinados, a imunização com Apep27 aumentou os títulos de anticorpos contra a proteína PspA, mas não o polissacarídeo capsular do sorotipo 2 (FIG. 13).

[0117] Para investigar o efeito protetor da imunização intranasal com Apep27 na infecção pneumocócica secundária, os camundongos foram infectados com dose letal de 0,02 (LD50) do vírus da influenza H1N1. Dez dias após a infecção pelo vírus influenza, os camundongos foram infectados com a cepa pneumocócica virulenta D39 e a taxa de sobrevivência foi monitorada. Enquanto camundongos não vacinados (PBS/ H1N1) sucumbiram à pneumonia após a infecção por D39, a maioria dos camundongos imunizados por via nasal (THpep27/ H1N1) sobreviveu com sucesso após a infecção por D39 (FIG. 14) . Este resultado sugere que a imunização intranasal com Apep27 podería proteger os camundongos contra a infecção pneumocócica secundária, bem como contra a infecção por vírus influenza.

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[0118] Quando os camundongos foram infectados com a imunização pós-intranasal de Streptococcus pneumoniae, muito menos bactérias foram detectadas no pulmão de todos os camundongos vacinados do que os controles não vacinados (FIG. 15), indicando que a imunização intranasal com Apep27 também protegeu, com sucesso, os camundongos de infecção pneumocócica secundária após a infecção por influenza.

2-2-2. Diminuição da contagem viral e bacteriana no pulmão pela imunização com Apep27

[0119] Para investigar se a imunização com Apep27 atenuou a carga do vírus influenza, a perda de peso corporal foi determinada após a infecção pelo vírus influenza. Curiosamente, nenhum camundongo vacinado com Apep27 sofreu perda de peso após a infecção por influenza, enquanto os camundongos não vacinados apresentaram perda de peso significativa (FIG. 16) . Como a vacinação Apep27 protegeu contra perda de peso da infecção pelo vírus influenza, foi feito um exame adicional para verificar se a vacinação com Apep27 podería afetar a replicação do vírus influenza no pulmão, determinando o TCID50 dos pulmões de camundongos infectados com influenza. Surpreendentemente, os camundongos vacinados mostraram títulos de vírus significativamente mais baixos no pulmão do que os camundongos de controle não vacinados (FIG. 17). Estes resultados indicaram que a vacinação intranasal com Apep27 não apenas protegeu contra

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53/68 a infecção pneumocócica, mas também aliviou significativamente a infecção pelo vírus influenza.

2-3. Caso 3: Proteção por imunização Apep27 contra outras infecções bacterianas

2-3-1. Proteção por imunização Apep27 contra infecção bacteriana Gram negativa

[0120] Para investigar se a imunização com Apep27 podería impedir a colonização de outras bactérias, os camundongos foram vacinados com Apep27 e depois infectados com a bactéria Gram negativa Klebsiella pneumoniae, seguida pela contagem das bactérias nos tecidos. Vinte e quatro horas após a infecção, uma contagem significativamente reduzida de Klebsiellae pneumonia foi detectada nos pulmões e nos soros dos grupos vacinados, em comparação com os controles não vacinados (FIG. 18). Os dados demonstraram que a vacinação com Apep27 podería prevenir a infecção bacteriana Gram negativa.

2-3-2. Proteção por imunização Apep27 contra infecção bacteriana Gram positiva

[0121] Para investigar novamente se a vacinação com Apep27 podería impedir a colonização de outras bactérias, os camundongos foram vacinados com Apep27 e depois infectados com a bactéria Gram positiva Staphylococcus aureus, seguida pela contagem das bactérias viáveis nos tecidos. Curiosamente, menos colônias foram detectadas no líquido de

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54/68 lavagem pulmonar e nasal do grupo vacinado com Apep27 do que no controle não vacinado (FIG. 19) . Este resultado demonstrou que a vacinação com Apep27 pode prevenir a infecção de outras bactérias, como bactérias Gram positivas.

2-4. Caso 4: Proteção contra doença inflamatória intestinal

[0122] Os fenômenos de tolerância imunológica oral foram estudados para artrite reumatoide (AR), doenças alérgicas, diabetes, arteriosclerose, doenças de colites humanas (Faria e Weiner, 2005). Foi relatado que a inoculação intranasal com proteína efetora (SseB) derivada de Salmonella induziu respostas intestinais e sistêmicas de IgA Thl e Thl7, após as quais as cargas bacterianas nos tecidos intestinais e no baço foram reduzidas mesmo na infecção letal oral (Pigny et al., 2016). No entanto, em nenhum lugar foi relatado anteriormente sobre vacinas intranasais para proteção contra doenças inflamatórias intestinais.

2-4-1. Proteção pela vacinação Apep27 contra doença inflamatória intestinal

[0123] Para investigar se a vacinação com Apep27 podería suprimir a doença inflamatória intestinal, os camundongos foram imunizados por via intranasal com a vacina, seguido de indução de colite com DSS. Como resultado do experimento, o índice de atividade da doença foi agravado desde o dia nove após a adição de 5% de DSS à água potável,

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55/68 com a redução significativa concomitante do peso corporal nos camundongos. Enquanto camundongos tratados com DSS a 5% isolados sofreram perda de peso significativa, o grupo experimental imunizado com Apep27 e tratado com DSS a 5% diminuiu significativamente menos em peso corporal do que o grupo tratado apenas com DSS (FIG. 20).

[0124] Quando comparados os escores gerais do índice de atividade clínica da doença (p <0,05, ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni, tratamento com DSS por 6 a 9 dias), o grupo tratado apenas com DSS a 5% obteve pontos significativamente mais altos na consistência das fezes do que no grupo experimental tratado com Apep27 + 5% de DSS (FIG. 21) . Assim, o resultado indicou que após o início da colite induzida por DSS, a doença foi agravada no grupo tratado apenas com DSS, com um alto índice de atividade clínica da doença, enquanto que a colite no grupo vacinado era tão leve quanto no grupo normal.

[0125] A redução do comprimento do cólon é usada como marcador de inflamação no modelo de colite induzida por DSS. Na prática, o comprimento do cólon nos grupos administrados por DSS foi reduzido com significância (FIG. 22). Por conseguinte, o grupo DSS aumentou significativamente na proporção peso/ cólon, mas o grupo vacinado com Apep27 exibiu uma proporção quase normal em comparação com o grupo DSS (FIG. 23).

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2-4-2. Inibição de citocinas inflamatórias pela vacinação com Apep27

[0126] Para confirmar o efeito redutor da vacinação Apep27 na inflamação intestinal, foram medidos os níveis de mRNA de citocinas no intestino grosso. Como resultado do experimento, observou-se que o grupo vacinado com Apep27 apresentou um nível de mRNA significativamente reduzido de IL-Ιβ pró-inflamatória, em comparação com o controle não imunizado (FIG. 24) . Além disso, a vacinação intranasal suprimiu os níveis de mRNA de IL-17A, TNF-α e IL6, em comparação com o controle não imunizado (FIG. 24), demonstrando que a vacinação intranasal diminuiu a expressão das citocinas.

[EXEMPLO 2] Ensaio do potencial inibidor da cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae THpep27 contra doenças alérgicas

1. Materiais e métodos

1.1. Cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae THpep27

[0127] A cepa de Apep27 Streptococcus pneumoniae (THpep27, D39Apep27:: Cheshire) é a cepa relatada por Choi SY et al. (Inactivated pep27 mutant as an effective mucosal vaccine against a secondary lethal pneumococcal challenge in mice. Clin Exp Vaccine Res. 2013), que é o mesmo que ο Streptococcus pneumoniae mutado em pep27 divulgado na Patente Coreana No. 10-1252911, com a exceção de que o

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57/68 marcador resistente à eritromicina (ermAM) para seleção não está incluído.

[0128] Um cassete Cheshire (número de acesso GenBank FJ981645) com o marcador de resistência à eritromicina (ermAM) , que pode ser usado como marcador temporário para seleção, foi amplificado usando iniciadores (5'-TGG CTT ACC GTT CGT ATA G-3’ (SEQ ID NO: 2) e 5’-TCG ATA CCG TTC GTA TAA TGT-3' (SEQ ID NO: 3)), 3)), que foram concedidas pelo Dr. Donald Morrison (Universidade de Illinois em Chicago) e ligadas por reação em cadeia da polimerase (PCR), com sequências a montante e a jusante amplificadas com iniciadores (5’-TCT GTA TCG GCC TCA AGC AGS’ (SEQ ID NO: 4) e 5’-GTA TAG GAA CGG TAA GCC A GAT TTT CAC GAG TGC TTT CG-3’ (SEQ ID NO: 5), e 5’-AGA TTA TAG GAA CGG TAT CGA AAG GCC AGC AAG AGA CTA-3’ (SEQ ID NO: 6) e 5’-CTG CGA GGC TTG GAG TGT AG-3’ (SEQ ID NO: 7) a partir do DNA genômico de D39, que serviu de modelo. Subsequentemente, o produto ligado foi então transformado em D39 para criar um mutante pep27.

[0129] A excisão do cassete de Cheshire foi induzida pela adição de 1% de L-fucose (Sigma, St. Louis, MO, EUA) . As culturas tratadas com fucose foram então espalhadas em placas de THY ágar no sangue para formar uma única colônia. A presença dos cassetes Cheshire em cada colônia foi confirmada por PCR usando os seguintes

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58/68 iniciadores: 5'-TCT CTA TCG GCC TCA AGO AG-3' (SEQ ID NO: 8) and 5'-CTG CGA GGC TTG CAC TGT AG-3' (SEQ ID NO: 9) . A sequência mutante (THpep27) foi confirmada por sequenciamento de nucleotideos (Cosmo, Seul, Coréia), bem como por análise de immunoblot com anticorpo Pep27 (dados não mostrados).

[0130] Para confirmar o mutante THpep27 no nível do RNA, o RNA foi isolado de bactérias na fase exponencial inicial usando o método convencional de fenol quente. Após remoção do DNA pela DNase I (Takara, Tóquio, Japão), um micrograma de RNA bacteriano foi transcrito reversamente em cDNA usando iniciadores aleatórios (Takara). A PCR de transcrição reversa foi realizada usando os iniciadores de acordo com as instruções do fabricante (Super Bio, American Building Restoration Products Inc., Franklin, WI, EUA) .

[0131] A cepa mutante THpep27 de Streptococcus pneumoniae assim formada foi cultivada em caldo THY (caldo Todd-Hewitt suplementado com extrato de levedura a 0,5%; Difco Laboratories) a 37 °C até OD550 atingir 0,3 (1 x 10⁸UFC/ ml). A cultura bacteriana coletada foi lavada com PBS e depois diluída em PBS filtrado para uma concentração final de 1 x 10⁸ UFC/ 50 μΐ para uso em imunização.

1.2. Animais Experimentais

[0132] Camundongos BALB/ c fêmeas (cinco semanas de idade, Orient, Coréia) foram adquiridos e aclimatados por

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59/68 dias em uma câmara animal antes do uso. Uma mistura de 4: 1 de cetamina (injeção de cetamina, Yuhan Corporation, Coréia) e xilazina (Rompun, Bayer Korea Ltd.) foi diluída duas vezes em BBS. Os camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de 100 μΐ da diluição. A anestesia foi seguida por desafio e vacinação, e experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética Animal da Universidade de Sungkyunkwan.

1.3. Ensaio do efeito preventivo do mutante pep27 na asma

[0133] 1) Os camundongos foram divididos em três grupos (n = 7/ grupo): um grupo normal alimentado com água estéril (BBS); um grupo em que a asma foi induzida com OVA (ovalbumina), seguida pela alimentação de água estéril; e um grupo em que a vacinação com mutante pep27 (Apep27) foi seguida por indução de asma.

[0134] 2) Nos dias 0, 7 e 14 após o início do experimento, os camundongos foram anestesiados e vacinados por via intranasal (I.N) com Apep27 a 1 x 10⁸ UFC/ 50 μΐ. Nos dias 38 e 49 após o início do experimento, os camundongos foram sensibilizados por injeção intraperitoneal de 100 μΐ de uma solução de sensibilização que foi preparada por voltexing de 50 pg de OVA (albumina de clara de ovo de galinha, Sigma Chemical Co., EUA) e 2 mg de Alúmen (hidróxido de alumínio hidratado, Thermo Co., EUA) em 100 μΐ de solução

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60/68 salina a 0,9% (pH 4,0, Dyne Bio Inc., Coréia) por 4 horas a 4 °C. Posteriormente, os camundongos foram desafiados com 25 μΐ de uma solução de 0,4 mg/ ml de OVA em soro fisiológico todos os dias durante seis dias do dia 59 ao dia 64, adicionando gota a gota 12,5 μΐ da solução a cada uma das duas regiões intranasais (finalmente administrado em uma quantidade total de OVA 10 pg/ camundongo) para induzir a asma. Vinte e quatro horas após o último desafio com OVA, os animais experimentais foram sacrificados e o liquido de lavagem bronco-alveolar (LBA) foi coletado e medido quanto aos níveis de citocinas. Os tecidos pulmonares foram excisados, fixados e corados com hematoxilina-eosina (H&E) (FIGS. 25 e 26).

1.4. Ensaio de efeito terapêutico na asma

[0135] Os camundongos foram divididos em três grupos (n = 7/ grupo): um grupo normal alimentado com água estéril (PBS); um grupo em que a asma foi induzida com OVA (ovalbumina) (grupo induzido por asma) ; e um grupo no qual a asma foi induzida com OVA, seguida de vacinação com a cepa mutante pep27 (Apep27) (grupo experimental curado pela asma) [0136] 2) Grupo induzido para asma: Resumidamente todos os grupos exclusivos do grupo normal foram sensibilizados nos dias 0 e 10 após o inicio do experimento, injetando intraperitonealmente 100 μΐ de uma solução de sensibilização, preparada por voltexing de 50 pg de OVA

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61/68 (albumina da clara de ovo da galinha, Sigma Chemical Co., EUA) e 2 mg de Alúmen (hidróxido de alumínio, Thermo Co., EUA) em 100 mL de solução salina a 0,9% (pH 4,0, Dyne Bio Inc., Coréia) por 4 horas a 4 °C. Dez dias depois, os camundongos foram desafiados com 25 μΐ de uma solução de OVA a 0,4 mg/ ml em soro fisiológico todos os dias por seis dias do dia 20 ao dia 25 pela administração de 12,5 μΐ da solução a cada uma das duas regiões intranasais (em uma quantidade total de OVA 10 pg/ camundongo) . Para o grupo normal, solução salina biológica foi fornecida isoladamente (FIG. 27A).

[0137] 3) Grupo experimental de terapia de asma: Uma semana após o mesmo desafio de OVA que em 2), os camundongos foram imunizados por imunização intranasal de Apep27 a 1 x 10⁸ UFC/ 50 pi uma vez por semana, por um total de três vezes. Durante três semanas de tratamento, os camundongos foram desafiados via I.N. com OVA na dose de 10 pg/ 25 pi de três dias antes da administração da vacina até três vezes por semana (9 vezes no total), de modo a induzir a asma. Uma semana após a última vacinação, os camundongos foram finalmente desafiados com OVA, 24 horas após as quais os camundongos foram sacrificados (FIG. 27B).

1.5. Análise histoquimica

[0138] Os tecidos pulmonares e brônquicos foram isolados e fixados com formaldeído a 10% (v/ v), seguido de bloqueio de parafina. Os tecidos bloqueados com parafina

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62/68 foram cortados em seções de 4 pm de espessura antes da coloração com H&E. Os tecidos corados com H&E foram fotografados usando um microscópio óptico. A análise histoquímica foi confiada à KNOTUS Co., Ltd. (Coréia) (FIG. 28) .

1.6. Análise de citocinas

[0139] O líquido de lavagem bronco-alveolar (LBA) foi coletado e medido quanto aos níveis de citocinas. Em resumo, a traqueia do camundongo foi exposta e um cateter foi inserido na traqueia. Através do cateter, 1,0 ml de PBS para BAL foi instilado lentamente nos bronquíolos e aspirados cerca de 0,9 ml. Este fluido foi carregado como estava, seguido pela recuperação do fluido de lavagem. O procedimento foi repetido mais duas vezes para obter BALE em um total de 0,8 ml. O BALD obtido foi centrifugado a 3.000 rpm por 10 minutos a 4 °C. Em seguida, o sobrenadante foi separado como BALE para medir os níveis de citocinas e armazenado a -70°C em um freezer até o uso. Os níveis de citocinas no BALE foram medidos usando um kit ELISA (ELISA Ready-SET-Go!, eBioscience, San Diego).

1.7. Estatísticas

[0140] Os dados experimentais foram expressos como média ± desvio padrão. O processamento estatístico para medições de citocinas foi realizado com ANOVA de uma via. A comparação estatística de cada grupo foi realizada pelo teste

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63/68 de Bonferroni (*, P<0,05; **, P<0,01; ***, P<0,001). Todos os valores de p <0,05 foram considerados significativos.

2. Resultado

2.1. Ef icácia preventiva do mutante pep27 (Apep27) contra a asma

2.1.1. Inibição da secreção de citocinas induzida por asma pela vacinação com Apep27

[0141] Quando os níveis de citocinas nos alvéolos foram medidos usando um kit ELISA, os níveis respectivos de citocinas indutoras de alergia IL-4, IL-5 e IL-13 (citocina Th2; Cho et al. , 2002) no grupo vacinado com Apep27 foram notavelmente reduzidos em comparação com o grupo de asma e foram tão baixos quanto os do grupo normal (FIG. 25).

2.1.2. Supressão do edema das vias aéreas na asma pela vacinação com Apep27

[0142] Nas doenças alérgicas das vias aéreas, os alérgenos induzem inflamação, tornando as vias aéreas notavelmente espessas (FIG. 26, grupo asma). Após a coloração imuno-histoquímica de células inflamatórias (hematoxilinaeosina, HE) e as células caliciformes (ácido periódico de Schiff, PAS), as células foram observadas em 400 ampliações para reduzir a inflamação notavelmente no grupo vacinado com Apep27, em comparação com o grupo asma, com nível semelhante ao do controle (FIG. 26, grupo vacinado).

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2.2. Eficácia terapêutica do mutante pep27 (Apep27) para a asma

2.2.1. Eficácia terapêutica da vacina Apep27 suprimindo citocinas relacionadas à asma

[0143] Os camundongos foram imunizados com a vacina Apep27 uma vez por semana, durante um total de três vezes e uma semana após a última imunização, os níveis de citocinas em BALE dos camundongos foram quantificados (FIG. 27A) . Os níveis de citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) aumentaram notavelmente no grupo de asma, mas foram semelhantes entre o grupo vacinado e o grupo normal (FIG. 27B) .

2.2.2. Eficácia terapêutica da vacina com Apep27 suprimindo a inflamação pulmonar

[0144] Após a conclusão do experimento, os pulmões dos camundongos foram corados com hematoxilinaeosina (HE). Observou-se que o grupo vacinado com Apep27 (C) apresentou uma inflamação notavelmente suprimida, em comparação com o grupo induzido por asma (B) . Particularmente o grupo vacinado exibiu quase a mesma morfologia que no controle normal (A) quando a infiltração e a secreção mucosa de células de inflamação ao redor dos brônquios e vasos sanguíneos foram suprimidas (FIG. 28).

3. Discussão

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[0145] Até o momento há artigos divulgando a prevenção/ tratamento da asma usando micro-organismos que inalam Mycobacterium phleí inativado suprimindo a hipersensibilidade brônquica em crianças com asma moderada (Ming et al. , 2013) e inibindo a expressão de IL-23R para regular a inflamação das vias aéreas mediada por células γδΤ produtoras de IL-17, aliviando a asma (Ming et al. , 2017) . Além disso, é relatado que a imunização intranasal com a cepa de pertussis atenuada BPZE1 em camundongos reduziu a inflamação alérgica das vias aéreas e a hiper-responsividade de contato de pele e, portanto, pode ser usada para prevenir e tratar essas doenças (Li et al., 2012). Conforme relatado, a imunização com difteria ou toxina tetânica atenuada sozinha ou em combinação com a vacina contra células inteiras de coqueluche suprime as respostas imunes Th2 induzidas por alérgenos em modelos de camundongos e, portanto, pode ser usada para inibir a inflamação das vias aéreas ou a hiperresponsividade (Grüber et al. , 2006) .

[0146] Além disso, a infecção por Streptococcus pneumoniae induz células T reguladoras, suprimindo doenças alérgicas das vias aéreas (Preston et al., 2011) . Além disso, a imunização intranasal com as vacinas conjugadas atualmente comercializadas contra Streptococcus pneumoniae inibe a progressão para doença alérgica das vias aéreas, mas não foram obtidos efeitos sobre a injeção intramuscular

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66/68 (Thorburn et al., 2010). Foi assim revelado que a injeção de polissacarídeos e toxina atenuada de Streptococcus pneumoniae nas vias aéreas suprime doenças alérgicas das vias aéreas e induz células T reguladoras, que inibe o aparecimento de doenças alérgicas das vias aéreas, com o consequente impedimento e supressão das respostas imunes aos alérgenos (Thorburn et al. al., 2013) . No entanto, como todas as bactérias usadas na prevenção e tratamento da asma são muito tóxicas, exceto Bordetella pertussis atenuada, bactérias inativadas ou componentes específicos devem ser empregados. Além disso, é relatado que a imunização intranasal exibe um efeito inibitório mais alto nas respostas alérgicas das vias aéreas do que a imunização subcutânea (Takabayashi et al., 2003) .

[0147] A infecção por Bordetella pertussis induz respostas Thl (regulação positiva de IFN-γ) em modelos de doenças alérgicas das vias aéreas de camundongos, que podem agravar a inflamação (Ennis et al., 2004; Cho et al. , 2002; Kumar et al., 2004). Por isso, é necessário suprimir respostas alérgicas sem a regulação positiva da expressão de IFN-γ. Quando a instilação de Streptococcus pneumoniae morto nas vias aéreas foi mensurada para efeitos de prevenção da asma, as respostas Thl foram induzidas sem a supressão significativa dos níveis de IL-5 e IL-13, de modo que a expressão de IFN-γ foi significativamente aumentada (Preston

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67/68 et al. , 2007; Gibson et al., 2012; Pat. No. 8,226, 959) . Ou seja, apesar da supressão das respostas Th2, a indução de respostas Thl não pode excluir a possibilidade de agravar a inflamação. Assim, Gibson et al. (2012; US. Pat. No. 8,226,959) focaram em componentes separados de Streptococcus pneumoniae que têm efeitos inibitórios em doenças alérgicas das vias aéreas.

[0148] Quando usado, no entanto, o mutante pep27 atenuado (Apep27) da presente divulgação suprimiu significativamente a expressão de citocinas Th2 (IL-13 e IL4), bem como a citocina Thl (IFN-γ) aos níveis normais, com semelhança com o grupo normal em termos de opiniões histológicas. Portanto, espera-se que uma composição farmacêutica compreendendo a cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae, de acordo com a presente divulgação, seja um agente mais seguro para prevenção ou tratamento de doenças alérgicas, em comparação com vacinas ou medicamentos convencionais.

[0149] A descrição acima das modalidades exemplares é fornecida com a finalidade de ilustração e deve ser entendido pelos especialistas na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas sem alterar a concepção técnica e os recursos essenciais das modalidades exemplares. Assim, é claro que as modalidades de exemplo acima descritas são ilustrativas em todos os aspectos e não

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68/68 limitam a presente divulgação. Por exemplo, cada componente descrito como sendo de um único tipo pode ser implementado de maneira distribuída. Da mesma forma, os componentes descritos para serem distribuídos podem ser implementados de maneira combinada.

[0150] Deve ser entendido que o precedente é ilustrativo da presente invenção e não deve ser interpretado como limitado às modalidades específicas divulgadas, e que modificações nas modalidades divulgadas, bem como em outras modalidades, devem ser incluídas dentro do escopo das reivindicações anexas. A invenção é definida pelas reivindicações a seguir, com equivalentes das reivindicações a serem incluídas na mesma.

Claims

1. Composição farmacêutica compreendendo uma cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae caracterizada pelo fato de que a cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae compreende um gene pep27 mutante no qual os resíduos de nucleotídeo nas posições 1 a 53 na sequência de nucleotídeos pep27 representada pela SEQ ID NO: 1 são deletados, em que compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável ou um adjuvante.

2. Uso de cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae conforme definida na reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que é para preparar uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença inflamatória, uma doença infecciosa por vírus respiratório, uma doença infecciosa causada por uma bactéria diferente de Streptococcus pneumoniae, ou uma doença alérgica.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a doença inflamatória é selecionada entre asma, bronquite, pneumonia, sepse, rinite, doenças inflamatórias intestinais, gastroenterite, colite, doença de Crohn, pancreatite, aterosclerose e artrite.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o vírus respiratório é selecionado entre metapneumovírus, coronavirus, enterovirus, vírus sincicial

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2/3 respiratório, adenovirus, bocavírus, rinovírus e vírus da influenza.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a doença infecciosa causada por bactérias é selecionada a partir de uma doença infecciosa causada por uma bactéria Gram positiva e uma doença infecciosa causada por uma bactéria Gram negativa.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a bactéria Gram positiva é selecionada entre Staphylococcus, Streptococcus , Clostridium tetani e Bacillus anthracis, e em que a bactéria Gram negativa é selecionada dentre Salmonella , Shigella_r Klepsiella pneumoniae_r E. coll e Vibrio cholerae.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a doença alérgica é uma doença respiratória alérgica selecionada entre asma, rinite alérgica, sinusite e doença pulmonar obstrutiva crônica.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a doença alérgica é selecionada entre urticária, conjuntivite alérgica, alergia ao pólen, atopia, alergia alimentar, timpanite alérgica, choque anafilático, hipersensibilidade ao contato, dermatite alérgica de contato, alergia bacteriana, alergia fúngica, alergia viral, alergia a medicamento e encefalite alérgica.

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9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8, caracterizada pelo fato de que a composição permite a imunização de uma maneira independente de sorotipo.

10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 9, caracterizada pelo fato de que a cepa atenuada de Streptococcus pneumoniae suprime a produção de uma citocina Thl ou uma citocina Th2.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10, caracterizada pelo fato de que a citocina Thl é selecionada a partir de interferon-gama (IFN-γ), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina-12 (IL-12), e em que a citocina Th2 é selecionada a partir de interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5) e interleucina-13 (IL-13).

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 11, caracterizada pelo fato de que a composição é não invasiva para um pulmão, baço, sangue ou cérebro.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizada pelo fato de que a composição é configurada para ser administrada por uma via intraperitoneal ou intramucosa.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a composição é configurada para ser administrada por uma via intranasal.