CN101612394B - 肺炎链球菌减毒活菌疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于预防肺炎链球菌感染的肺炎链球菌减毒活菌疫苗，该疫苗为含有肺炎链球菌SPD_1672基因功能缺陷的D39△1672肺炎链球菌菌株的组合物，能够有效预防肺炎链球菌感染，安全性强、保护效果好、易大规模生产、具备推广使用的潜力。

Description

肺炎链球菌减毒活菌疫苗

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体说是一种用于预防肺炎链球菌感染的肺炎链球菌减毒活菌疫苗。 

背景技术

肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae，S.pn)是全球儿童和成人致病和致死的主要原因之一。它可以从鼻咽部粘膜的寄居处非侵袭地持续扩散至肺部引起肺炎、至血液引起败血症、至脑脊液引起脑膜炎或其他的部位引起疾病(中耳炎、鼻窦炎、气管炎)。目前全球每年死于肺炎链球菌感染的总人数高达300至500万人，其中多数是儿童和老人及免疫功能低下的人。另外，由于抗生素的应用越来越广泛，肺炎链球菌的耐药率也持续增加。在美国临床分离的肺炎链球菌44％都出现青霉素耐药，在亚洲临床分离的肺炎链球菌36％都表明多重耐药性，甚至还出现了耐万古霉素的肺炎链球菌，这些都使得肺炎链球菌引起的疾病在治疗上面临巨大问题，因此，肺炎链球菌疫苗的开发就显得尤为重要。目前已经上市的疫苗有两种：一种是23价多糖肺炎球菌疫苗，它覆盖23种血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F，主要用于预防成人肺炎链球菌性疾病，对2岁以下的儿童免疫性差；肺炎链球菌多糖是非T细胞依赖抗原，不能诱导免疫记忆。另外在一些研究中发现此疫苗诱导的抗体持久性差，老年人接种后4-7年抗体滴度降至免疫前水平，因此可能需要再次接种。另一种是7价多糖结合疫苗，覆盖的血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F，主要用于预防2岁以下儿童肺炎性疾病；可诱导T细胞依赖性免疫应答及诱发免疫记忆，即便在各类免疫缺陷患者中也可诱导保护性抗体应答。该疫苗还可预防全身性感染和粘膜感染，防止鼻咽部定植，从而减少细菌在社区人群的传播，它是由荚膜多糖与无毒性的白喉CRM197蛋白结合而成，价格昂贵，在发展中国家不能推广。另外，此疫苗在应用过程中存在荚膜血清型转换，包含的血清型覆盖了西方工业国家的幼儿中65％-80％与侵袭性肺炎链球菌疾病相关的血清型，然而，在许多发展中国家其覆盖率可能较低，持续时间也只有2-3年。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够有效预防肺炎链球菌感染的肺炎链球菌减毒活菌疫苗。 

肺炎链球菌的荚膜是主要毒力因子之一，对细菌在宿主体内生存具有重要意义，肺炎链球菌凭借荚膜抵御巨噬细胞吞噬，逃避机体的免疫清除。而肺炎链球菌基因SPD_1672编码的SPD_1672假想蛋白可能参与荚膜的形成，采用BLAST program分析软件，在NCBI数据库对36个体内诱导基因进行功能域分析，发现由基因(SPD_1672)编码SPD_1672蛋白属于膜结合蛋白，其整个保守区域(aa28-386)与脂质A核心-O-抗原连接酶有较高的同源性，并且其中的一段(aa260-322)与脂质A核心-O-抗原连接酶中Wzy-C(O-抗原聚合酶)高度同源，即SPD-1672蛋白可能是一种具有连接功能的膜结合蛋白。用TMHMM软件对SPD-1672蛋白进行结构预测也提示它可能具有脂质A核心-O-抗原连接酶的结构。如果把肺炎链球菌的SPD_1672基因缺陷后，荚膜形成可能受阻，细菌的毒力也可能减弱。构建SPD_1672基因缺陷菌发现细菌菌体减小，不成链，电镜下观察荚膜很薄很稀疏，又通过小鼠体内毒力实验发现注射野生菌14个小时后小鼠全部死亡，而注射缺陷菌的小鼠全部存活，且缺陷菌在腹腔内3个小时内基本被清除，尚存的细菌荚膜不能完全回复，提示SPD_1672基因所表达蛋白是一种影响荚膜形成的毒力因子。 

本发明所述肺炎链球菌减毒活菌疫苗为含有肺炎链球菌SPD_1672基因功能缺陷的D39△1672肺炎链球菌菌株的组合物。 

所述肺炎链球菌菌株为包括全基因缺失、基因小片段缺失、基因断裂、插入突变、点突变等导致SPD_1672蛋白功能缺陷而形成的减毒肺炎链球菌菌株。 

该组合物中还具有一种或一种以上医学上可接受的佐剂，佐剂包括CT佐剂、CTB佐剂、LT佐剂、MPL、铝佐剂、CPG、福氏完全和不完全佐剂、脱乙酞壳多糖颗粒等。 

该肺炎链球菌减毒活菌疫苗可由本技术领域常规的方法制备而得： 

1、用引物修饰法PCR扩增出spd1672up-erm-spd1672down片段，胶回收后备用。 

2、将胶回收片段转化入肺炎链球菌D39中，得到缺陷菌。 

3、提取缺陷菌DNA，用引物修饰法PCR扩增出spd1672up-erm-spd1672down片段，胶回收后测序鉴定。 

该肺炎链球菌减毒活菌疫苗具有以下优点：一、制做工艺简单，只要缺陷菌构建好即可大量培养，成本低，周期短，能在全世界推广使用；二、对所有年龄组的人群都有保护效果；三、既有细胞免疫又有体液免疫，并能诱发免疫记忆；四、可以产生非血清型依赖的保护作用；五、粘膜途径免疫既简便又安全。 

本发明采用基因工程的构建肺炎链球菌D39假想蛋白SPD_1672的缺陷株(D39Δ1672)，此缺陷株是基本无毒性的，用其作为免疫抗原对Balb/c小鼠进行免疫，并采用主动免疫和抗体被动免疫保护实验来评估此疫苗的保护性。实验已经证实该疫苗可以抵抗多种血清型的肺炎链球菌感染。 

附图说明

图1表示了spd1672up-erm-spd1672down连接PCR的结果：泳道1为Marker，泳道2为上游片段为388bp，泳道3为下游片段长为305bp，泳道4为红霉素片段长为780bp，泳道5为连接片段长为1473bp。 

图2表示了缺陷株毒力实验结果：野生菌D39的半数致死时间为12小时，缺陷菌D39Δ1672的半数致死时间大于14天。 

图3表示了缺陷菌和野生菌及R6电镜的比较：野生型D39的荚膜厚而致密，缺陷菌D39Δ1672荚膜很薄且稀疏，R6无荚膜。 

图4表示了小鼠血清和唾液抗D39Δ1672抗体效价，ND表示No found，血中SC组IgG抗体比IN组高，唾液中IN组IgA高而SC组抗体滴度为0。 

图5表示了小鼠血清对肺炎链球菌多种血清型抗体效价：SC组及IN组血清对肺炎链球菌多种血清型(D39、693、614、207、TIGR4、R6、203)都有抗体产 生。 

图6表示败血症模型：用D39腹腔注射3LD50攻毒后，小鼠生存率：阴性对照为0，阳性对照为80％，SC组为75％，IN组为100％。 

图7表示肺炎模型：用D39滴鼻1x10⁷cfu攻毒后，小鼠生存率：阴性对照为0，阳性对照为70％，SC组为83.3％，IN组为100％。 

图8表示国内流行菌株6B滴鼻5x10⁸cfu攻毒后，小鼠存活率：阴性对照为0，阳性对照为60％，SC组为83.3％，IN组为100％。 

图9表示国内流行菌株3型滴鼻2x10⁸cfu(203)攻毒后，小鼠存活率：阴性对照为16.7％，SC组为66.7％，IN组为100％；1x10⁸cfu(436)滴鼻功毒后，小鼠存活率：阴性对照为0；SC组为41.7％；IN组为58.3％。 

图10表示小鼠抗体被动免疫保护实验，用D39腹腔注射3LD50攻毒后，小鼠生存率：阴性对照为0，SC组和IN组都为100％。 

具体实施方式

一、缺陷菌D39Δ1672的构建 

(一)材料： 

细菌DNA提取试剂盒购于上海华舜生物工程有限公司，PCR用rTaq酶、dNTPs、Buffer、MgCl₂购自大连宝生物技术公司，胶回收试剂盒购于上海华舜生物工程有限公司，感受态刺激肽(CSP₁)购于吉尔生化(上海)有限公司合成，PCR仪为美国Bio-Rad公司Gene cycleTM。 

(二)引物的设计合成； 

以肺炎链球菌D39基因组DNA为模板，参照其全序列(编号NC008533)，使用primer premier5.0设计引物。引物由TAKARA公司合成。 

Up   P1：正5-TCCAAGGTTTCTGGGTCT-3 

     P2：反5-ATCAAACAAATTTTGGGCCCGG-CATTGTTCCGTCCGTATT-3 

Down P3：正5-AATTCTATGAGTCGCTGCCGACT-TTGCCTGCTAATAGACCC-3 

     P4：反5-AAGATGAGCCCGATGAAG-3 

Erm  P5  正5-CCGGGCCCAAAATTTGTTTGAT-3 

     P6  反5-AGTCGGCAGCGACTCATAGAAT-3 

(三)PCR扩增目的基因： 

Up片断的扩增： 

体系：ddH₂O         17.8μl 

      10×buffer    3.0μl 

      Mg²⁺          1.0μl 

      dNTP          3.0μl 

      P1            1.5μl 

      P2            1.5μl 

      DNA模板       2.0μl 

      rTaq酶        0.2μl 

条件：95℃ 5min，1次；94℃ 1min、55℃ 45s、72℃ 45s、30cycle；72℃5min，1次。 

Down基因片断的扩增： 

体系：ddH₂O         17.8μl 

      10×buffer    3.0μl 

      Mg²⁺          1.0μl 

      dNTP          3.0μl 

      P3            1.5μl 

      P4            1.5μl 

      DNA模板       2.0μl 

      rTaq酶        0.2μl 

条件：95℃ 5min，1次；94℃ 1min、55℃ 45s、72℃ 45s、30cycle；72℃5min，1次。 

Erm基因片断的扩增： 

体系：ddH₂O         14.7μl 

      10×buffer    2.5μl 

      Mg²⁺          2.0μl 

      dNTP          2.0μl 

      P5            1.0μl 

      P6            1.0μl 

      DNA模板       1.5μl 

      rTaq酶        0.3μl 

条件：95℃ 5min，1次；94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 50s、30cycle；72℃ 5min，1次。 

spd1672up-erm-spd1672down连接片断PCR扩增：其中primer∶DNA＝1∶40；up∶erm∶down＝1∶1∶1(摩尔比) 

体系：ddH₂O         15.3μl 

      10×buffer    3.0μl 

      Mg²⁺          2.0μl 

      dNTP          3.0μl 

      P1            2.0μl 

      P4            2.0μl 

      Up            0.7μl 

      Down          0.5μl 

      Erm           1.0μl 

      rTaq酶        0.5μl 

条件：95℃ 5min，1次；94℃ 1min、58℃ 1min30s、72℃ 1min30s、33cycle；72℃ 5min，1次。 

(四)缺陷菌的构建： 

将肺炎链球菌D39培养于C+Y至A₅₅₀＝0.1左右，加入感受态刺激因子CSP₁(100ng/ml)10ul，同时加入胶回收产物10ul(100ng/ul)，于37℃水浴箱孵育90min，然后铺于含红霉素0.25mg/L的TSA血平板上，于37℃孵箱培养24～ 48h，挑取单个菌落于C+Y培养基中培养，当细菌密度达到A₆₂₀＝0.2左右时，冻于-80℃冰箱保存，即得到缺陷菌。 

(五)spd1672up-erm-spd1672down的鉴定： 

将缺陷菌培养于C+Y至A₆₂₀＝0.4左右，按DNA提取试剂盒提取其DNA，以P1、P4为引物PCR扩增spd1672up-erm-spd1672down片断(见附图1)，胶回收后送往TAKARA测序，测序结果证实目的基因正确转化入细菌，无碱基突变。 

二、缺陷菌毒力检测： 

(一)小鼠毒力实验： 

将雌性Balb/c小鼠随机分成两组，一组12只，一组13只。将肺炎链球菌D39野生菌株与spd-1672缺陷菌株用PBS稀释至5×10⁸CFU/ml，腹腔注射小鼠，每只100ul，观察小鼠存活状态，记录小鼠死亡时间，并采用Mann-Whitney U进行结果分析。实验结果：野生菌的半数致死时间为12小时，而缺陷菌株的则大于14天(见附图2)，表明spd-1672缺陷菌株的毒力显著下降。 

(二)电镜下观察荚膜的形成： 

电镜前准备：C+Y中培养缺陷菌、D39、R6至A₆₂₀＝0.4左右，5000g，10min离心集菌，弃上清后立即沿壁加入戊二醛固定液1ml。电镜下可以看到(见附图3)：与D39比荚膜明显变薄变稀疏，而与无荚膜的R6相比，菌体周围不平整，毛刺状。 

三、D39Δ1672主动免疫保护实验 

(一)材料： 

23价多糖疫苗购于成都生物制品研究所，7价结合疫苗购于惠氏公司，CT佐剂购于SIGMA公司，铝佐剂购于Thermo公司，HRP标记羊抗人IgG购于北京中杉，HRP标记羊抗人IgA购于Santa Cruz公司。 

(二)将Balb/c小鼠随机分为四大组，第一组阳性对照PC(positivecontrol)为23价多糖疫苗和7价结合疫苗共3小组，每组10只；第二大组阴性对照NC(negative control)为CT佐剂+PBS共5小组，每组12只；第三大 组皮下免疫SC(subcutaneous)组为D39Δ1672+铝佐剂共5小组，每组12只；第四大组鼻内免疫组IN(intranasal)组为D39Δ1672+CT佐剂共5小组，每组12只。 

(三)首次免疫时，PC组2组腹腔注射0.1ml23价多糖疫苗，1组腹腔注射0.1ml7价结合疫苗(此组单独用于肺炎链球菌6B型的攻毒)；NC组5组都滴鼻30ulCT(1ug)+PBS；SC组5组都皮下注射100ul 10⁸cfu D39Δ1672+100ul铝佐剂；IN组5组都滴鼻30ul0⁸cfu D39Δ1672+CT(1ug)。 

(四)首次免疫两周后进行第二次免疫，PC组只进行一次免疫，无需再免疫，NC、SC、IN组的免疫方法如步骤一。 

(五)首次免疫四周后进行第三次加强免疫，此次免疫无需佐剂，免疫途径如前：NC组30ulPBS；SC组200ul 10⁸cfu D39Δ1672；IN组30ul 10⁸cfu D39Δ1672。 

(六)首次免疫五周后采集小鼠尾静脉血和唾液，其中唾液是用卡米可林30ul腹腔注射促进其分泌的。分离血清，把唾液蛋白水平用PBS调到同水平，适当稀释后ELISA检测其抗体效价，具体步骤如下： 

1、包被：D39Δ1672菌株于C+Y中培养至A₆₂₀＝0.4左右，12000g，1min离心，PBS洗三次，抗原包被液重悬后稀释至A₆₂₀＝0.1，每孔包被100ul，4℃过夜，洗三次。 

2、封闭：封闭液为2％BSA溶于PBST(0.1％Tween-20)，300ul封闭2h，洗三次。 

3、抗体：血清按1∶100、1∶200、1∶400、……倍比稀释；唾液按1∶25、1∶50、1∶100、……倍比稀释。每孔100ul，37℃1h，洗六次。 

4、二抗：二抗按1∶5000稀释，每孔100ul，37℃45min，洗6次。 

5、显色终止：加入显色液(H2O2/OPD)，每孔100ul，37℃孵育15分钟。每孔加入50ul终止液终止显色，在450nm波长处测吸光度值(A450)。 

抗体滴度定义为：实验组和阴性对照组光吸收比值大于或等于2.1时最大的血清稀释倍数。 

(七)小鼠末次免疫两周后进行攻毒实验，我们选择的攻毒菌有标准菌株D39，还有国内流行的菌株6B(207)，3型(203、436)。用D39攻毒有两种模型，败血症模型选用3LD50的D39腹腔攻击，肺炎模型选用1×10⁷CFU的D39滴鼻攻毒；6B用5x10⁸cfu滴鼻攻毒；3型(203)选用2x10⁸cfu滴鼻攻毒；3型(436)选用1×10⁸CFU滴鼻攻毒。连续21天内观察小鼠的生存状态，计算小鼠的生存率。 

(八)各组小鼠的生存率用Mantel-cox Test统计学方法进行分析。 

结果：附图4中可见，SC组血中IgG抗体效价虽然比IN组高，但唾液中并不存在sIgA，既并不诱导粘膜免疫反应，而IN组即可诱导粘膜免疫又可诱导系统免疫；SC组、IN组与NC组(效价为0，图未给出)比效价明显高(p＜0.0001)。附图5说明本疫苗产生的抗体对肺炎链球菌多种血清型都有免疫作用。附图6、7说明接受我们减毒活菌D39Δ1672免疫的SC组和IN组小鼠的生存率显著高于阴性对照组NC组(p＜0.0001)，其中IN组的生存率可以达到100％，SC组也有75％以上，几乎同已上市的23价疫苗保护效果相似，无统计学差别。附图8说明本疫苗对国内流行菌株6B的保护效果，SC组和IN组小鼠的生存率显著高于阴性对照组NC组(p＜0.0001)，鉴于7价疫苗覆盖率中西方可能不同，我们选用7价结合疫苗作为阳性对照(PC)，IN组与PC组比生存率明显高((p＜0.05)，即本疫苗粘膜免疫途径对6B型肺炎链球菌的保护效果比已上市的7价疫苗效果更好，而SC组同PC组效果也相当，无统计学差异。附图9是血清型3型的攻毒结果，目前国内流行的3型包括两种203和436，两种的毒力差别很大，前者2x10⁸cfu滴鼻攻毒，IN组的生存率可达100％，SC组也有91.7％，显著高于阴性对照组NC组(p＜0.0001)；后者毒性很强，选用致死剂量1x10⁸cfu滴鼻攻毒时，虽然IN组的生存率只有58.3％，SC组只有41.7％，但与阴性对照组比生存率仍然明显高于NC组(p＜0.001)。 

以上的实验均表明：本发明的疫苗对多种不同血清型肺炎链球菌均有保护作用，而且保护效果较好。特别是D39Δ1672通过粘膜途径进行免疫时，保护效果更好，生存率可达100％(除强毒株436攻毒外)。 

四、D39Δ1672多克隆抗体的制备及其抗体的被动免疫保护性实验研究 

为了进一步证实该减毒活菌疫苗主动保护性实验的结果，我们制备了D39Δ1672的多克隆抗血清，并用这些抗血清免疫Balb/c小鼠后进行攻毒，研究其保护作用。 

(一)D39Δ1672多克隆抗体的制备 

D39Δ1672+佐剂免疫Balb/c小鼠，免疫程序按实施例3，首次免疫6周后，小鼠心脏取血，分离血清，-20℃保存备用。 

(二)免疫攻毒保护性研究 

免疫的Balb/c小鼠随机分成3组NC组、SC组、IN组，每组10只，SC和IN组小鼠分别注射100ul皮下免疫和鼻内免疫制备的多克隆抗体血清，NC组注射非免疫的正常小鼠血清，然后用D39腹腔注射3LD50cfu，连续检测小鼠的生存状态至第21天，计算小鼠的生存率。 

(三)各组小鼠的生存率用Mantel-cox Test统计学方法进行分析 

结果(附图10)：注射SC组和IN组抗血清小鼠的存活率都为100％，而NC组的存活率为0，SC组和IN组小鼠的生存率显著高于阴性对照组NC组(p＜0.0001)。 

从以上的实验结果得出：本发明成功制备了减毒活菌疫苗及其多克隆抗体，并通过主动免疫保护实验和被动免疫保护实验来证明本疫苗的保护效果。所以本发明成功地开发了肺炎链球菌减毒活菌疫苗D39Δ1672，该疫苗安全性强、保护效果好、易大规模生产、具备推广使用的潜力。 

Claims (2)

1.肺炎链球菌减毒活菌疫苗，其特征在于：为含有肺炎链球菌SPD_1672基因功能缺陷的D39△1672肺炎链球菌菌株的组合物。

2.根据权利要求1所述肺炎链球菌减毒活菌疫苗，其特征在于：所述组合物具有一种或一种以上医学上可接受的佐剂。

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