EP2828376A1 - Procede d'attenuation d'une bacterie du complexe mycobacterium tuberculosis pour la fabrication d'un vaccin contre la tuberculose - Google Patents

Procede d'attenuation d'une bacterie du complexe mycobacterium tuberculosis pour la fabrication d'un vaccin contre la tuberculose

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EP2828376A1
EP2828376A1 EP13729975.6A EP13729975A EP2828376A1 EP 2828376 A1 EP2828376 A1 EP 2828376A1 EP 13729975 A EP13729975 A EP 13729975A EP 2828376 A1 EP2828376 A1 EP 2828376A1
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EP
European Patent Office
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strain
tuberculosis
mycobacterium
mspa
vaccine
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP13729975.6A
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German (de)
English (en)
Inventor
Michel Drancourt
Otmane LAMRABET
Didier Raoult
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Fondation Mediterranee Infection
Original Assignee
Fondation Mediterranee Infection
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Publication date
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    • A61K2039/522Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
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    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/32Mycobacterium

Definitions

  • Tuberculosis is an infectious disease of humans and animals caused by one of the species of the Mycobacterium tuberculosis complex, namely Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis (and the BCG strains derived from it), Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii, Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti, and Mycobacterium pinnipedii [19] and Mycobacterium mungii (20). Tuberculosis causes about 9 million new cases worldwide each year and kills about 3 million people each year.
  • Tuberculosis is a contagious disease from a person with pulmonary tuberculosis bacillifera, that is to say a person expectorant mycobacteria Mycobacterium tuberculosis complex living in its sputum.
  • BCG Bacille Calmette and Guérin
  • such attenuated strains of Mycobacterium responsible for infection in humans or animals are suitable for use in the manufacture of vaccines, especially by administering said attenuated bacteria in said vaccine.
  • the mycobacterial strains used as vaccines have a survival time in eukaryotic cell culture and in particular in vivo, of not more than 30 days.
  • the decrease in growth is accompanied by a decrease in the life of said bacterium in said cells and in particular in vivo MspA porine was found in the membrane extracts of M. smegmatis as an oligomeric protein composed of 20 kDa subunits [5]. It has been considered the major and most abundant porine in M. smegmatis [5, 6]. Suppression of the mspA gene coding for MspA reduces the permeability of the outer membrane of M.
  • MspA porine increases the growth of a M.
  • the object of the present invention was to provide new M. tuberculosis complex strains with decreased growth rates while maintaining their immunogenicity.
  • the inventors have surprisingly found that it is possible to attenuate a bacterium.
  • Mycobacterium tuberculosis complex by adding and expressing a gene using molecular engineering methods.
  • the present invention provides a method for decreasing the growth of a mycobacterium strain of Mycobacterium tuberculosis complex in eukaryotic cells by adding and expressing in said mycobacterium a mspA gene coding for a porin A of Mycobacterium smegmatis. for use as a vaccine.
  • a mycobacterium strain of Mycobacterium tuberculosis complex in eukaryotic cells by adding and expressing in said mycobacterium a mspA gene coding for a porin A of Mycobacterium smegmatis. for use as a vaccine.
  • a mspA gene coding for a porin A of Mycobacterium smegmatis. for use as a vaccine.
  • tuberculosis and therefore unsuitable for use as a vaccine, and reported reduced viability of a so-called transformed MspA-expressing strain in murine macrophages because said murine macrophages were infected with a leukemia virus murine (MuLV), namely RAW 264.7 cells [28].
  • MuLV leukemia virus murine
  • Mycobacterium tuberculosis infecting said cells [29]. Therefore, the authors do not mention the interest of a possible use of such a mutant Mycobacterium tuberculosis to confer increased immunity in its host to constitute a vaccine against tuberculosis.
  • the present invention provides the use of a Mycobacterium tuberculosis mycobacterium strain, wherein an mspA gene capable of expressing a porin A of Mycobacterium smegmatis has been inserted, for the manufacture of a vaccine for preventing infection by a bacterium of the Mycobacterium tuberculosis complex in a host comprising eukaryotic cells, preferably macrophages, said strain of mycobacteria thus transformed having decreased growth in said eukaryotic cells.
  • the present invention relates to the use of a Mycobacterium tuberculosis transformed strain according to the invention for the manufacture of a vaccine for the prevention of tuberculosis in mammals or birds, said cells being macrophages.
  • the subject of the present invention is a use of a transformed strain according to the invention which is useful for the manufacture of a vaccine for the prevention of human tuberculosis.
  • a strain thus transformed of mycobacterium of the Mycobacterium tuberculosis complex allowing the expression of MspA porine in a said mycobacterium of the M. tuberculosis complex has a greater growth than the wild-type strain.
  • Mycobacterium tuberculosis in culture medium without cells eukaryotes (axenic medium) - in this the inventors have confirmed the results previously published in the literature [12, 14]; b- but, surprisingly, the growth of this transformed strain, in co-culture of eukaryotic cells, makes it possible to reduce the growth of the mutant Mycobacterium tuberculosis compared to that of the original wild-type strain and this by using three mediums of different eukaryotic cell cultures, including in particular mouse macrophages and human macrophages.
  • these macrophages are particularly concerned in tuberculosis and immunogenicity reactions and therefore protection in use as a vaccine.
  • macrophages are the cells of humans and animals that phagocytize Mycobacterium tuberculosis mycobacteria in an attempt to destroy them and to present mycobacterial antigens to other cells of the immune system [25].
  • said mspA gene placed under the control of a promoter allowing the expression of said mspA gene in said mycobacterium of the Mycobacterium tuberculosis complex is inserted into said strain. More particularly, a plasmid containing said mspA gene is introduced under the control of a promoter of the expression of said mspA gene in a said bacterium of the Mycobacterium tuberculosis complex.
  • said mspA gene and said control elements for the expression of said mspA gene in a said bacterium of the Mycobacterium tuberculosis complex are inserted into the chromosome of said bacterium of the Mycobacterium tuberculosis complex.
  • bacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex is intended here to mean one of the bacteria of the species chosen from at least Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis and its clones or subspecies BCG, Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii, Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti, Mycobacterium pinnipedii, and Mycobacterium mongii. These species are all neighbors with more than 99% similarity of their genome for the species currently sequenced; they all induce the same clinical disease and cause the same tissue lesions in the infected organs, characterized by the formation of granulomas with macrophagic giant cells [26].
  • said strain of the Mycobacterium tuberculosis complex is a strain of the Mycobacterium tuberculosis species.
  • said strain of Mycobacterium tuberculosis of origin is the H37Rv strain.
  • said mspA gene comprises the sequence SEQ ID No. 1 of the sequence listing appended to the present description.
  • said mspA gene is under the control of expression elements called "hsp60 promoter" consisting of SEQ. ID. No. 4 of the sequence listing appended to this description.
  • said eukaryotic cells are mammalian or bird cells, preferably said cells are human cells. More particularly, said cells are macrophage cells.
  • the present invention also provides a vaccine comprising a transformed strain of a bacterium of the Mycobacterium tuberculosis complex into which a said mspA gene capable of expressing porin A of Mycobacterium smegmatis has been inserted into a so-called mycobacterium making it possible to implement a method according to the invention.
  • H37RvpVVMspA the strain, hereinafter referred to as H37RvpVVMspA, filed on April 26, 2012 at the National Collection of Type Cultures (NCTC) collection, Health Protection Agency Culture Collections, Porton Down, Salisbury Wiltshire, SP4 OJG UK under number 12042601. This deposit was made in accordance with the Budapest Treaty.
  • a transformed strain according to the invention more particularly exhibits a decrease in the growth of said bacterium in eukaryotic cells by at least 90%, or even at least 99% in terms of the number of bacteria per ml of cell culture.
  • the number of bacteria per ml of cell culture is divided by at least 10, or even divided by at least 100.
  • a strain of mycobacterium transformed according to the invention has a survival time in culture of eukaryotic cells and in particular in vivo, not more than 60 days, preferably not more than 50 days.
  • the decrease in growth is accompanied by a decrease in the life of said bacterium in said cells and in particular in vivo of at least 3 to 10 days.
  • FIG. 1 represents an SDS-PAGE gel photograph showing the level of expression of MspA porine.
  • Lane M shows the molecular weight markers.
  • Lane 1 represents the separation of a protein extract from M. smegmatis
  • Lane 2 a protein extract from M. tuberculosis H37Rv / pVV16
  • Lane 3 represents the separation of a protein extract from M. tuberculosis H37Rv / pVVMspA, the MspA protein being apparent at 20 KDa.
  • FIG. 2 represents the growth curves of M. tuberculosis growth in the presence of MspA porine on 7H9 axenic media of Example 1, measured in optical density (OD) ordinates at 600 nm, from 0 to 1, for 18 days ("t" on the abscissa).
  • FIGS. 3A to 3C show the intracellular growth graphs of M. tuberculosis H37Rv / pVV16 and M. tuberculosis H37Rv / MspA in various eukaryotic cells: A. polyphaga (FIG. 3A), BMDMs (FIG. 3B) and hMdMs (FIG. 3C) Examples 2 and 3, measured in number of CFU / ml of cell lysate, from 0 to 1,000,000 (on the ordinate) after 0 to 14 days of cultures ("t" on the abscissa).
  • FIG. 4 represents the evolution of the weight of the mice (w) in grams (g) as a function of time (t), in number of days, from 0 to 39, for mice infected with the wild-type strain H37Rv and for mice infected with modified strain H37Rv / pVVMspA at different concentrations (10,000 CFU / 100 ⁇ and 10,000 CFU / 100 ⁇ ).
  • FIG. 5 represents the bacterial load (number of CFUs) in the liver (A), the spleen (B) and the lung (C), after a inoculation with the wild-type strain of M. tuberculosis H37Rv ( ⁇ ) and the strain of M. tuberculosis according to the present invention ( ⁇ ), as discussed in Example 4.
  • Example 1 Growth of Mycobacterium tuberculosis expressing MspA in axenic medium.
  • the inventors amplified the gene encoding MspA porine from the genome of Mycobacterium smegmatis, and then introduced the amplification product into the expression vector pVV16 [16] which is characterized by the presence of two genes coding for hygromycin and kanamycin resistance proteins (selection markers) to obtain plasmid pVVMspA.
  • the inventors incorporated plasmid pVVMspA by electroporation into Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv and the selection of transformed clones was performed using hygromycin and kanamycin as antibiotics.
  • the inventors extracted the genomic DNA of the strain M. smegmatis mc 2 155 (ATCC 700084) and amplified by standard PCR the gene encoding porin MSpa [5].
  • sequence gi_118467340 of said gene is the sequence SEQ. ID. n ° following:
  • the primers used are:
  • MSPA-pVV16F 5'-ccccccatatg_aaggcaatcagtc-3 '(SEQ ID NO: 2), and
  • MSPA-pVV16ndeI 5'-cccatatg_tcagttcatgttccaggg-3 '(SEQ ID NO: 3).
  • primers were determined to generate a PCR product corresponding to the entire mspA gene (636 bp) harboring on each side a cleavage site for the restriction enzyme Nde I (this enzymatic cleavage site is underlined in the sequences of primers above) to allow cloning into the pVV16 expression vector; then its expression in a constitutive way.
  • the pVV16 vector has a hygromycin resistance cassette and an expression hsp60 promoter (SEQ ID NO: 4) in mycobacteria [16].
  • the specificity of pVV16 is an expression promoter in Escherichia coli (used in the verification of plasmid construction at the time of cloning) and a kanamycin resistance cassette allowing for double selection [16].
  • the PCR fragment was cloned into the NdeI site of the plasmid pVV16 to give the plasmid pVVMspA.
  • the latter was introduced into Escherichia coli DH5 alpha by the simplest means: thermal shock.
  • the plasmid construction was verified by enzymatic digestion and amplification by PCR and sequencing.
  • the sequence SEQ. ID. # 4 of the hsp60 promoter is 5'-
  • the expression cassette of the mspA gene under the control of the hsp60 promoter consists of the juxtaposition of SEQ. ID. No. 4 and SEQ. ID. No. l.
  • Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv (ATCC 27294) [17] electrocompetent mycobacteria (permeable to introduction of a plasmid) were prepared as previously described by Van Kessel and Hatfull [18]. Briefly, Mycobacterium tuberculosis mycobacteria were harvested from a liquid culture of M. tuberculosis H37Rv of optical density (OD 60 o) between 0.8-1.0, washed three times in 10% glycerol and resuspended. in the same buffer.
  • OD 60 o optical density
  • the plasmids pVV16 control to ensure that the growth changes are not due to the expression vector itself but to the presence of mspA gene
  • pVVMspA plasmid containing the MspA d porine gene. interest
  • electroporator reference Multiporator / Electroporator 2510, Le Pecq, France
  • Electroporated mycobacteria were recovered in 1 ml of Middelbrook 7H9 enriched liquid medium (Sigma-Aldrich, Lyon, Way), cultured at 37 ° C.
  • MspA porine is characterized by its stability to heat denaturation [5].
  • an SDS-PAGE electrophoresis gel was made from the protein extracts of M. tuberculosis H37Rv / pVV16 (lane 2), M. tuberculosis H37Rv / pVVMspA (lane 3) and M. smegmatis (control positive) (track 1). These extracts were prepared by selective extraction by high temperature [27].
  • Figure 1 shows the expression of the mspA gene in M. tuberculosis H37Rv and in the M. smegmatis control strain. Detected protein spots were excised from the gel and analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry. Protein stains were identified with a sequence coverage ranging from 21% to 29% and a similarity to the MspA protein sequence of M. smegmatis at 20 KDa.
  • M. tuberculosis H37Rv / pVV16 Transformed Control Strains Not Expressing MspA Porine
  • M. tuberculosis H37Rv / pVVMspA Transformed Strains Expressing Porina MspA
  • M. tuberculosis H37Rv / pVVMspA Transformed Strains Expressing Porina MspA
  • 5mL of Middlebrook 7H9 medium Becton Dickinson, Claix's Bridge, Way
  • the mycobacteria were strongly mixed with stirring vortexed to remove cell clumps, harvested and diluted in 10 ml of fresh 7H9 medium.
  • Growth rates were determined for both strains in three independent cultures by OD 60 measurements in a BACTEC MGIT 960 system (Becton Dickinson, Claix Bridge, Way). This Fully automated system is based on the detection of oxygen consumption from aerobic bacteria.
  • MspA protein carried out in vitro growth experiments with M. tuberculosis / pVV 16 and M. tuberculosis / pVVMsp A strains in a 7H9 axenic liquid medium in three independent cultures.
  • the inventors used a cell suspension and the growth of the bacteria was measured in the BACTEC MGIT 960 system for 17 days.
  • the generation time of the M. tuberculosis / pVV 16 control strain and the M. tuberculosis / pVVMsp A strain were respectively 19h 10min ⁇ 10min and 17h 16min ⁇ 12min ( Figure 2).
  • the inventors have thus found that the strain which expresses MspA porine grows significantly faster than the control strain (p ⁇ 0.05). This experiment, performed three times, showed that MspA porine expression increases the growth rate of M. tuberculosis.
  • Figure 3A shows the intracellular growth graphs of M. tuberculosis H37Rv / pVV16 and M. tuberculosis H37Rv / MspA in eukaryotic cell culture: A. polyphaga.
  • Example 3 Growth of Mycobacterium tuberculosis expressing MspA in co-culture with human macrophages (hMdMs) or mouse macrophages (BMDMs):
  • BMDMs [24] and hMdMs isolated from leukopacks (French Blood Establishment, Marseille, Way) by a differentiated Ficoll gradient (MSL, Eurobio, Courtaboeuf, Manière) were seeded separately (10 5 cells / well) in 24-well culture plates in RPMI 1640 medium containing 10% FCS.
  • BMDMs and hMdMs were separately infected with M. tuberculosis, M. tuberculosis H37Rv / pVV16, and M.
  • tuberculosis H37Rv / pVVMspA for 24 hours, then the macrophages were washed to remove free mycobacteria before being incubated for different periods of time in RPMI 1640 medium containing 10% calf serum (FCS).
  • FCS calf serum
  • each cell type as well as mycobacteria were cultured separately. Determination of the number of intracellular mycobacteria
  • the infected cells were lysed with 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) for 30 min and then passed through a 26 gauge needle to ensure complete lysis.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the lysate (500 ⁇ ) was washed three times with PBS, plated on solid 7H10 medium (Becton Dickinson, Claix's Bridge, Way) and incubated for 15 days at 37 ° C to determine the number of colonies of intracellular mycobacteria ( UFC). All experiments were conducted in triplicate.
  • BMDM macrophages as eukaryotic cells, the inventors observed that both M. tuberculosis strains H37Rv / pVV16 and M. tuberculosis H37Rv / pVVMspA survived throughout the time of the experiment (14 days). The inventors observed that between the 4 th and the 14 th day, the H37Rv / pVV16 control strain was significantly higher than the strain that expresses MspA (p ⁇ 0.05) (FIG. 3B). To I4 th day, the number of colonies was 1 ⁇ 10 6 ⁇ 7 ⁇ 10 5 M. tuberculosis H37Rv / pVV16 against 4 ⁇ 10 5 ⁇ 1 May 10 in M. tuberculosis H37Rv / pVVMspA (p ⁇ 0.05) .
  • Figures 3B and 3C show the intracellular growth graphs of M. tuberculosis H37Rv / pVV16 and M. tuberculosis H37Rv / MspA in different macrophage cultures: BMDMs (fig.3B) and hMdMs (fig.3C).
  • Example 4 Growth of Mycobacterium tuberculosis expressing MspA in animal model and protection against tuberculosis
  • mice 6 to 8 weeks old (10 per group) were infected intraperitoneally with 100 ⁇ l of bacterial culture.
  • Two different inoculums of each of the above strains wild strain H37Rv ATCC 27294 and mutated strain M. tuberculosis H37Rv / pVVMspA were used: 1 X 10 7 CFU / mL and 1 X 10 5 CFU / mL.
  • As a control one group of mice was infected with 100 ⁇ l of sterile PBS. The weight, performance and survival of the mice were monitored for 1 month.
  • mice The examination of the infected mice was carried out according to a protocol published by other researchers [3]. Also, at first some surviving mice were sacrificed, the spleen, liver and lungs were analyzed for pathological anatomy and the load Bacterial was determined per gram of tissue, per culture and expressed in CFU. In a second step, the surviving mice of both groups were re-inoculated with 10 7 CFU / mL M. tuberculosis h37Rv and the same observation protocol was followed.
  • mice infected with the strain modified according to the invention have less behavioral problems and grow faster than mice infected with the wild strain of M. tuberculosis ( Figures 4 and 5).
  • mice inoculated with the mutated strain M. tuberculosis H37Rv / pVVMspA survived, while those inoculated with the wild-type strain showed 50% mortality. This survival was correlated with a very low number of colony forming units (CFU) of M. tuberculosis H37Rv / pVVMspA in the lungs. Mice inoculated with the mutated strain M. tuberculosis H37Rv / pVVMspA developed few tissue lesions with small granulomas. A mouse inoculated with the wild-type M.
  • CFU colony forming units
  • tuberculosis H37Rv strain presented an abdominal fistula. Macroscopic analysis showed that the spleen weights of mice inoculated with the wild-type M. tuberculosis H37Rv strain was significantly greater than that of mice inoculated with the mutated strain. Also, the number of granulomas was respectively in the liver 24 ⁇ 21 vs 0; and in the spleen 61 ⁇ 27 vs 8 ⁇ 7, these differences being significant (p ⁇ 0.05). In the spleen, enumeration of mycobacteria showed a significant decrease in the number of CFU for the mutated strain M. tuberculosis H37Rv / pVVMspA compared to the wild-type strain M. tuberculosis H37Rv. The immunogenicity tested in the cell assays was retained.
  • mice 90 days after the first inoculation, the inventors inoculated again the two groups of mice with the wild strain of Mycobacterium tuberculosis H37RV using an inoculum 10 7 CFU per ml. The mice were again followed for 90 days, all mice survived with the exception of one in four mice inoculated with the wild strain during the first inoculation.
  • mice were euthanized 90 days after the second inoculation, the histopathological analysis of the tissues showed a significantly larger number of pulmonary granuloma nodules in the group initially inoculated with wild-type tuberculosis (33 ⁇ 37 nodules than in the initially inoculated mice). with the vaccine strain according to the present invention (21 ⁇ 25 nodules) (p ⁇ 0.05).
  • the inventors thus obtained three types of evidence, a clinical evidence (mortality); histological evidence (number of granulomas per organ); and a microbiological evidence (bacterial load after inoculation) to conclude that mutated strain M. tuberculosis H37RV / PVVMSPA confers protection in this animal model against wild-type tuberculosis.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'une souche d'une mycobactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis, dans laquelle un gène mspA capable d'exprimer une porine A de Mycobacterium smegmatis a été inséré, pour la fabrication d'un vaccin pour la prévention d'une infection par une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis chez un hôte comprenant des cellules eucaryotes, de préférence des macrophages, ladite souche de mycobactéries ainsi transformée présentant une croissance diminuée dans lesdites cellules eucaryotes

Description

Procédé d'atténuation d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis pour la fabrication d'un vaccin contre la tuberculose
La tuberculose est une maladie infectieuse de l'homme et des animaux due à l'une des espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis, à savoir notamment Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis (et les souches BCG qui en sont dérivées), Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii, Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti, et Mycobacterium pinnipedii [19] et Mycobacterium mungii (20). La tuberculose cause environ 9 millions de nouveaux cas dans le monde tous les ans et tue environ 3 millions de personnes tous les ans. L'épidémie d'infection par le HIV a coïncidé avec une réémergence de la tuberculose dans les pays développés et s'est accompagnée de l'émergence inquiétante de souches de Mycobacterium tuberculosis résistant aux antibiotiques antituberculeux de première ligne. La tuberculose est une maladie contagieuse à partir d'une personne présentant une tuberculose pulmonaire bacillifére, c'est-à-dire une personne expectorant des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis vivantes dans son expectoration.
Longtemps, la prévention contre la tuberculose pulmonaire a reposé sur la vaccination par le bacille de Calmette et Guérin (BCG) qui est une souche atténuée de Mycobacterium bovis mycobactérie extrêmement proche de Mycobacterium tuberculosis et également responsable de tuberculose humaine et de tuberculose animale, essentiellement tuberculose bovine. Cependant, l'efficacité du vaccin BCG est extrêmement variable selon les circonstances cliniques et les pays dans lesquelles cette efficacité a été mesurée. En effet, cette efficacité est variable entre 0% de protection jusqu'à 60% de protection. Cette médiocre protection par le vaccin BCG contre la tuberculose pulmonaire a conduit les autorités de santé dans plusieurs pays à abandonner cette vaccination. C'est le cas en Manière depuis Juillet 2007 puisque la vaccination par le BCG n'est plus obligatoire en Manière en dehors de certains groupes plus particuliers de population comme les personnels de soins.
Plusieurs travaux expérimentaux ont tenté d'augmenter le caractère protecteur du vaccin BCG par différentes méthodes de manipulation génétique du génome de Mycobacterium tuberculosis mais jusqu'à présent aucune de ces constructions n'a permis de développer un vaccin alternatif au BCG pour la protection contre la tuberculose en particulier contre la tuberculose pulmonaire. Une première stratégie a consisté à développer des variants du BCG produisant et sécrétant des cytokines [1]. Une seconde stratégie était la construction de BCG recombinant exprimant une protéine antigénique de 30 kilo-daltons de Mycobacterium tuberculosis; cette construction a montré un effet protecteur dans les modèles animaux. Enfin plusieurs travaux ont manipulé le génome de la souche BCG pour qu'elle sécrète la listeriolysine de la bactérie Listeria monocytogenes enfin de stimuler les lymphocytes CD 8 et CD 4 qui sont impliqués dans la protection contre la tuberculose [2]. Une dernière stratégie a consisté à fabriquer des souches atténuées de Mycobacterium tuberculosis par inactivation de gènes de virulence tel que le gène phoP et le gène mce [3, 4]. Ces constructions ont montré une protection plus importante contre l'infection par Mycobacterium tuberculosis que le BCG dans des modèles animaux [3, 4].
De façon connue, de telles souches atténuées de Mycobacterium responsables d'infection chez l'homme ou l'animal sont aptes à être utilisées pour la fabrication de vaccins, notamment par administration de dites bactéries atténuées dans ledit vaccin.
De façon connue, les souches de mycobactéries utilisées à titre de vaccins, notamment la souche H37Rv présentent une durée de survie en culture de cellules eucaryotes et notamment in vivo, de pas plus de 30 jours. En pratique, la diminution de la croissance s'accompagne d'une diminution de la durée de vie de ladite bactérie dans lesdites cellules et notamment in vivo La porine MspA a été découverte dans les extraits membranaires de M. smegmatis comme une protéine oligomérique composée de sous- unités de 20 kDa [5]. Elle a été considérée comme la porine majeure et la plus abondante chez M. smegmatis [5, 6]. La suppression du gène mspA codant pour MspA réduit la perméabilité de la membrane externe de M. smegmatis au glucose [7], au phosphate [8], aux ions métalliques et aux acides aminés [9] indiquant que cette porine représente la principale voie de diffusion générale de différents substrats chez M. smegmatis, permettant aussi un afflux de nutriments depuis le milieu extérieur à la mycobactérie [8, 9]. Le gène qui code pour la porine MspA est détecté également chez d'autres mycobactéries à croissance rapide tel que Mycobacterium chelonae [10] et Mycobacterium phlei [11]. Il a été montré que l'expression de la porine MspA chez M. tuberculosis et M.bovis augmentait leur sensibilité aux antibiotiques [12]. De même, la porine MspA de M. smegmatis augmente la croissance d'une souche de M. bovis BCG en milieu axénique [14]. Dans ces travaux antérieurs [12, 14], les auteurs ont déterminé des concentrations minimales d'inhibition d'antibiotiques pour la souche de M. tuberculosis H37Rv contrôle et la souche exprimant MspA par croissance sur milieu axénique Middiebrook 7H10 agar.
Enfin, il a été montré que la délétion du gène mspA chez M. smegmatis augmentait la survie de M. smegmatis dans des macrophages de souris (13).
En conséquence, il ressort de la littérature que :
1-Différentes techniques d'ingénierie biologique ont été utilisées pour créer des mutations ou des délétions afin de construire des souches atténuées de bactéries du complexe M. tuberculosis. Les stratégies de fabriquer des souches atténuées de Mycobacterium tuberculosis par inactivation de gènes de virulence, tels que le gène phoP et le gène mce [3,4], ont montré une protection plus importante contre l'infection par Mycobacterium tuberculosis que le BCG dans des modèles animaux de souris et de cobaye [3, 4]. Cependant, ces techniques d'ingénierie biologique n'ont pas été utilisées valablement pour ajouter des gènes absents du génome de bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis à des fins d'utilisation comme vaccin ou pour la fabrication d'un vaccin
2-Aucun des travaux antérieurs ne suggéraient que l'expression du gène mspA pouvait atténuer la croissance d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans des modèles cellules eucaryotes et des modèles animaux et fortiori pour d'utilisation comme vaccin ou pour la fabrication d'un vaccin.
Le but de la présente invention était de fournir de nouvelles souches de complexe M. tuberculosis présentant des taux de croissance diminués tout en conservant leur immunogénicité.
En effet, l'homme de l'art dans le domaine du vaccin cherche toujours à diversifier les modes de réalisation de vaccins pour améliorer l'efficacité et diminuer les effets secondaires des dits vaccins, ainsi qu'à élargir le spectre des mammifères pouvant bénéficier de la vaccination, en particulier les animaux d'élevage tels que bovins
A l'inverse des stratégies qui consistent à inactiver ou à retirer des gènes pour inactiver la mycobactérie et la rendre utilisable dans une perspective vaccinale, selon la présente invention, les inventeurs ont découvert de façon surprenante qu'il était possible d'atténuer une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis par ajout et expression d'un gène en utilisant les méthodes d'ingénierie moléculaire.
Pour ce faire la présente invention fournit une méthode pour diminuer la croissance d'une souche d'une mycobactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans des cellules eucaryotes, par ajout et expression dans ladite mycobactérie d'un gène mspA codant pour une porine A de Mycobacterium smegmatis en vue d'une utilisation comme vaccin. Dans Georgiana E. Purdy et al., 2009 (Molecular Microbiology. Vol 73. N° 5. 1 september 2009, pages 844-857) les auteurs ont utilisé une souche de Mycobacterium tuberculosis CDC 1551, plus virulente [31] que la plupart des autres souches de M. tuberculosis et donc inappropriée pour une utilisation comme vaccin, et ont rapporté une viabilité réduite d'une dite souche transformée exprimant la porine mspA dans des macrophages murins du fait que lesdits macrophages murins étaient infectés par un virus de la leucémie murine (MuLV), à savoir des cellules RAW 264.7 [28]. Il est, en effet, connu que l'infection de cellules du système immunitaire, telles que des macrophages, par un premier virus (MuLV) entraîne, du fait du phénomène d'interférence virale, la diminution de la viabilité d'un deuxième microbe Mycobacterium tuberculosis infectant lesdites cellules [29]. C'est pourquoi, les auteurs n'évoquent pas l'intérêt d'une utilisation possible d'un tel mutant de Mycobacterium tuberculosis pour conférer une immunité accrue chez son hôte en vue de constituer un vaccin contre la tuberculose.
Dans Mailaender et al. [12], les résultats d'augmentation de la croissance d'une souche transformée exprimant la porine mspA par rapport à une souche sauvage de Mycobacterium tuberculosis dans un milieu de culture, suggéraient à l'homme du métier que la souche ainsi transformée ne permettait pas de diminuer la croissance de ladite souche dans des cellules eucaryotes hôtes. Dans Mailaender et al. 2004 [12], les auteurs ont interprété les données expérimentales qu'ils ont obtenues, uniquement dans le sens d'une plus grande sensibilité de la souche de Mycobacterium tuberculosis à des antibiotiques naturels (peptides dérivés de l'ubiquitine) en vue de fournir de nouvelles molécules à activité contre la tuberculose et non en vue de fournir un nouveau vaccin.
Selon la présente invention, il a été découvert qu'en utilisant des lignées macrophagiques non infectées par un virus, d'une part, mais, surtout, en réalisant des essais sur des cellules de donneurs sains humains volontaires, il était possible de fournir une souche de Mycobacterium tuberculosis atténuée améliorée, pouvant être avantageusement utilisée comme vaccin. Ces résultats ont été confirmés par des données expérimentales in vivo chez l'animal, comme rapporté à l'exemple 4 ci-après. Ces résultats montrant l'innocuité de la souche mutée selon la présente invention, dépassent tous les résultats actuellement publiés dans ce domaine avec le BCG [30] pour constituer la base d'un vaccin amélioré contre la tuberculose.
Plus précisément, la présente invention fournit l'utilisation d'une souche d'une mycobactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis, dans laquelle un gène mspA capable d'exprimer une porine A de Mycobacterium smegmatis a été inséré, pour la fabrication d'un vaccin pour la prévention d'une infection par une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis chez un hôte comprenant des cellules eucaryotes, de préférence des macrophages, ladite souche de mycobactéries ainsi transformée présentant une croissance diminuée dans lesdites cellules eucaryotes.
Plus particulièrement, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une souche transformée Mycobacterium tuberculosis selon l'invention pour la fabrication d'un vaccin pour la prévention de la tuberculose chez les mammifères ou oiseaux, lesdites cellules étant des macrophages.
Plus particulièrement encore, la présente invention a pour objet une utilisation d'une souche transformée selon l'invention utile pour la fabrication d'un vaccin pour la prévention de la tuberculose humaine.
Selon la présente invention, il a été observé que : a- Une souche ainsi transformée de mycobactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis permettant l'expression de la porine MspA chez une dite mycobactérie du complexe M. tuberculosis présente une croissance plus importante que la souche sauvage de Mycobacterium tuberculosis dans un milieu de culture ne comportant pas de cellules eucaryotes (milieu axénique) - en cela, les inventeurs ont confirmé les résultats antérieurement publiés dans la littérature [12, 14]; b- mais, de façon surprenante, la croissance de cette souche transformée, en co-culture de cellules eucaryotes, permet de diminuer la croissance du mutant Mycobacterium tuberculosis par rapport à celle de la souche sauvage d'origine et ceci en utilisant trois milieux de culture cellulaires eucaryotes différents, comprenant notamment des macrophages de souris et macrophages humains. Or, ces macrophages sont particulièrement concernés dans la tuberculose et les réactions d'immunogénicité et donc de protection dans une utilisation comme vaccin. En effet, les macrophages sont les cellules de l'homme et des animaux qui phagocytent les mycobactéries Mycobacterium tuberculosis pour tenter de les détruire et pour présenter les antigènes des mycobactéries aux autres cellules du système immunitaire [25].
Ce résultat de croissance intracellulaire dans des co-cultures de cellules eucaryotes était tout à fait inattendu car opposé à celui obtenu par les inventeurs et publié dans la littérature internationale concernant des cultures en milieux axéniques en l'absence de cellules eucaryotes [12, 14].
En outre , les essais in vivo sur souris , ont permis de démontrer que cette diminution de croissance était conservée in vivo et que les propriétés d'immunogénicité de la souche atténuée étaient conservées également , celle-ci pouvant donc avantageusement être utilisée pour la fabrication d'un vaccin, voire comme vaccin, pour la prévention de la tuberculose humaine et de façon plus générale de la tuberculose chez les mammifères et les oiseaux.
Plus particulièrement, on insère dans ladite souche ledit gène mspA placé sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression dudit gène mspA dans une dite mycobactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis. Plus particulièrement encore, on introduit un plasmide contenant ledit gène mspA sous le contrôle d'un promoteur de l'expression dudit gène mspA dans une dite bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis.
Plus particulièrement encore, ledit gène mspA et lesdits éléments de commande de l'expression dudit gène mspA dans une dite bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis sont insérés dans le chromosome de ladite bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis.
On entend ici par "bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis", l'une des bactéries des espèces choisies parmi au moins Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis et ses clones ou sous- espèces BCG, Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii, Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti, Mycobacterium pinnipedii, et Mycobacterium mongii. Ces espèces sont toutes voisines présentant plus de 99% de similarité de leur génome pour les espèces actuellement séquencées; elles induisent toutes la même maladie clinique et provoquent les mêmes lésions tissulaires dans les organes infectés, caractérisées par la formation de granulomes avec cellules géantes de nature macrophagiques [26].
Dans un mode préféré de réalisation, ladite souche du complexe Mycobacterium tuberculosis est une souche de l'espèce Mycobacterium tuberculosis.
Plus particulièrement, ladite souche de Mycobacterium tuberculosis d'origine est la souche H37Rv.
Plus particulièrement encore, ledit gène mspA comprend la séquence SEQ ID N°l du listage de séquence annexé à la présente description.
Plus particulièrement encore, ledit gène mspA est sous le contrôle d'éléments d'expression dénommé « Promoteur hsp60 » consistant en SEQ. ID. n°4 du listage de séquence annexé à la présente description. Avantageusement, lesdites cellules eucaryotes sont des cellules de mammifère ou d'oiseau, de préférence, lesdites cellules sont des cellules humaines. Plus particulièrement encore, lesdites cellules sont des cellules de macrophages.
La présente invention fournit également un vaccin comprenant une souche transformée d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans laquelle on a inséré un dit gène mspA capable d'exprimer le porine A de Mycobacterium smegmatis dans une dite mycobactérie permettant de mettre en œuvre une méthode selon l'invention.
Plus particulièrement, il s'agit d'une souche transformée de Mycobacterium tuberculosis.
Plus particulièrement encore, il s'agit de la souche, ci-après dénommée H37RvpVVMspA, déposée le 26 avril 2012 à la collection NCTC (National Collection of Type Cultures), Health Protection Agency Culture Collections, Porton Down, Salisbury Wiltshire, SP4 OJG UK, sous le numéro 12042601. Ce dépôt a été réalisé en conformité avec le traité de Budapest.
Une «souche transformée selon l'invention présente plus particulièrement une diminution de la croissance de ladite bactérie dans des cellules eucaryotes d'au moins 90%, voire au moins 99% en termes de nombres de bactéries par ml de culture cellulaire. En d'autres termes encore, le nombre de bactéries par ml de culture cellulaire est divisé par au moins 10, voire divisé par au moins 100.
Une souche de mycobactérie transformée selon l'invention présente une durée de survie en culture de cellules eucaryotes et notamment in vivo, de pas plus de 60 jours, de préférence pas plus de 50 jours. En pratique la diminution de la croissance s'accompagne d'une diminution de la durée de vie de ladite bactérie dans lesdites cellules et notamment in vivo d'au moins 3 à 10 jours.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture des exemples qui vont suivre, faits en référence aux figures 1 à 3, dans lesquelles :
- la figure 1 représente une photographie de gel SDS-PAGE montrant le niveau d'expression de la porine MspA. La piste M montre les marqueurs de masse moléculaire. La piste 1 représente la séparation d'un extrait de protéines de M. smegmatis, la piste 2 un extrait de protéines de M. tuberculosis H37Rv/pVV16 et la piste 3 représente la séparation d'un extrait de protéines de M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA, la protéine MspA étant apparente à 20 KDa.
- la figure 2 représente les courbes de d'augmentation de la croissance de M. tuberculosis en présence de la porine MspA sur milieux axéniques 7H9 de l'exemple 1, mesuré en ordonnées en densité optique (OD) à 600 nm, de 0 à 1, pendant 18 jours ("t" en abscisses).
- les figures 3A à 3C représentent les graphes de croissance intracellulaire de M. tuberculosis H37Rv/pVV16 et M. tuberculosis H37Rv/MspA dans différentes cellules eucaryotes: A. polyphaga (figure 3A), BMDMs (figure 3B) et hMdMs (figure 3C) des exemples 2 et 3, mesurées en nombre de UFC/ml de lysat de cellules, de 0 à 1000000, (en ordonnées) à l'issue de 0 à 14 jours de cultures ("t" en abscisses).
- la figure 4 représente l'évolution du poids des souris (w) en gramme (g) en fonction du temps (t), en nombre de jours, de 0 à 39, pour des souris infectées avec la souche sauvage H37Rv et pour des souris infectées avec la souche modifiée H37Rv/pVVMspA, à différentes concentrations (10 000 UFC/100 μΙ et 10 000 UFC/100 μΙ).
- la figure 5 représente la charge bactérienne (nombre de UFC (CFU)) dans le foie (A), la rate (B) et le poumon (C), après une inoculation avec la souche sauvage de M. tuberculosis H37Rv (■) et la souche de M. tuberculosis selon la présente invention (□), tel que discuté à l'exemple 4.
Exemple 1. Croissance de Mycobacterium tuberculosis exprimant MspA en milieu axénique.
Dans un premier temps, les inventeurs ont amplifié le gène codant la porine MspA à partir du génome de Mycobacterium smegmatis, puis ils ont introduit le produit d'amplification dans le vecteur d'expression pVV16 [16] qui se caractérise par la présence de deux gènes codant pour des protéines de résistance à l'hygromycine et au kanamycine (marqueurs de sélection) afin d'obtenir le plasmide pVVMspA. Ensuite, les inventeurs ont incorporé le plasmide pVVMspA par electroporation dans Mycobacterium tuberculosis souche H37Rv et la sélection des clones transformés a été réalisée en utilisant hygromycine et kanamycine comme antibiotiques.
Protocoles expérimentaux
1) Construction de plasmide pVVMspA:
Dans un premier temps, les inventeurs ont extrait l'ADN génomique de la souche M. smegmatis mc2155 (ATCC 700084) et ont amplifié par PCR standard le gène codant la porine MspA [5].
La séquence gi_118467340 dudit gène est la séquence SEQ. ID. n°l suivante:
5'-
ATGAAGGCAATCAGTCGGGTGCTGATCGCGATGGTTGCAGCCATCGCGGCGCTTT
TCACGAGCACAGGCACCTCTCACGCAGGCCTGGACAACGAGCTGAGCCTCGTTG
ATGGCCAGGACCGCACCCTCACCGTGCAGCAGTGGGACACCTTCCTCAATGGTGT
GTTCCCCCTGGACCGCAACCGTCTTACCCGTGAGTGGTTCCACTCCGGTCGCGCC
AAGTACATCGTGGCCGGCCCCGGTGCCGACGAGTTCGAGGGCACGCTGGAACTC
GGCTACCAGATCGGCTTCCCGTGGTCGCTGGGTGTGGGCATCAACTTCAGCTACA CCACCCCGAACATCCTGATCGACGACGGTGACATCACCGCTCCGCCGTTCGGCCT
GAACTCGGTCATCACCCCGAACCTGTTCCCCGGTGTGTCGATCTCGGCAGATCTG
GGCAACGGCCCCGGCATCCAGGAAGTCGCAACGTTCTCGGTCGACGTCTCCGGC
GCCGAGGGTGGCGTGGCCGTGTCGAACGCCCACGGCACCGTGACCGGTGCGGC
CGGCGGTGTGCTGCTGCGTCCGTTCGCCCGCCTGATCGCCTCGACCGGTGACTC
GGTCACCACCTACGGCGAACCCTGGAACATGAACTGA-3'.
Les amorces utilisées sont :
- MSPA-pVV16F: 5'-ccccccçatatg_aaggcaatcagtc-3' (SEQ. ID. n°2), et
- MSPA-pVV16ndeI: 5'-cccçatatg_tcagttcatgttccaggg-3' (SEQ. ID. n°3).
Ces amorces ont été déterminées pour générer un produit de PCR correspondant à la totalité du gène mspA (636 pb) hébergeant de chaque côté un site de coupure pour l'enzyme de restriction Nde\ (ce site de coupure enzymatique est souligné dans les séquences des amorces ci-dessus) pour permettre le clonage dans le vecteur d'expression pVV16; puis son expression d'une manière constitutive.
Comme d'autres vecteurs d'expression tels que pMS3 [15], pMV261 [16], le vecteur pVV16 présente une cassette de résistance à l'hygromycine et un promoteur hsp60 d'expression (SEQ. ID. n°4) chez les mycobactéries [16]. La spécificité de pVV16 est un promoteur d'expression chez Escherichia coli (utilisé dans la vérification de la construction de plasmide au moment de clonage) et une cassette de résistance à la kanamycine permettant une double sélection [16].
Dans un deuxième temps, le fragment de PCR a été cloné dans le site Ndel du plasmide pVV16 pour donner le plasmide pVVMspA. Ce dernier a été introduit dans Escherichia coli DH5 alpha par le moyen le plus simple: choc thermique. La construction de plasmide a été vérifiée par digestion enzymatique et amplification par PCR puis séquençage. La séquence SEQ. ID. n°4 du promoteur hsp60 est 5'-
AACGCGTCGGCGGCTGCGCGCACCGAGTCCAGCGAGCACAGATCGAGTTGCTGC
AGCGTGACGTGGGCGCCTGGGCGGGCGGCCATGATGCGGGCCCGGGCGGCGTT
GCCCTTCTCGAGATTGCGGACGGCCAAACCTACGTGTGCACCGCGGTCGGCAAAC
ACGGCGGCGGTGTGGTAGCCGATGCCGGTGTTGGCGCCGGTGACCACAACGACG
CGCCCGCTTTGATCGGGGACGTCTGCGGCCGACCATTTACGGGTCTTGTTGTCGT
TGGCGGTCATGGGCCGAACATACTCACCCGGATCGGAGGGCCGAGGACAAGGTC
GAACGAGGGGCATGACCCGGTGCGGGGCTTCTTGCACTCGGCATAGGCGAGTGC
TAAGAATAACGTTGGCACTCGCGACCGGTGAGTCGTAGGTCGGGACGGTGAGGC
CAGGCCCGTCGTCGCAGCGAGTGGCAGCGAGGACAACTTGAGCCGTCCGTCGCG
GGCACTGCGCCCGGCCAGCGTAAGTAGCGGGGTTGCCGTCACCCGGTGACCCCC
GGTTTCATCCCCGATCCGGAGGAATCACTTCGCA-3'
La cassette d'expression du gène mspA sous le contrôle du promoteur hsp60 consiste en la juxtaposition de SEQ. ID. n°4 et SEQ. ID. n°l.
2) Préparation des mycobactéries Mvcobacterium tuberculosis électrocompétentes et introduction de plasmide pVVMspA:
Les mycobactéries Mycobacterium tuberculosis souche H37Rv (ATCC 27294) [17] électrocompétentes (manière perméables à l'introduction d'un plasmide) ont été préparées comme il a été décrit précédemment par Van Kessel et Hatfull [18]. Brièvement, les mycobactéries Mycobacterium tuberculosis ont été récoltées à partir d'une culture liquide de M. tuberculosis H37Rv de densité optique (D060o) entre 0,8-1,0, lavées trois fois dans du glycérol 10% et remises en suspension dans le même tampon. Ensuite, les plasmides pVV16 (contrôle permettant de s'assurer que les modifications de croissance ne sont pas dues au vecteur d'expression lui-même mais bien à la présence de gène mspA) et pVVMspA (plasmide contenant le gène de la porine MspA d'intérêt) ont été introduits séparément par électroporation dans les mycobactéries en utilisant un électroporateur (référence Multiporator/Electroporator 2510 , Le Pecq, France) à 1000 oméga, 2,5 kV et 25 uF. Les mycobactéries électroporées ont été récupérées dans 1 ml_ de milieu liquide Middelbrook 7H9 enrichi (Sigma-AIdrich, Lyon, Manière), mises en culture à 37°C pendant 12 h puis étalées sur un milieu Middelbrook 7H10 rendu sélectif par ajout de kanamycine plus hygromycine, et incubées à 37°C pendant 3 à 4 semaines. La transcription et la traduction du gène mspA chez les mycobactéries M. tuberculosis transformées ont été vérifiées par PCR, RT-PCR et SDS- PAGE.
La porine MspA est caractérisée par sa stabilité à la dénaturation par la chaleur [5]. Sur la figure 1, un gel d'électrophorèse par SDS- PAGE a été effectué à partir des extraits protéiques de M. tuberculosis H37Rv/pVV16 (piste 2), M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA (piste 3) et M. smegmatis (contrôle positif) (piste 1). Ces extraits ont été préparés grâce à l'extraction sélective par une haute température [27]. La figure 1 montre l'expression du gène mspA chez M. tuberculosis H37Rv et chez la souche contrôle M. smegmatis. Les spots de protéines détectées ont été excisés du gel et analysés par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Les taches de protéines ont été identifiées avec une couverture de séquences allant de 21% à 29% et une similitude avec la séquence protéique MspA de M. smegmatis à 20 KDa.
3) Croissance en milieu liquide des M. tuberculosis transformées ou non transformées : M. tuberculosis H37Rv/pVV16 (souches transformées contrôles n'exprimant pas la porine MspA) et M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA (souches transformées exprimant la porine MspA) ont été mis en pré-cultures dans 5mL de milieu Middlebrook 7H9 (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Manière) pendant 15 jours jusqu'à l'obtention d'une D060o de 1. Ensuite, les mycobactéries ont été fortement mélangées sous agitation au vortex pour éliminer les amas cellulaires, récoltées et diluées dans 10 ml de milieu 7H9 frais. Les taux de croissance ont été déterminés pour les deux souches dans trois cultures indépendantes par des mesures de D060o dans un système BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Manière). Ce système entièrement automatisé est basé sur la détection de la consommation d'oxygène à partir des bactéries aérobies.
4) Résultats.
Pour étudier l'influence de la protéine MspA sur la croissance de M. tuberculosis, les inventeurs ont effectué des expériences de croissance in vitro avec des souches M. tuberculosis/ pVV 16 et M. tuberculosis/ pVVMsp A en milieu liquide axénique 7H9 en trois cultures indépendantes. Les inventeurs ont utilisé une suspension de cellules puis la croissance des bactéries a été mesurée dans le système BACTEC MGIT 960 pendant 17 jours. Le temps de génération de la souche témoin M. tuberculosis/ pVV 16 et de la souche M. tuberculosis/ pVVMsp A étaient respectivement 19h 10min ± 10min et 17h 16min ±12min (Figure 2). Les inventeurs ont donc constaté que la souche qui exprime la porine MspA croît nettement plus vite que la souche témoin (p < 0,05). Cette expérience, réalisée trois fois a montré que l'expression de la porine MspA augmente le taux de croissance de M. tuberculosis.
Exemple 2. Croissance de Mycobacterium tuberculosis exprimant MspA en co-culture avec l'amibe A. polyphaga:
1) Protocole expérimental :
Dix millilitres d'une suspension d'amibes (~ 105 amibe/ml) ont été inoculés avec ~ 106 mycobactéries/ml (MOI = 10). Comme contrôles, A. polyphaga et les mycobactéries ont été cultivées séparément dans le tampon PAS (Page's modified Neff's amoeba saline) (21, 22,23) Après 24h d'incubation à 32 °C, la coculture a été lavée trois fois avec le PAS et incubée à 32 °C dans 10 ml de PAS pendant 10 à 15.
2) Résultats:
En utilisant des amibes comme cellules eucaryotes, on a observé que les deux souches M. tuberculosis H37Rv/pVV16 et M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA ont survécu au cours de l'expérience, mais le nombre des mycobactéries M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA qui expriment la porine MspA a diminué significativement (p < 0,05; test statistique de Student) après 8 jours de coculture. Au I2eme jour, le nombre de colonies a été de 2 x 105 ± 6 x 104 chez M. tuberculosis H37Rv/pVV16 contre 8 x 103 ± 5 x 103 chez M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA (Figure 3A).
La figures 3A représente les graphes de croissances intracellulaires de M. tuberculosis H37Rv/pVV16 et M. tuberculosis H37Rv/MspA dans une culture de cellules eucaryotes: A. polyphaga.
Ces données indiquent une diminution d'environ deux logsde la croissance intracellulaire de M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA par rapport à la souche M. tuberculosis H37Rv/pVV16, soit une diminution d'environ 99% du nombre de bactéries/ml de culture.
Exemple 3. Croissance de Mycobacterium tuberculosis exprimant MspA en co-culture avec des macrophages humains (hMdMs) ou macrophages de souris (BMDMs):
1) Protocole expérimental :
Les BMDMs [24] et les hMdMs isolées à partir des leukopacks (Etablissement Français du Sang, Marseille, Manière) par un gradient Ficoll (MSL, Eurobio, Courtaboeuf, Manière) différenciés ont été ensemencés séparément (105 cellules/puits) dans des plaques de culture de 24 puits en milieu RPMI 1640 contenant 10% de FCS. Les BMDMs et les hMdMs ont été infectés séparément par M. tuberculosis, M. tuberculosis H37Rv/pVV16 et M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA pendant 24 heures, puis les macrophages ont subi un lavage pour éliminer les mycobactéries libres avant d'être incubés pendant différentes périodes de temps dans du milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum de veau manière (FCS). Comme contrôles, chaque type cellulaire ainsi que les mycobactéries ont été cultivées séparément. Détermination du nombre des mycobactéries intracellulaires
(UFC):
A un temps donné, les cellules infectées ont été lysées avec 0,1% de dodécyl sulfate de sodium (SDS) pendant 30 min puis passées à travers une aiguille de calibre 26 pour assurer leur lyse complète. Le lysat (500μΙ_) a été lavé trois fois avec du PBS, étalé sur milieu solide 7H10 (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Manière) et incubé pendant 15 jours à 37°C afin de déterminer le nombre de colonies des mycobactéries intracellulaires (UFC). Toutes les expériences ont été réalisées en triple exemplaire.
2) Résultats:
En utilisant des macrophages BMDM comme cellules eucaryotes, les inventeurs ont observé que les deux souches M. tuberculosis H37Rv/pVV16 et M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA ont survécu tout au long le temps de l'expérience (14 jours). Les inventeurs ont observé qu'entre le 4ème et le 14ème jour la souche contrôle H37Rv/pVV16 a cru signif icativement plus que la souche qui exprime MspA (p < 0,05) (Figure 3B). Au I4eme jour, le nombre de colonies était de 1 x 106 ± 7 x 105 de M. tuberculosis H37Rv/pVV16 contre 4 x 105 ± 1 105 chez M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA (p < 0,05).
Co-culture de M. tuberculosis transformé ou non transformé avec des macrophages humains.
En utilisant des macrophages hMdM comme cellules eucaryotes, les inventeurs ont observé qu'à partir du 4eme jour et jusqu'à la fin de l'expérience, la souche contrôle M. tuberculosis H37Rv/pVV16 a cru signif icativement plus que la souche qui exprimait MspA (p < 0,05) (Figure 3C). Au 14 jour, le nombre de colonies était de 2 x 104 ± 2 x 103 chez M. tuberculosis H37Rv/pVV16 contre 5 x 103 ± 7 102 chez M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA. En conclusion, ces résultats indiquent que l'expression de la porine MspA chez M. tuberculosis entraine une difficulté pour la bactérie à se multiplier dans les 3 types des cellules eucaryotes testées par rapport à la souche de contrôle.
Les figures 3B et 3C représentent les graphes de croissances intracellulaires de M. tuberculosis H37Rv/pVV16 et M. tuberculosis H37Rv/MspA dans différentes cultures de macrophages: BMDMs (fig.3B) et hMdMs (fig.3C).
Ces données indiquent une diminution d'environ un log de la croissance intracellulaire de M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA par rapport à la souche M. tuberculosis H37Rv/pVV16, soit une diminution d'environ 90% du nombre de bactéries/ml de culture.
Exemple 4. Croissance de Mycobacterium tuberculosis exprimant MspA en modèle animal et protection contre la tuberculose
1) Protocole expérimental :
Le travail avec des animaux a été réalisé dans un laboratoire NSB 3 après approbation de l'échelon local du comité d'éthique pour l'expérimentation chez les animaux. Des souris Balb/c de 6 à 8 semaines (10 par groupe) ont été infectées par voie intrapéritonéale par 100 pL de culture bactérienne. Deux inoculums différents de chacune des souches ci-dessus (sauvage souche H37Rv ATCC 27294 et souche mutée M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA) ont été utilisées: 1 X 107 UFC/mL et 1 X 105 UFC/mL. Comme contrôle, un groupe de souris à été infecté par 100 pL de PBS stérile. Le poids, la performance et la survie des souris ont été suivis pendant 1 mois.
L'examen des souris infectées a été réalisé selon un protocole publié par d'autres chercheurs [3]. Egalement, dans un premier temps certaines souris survivantes ont été sacrifiées, la rate, le foie et les poumons ont été analysés en anatomie pathologique et la charge bactérienne a été déterminée par gramme de tissu, par culture et exprimée en UFC. Dans un deuxième temps, les souris survivantes des deux groupes ont été ré-inoculées avec 107 UFC/mL M. tuberculosis h37Rv et le même protocole d'observation a été suivi.
2) Résultats :
Les données actuelles sont que les souris infectées avec la souche modifiée selon l'invention ont moins de troubles de comportement et grossissent plus vite que les souris infectées avec la souche sauvage de M. tuberculosis (figures 4 et 5).
L'examen des souris infectées a été réalisé selon un protocole publié par d'autres chercheurs [3]. Dix semaines après infection, toutes les souris inoculées avec la souche mutée M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA ont survécu, alors que celles inoculées avec la souche sauvage-type montraient une mortalité de 50%. Cette survie était corrélée avec un nombre très bas d'unités de formation de colonies (UFC) de M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA dans les poumons. Les souris inoculées avec la souche mutée M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA ont développé peu de lésions tissulaires comportant de petits granulomes. Une souris inoculée avec la souche M. tuberculosis H37Rv sauvage a présenté une fistule abdominale. L'analyse macroscopique a montré que le poids de la rate des souris inoculées avec la souche M. tuberculosis H37Rv sauvage était significativement supérieur à celui des souris inoculées avec la souche mutée. Egalement, le nombre de granulomes était respectivement dans le foie de 24±21 vs 0 ; et dans la rate de 61±27 vs 8±7, ces différences étant significatives (p < 0.05). Dans la rate, le dénombrement des mycobactéries a montré une diminution significative du nombre de UFC pour la souche mutée M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA par rapport à la souche sauvage M. tuberculosis H37Rv. L'immunogénicité testée dans les tests cellulaires était conservée.
90 jours après la première inoculation, les inventeurs ont inoculé à nouveau les deux groupes de souris avec la souche sauvage de Mycobacterium tuberculosis H37RV utilisant un inoculum 107 CFU par ml. Les souris ont été à nouveau suivies pendant 90 jours, toutes les souris ont survécu à l'exception d'une souris sur 4 inoculées avec la souche sauvage lors de la première inoculation.
Egalement, la prise de poids a été significativement plus importante (P< à 0,05) dans le groupe des souris inoculées initialement avec la souche vaccinale selon la présente invention par rapport aux souris initialement inoculées avec la souche sauvage et cela à partir du 38eme jour avec inoculation (p=test statistique de Student qui indique la probabil itéCici <5%) de se tromper en affirmant que 2 moyennes de 2 séries sont différentes).
Les souris ont été euthanasiées 90 jours après la seconde inoculation, l'analyse histopathologique des tissus a montré un nombre de nodules de granulomes pulmonaires significativement plus importants dans le groupe initialement inoculé avec la tuberculose sauvage (33 ± 37 nodules que dans les souris initialement inoculées avec la souche vaccinale selon la présente invention (21 ± 25 nodules) (p < à 0,05).
Enfin, la charge bactérienne (nombre de UFC) en Mycobacterium tuberculosis H37RV était significativement supérieure dans le groupe des souris initialement inoculées avec la tuberculose sauvage, que dans le groupe des souris initialement inoculés avec la souche vaccinale selon la présente invention (p< à 0,05) (figure 5).
Les inventeurs ont donc obtenu trois types d'éléments de preuve, un élément de preuve clinique (mortalité); un élément de preuve histologique (nombre de granulomes par organe); et un élément de preuve microbiologique (charge bactérienne après inoculation) permettant de conclure au fait que la souche mutée M. tuberculosis H37RV/PVVMSPA confère une protection dans ce modèle animal contre la tuberculose sauvage.
Ces résultats montrant l'innocuité de la souche mutée selon la présente invention, et le caractère protecteur de la souche mutante de M. tuberculosis selon la présente invention contre une infection par M. tuberculosis, dépassent tous les résultats actuellement publiés dans ce domaine avec le BCG [30] pour constituer la base d'un vaccin amélioré contre la tuberculose.
Dans Brandt L. et al 2002 [30], aucune protection contre la mortalité induite par la tuberculose n'est montrée 6 semaines après infection par M. tuberculosis bien que ce soit le point capital en perspective d'infection chez l'homme. Par ailleurs, les charges bactériennes de M. tuberculosis sont très modérément diminuées dans la rate et les poumons.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] Metchock BG, Nolte FS, Wallace RJ Jr. Mycobacterium. In : Murray PR, Jo Baron H, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH, Eds. Manual of clinical microbiology. ASM Press; Washington DC, 1999; 399-437.
[2] Grode L, Seiler P, Baumann S, Hess J, Brinkmann V, Nasser Eddine A, Mann P, Goosmann C, Bandermann S, Smith D, Bancroft GJ, Reyrat JM, van Soolingen D, Raupach B, Kaufmann SH. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guérin mutants that secrète listeriolysin. J Clin Invest. 2005;115:2472-9.
[3] Gioffre A, Infante E, Aguilar D, Santangelo MP, Klepp L, Amadio A, Meikle V, Etchechoury I, Romano MI, Cataldi A et al. Mutation in mce opérons atténuâtes Mycobacterium tuberculosis virulence. Microbes Infect 2005;7:325-334;
[4] Martin C, Williams A, Hernandez-Pando R, Cardona PJ, Gormley E, Bordât Y, Soto CY, Clark SO, Hatch GJ, Aguilar D et al. The live Mycobacterium tuberculosis phoP mutant strain is more attenuated than BCG and confers protective immunity against tuberculosis in mice and guinea pigs. Vaccine 2006;24:3408-3419
[5] Niederweis,M., Ehrt,S., Heinz, C, Klocker,U., Karosi,S., Swiderek,K.M., Riley,L.W. and Benz,R. Cloning of the mspA gene encoding a porin from Mycobacterium smegmatis. Mol. Microbiol. 1999;5:933-945.
[6] Ojha A, Hatfull GF. The rôle of iron in Mycobacterium smegmatis biofilm formation: the exochelin siderophore is essential in limiting iron conditions for biofilm formation but not for planktonic growth. Mol Microbiol. 2007;66:468-83.
[7] Stahl, C. Kubetzko, S. Kaps, I. Seeber, S. Engelhardt, H.
Niederweis, M. MspA provides the main hydrophilic pathway through the cell wall of Mycobacterium smegmatis. Mol Microbiol. 2001;40; 451-64.
[8] Wolschendorf F, Mahfoud M, Niederweis M. Porins are required for uptake of phosphates by Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol. 2007;189:2435-42.
[9] Stephan J, Bender J, Wolschendorf F, Hoffmann C, Roth E, Mailander C, Engelhardt H, Niederweis M. The growth rate of Mycobacterium smegmatis dépends on sufficient porin-mediated influx of nutrients. Mol Microbiol. 2005; 58:714-30.
[10] Trias, J., Jarlier, V., and Benz, R. Porins in the cell wall of mycobacteria. Science 1992;258: 1479-1481
[11] Riess, F.G., Dorner, U., Schiffler, B., and Benz, R. Study of the properties of a channel-forming protein of the cell wall of the
Gram-positive bacterium Mycobacterium phlei. J Membr Biol 2001;182: 147-157
[12] Mailaender C, Reiling N, Engelhardt H, Bossmann S, Ehlers S, Niederweis M. The MspA porin promûtes growth and increases antibiotic susceptibility of both Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium tuberculosis. Microbiology 2004;150:853-864
[13] Fabrino DL, Bleck CK, Anes E, Hasilik A, Melo RC, Niederweis M, Griffiths G, Gutierrez MG. Porins facilitate nitric oxide-mediated killing of mycobacteria. Microbes Infect. 2009;11:868-75.
[14] Sharbati-Tehrani S, Meister B, Appel B, Lewin A. The porin MspA from Mycobacterium smegmatis improves growth of Mycobacterium bovis BCG. Int J Med Microbiol. 2004;294:235-45.
[15] Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W. & Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. Eur J Biochem 2000;267, 1565-1570. [16] Stover CK, De la Cruz VF, Fuerst TR, Burlein JE, Benson LA, Bennett LT, Bansal GP, Young JF, Lee MH, Hatfull GF, Snapper SB, Barletta RG, Jacobs WR, Bloom BR. New use of BCG for recombinant vaccines. Nature 1991:351:456-460.
[17] Cole ST, Brosch R, Parkhill J, Garnier T, Churcher C, Harris D, Gordon SV, Eiglmeier K, Gas S, Barry CE, 3rd et al: Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complète génome séquence. Nature 1998, 393(6685):537-544)
[18] Van Kessel, J.C., and Hatfull, G. F. (2007) Recombineering in Mycobacterium tuberculosis. Nat Methods 4: 147-152.
[19] Dye C. et al. Prospects for worlwide tuberculosis control under the WHO DOTS strategy. Lancet 1998; 352:1886-91.3.
[20] Alexander KA, Laver PN, Michel AL, Williams M, van Helden PD, Warren RM, Gey van Pittius NC. Novel Mycobacterium tuberculosis complex pathogen, M. mung.Emerq Infect Dis. 2010;16:1296-9.
[21] Rowbotham, T.J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical spécimens via amoebae, and the interaction of those and other isolâtes with amoebae. J Clin Pathol 1983;36: 978986.
[22] La Scola, B., Mezi, L., Weiller, P.J., and Raoult, D. Isolation of Legionella an/sa using an amoebic coculture procédure. J Clin Microbiol 2001;39:365-366.
[23] Greub, G., and Raoult, D. Microorganisms résistant to free-living amoebae. Clin Microbiol Rev 2004;17: 413-433).
[24] Cook, P., Totemeyer, S., Stevenson, C, Fitzgerald, K.A., Yamamoto, M., Akira, S. et al. Sa/mone/la-lnduced SipB- independent cell death requires Toll-like receptor-4 signalling via the adapter proteins. Tram and Trif. Immunology 2007;122: 222- 229). [25] Gengenbacher M, Kaufmann SH. Mycobacterium tuberculosis: success through dormancy. FEMS Microbiol Rev. 2012;36:514-32
[26] Isaza R. Tuberculosis in ail taxa. In: Fowler ME, Miller RE, eds.
Zoo and Wild Animal Medicine. 5 th ed. St. Louis, MO: Elsevier; 2003:689-696
[27] Heinz, C, and Niederweis, M. Sélective extraction and purification of a mycobacterial outer membrane protein. Anal Biochem 2000; 285 ; 113-120
[28] HARTLEY jw et al. Retrovirology 2008, 5:1
[29] Microbiologie Médicale Jawetz E. Melnick JL, Adelberg EA.
Maloine SA Editor, 1973, p 384
[30] Brandt L. et al. Infect. Immun. 2002 ; 70 : 672-678
[31] Manca C. et al, J. Immunol. 1999; 62: 6740-6

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une souche d'une mycobactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis, dans laquelle un gène mspA capable d'exprimer une porine A de Mycobacterium smegmatis a été inséré, pour la fabrication d'un vaccin pour la prévention d'une infection par une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis chez un hôte comprenant des cellules eucaryotes, de préférence des macrophages, ladite souche de mycobactéries ainsi transformée présentant une croissance diminuée dans lesdites cellules eucaryotes.
2. Utilisation d'une souche transformée Mycobacterium tuberculosis selon la revendication 1, pour la fabrication d'un vaccin pour la prévention de la tuberculose chez les mammifères ou oiseaux, lesdites cellules eucaryotes étant des macrophages.
3. Utilisation de la souche selon la revendication 2, pour la fabrication d'un vaccin pour la prévention de la tuberculose humaine.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit gène mspA inséré dans ladite souche est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression dudit gène mspA dans une dite mycobactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis.
5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit gène et ledit promoteur sont insérés dans un plasmide.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite souche de dite mycobactérie du complexe Mycobacterium est une souche de l'espèce Mycobacterium tuberculosis.
7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite souche d'origine de Mycobacterium tuberculosis est la souche H37Rv.
8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit gène mspA comprend la séquence SEQ ID N°l.
9. Utilisation selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisée en ce que ledit gène mspA est sous le contrôle d'éléments d'expression du promoteur hsp60 consistant en SEQ.ID.N°4.
10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ladite souche est transformée et déposée à la collection NCTC (UK), le 26 avril 2012, sous le numéro 12042601.
11. Vaccin obtenu par l'utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend une dite souche transformée d'une mycobactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans laquelle on a inséré un gène mspA capable d'exprimer une porine MspA de Mycobacterium smegmatis dans ladite mycobactérie.
12. Vaccin selon la revendication 11, caractérisé en ce que ladite souche est une souche transformée de Mycobacterium tuberculosis.
13. Vaccin selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite souche est la souche déposée à la collection NCTC (UK), le 26 avril 2012, sous le numéro 12042601.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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