FR2990697A1 - Procede d'attenuation d'une bacterie du complexe mycobacterium tuberculosis pour la fabrication d'un vaccin contre la tuberculose - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une méthode pour diminuer la croissance d'une souche d'une mycobactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans des cellules eucaryotes, par ajout et expression dans ladite mycobactérie d'un gène mspA codant pour une porine A de Mycobacterium smegmatis, ainsi qu'une souche ainsi transformée utile pour la fabrication d'un vaccin pour la prévention d'une infection par une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis chez un hôte comprenant desdites cellules eucaryotes, de préférence des macrophages.

Description

Procédé d'atténuation d'une bactérie du complexe Mycobacteriurn tuberculosis pour la fabrication d'un vaccin contre la tuberculose La tuberculose est une maladie infectieuse de l'homme et des animaux due à l'une des espèces du complexe Mycobacteriurn tuberculosis, à savoir notamment Mycobacteriurn tuberculosis, Mycobacteriurn bovis (et les souches BCG qui en sont dérivées), Mycobacteriurn africanurn, Mycobacteriurn canettii, Mycobacteriurn caprae, Mycobacteriurn rnicroti, et Mycobacteriurn pinnipedii [19] et Mycobacteriurn rnungii (20). La tuberculose cause environ 9 millions de nouveaux cas dans le monde tous les ans et tue environ 3 millions de personnes tous les ans. L'épidémie d'infection par le HIV a coïncidé avec une réémergence de la tuberculose dans les pays développés et s'est accompagnée de l'émergence inquiétante de souches de Mycobacteriurn tuberculosis résistant aux antibiotiques antituberculeux de première ligne. La tuberculose est une maladie contagieuse à partir d'une personne présentant une tuberculose pulmonaire bacillifére, c'est-à-dire une personne expectorant des mycobactéries du complexe Mycobacteriurn tuberculosis vivantes dans son expectoration. Longtemps, la prévention contre la tuberculose pulmonaire a reposé sur la vaccination par le bacille de Calmette et Guérin (BCG) qui est une souche atténuée de Mycobacteriurn bovis mycobactérie extrêmement proche de Mycobacteriurn tuberculosis et également responsable de tuberculose humaine et de tuberculose animale, essentiellement tuberculose bovine. Cependant, l'efficacité du vaccin BCG est extrêmement variable selon les circonstances cliniques et les pays dans lesquelles cette efficacité a été mesurée. En effet, cette efficacité est variable entre 0% de protection jusqu'à 60% de protection. Cette médiocre protection par le vaccin BCG contre la tuberculose pulmonaire a conduit les autorités de santé dans plusieurs pays à abandonner cette vaccination. C'est le cas en Manière depuis Juillet 2007 puisque la vaccination par le BCG n'est plus obligatoire en Manière en dehors de certains groupes plus particuliers de population comme les personnels de soins. Plusieurs travaux expérimentaux ont tenté d'augmenter le caractère protecteur du vaccin BCG par différentes méthodes de manipulation génétique du génome de Mycobacteriurn tuberculosis mais jusqu'à présent aucune de ces constructions n'a permis de développer un vaccin alternatif au BCG pour la protection contre la tuberculose en particulier contre la tuberculose pulmonaire. Une première stratégie a consisté à développer des variants du BCG produisant et sécrétant des cytokines [1]. Une seconde stratégie était la construction de BCG recombinant exprimant une protéine antigénique de 30 kilo-daltons de Mycobacteriurn tuberculosis; cette construction a montré un effet protecteur dans les modèles animaux. Enfin plusieurs travaux ont manipulé le génome de la souche BCG pour qu'elle sécrète la listeriolysine de la bactérie Listeria rnonocytogenes enfin de stimuler les lymphocytes CD 8 et CD 4 qui sont impliqués dans la protection contre la tuberculose [2]. Une dernière stratégie a consisté à fabriquer des souches atténuées de Mycobacterium tuberculosis par inactivation de gènes de virulence tel que le gène phoP et le gène mce [3, 4]. Ces constructions ont montré une protection plus importante contre l'infection par Mycobacteriurn tuberculosis que le BCG dans des modèles animaux [3, 4]. De façon connue, de telles souches atténuées de Mycobacteriurn responsables d'infection chez l'homme ou l'animal sont aptes à être utilisées pour la fabrication de vaccins, notamment par administration de dites bactéries atténuées dans ledit vaccin. De façon connue, les souches de mycobactéries utilisées à titre de vaccins, notamment la souche H37Rv présentent une durée de survie en culture de cellules eucaryotes et notamment in vivo, de pas plus de 30 jours. En pratique, la diminution de la croissance s'accompagne d'une diminution de la durée de vie de ladite bactérie dans lesdites cellules et notamment in vivo La porine MspA a été découverte dans les extraits membranaires de M. srnegrnatis comme une protéine oligomérique composée de sous-unités de 20 kDa [5]. Elle a été considérée comme la porine majeure et la plus abondante chez M. srnegrnatis [5, 6]. La suppression du gène mspA codant pour MspA réduit la perméabilité de la membrane externe de M. srnegrnatis au glucose [7], au phosphate [8], aux ions métalliques et aux acides aminés [9] indiquant que cette porine représente la principale voie de diffusion générale de différents substrats chez M. srnegrnatis, permettant aussi un afflux de nutriments depuis le milieu extérieur à la mycobactérie [8, 9]. Le gène qui code pour la porine MspA est détecté également chez d'autres mycobactéries à croissance rapide tel que Mycobacteriurn chelonae [10] et Mycobacteriurn phlei [11]. Il a été montré que l'expression de la porine MspA chez M. tuberculosis et M.bovis augmentait leur sensibilité aux antibiotiques [12]. De même, la porine MspA de M. srnegrnatis augmente la croissance d'une souche de M. bovis BCG en milieu axénique [14]. Dans ces travaux antérieurs [12, 14], les auteurs ont déterminé des concentrations minimales d'inhibition d'antibiotiques pour la souche de M. tuberculosis H37Rv contrôle et la souche exprimant MspA par croissance sur milieu axénique Middlebrook 7H10 agar. Enfin, il a été montré que la délétion du gène mspA chez M. srnegrnatis augmentait la survie de M. srnegrnatis dans des macrophages de souris (13). En conséquence, il ressort de la littérature que : 1-Différentes techniques d'ingénierie biologique ont été utilisées pour créer des mutations ou des délétions afin de construire des souches atténuées de bactéries du complexe M. tuberculosis. Les stratégies de fabriquer des souches atténuées de Mycobacteriurn tuberculosis par inactivation de gènes de virulence, tels que le gène phoP et le gène mce [3,4], ont montré une protection plus importante contre l'infection par Mycobacteriurn tuberculosis que le BCG dans des modèles animaux de souris et de cobaye [3, 4]. Cependant, ces techniques d'ingénierie biologique n'ont pas été utilisées valablement pour ajouter des gènes absents du génome de bactéries du complexe Mycobacteriurn tuberculosis à des fins d'utilisation comme vaccin ou pour la fabrication d'un vaccin 2-Aucun des travaux antérieurs ne suggéraient que l'expression du gène mspA pouvait atténuer la croissance d'une bactérie du complexe Mycobacteriurn tuberculosis dans des modèles cellules eucaryotes et des modèles animaux et fortiori pour d'utilisation comme vaccin ou pour la fabrication d'un vaccin.

Le but de la présente invention était de fournir de nouvelles souches de complexe M. tuberculosis présentant des taux de croissance diminués tout en conservant leur immunogénicité. En effet, l'homme de l'art dans le domaine du vaccin cherche toujours à diversifier les modes de réalisation de vaccins pour améliorer l'efficacité et diminuer les effets secondaires des dits vaccins, ainsi qu'à élargir le spectre des mammifères pouvant bénéficier de la vaccination, en particulier les animaux d'élevage tels que bovins A l'inverse des stratégies qui consistent à inactiver ou à retirer des gènes pour inactiver la mycobactérie et la rendre utilisable dans une perspective vaccinale, selon la présente invention, les inventeurs ont découvert de façon surprenante qu'il était possible d'atténuer une bactérie du complexe Mycobacteriurn tuberculosis par ajout et expression d'un gène en utilisant les méthodes d'ingénierie moléculaire. Pour ce faire la présente invention fournit une méthode pour diminuer la croissance d'une souche d'une mycobactérie du complexe Mycobacteriurn tuberculosis dans des cellules eucaryotes, par ajout et expression dans ladite mycobactérie d'un gène rnspA codant pour une porine A de Mycobacteriurn srnegrnatis. Selon la présente invention, il a été observé que : a- Une souche ainsi transformée de mycobactérie du complexe Mycobacteriurn tuberculosis permettant l'expression de la porine MspA chez une dite mycobactérie du complexe M. tuberculosis présente une croissance plus importante que la souche sauvage de Mycobacteriurn tuberculosis dans un milieu de culture ne comportant pas de cellules eucaryotes (milieu axénique) - en cela, les inventeurs ont confirmé les résultats antérieurement publiés dans la littérature [12, 14]; b- mais, de façon surprenante, la croissance de cette souche transformée, en co-culture de cellules eucaryotes, permet de diminuer la croissance du mutant Mycobacteriurn tuberculosis par rapport à celle de la souche sauvage d'origine et ceci en utilisant trois milieux de culture cellulaires eucaryotes différents, comprenant notamment des macrophages de souris et macrophages humains. Or, ces macrophages sont particulièrement concernés dans la tuberculose et les réactions d'immunogénicité et donc de protection dans une utilisation comme vaccin. En effet, les macrophages sont les cellules de l'homme et des animaux qui phagocytent les mycobactéries Mycobacteriurn tuberculosis pour tenter de les détruire et pour présenter les antigènes des mycobactéries aux autres cellules du système immunitaire [25].

Ce résultat de croissance intracellulaire dans des co-cultures de cellules eucaryotes était tout à fait inattendu car opposé à celui obtenu par les inventeurs et publié dans la littérature internationale concernant des cultures en milieux axéniques en l'absence de cellules eucaryotes [12, 14].

En outre , les essais in vivo sur souris , ont permis de démontrer que cette diminution de croissance était conservée in vivo et que les propriétés d'immunogénicité de la souche atténuée étaient conservées également , celle-ci pouvant donc avantageusement être utilisée pour la fabrication d'un vaccin , voire comme vaccin, pour la prévention de la tuberculose humaine et de façon plus générale de la tuberculose chez les mammifères et les oiseaux.

Plus particulièrement, on insère dans ladite souche ledit gène rnspA placé sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression dudit gène rnspA dans une dite mycobactérie du complexe Mycobacteriurn tuberculosis.

Plus particulièrement encore, on introduit un plasmide contenant ledit gène rnspA sous le contrôle d'un promoteur de l'expression dudit gène rnspA dans une dite bactérie du complexe Mycobacteriurn tuberculosis. Plus particulièrement encore, ledit gène rnspA et lesdits éléments de commande de l'expression dudit gène rnspA dans une dite bactérie du complexe Mycobacteriurn tuberculosis sont insérés dans le chromosome de ladite bactérie du complexe Mycobacteriurn tuberculosis. On entend ici par "bactéries du complexe Mycobacteriurn tuberculosis", l'une des bactéries des espèces choisies parmi au moins Mycobacteriurn tuberculosis, Mycobacteriurn bovis et ses clones ou sous- espèces BCG, Mycobacteriurn africanurn, Mycobacteriurn canettii, Mycobacteriurn caprae, Mycobacteriurn rnicroti, Mycobacteriurn pinnipedii, et Mycobacteriurn rnongii. Ces espèces sont toutes voisines présentant plus de 99% de similarité de leur génome pour les espèces actuellement séquencées; elles induisent toutes la même maladie clinique et provoquent les mêmes lésions tissulaires dans les organes infectés, caractérisées par la formation de granulomes avec cellules géantes de nature macrophagiques [26]. Dans un mode préféré de réalisation, ladite souche du complexe Mycobacteriurn tuberculosis est une souche de l'espèce Mycobacteriurn tuberculosis. Plus particulièrement, ladite souche de Mycobacteriurn tuberculosis d'origine est la souche H37Rv.

Plus particulièrement encore, ledit gène mspA comprend la séquence SEQ ID N°1 du listage de séquence annexé à la présente description. Plus particulièrement encore, ledit gène mspA est sous le contrôle d'éléments d'expression dénommé « Promoteur hsp60 » consistant en SEQ. ID. n°4 du listage de séquence annexé à la présente description. Avantageusement, lesdites cellules eucaryotes sont des cellules de mammifère ou d'oiseau, de préférence, lesdites cellules sont des cellules humaines.

Plus particulièrement encore, lesdites cellules sont des cellules de macrophages. La présente invention fournit également une souche transformée d'une bactérie du complexe Mycobacteriurn tuberculosis dans laquelle on a inséré un dit gène mspA capable d'exprimer le porine A de Mycobacteriurn srnegrnatis dans une dite mycobactérie permettant de mettre en oeuvre une méthode selon l'invention. Plus particulièrement, il s'agit d'une souche transformée de Mycobacteriurn tuberculosis. Plus particulièrement encore, il s'agit de la souche, ci-après dénommée H37RvpVVM5pA, déposée le 26 avril 2012 à la collection NCTC (National Collection of Type Cultures), Health Protection Agency Culture Collections, Porton Down, Salisbury Wiltshire, 5P4 03G UK, sous le numéro 12042601. Ce dépôt a été réalisé en conformité avec le traité de Budapest.

Une «souche transformée selon l'invention présente plus particulièrement une diminution de la croissance de ladite bactérie dans des cellules eucaryotes d'au moins 90%, voire au moins 99% en termes de nombres de bactéries par ml de culture cellulaire. En d'autres termes encore, le nombre de bactéries par ml de culture cellulaire est divisé par au moins 10, voire divisé par au moins 100. Une souche de mycobactérie transformée selon l'invention présente une durée de survie en culture de cellules eucaryotes et notamment in vivo, de pas plus de 60 jours, de préférence pas plus de 50 jours. En pratique la diminution de la croissance s'accompagne d'une diminution de la durée de vie de ladite bactérie dans lesdites cellules et notamment in vivo d'au moins 3 à 10 jours.

La présente invention a également pour objet une utilisation d'une souche transformée du complexe Mycobacteriurn tuberculosis selon l'invention pour la fabrication d'un vaccin pour la prévention d'une infection par une bactérie du complexe Mycobacteriurn tuberculosis chez un hôte comprenant des dites cellules eucaryotes, de préférence des macrophages. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une souche transformée Mycobacteriurn tuberculosis selon l'invention pour la fabrication d'un vaccin pour la prévention de la tuberculose chez les mammifères ou oiseaux.

Plus particulièrement encore, la présente invention a pour objet une utilisation d'une souche transformée selon l'invention est utile pour la fabrication d'un vaccin pour la prévention de la tuberculose humaine D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture des exemples qui vont suivre, faits en référence aux figures 1 à 3, dans lesquelles : - la figure 1 représente une photographie de gel SDS-PAGE montrant le niveau d'expression de la porine MspA. La piste M montre les marqueurs de masse moléculaire. La piste 1 représente la séparation d'un extrait de protéines de M. srnegrnatis, la piste 2 un extrait de protéines de M. tuberculosis H37Rv/pVV16 et la piste 3 représente la séparation d'un extrait de protéines de M. tuberculosis H37Rv/pVVM5pA, la protéine MspA étant apparente à 20 KDa. - la figure 2 représente les courbes de d'augmentation de la croissance de M. tuberculosis en présence de la porine MspA sur milieux axéniques 7H9 de l'exemple 1, mesuré en ordonnées en densité optique (OD) à 600 nm, de 0 à 1, pendant 18 jours ("t" en abscisses). - les figures 3A à 3C représentent les graphes de croissance intracellulaire de M. tuberculosis H37Rv/pVV16 et M. tuberculosis H37Rv/MspA dans différentes cellules eucaryotes: A. polyphaga (figure 3A), BMDMs (figure 3B) et hMdMs (figure 3C) des exemples 2 et 3, mesurées en nombre de UFC/ml de lysat de cellules, de 0 à 1000000, (en ordonnées) à l'issue de 0 à 14 jours de cultures ("t" en abscisses). - la figure 4 représente l'évolution du poids des souris (w) en gramme (g) en fonction du temps (t), en nombre de jours, de 0 à 39, pour des souris infectées avec la souche sauvage H37Rv et pour des souris infectées avec la souche modifiée H37Rv/pVVM5pA, à différentes concentrations (10 000 UFC/100 pl et 10 000 UFC/100 pl). Exemple 1. Croissance de Mycobacterium tuberculosis exprimant MspA en milieu axénique. Dans un premier temps, les inventeurs ont amplifié le gène codant la porine MspA à partir du génome de Mycobacteriurn srnegrnatis, puis ils ont introduit le produit d'amplification dans le vecteur d'expression pVV16 [16] qui se caractérise par la présence de deux gènes codant pour des protéines de résistance à l'hygromycine et au kanamycine (marqueurs de sélection) afin d'obtenir le plasmide pVVMspA. Ensuite, les inventeurs ont incorporé le plasmide pVVMspA par electroporation dans Mycobacteriurn tuberculosis souche H37Rv et la sélection des clones transformés a été réalisée en utilisant hygromycine et kanamycine comme antibiotiques.

Protocoles expérimentaux 1) Construction de plasmide pVVMspA: Dans un premier temps, les inventeurs ont extrait l'ADN génomique de la souche M. srnegrnatis mc2155 (ATCC 700084) et ont amplifié par PCR standard le gène codant la porine MspA [5]. La séquence gi_118467340 dudit gène est la séquence SEQ. ID. n°1 suivante: 5'- ATGAAGGCAATCAGTCGGGTGCTGATCGCGATGGTTGCAGCCATCGCGGCGCTTT TCACGAGCACAGGCACCTCTCACGCAGGCCTGGACAACGAGCTGAGCCTCGTTG ATGGCCAGGACCGCACCCTCACCGTGCAGCAGTGGGACACCTTCCTCAATGGTGT GTTCCCCCTGGACCGCAACCGTCTTACCCGTGAGTGGTTCCACTCCGGTCGCGCC AAGTACATCGTGGCCGGCCCCGGTGCCGACGAGTTCGAGGGCACGCTGGAACTC GGCTACCAGATCGGCTTCCCGTGGTCGCTGGGTGTGGGCATCAACTTCAGCTACA CCACCCCGAACATCCTGATCGACGACGGTGACATCACCGCTCCGCCGTTCGGCCT GAACTCGGTCATCACCCCGAACCTGTTCCCCGGTGTGTCGATCTCGGCAGATCTG GGCAACGGCCCCGGCATCCAGGAAGTCGCAACGTTCTCGGTCGACGTCTCCGGC GCCGAGGGTGGCGTGGCCGTGTCGAACGCCCACGGCACCGTGACCGGTGCGGC CGGCGGTGTGCTGCTGCGTCCGTTCGCCCGCCTGATCGCCTCGACCGGTGACTC GGTCACCACCTACGGCGAACCCTGGAACATGAACTGA-3'. Les amorces utilisées sont : - MSPA-pVV16F: 5'-cccccccatatqaaggcaatcagtc-3' (SEQ. ID. n°2), et - MSPA-pVV16ndeI: 5'-ccccatatecagttcatgttccaggg-3' (SEQ. ID. n°3). Ces amorces ont été déterminées pour générer un produit de PCR correspondant à la totalité du gène rnspA (636 pb) hébergeant de chaque côté un site de coupure pour l'enzyme de restriction Ndel (ce site de coupure enzymatique est souligné dans les séquences des amorces ci-dessus) pour permettre le clonage dans le vecteur d'expression pVV16; puis son expression d'une manière constitutive. Comme d'autres vecteurs d'expression tels que pMS3 [15], pMV261 [16], le vecteur pVV16 présente une cassette de résistance à l'hygromycine et un promoteur hsp60 d'expression (SEQ. ID. n°4) chez les mycobactéries [16]. La spécificité de pVV16 est un promoteur d'expression chez Escherichia cou i (utilisé dans la vérification de la construction de plasmide au moment de clonage) et une cassette de résistance à la kanamycine permettant une double sélection [16].

Dans un deuxième temps, le fragment de PCR a été cloné dans le site Ndel du plasmide pVV16 pour donner le plasmide pVVMspA. Ce dernier a été introduit dans Escherichia cou i DH5 alpha par le moyen le plus simple: choc thermique. La construction de plasmide a été vérifiée par digestion enzymatique et amplification par PCR puis séquençage.

La séquence SEQ. ID. n°4 du promoteur hsp60 est 5'- AACGCGTCGGCGGCTGCGCGCACCGAGTCCAGCGAGCACAGATCGAGTTGCTGC AGCGTGACGTGGGCGCCTGGGCGGGCGGCCATGATGCGGGCCCGGGCGGCGTT GCCCTTCTCGAGATTGCGGACGGCCAAACCTACGTGTGCACCGCGGTCGGCAAAC ACGGCGGCGGTGTGGTAGCCGATGCCGGTGTTGGCGCCGGTGACCACAACGACG CGCCCGCTTTGATCGGGGACGTCTGCGGCCGACCATTTACGGGTCTTGTTGTCGT TGGCGGTCATGGGCCGAACATACTCACCCGGATCGGAGGGCCGAGGACAAGGTC GAACGAGGGGCATGACCCGGTGCGGGGCTTCTTGCACTCGGCATAGGCGAGTGC TAAGAATAACGTTGGCACTCGCGACCGGTGAGTCGTAGGTCGGGACGGTGAGGC CAGGCCCGTCGTCGCAGCGAGTGGCAGCGAGGACAACTTGAGCCGTCCGTCGCG GGCACTGCGCCCGGCCAGCGTAAGTAGCGGGGTTGCCGTCACCCGGTGACCCCC GGTTTCATCCCCGATCCGGAGGAATCACTTCGCA-3' La cassette d'expression du gène mspA sous le contrôle du promoteur hsp60 consiste en la juxtaposition de SEQ. ID. n°4 et SEQ. ID. n°1. 2) Préparation des mycobactéries Mycobacteriurn tuberculosis électrocompétentes et introduction de plasmide pVVMspA: Les mycobactéries Mycobacteriurn tuberculosis souche H37Rv (ATCC 27294) [17] électrocompétentes (manière perméables à l'introduction d'un plasmide) ont été préparées comme il a été décrit précédemment par Van Kessel et Hatfull [18]. Brièvement, les mycobactéries Mycobacteriurn tuberculosis ont été récoltées à partir d'une culture liquide de M. tuberculosis H37Rv de densité optique (D0600) entre 0,8-1,0, lavées trois fois dans du glycérol 10% et remises en suspension dans le même tampon. Ensuite, les plasmides pVV16 (contrôle permettant de s'assurer que les modifications de croissance ne sont pas dues au vecteur d'expression lui-même mais bien à la présence de gène rnspA) et pVVMspA (plasmide contenant le gène de la porine MspA d'intérêt) ont été introduits séparément par électroporation dans les mycobactéries en utilisant un électroporateur (référence Multiporator/Electroporator 2510 , Le Pecq, France) à 1000 omega, 2,5 kV et 25 uF. Les mycobactéries électroporées ont été récupérées dans 1 mL de milieu liquide Middelbrook 7H9 enrichi (Sigma-Aldrich, Lyon, Manière), mises en culture à 37°C pendant 12 h puis étalées sur un milieu Middelbrook 7H10 rendu sélectif par ajout de kanamycine plus hygromycine, et incubées à 37°C pendant 3 à 4 semaines. La transcription et la traduction du gène rnspA chez les mycobactéries M. tuberculosis transformées ont été vérifiées par PCR, RT-PCR et SDSPAGE. La porine MspA est caractérisée par sa stabilité à la dénaturation par la chaleur [5]. Sur la figure 1, un gel d'électrophorèse par SDS- PAGE a été effectué à partir des extraits protéiques de M. tuberculosis H37Rv/pVV16 (piste 2), M. tuberculosis H37Rv/pVVM5pA (piste 3) et M. srnegrnatis (contrôle positif) (piste 1). Ces extraits ont été préparés grâce à l'extraction sélective par une haute température [27]. La figure 1 montre l'expression du gène mspA chez M. tuberculosis H37Rv et chez la souche contrôle M. srnegrnatis. Les spots de protéines détectées ont été excisés du gel et analysés par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Les taches de protéines ont été identifiées avec une couverture de séquences allant de 21% à 29% et une similitude avec la séquence protéique MspA de M. srnegrnatis à 20 KDa. 3) Croissance en milieu liquide des M. tuberculosis transformées ou non transformées : M. tuberculosis H37Rv/pVV16 (souches transformées contrôles n'exprimant pas la porine MspA) et M. tuberculosis H37Rv/pVVM5pA (souches transformées exprimant la porine MspA) ont été mis en pré-cultures dans 5mL de milieu Middlebrook 7H9 (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Manière) pendant 15 jours jusqu'à l'obtention d'une D0600 de 1. Ensuite, les mycobactéries ont été fortement mélangées sous agitation au vortex pour éliminer les amas cellulaires, récoltées et diluées dans 10 ml de milieu 7H9 frais. Les taux de croissance ont été déterminés pour les deux souches dans trois cultures indépendantes par des mesures de D0600 dans un système BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Manière). Ce système entièrement automatisé est basé sur la détection de la consommation d'oxygène à partir des bactéries aérobies. 4) Résultats. Pour étudier l'influence de la protéine MspA sur la croissance de M. tuberculosis, les inventeurs ont effectué des expériences de croissance in vitro avec des souches M. tuberculosislpVV16 et M. tuberculosislpVVMspA en milieu liquide axénique 7H9 en trois cultures indépendantes. Les inventeurs ont utilisé une suspension de cellules puis la croissance des bactéries a été mesurée dans le système BACTEC MGIT 960 pendant 17 jours. Le temps de génération de la souche té moi n M. tuberculosislpVV16 et de la souche M. tuberculosislpVVMspA étaient respectivement 19h 10min ± 10min et 17h 16min ±12min (Figure 2). Les inventeurs ont donc constaté que la souche qui exprime la porine MspA croît nettement plus vite que la souche témoin (p 0,05). Cette expérience, réalisée trois fois a montré que l'expression de la porine MspA augmente le taux de croissance de M. tuberculosis.

Exemple 2. Croissance de Mycobacterium tuberculosis exprimant MspA en co-culture avec l'amibe A. polyphaga: 1) Protocole expérimental : Dix millilitres d'une suspension d'amibes (- 105 amibe/mi) ont été inoculés avec - 106 mycobactéries/mi (MOI=10). Comme contrôles, A. polyphaga et les mycobactéries ont été cultivées séparément dans le tampon PAS (Page's modified Neff's amoeba saline) (21, 22,23) Après 24h d'incubation à 32 °C, la coculture a été lavée trois fois avec le PAS et incubée à 32°C dans 10 ml de PAS pendant 10 à 15. 2) Résultats: En utilisant des amibes comme cellules eucaryotes, on a observé que les deux souches M. tuberculosis H37Rv/pVV16 et M. tuberculosis H37Rv/pVVM5pA ont survécu au cours de l'expérience, mais le nombre des mycobactéries M. tuberculosis H37Rv/pVVM5pA qui expriment la porine MspA a diminué significativement (p 0,05; test statistique de Student) après 8 jours de coculture. Au 12ème jour, le nombre de colonies a été de 2 x 105 ± 6 x 104 chez M. tuberculosis H37Rv/pVV16 contre 8 x 103 ± 5 x 103 chez M. tuberculosis H37Rv/pVVM5pA (Figure 3A).

La figures 3A représente les graphes de croissances intracellulaires de M. tuberculosis H37Rv/pVV16 et M. tuberculosis H37Rv/MspA dans une culture de cellules eucaryotes: A. polyphaga. Ces données indiquent une diminution d'environ deux logsde la croissance intracellulaire de M. tuberculosis H37Rv/pVVM5pA par rapport à la souche M. tuberculosis H37Rv/pVV16, soit une diminution d'environ 99% du nombre de bactéries/mi de culture. Exemple 3. Croissance de Mycobacterium tuberculosis exprimant MspA en co-culture avec des macrophages humains (hMdMs) ou macrophages de souris (BMDMs): 1) Protocole expérimental : Les BMDMs [24] et les hMdMs isolées à partir des leukopacks (Etablissement Français du Sang, Marseille, Manière) par un gradient Ficoll (MSL, Eurobio, Courtaboeuf, Manière) différenciés ont été ensemencés séparément (105 cellules/puits) dans des plaques de culture de 24 puits en milieu RPMI 1640 contenant 10% de FCS. Les BMDMs et les hMdMs ont été infectés séparément par M. tuberculosis, M. tuberculosis H37Rv/pVV16 et M. tuberculosis H37Rv/pVVM5pA pendant 24 heures, puis les macrophages ont subi un lavage pour éliminer les mycobactéries libres avant d'être incubés pendant différentes périodes de temps dans du milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum de veau manière (FCS). Comme contrôles, chaque type cellulaire ainsi que les mycobactéries ont été cultivées séparément. Détermination du nombre des mycobactéries intracellulaires (UFC): A un temps donné, les cellules infectées ont été lysées avec 0,1% de dodécyl sulfate de sodium (SDS) pendant 30 min puis passées à travers une aiguille de calibre 26 pour assurer leur lyse complète. Le lysat (500pL) a été lavé trois fois avec du PBS, étalé sur milieu solide 7H10 (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Manière) et incubé pendant 15 jours à 37°C afin de déterminer le nombre de colonies des mycobactéries intracellulaires (UFC). Toutes les expériences ont été réalisées en triple exemplaire. 2) Résultats: En utilisant des macrophages BMDM comme cellules eucaryotes, les inventeurs ont observé que les deux souches M. tuberculosis H37Rv/pVV16 et M. tuberculosis H37Rv/pVVM5pA ont survécu tout au long le temps de l'expérience (14 jours). Les inventeurs ont observé qu'entre le 4è" et le 14è" jour la souche contrôle H37Rv/pVV16 a cru significativement plus que la souche qui exprime MspA (p 0,05) (Figure 3B). Au 14ème jour, le nombre de colonies était de 1 x 106 ± 7 x 105 de M. tuberculosis H37Rv/pVV16 contre 4 x 105 ± 1 105 chez M. tuberculosis H37Rv/pVVMspA (p 0,05). Co-culture de M. tuberculosis transformé ou non transformé avec des macrophages humains.

En utilisant des macrophages hMdM comme cellules eucaryotes, les inventeurs ont observé qu'à partir du 4ème jour et jusqu'à la fin de l'expérience, la souche contrôle M. tuberculosis H37Rv/pVV16 a cru significativement plus que la souche qui exprimait MspA (p 0,05) (Figure 3C). Au 14 jour, le nombre de colonies était de 2 x 104 ± 2 x 103 chez M. tuberculosis H37Rv/pVV16 contre 5 x 103 ± 7 102 chez M. tuberculosis H37Rv/pVVM5pA. En conclusion, ces résultats indiquent que l'expression de la porine MspA chez M. tuberculosis entraine une difficulté pour la bactérie à se multiplier dans les 3 types des cellules eucaryotes testées par rapport à la souche de contrôle. Les figures 3B et 3C représentent les graphes de croissances intracellulaires de M. tuberculosis H37Rv/pVV16 et M. tuberculosis H37Rv/MspA dans différentes cultures de macrophages: BMDMs (fig.3B) et hMdMs (fig.3C).

Ces données indiquent une diminution d'environ un logde la croissance intracellulaire de M. tuberculosis H37Rv/pVVM5pA par rapport à la souche M. tuberculosis H37Rv/pVV16, soit une diminution d'environ 90% du nombre de bactéries/mi de culture. Exemple 4. Croissance de Mycobacterium tuberculosis exprimant MspA en modèle animal. 1) Protocole expérimental : Le travail avec des animaux a été réalisé dans un laboratoire NSB 3 après approbation de l'échelon local du comité d'éthique pour l'expérimentation chez les animaux. Des souris Balb/c de 6 à 8 semaines (10 par groupe) ont été infectées par voie intrapéritonéale par 100 pL de culture bactérienne. Deux inoculums différents de chacune des souches ci-dessus (sauvage souche H37Rv ATCC 27294 et souche mutée M. tuberculosis H37Rv/pVVM5pA) ont été utilisées: 1 X 107 UFC/mL et 1 X 105 UFC/mL. Comme contrôle, un groupe de souris à été infecté par 100 pL de PBS stérile. Le poids, la performance et la survie des souris ont été suivis pendant 1 mois. 2) Résultats : Les données actuelles sont que les souris infectées avec la souche modifiée selon l'invention ont moins de troubles de comportement et grossissent plus vite que les souris infectées avec la souche sauvage de M. tuberculosis (figure 4). L'examen des souris infectées a été réalisé selon un protocole publié par d'autres chercheurs [3]. Dix semaines après infection, toutes les souris inoculées avec la souche mutée M. tuberculosis H37Rv/pVVM5pA ont survécu, alors que celles inoculées avec la souche sauvage-type montraient une mortalité de 50%. Cette survie était corrélée avec un nombre très bas d'unités de formation de colonies (UFC) de M. tuberculosis H37Rv/pVVM5pA dans les poumons. Les souris inoculées avec la souche mutée M. tuberculosis H37Rv/pVVM5pA ont développé peu de lésions tissulaires comportant de petits granulomes. Dans la rate, le dénombrement des mycobactéries a montré une diminution significative du nombre de UFC pour la souche mutée M. tuberculosis H37Rv/pVVM5pA par rapport à la souche sauvage M. tuberculosis H37Rv. L'immunogénicité testée dans les tests cellulaires était conservée.

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Claims (15)

1. REVENDICATIONS1. Méthode de transformation in vitro d'une souche d'une mycobactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis pour diminuer la croissance de ladite mycobactérie dans des cellules eucaryotes, caractérisée en ce que l'on ajoute un gène mspA capable d'exprimer un porine A de Mycobacterium smegmatis dans ladite mycobactérie.
2. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on insère dans ladite souche ledit gène mspA placé sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression dudit gène mspA dans une dite mycobactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis.
3. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'on introduit un plasmide contenant ledit gène mspA sous le contrôle d'un promoteur de l'expression dudit gène mspA dans une dite mycobactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis.
4. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite souche de dite mycobactérie du complexe Mycobacterium est une souche de l'espèce Mycobacterium tuberculosis
5. 5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite souche d'origine de Mycobacterium tuberculosis est la souche H37Rv.
6. 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit gène mspA comprend la séquence SEQ ID N°1.
7. 7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit gène mspA est sous le contrôle d'éléments d'expression du promoteur hsp60 consistant en SEQ.ID.N°4.
8. 8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que lesdites cellules eucaryotes sont des cellules de mammifère ou d'oiseau.
9. 9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules de macrophages.
10. 10. Souche transformée d'une mycobactérie du complexe Mycobacterium tuberculosfs dans laquelle on a inséré un gène mspA capable d'exprimer une porine MspA de Mycobacterium smegmatis dans ladite mycobactérie par la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une des revendications 1 à 9.
11. 11. Souche selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche transformée de Mycobacterium tuberculosis.
12. 12. Souche selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche déposée à la collection NCTC (UK), le 26 avril 2012, sous le numéro 12042601.
13. 13. Utilisation d'une souche transformée selon l'une des revendications 10 à 12, pour la fabrication d'un vaccin pour la prévention d'une infection par une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis chez un hôte comprenant des cellules eucaryotes, de préférence des macrophages.
14. 14. Utilisation d'une souche transformée Mycobacterium tuberculosis selon la revendication 13, pour la fabrication d'un vaccin pour la prévention de la tuberculose chez les mammifères ou oiseaux.
15. 15. Utilisation de la souche selon la revendication 14, pour la fabrication d'un vaccin pour la prévention de la tuberculose humaine.