CN109825515B - 一种牛分枝杆菌卡介苗低侵袭力突变株b2801 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物传染病防制技术领域，涉及一种牛分枝杆菌卡介苗低侵袭力突变株B2801，该突变株含有牛分枝杆菌卡介苗BCG_2658的突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，突变位点位于基因组2922763位点后，位于BCG_2658基因序列的748位点后，是一种新的结构基因和功能因。本发明的突变株为低侵袭力，低胞内存活能力，高生长速度，无索状结构及小菌落形态。本发明的突变株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018864。本发明分离的突变基因及其突变株可望在牛分枝杆菌致病机理、免疫机制研究和制备防制牛结核病药物中应用。

Description

一种牛分枝杆菌卡介苗低侵袭力突变株B2801

技术领域

本发明属于动物传染病防制技术领域，具体涉及一种牛分枝杆菌卡介苗低侵袭力突变株B2801，该突变株含有牛分枝杆菌卡介苗BCG_2658的突变体基因，相较于野生株，本发明的突变株为低侵袭力，低胞内存活能力，高生长速度，无索状结构及小菌落形态。

背景技术

牛结核病是多种动物和人共患的一种慢性消耗性人畜共患病，给世界养牛业带来了巨大的经济损失。据OIE报道，在2014-2015年间，通过世界动物健康信息系统上报的180个成员国中，仅7个成员国报道在牛群中无牛结核病存在。牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis,M.bovis)是导致牛结核病的主要病原菌，它与人结核病的主要致病菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)在基因水平上有99.95％的同源^[1]，因此感染谱相互交叉，两者几乎可以感染所有的脊椎动物，包括人。正因如此，目前用于预防人结核病的唯一官方疫苗就是牛分枝杆菌的致弱菌株—牛分枝杆菌卡介苗(Mycobacterium bovisBacille Calmette-Guerin，M.bovis BCG)。

牛分枝杆菌卡介苗的野生株为牛分枝杆菌，经实验室多次连续传代培养后自然丢失其编码毒力因子的RD1区后所形成。1921年法国开始将BCG作为人结核病的预防性疫苗，此后逐渐延伸到全球。迄今为止仍是用来预防人结核病的唯一获得许可使用疫苗。部分国家也用来预防动物结核病。然而，虽然卡介苗毋庸置疑的拯救了数以万计的生命，但对许多特殊群体尤其是免疫低下群体(如艾滋病人)而言，卡介苗不仅无法实现其免疫保护功能，反而加速了结核病的发生。为解决这一问题，越来越多的学者致力于开发更为安全有效的结核病疫苗，但至今却仍没有优于卡介苗的疫苗问世。因此，从不同角度探讨开发出不影响卡介苗保护效力，且针对免疫低下群体更为安全的卡介苗具有十分重要的意义。

分枝杆菌属的毒力相关因子包括侵袭力、胞内存活能力及索状结构等。通过缺失毒力相关因子来降低卡介苗的毒力是制备安全疫苗的重要研究方向。

侵袭是细菌感染宿主细胞、激发免疫学反应的重要一步。在分枝杆菌感染过程中，细菌最先被吸入肺泡腔，并与肺泡巨噬细胞互作，随后通过一系列通路或方式实现对宿主细胞侵袭^[2]。侵袭力也因此成为了细菌的毒力相关因子，直接影响着细菌的毒力强弱，并与细菌的扩散密切相关^[3,4]。当细菌侵入细胞，或细胞吞噬细菌后，细菌的胞内存活能力则可用来影射细菌毒力的大小。

分枝杆菌可能有不同的菌落表型，其索状结构形成程度决定了细菌的光滑和粗糙程度，从而影响了细菌的毒力。如脓肿分枝杆菌的光滑型被认为不具备侵袭能力且能够形成生物膜，而粗糙型则具有更强的侵袭能力，并且不能形成生物膜^[5]。索状因子可能是导致细菌呈蜿蜒索状排列的重要因子，也是卡介苗细胞壁糖脂中的一种潜在的炎性刺激因子^[6]，能影响细胞呼吸，抑制白细胞游走和引起慢性肉芽肿。在结核感染中起着重要的作用。

由侵袭相关基因所编码的侵袭相关蛋白直接影响着细菌的侵袭能力。因此，侵袭相关基因的筛选及鉴定，不仅有助于结核分支杆菌与宿主细胞互作机制的研究，更为新型卡介苗的研发奠定了重要的基础。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一株重要的牛分枝杆菌低侵袭力突变体菌株(在本发明中简称为突变株)B2801，该突变株涉及的基因为BCG_2658，相对于野生型牛分枝杆菌呈现明显的低侵袭能力、低胞内存活能力、高生长速度及低索状结构形成能力，所示性状与所插入失活基因的毒力相关。

为了实现本发明的目的，申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原学分室从牛分枝杆菌卡介苗基因缺失突变体库中筛选得到一株侵袭能力显著降低的菌株B2801，该突变株含有BCG_2658基因，编码一种保守的假想蛋白。经验证，在感染A549细胞过程中，突变菌株侵袭能力显著降低，胞内存活能力下降。在7H9培养基中，该突变菌株生长速度显著快于野生菌株。在7H11培养基中，该突变菌株单菌落索状结构较野生菌株显著消失。突变菌株与突变基因的关系研究显示突变菌株所述表型与失活基因BCG_2658的毒力相关。侵袭是细菌实现感染的重要步骤，病原菌毒力能够直接影响着宿主的免疫反应水平。因此，牛分枝杆菌卡介苗B2801突变株的成功构建及其所涉及基因BCG_2658相关功能的研究将对阐明牛分枝杆菌属成员的相关致病机制及开发更为安全有效的疫苗具有重要的参考价值。

本发明的具体技术方案如下所述：

申请人所用的牛分枝杆菌卡介苗巴斯德株BCG【美国模式培养物保藏所(ATCC)：35734】为美国俄勒冈州立大学Luiz Bermudez教授馈赠。本发明的前期工作包括对保藏的牛分枝杆菌卡介苗巴斯德株的复苏及培养。

本发明以牛分枝杆菌卡介苗巴斯德株(ATCC：35734)为野生菌株，利用具有温敏特性的噬菌体MycoMarT7，将Himar 1转座子转化到牛分枝杆菌卡介苗中，利用卡那霉素做抗性筛选标志，对突变菌株进行筛选，从而成功构建突变体库。本发明利用细胞侵袭模型从突变体库中筛选出侵袭能力降低的突变株，得到了侵袭能力降低显著的BCG突变菌株B2801(BCG::Tn 2658)，申请人将该突变株命名为Mycobacterium bovis BCG Pasterur B2801，于2018年12月6日送交中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2018864。将本发明筛选的突变株B2801与牛分枝杆菌卡介苗野生株分别接种于7H9培养基中，进行胞内存活能力及生长曲线检测，结果显示突变株B2801具有低存活能力，且在对数生长期生长迅速。将突变株B2801与牛分枝杆菌卡介苗野生株分别接种于7H11培养基中，菌落形态观察显示突变株呈现小菌落，且索状结构明显消失。

本发明构建的突变菌株涉及基因为BCG_2658，该基因编码保守型假想蛋白，尚未检索到到相关文献或数据库报道该基因的功能。

本发明具有以下优点：

1、本发明的B2801菌株是发明人从牛分枝杆菌卡介苗突变体库中筛选获得的侵袭能力降低的突变株。

2、本发明的B2801菌株已被发明人证实相对于于牛分枝杆菌野生菌株呈现显著的胞内低存活能力。

3、本发明的B2801菌株已被发明人证实相对于牛分枝杆菌野生菌株呈现显著的生长迅速表现。

4、本发明的B2801菌株已被发明人证实相较于牛分枝杆菌野生菌株呈现显著的索状结构消失表型。

5、本发明所涉及的BCG_2658基因为一个新基因，该基因具有侵袭功能，能够增强细菌的胞内存活，降低生长速度，并能够编码索状结构。

更详细的技术方案请参见《具体实施方式》。

附图说明

图1：是本发明的牛分枝杆菌卡介苗侵袭能力改变突变菌体高通量筛选部分结果。附图标记说明：图1中A-F图分别是对突变体库中不同突变体进行筛选的结果，由于篇幅所限，仅对其中部分结果进行了展示。图1中的F图中的方框所示为低侵袭能力突变株B2801。整个实验中的“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。

图2：是本发明牛分枝杆菌卡介苗突变株B2801感染A549细胞后侵袭能力定量检测分析图。“***”表示P<0.001。B2801相较野生株侵袭能力显著下调。

图3：是本发明牛分枝杆菌卡介苗突变株B2801所涉及BCG_2658基因的核苷酸序列(如序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列一致)。

图4：是本发明牛分枝杆菌卡介苗突变株B2801所涉及基因BCG_2658的核苷酸序列(如序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列一致)。其中在该基因的748位点、基因组2922763位点后发生转座子插入失活。

图5：是本发明牛分枝杆菌卡介苗突变株B2801感染A549细胞后胞内存活能力定量检测分析图。附图标记说明：“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。感染4h后B2801株胞内存活能力显著高于野生株。12h后无差异。

图6：是本发明牛分枝杆菌卡介苗在7H9培养基中生长曲线分析图。附图标记说明：“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。感染12-24d期间，B2801生长速度显著高于野生株。

图7：是本发明牛分枝杆菌卡介苗菌落形态图，附图标记说明：图7中的A图为野生菌株BCG，图7中的B图为突变子。箭头所示菌落中心B2801株相较野生株褶皱明显减少。

具体实施方式

对序列表的说明：

SEQ ID NO:1是本发明分离的牛分枝结核杆菌突变体基因BCG_2658基因的核苷酸序列。

实施例1：牛分枝杆菌卡介苗低侵袭力突变体的筛选和鉴定

1.1牛分枝杆菌低侵袭力突变体高通量筛选

将牛分枝杆菌卡介苗突变体库中克隆子逐一转移至7H9液体培养基(7H9液体培养基购自BD公司)中培养，利用A549细胞(美国俄勒冈州立大学Luiz Bermudez教授馈赠)感染模型对牛分枝杆菌卡介苗突变体库进行高通量筛选。将A549细胞在12孔细胞培养板中培养，待长成单层并达到2×10⁵个/孔后，按照感染比10:1加入细菌，于37℃、5％CO₂培养箱中作用1h后加入庆大霉素(终浓度100μg/ml)杀死胞外细菌，充分洗涤后用Triton X-100(Bio-Rad公司)进行裂解细胞，收集胞内菌涂布7H11固体(购自BD公司)平皿，于37℃、5％CO₂培养箱中培养约15天。通过细菌计数发现，64株突变子侵袭能力相较野生株BCG发生了显著变化，其中28株表现为侵袭能力降低，36株表现为侵袭能力增强(图1)。

1.2牛分枝杆菌卡介苗低侵袭力突变体定量检测分析

为了验证1.1步骤中结果，对侵袭能力降低的28株突变子进一步进行了定量检测分析。将A549细胞按照2×10⁵个/孔铺至12孔细胞培养板，利用感染比为10:1将初筛的突变体逐一接种至A549细胞中，设置野生株卡介苗为对照。将突变体与A549细胞在37℃、5％CO₂培养箱中作用1h后加入庆大霉素(终浓度100μg/ml)杀死胞外细菌，充分洗涤后裂解细胞，利用菌落计数法定量测定突变体菌落数。结果显示，在28株突变子中，有10株具有稳定的侵袭能力，在两次试验中均表现为侵袭能力降低。其中，本发明的突变株B2801与牛分枝杆菌野生株相比侵袭能力降低了22倍，差异达极显著(图2)，进一步对其功能进行验证。

同时，申请人将该突变菌株命名为Mycobacterium bovis BCG Pasterur B2801，于2018年12月6日送交中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2018864。

1.3对B2801菌株突变基因的鉴定

利用常规的CTAB法抽提牛分枝杆菌卡介苗B2801突变体基因组DNA，对Himar1转座子与牛分枝杆菌卡介苗基因组连接处进行测序，将测序结果与牛分枝杆菌卡介苗全基因组序列进行比对，结果显示，B2801所涉及基因为BCG_2658(图3)其核苷酸序列如序列表SEQID NO:1所示，转座子的插入位点位于基因组2922763位点后，以及位于BCG_2658基因748位点后(图4)。因此申请人将该突变子命名为BCG::Tn 2658。

实施例2：牛分枝杆菌卡介苗低侵袭力突变体胞内存活能力的检测

为了验证突变体的胞内存活能力，将A549细胞按照2×10⁵个/孔铺至12孔细胞培养板，利用感染比为10:1将B2801突变株接种至A549细胞中，设置牛分枝杆菌野生株卡介苗为对照。将突变体B2801与A549细胞在37℃、5％CO₂培养箱中作用1h后弃上清，加入磷酸盐缓冲液(0.01M,pH 7.4PBS,Hyclone公司)充分洗涤3遍后加入庆大霉素(终浓度100μg/ml)杀死胞外细菌，再放置37℃、5％CO₂培养箱中培养，此时记为感染0h。当感染4h、12h、及24h后用PBS充分洗涤，裂解细胞后利用菌落计数法定量测定突变体菌落数。结果显示，感染4h后B2801突变株胞内存活能力相较野生株显著降低2倍(P<0.01)。12h后两者无显著差异(图5)。

实施例3：牛分枝杆菌卡介苗生长曲线检测

取牛分枝杆菌卡介苗野生株和突变株B2801以1:100(体积比)的比例接种7H9液体培养基中，静置于37℃、5％CO₂培养箱中连续培养27天，每3天取适当菌液测量OD₆₃₀值，结果显示突变菌株在对数期的生长速度显著高于野生菌株(图6)。相较于野生株，突变株B2801在生长第12天、15天、18天、21天及24天分别上升1.2、1.1、1.2、1.1及1.1倍。统计学差异显著。暗示了突变株B2801基因具有降低细菌生长速度的功能。

实施例4：牛分枝杆菌卡介苗的形态学观察

将培养至对数末期的牛分枝杆菌卡介苗野生株和突变株B2801分别稀释适当倍数，涂布于7H11固体培养基上，于37℃、5％CO₂培养箱中培养14天后观察卡介苗菌落形态，结果显示B2801突变菌株菌落显著小于野生菌株，相对于野生株菌落而言，突变菌株索状结构明显消失(图7)。依照已发表文章数据结果，菌落的索状结构与细菌毒力相关，不同菌株间存在差异。索状结构直接影响着细菌的毒力。暗示B2801突变株相对于野生株具有较低毒力，即BCG_2658基因具有增强细菌毒力的功能。

综上，本发明的牛分枝杆菌突变株B2801相对于牛分枝杆菌野生菌株对宿主细胞的侵入能力呈明显下降。导致了在感染4h后突变株B2801的存活比牛分枝杆菌野生株减少。这是由于该突变株的快速生长能力，在感染后期(如12-24h)，两者胞内存活数量达到一致。本发明进一步确定了突变株B2801胞内存活数量的减少是由于侵袭能力降低所导致。从形态学上看，索状结构的明显降低也从另一方面反应了突变株毒力的下降。侵袭力和索状结构均为细菌的毒力相关因子。众所周知，侵袭力的降低及索状结构的形成与细菌的毒力相关。本发明所筛选出的突变株侵袭能力和索状结构形成能力均明显下降，其毒力相较野生株也有明显降低，因此有望在结核病疫苗的制备方面具有广泛的应用价值。

名词术语说明：

牛分枝杆菌卡介苗B2801涉及基因以BCG_2658表示。

牛分枝杆菌卡介苗B2801基因突变株以突变株B2801或B2801突变株表示。

主要参考文献：

1.Garnier T,Eiglmeier K,Camus JC,et al.The complete genome sequenceof Mycobacterium bovis.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 2003；100(13):7877-7882；

2.Zhang Y,Li J,Li B,Wang J,Liu CH.Mycobacterium tuberculosis Mce3Cpromotes mycobacteria entry into macrophages through activation of beta2integrin-mediated signalling pathway.Cellular microbiology 2018；20(2)；

3.Ashiru OT,Pillay M,Sturm AW.Mycobacterium tuberculosis isolatesgrown under oxygen deprivation invade pulmonary epithelial cells.Anaerobe2012；18(4):471-474；

4.Ashiru OT,Pillay M,Sturm AW.Adhesion to and invasion of pulmonaryepithelial cells by the F15/LAM4/KZN and Beijing strains of Mycobacteriumtuberculosis.Journal of medical microbiology 2010；59(Pt 5):528-533；

5.Clary G,Sasindran SJ,Nesbitt N,et al.Mycobacterium abscessus Smoothand Rough Morphotypes Form Antimicrobial-Tolerant Biofilm Phenotypes but AreKilled by Acetic Acid.Antimicrobial agents and chemotherapy 2018；62(3)；

6.Toyonaga K,Miyake Y,Yamasaki S.Characterization of the receptorsfor mycobacterial cord factor in Guinea pig.PloS one 2014；9(2):e88747。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种牛分枝杆菌卡介苗低侵袭力突变株B2801

<141> 2019-02-22

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1299

<212> DNA

<213> 牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1299)

<400> 1

atgcaagtgg tcaacgtggc tacgctgccg gggattgtcc gggcctcgta tgcgatgccc 60

gatgtgcact ggggatatgg tttcccaatc ggcggcgtgg ccgcaaccga cgtcgacaat 120

gatggagtcg tttccccagg cggtgtcggc ttcgatattt cgtgcggcgt aagactcttg 180

gtcggcgaag ggctggaccg cgaggagctg caaccacggt tgccggcggt catggaccgg 240

cttgatcgcg cgataccgcg cggagtgggc acggcgggtg tgtggcgact acccgaccgg 300

aacacgctgc aggaggtgct caccggtggt gcccggtttg cggtggaaca ggggcatggc 360

gtcgcgctag acctcgagcg gtgcgaagac ggcggtgtga tgacaggagc ggacgcggcc 420

aaaatcagtg accgggccct ccaacgcggg cttgggcaga tcggcagcct tggctcgggc 480

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atgggtctgg cggaagggac cgtctgcgtg atgatccaca ccggctcacg gggcctgggc 600

catcagatct gcacggatca cgtccgccag atggaacaag ccatgggccg atacggaatc 660

gcggtgcccg atcgccaatt ggcttgtgtg ccggtgcact cccccgatgg gcaggcctat 720

ctcgccgcga tggcggcggc ggccaactac ggacgcgcca accgccaact gctgaccgag 780

gcgacgcgtc gtgtgttcgc tgatgcaacc ggaacacctc tggacctgct ctacgacgtg 840

tcgcacaacc tggccaagat cgagacgcat ccgatcgacg gtcagctgcg ctcggtgtgc 900

gtgcaccgca agggcgccac ccgctcgctg ccgccgcacc atcacgagct gccggccgaa 960

ctggcagcgg tcggccaacc cgtgctgata cccgggacga tgggtacggc gtcatatgtg 1020

cttgccgggg tcaccggcaa cccggcgttc ttttccaccg cgcatggtgc tgggcgggta 1080

ctgagccgtc accaggccgc ccgccacacc agcggtgaag cgatacgcgc cagcctcgca 1140

aaacgtggca tcatcgtccg cggtacctct cgtaggggta tcgccgagga aaagccggag 1200

gcctacaaag acgtcgacga ggtcatcgaa gccagccatc agagtggcct cgcgcgcaaa 1260

gtggctcgcc ttgttccctt gggctgtgtc aaaggatga 1299

Claims (2)

1.一株从牛分枝杆菌卡介苗中筛选的突变株B2801，其特征在于，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018864。

2.权利要求1的所述的突变株在制备防制牛结核病药物中的应用。

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