MX2014010893A

MX2014010893A - Composicion celular inmunoestimulante activada para terapia de infecciones.

Info

Publication number: MX2014010893A
Application number: MX2014010893A
Authority: MX
Inventors: Irene Ginis; Alan Smith; Marina Bubis; Mitchell Shirvan
Original assignee: Macrocure Ltd
Priority date: 2012-03-15
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2015-06-23
Also published as: CA2864838A1; JP2015509974A; RU2014140795A; US20150071892A1; WO2013136191A1; IN2014DN08407A; EP2825182A1

Abstract

Se describen métodos para elaborar composiciones celulares inmunoestimulantes activadas, composiciones celulares inmunoestimulantes activadas y métodos para usar dichas composiciones para estimular las respuestas inmunitarias terapéuticas a organismos infecciosos.

Description

COMPOSICIÓN CELULAR INMUNOESTIMULANTE ACTIVADA PARA TERAPIA DE INFECCIONES REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.° 61/611,180 presentada el 15 de marzo de 2012, la cual se incorpora a la presente mediante referencia.

CAMPO Y ANTECEDENTES La presente invención se refiere a composiciones celulares inmunoestimulantes activadas, métodos para preparar estas composiciones y usos de las composiciones para tratar afecciones que pueden beneficiarse de la inmunoestimulación, como la infección.

Los antigenos virales o bacterianos se escinden dentro de las células infectadas en péptidos pequeños que se presentan a las células inmunitarias como un complejo con las principales moléculas de histocompatibilidad de clase I (MHC de clase I), también denominadas antigenos leucocitarios humanos (HLA de clase I, p. ej., HLA A, B o C). El complejo de péptidos-MHC de clase I también es reconocido por el complejo del receptor de linfocitos T (TCR) de linfocitos T citotóxicos (CTL), que son linfocitos T CD8+. La interacción del TCR con el complejo de péptidos-MHC I provoca la liberación de sustancias de los CTL (perforina, granzimas y granulisina) que destruyen las células infectadas (Mullbacher et ál. Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A.1999, 96:13950).

La respuesta inicial de los CTL tiene una corta duración y requiere apoyo de amplificación por parte de linfocitos T auxiliares (Th) CD4+ para poder continuar. La diferenciación y proliferación de linfocitos Th tiene lugar a través de su interacción con células presentadoras de antigenos (APC) profesionales, como macrófagos o células dendriticas (DC) intersticiales (Heath et ál., Nat Imunol. 2009; 10:1237- 1244). Las DC expresan diversos receptores para reconocer virus como los receptores tipo Toll (p. ej., TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8) y lectinas tipo C (p. ej., DEC-205, DCIR, CLEC9A) (Altfeld et ál., 2011) (Altfeld et ál., Nat Rev Immunol. marzo de 2011; 11(3):176-86).

Las APC absorben virus, bacterias y células apoptóticas infectadas, procesan antigenos del material absorbido mediante escisión de sus proteínas en péptidos pequeños, luego presentan los péptidos a linfocitos T vírgenes. El proceso es similar a la estimulación de CTL mediante MHC de clase I + péptido, pero los linfocitos T CD4+ reconocen péptidos presentados en el contexto de MHC de clase II (p. ej., HLA-DR). Luego de reconocer los complejos de péptidos-MHC de clase II mediante TCR, los linfocitos T adquieren funciones Th y producen IL-2, una citocina que, a su vez, amplifica la respuesta de los CTL e induce el desarrollo de linfocitos T de memoria para lograr una inmunidad continua (Keene JA, 1982).

Se cree que la estimulación de linfocitos T tiene lugar en al menos dos etapas. (Marelli-Berg FM, 2007; Chambers CA 2001). En la primera etapa (señal 1), los complejos de MHC/péptido interactúan con los TCR. Esta etapa no es suficiente para estimular completamente los linfocitos T. Por el contrario, se necesita una segunda interacción entre una de las moléculas co-estimulantes expresadas en APC (como CD86, CD83, CD80 y CD40) y un ligando correspondiente en los linfocitos T (señal 2). Los linfocitos T que reciben la señal 1 en ausencia de la señal 2 no pueden adquirir funciones auxiliares (Chappert & Schwartz, 2010).

La interacción de linfocitos T auxiliares vírgenes con APC como DC polariza los linfocitos Th en subconjuntos Thl y Th2, que difieren en los patrones de citocinas que producen. Los linfocitos Thl producen citocinas como el interferón gama y la IL-2 que activan la proliferación de CTL. Los linfocitos Th2 producen las citocinas IL-4, IL-6, IL-10 e IL-13. Las citocinas Thl son generalmente más beneficiosas en la eliminación de infecciones. Por ejemplo, el INF-gama es fundamental para la inmunidad contra los patógenos intracelulares (Schoenborn & Wilson, 2007). (Schoenborn et ál., Adv. Immunol. 2007, 96: 41-101). Los defectos en las respuestas proinflamatorias de Thl, que llevan a perfiles de citocina Th2 sesgados, tienen efectos perjudiciales para el resultado de las infecciones. (Netea et ál, Antimicrob. Agents Chemother. 2005; 49(10):3991-96 (2005); Palucka & Banchereau, Curr Opin Immunol.2002, 14(4):420-31).

De la misma forma que los linfocitos Th, los fenotipos de monocitos/macrófagos se polarizan en un proceso que depende del equilibrio entre las citocinas Thl/Th2. La nomenclatura de estas células polarizadas refleja la nomenclatura de Thl y Th2 y, de la misma forma que los linfocitos Thl y Th2, los macrófagos MI y M2 producen diferentes patrones de citocinas. Los macrófagos MI producen en su mayoría IL-12, IL-23, TNFa, IL-1, IL-b, mientras que los macrófagos M2 producen niveles elevados de IL-10 e IL-13 (Cassetta L, 2011; Benoit et ál., J Immunol. 2008. 181(6):3733-9). Los macrófagos MI también expresan niveles elevados de HLA-DR, mientras que los macrófagos M2 expresan niveles elevados de antigeno CD163.

Los macrófagos MI y M2 completamente polarizados son los extremos de un continuo de estados funcionales.

Otra APC que también se piensa que se diferencia de los monocitos de sangre periférica es la célula dendritica (DC) mieloide. Las DC maduras y activadas son APC extremadamente potentes. La maduración de DC está asociada con la sobrerregulación de moléculas de MHC, moléculas co estimulantes (CD86, CD83 CD80, CD40), moléculas de adhesión, como CDllb., CDllc y CD54, y el receptor de quimiocinas CCR7 (Alvarez D, 2008; Banchereau et ál., Annu Rev Immunol.2000; 18:767-811).

Este último permite que las DC migren desde el tejido periférico a través de las paredes de los vasos sanguíneos hasta las zonas de los linfocitos T (Forster R, 2008). La maduración de DC no solo asegura la expresión de moléculas relevantes para la estimulación de linfocitos T, sino que también permite que las DC alcancen los compartimientos anatómicos apropiados en órganos linfoides secundarios de forma de poder presentar antígenos a linfocitos T vírgenes. Las señales cognadas de los linfocitos T activan adicionalmente las DC (Cavanagh LL, 2002).

Las DC mieloides maduras se caracterizan por su capacidad de producir IL-12 (Mariotti S, 2008). Debido a que la IL-12 promueve la polarización de Thl, se utilizan las DC que producen IL-12 en el desarrollo de vacunas (Trinchieri G: 2003).

Además de estimular las respuestas inmunitarias específicas para antígenos con capacidad de adaptación descritas anteriormente, las DC también inciden en la estimulación de inmunidad innata (no limitada a las MHC). Estas células incluyen linfocitos citolíticos naturales (linfocitos NK) clásicos que no expresan TCR (células CD3-/CD56+) y linfocitos T citolíticos inducidos por citocinas (CD3+/CD56+). Las linfocitos NK pueden inducir directamente la apoptosis de células infectadas a través de la vía de perforina-granzima o mediante la expresión de ligandos del receptor de muerte como el ligando Fas (Bryceson YT, 2011). La IL-12 que produce DC puede inducir la proliferación de linfocitos NK (Walzer T, 2005). Las linfocitos NK también liberan citocinas que promueven la diferenciación de DC (Ferlazzo G, 2009). Las DC plasmacitoides producen grandes cantidades de interferones tipo I (IFN-a, IFN-b) en respuesta a la infección viral que incluye la infección por V1H. Los interferones tipo I estimulan las DC mieloides y los linfocitos NK de forma no específica, mediando la muerte de células infectadas con el virus (Trinchieri G> J Exp Med. 2010; 207(10):2053-63).

Por lo tanto, las DC maduras son un tipo celular importante en la generación tanto de respuestas inmunitarias con capacidad de adaptación (linfocitos T) e innatas (linfocitos NK, TNK) eficaces. En efecto, muchas investigaciones se han enfocado en la aplicación de vacunas basadas en DC como una terapia para las infecciones, en particular las infecciones crónicas, y hay diversos ensayos clínicos en proceso para utilizar células dendríticas en pacientes infectados con el virus de inmunodeficiencia humana (V1H) (Patham et ál., Curr Med Chem. 2011 18(26):3987-94). Por consiguiente, hay una gran necesidad de contar con composiciones que comprenden células dendríticas plenamente maduras y otras células inmunitarias activadas para el tratamiento de afecciones que se pueden beneficiar de la inmunoestimulación, como una terapia durante la infección.

COMPENDIO DE ALGUNAS MODALIDADES La presente invención se refiere a composiciones celulares inmunoesti ulantes activadas, métodos para preparar estas composiciones y usos de las composiciones para tratar afecciones que pueden beneficiarse de la inmunoestimulación, como la infección.

Por consiguiente, en un aspecto la invención se dirige a métodos para tratar una infección viral que comprenden administrar a un sujeto infectado una composición de células dendriticas maduras, linfocitos T auxiliares activados, linfocitos T citoliticos y al menos otro tipo de célula leucocitaria.

En otro aspecto, la invención se dirige a métodos para tratar una infección viral, donde los métodos comprenden: (a) incubar leucocitos en condiciones de tiempo y temperatura adecuadas para activar los leucocitos, (b) cultivar los leucocitos activados en un medio de soporte en condiciones de tiempo y temperatura que inducen la maduración de células dendriticas en la composición, y (c) introducir la composición que comprende las células dendriticas al sujeto para tratar de esa forma la infección viral.

En aun otro aspecto, la invención se dirige a métodos para tratar una infección viral, donde el método comprende (a) incubar leucocitos no inactivos en un medio de soporte en condiciones de tiempo y temperatura que inducen la maduración de las células dendriticas en la composición, y (b) introducir la composición que comprende las células dendriticas al sujeto para tratar de esa forma la infección viral .

En aun otro aspecto, la invención se dirige a métodos para tratar una infección viral, donde el método comprende: (a) elaborar una composición que comprende células dendriticas maduras i) proporcionando leucocitos, ii) permitiendo que los leucocitos pasen de un estado inactivo a un estado activo manteniendo los leucocitos a temperatura ambiente durante alrededor de 8 a 20 horas, iii) sometiendo los leucocitos a choque hipo-osmótico, y (iv) incubando los leucocitos sometidos al choque durante 36 horas hasta 14 dias en un medio de soporte para lograr asi una composición que comprende DC maduras, y (b) introducir la composición que comprende las células dendriticas en el sujeto para tratar asi la infección viral.

En aspectos similares, la invención se dirige al uso de cualquiera de las composiciones de la invención en la elaboración de un medicamento para tratar una infección viral.

En otros aspectos similares, la invención se dirige a cualquiera de las composiciones de la invención para tratar una infección viral.

En algunas modalidades de estos aspectos de la invención, la composición que comprende células dendriticas se expone a al menos un epitopo peptidico del virus.

En algunas modalidades de estos aspectos de la invención, la infección viral es una infección viral con virus de inmunodeficiencia humana (V1H), virus de herpes simple 1 (VHS 1), virus de herpes simple 2 (VHS2), virus de hepatitis C (VHC) o virus del papiloma humano (VPH).

En algunas modalidades de estos aspectos de la invención, la infección viral es una infección con V1H.

En algunas modalidades de estos aspectos de la invención, la infección viral es una infección crónica.

En otro aspecto, la invención se dirige a métodos para tratar una infección con un organismo infeccioso que comprenden administrar a un sujeto infectado una composición de células dendriticas maduras, linfocitos T auxiliares activados, linfocitos T citoliticos y al menos otro tipo de célula leucocitaria.

En otro aspecto, la invención se dirige a métodos para tratar una infección con un organismo infeccioso, donde el método comprende: (a) incubar leucocitos en condiciones de tiempo y temperatura adecuadas para activar los leucocitos, (b) cultivar los leucocitos activados en un medio de soporte en condiciones de tiempo y temperatura que inducen la maduración de las células dendriticas en la composición, y (d) introducir la composición que comprende las células dendriticas al sujeto para tratar de esa forma la infección viral.

En aun otro aspecto, la invención se dirige a métodos para tratar una infección, donde el método comprende (a) incubar leucocitos no inactivos en un medio de soporte en condiciones de tiempo y temperatura que inducen la maduración de las células dendriticas en la composición, y (b) introducir la composición que comprende las células dendriticas al sujeto para tratar de esa forma la infección.

En aun otro aspecto, la invención se dirige a métodos para tratar una infección con un organismo infeccioso, donde el método comprende: (a) elaborar una composición que comprende células dendriticas maduras i) proporcionando leucocitos, ii) permitiendo que los leucocitos pasen de un estado inactivo a un estado activo manteniendo los leucocitos a temperatura ambiente durante alrededor de 8 a 20 horas, iii) sometiendo los leucocitos a choque hipo-osmótico, y (iv) incubando los leucocitos sometidos al choque durante 36 horas hasta 14 dias en un medio de soporte para lograr asi una composición que comprende DC maduras, y (b) introducir la composición que comprende las células dendriticas en el sujeto para tratar asi la infección.

En aspectos similares, la invención se dirige al uso de cualquiera de las composiciones virales de la invención en la elaboración de un medicamento para tratar una infección con un organismo infeccioso.

En otros aspectos similares, la invención se dirige a cualquiera de las composiciones de la invención para tratar una infección con un organismo infeccioso.

En algunas modalidades de estos aspectos de la invención, la composición que comprende células dendriticas se expone a al menos un epitopo peptidico del organismo infeccioso.

En algunas modalidades de estos aspectos de la invención, la infección es una infección bacteriana.

En algunas modalidades de estos aspectos de la invención, la infección es una infección micótica.

En algunas modalidades de estos aspectos de la invención, la infección es una infección protozoaria.

En algunas modalidades de estos aspectos de la invención, la infección es una infección con una proteina priónica.

Una parte de los objetos y ventajas adicionales de las modalidades de la invención en su aplicación se incluye en la descripción que sigue y otra parte será evidente a partir de la descripción o se puede aprender mediante la puesta en práctica de la invención. Los objetos y las ventajas de las modalidades se manifestarán mediante los elementos y las combinaciones señaladas particularmente en las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos téenicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Si bien en la práctica o en la prueba de la presente invención se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la memoria descriptiva de la patente, incluyendo las definiciones. Adicionalmente, los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden ser taxativos.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La invención se describe en la presente únicamente a modo de ejemplo con respecto a los dibujos adjuntos. Haciendo referencia especifica a continuación a los dibujos de forma detallada, se resalta que la información que se muestra se proporciona a modo de ejemplo y solamente con fines ilustrativos. En este sentido, no se intenta mostrar los detalles estructurales de la invención más detalladamente de lo necesario para la comprensión fundamental de la invención. La descripción junto con los dibujos hará evidente para los expertos en la téenica cómo se pueden poner en práctica las diversas formas de la invención.

La figura 1 muestra marcadores de células dendriticas (DC) en monocitos expresados como un aumento múltiplo lueqo de la incubación a 37 °C durante 48 horas.

La figura 2 compara la expresión de los marcadores de DC antes y después de la incubación a 37 °C durante 48 h en condiciones de cultivo adherentes y no adherentes.

Las figuras 3A-3B comparan la expresión de CD8 en monocitos antes y después de la incubación a 37 °C durante 48 horas. La figura 3A presenta el % de células positivas para CD8. La figura 3B presenta la intensidad de fluorescencia media (IFM) de CD8.

Las figuras 4A-4B muestran la expresión del marcador de activación CD69 en los subconjuntos de linfocitos antes y después de la incubación a 37 °C durante 48 horas en presencia o ausencia del superantigeno, enterotoxina B de Staphylococcus aureus. La figura 4A muestra el % de células positivas entre todos los linfocitos, linfocitos T o células negativas para CD3. La figura 4B presenta la intensidad de fluorescencia media (IFM) de CD69 en células positivas en cada población.

La figura 5 muestra la expresión del receptor de IL-2 (CD25) en los subconjuntos de linfocitos antes y después de la incubación a 37 °C durante 48 horas en ausencia (48 h) y presencia (48 h SA) de superantigeno, enterotoxina B de Staphylococcus aureus.

Las figuras 6A-6C muestran la expresión de CD40 en monocitos antes y después de la incubación a 37 °C durante 48 horas en ausencia y presencia de superantigeno, enterotoxina B de Staphylococcus aureus. La figura 6A presenta el % de células positivas para CD40. La figura 6B presenta la intensidad de fluorescencia media. La figura 6C muestra el aumento múltiplo después de 48 horas de incubación.

La figura 7A muestra la producción de IL-12 antes y después de la incubación a 37 °C durante 48 horas. La figura 7B muestra la producción de IL-12 en ausencia y presencia de superantigeno, enterotoxina B de Staphylococcus aureus, antes y después de la incubación a temperatura ambiente (TA) o 37 °C durante 48 horas.

La figura 8 muestra el contenido de IL-2 en AICC y la producción de IL-2 mediante células lavadas de AICC suspendidas nuevamente en suero fresco luego de la incubación a 37 °C durante 48 horas en ausencia y presencia de superantigeno, enterotoxina B de Staphylococcus aureus.

La figura 9 muestra la producción de IFN-gama en presencia de superantigeno, enterotoxina B de Staphylococcus aureus, después de la incubación a 37 °C durante 48 horas y la producción de IFN-gama mediante células lavadas suspendidas nuevamente en suero fresco después de la incubación a 37 °C durante 48 horas en presencia de Enterotoxina B.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES Tal como se describe a continuación con más detalle, la presente invención se refiere a composiciones celulares inmunoestimulantes activadas (AICC), métodos para preparar AICC y métodos para utilizar AICC.

Una AICC de la invención incluye monocitos funcionalmente activos diferenciados en DC maduras, tal como muestra según los perfiles del marcador de la superficie celular, su capacidad para presentar antígenos como superantigenos a linfocitos T y su liberación de IL-12, un factor clave que promueve la polarización de Thl preferencial. También se activan los linfocitos T en las AICC. La interacción de las DC maduras con linfocitos T en una AICC en presencia de antígenos provoca la sobrerregulación del receptor de IL-2 en linfocitos T y la liberación de IL-2 e IFN-g. Cuando se exponen las DC en una AICC al antigeno, aumenta drásticamente la producción de IL-12. Por consiguiente, una AICC de la presente invención es una herramienta útil para la estimulación inmune. Por ejemplo, cuando se administra in vivo, una AICC puede cambiar el equilibrio de citocinas para favorecer las citocinas Thl (p. ej., interferones, IL-2), que activan la proliferación de CTL y facilita la eliminación de organismos infecciosos como virus y bacterias y la eliminación de células infectadas con esos organismos.

Sin limitarse por la teoría, una AICC de la invención polariza los monocitos/macrófagos en un fenotipo MI. Tal como se demuestra en los ejemplos de trabajo, la mayoría de monocitos/macrófagos en AICC expresa niveles elevados de HLA-DR y produce IL-12 y otras citocinas MI. Se sabe que las citocinas MI superan los efectos inhibidores sobre la inmunidad celular en el contexto de los entornos tumorales. Por consiguiente, las citocinas en una AICC también son útiles para superar los efectos inhibidores que pueden tener diversos organismos infecciosos.

Se pueden comprender mejor los principios y el funcionamiento de la presente invención con referencia a los dibujos y las descripciones adjuntas. Antes de explicar al menos una modalidad de la invención de forma detallada, se debe comprender que la invención no se limita en su aplicación a los detalles que se indican en la siguiente descripción o se ejemplifican en los ejemplos. La invención permite otras modalidades, asi como también su puesta en práctica de diversas formas.

Se debe comprender que la fraseología y la terminología utilizadas en la presente cumplen fines descriptivos y no deben interpretarse como taxativas. Adicionalmente, el término "alrededor de" tal como se usa con relación a cualquiera y todos los valores (incluyendo los extremos superiores e inferiores de intervalos numéricos) incluye un intervalo de desviación de +/- 0,5 % a +/- 20 % (y valores intermedios, p. ej., ± 1 %, ± 1,5 %, ± 2 %, ± 2,5 %, ± 3 %, ± 3.5 %, ± 4 %, ± 4,5 %, + 5 %, ± 5,5 %, ± 6 %, ± 6,5 %, ± 7 %, ± 7,5 %, ± 8 %, ± 8,5 %, ± 9 %, ± 9,5 %, + 10 %, ± 10,5 %, + 11 %, ± 11,5 %, ± 12 %, ± 12,5 %, ± 13, ± 13,5 %, ± 14 %, ± 14.5 %, ± 15 %, ± 15,5 %, ± 16 %, ± 16,5 %, ± 17 %, ± 17,5 %, ± 18 %, ± 18,5 %, ± 19 %, ± 19,5 % y ± 20 %).

I. Métodos para realizar una composición celular inmunoestimulante activada Los leucocitos requieren la activación mediante una respuesta inmunitaria. Tal como se usa en la presente, una composición celular inmunomoduladora activada se refiere a una composición que comprende al menos un tipo de leucocito activado. En este contexto, "activado" significa que una célula adquirió una o más características funcionales o fenotípicas de una célula activada. Los ejemplos de características de una célula dendrítica activada (o "madura") incluyen, de modo no taxativo, producción de IL-12, producción ausente o de bajo nivel de IL-10, expresión de una o más moléculas coestimulantes CD80, CD86, CD83, CD40 o CDlc (BDCA1), de una o más moléculas de adhesión como CD56, CDllb CDllc o IGSF4 (SynCam y Nectina-tipo-2) de uno o más receptores de lectina como CLEC9A (DNGR-1), de uno o más receptores de quimiocinas como CCR7, de uno o más receptores Toll como TLR2, TLR3, TLR4 o TLR7 o TLR8, de una o más proteínas endocomales como DC-LAMP, o de uno o más factores de transcripción como Id2, IRF8 o ICSBP; capacidad de activar linfocitos T vírgenes a través de la presentación de antígenos, y capacidad de inducir la diferenciación de células B en células que secretan anticuerpos (plasma). Los ejemplos de características de un linfocito T activado incluyen, de modo no taxativo, producción de uno o más de IL-2, IFN-gama, IFN-alfa o IFN-beta; expresión de IL-2R; sobrerregulación de marcadores de activación de linfocitos T como uno o más de CD69, CD71 (receptor de transferrina 1), CD28 o CD40L y la proliferación luego de la exposición al antígeno, función citotóxica o función auxiliar.

En una modalidad, se prepara una AICC a partir de sangre periférica. .La sangre periférica contiene generalmente no solo glóbulos rojos (RBC) y plaquetas, sino también leucocitos. Los leucocitos, también conocidos como "glóbulos blancos", incluyen monocitos (una célula "precursora" que se diferencia en macrófagos de diversos tejidos y células dendríticas), linfocitos (que incluyen linfocitos T, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales (NK) y linfocitos T citolíticos naturales (linfocitos T NK)) y granulocitos (que incluyen neutrófilos, basófilos y eosinófilos).

Si bien la sangre periférica entera es una fuente conveniente de leucocitos, en modalidades alternativas, se elabora una AICC utilizando leucocitos aislados de la sangre de una linea central, sangre del cordón umbilical, sangre de placenta, linfa, médula ósea o tejido linfoide, como ganglios linfáticos o bazo. Los leucocitos pueden elaborarse mediante leucoferesis. Por consiguiente, no se cree que la fuente de los leucocitos sea fundamental.

Cuando se utiliza sangre entera, los leucocitos se pueden separar parcialmente de los glóbulos rojos y las plaquetas preparando una "capa leucocitaria" usando separación de gradiente de densidad de los diferentes tipos celulares. Por consiguiente, en algunas modalidades, las cantidades de plaquetas y glóbulos rojos presentes en una AICC son menores que en la sangre entera.

Los materiales de partida para la producción de AICC se pueden obtener de fuentes autólogas o alogénicas. En una modalidad, se elabora una AICC de un paciente que se tratará eventualmente con la AICC, es decir, la fuente es autóloga.

En otras modalidades, se elabora una AICC de un individuo sin ser el receptor deseado de la AICC. En este caso, la fuente es alogénica.

En esas modalidades que implican materiales de partida alogénicos, estos se pueden obtener de forma conveniente de un banco de sangre. Las muestras se pueden analizar en el banco de sangre para determinar el tipo sanguíneo (ABO, Rh) o los alelos del antígeno de leucocito humano específico como, de modo no taxativo, A2, B12 y C3, anticuerpos irregulares de antígenos de glóbulos rojos y enfermedades que se transmiten mediante transfusión. Más específicamente, el análisis puede llevarse a cabo con anticuerpos usando un instrumento Abbott PRISM para detectar: Hepatitis B, C, V1H 1/2, VLTH y sífilis (-VHC; HbsAg; anti-V1H 1/2 0+; y anti-VLTH I/II). Las muestras también se pueden analizar para detectar VIH, VHC y VHB mediante métodos moleculares (análisis de NAT-ácido nucleico). El análisis molecular se puede lograr usando instrumentos comercialmente disponibles, p. ej., el sistema TIGRIS de Chiron o cualquier otro método que constituya una forma de análisis adecuada para dichas enfermedades.

En una modalidad que implica fuentes alogénicas, la muestra se obtiene de donantes con el mismo tipo sanguíneo que el destinatario pretendido de la AICC. En una modalidad, el o los pacientes donantes y destinatarios se pueden emparejar según uno o más tipos de alelos de HLA. De manera alternativa, las muestras de plasma se pueden obtener de donantes con sangre AB+ y los leucocitos se pueden obtener de donantes con sangre O-. Los donantes con sangre AB+ son donantes universales de plasma y los donantes con sangre O- son donantes universales de leucocitos. El plasma puede estar fresco, almacenado (p. ej., a 1-6 °C durante menos de 24 horas), seco o pre-tratado de otra forma (p. ej., plasma con patógenos-reducidos y plasma tratado con solvente/detergente (SD)). Independientemente de la fuente, todos los procesamientos necesarios de la o las muestras pueden llevarse a cabo sin necesidad de equipamiento altamente especializado.

En algunas modalidades, la composición celular inmunomoduladora activada se puede preparar a partir de volúmenes menores de muestras de sangre, con disminuciones proporcionales en volúmenes de todas las soluciones y uso de bolsas más pequeñas u otros recipientes de incubación. Adicionalmente, el uso de estos recipientes de incubación de diferentes tamaños proporciona AICC con composiciones similares. El uso de volúmenes menores proporciona a los médicos la capacidad de realizar extracciones de sangre de forma autónoma, sin utilizar el banco de sangre externo. Esto puede resultar útil al tratar pacientes con sistemas inmunitarios que en lo demás son saludables.

En algunas modalidades, un método para preparar una AICC comprende a) activar leucocitos humanos, b) incubar los leucocitos activados en una composición de incubación en condiciones de tiempo y temperatura para inducir la diferenciación y maduración de células dendriticas (DC) y asi producir una AICC. En otra modalidad, la etapa (b) también induce la activación de linfocitos.

En una modalidad, el método comprende adicionalmente poner en contacto la DC con un antigeno o péptido antigénico. En una modalidad, el antigeno o péptido antigénico se pone en contacto con la DC a medida que se diferencia y madura en la composición de incubación. Es decir, se agrega el antigeno o péptido antigénico durante una parte o toda la etapa de incubación (b). En una modalidad, el antigeno o péptido antigénico se pone en contacto con la DC luego de concluir la incubación en la composición de incubación. Es decir, el método comprende adicionalmente la etapa (c) donde el antigeno o péptido antigénico se agrega a la AICC durante un periodo de tiempo suficiente para cargar la DC con péptido antigénico.

En una modalidad, se utiliza una composición de leucocitos activados producida utilizando los métodos de WO 2010/100570 para preparar la AICC. En esta modalidad, la composición de leucocitos activados corresponde a la etapa (a) de la modalidad anterior del método.

En algunas modalidades, el método para preparar una AICC comprende a) aislar leucocitos humanos, b) someter opcionalmente los leucocitos a choque hipo-osmótico y c) incubar los leucocitos sometidos a choque en una composición de incubación en condiciones de tiempo y temperatura para inducir la diferenciación y maduración de células dendriticas (DC) y asi producir una AICC. En una modalidad, la etapa (c) también induce la activación de linfocitos.

En una modalidad, el método comprende adicionalmente poner en contacto la DC con un antigeno o péptido antigénico. En una modalidad, el antigeno o péptido antigénico se pone en contacto con la DC a medida que se diferencia y madura en la composición de incubación. Es decir, se agrega el antigeno o péptido antigénico durante una parte o toda la etapa de incubación (c). En una modalidad, el antigeno o péptido antigénico se pone en contacto con la DC luego de concluir la incubación en la composición de incubación. Es decir, el método comprende adicionalmente una etapa (d) donde el antigeno o péptido antigénico se agrega a la AICC durante un período de tiempo suficiente para cargar la DC con péptido antigénico.

En una modalidad, se utiliza una composición de leucocitos activados producida utilizando los métodos de WO 2010/100570 para preparar la AICC. En esta modalidad, la composición de leucocitos activados corresponde a las etapas (a) y (b) de la modalidad anterior del método.

En algunas modalidades, el método comprende a) incubar leucocitos humanos en condiciones de tiempo y temperatura para activar los leucocitos, b) opcionalmente someter los leucocitos a choque hipo-osmótico, c) agregar a los leucocitos de la etapa b una solución salina fisiológicamente aceptable en una cantidad eficaz para restituir la isotonicidad, d) mezclar los leucocitos de la etapa c con un medio para formar una segunda composición de incubación y e) incubar la segunda composición de incubación en condiciones de tiempo y temperatura para inducir la diferenciación y maduración de células dendríticas (DC) y así producir una AICC. En una modalidad, la etapa (e) también induce la activación adicional de linfocitos.

En una modalidad, el método comprende adicionalmente poner en contacto las células dendríticas (DC) de la etapa (e) con un antigeno o péptido antigénico. En una modalidad, el antigeno o péptido antigénico se pone en contacto con la DC a medida que se diferencia y madura en la composición de incubación. Es decir, se agrega el antigeno o péptido antigénico durante una parte o toda la etapa de incubación (e). En una modalidad, el antigeno o péptido antigénico se pone en contacto con la DC luego de concluir la incubación en la composición de incubación. Es decir, el método comprende adicionalmente una etapa (f) donde el antigeno o péptido antigénico se agrega a la AICC durante un periodo de tiempo suficiente para cargar la DC con péptido antigénico.

En una modalidad, se utiliza una composición de leucocitos activados producida utilizando los métodos de WO 2010/100570 para preparar la AICC. En esta modalidad, la composición de leucocitos activados corresponde a las etapas (a) a (d) de la modalidad anterior del método.

En algunas modalidades, el método comprende a) incubar leucocitos humanos a temperatura ambiente durante hasta 20 horas para activar los leucocitos, b) someter los leucocitos a choque hipo-osmótico, c) agregar a los leucocitos de la etapa b una solución salina fisiológicamente aceptable en una cantidad eficaz para restituir la isotonicidad, d) mezclar los leucocitos de la etapa c con un medio para formar una segunda composición de incubación y e) incubar la segunda composición de incubación en condiciones de tiempo y temperatura adecuadas para inducir la diferenciación y maduración de células dendriticas (DC) y asi producir una AICC. En una modalidad, la etapa (e) también induce la activación adicional de linfocitos.

En una modalidad, el método comprende adicionalmente poner en contacto las células dendriticas (DC) de la etapa (e) con un antigeno o péptido antigénico. En una modalidad, el antigeno o péptido antigénico se pone en contacto con la DC a medida que se diferencia y madura en la composición de incubación. Es decir, se agrega el antigeno o péptido antigénico durante una parte o toda la etapa de incubación (e). En una modalidad, el antigeno o péptido antigénico se pone en contacto con la DC luego de concluir la incubación en la composición de incubación. Es decir, el método comprende adicionalmente la etapa (f) donde el antigeno o péptido antigénico se agrega a la AICC durante un periodo de tiempo suficiente para cargar la DC con péptido antigénico.

En una modalidad, se utiliza la composición de leucocitos activados producida utilizando los métodos de WO 2010/100570 para preparar la AICC. En esta modalidad, la composición de leucocitos activados corresponde a las etapas (a) a (d) de la modalidad anterior del método.

En algunas modalidades, el método comprende a) activar leucocitos humanos, b) mezclar los leucocitos de la etapa a con un medio para formar una segunda composición de incubación, y c) incubar la segunda composición de incubación en condiciones de tiempo y temperatura para inducir la diferenciación y maduración de células dendríticas (DC) y producir así una AICC. La activación de leucocitos se indica mediante un cambio en los niveles de expresión o en la cantidad de leucocitos que expresan un marcador de activación de leucocitos, como CDllb y/o CD62L. Por consiguiente, en una modalidad, la activación de leucocitos se indica mediante una mayor expresión de CDllb en la población de leucocitos. La mayor expresión de CDllb se puede detectar, por ejemplo, mediante citometria de flujo. La mayor expresión de CDllb comprende un aumento en la intensidad de fluorescencia media para CDllb en leucocitos, por ejemplo, la intensidad de fluorescencia media puede aumentar en al menos alrededor de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %. La mayor expresión de CDllb también comprende un aumento en el porcentaje de leucocitos que expresan CDllb (p. ej., luego de la corrección para la tinción de fondo utilizando un control con isotipo). Por ejemplo, el porcentaje de leucocitos que expresan CDllb puede aumentar en al menos alrededor de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % con relación a la expresión de CDllb en leucocitos en una capa leucocitaria. En una modalidad, la activación de leucocitos se indica mediante una menor expresión de CD62L en la población de leucocitos. La menor expresión de CD62L se puede detectar, por ejemplo, mediante citometria de flujo. La menor expresión de CD62L comprende una disminución en la intensidad de fluorescencia media para CD62L en leucocitos, por ejemplo, la intensidad de fluorescencia media puede disminuir en al menos alrededor de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %. La menor expresión de CD62L también comprende una disminución en el porcentaje de leucocitos que expresan CD62L (p. ej., luego de la corrección para la tinción de fondo utilizando un control con isotipo). Por ejemplo, el porcentaje de leucocitos que expresan CD62L puede disminuir en al menos alrededor de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % con relación a la expresión de CD62L en leucocitos en una capa leucocitaria. En una modalidad, se miden CD62L y/o CDllb en leucocitos que son granulocitos. En una modalidad, se miden CD62L y/o CDllb en leucocitos que son monocitos. En una modalidad, la etapa (c) también induce la activación adicional de linfocitos.

Adicionalmente, en cualquiera de las otras modalidades que implican la activación de leucocitos, los cambios en la expresión de CDllb y/o CD62L, tal como se indicó anteriormente, se pueden utilizar solos, juntos o en combinación con marcadores y ensayos adicionales, como se indica en otro punto en la solicitud, como un indicador de la activación de leucocitos.

En una modalidad, el método comprende adicionalmente poner en contacto las células dendriticas (DC) de la etapa (c) con un antígeno o péptido antigénico. En una modalidad, el antigeno o péptido antigénico se pone en contacto con la DC a medida que se diferencia y madura en la composición de incubación. Es decir, el antigeno o péptido antigénico se agrega durante parte o toda la incubación de la etapa (c). En una modalidad, el antigeno o péptido antigénico se pone en contacto con la DC luego de concluir la incubación en la composición de incubación. Es decir, el método comprende adicionalmente una etapa (d) donde el antigeno o péptido antigénico se agrega a la AICC durante un periodo de tiempo suficiente para cargar la DC con péptido antigénico.

En general, en cualquiera de los métodos para preparar una AICC, se puede utilizar cualquier composición en la que los leucocitos hayan pasado de un estado inactivo a un estado funcionalmente activo para la etapa de choque hipo-osmótico.

Por ejemplo, tal como se describe en WO 2010/100570, los leucocitos pueden pasar de un estado inactivo a un estado funcionalmente activo mediante su incubación a temperatura ambiente durante hasta 20 horas. En una modalidad, la transición ocurre mediante incubación de los leucocitos durante alrededor de 90 minutos hasta alrededor de 20 horas a temperatura ambiente. En una modalidad, la transición ocurre mediante incubación de los leucocitos durante alrededor de 8 horas hasta alrededor de 20 horas a temperatura ambiente. En una modalidad, la transición ocurre mediante incubación de los leucocitos durante la noche a temperatura ambiente. En otras modalidades, la temperatura puede ser de alrededor de 37 °C. Como se observó, los detalles de esta etapa de "transición" no son esenciales y los leucocitos se pueden obtener mediante cualquier método para uso en la preparación de AICC.

Adicionalmente, debido a que el choque hipo-osmótico es un tipo de estrés, en las modalidades del método que incluyen una etapa de choque hipo-osmótico se pueden utilizar otros métodos para producir estrés en las células. Es decir, debido a que diversos tipos de estrés provocan respuestas celulares a través de la misma via de señalización muy conservada que consiste en cascadas de proteínas cinasas que provocan la activación de proteínas cinasas activadas por mitógenos (MAPK), se pueden utilizar otros agentes de estrés en lugar del choque hipo-osmótico en cualquiera de las modalidades que mencionan el choque hipo-osmótico. Por ejemplo, en algunas modalidades, los métodos para preparar una AICC comprenden una etapa opcional (en remplazo o adición del choque hipo-osmótico) de someter a los leucocitos a un agente de estrés seleccionado de choque térmico, hipoxia, tratamiento con uno o más cualesquiera de clorpromazina, cafeína, vanadato, zimoliasa, rojo Congo, calcoflúor, rapamicina o una feromona de apareamiento o mediante inducción de despolimerización de actina. La activación de leucocitos también provoca un aumento en el calcio intracelular y hay muchos agonistas que imitan esta respuesta. Por consiguiente, en aun otras modalidades, los métodos para preparar una AICC comprenden una etapa opcional de someter los leucocitos a una ionóforo de calcio como FMLP o PMA en remplazo o adición del choque hipo-osmótico.

En cualquiera de las modalidades de los diversos métodos para producir una AICC, una incubación en "condiciones de tiempo y temperatura adecuadas para inducir la diferenciación y maduración de células dendriticas (DC)" (que también puede activar opcionalmente linfocitos y otras células) en general es una incubación de entre alrededor de 24 horas y alrededor de 14 dias a entre temperatura ambiente y alrededor de 37 °C.

En algunas modalidades, la incubación para inducir diferenciación y maduración de células dendriticas (DC) tiene lugar a una temperatura alrededor de temperatura ambiente, es decir, en el intervalo de alrededor de 12 °C y alrededor de 28 °C. En una modalidad, la incubación tiene lugar a una temperatura entre alrededor de 16 °C y alrededor de 25 °C. En una modalidad, la incubación tiene lugar a una temperatura entre alrededor de 18-25 °C. En aun otra modalidad, la incubación tiene lugar a una temperatura entre alrededor de 20-25 °C.

En algunas modalidades, la incubación para inducir la diferenciación y maduración de células dendriticas (DC) tiene lugar a una temperatura de alrededor de 37 °C. En una modalidad, la incubación tiene lugar a alrededor de 35 °C hasta alrededor de 38 °C. En una modalidad, la incubación tiene lugar a 37 °C +/- 0,5 °C.

En algunas modalidades, el período de tiempo de la incubación para inducir la diferenciación y maduración de células dendríticas (DC) es de alrededor de 24 horas a 14 días. Por lo tanto, en algunas modalidades, la incubación dura alrededor de 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168, 192, 216, 240, 264, 288, 312 o alrededor de 336 horas o alrededor de cualquier intervalo de horas entre estos valores.

En algunas modalidades, el período de tiempo de la incubación para inducir la diferenciación y maduración de células dendríticas (DC) es de alrededor de 48 horas a alrededor de 72 horas. En una modalidad, la incubación tiene lugar durante alrededor de 48 hasta alrededor de 72 horas a alrededor de 37 °C. En una modalidad, la incubación tiene lugar durante alrededor de 48 horas a alrededor de 37 °C. En una modalidad, la incubación tiene lugar durante alrededor de 72 horas a alrededor de 37 °C. En una modalidad, la incubación tiene lugar durante alrededor de 24 hasta alrededor de 72 horas a temperatura ambiente.

En algunas modalidades, la incubación tiene lugar en una incubadora celular en una atmósfera con 5 % de C02 y 100 % de humedad. En algunas modalidades, la incubación tiene lugar en bolsas permeables a los gases y dichas bolsas se colocan en una incubadora celular en una atmósfera con 5 % de CO2 y 100 % de humedad. En otras modalidades, en el método se utilizan placas o matraces de cultivo tisular. En aun otras modalidades, en el método se utilizan combinaciones de sistemas de bolsas y placas o matraces de cultivo. En las modalidades que implican la incubación en un sistema de bolsas, el sistema de bolsas puede ser uno de los descritos en W02010/100570, o puede ser una bolsa hecha a partir de un material diferente, como, de modo no taxativo, etilen-propileno fluorinado (FEP) o acetato de etil-vinilo (EVA) o un recipiente de cultivo tisular o cualquier recipiente.

Cualquier recipiente que se utilice para incubación también se puede tratar o modificar de otra forma de manera que se vuelva adhesivo a los leucocitos, lo cual puede resultar beneficioso para la activación de leucocitos, diferenciación de monocitos y activación/cebado de linfocitos. En una modalidad, uno o más de los recipientes de cultivo que se utilizan en los métodos para preparar una AICC no son adherentes para las células dendriticas. En otra modalidad, los recipientes de cultivo que se utilizan en los métodos para preparar una AICC se tratan para reducir la adherencia celular. En aun otra modalidad, uno o más recipientes de cultivo que se utilizan en los métodos para preparar una AICC se tratan para aumentar la adherencia celular.

Cualquier recipiente que se utilice para una incubación también puede contener andamiajes. Los andamiajes pueden ser de diferentes formas y en particular pueden ser microesferas, biodegradables o no biodegradables, p. ej., hechas a partir de colágeno o de PLA, PGA (ácido poliláctico, ácido poliglicólico) o polímeros sintéticos similares, andamiajes de hidrogel hechos a partir de gelatina, sellante de fibrina alginada y ácido hialurónico. Los andamiajes o bolsas se pueden recubrir con receptores de adhesión, proteínas de matriz extracelular como fibronectina o laminina o con péptidos de unión activa a partir de matrices extracelulares, como RGD. Los andamiajes o microesferas también se pueden recubrir con estímulos de activación o anticuerpos de estimulación como, de modo no taxativo, anticuerpos de activación contra CD3, CD28 o CD40. No obstante, en al menos una modalidad, el método no comprende microesferas o andamiajes recubiertos con uno o más estímulos de activación o con uno o más anticuerpos contra CD3, CD28 o CD40.

En algunas modalidades, el medio que se utiliza para la incubación para producir una AICC es plasma o suero. En las modalidades que utilizan suero, el suero puede obtenerse de una muestra de plasma que puede obtenerse de la misma u otra muestra de sangre completa (es decir, del mismo u otro humano) como los leucocitos, puesta en contacto con un agente coagulante a alrededor de 37 °C. En algunas modalidades, el suero o plasma se obtiene de un proveedor comercial o sin fines de lucro y puede estar fresco o en forma compatible con el almacenamiento, tal como congelado.

Además, pese a que el suero (particularmente el suero humano) se utiliza con frecuencia en la composición de incubación como el medio de soporte, también se pueden usar otros medios de soporte siempre que sea un medio fisiológico que soporte la liberación de citocinas, factores de crecimiento y/u otros componentes solubles de los leucocitos activados. Por ejemplo, se puede usar plasma en vez de suero. Otros medios de incubación que también se pueden usar como medio de soporte incluyen medio de cultivo, soluciones salinas o soluciones salinas amortiguadas con la adición opcional de azúcares y otros componentes esenciales para la viabilidad y función celular, tales como aminoácidos (p. ej., solución de Ringer lactato, solución de Ringer acetato, solución salina equilibrada de Hank (HBSS), solución salina equilibrada de Earle (EBSS), citrato salino estándar (SSC), solución salina amortiguada con HEPES (HBS), solución salina equilibrada de Gcy (GBSS)). Las soluciones salinas y los medios de cultivo también se pueden complementar con suero humano o suero animal de grado clínico, o sustitutos de suero. La composición de incubación alternativa o adicionalmente puede contener proteínas séricas tales como albúmina humana o bovina, gama globulina, transferrina u otras proteínas de diferentes tejidos, proteínas vegetales o extractos vegetales.

En determinadas modalidades, se agregan a la incubación agonistas de leucocitos como proteínas de complemento, quimiocinas, interferón-alfa, interferón-gama, citocinas como interleucina-4, factor estimulador de colonias de macrófagos-granulocitos (GM-CSF) o interleucina-12. Se puede inducir la diferenciación de monocitos en las DC in vitro utilizando cócteles de citocinas bien definidas (Jensen SS, Gad M. 2010). Por consiguiente, en una modalidad, se puede realizar una incubación en presencia de citocinas como interleucina-4 o GM-CSF. En otras modalidades, se puede realizar una incubación con otras sustancias que aumentan la diferenciación y maduración de células dendríticas y activación de linfocitos y linfocitos NK. Por ejemplo, se puede ligar el receptor co-estimulante CD40 en monocitos mediante anticuerpos de CD40 o mediante un ligando de CD40 (CD54) en ausencia de citoquinas (Brossart P, 1998). Se puede inducir una activación independientemente de CD40 de la maduración de DC mediante interacción con linfocitos T positivos para CD8 activadas (Ruedl C., 1999; Wirths, 2002).

Por consiguiente, en una modalidad, se pueden agregar linfocitos T positivos para CD8 activadas y exógenas a la incubación. La diferenciación de DC de monocitos in vitro también se puede inducir mediante interacción de DC con linfocitos T NK. La diferenciación de DC se deriva de la secreción de linfocitos T NK de GM-CSF e IL-13, citocinas producidas mediante los linfocitos T NK luego de la activación mediante monocitos (Hegde, 2007). Por consiguiente, en una modalidad, se pueden agregar linfocitos T NK activados y exógenos a la incubación. En otras modalidades, la diferenciación y maduración de DC se puede promover mediante la adición de uno o más de GM-CSF, IL-4, IFN-gama, IL-2, IFN-alfa y TNF-alfa y/o mediante adición de uno o más productos bacterianos gue interactúan con los receptores Toll en las DC como, de modo no taxativo, lipopolisacárido (LPS), peptidoglicano (mureina), ARN de cadena doble o su análogo sintético ácido poliinosinico:policitidilico (poli I:C), Resiquimod (R-848) y Picibanil (OK-432).

También se contempla de forma expresa que, en una o más modalidades de los métodos, la incubación tiene lugar en ausencia de uno o más de los factores agregados de forma exógena descritos anteriormente como implicados en la maduración de DC. En una modalidad, todos los componentes necesarios para la maduración de DC se proporcionan de forma endógena y no se agregan estímulos adicionales a la composición de incubación. No obstante, pueden estar presentes diversas citocinas en la composición de incubación debido a que se liberan luego de la activación de los leucocitos durante la incubación. Por ejemplo, el ligando de CD40 se puede encontrar en el suero y en las plaquetas que forman parte de la composición de incubación. De manera similar, los linfocitos T CD8+ activados y linfocitos T NK presentes de forma endógena en la composición de incubación pueden interactuar con monocitos para apoyar la maduración y diferenciación de células dendríticas.

Por consiguiente, en una modalidad, la composición de incubación para producir una AICC no incluye GM-CSF exógeno, IL-4 exógeno, TNF exógeno o un interferón exógeno (si bien se pueden producir uno o más de GM-CSF, IL-4, TNF o un interferón de forma endógena durante la incubación). Por lo tanto, en una modalidad, un método para preparar una AICC excluye la adición de uno o más de citocina o interferón exógenos, la adición de reactivo/s que reticula/n CD3 y/o CD28, la adición de reactivo/s que reticula/n CD40 y/o la adición de otros agentes exógenos que promueven la maduración de células dendríticas durante la producción de la AICC. Los ejemplos de citocinas agregadas de forma exógena e interferones agregados de forma exógena que se pueden excluir de la práctica del método incluyen uno o más cualquiera de GM-CSF, IL-4, IFN-ga a, IL-2, IFN-alfa o IL-2. Los ejemplos de productos bacterianos agregados de forma exógena que se pueden excluir de la práctica de los métodos incluyen los que se sabe que interactúan con receptores Toll en DC, como, de modo no taxativo lipopolisacáridos (LPS), peptidoglicano (mureina), ARN de doble cadena o su análogo sintético ácido poliinosínico:policitidílico (poli I:C), Resiquimod (R-848) y Picibanil (OK-432).

En algunas modalidades, se agregan inhibidores de angiogénesis que se dirigen a la señalización del VEGF a la composición de incubación. Estos incluyen, de modo no taxativo, anticuerpos anti-VEGF (p. ej., bevacizumab, ranibizumab), anticuerpos contra receptores del VEGF (p. ej., Brivanib, que se dirige al VEGFR-2 y FGFR), inhibidores de la actividad de la tirosina cinasa de los receptores del VEGF (p. ej., Sorafenib, Cediranib, Sunitinib), señuelos-receptores solubles (p. ej., VEGF Trap, también denominado aflibercept) o agentes de alteración vascular (p. ej., ZD6126).

En algunas modalidades, se agregan adyuvantes a la composición de incubación. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, de modo no taxativo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de calcio, adyuvantes basados en emulsiones oleosas (adyuvantes oleosos emulsionados de Freund (completo e incompleto), Arlacel A, aceite mineral, adyuvante de aceite de cacahuete emulsificado (adyuvante 65), productos de bacterias (sus derivados sintéticos, así como liposomas) o bacterias gram-negativas, endotoxinas, colesterol, ácidos grasos, aminas alifáticas, aceites parafínicos y vegetales, monofosforil lípido A, ISCOM con Quil-A y formulaciones adyuvantes Syntex (SAF).

Como se indicó en otro punto, en algunas modalidades, cualquiera de los métodos puede comprender adicionalmente una etapa de contacto donde se introducen uno o más antígenos o péptidos antigénicos. Los ejemplos de antígenos incluyen antígenos fúngicos, protozoarios, bacterianos, virales, así como superantígenos (p. ej., enterotoxinas de estafilococo) y antígenos priónicos. En términos generales, los antígenos o péptidos antigénicos potencian la diferenciación de monocitos en células dendríticas y linfocitos cebadores específicos para ese antigeno. Adicionalmente, debido a que la presentación de antígenos en el nivel celular implica un péptido antigénico presentado en el contexto de una molécula de clase I o clase II, no se debería interpretar que los términos "antigeno", " "ppééppttiiddoo ddee aannttiiggeennoo"" yy "péptido antigénico" requieren contacto con un antigeno intacto o un péptido particular. Por el contrario, los términos utilizados indican ampliamente que una célula presentadora de antigeno entra en contacto con material antigénico que luego puede, de forma directa o luego de un procesamiento adicional, presentarlo en el contexto de moléculas de clase I o clase II.

Los antigenos y péptidos antigénicos, ya sea que se elaboren a partir de lisados celulares o mediante expresión recombinante de una proteina o péptido, se incuban con una AICC o durante la producción de una AICC a diversas concentraciones durante alrededor de 1 hora hasta alrededor de 24 horas a temperatura ambiente hasta 37 °C. Los ejemplos de antigenos/péptidos incluyen los que se indicaron anteriormente y cualquier antigeno/péptido que se utiliza en la sección de Ejemplos.

En algunas modalidades, se utiliza el antigeno intacto. Los ejemplos de antigenos intactos incluyen proteínas de virus, bacterias, hongos y protozoarios que infectan a humanos, asi como proteínas priónicas.

Los ejemplos de virus que se pueden usar para proporcionar antígenos virales incluyen, de modo no taxativo, virus de inmunodeficiencia humana (V1H-1, V1H-2); virus de papiloma humano; virus de influenza; fiebre de Dengue; encefalitis japonesa; fiebre amarilla; virus de hepatitis (virus de hepatitis B (VHB), virus de hepatitis C (VHC), hepatitis no-A, no-B); RSV (virus respiratorio sincicial); VPIH 1; VPIH 3; adenovirus y rhinovirus; VEB; CMV (citomegalovirus); virus de herpes simple VHS-1 y VHS-2; BK; HVH6; parainfluenza; bocavirus; coronavirus; VCML; paperas; sarampión; metapneumovirus; parvovirus B; rotavirus; virus del Nilo occidental y virus de fiebre hemorrágica de Ébola.

Los ejemplos de antigenos bacterianos incluyen, de modo no taxativo, antigenos bacterianos como toxina de pertussis, hemaglutinina filamentosa, pertactina, FIM2, FIM3, adenilato cielasa, toxina de difteria, toxina de tétano, proteina de estreptococo M, lipopolisacáridos, ácido micólico, proteina de choque térmico 65 (HSP65), la proteina secretada principal de 30 kDa, antigeno 85A y otros componentes del antigeno micobacteriano; componentes del antigeno bacteriano de Helicobacter pylori; antigenos bacterianos de neumococo, tal como neumolisina, polisacáridos de la cápsula de neumococo y otros componentes del antigeno bacteriano de neumococo; antígenos bacterianos de influenza hemofílica, tales como polisacáridos capsulares y otros componentes del antígeno bacteriano de influenza hemofílica; antigenos bacterianos de ántrax, tales como antigeno protector de ántrax y otros componentes del antigeno bacteriano de ántrax; antigenos bacterianos de rickettsia, tales como rompA y otro componente de antigeno bacteriano de rickettsia. También se incluyen con los antigenos bacterianos descritos en la presente cualesquiera otros antigenos bacterianos, micobacterianos, micoplásmicos, de rickettsia o clamidia.

Los ejemplos de antigenos fúngicos incluyen, de modo no taxativo, p. ej ., componentes de antigenos fúngicos de cándida, antigenos fúngicos de histoplasma, tales como proteina de choque térmico 60 (HSP60) y otros componentes del antigeno fúngico de histoplasma, antigenos fúngicos de criptococo, tales como polisacáridos capsulares y otros componentes del antigeno fúngico de criptococo, antigenos fúngicos de coccidiodes, tales como antigenos de esférulas y otros componentes del antigeno fúngico de coccidiodes, y antigenos fúngicos de tinea, tales como tricofitina y otros componentes del antigeno fúngico coccidiodes.

En otras modalidades, se usa un epitopo peptidico del antigeno (preparado mediante digestión proteolitica o de forma recombinante).

En algunas modalidades, el antigeno peptidico es un antigeno peptidico de V1H. Los ejemplos de péptidos incluyen uno, una combinación, o todos de un péptido de Tat, péptido de Nef, péptido de Rev, péptido de Gag, péptido de Env, péptido de Pol, péptido de Vpu, péptido de Vif y Padre. Los ejemplos de péptidos de Gag incluyen Gagl50, Gag433, Gag298 o una combinación de estos. Los ejemplos de péptidos de Env incluyen Env67. Los ejemplos de péptidos de Pol incluyen P0I6O6. Los ejemplos de péptidos de Vpu incluyen Vpu66. Los ejemplos de péptidos de Vif incluyen Vif23 y Vif101.

En algunas modalidades, el antigeno peptidico es un antigeno peptidico del virus de hepatitis C (VHC).

En algunas modalidades, el antigeno es un antigeno asociado a una infección viral crónica. En una modalidad, la infección viral crónica es V1H, virus de herpes simple 1 (VHS1), virus de herpes simple 2 (VHS2), virus de hepatitis C (VHC) o virus del papiloma humano (VPH).

En algunas modalidades, las células dendriticas en una AICC se transfectan con ARNm para uno o más antigenos de un organismo infeccioso a través de electroporación, por ejemplo, utilizando electroporadores de onda de deterioro u onda cuadrada exponencial u otros aparatos de impulsos de ARN. En otra modalidad, se introducen uno más antigenos o péptidos antigénicos en células presentadoras de antigenos, como células dendriticas, en una AICC, usando transfección basada en microparticulas, por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense n.° 8,097,243. En aun otras modalidades, se introducen uno o más antigenos o péptidos antigénicos usando transducción basada en adenovirus, por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense n.° 8,012,468 y en Butterfield et ál., J. Immunotherapy 2008; 31:294-309; o usando un vector retroviral como se describe en la patente estadounidense n.° 8,003,773.

En cualquiera de las modalidades, el método puede producir uno o más de diferenciación de monocitos en DC maduras, activación de linfocitos, activación y/o proliferación de linfocitos NK o activación y/o proliferación de linfocitos T NK.

En una modalidad, una AICC comprende DC "maduras" si la AICC incluye células que pueden estimular la activación (cebado) de linfocitos T vírgenes (como se muestra mediante la expresión de uno o más de los marcadores de activación de linfocitos T CD69, IL-2R, CD28, CD71, CD49d, CD40L y/o mediante la producción de IL-2, IFN-alfa, IFN-beta o IFN-gama) y la diferenciación y proliferación de linfocitos T auxiliares y T citotóxicos en presencia de antigeno. En otra modalidad, la AICC comprende DC maduras en caso de haber un aumento en la producción de IL-12. En otra modalidad, la AICC comprende DC maduras en caso de haber un aumento en la expresión de uno o más de los marcadores de CD80, CD86, CD83, CD40, CDlc, CD56, CDllb, CDllc, IGSF4, CLEC9A, CCR7, TLR1, TLR3, TLR6, DC-LAMP, Id2, IRF8 o ICSBP en monocitos en la AICC. En una modalidad, un aumento en la expresión es un aumento en la cantidad de una o más moléculas en la superficie de una DC en la AICC (p. ej., un aumento en la intensidad de fluorescencia media (MFI) según se determina mediante citometria de flujo). Se determina un aumento en la cantidad de moléculas mediante comparación de la MFI para ese marcador particular en una DC en la AICC cuya madurez se sospecha. En una modalidad, una AICC comprende DC "maduras" en caso de que haya un aumento en el porcentaje de monocitos que expresan uno o más de los marcadores. En una modalidad, se identifica un monocito según la difracción lateral característica [SSC] y tinción positiva para el marcador de pan-leucocitos CD45 mediante citometria de flujo o mediante tinción de CD14 específica para monocitos. En una modalidad, el método produce una AICC donde aumentan tanto la MFI como el porcentaje de monocitos que expresan al menos uno de los marcadores de la superficie celular HLA-DR, CD54, CD86, CD83, CD80, CD40 y CCR7. En una modalidad, el método produce una AICC donde aumentan tanto la MFI como el porcentaje de monocitos que expresan cualquier combinación o todos los marcadores de la superficie celular HLA-DR, CD54, CD86, CD83, CD80, CD40 y CCR7. En una modalidad, se evalúa un aumento con relación a la composición de leucocito de partida utilizada para producir la AICC (p. ej., leucocitos en una capa leucocitaria). En una modalidad, un aumento se evalúa con relación a la composición celular utilizada para iniciar la incubación en condiciones de tiempo y temperatura para inducir la diferenciación y maduración de DC.

En una modalidad, una AICC presenta antigenos para linfocitos T vírgenes, lo cual hace que los linfocitos T vírgenes se diferencien en células positivas para CD4 y positivas para CD8, proliferen, produzcan IL-2, expresen el receptor de IL-2 y produzcan interferones y otras citocinas Thl.

En otro aspecto, los métodos pueden comprender adicionalmente el enriquecimiento de AICC de la invención para una o más poblaciones celulares. Se pueden preparar composiciones enriquecidas para células dendríticas, linfocitos T, linfocitos NK, linfocitos T NK u otros tipos celulares mediante clasificación celular, cribado, MACS, etc., usando selección de marcador positivo o negativo de acuerdo con métodos conocidos.

En una modalidad adicional, los métodos pueden comprender adicionalmente la separación de la parte celular de la AICC de la parte liquida. En una modalidad, se recuperan tanto la parte celular como liquida (sobrenadante). Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante centrifugación de la AICC y transferencia del sobrenadante a un recipiente separado. Tal como se describe en los Ejemplos, el sobrenadante es útil para la terapia incluso en ausencia de células debido a las citocinas y otros factores solubles que contiene. Las células en el sedimento que forma la centrifugación posterior luego se pueden volver a suspender en cualquier portador deseado. En otras modalidades, las células se retiran de la parte liquida sin recuperar las células, por ejemplo, mediante filtración. En aun otras modalidades, las células se recuperan sin recuperar el sobrenadante, por ejemplo, mediante sedimentación de las células y aspiración del sobrenadante.

En cualquiera de las modalidades, luego de que se produce una AICC, se pueden aislar las células en la AICC, ya sea con o sin concentración adicional y suspender en un portador como suero (que puede ser autólogo o alogénico con respecto al receptor) o algún otro liquido isotónicamente normal y fisiológicamente aceptable adecuado para almacenar y administrar células. A continuación se describen ejemplos de estas soluciones e incluyen soluciones que se utilizan para restablecer la isotonicidad, el medio de cultivo celular, solución salina amortiguada o cualquier otro fluido biocompatible o medio de crioconservación celular o de almacenamiento celular clínicamente aceptable y especialmente formulado.

II. Composiciones celulares in unoestimulantes activadas En otro aspecto, la invención se refiere a una composición celular inmunoestimulante activada (AICC) que se refiere a cualquiera de las composiciones producidas a través de los métodos para realizar una AICC descritos anteriormente. Por consiguiente, mientras que la "AICC" se refiere generalmente a una composición celular en el mismo portador que se utiliza en la incubación, como se describió anteriormente, una AICC también comprende el componente celular en cualquier portador o excipiente, así como la parte líquida separada de la parte celular.

Los leucocitos en una AICC tienen determinadas características que se pueden utilizar para distinguir los tipos celulares de leucocitos individuales o la composición en su totalidad. Por ejemplo, los monocitos en una AICC pueden expresar niveles más elevados de CD54, HLA-DR y/o CD86 en comparación con monocitos recientemente aislados. Adicionalmente, los monocitos en la AICC pueden expresar marcadores de activación adicionales, como uno o más de CD8-alfa, CD83, CD80, CCR7, y/o CD40 en comparación con monocitos recientemente aislados. Una composición de AICC puede comprender un porcentaje o cantidad más elevada de monocitos que se diferenciaron y maduraron en DC que una muestra recientemente elaborada, por ejemplo, de leucocitos de sangre periférica. De la misma forma, una AICC puede contener un porcentaje o cantidad mayor de células capaces de activar/cebar linfocitos vírgenes que una muestra recientemente elaborada, por ejemplo, de linfocitos de sangre periférica. Los linfocitos en la AICC pueden expresar niveles superficiales más elevados de marcadores adicionales en comparación con linfocitos recientemente aislados, como uno o más de CD69, CD25, CD28, CD154, CD107a y/o CD42d. Adicionalmente, los leucocitos en la AICC pueden presentar una mayor capacidad para producir citocinas, como una o más de IL-2, IFN gama, IFN alfa, IFN beta, TNF alfa, TNF beta y/o IL-12, en comparación con leucocitos recientemente aislados.

Tal como observó, en algunas modalidades del método, se utiliza una composición de leucocitos activados (ALC) producida utilizando un método de WO 2010/100570 en el método para preparar la composición celular inmunoestimulante activada (AICC). Si bien los leucocitos en la ALC pueden estar al menos parcialmente activados, como se describe en los Ejemplos, los leucocitos en la AICC pueden lograr niveles más elevados de activación que en la ALC. El nivel más elevado de activación de los leucocitos en la AICC en comparación con los leucocitos en una ALC se puede mostrar mediante una o más cualquiera de las características indicadas anteriormente para una AICC utilizando la ALC como comparador.

Tal como se muestra en los ejemplos de trabajo, una AICC también puede estar caracterizada y distinguirse de composiciones conocidas en términos del nivel de activación mínima de DC, p. ej., según se indica mediante la expresión superficial de HLA-DR, CD86, CD83, CD80, CD40, CD54 y CCR7 en monocitos, nivel de activación mínima de linfocitos, p. ej., como se indica mediante la expresión superficial de CD69, CD25 (IL-2R), CD28, CD154/CD40L y CD49d, y niveles de activación mínima de linfocitos NK y T NK, p. ej., como se indica mediante la expresión superficial de CD56, CD57 y CD107a. La expresión superficial de marcadores se puede evaluar como el porcentaje de células que expresan el marcador o como el nivel de marcador por célula.

En algunas modalidades, el contenido final de composición celular inmunoestimulante activada (AICC) incluye, en términos de las poblaciones de leucocitos presentes, granulocitos, monocitos y linfocitos. Las cantidades específicas y los porcentajes relativos de células pueden diferir según las téenicas de análisis utilizadas y la variación de muestra a muestra. Por ejemplo, cuando se realiza el análisis usando un analizador Cell Dyn, la AICC contiene generalmente alrededor de 45 % a alrededor de 72 % de granulocitos (incluyendo neutrófilos, eosinófilos y basófilos), alrededor de 3 % a alrededor de 10 % de monocitos y alrededor de 25 % a alrededor de 50 % de linfocitos. Cuando se realiza un análisis utilizando FACS (p. ej., usando un análisis de gráfica de puntos con aspersión-lateral versus aspersión-delantera o versus fluorescencia de CD45 y/o CD14), la AICC generalmente contiene alrededor de 50 % a alrededor de 70 % de granulocitos, alrededor de 5 % a alrededor de 15 % de monocitos y alrededor de 15 % a alrededor de 35 % de linfocitos.

Los granulocitos incluyen neutrófilos, eosinófilos y basófilos. En algunas modalidades, una AICC contiene alrededor de 25 % a alrededor de 85 % de neutrófilos, alrededor de 0 a alrededor de 9 % de eosinófilos, alrededor de 1,5 a alrededor de 4 % de basófilos, alrededor de 2 % a alrededor de 40 o, de monocitos (incluyendo células dendriticas) y alrededor de 4 a alrededor de 70 de linfocitos, según la cantidad total de leucocitos en la AICC.

En cualquiera de las modalidades, una AICC puede contener adicionalmente niveles residuales de glóbulos rojos, generalmente en la cantidad de alrededor de 0,05 a alrededor de 0,2 millones por microlitro y/o niveles residuales de plaquetas, generalmente en la cantidad de alrededor de 1 a alrededor de 100 mil por microlitro.

En algunas modalidades, las subpoblaciones de linfocitos en la AICC se encuentran en general en los siguientes intervalos: alrededor de 20 % a alrededor de 80 % de linfocitos T (CD3+); alrededor de 5 % a alrededor de 40 % de células B (CD19+); alrededor de 5 % a alrededor 35 % linfocitos NK (CD3-/CD56+) y/o alrededor de 0,1 % a alrededor de 35 % de linfocitos T NK (CD3+/CD56+). En algunas modalidades, entre los linfocitos T se encuentran alrededor de 5 % a alrededor de 65 % de linfocitos T auxiliares (CD4+/CD3+) y alrededor de 5 % a alrededor de 75 % de linfocitos T citotóxicos (CTL, CD8+/CD3+).

En otras modalidades, hay alrededor de 40 % a alrededor de 60 % de linfocitos T (CD3+); alrededor de 15 % a alrededor de 30 % de células B (CD19+); alrededor de 15 % a alrededor 30 % linfocitos NK (CD3-/CD56+), alrededor de 2 % a alrededor de 20 % de linfocitos T NK (CD3+/CD56+). En algunas modalidades, entre los linfocitos T se encuentran alrededor de 15 % a alrededor de 40 % de linfocitos T auxiliares (CD4+/CD3+) y alrededor de 25 % a alrededor de 50 % de CTL (CD8+/CD3+).

La relación entre los linfocitos Th y los CTL es normalmente de alrededor de 0,5 a 1,5.

En muchas de las modalidades, los niveles de DC, linfocitos, marcadores de linfocitos NK y T NK, asi como porcentajes de expresión celular de esos marcadores, se pueden determinar como se describe en los métodos para preparar una AICC o como se describe en los Ejemplos.

En una modalidad, una AICC comprende DC, donde al menos alrededor de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % o 30 % de la DC expresa CD8, según se detecta mediante citometria de flujo en comparación con un control con isotipo.

En una modalidad, al menos alrededor de 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 % o 60 % de los monocitos en la AICC son positivos para el marcador CCR7, según se detecta mediante citometria de flujo en comparación con un control con isotipo.

En una modalidad, al menos alrededor de 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 % o 60 % de los monocitos en la AICC son positivos para el marcador CD40, según se detecta mediante citometria de flujo en comparación con un control con isotipo.

En una modalidad, al menos alrededor de 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 % o 60 % de los monocitos en la AICC son positivos para el marcador CD80, según se detecta mediante citometria de flujo en comparación con un control con isotipo.

En una modalidad, al menos alrededor de 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 % o 60 % de los monocitos en la AICC son positivos para el marcador CD83, según se detecta mediante citometria de flujo en comparación con un control con isotipo.

En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de monocitos totales para el marcador CD86 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 veces más fresco que en los monocitos de sangre periférica. En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de monocitos para el marcador CD86 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 veces más que en los monocitos en una ALC preparada de acuerdo con la WO 2010/100570. En estas modalidades, los monocitos totales se determinan mediante SSC y tinción para un marcador del pan-leucocito.

En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de monocitos totales para el marcador CD83 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 veces más fresco que en los monocitos de sangre periférica. En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de monocitos para el marcador CD83 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 veces más que en los monocitos en una ALC preparada de acuerdo con la WO 2010/100570. En estas modalidades, los monocitos totales se determinan mediante SSC y tinción para un marcador de pan-leucocito .

En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de monocitos totales para el marcador CD80 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 veces más fresco que en los monocitos de sangre periférica. En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de monocitos para el marcador CD80 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 veces más que en los monocitos en una ALC preparada de acuerdo con la WO 2010/100570. En estas modalidades, los monocitos totales se determinan mediante SSC y tinción para un marcador de pan-leucocito.

En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de monocitos totales para el marcador CD40 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 veces más fresco que en los monocitos de sangre periférica. En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de monocitos para el marcador CD40 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 veces más que en los monocitos en una ALC preparada de acuerdo con la WO 2010/100570. En estas modalidades, los monocitos totales se determinan mediante SSC y tinción para un marcador de pan-leucocito.

En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de monocitos totales para el marcador CCR7 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 veces más fresco que en los monocitos de sangre periférica. En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de monocitos para el marcador CCR7 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 veces más que en los monocitos en una ALC preparada de acuerdo con la WO 2010/100570. En estas modalidades, los monocitos totales se determinan mediante SSC y tinción para un marcador de pan-leucocito.

En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de monocitos totales para el marcador CD54 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 veces más fresco que en los monocitos de sangre periférica. En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de monocitos para el marcador CD54 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 veces más que en los monocitos en una ALC preparada de acuerdo con la WO 2010/100570. En estas modalidades, los monocitos totales se determinan mediante SSC y tinción para un marcador de pan-leucocito.

En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de monocitos totales para el marcador CD8 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 veces más fresco que en los monocitos de sangre periférica. En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de monocitos para el marcador CD8 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 veces más que en los monocitos en una ALC preparada de acuerdo con la WO 2010/100570. En estas modalidades, los monocitos totales se determinan mediante SSC y tinción para un marcador de pan-leucocito.

En una modalidad, al menos alrededor del 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 % o 35 % de los linfocitos positivos CD3 en una AICC son positivos para el marcador CD69, tal como se detecta mediante citometría de flujo en comparación con un control de isotipo, cuando se prepara la AICC en presencia de un superantigeno. En una modalidad, el superantigeno es enterotoxina B de estafilococo (SEB) a 100 ng/mL.

En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de linfocitos positivos CD3 para el marcador CD69 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 o 5,0 veces más cuando se prepara la AICC en presencia de un superantigeno que actúa como intermediario de la interacción entre linfocitos T y APC. En una modalidad, el superantigeno es enterotoxina B de estafilococo (SEB) a 100 ng/mL.

En una modalidad, al menos alrededor del 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 % o 45 % de los linfocitos negativos CD3 en una AICC son positivos para el marcador CD69, tal como se detecta mediante citometria de flujo en comparación con un control de isotipo, cuando se prepara la AICC en presencia de un superantigeno. En una modalidad, el superantigeno es enterotoxina B de estafilococo (SEB) a 100 ng/mL.

En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de linfocitos negativos CD3 para el marcador CD69 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 o 5,0 veces más cuando se prepara la AICC en presencia de un superantigeno que actúa como intermediario de la interacción entre linfocitos T y APC. En una modalidad, el superantigeno es enterotoxina B de estafilococo (SEB) a 100 ng/mL.

En una modalidad, al menos alrededor del 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 % o 35 % de los linfocitos positivos CD3 en una AICC son positivos para el marcador CD25, tal como se detecta mediante citometria de flujo en comparación con un control de isotipo, cuando se prepara la AICC en presencia de un superantigeno. En una modalidad, el superantigeno es enterotoxina B de estafilococo (SEB) a 100 ng/mL.

En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de linfocitos positivos CD3 para el marcador CD25 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 o 6,0 veces más cuando se prepara la AICC en presencia de un superantigeno que actúa como intermediario de la interacción entre linfocitos T y APC que en la composición de preincubación o en AICC incubada sin superantigeno. En una modalidad, el superantigeno es enterotoxina B de estafilococo (SEB) a 100 ng/mL.

En una modalidad, al menos alrededor del 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 % o 35 % de los linfocitos negativos CD3 son positivos para el marcador CD25, tal como se detecta mediante citometria de flujo en comparación con un control de isotipo, cuando se prepara la AICC en presencia de un superantigeno. En una modalidad, el superantigeno es enterotoxina B de estafilococo (SEB) a 100 ng/mL.

En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de linfocitos negativos CD3 para el marcador CD25 es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 o 5,0 veces más cuando se prepara la AICC en presencia de un superantigeno que en la composición de preincubación o cuando se prepara sin un superantigeno. En una modalidad, el superantigeno es enterotoxina B de estafilococo (SEB) a 100 ng/mL.

En una modalidad, al menos alrededor del 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % u 80 % de los monocitos en una AICC incubados con un superantigeno son positivos para el marcador CD40, tal como se detecta mediante citometria de flujo en comparación con un control de isotipo, cuando se prepara la AICC en presencia de un superantigeno. En una modalidad, el superantigeno es enterotoxina B de estafilococo (SEB) a 100 ng/mL.

En una modalidad, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de monocitos para el marcador CD40 es de al menos alrededor de 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 o 10 veces más que en la composición de preincubación o cuando se prepara la AICC sin un superantigeno. En una modalidad, el superantigeno de linfocitos T-APC es enterotoxina B de estafilococo (SEB) a 100 ng/mL.

En una modalidad, la concentración de IL-12 en una AICC es de al menos alrededor de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 picogramos por mililitro, según se determinó mediante ELISA. En una modalidad, la concentración de IL-12 en una AICC incubada con un superantigeno es de al menos alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 o 5,0 veces más cuando se prepara la AICC en presencia de un superantigeno que actúa como intermediario de la interacción entre linfocitos T y APC que cuando se prepara sin un superantigeno. En una modalidad, el superantigeno es enterotoxina B de estafilococo (SEB) a 100 ng/mL.

En una modalidad, la concentración de IL-2 en una AICC es de al menos alrededor de 100, 500, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000 o más picogramos por mililitro, según se determinó mediante ELISA. En una modalidad, la concentración de IL-2 se determina en una AICC incubada con un superantigeno que actúa como intermediario de la interacción entre linfocitos T y APC. En una modalidad, el superantigeno es enterotoxina B de estafilococo (SEB) a 100 ng/mL. En una modalidad, el superantigeno está presente durante una incubación de 48 horas a 37 °C utilizada para producir una AICC.

En una modalidad, la concentración de IFN-gamma (IFN-g) en una AICC es de al menos alrededor de 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 o 300 picogra os por mililitro, según se determinó mediante ELISA. En una modalidad, la concentración de IFN-g en una AICC incubada con un superantigeno es de al menos alrededor de 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 o 7,0 veces más cuando se prepara la AICC en presencia de un superantigeno que actúa como intermediario de la interacción entre linfocitos T y APC que cuando se prepara sin un superantigeno. En una modalidad, el superantigeno es enterotoxina B de estafilococo (SEB) a 100 ng/mL.

En una modalidad, una AICC permite la presentación del antigeno a los linfocitos T CD4 sin tratamiento anterior, como se muestra mediante proliferación de los linfocitos T cuando se cultivan conjuntamente con una AICC en presencia de un antigeno. En una modalidad, una AICC permite la generación de linfocitos T con un fenotipo Thl, como se muestra mediante la secreción de IL-2 e IFN-gamma mediante los linfocitos T luego del cultivo conjunto con AICC.

En algunas modalidades, una AICC comprende subconjuntos de linfocitos T en una relación que se modifica en comparación con la relación de los mismos subconjuntos de linfocitos T en sangre periférica. En una modalidad, una AICC comprende una relación de linfocitos T CD4 a linfocitos T CD8 (relación CD4/CD8) que es inferior a alrededor de 1:1.

En una modalidad, una AICC presenta las características de una AICC como se describe en los Ejemplos con respecto a uno o más marcadores de superficies celulares y/o citocinas. En una modalidad, una AICC presenta una o más de las características de una AICC "promedio" que se presentan en las Tablas (es decir, la característica refleja el promedio +/- cualquier desviación estándar se proporciona en las Tablas). En una modalidad, una AICC presenta una o más características de una AICC representativa, como se muestra en las Figuras, si bien cualquier cifra en las Figuras debería interpretarse como "alrededor de" dicha cifra. En una modalidad, una AICC presenta una característica como se describe en los Ejemplos luego de la estimulación de la AICC con un superantígeno.

En algunas modalidades, una AICC de la invención puede estar enriquecida de una o más poblaciones celulares. En una modalidad, una AICC está enriquecida de células dendríticas mediante selección negativa de linfocitos, por ejemplo, usando anticuerpos anti-CD3 y anti-CD19. En una modalidad, una AICC está enriquecida de linfocitos mediante selección negativa de monocitos y células dendriticas, por ejemplo, usando adhesión celular o usando anti-HLA-DR o anti-CD40 o anticuerpos anti-CDl4, o combinaciones de estos. En una modalidad, una AICC está enriquecida de linfocitos T mediante selección positiva, por ejemplo, usando anticuerpo anti-CD3 en perlas recubiertas en MACS o anticuerpo anti-CD2 en FACS.

Se puede usar terapéuticamente cualquier AICC en los métodos de la invención. Sin embargo, como se describe detalladamente en otra parte, en algunas modalidades, se incuba una AICC con antigenos aislados de un organismo infeccioso o se produce mediante métodos recombinantes o cualquier otro medio para producir o aislar antigenos o péptidos antigénicos a partir de un organismo infeccioso, por ejemplo, eluyendo péptidos a partir de células infecciosas. En algunas modalidades, la AICC o las DC dentro de la AICC, se incuba con uno o más antigenos virales, bacterianos, fúngicos o protozoarios. En algunas modalidades, una AICC, o DC dentro de la AICC, se incuba con superantigenos, tales como productos bacterianos. La adición de antigeno/péptidos dará como resultado una mayor maduración de DC a partir de monocitos y activación/cebado más especifico de linfocitos T presentes en la AICC.

Se puede separar una AICC en componentes celulares y líquidos. Por consiguiente, en una modalidad, una AICC comprende las partes celulares y líquidas que se producen directamente mediante cualquiera de los métodos. En una modalidad, una AICC comprende la parte celular separada de la parte liquida, si bien el componente celular se puede volver a formular en uno o más portadores o excipientes. En una modalidad, una AICC comprende la parte liquida separada de la parte celular. Se cree que tanto los componentes celulares como la parte líquida sin células poseen propiedades terapéuticamente beneficiosas. Por ejemplo, el componente celular comprende DC maduras y otros tipos celulares y la parte/componente líquido (sin células) comprende varias citocinas, tales como IL-2 e IL-12.

En algunas modalidades, los adyuvantes se agregan a una AICC. En una modalidad, la vacuna comprende adicionalmente al menos un antígeno/péptido de uno o más organismos infecciosos. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, de modo no taxativo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, Arlacel A, aceite mineral, adyuvante de aceite de maní emulsificado (adyuvante 65), lipopolisacárido (LPS), liposomas, endotoxinas, colesterol, ácidos grasos, aminas alifáticas, aceites parafínicos y vegetales, monofosforil lípido A, ISCOM con Quil-A y formulaciones adyuvantes Syntex (SAF).

Las composiciones de AICC, si se desea, pueden presentarse en un envase o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. El envase puede comprender, por ejemplo, una lámina metálica o de plástico, tal como un blister. El envase o dispositivo dispensador puede estar acompañado por instrucciones para su administración. También puede estar acompañado por un aviso asociado con el recipiente de forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos, cuyo aviso refleja la aprobación por parte de la agencia de la forma de la composición para la administración en humanos o animales. Dicho aviso, por ejemplo, puede tener una etiqueta aprobada por la Administración de Medicamentos y Alimentos de Estados Unidos para fármacos de receta o un prospecto de producto aprobado.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una AICC formulada como una vacuna para tratar una infección. En una modalidad, la vacuna comprende adicionalmente al menos un adyuvante como se describe anteriormente. En una modalidad, la vacuna comprende una AICC formulada con al menos uno de los antigenos descritos anteriormente. En una modalidad, la vacuna comprende una AICC que comprende células dendríticas maduras, linfocitos activados, al menos 5 mg/mL de IL-12, al menos 1500 pg/mL de IL-2 y al menos 100 pg/mL de IFN-gamma.

En otro aspecto, la invención proporciona una AICC que estimula una respuesta inmunitaria. Las modalidades de este aspecto incluyen las que se describen con respecto a una AICC en sí misma y las que se describen con respecto a los usos terapéuticos de una AICC. Por ejemplo, este aspecto también se refiere a una AICC para tratar una infección o para estimular una respuesta inmunitaria a un organismo infeccioso o una célula infectada con un organismo infeccioso.

En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de cualquier AICC en la preparación de un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria. Las modalidades de este aspecto incluyen las que se describen con respecto a una AICC en sí misma y las que se describen con respecto a los usos terapéuticos de una AICC. Por ejemplo, este aspecto también se refiere al uso de una AICC para preparar un medicamento para tratar una infección o para estimular una respuesta inmunitaria a un organismo infeccioso o una célula infectada con un organismo infeccioso.

III. Usos terapéuticos En otro aspecto, la invención proporciona métodos en los que se usa una AICC como composición inmunoestimulante. Por consiguiente, la invención comprende métodos para estimular una respuesta inmunitaria a al menos un antigeno de un organismo infeccioso, que comprende administrar una AICC de la invención a un sujeto. El sujeto incluye tanto sujetos humanos como veterinarios.

Se puede administrar una AICC para tratar cualquier tipo de infección. Los ejemplos de antigenos intactos incluyen proteínas de virus, bacterias, hongos y protozoarios que infectan a humanos, así como antígenos de proteína priónica.

Cualquier virus infeccioso puede ser útil como fuente de antígenos virales. Los ejemplos de virus que se pueden usar para proporcionar antígenos virales incluyen, de modo no taxativo, virus de inmunodeficiencia humana (V1H-1, V1H-2); virus de papiloma humano (VPH); virus de influenza; fiebre Dengue; encefalitis japonesa; fiebre amarilla; virus de hepatitis (virus de hepatitis B (VHB), virus de hepatitis C (VHC), hepatitis no A, no B) ; VRS (virus respiratorio sincicial); VPIH 1; VPIH 3; adenovirus y rhinovirus; VEB; CMV (citomegalovirus); virus de herpes simple VHS-1 y VHS-2; BK; VHH6; parainfluenza; bocavirus; coronavirus; VCML; paperas; sarampión; metapneumovirus; parvovirus B; rotavirus; virus del Nilo occidental y virus de fiebre hemorrágica de Ébola.

Cualquier especie de bacterias puede ser útil como fuente de antigenos bacterianos. Los ejemplos de antigenos bacterianos incluyen, de modo no taxativo, antigenos bacterianos como toxina de pertussis, hemaglutinina filamentosa, pertactina, FIM2, FIM3, adenilato cielasa, toxina de difteria, toxina de tétano, proteina de estreptococo M, lipopolisacáridos, ácido micólico, proteina de choque térmico 65 (HSP65), la proteina secretada principal de 30 kDa, antigeno 85A y otros componentes del antigeno micobacteriano; componentes del antigeno bacteriano de Helicobacter pylori; antigenos bacterianos de neumococo, tal como neumolisina, polisacáridos de la cápsula de neumococo y otros componentes del antigeno bacteriano de neumococo; antigenos bacterianos de influenza hemofilica, tales como polisacáridos capsulares y otros componentes del antigeno bacteriano de influenza hemofilica; antigenos bacterianos de ántrax, tales como antigeno protector de ántrax y otros componentes del antigeno bacteriano de ántrax; antigenos bacterianos de rickettsia, tales como rompA y otro componentes de antigeno bacteriano de rickettsia. Se incluyen a los antigenos bacterianos cualesquiera otros antigenos bacterianos, micobacterianos micoplásmicos, de rickettsia o clamidia.

Cualquier especie de hongos puede ser útil como fuente de antigenos fúngicos. Los ejemplos de antigenos fúngicos incluyen, de modo no taxativo, p. ej., componentes de antigenos fúngicos de cándida, antigenos fúngicos de histoplasma, tales como proteina de choque térmico 60 (HSP60) y otros componentes del antigeno fúngico de histoplasma, antigenos fúngicos de criptococo, tales como polisacáridos capsulares y otros componentes del antigeno fúngico de criptococo, antigenos fúngicos de coccidiodes, tales como antígenos de esférulas y otros componentes del antigeno fúngico de coccidiodes, y antigenos fúngicos de tinea, tales como tricofitina y otros componentes del antigeno fúngico coccidiodes.

En algunas modalidades, el antigeno peptidico es un antigeno peptidico de V1H. Los ejemplos de péptidos incluyen uno, una combinación, o todos de un péptido de Tat, péptido de Nef, péptido de Rev, péptido de Gag, péptido de Env, péptido de Pol, péptido de Vpu, péptido de Vif y Padre. Los ejemplos de péptidos de Gag incluyen Gagl50, Gag433, Gag298 o una combinación de estos. Los ejemplos de péptidos de Env incluyen Env67. Los ejemplos de péptidos de Pol incluyen Pol606. Los ejemplos de péptidos de Vpu incluyen Vpu66. Los ejemplos de péptidos de Vif incluyen Vif23 y ViflOl.· En algunas modalidades, el antígeno peptidico es un antígeno peptidico del virus de hepatitis C (VHC).

En algunas modalidades, el antigeno es un antigeno asociado a una infección viral crónica. En una modalidad, la infección viral crónica es un virus de inmunodeficiencia humana (V1H), virus de herpes simple 1 (VHS1), virus de herpes simple 2 (VHS2), virus de hepatitis C (VHC) o virus del papiloma humano (VPH).

En algunas modalidades, se usa una AICC directamente en un método para estimular una respuesta inmunitaria a un organismo infeccioso sin manipulación adicional. En otras modalidades, antes de la administración, se incuba (pulsa) una AICC con uno o más antigenos del organismo infeccioso. Los antigenos se pueden preparar de forma recombinante, se purifican parcialmente a partir del organismo infeccioso, se preparan a partir de células infectadas con el organismo o se puede usar una combinación de téenicas para proporcionar uno o más antigenos. En aun otras modalidades, se incuba una AICC con uno o más "superantigenos", tales como productos bacterianos, antes de la administración. Poner en contacto una AICC con un antigeno o superantigeno antes de la administración dará como resultado activación/cebado adicional y más especifico de linfocitos T presentes en la AICC.

Se presentan ejemplos y detalles adicionales con respecto a la adición de antigenos y péptidos antigénicos en la descripción de métodos para preparar una AICC.

En algunas modalidades, los adyuvantes se agregan a la AICC antes de la administración. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, de modo no taxativo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, Arlacel A, aceite mineral, adyuvante de aceite de maní emulsificado (adyuvante 65), lipopolisacárido (LPS), liposomas, endotoxinas, colesterol, ácidos grasos, aminas alifáticas, aceites parafinicos y vegetales, monofosforil lipido A, ISCOM con Quil-A y formulaciones adyuvantes Syntex (SAF).

En general, la aplicación de la composición celular inmunoestimulante activada se logra mediante una o más administraciones de una AICC. En una modalidad, se prepara una AICC de forma sistémica. Los ejemplos de administración sistémica incluyen inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea e intradérmica. En una modalidad, se administra una AICC de forma local, por ejemplo, tópica, intradérmica o subcutánea alrededor de un sitio de infección. En una modalidad, se administra una AICC intranodalmente, es decir, se inyecta una AICC en uno o más ganglios linfáticos asociados con (por ejemplo, drenar) un sitio de infección.

En algunas modalidades, se administra una AICC en un único sitio. En otras modalidades, se administra una AICC en múltiples sitios.

En algunas modalidades, se administra una AICC mediante inyección usando una jeringa y aguja adecuadas (por ejemplo, una jeringa de 2 i adaptada con una aguja de 18 G o 25 G). En las modalidades en las que se inyecta una AICC directamente en los ganglios linfáticos de drenaje regional, la administración de la AICC se puede realizar mediante un catéter o dispositivo endoscópico vigilado por ultrasonido, rayos X y otras teenologías similares. En algunas modalidades, la inyección ocurre a alrededor de cada un centímetro a alrededor de cada tres centímetros en todo el sitio de infección local. En otra modalidad, la inyección se realiza en el tejido asociado a los ganglios linfáticos que drenan un sitio de infección. En una modalidad, la inyección ocurre a alrededor de cada un centímetro a alrededor de cada tres centímetros en la zona de tejidos sanos asociados a los ganglios linfáticos que drenan un sitio de infección.

Para la inyección, una AICC se puede usar directamente. En esta modalidad, se administra la composición de incubación, que puede contener citocinas que pueden ayudar a estimular la muerte directa del organismo o la muerte de las células infectadas con el organismo infeccioso, junto con la parte celular de la AICC. En modalidades alternativas, se puede retirar la parte líquida de la AICC, por ejemplo, mediante centrifugación, y la parte celular de una AICC luego se formula en una solución acuosa (opcionalmente más concentrada que la AICC), por ejemplo, en amortiguadores fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer u otro amortiguador de sal fisiológica o en suero o plasma, que incluye suero o plasma del paciente.

En otra modalidad, se absorbe una AICC en una matriz o andamiaje fisiológicamente inerte y/o reabsorbióle (p. ej., colágeno) y se inserta a presión en la lesión. Esto permite una administración sostenida de la AICC en el sitio, que beneficia al paciente ya que las células permanecen durante más tiempo en el sitio.

Dependiendo de la gravedad y grado de respuesta de la afección que será tratada, la dosificación puede ser de una única o múltiples administraciones, donde el periodo del tratamiento dura desde varios dias a varias semanas o hasta que se logra la disminución de la enfermedad. Por consiguiente, en una modalidad, una AICC se administra una única vez. En otra modalidad, se administra una AICC al menos dos, tres, cuatro, cinco o hasta diez veces o más. Cuando la administración comprende al menos dos administraciones, cada administración puede ser de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 dias entre cada una. De manera alternativa, cada administración puede ser de alrededor de uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis meses entre si.

Se puede administrar una AICC más de una vez si un médico determina que se requiere otra aplicación.

En el caso de múltiples administraciones, las administraciones individuales pueden realizarse mediante la misma vía o se pueden utilizar distintas vías de administración para distintas administraciones durante el transcurso de la terapia.

La cantidad de una AICC que se administrará obviamente, dependerá del individuo que se esté tratando, de la gravedad de la afección, del modo de administración, del criterio del médico tratante, etc. La dosificación y el momento de administración responderán a un atento y continuo control de la afección cambiante del individuo. Además, los algoritmos de tratamiento no deberían limitarse según la gravedad o tipo de infección, dado que una AICC puede ser más eficaz en pacientes que presentan infecciones diseminadas o crónicas.

En una modalidad, se usa una AICC como una modalidad de tratamiento unitario, en la que puede administrarse una o más veces. Sin embargo, en otras modalidades, la AICC se administra como parte de un enfoque de tratamiento combinado. En las modalidades que implican una terapia de combinación, se administra una AICC antes, después o junto con otras modalidades de tratamiento. Se puede usar una AICC sola o junto con cualquier otro tratamiento convencional para el tipo específico de infección.

Se puede demostrar la estimulación de una respuesta inmunitaria contra un organismo infeccioso mediante una AICC de varias maneras. Por ejemplo, en una modalidad, la administración de una AICC a un sujeto provoca una reducción de la fiebre u otros síntomas sistémicos de infección. En aun otras modalidades, una AICC estimula una respuesta inmunitaria a un antigeno del organismo infeccioso.

En cualquiera de las modalidades, el grado de respuesta a la terapia se puede medir mediante la disminución de las concentraciones de suero de los marcadores de la infección, tales como los anticuerpos al organismo infeccioso. En determinadas modalidades, el grado de respuesta a la terapia se mide mediante uno o más de un aumento del tiempo de supervivencia total.

Independientemente de la naturaleza del tratamiento, puede ser útil una AICC para mejorar los resultados de la enfermedad en los pacientes. Además, una AICC también puede proporcionar un efecto analgésico.

EJEMPLOS Se hace referencia ahora a los siguientes ejemplos, que junto con la descripción que antecede ilustran la invención de una manera no restrictiva.

A menos que se indique lo contrario, la nomenclatura utilizada y los procedimientos de laboratorio utilizados incluyen las téenicas estándar. Ver, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology" tomos I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); "Cell Biology: A Laboratory Handbook", tomos I- III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" tomos I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et ál. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); "Animal Cell Culture" Freshncy, R. L, ed. (1986); "Methods in Enzymology" tomo 1-317, Academic Press; y Marshak et ál., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996).

EJEMPLO 1: Preparación de ejemplos de composiciones celulares inmunoestimulantes activadas (AICC) Los ejemplos de AICC se prepararon de la siguiente manera.

Como paso inicial, se preparó una composición de leucocitos activados de acuerdo con los métodos que se describen en W02010/100570. En resumen, se incubó una capa leucocitaria derivada de una única unidad sanguínea durante 8-12 horas a temperatura ambiente. Luego, las células se sometieron a choque hipo-osmótico ("HOS") mediante adición de agua durante 40-45 segundos, y se restituyó la isotonicidad mediante adición de una solución de NaCl. Las células se sedimentaron mediante centrifugación y el sedimento celular se volvió a suspender en 50 mL de suero obtenido de la fracción de plasma derivada de la misma unidad sanguínea. Luego, la suspensión de leucocito en suero se incubó durante 90 min a 37 °C.

Luego, el suero se descartó y se agregó suero nuevo a los leucocitos para elaborar una concentración final de 3-4 millones/mL. Esta composición inicial se denomina en los ejemplos como "Composición de preincubación" (PC).

Si bien los ejemplos utilizan una PC que se incubó en suero durante 90 min a 37 °C, se contempla expresamente que los leucocitos sedimentados luego del choque hipo-osmótico también se pueden volver a suspender en, por ejemplo, suero, y se pueden incubar directamente durante un período de tiempo, por ejemplo, 48 horas, para formar la AICC.

En los ejemplos de la presente, se concentró la PC mediante centrifugación suave, remoción del exceso de suero y resuspensión suave del sedimento de leucocito en un volumen de suero tal que la concentración de leucocito sea de aproximadamente 10 millones/mL. Luego, la composición se incubó durante 48 o 72 horas (tal como se indica en el ejemplo particular) en una incubadora celular a 37 °C, 5 % de C O2 y 100 % de humedad. La incubación se realizó en bolsas de FEP permeables al gas.

Los ejemplos de la presente muestran resultados de AICC preparada usando una PC concentrada, de modo que la AICC resultante también será concentrada. Una AICC concentrada será mejor para aplicaciones clínicas dado que cuanto más concentradas sean las células, se requerirá menor volumen de inyección para administrar una cantidad suficiente de células. Pero una comparación usando una PC no concentrada mostró que la concentración de leucocitos no afectó la composición de leucocitos en la AICC, según se evaluó por porcentaje de tipos celulares o por niveles de expresión de marcadores específicos. Por consiguiente, también es posible utilizar una PC no concentrada y los ejemplos no deberían interpretarse de ninguna manera como una limitación a una AICC preparada mediante el uso de una PC concentrada.

En los ejemplos que figuran a continuación, los leucocitos en la composición preincubada (PC) se compararon con los leucocitos en la AICC preparada a partir de la PC concentrada, a menos que en el ejemplo se especifique claramente lo contrario.

EJEMPLO 2: Análisis de población celular de una composición celular in unoestimulante activada (AICC) La composición celular de la AICC se comparó con la de la PC usando dos métodos de conteo celular distintos: conteo celular diferenciado en un analizador Cell-Dyn Ruby Hematology (Abbott Diagnostics) y análisis de citometria de flujo en un FACSCalibur™ (BD Biosciences). Los conteos de Cell Dyn comparan las poblaciones celulares presentes en la PC ("antes de la incubación") y en una AICC luego de la incubación durante 48 horas a 37 °C. En la tabla, WBC denota glóbulos blancos o leucocitos. Se determinaron tanto el conteo de WBC total como el porcentaje de tipos de leucocitos en los WBC. También se determinó la cantidad de glóbulos rojos (RBC) y plaquetas en la muestra. Los resultados de los conteos Cell Dyn se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1. Análisis hematológico Cell Dyn Los datos presentados son promedio +SD de 5 experimentos cada uno realizado con una muestra de sangre de una donación de sangre distinta. Cada medición del analizador hematológico Cell Dyn se realizó por triplicado y se calculó el conteo promedio .

También se determinaron los porcentajes de subtipos de leucocito presentes en la PC ("antes de la incubación") y en una AICC luego de la incubación durante 48 horas a 37 °C mediante citometria de flujo. Se tiñeron las células analizadas con antigeno de pan-leucocito CD45 conjugado con proteina clorofílica de peridinina (PerCP). La tinción de CD45 permitió una mejor resolución de las poblaciones de leucocitos. Se realizó citometría de flujo usando FACSCalibur™ (BD Biosciences) y se realizó el análisis de la población y el marcador usando el software FACSDiva™ BD Biosciences). Se separaron las poblaciones de leucocitos en función de las señales SSC y FL3 (CD45-PerCP).

Luego se determinó el porcentaje de granulocitos, linfocitos y monocitos en la población de leucocitos. Los resultados del análisis de citometría de flujo de las poblaciones de leucocitos se presentan en la Tabla 2 como promedio +SD de 5 experimentos.

Tabla 2. Análisis de citometria de flujo de leucocitos Los dos métodos de conteo producen resultados ligeramente distintos. Sin embargo, cada método proporciona una medida aceptable de subconjuntos de leucocitos. El sistema Cell-Dyn se utiliza a menudo en aplicaciones clínicas. Sin embargo, como se describe posteriormente, la citometria de flujo se puede utilizar de forma ventajosa para determinar los niveles de expresión de las moléculas individuales en la superficie de una célula individual. En general, la AICC es un poco distinta de la PC en términos de porcentajes de los subconjuntos de leucocitos. Sin embargo, los conteos de Cell-Dyn indican que la cantidad total de leucocitos disminuye durante la incubación para preparar la AICC.

El subconjunto de linfocitos separados, como se describe anteriormente, en función de la fluorescencia de SSC y CD45-PerCP se analizó adicionalmente mediante citometria de flujo. Para separar los linfocitos T y B, se tiñeron muestras con un anticuerpo anti-CD3 conjugado con isotiocianato de fluoresceina (FITC) y con un anticuerpo anti-CD19 conjugado con aloficocianina (APC). Los linfocitos que fueron CD3+/CD19 se contabilizaron como linfocitos T, mientras que las células que fueron CD3~/CD19+ se contabilizaron como linfocitos B. También se realizó la tinción triple de las muestras con anticuerpos anti-CD4-APC, anti-CD8-ficoeritrina (PE) y anti-CD3-FITC. Luego se separaron los linfocitos CD3+ en linfocitos T auxiliares CD4+ y linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL). Se identificaron linfocitos NK y TNK mediante tinción doble con anti-CD3-FITC y una mezcla de anticuerpos anti-CD56 y anti-CD16 conjugados con PE (anticuerpos de PE (CD56+CD16)). Los linfocitos NK se identificaron como células CD3 (CD56+CD16)+ y los linfocitos NKT se identificaron como células CD3+/(CD56+CD16)+. Los resultados de 4-7 experimentos realizados con AICC producida a partir de distintas donaciones de sangre se resumen en la Tabla 3 y se presentan como promedio +SD.

Tabla 3. Análisis de subconjuntos de linfocitos mediante citometría de flujo Estos resultados demuestran un aumento estadísticamente significativo de 38,8 % a 48,4% (p=0,18) en el porcentaje de linfocitos T (positivos para CD3) en la AICC, en comparación con el porcentaje de linfocitos T en la composición inicial.

Ejemplo 3. Activación y diferenciación de células dendriticas (DC) Análisis de marcadores de células dendriticas en monocitos Se evaluó la diferenciación de monocitos en células dendriticas (DC) mediante análisis de citometria de flujo de expresión de los marcadores específicos de DC HLA-DR, CD54, CD86, CD83, CD80, CD40 y CCR7 en monocitos. Se analizaron los monocitos primero en la composición preincubada (PC) y luego en AICC producida usando incubaciones de 48 o 72 horas en bolsas de FEP permeables al gas. Se realizó tinción doble de las células analizadas con anticuerpos contra cada uno de los marcadores específicos de DC y con un anticuerpo del antígeno de pan-leucocito CD45 conjugado con la proteína clorofílica de peridinina (PerCP). El último se usó para una mejor resolución de las poblaciones de leucocitos. Se conjugaron anticuerpos anti-HLA-DR y anti-CCR7 con aloficocianina (APC). El resto de los anticuerpos específicos de DC se conjugó con ficoeritrina (PE).

Las células de cada punto de tiempo se lavaron con solución de tinción de FACS (PBS, 2 % de suero de ratón normal; 0,02 % de azida de sodio), divididas en alícuotas a 0,5xl06/tubo y se incubaron con anticuerpos monoclonales apropiados durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. El segundo anticuerpo (anti-CD45- PerCP) se agregó durante 15 min a 4 °C en la oscuridad.

Luego de la incubación, las células se lavaron, volvieron a suspender en PBS y se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur™ (BD Biosciences). Se usaron las células teñidas con anticuerpos emparejados con isotipo en las mismas condiciones como controles negativos. Los resultados se analizaron mediante el software FACSDiva™ (BD Biosciences). Se distinguieron las poblaciones de leucocitos en función de las señales SSC y FL3 (positivas para CD45, fluorescencia roja).

Los resultados del análisis de citometria de flujo de los marcadores de DC en monocitos se resumen en la Tabla 4 y se muestra un experimento representativo en la Figura 1.

Tabla 4. Análisis de marcadores específicos de DC en monocitos Hay dos parámetros que se pueden usar para caracterizar la expresión del marcador: 1) porcentaje de células que expresan el marcador (% de células positivas) y 2) la intensidad de fluorescencia media (MFI) del marcador, que depende de la cantidad de moléculas marcadoras por célula. Los datos de la Tabla 4 presentan la MFI de todos los monocitos para cada marcador, que se presentan como promedio +SD de 7-8 experimentos. Se calculó el aumento múltiplo para cada marcador en cada experimento, luego se calculó el promedio +SD. Tal como se muestra mediante la desviación estándar, hay variabilidad entre los experimentos. Sin embargo, la MFI es varias veces más alta en la AICC (ya sea que se incube durante 48 horas o 72 horas), en comparación con la PC para la mayoría de los marcadores relacionados con la diferenciación y la maduración de DC, lo que confirma la diferenciación de monocitos en DC durante una incubación de 48 horas de PC a 37 °C.

La Figura 1 presenta el aumento múltiplo para la AICC preparada usando una incubación durante 48 horas, en comparación con la composición inicial de PC para un experimento representativo. El aumento múltiplo se muestra para tres parámetros para cada marcador: 1) la cantidad de células que expresan determinado marcador (% de células positivas, primera barra), 2) MFI para todos los monocitos (barra media) y 3) MFI de monocitos "positivos" (tercera barra). MFI representa la distribución de fluorescencia en la población de monocitos. Se incluye una medición de MFI para monocitos positivos de modo que aún se pueda detectar el aumento de la MFI en una población de células que es un porcentaje pequeño de los monocitos totales. La expresión de HLA-DR ya era alta en la composición de preincubación (PC) utilizada para preparar la AICC. En la PC, 94+3 % de los monocitos fueron positivos para HLA-DR y la MFI también era alta. La expresión de HLA-DR no aumentó adicionalmente en la AICC. Para los marcadores CD86, CD83, CD40 y CD54, el "% de células positivas" permaneció casi sin cambio o incluso disminuyó como en el caso de CD83 luego de la incubación (aumento múltiplo ~0,2-l); sin embargo, la MFI de todos los monocitos aumentó 2-5 veces principalmente porque la MFI de las células positivas aumentó muchas veces. Para los marcadores CD80 y CCR7, aumentó varias veces tanto el % de células positivas como la MFI.

Estos resultados muestran que la AICC está enriquecida para DC maduras, en comparación con la composición inicial.

También se analizó el efecto de incubar células en condiciones que fomentan la adhesión de las células. Se preparó AICC usando dos tipos distintos de bolsas, un tipo con una superficie normal y el otro tipo con una superficie tratada para fomentar la adhesión de las células. Luego, se comparó la expresión de los marcadores específicos de DC con AICC preparada usando las bolsas adherentes y no adherentes. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 2. Sorprendentemente, la incubación en bolsas no adherentes dieron como resultado marcadores de DC de MFI más alta, en comparación con la incubación en bolsas adherentes. El efecto fue particularmente notable para CD83, CD40 y CCR7.

Análisis de expresión de CD8-alfa en monocitos Si bien los monocitos expresan bajos niveles de CD8-alfa, una subpoblación de DC diferenciadas expresan altos niveles de este marcador (Merad M, 2000). Las células dendriticas de CD8OÍ(+) (DC) son importantes in vivo para la presentación cruzada de antigenos derivados de patógenos intracelulares y tumores dado que secretan altos niveles de IL-12 (Mashayekhi M, 2011) y fomentan un fenotipo Thl de linfocitos T auxiliares (Maldonado-López R, 1999; Maldonado-López R, 2001) .

Se midió la expresión de CD8 en monocitos mediante citometria de flujo. Se analizaron los monocitos en la composición preincubada (PC) y en la AICC producida usando incubaciones durante 48 horas en bolsas de FEP permeables al gas. Se realizó tinción doble de las células analizadas con anticuerpos contra CD8 conjugado con PE y con un anticuerpo del antígeno de pan-leucocito CD45 conjugado con PerCP. Se distinguieron las poblaciones de leucocitos en función de las señales de SSC y FL3 (CD45), de modo que se pueda analizar la expresión de CD8 en la población de monocitos.

La Tabla 5 resume los resultados de 3 experimentos. La Figura 3 presenta un experimento representativo.

Tabla 5. Expresión de CD8 en monocitos La AICC preparada mediante incubación de la composición de preincubación (PC) durante 48 horas a 37 °C presentó un porcentaje más alto de monocitos que expresan CD8, en comparación con el porcentaje de células CD8+ en la PC (Tabla 5 y Figura 3A). La MFI de CD8 también aumentó (Tabla 5 y Figura 3B).

Ejemplo 4. Efectos de presentación de superantigeno mediante DC a linfocitos T en AICC Para confirmar la funcionalidad de las DC producidas a partir de monocitos durante la incubación de PC para producir la AICC, se agregó la enterotoxina B de estafilococo, un superantígeno (SA), a la mezcla de incubación. Los superantigenos (SA) se asemejan a los péptidos de antigeno procesados, ya que también involucran las moléculas MHC de clase II en las células presentadoras de antigenos y receptor de linfocitos T en linfocitos T. Sin embargo, los SA son ventajosos dado que, a diferencia de otros antigenos, no requieren procesamiento intracelular. Además, los SA estimulan alrededor del 20 % de linfocitos T que presentan determinada familia de receptores de linfocitos T; por el contrario, la mayoría de los péptidos de antígenos estimulan solamente alrededor de 0,001 % de los linfocitos T, dado que solamente estimulan los linfocitos T específicos del antígeno. (Bhardwaj N, 1993). Por lo tanto, se pueden usar SA como sustituyente del antígeno de péptido para analizar la capacidad de las células presentadoras de antígenos, tales como DC, para estimular los linfocitos T.

Análisis de marcadores de activación de linfocitos T CD69 y CD25 (IL-2R) Se evaluó la activación de linfocitos en AICC en presencia de SA mediante análisis de citometría de flujo de la expresión de un marcador de activación de linfocitos conocidos, CD69. La expresión de CD69 aumenta rápidamente en los linfocitos T activados, donde la expresión máxima ocurre 18-48 horas luego de la estimulación. (Simms & Ellis 1996.) Los linfocitos se analizaron primero en composición preincubada (PC) y luego en AICC luego de incubación durante 48 o 72 horas en suero en incubadora celular (a 37 °C, 5 % de C02 y 100 % de humedad) en ausencia o presencia de distintas dosis de la enterotoxina B de estafilococo SA B (SEB) (Sigma Aldrich). La PC se produjo y concentró como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. La fitohemaglutinina (PHA), que es un linfocito T policlonal estimulante que no requiere la interacción con las células presentadoras de antigenos, tales como DC, se usó como control.

Se realizó la tinción doble de los linfocitos primero con anticuerpo anti-CD69-FITC y anticuerpo anti-CD3-APC (ambos de eBioscience) y luego con anticuerpo anti-CD45-PerCP. Las células se analizaron por citometria de flujo. El promedio +SD de 4 experimentos se muestra en la Tabla 6. La Figura 4 presenta un experimento representativo.

Tabla 6. Expresión de CD69 en linfocitos estimulados con SA La AICC a las 48 horas contenia una menor cantidad de linfocitos T positivos para CD69 (CD3+) y linfocitos T negativos (CD3~) en presencia de SA. La adición de SA estimuló ambos subconjuntos de linfocitos, provocando un aumento dependiente de la dosis en el porcentaje de células positivas para CD69 (Tabla 6 y Figura 4A) y en la intensidad de fluorescencia media (MFI) de dichas células (Tabla 6 y Figura 4B). Un aumento en la MFI refleja un aumento en la cantidad de moléculas de CD69 en cada célula activada. El efecto del SA fue mediante un mecanismo dependiente de DC, ya que la fitohemaglutinina (PHA), un activador de los linfocitos que actúa de forma independiente de la presentación de antigenos por parte de DC, no produjo un efecto similar, lo que sugiere un efecto específico de SA mediante un mecanismo dependiente de DC (Tabla 6).

También se estudió el efecto de SA en la expresión del receptor IL-2 (CD25). La presentación de antígenos provoca la liberación de IL-2 a partir de linfocitos y la regulación por incremento del receptor de IL-2 en su superficie, dando como resultado la amplificación de la respuesta inmunitaria. La composición de preincubación se incubó en suero durante 48 horas a 37 °C en presencia de 100 ng/mL de SA. Se realizó la tinción doble de la AICC resultante con anticuerpo anti-CD25-PE y anticuerpo anti-CD3-FITC (ambos de eBioscience), y luego con anticuerpo anti-CD45-PerCP. Los resultados de 4 experimentos se resumen en la Tabla 7 y se muestra un experimento representativo en la Figura 5.

Tabla 7. Expresión de IL-2R luego de la estimulación de superantígeno La presentación de SA por DC a linfocitos aumenta el porcentaje de linfocitos que expresan IL-2R (Tabla 7, Figura 5A) y la cantidad de IL-2R en cada célula (MFI) (Tabla 7, Figura 5B). Este efecto se observó tanto en linfocitos T como en células negativas para CD3.

Análisis de diferenciación del marcador de monocitos CD40 Sorprendentemente, la adición del superantígeno (SA) durante la incubación a 48 horas utilizada para elaborar una AICC no solamente fomentó la activación de linfocitos sino que también estimuló la maduración adicional de DC. CD40 es una molécula coestimulante fundamental en DC que interactúa con CD40L en los linfocitos T e induce la producción de IL-12 a partir de DC. Por lo tanto, la expresión de CD40 indica que las DC son funcionalmente maduras. Para evaluar el estado de maduración de las DC, se midieron los niveles de este marcador en monocitos en la composición de preincubación y en la AICC preparada con o sin distintas cantidades de superantigeno. La Tabla 8 y la Figura 6 resumen los resultados de 3 experimentos independientes realizados con AICC de distintos donantes de sangre.

Tabla 8. Expresión de CD40 en monocitos El porcentaje de células positivas para CD40 en la AICC aumentó al aumentar la cantidad de SA (Tabla 8 y Figura 6A). Los niveles de expresión (MFI) de CD40 también se potenciaron mediante la adición de SA de manera dependiente de la dosis (Tabla 8 y Figura 6B). Tal como se muestra mediante los resultados de MFI, si bien los niveles de CD40 fueron altos en AICC en comparación con la composición de preincubación, la presencia de SA dio como resultado una potenciación incluso mayor de los niveles de CD40 en las células (Tabla 8, "MFI" y Figura 6C). La fitohemaglutinina (PHA), un activador de los linfocitos que actúa de manera independiente de presentación de antigenos mediante DC, no produjo este efecto.

Análisis del contenido de IL-12 en AICC Cuando las DC completamente maduras interactúan con los linfocitos T, las DC producen IL-12. Por consiguiente, también se determinaron los niveles de IL-12.

En el primer experimento, se midió la concentración de IL-12 en la PC y en la AICC preparada usando una incubación durante 48 horas a 37 °C en bolsas FEP. Se agregaron diez L de PC concentrada a una bolsa y se incubaron las células durante 48 horas para preparar AICC. Se centrifugaron composiciones de PC y AICC a 3.500xg durante 30 min a 15 °C y se midieron las concentraciones de IL-12 en los sobrenadantes con Diaclone™-ELISA para IL12p70 (heterodimero activo) (Gen-Probe, Inc) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se centrifugó el suero sin adición de las células, ya sea obtenido el dia de la producción de PC o incubado simultáneamente con AICC durante 48 horas a 37 °C, de la misma manera. Los valores de OD del suero se utilizaron como base y se restaron de los valores de OD de las muestras de PC y AICC, respectivamente.

Tal como se muestra en la Figura 7A, aumentó la concentración de IL-12 en la AICC. Por consiguiente, los resultados proporcionan una prueba adicional de que los monocitos se diferenciaron en DC que pueden producir IL-12 en la AICC. Teniendo en cuenta que los monocitos comprenden solamente alrededor de 10 % de todos los leucocitos en la AICC, estos resultados son bastante significativos.

En el segundo experimento (Figura 7B), la PC se incubó a 37 °C durante 48 horas con o sin 100 ng/ml de SA para producir AICC. Se incubaron cultivos en paralelo a temperatura ambiente (RT). Nuevamente, el contenido de IL-12 aumentó durante la incubación a 48 horas a 37 °C. Sin embargo, en presencia de SA aumentó la concentración de IL-12 más de 2 veces. Estos resultados sugieren que ocurre maduración adicional de DC en presencia de SA. Cuando la incubación se realizó a RT, no se observó efecto de SA, lo que confirma que la liberación de IL-12 es un proceso biológico dependiente de la función celular (Figura 7B).

Análisis de la producción de IL-12 mediante linfocitos de AICC Los linfocitos T sin tratamiento anterior activados por DC mediante la presentación de antigenos adquieren un fenotipo Thl positivo para CD4 y producen grandes cantidades de la citocina mitógena de linfocitos T IL-2. Por consiguiente, si la AICC incluía linfocitos T activados, dichos linfocitos T deberían liberar la IL-2 en presencia de antígenos, dado que la AICC contiene DC maduras.

Para detectar la liberación de IL-2, se midieron las concentraciones de IL-2 en la composición de preincubación (PC) y en la AICC al final de la incubación durante 48 horas a 37 °C en presencia y ausencia de 100 ng/ml de SA. Las muestras se prepararon como se describe para IL-12. Luego de la sedimentación celular, se midieron las concentraciones de IL-2 en los sobrenadantes usando un kit ELISA IL-2 (eBioscience). Tal como se describe anteriormente, las muestras de suero preincubadas e incubadas se utilizaron como controles. Además, se sedimentaron las células incubadas (más/menos SA), se lavaron con medio de cultivo, se volvieron a suspender en suero fresco sin aditivos a 5xl06/mL, y se colocaron en una incubadora durante 3 horas. Luego, se midió la liberación de IL-2 en el suero fresco. Los resultados de 3 experimentos usando distintos lotes de PC como composición inicial se resumen en la Tabla 9.

Tabla 9. Liberación de IL-2 luego de la estimulación de superantígeno Los datos de la Tabla 9 muestran que las DC en la AICC son funcionalmente activas y presentan SA a linfocitos T que provoca fuerte liberación de IL-2. Los resultados de la Tabla 9 también demuestran que los linfocitos activados continúan la liberación de IL-2 luego de que se haya retirado por lavado el SA y otros agentes biológicamente activos en la AICC. Tal como se muestra en la Figura 8, las concentraciones de IL-2 en AICC producida en presencia de SA fueron altas en las tres muestras derivadas de distintos sujetos. Hubo una correlación entre la concentración de IL-2 en las muestras incubadas y la capacidad de los linfocitos de liberar IL-2 en suero fresco. Se produjeron cantidades insignificantes de IL-2 cuando no se agregó SA al medio de incubación (es decir, sin presentación de antigenos).

Análisis de la producción de IFN-gamma mediante linfocitos de AICC Los linfocitos T auxiliares CD4 y los linfocitos T efectores de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8 activados por DC mediante presentación de antigenos producen grandes cantidades de interferón gamma (IFN-g). IFN-g es una citocina que es fundamental para la inmunidad innata y adaptativa y para el control de tumores. Por consiguiente, si la AICC incluía linfocitos T activados, debería contener IFN-g.

Se midió la liberación de IFN-g durante una incubación durante 48 horas en presencia de SA en la composición de preincubación (PC) y en la AICC al final de la incubación durante 48 horas a 37 °C en presencia y ausencia de 100 ng/ml de SA. Las muestras se prepararon como se describe para IL-12. Se midió la concentración de IFN-g en sobrenadantes luego de la sedimentación celular usando un kit ELISA IFN-g (eBioscience). Las muestras de suero preincubadas e incubadas se utilizaron como controles. La cantidad de IFN-g naturalmente presente en el suero osciló entre 1,5 y 5 mg/mL.

Estas concentraciones de suero base se restaron de los valores obtenidos para las muestras experimentales. Además, se sedimentaron las células incubadas (más/menos SA), se lavaron con medio de cultivo y se volvieron a suspender en suero fresco sin aditivos a 5xl06/mL. Las células se incubaron durante 3 horas y se midió la liberación de IFN-g en el suero fresco. Los resultados de 4 experimentos con distintos lotes de PC se resumen en la Tabla 10.

Tabla 10. Liberación de IFN-g luego de la estimulación de superantigeno Los datos de la Tabla 10 muestran que las DC en la AICC son funcionalmente activas y presentan SA a linfocitos T, lo que provoca una fuerte liberación de IFN-g. Los datos de la Tabla 10 también demuestran que los linfocitos activados continúan liberando IFN-g luego de retirar por lavado el SA y otros agentes biológicamente activos en la AICC. Tal como se muestra en la Figura 9, hubo una correlación entre las concentraciones de IFN-g en las muestras incubadas y la capacidad de los linfocitos de liberar IFN-g en suero fresco. Se producen cantidades insignificantes de IFN-g cuando no se agrega SA al medio de incubación y no ocurre presentación de antigenos.

Ejemplo 5. Expresión de marcadores de activación específicos de linfocitos NK También se evaluó la expresión de dos marcadores de activación de linfocitos NK conocidos, CD57 y CD107a, en la composición de preincubación, y en la AICC preparada mediante incubación durante 48 horas a 37 °C con o sin SA. Se tiñeron leucocitos con anticuerpos contra CD57 conjugado con APC o con anticuerpos contra CD107a conjugado con PE. Se agregó un segundo anticuerpo contra el marcador CD14 en monocitos conjugados con FITC o APC, respectivamente, para lograr una mejor resolución entre las poblaciones de leucocitos. Se analizaron las células dentro de una ventana de linfocitos.

Los resultados de dos experimentos se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11. Expresión de marcadores de NK en linfocitos No se encontraron diferencias significativas en la MFI para ninguno de los marcadores. El porcentaje de células positivas para CD107 aumentó (66,4 % vs 47,5 %) cuando se realizó la incubación en presencia de SA.

Ejemplo 6. Tratamiento de infección por V1H La composición celular inmunoestimulante activada es particularmente útil para estimular una respuesta inmunitaria a V1H.

Para estimular una respuesta inmunitaria a V1H, se prepara una AICC a partir de un individuo infectado con V1H. Se puede agregar un mM de zidovudina (Retrovir) a AICC para evitar la infección con VIH. Se estimula la AICC (ya sea durante la preparación o en una incubación posterior separada) con uno o más antígenos o péptidos antigénicos de VIH. Los ejemplos de antigenos de VIH incluyen uno, una combinación, o todos de un péptido de Tat, péptido de Nef, péptido de Rev, péptido de Gag, péptido de Env, péptido de Pol, péptido de Vpu, péptido de Vif y Padre. De manera alternativa, los vectores vivos recombinantes, tales como los vectores de poxvirus (p. ej., avipoxvirus o el virus Ankara de vaccinia modificada (MVA) de la cepa de poxvirus atenuado) construidos con casetes de expresión de proteina viral se incuban con AICC para transfectar DC con genes virales. Se confirma la eficacia de la transfección mediante análisis de citometria de flujo de expresión intracelular de proteínas virales en células positivas para CD86 en la composición (se usa CD86 como marcador superficial de DC). El análisis de citometria de flujo de las células de AICC teñidas con indicadores de células muertas y apoptóticas (7-AAD y anexina V, respectivamente) confirma la viabilidad de la DC que contiene antígeno. Se calcula la actividad funcional de las DC gue tienen péptidos virales ex vivo y en un ensayo clínico.

Para los estudios ex vivo, se analiza la inducción de la proliferación de linfocitos T CD4+ y CD8+ de pacientes infectados con V1H mediante DC. Los linfocitos de sangre periférica del paciente (células mononucleares sin monocitos luego de la adhesión al plástico) se usan como fuente de linfocitos T. Los linfocitos sin monocitos se etiquetan con CellTrace CFSE (Molecular Probes) y se cultivan conjuntamente con AICC autóloga que contiene antigenos virales, durante 6-7 dias. Las células etiquetadas con CFSE se analizan mediante citometria de flujo. Las células que proliferan luego del cultivo conjunto presentan una menor intensidad de CFSE, en comparación con el control. Para identificar los linfocitos T CD4+ y CD8+, las células se etiquetan con los anticuerpos anti-CD3, anti-CD4 y anti CD8 (p. e j ., cóctel de linfocitos T NHP, BD).

Se confirma la activación de linfocitos T en la AICC derivada de pacientes infectados con V1H e incubados con antigenos virales mediante expresión de CD69 e IL-2R (CD25) en linfocitos y medición de la producción de IL-2 e INFg, como se describe en el Ejemplo 4.

Para los estudios clínicos, la composición de AICC incubada con antígenos virales se aspira en una jeringa estéril de cualquier tamaño, usando una aguja de calibre 18- (18G). Se realiza la aspiración lentamente para minimizar el daño a las células. Si bien el tamaño de la jeringa y la aguja no son restrictivos de modo alguno, se prefiere un calibre de aguja grande para la aspiración. Esto facilita la transferencia y reduce el daño celular.

Se administra la AICC inyectando la composición sistémicamente, por ejemplo, mediante administración intravenosa o subcutánea. La AICC también se puede inyectar en los ganglios linfáticos regionales. El médico puede elegir administrar dosis repetitivas de AICC si se determina que es necesario según los parámetros clínicos.

Se controla al paciente y se determina el efecto de la AICC en los parámetros como la carga viral en plasma y los conteos de linfocitos T CD4. Se recogen linfocitos de sangre periférica del paciente (células mononucleares sin monocitos luego de la adhesión al plástico) y se congelan al inicio y en varios momentos luego de la vacunación. Se utilizan para evaluar las respuestas inmunitarias específicas dirigidas contra péptidos de V1H-1 agrupados o las secuencias de ARN usadas para la carga de AICC. Por ejemplo, en un análisis, se calcula la cantidad de clones de linfocitos T que producen interferón (IFN)-y entre los linfocitos del paciente usando ELISPOT. Otros análisis calculan la capacidad de linfocitos T del paciente para proliferar en un cultivo conjunto con DC de AICC pulsada con péptidos de V1H-1 como se describe anteriormente y/o para provocar la lisis citotóxica de las células diana infectadas viralmente pulsadas con el péptido correspondiente. Se analiza la apoptosis celular diana mediante citometría de flujo usando tinción de anexina V y caspasa 3.

Todas las publicaciones mencionadas en la memoria descriptiva, que incluye las publicaciones de patente y las publicaciones que no son patentes, indican el nivel de experiencia de los expertos en la téenica con la cual está relacionada esta invención. Todas estas publicaciones se incorporan a la presente mediante esta referencia en la misma medida que si cada publicación individual se indicara especifica e individualmente como incorporada mediante esta referencia.

Otras modalidades de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la consideración de la memoria descriptiva y la práctica de la invención descrita en la presente. Se pretende que la memoria descriptiva y los ejemplos se consideren solamente como ejemplos, con un verdadero alcance y espíritu de la invención indicado por las reivindicaciones que figuran a continuación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar una infección viral que comprende administrar a un sujeto infectado una composición de células dendriticas maduras, linfocitos T auxiliares activados, linfocitos T citoliticos y al menos otro tipo de célula leucocitaria.

2. Un método para tratar una infección viral, donde el método comprende: (a) incubar leucocitos en condiciones de tiempo y temperatura adecuadas para activar los leucocitos, (b) cultivar los leucocitos activados en un medio de soporte en condiciones de tiempo y temperatura que inducen la maduración de células dendriticas en la composición, y (c) introducir la composición que comprende las células dendriticas al sujeto para tratar de esa forma la infección viral.

3. Un método para tratar una infección viral, donde el método comprende (a) incubar leucocitos no inactivos en un medio de soporte en condiciones de tiempo y temperatura que inducen la maduración de las células dendriticas en la composición, y (b) introducir la composición que comprende las células dendriticas al sujeto para tratar de esa forma la infección viral.

4. Un método para tratar una infección viral, donde el método comprende: (a) preparar una composición que comprende células dendriticas maduras i) proporcionando leucocitos, ii) permitiendo que los leucocitos pasen de un estado inactivo a un estado activo manteniendo los leucocitos a temperatura ambiente durante alrededor de 8 a 20 horas, iii) sometiendo los leucocitos a choque hipo-osmótico, y iv) incubando los leucocitos sometidos al choque durante 36 horas hasta 14 dias en un medio de soporte para lograr asi una composición que comprende DC maduras, y (b) introduciendo la composición que comprende las células dendriticas en el sujeto para tratar asi la infección viral.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde la composición que comprende células dendriticas se expone a al menos un epitopo peptidico del virus.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde la infección viral es una infección viral con virus de inmunodeficiencia humana (V1H), virus de herpes simple 1 (VHS 1), virus de herpes simple 2 (VHS 2), virus de hepatitis C (VHC) o virus del papiloma humano (VPH).

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde la infección viral es una infección con V1H.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde la infección viral es crónica.

9. Un método para tratar una infección con un organismo infeccioso, que comprende administrar a un sujeto infectado una composición de células dendriticas maduras, linfocitos T auxiliares activados, linfocitos T citoliticos y al menos otro tipo de célula leucocitaria.

10. Un método para tratar una infección con un organismo infeccioso, el método comprende: (a) incubar leucocitos en condiciones de tiempo y temperatura adecuadas para activar los leucocitos, (b) cultivar los leucocitos activados en un medio de soporte en condiciones de tiempo y temperatura que inducen la maduración de las células dendriticas en la composición, y (d) introducir la composición que comprende las células dendriticas al sujeto para tratar de esa forma la infección viral.

11. Un método para tratar una infección, donde el método comprende (a) incubar leucocitos no inactivos en un medio de soporte en condiciones de tiempo y temperatura que inducen la maduración de las células dendríticas en la composición, y (b) introducir la composición que comprende las células dendríticas al sujeto para tratar de esa forma la infección.

12. Un método para tratar una infección con un organismo infeccioso, el método comprende: (a) preparar una composición que comprende células dendríticas maduras: i) proporcionando leucocitos, ii) permitiendo que los leucocitos pasen de un estado inactivo a un estado activo manteniendo los leucocitos a temperatura ambiente durante alrededor de 8 a 20 horas, iii) sometiendo los leucocitos a choque hipo-osmótico, y iv) incubando los leucocitos sometidos al choque durante 36 horas hasta 14 días en un medio de soporte para lograr así una composición que comprende DC maduras, y (b) introduciendo la composición que comprende las células dendríticas en el sujeto para tratar así la infección.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde la composición que comprende células dendríticas se expone a al menos un epítopo peptídico del organismo infeccioso .

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-13, donde la infección es una infección bacteriana.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-13, donde la infección es una infección micótica.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-13, donde la infección es una infección protozoaria.