CN109810995A - 编码car的核苷酸序列、表达该car的robo1 car-nk细胞及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种编码CAR的核苷酸序列、表达该CAR的ROBO1 CAR‑NK细胞。本发明提供的ROBO1 CAR‑NK细胞通过将ROBO1抗体用于CAR‑NK细胞的构建，其以ROBO1分子为靶抗原，利用ROBO1 CAR‑NK细胞特异性地杀伤肿瘤细胞。其可作为肿瘤类疾病的治疗药物，用于ROBO1分子高表达的肿瘤的治疗，且无细胞因子风暴等不良现象，为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治疗方法；且与ROBO1 CAR‑T细胞相比毒副作用小，安全性高，且杀伤效果更好。

Description

编码CAR的核苷酸序列、表达该CAR的ROBO1 CAR-NK细胞及其 制备和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种编码CAR的核苷酸序列、表达该CAR的ROBO1 CAR-NK细胞及其制备和应用。
背景技术
乳腺是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的，乳腺癌是发生在乳腺腺体上皮组织的恶性肿瘤，乳腺癌中99％发生在女性，男性仅占1％。
乳腺并不是维持人体生命活动的重要器官，原位乳腺癌并不致命；但由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间连接松散，容易脱落。癌细胞一旦脱落，游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身，形成转移，危及生命。目前，乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。
全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。美国8名妇女一生中就会有1人患乳腺癌。中国不是乳腺癌的高发国家，但不宜乐观，近年我国乳腺癌发病率的增长速率却高出高发国家1-2个百分点。
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，缩写CAR)修饰的免疫细胞使用遗传工程手段修饰免疫细胞使其表达外源性抗肿瘤基因。CAR基因主要包括细胞外识别域和细胞内信号转导结构域：前者用于识别肿瘤表面特异性分子，后者用于启动识别肿瘤表面分子后的免疫细胞应答，发挥细胞毒作用。其主要以T-细胞为载体，但CAR-T细胞治疗肿瘤时会出现IL-6等细胞因子急剧升高，产生细胞因子风暴现象，存在靶向/脱靶毒性和神经毒性等问题，严重时会危及患者生命。并且,T细胞必须分离出体外(这一过程耗时长且费用高)。而且，由于T细胞是针对特定患者进行修改，但是一些患者可能无法采集T细胞，或者没有足够的时间等待T细胞的准备过程，虽然目前CAR-T在向通用型的CAR-T发展，但其实又增加了临床风险以及操作难度。此外，面对CAR-T的高额费用，这些局限性可能会导致一些有望受益的患者无法接受CAR-T免疫疗法。
而自然杀伤(natural killer，缩写NK)细胞是非特异性免疫系统的重要组成部分，先天免疫系统反应的关键性介质细胞。NK细胞是一种广谱免疫细胞，具有快速发现和摧毁异常细胞(如癌症或病毒感染的细胞)的特异功能，而且不需要提前致敏或HLA配型，即可展示强大的溶解异常细胞的活性。使用免疫细胞(包括NK细胞)来治疗癌症是近年来新趋势，这种新疗法有望为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治愈希望。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种编码CAR的核苷酸序列、表达该CAR的ROBO1 CAR-NK细胞及其制备和应用，该细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤，具有更高效的肿瘤杀伤活性，并且毒副作用小，安全性更高。
本发明一方面提供一种编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活该NK细胞。
示例性地，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5、FN1、FN2和FN3结构域中的一种或多种。
示例性地，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的FN3结构域。
示例性地，所述的抗原结合结构域为特异性结合ROBO1的FN3结构域的抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段为Fab或scFv。
示例性地，所述的跨膜结构域选自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种。
优选地，所述的跨膜结构域为CD8跨膜结构域。
示例性地，所述的共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述的共刺激分子选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和OX40中的一种或多种。
优选地，所述的共刺激信号传导区包含4-1BB和CD3ζ胞内结构域。
在本发明的一个具体实施方式中，所述嵌合抗原受体是结构为scFV-CD8-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白，所述SCFV-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸的序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述SCFV-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的编码核苷酸的序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示。
本发明的另一方面提供一种构建体，包括上述的编码嵌合抗原受体的核苷酸序列。
本发明的再一方面提供一种嵌合抗原构建体，由上述的核苷酸序列编码。
本发明的又一方面提供一种ROBO1 CAR-NK细胞，所述ROBO1 CAR-NK细胞能够表达嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活该NK细胞。
示例性地，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5、FN1、FN2和FN3结构域中的一种或多种。
示例性地，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的FN3结构域。
示例性地，所述的抗原结合结构域为特异性结合ROBO1的FN3结构域的抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段为Fab或scFv。
示例性地，所述的跨膜结构域选自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种；优选地，所述的跨膜结构域为CD8跨膜结构域；和/或，
所述的共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述的共刺激分子选自：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和OX40中的一种或多种；优选地，所述的共刺激信号传导区包含4-1BB和CD3ζ胞内结构域。
示例性地，ROBO1 CAR-NK细胞能够表达SCFV-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，该融合蛋白能够特异性识别ROBO1分子，以ROBO1-FN3结构域为靶点。
在本发明的一个具体实施方式中，所述SCFV-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的编码核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示或SEQ ID NO：3所示或它们的同源序列等。
示例性地，所述SCFV-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO：2所示或SEQ ID NO：4所示或它们的同源序列等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述ROBO1 CAR-NK细胞能够有效地杀伤或杀死肺癌细胞系、胰腺癌细胞系、肝癌细胞系、神经胶质瘤细胞系、乳腺细胞系、结肠癌细胞系或前列腺癌细胞系。
示例性地，所述细胞肺癌细胞系为H1299或A549。
示例性地，所述胰腺癌细胞系为ASPC-1或BXPC3。
示例性地，所述肝癌细胞系为HepG2。
示例性地，所述神经胶质瘤细胞系为U87-MG或SH-SY5Y。
示例性地，所述乳腺癌细胞系为MCF-7、HCC1143、HCC1187、HCC1599、HCC1806、HCC38、HCC1937或MDA-MB-453。
本发明另一方面还提供了上述ROBO1 CAR-NK细胞的制备方法，其包括如下步骤：
(1)合成和扩增上述核苷酸序列，将所述SCFV-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因克隆到慢病毒表达载体上；优选地，所述核苷酸序列为SCFV-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因；
(2)利用慢病毒包装质粒和步骤(1)得到的慢病毒表达载体质粒感染293T细胞，包装和制备慢病毒；
(3)利用步骤(2)得到的慢病毒感染NK-92细胞，得到CAR-NK细胞。
本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述ROBO1 CAR-NK细胞。
示例性地，所述药物组合物中ROBO1 CAR-NK细胞与肿瘤细胞的效靶比为(0.5～1)：2，优选为(0.5～1)：1。
示例性地，所述药物组合物还包括任选地药学上可接受的辅料。
示例性地，所述药物组合物的剂型为水剂。
本发明所述的药学上可接受的辅料优选为药学上可接受的注射剂辅料，例如等渗的无菌盐溶液(磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，氯化镁等，或上述盐的混合物)，或干燥的例如冷冻干燥的组合物，其适当的通过加入无菌水或生理盐水形成可注射溶质等。
本发明还提供上述ROBO1 CAR-NK细胞或药物组合物用于治疗和/或预防癌症的方法，所述方法包括将有效量的含有ROBO1 CAR-NK细胞的药物施于需要治疗的患者。
示例性地，所述的癌症为高表达ROBO1分子的肿瘤及相关疾病。
示例性地，所述癌症为肝癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤或肺癌等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述癌症为乳腺癌。
示例性地，所述ROBO1 CAR-NK细胞的摄入量为(0.5～5)×109细胞/次。
示例性地，所述含有ROBO1 CAR-NK细胞的药物的摄入方法为瘤内注射、静脉注射、胸腔内注射或局部介入。
本发明还提供一种上述ROBO1 CAR-NK细胞或药物组合物用于制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。
示例性地，所述癌症为高表达Robo1的肿瘤及相关疾病。
示例性地，所述癌症为肝癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤或肺癌；优选地，所述癌症为乳腺癌。
在本发明的一个具体实施方式中，所述含有ROBO1 CAR-NK细胞的药物的摄入方法为静脉注射。
本发明提供的ROBO1 CAR-NK细胞至少具有如下优势之一：通过将ROBO1抗体用于CAR-NK细胞的构建，其以ROBO1分子为靶抗原，利用ROBO1 CAR-NK细胞特异性地杀伤肿瘤细胞；其可作为肿瘤类疾病的治疗药物，用于ROBO1分子高表达的肿瘤的治疗，且无细胞因子风暴等不良现象，为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治疗方法；并且通过对NK92细胞进行改造，装上CAR后，又大大增加了它的靶向性,并增加抗肿瘤靶点ROBO1，在提高靶向性地同时，大大地提高其抗肿瘤性能；此外,该ROBO1 CAR-NK细胞通过与ROBO1 CAR-T细胞相比其杀伤效果明显好很多,可以更有效的杀伤肿瘤；也就是说本发明构建的ROBO1CAR-NK细胞，通过对NK92细胞进行改造，装上CAR后不但增加了其靶向性，而且由于使用的是NK细胞，大大提高了其安全性，毒副作用小，成本低，并且由于NK细胞、CAR和抗ROBO1靶点的共同作用，其杀伤效果好，且明显优于ROBO1 CAR-T细胞。
附图说明
图1所示为本发明实施例1提供的慢病毒质粒载体PRRLSIN-SCFV(anti ROBO1-FN3)的结构示意图。
图2a-2b所示为本发明实施例3提供的ROBO1 CAR-NK流式检测CAR细胞阳性率的结果图。
图3a-3b所示为本发明实施例3提供的ROBO1 CAR-NK流式检测CD56分子阳性率的结果图。
图4a-4b所示为本发明实施例4提供的ROBO1 CAR-T流式检测阳性率的结果图。
图5a所示为本发明实施例5提供的ROBO1-CAR NK92细胞、ROBO1M-CAR NK92细胞杀伤H1299细胞的实验结果图。
图5b所示为本发明实施例5提供的ROBO1-CAR NK92细胞、ROBO1M-CAR NK92细胞杀伤A549细胞的实验结果图。
图5c所示为本发明实施例5提供的ROBO1-CAR NK92细胞、ROBO1M-CAR NK92细胞杀伤ASPC-1细胞的实验结果图。
图5d所示为本发明实施例5提供的ROBO1-CAR NK92细胞、ROBO1M-CAR NK92细胞杀伤HepG2细胞的实验结果图。
图5e所示为本发明实施例6提供的ROBO1M-CAR NK92细胞杀伤SH-SY5Y细胞的实验结果图。
图5f所示为本发明实施例6提供的ROBO1M-CAR NK92细胞杀伤U87-MG细胞的实验结果图。
图6a所示为本发明实施例7提供的ROBO1M CAR-NK细胞杀伤MCF7细胞的实验结果图。
图6b所示为本发明实施例7提供的ROBO1M CAR-NK细胞杀伤HCC1143细胞的实验结果图。
图6c所示为本发明实施例7提供的ROBO1M CAR-NK细胞杀伤HCC1187细胞的实验结果图。
图6d所示为本发明实施例7提供的ROBO1M CAR-NK细胞杀伤HCC1599细胞的实验结果图。
图6e所示为本发明实施例7提供的ROBO1M CAR-NK细胞杀伤HCC1806细胞的实验结果图。
图6f所示为本发明实施例7提供的ROBO1M CAR-NK细胞杀伤HCC38细胞的实验结果图。
图7所示为本发明实施例8提供的Robo1M CAR-NK细胞治疗乳腺癌前后对比实验结果图。
图8a所示为本发明实施例8提供的病灶直接注射Robo1M CAR-NK细胞后细胞因子的检测结果图。
图8b所示为本发明实施例8提供的静脉回输Robo1M CAR-NK细胞后细胞因子的检测结果图。
图9所示为本发明实施例8提供的Robo1M CAR-NK细胞治疗过程示意图。
图10所示为本发明实施例8提供的乳腺癌病人组化检测结果图。
图11所示为本发明对比实施例1中ROBO1M CAR-NK细胞和ROBO1M CAR-T杀伤HCC1937细胞的对比实验结果图。
图12所示为本发明对比实施例1中ROBO1M CAR-NK细胞和ROBO1M CAR-T杀伤MCF7细胞的对比实验结果图。
图13所示为本发明对比实施例1中ROBO1M CAR-NK细胞和ROBO1M CAR-T杀伤MDA-MB-453细胞的对比实验结果图。
图14所示为本发明对比实施例1中ROBO1M CAR-NK细胞和ROBO1M CAR-T杀伤BXPC3细胞的对比实验结果图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
具体而言，本发明所述的编码SCFV-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的核苷酸的序列是任何能够编码该融合蛋白的任何DNA序列，优选地，该序列为SEQ ID NO：2或其互补序列，或者SEQ ID NO：4或其互补序列。另一方面，本发明所述的编码SCFV-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的核苷酸的序列可为在严紧条件下与由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的核苷酸序列进行杂交、且编码该融合蛋白的多核苷酸或其互补序列；
本文所述的“严紧条件”，可以为低严紧条件、中严紧条件、高严紧条件中的任一种，优选为高严紧条件。示例性地，“低严紧条件”可为30℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“中严紧条件”可为40℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“高严紧条件”可为50℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件。本领域技术人员应当理解温度越高越能得到高同源性的多核苷酸。另外，本领域技术人员可以选择影响杂交的严紧度的温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个因素形成的综合结果来实现相应的严紧度。
除此之外可杂交的多核苷酸还可以为，通过FASTA、BLAST等同源性检索软件用系统设定的默认参数进行计算时，与编码序列号6的多核苷酸具有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸。
核苷酸序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的算法规则BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268,1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873,1993)来确定。基于BLAST算法规则的程序BLASTN、BLASTX已被开发(Altschul SF,et al:JMol Biol 215:403,1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，如使参数为score＝100、wordlength＝12；此外，使用BLASTX分析氨基酸序列时，如使参数为score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程序的系统可设定默认参数值。
本发明的药物的有效量可为治疗癌症、或缓解癌症症状或抑制癌症细胞的任何量，其可以是相当于约0.1-10.0×109细胞。有效量的测定在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文提供的公开内容的启示下。
根据本发明，本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以以任意有效剂量数施用给药受试者。优选地，本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以以多次剂量给药，例如从约2至约20次剂量，更优选从约4-10次剂量。在特别优选的实施方案，在给药过程中，以每三周给药约一次的频率将本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物给药至受试者，例如注射、输注或口服。在特别优选的实施方案，给药为通过注射施用至荷瘤部位。
应当理解本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以按用于通过任意适宜的途径给药的任意适宜的方式配制。
本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物的剂量单位是基于常规进行给药受试者。例如，剂量单位可以给药多于每日一次、每周一次、每月一次等。剂量单位可以是以两次/周为基础给药，即每周两次，例如每三天一次。
本发明的药学产品中所包含的涉及该药学产品的说明书可以含有如下内容：适应症(例如乳腺癌)、施用剂量(例如上述所示例性说明的)以及可能产生的副作用等等。
本发明中，术语“抗体”指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体等(Harlow等，1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等，1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等，1988,Science 242:423-426)。
术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分，并指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段，由抗体片段形成的线性抗体、scFv抗体和多特异性抗体。
除非另有规定，“编码核苷酸”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质的核苷酸序列可包括内含子。
术语“慢病毒”指的是逆转录病毒科的属，其能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞；它们可传递显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，以便它们是基因传递载体的最有效的方法之一。
术语“启动子”被定义为开始多核苷酸序列的特异性转录需要的，由细胞的合成机器识别或引导合成机器的DNA序列。
术语“特异性结合”指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样本中的其他分子。
术语“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等等。
术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌症细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其他部分。各种癌症的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。
如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。
本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。
本文中出现的英文名称不区分大小写，如ROBO1、Robo1、robo1等表示的含义相同；Robo1 CAR-NK、Robo1-CAR NK表示的含义相同；Robo1 CAR-NK与Anti Robo1-CAR NK表示相同的含义，均表示抗ROBO1分子的CAR-NK细胞；Robo1M CAR-NK与Anti Robo1M-CAR NK表示相同的含义，均表示突变型的抗ROBO1分子的CAR-NK细胞；NK-92、NK92均表示NK92细胞。
本发明所述的“NK”为人体正常NK细胞或NKT细胞或NK细胞系，其包括NK-92细胞，YT细胞，NKL细胞，HANK-1细胞，NK-YS细胞，KHYG-1细胞，SNK-6细胞和IMC-1细胞等。本发明的具体实施例中以NK-92细胞为例进行说明。
为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。
实施例1慢病毒载体的制备
分别合成SCFV(Anti ROBO1-FN3)-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因序列如SEQ ID NO：2所示)和突变型SCFV(Anti ROBO1-FN3)-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，基因序列如SEQ ID NO：4所示)。以SCFV(Anti ROBO1-FN3)-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因为例说明ROBO1 CAR-NK细胞的制备过程，突变型SCFV(Anti ROBO1-FN3)-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因制备ROBO1M CAR-NK细胞的过程与其相同。
通过酶切，将SCFV(Anti ROBO1-FN3)-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因序列转化连接到PRRSLIN载体中，基因上游为EP-1α启动子。载体转化Stbl3大肠杆菌菌株，氨苄青霉素筛选，获得阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定克隆，获得PRRLSIN-SCFV(anti ROBO1-FN3)慢病毒转染载体(如图1所示)。
实施例2慢病毒的制备
(1)转染前24小时，以每皿约8×106将293T细胞接种至15cm培养皿中。确保转染时293T细胞在80％左右的汇合度且均匀分布于培养皿中。
(2)准备溶液A和溶液B
溶液A：6.25ml 2×HEPES buffer缓冲液(5个大皿一起包装的量，效果最好)。
溶液B为分别加入以下质粒所得的混合物：112.5μg PRRLSIN-SCFV(anti ROBO1-FN3)(target plasmid)；39.5μg pMD2.G(VSV-G envelop)；73μg pCMVR8.74(gag，pol，tat，rev)；625μl 2M钙离子溶液。溶液A总体积：6.25ml。
充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，逐滴加入溶液B，得到A和B的混合溶液，静置5-15分钟。轻轻涡旋上述A和B的混合溶液，逐滴加入含293T细胞的培养皿中，轻轻前后晃动培养皿使DNA与钙离子的混合物均匀分布，再将该培养皿(不要旋转培养皿)放置于培养箱中培养16-18小时。更换新鲜培养基，继续培养，分别在48小时和72小时后收集含病毒的上清液。500g，25℃离心10分钟。PES膜(0.45μm)过滤。以70％乙醇消毒贝克曼库尔特Ultra-clear SW28 centrifuge tubes，并置于紫外灯下消毒30分钟。将已过滤的含慢病毒的上清液转移至离心管中。在离心管底部小心铺上一层20％蔗糖(每8ml上清液加1ml蔗糖)。以PBS平衡离心管，25000rpm(82，700g)，4℃离心2小时。小心取出离心管，倒掉上清液，倒置离心管去掉残余液体。加入100μl PBS，密封离心管，在4℃放置2小时，每20分钟轻轻涡旋一次，500g离心1分钟(25℃)，收集病毒上清。再将收集的病毒上清，于冰上冷却后，置于-80℃保存。
实施例3 ROBO1 CAR-NK细胞的制备
将NK-92细胞密度调整至2-3×105/ml，按体积比(V/V)病毒：细胞培养基＝1:5比例添加实施例2制得的病毒，同时添加聚凝胺8μg/ml。4h之后，补加等量的新鲜的完全培养基将细胞密度调整至1×105/ml继续培养。次日，将所有的细胞离心，加入新鲜的培养基，继续培养。每隔1-2天进行补液，使细胞密度维持在2-3×105/ml。72h后进行CAR抗体染色，同时流式分选ROBO1 CAR NK-92阳性细胞并扩大培养。每天观察培养基的颜色变化、细胞密度、细胞形态并作相应记录。
流式分选后，阳性的ROBO1 CAR NK-92细胞在GMP车间进行持续培养，将其扩增到临床使用所需计量后，进行离心和三次洗涤(PBS溶液)，最终将ROBO1 CAR-NK 92重悬在生理盐水中，用于临床治疗回输。
临床治疗回输前，参考药典的检测方法，对ROBO1 CAR-NK 92进行质量检测，保证细胞质量的安全性。检测结果如表1所示。
表1 ROBO1 CAR NK-92细胞质量检测
放行参数 GMP放行标准 实际检测结果
无菌检测(液体培养法) 阴性 阴性
无菌检测(革兰氏染色法) 阴性 阴性
细胞活率(台酚蓝染色) >95％ 98％
内毒素(鲎试剂法) <5EU/kg/hr <5EU/kg/hr
CAR阳性率(流式检测) >90％ 96.31％(见图2)
支原体DNA(PCR法) 阴性 阴性
CD56+(流式检测) 阳性 阳性(见图3)
利用流式检测CAR NK-92细胞阳性率，流式检测结果如图2a和图2b所示。图2a和图2b中，所采用的抗体为APC荧光标记，在横坐标上进行表示，NK92细胞若成功表达CAR分子，该信号值将显著升高。从图2a和图2b中可以看出，APC荧光标记的信号值显著升高，表明NK-92细胞成功表达出CAR分子，CAR-NK92阳性率为98.89％。
图3a和图3b为ROBO1 CAR-NK流式检测CD56分子阳性率的结果图。图3a为对照组，图3b实验组。从图3a和3b中可以看出，CD56分子为阳性，说明制备的CAR-NK92细胞未丢失CD56分子，未发生其它形式的分化，保存NK细胞的基本特性。
以同样的方法制备ROBO1M CAR-NK细胞。
实施例4 ROBO1 CAR-T细胞的制备
(1)T细胞的制备：抽取健康人的血液100ML,(15/50ml BD管)Ficall试剂梯度离心分离PBMC；使用T细胞培养基(X-VIVO 15；血清(5％)/血浆；IL-2 300IU(进口)/ml，500IU(国内)/ml，双抗10％)激活培养分离所得PBMC，得到激活培养的PBMC；然后将激活培养后的PBMC重悬，分离CD3+的T细胞(一般占PBMC的50％到60％的比例)。磁珠与T细胞的比例是(磁珠：T＝3:1),收集CD3+的T细胞(剩余细胞可用于其他实验)，得到T细胞。
(2)ROBO1 CAR-T细胞的制备：培养(1)得到的T细胞，以1×106/ml的密度培养24-48h，2～3天换液，得到换液培养后的T细胞；再将换液培养后的T细胞用新鲜的培养基进行细胞浓缩,浓缩至细胞密度为3～5×106个/ml进行病毒转导；按体积比(V/V)病毒：细胞培养基＝1:10比例添加病毒(按实施例2的方法制得)，病毒加进去后充分混匀，37℃，5％CO2静置培养4小时后，补加培养基，稀释细胞浓度为1×105/ml；第二天换液，把所有的细胞离心，加入新鲜的培养基，培养观察，2～3天后半量换液(半量换液：一般培养基进行离心，之后用新鲜的培养基稀释细胞，继续添加到培养瓶中)，使维持细胞密度在2～3×105/ml，连续培养7天后得到ROBO1 CAR-T细胞,该ROBO1 CAR-T细胞中所用的ROBO1的序列与ROBO1M相同。
同时通过流式分选ROBO1 CAR-T阳性细胞并扩大培养。利用流式检测CAR NK-T细胞阳性率，流式检测结果如图4a和图4b所示，其中所采用的抗体为APC荧光标记，在横坐标上进行表示,T细胞若成功表达CAR分子，该信号值将显著升高。从图4a和图4b中可以看出，APC荧光标记的信号值显著升高，表明T细胞成功表达出CAR分子，T细胞的阳性率为96.44％。
实施例5 ROBO1 CAR-NK细胞、ROBO1M CAR-NK细胞对体外肿瘤杀伤效果的评估
利用CCK-8方法(参见：Human Leukocyte Antigen-G Inhibits the Anti-TumorEffect of Natural Killer Cells via Immunoglobulin-Like Transcript 2 inGastric Cancer,Rui Wan Zi-Wei Wang Hui Li,et al.)检测ROBO1 CAR-NK细胞、ROBO1MCAR-NK细胞对不同肿瘤细胞系的杀伤效果，肿瘤细胞系包括：肺癌细胞系H1299、肺癌细胞系A549、胰腺癌细胞系ASPC-1和肝癌细胞系HepG2。实验操作方法如下：
(1)在24孔板中配制1ml肿瘤细胞悬液(2X104个/孔)。将培养板在培养箱预培养12h。
(2)弃去24孔板的培养上清，每孔加入1ml效应细胞，效应细胞与靶细胞数目的比例为1:1。培养基对照孔只加1ml培养基，每个实验置三个复孔。效应细胞与靶细胞共孵育4小时。
(3)每孔加入100ulCCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育2h。
(4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
(5)杀伤率＝(As-Ab)/(Ac-Ab)X100％；
As：试验孔(含有肿瘤细胞的培养基、CCK-8、CAR-NK)；
Ac：对照孔(含有肿瘤细胞的培养基、CCK-8)；
Ab：空白对照(不含细胞和CAR-NK的培养基、CCK-8)；
ROBO1 CAR-NK细胞、ROBO1M CAR-NK细胞体外肿瘤杀伤效果评估的实验结果如图5a-5d所示。
图5a-5d的实验结果证实，ROBO1-CAR NK 92细胞、ROBO1M-CAR NK 92细胞对肺癌细胞系H1299、肺癌细胞系A549、胰腺癌细胞系ASPC-1和肝癌细胞系HepG2均有很强的杀伤效果，其效果均优于普通的NK-92细胞。
另外，从图5a-5d中可以看出，ROBO1M-CAR NK 92细胞的杀伤效果优于ROBO1-CARNK 92细胞,可以更有效的杀伤肿瘤。鉴于此，后续临床实验，利用ROBO1M-CAR NK 92细胞进行。
实施例6 ROBO1M CAR-NK细胞对神经胶质瘤细胞杀伤效果的评估
利用CCK-8方法检测ROBO1M CAR-NK细胞神经胶质瘤细胞系U87-MG和神经胶质瘤细胞SH-SY5Y的杀伤效果。以NK 92细胞为对照。其实验结果如图5f和图5e所示。
图5f和图5e的实验结果显示，ROBO1M-CAR NK细胞对神经胶质瘤细胞系U87-MG和神经胶质瘤细胞SH-SY5Y的杀伤效果明显优于NK 92细胞。
实施例7 ROBO1M CAR-NK细胞对乳腺癌细胞杀伤效果的评估
利用CCK-8方法检测ROBO1M CAR-NK细胞对乳腺细胞系MCF-7、HCC1143、HCC1187、HCC1599、HCC1806和HCC38的杀伤效果。以NK 92细胞为对照。其实验结果如图6a-6f所示。
实验结果显示，ROBO1M-CAR NK细胞对乳腺细胞系MCF-7、HCC1143、HCC1187、HCC1599、HCC1806和HCC38的杀伤效果明显优于NK 92细胞。
本发明提供的Anti ROBO1 CAR-NK细胞对多种癌细胞，例如，肺癌细胞系H1299、肺癌细胞系A549、胰腺癌细胞系ASPC-1、肝癌细胞系HepG2、细胞神经胶质瘤细胞系U87-MG、神经胶质瘤细胞SH-SY5Y、乳腺细胞系MCF-7、乳腺细胞系HCC1143、乳腺细胞系HCC1187、乳腺细胞系HCC1599、乳腺细胞系HCC1806和乳腺细胞系HCC38等都具有杀伤作用，其为肿瘤患者的治疗提供了希望。
实施例8 ROBO1M CAR-NK细胞临床治疗乳腺癌的应用
一、患者情况
患者王某，女，55岁。2016年6月洗澡时意外发现右侧乳房条索状肿块，推之不动，伴乳头黄色恶臭溢液，右侧腋窝多发淋巴结肿大，无疼痛，无恶心呕吐，无头晕头痛等其他不适，患者没有予以重视。
2017年02月，患者因腰部疼痛至医院就诊，2017-02-13查头颅、胸部CT显示：1.右侧基底节区腔梗，左侧上额窦、筛窦炎症；2.右乳病变，考虑右乳K伴右侧腋窝淋巴结转移；3.右肺上叶多发胸膜下结节，右肺下叶纤维灶；4.右肺下叶钙化灶，左肺舌段、右肺下叶纤维灶，右侧胸腔少量积液；5.胸椎、腰椎、双侧肋骨入骶骨、双侧髂骨、耻骨多发骨质破坏，考虑转移伴右侧第7/10肋骨，左侧第3肋骨、左侧耻骨病理骨折；6.子宫体增大。2017-02-14至医院局部活检病理示：(右乳)侵润性导管癌Ⅱ级。免疫病理：癌细胞E-cadherin(+),Ki-67(+),约10％，ER(+)，强，阳性率约90％，PR(-),Her2(-)，CK7(+),P63(-),CK5/6(-)。结合病史及病理诊断为右乳侵润性导管癌，患者拒绝行放化疗治疗，遂出院。
2017年04月，患者因肿块增大，至医院就诊，2017-04-11复查胸腹部CT示：有乳腺癌伴脊柱、肋骨多发转移，双侧腋窝多发肿大淋巴结影，两肺多发小结节影，考虑转移。两肺慢支伴感染，双侧胸腔积液，予以岩舒，强林坦，唑来磷酸等对症治疗，效果欠佳。5月12日给予来曲唑口服治疗，治疗第二天患者出现房颤，经地高辛、倍他乐克及麝香保心丸治疗后好转。
2017年5月17日，症状主要表现为心慌胸闷，双下肢不自主抽搐，下肢活动仍受限，腰背部疼痛明显，查体：右乳房肿块较大，肿块大小约10*7cm大小，局部皮肤多处破溃，心电图提示房颤。
2017-05-19完善PET-CT提示：1.右乳腺病变，FDG摄取增高，考虑恶性，伴双肺、多发淋巴结、多发骨广泛转移。2.双肺炎症。双肺炎症。双侧胸腔积液。3.检查提示全身多发骨转移，予唑来磷酸行骨保护。患者因心房房颤，不能耐受全身静脉化疗，患者及其家属商议后拒绝行全身化疗，考虑免疫细胞治疗。
二、治疗设计
治疗设计前，利用病理组化检测病人ROBO1靶点的表达，表达结果如图10所示。结果为阳性，可以用Robo1M CAR-NK细胞进行治疗。鉴于患者存在严重的局部病灶和骨转移病灶，我们设计了先肿瘤组织内直接注射，后全身治疗的方案。患者每周接受2次Robo1M CAR-NK细胞直接注射，隔天1次，起始注射细胞数量为1×109细胞/次，若没有发生不良反应，则增加至2×109细胞/次。为降低与输注有关的不良反应，在细胞注射前给予患者地塞米松和盐酸异丙嗪，若耐受性良好，则降低地塞米松使用量或不使用地塞米松。若局部注射后，患者出现应答则给予患者全身治疗。
三、治疗过程
从2017年5月25日至2017年6月29日，该患者一共接受了8次Robo1M CAR-NK细胞肿瘤部位直接注射，其中2次1×109细胞，6次2×109细胞。从6月17日起，患者开始接受静脉输注细胞，每次2×109细胞，1周3次，间隔1天，到6月29日为止，共输注了5次。治疗过程见图9，图9为Robo1M CAR-NK细胞治疗过程示意图。其中，实线箭头指肿瘤组织内直接注射，虚线箭头指静脉输注。
四、治疗结果
5月25日及6月6日行右乳局部注射Robo1M CAR-NK细胞两次，右乳房肿块明显缩小，缩小至6*5cm大小，乳房局部破溃也明显好转，治疗有效。
6月12日复查头颅CT未见异常，胸部及腹部增强CT示病情稳定。
6月15日起同时行局部及全身Robo1M CAR-NK细胞治疗1月余,右乳房肿块明显缩小至2*3cm，破溃处基本愈合。
7月17日复查胸部增强CT提示胸腔积液明显缩小，患者无心慌胸闷、肩部疼痛基本缓解，右乳房肿块较5月份明显缩小(如图7所示)，提示病情稳定，逐渐康复。
由于国内外报道的CAR-T细胞治疗肿瘤时会出现IL-6等细胞因子急剧升高，产生细胞因子风暴现象，严重时会危及患者生命。因此，实验人员进一步检测了Robo1M CAR-NK细胞在治疗肿瘤时患者体内细胞因子变化情况，其结果如图8a和图8b。
图8a和图8b的结果表明，无论Robo1M CAR-NK细胞是肿瘤局部注射还是血液注射，患者体内仅有IL-10一过性升高，而IL-6等其细胞因子无显著变化，结合病人治疗过程中状态良好，表明该Robo1M CAR-NK细胞制品安全性良好，其可避免细胞因子风暴等不良反应，有效地治疗肿瘤，提高存活率。
对比实施例1 ROBO1 CAR-T细胞与ROBO1M CAR-NK细胞的杀伤效果
利用CFSE染色方法(参见：AMathematical Model of Natural Killer CellActivity,Anna Scherbakova,1,2 Helen Lust,1,2 Hele Everaus,1,2,3 Alar Aints1,2,4*)检测ROBO1 CAR-T细胞、ROBO1M CAR-NK细胞对不同肿瘤细胞系的杀伤效果，同时用T细胞作为对照，肿瘤细胞系包括：乳腺癌细胞系HCC1937、MCF7、MDA-MB-453和胰腺癌细胞系BXPC3。实验操作方法如下：
(1)提前处理靶细胞，按照1X 106个细胞加入1μl的CFSE，避光培养箱中孵育15min，10％的BSA终止，PBS清洗两次，在24孔板中加入配制好的500μl肿瘤细胞悬液(8X104个/孔)。将培养板在培养箱预培养12h。
(2)按照效应细胞与靶细胞为0.5:1和1:1的比例加入500μl的效应细胞，每个实验置三个复孔，效应细胞与靶细胞共孵育4小时。
(3)4小时后，吸取上清转移到1.5的EP管中，同时每孔加入200μl的胰酶，消化1min后，用对应转移出来的上清吹打细胞，离心，PBS重悬，加入1ul的7-AAD，避光孵育15min，上机检测。
(4)杀伤率＝(靶细胞的杀伤率-自发死亡率)/(1-自发死亡率)X100％；
ROBO1 CAR-T细胞、ROBO1M CAR-NK细胞体外肿瘤杀伤效果评估的实验结果如图11-14所示。
图11-14的实验结果证实，ROBO1 CAR-T细胞、ROBO1M CAR-NK细胞对乳腺癌细胞系HCC1937、MCF7、MDA-MB-453和胰腺癌细胞系BXPC3均有很强的杀伤效果，其效果均优于普通的T细胞。
另外，从图11-14中可以看出，ROBO1M CAR-NK的杀伤效果明显优于ROBO1 CAR-T细胞,可以更有效的杀伤肿瘤。
综上：本发明提供的Anti ROBO1 CAR-NK细胞通过将ROBO1抗体用于CAR-NK细胞的构建，其以ROBO1分子为靶抗原，利用Anti ROBO1 CAR-NK细胞特异性地杀伤肿瘤细胞；其可作为肿瘤类疾病的治疗药物，用于ROBO1分子高表达的肿瘤的治疗，且无细胞因子风暴等不良现象，为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治疗方法；并且通过对NK92细胞进行改造，装上CAR后，又大大增加了它的靶向性,并增加抗肿瘤靶点ROBO1，在提高靶向性地同时，大大地提高其抗肿瘤性能；此外,该Anti ROBO1 CAR-NK细胞通过与ROBO1 CAR-T细胞相比其杀伤效果明显好很多,可以更有效的杀伤肿瘤；也就是说本发明构建的AntiROBO1 CAR-NK细胞，通过对NK92细胞进行改造，装上CAR后不但增加了其靶向性，而且由于使用的是NK细胞，大大提高了其安全性，毒副作用小，成本低，并且由于NK细胞、CAR和抗ROBO1靶点的共同作用，其杀伤效果好，且明显优于ROBO1 CAR-T细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 阿思科力（苏州）生物科技有限公司
<120> ROBO1 CAR-NK细胞及其制备和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Ser Asn Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Lys Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn
100 105 110
Thr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln
130 135 140
Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser
145 150 155 160
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val
165 170 175
Lys Leu Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Val Pro
180 185 190
Asn Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe Arg Gly Lys Ala Thr
195 200 205
Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser
210 215 220
Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ser Asn
225 230 235 240
Tyr Val Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Ile Thr Val
245 250 255
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
260 265 270
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
275 280 285
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
290 295 300
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
305 310 315 320
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
325 330 335
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
340 345 350
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
355 360 365
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
370 375 380
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
385 390 395 400
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
405 410 415
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
420 425 430
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
435 440 445
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
450 455 460
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470 475 480
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<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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ggaaagagcc ttgagtggat tggagatatt gttcctaaca atggtgatac tacttacaac 600
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<210> 3
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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1 5 10 15
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Claims (10)

1.一种编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活该NK细胞；优选地，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5、FN1、FN2和FN3结构域中的一种或多种；更优选地，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的FN3结构域；进一步优选地，所述的抗原结合结构域为特异性结合ROBO1的FN3结构域的抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段为Fab或scFv。
2.根据权利要求1所述的编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，其特征在于，所述的跨膜结构域选自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种；优选地，所述的跨膜结构域为CD8跨膜结构域；和/或
所述的共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述的共刺激分子选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和OX40中的一种或多种；优选地，所述的共刺激信号传导区包含4-1BB和CD3ζ胞内结构域；
优选地，所述嵌合抗原受体是结构为scFV-CD8-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白，所述SCFV-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸的序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示；更优选地，所述SCFV-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的编码核苷酸的序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示。
3.一种构建体，包括权利要求1或2所述的编码嵌合抗原受体的核苷酸序列。
4.一种嵌合抗原构建体，由权利要求1或2所述的核苷酸序列编码。
5.一种ROBO1 CAR-NK细胞，所述细胞表达嵌合抗原构建体，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活该NK细胞；优选地，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5、FN1、FN2和FN3结构域中的一种或多种；更优选地，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的FN3结构域；进一步优选地，所述的抗原结合结构域为特异性结合ROBO1的FN3结构域的抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段为Fab或scFv。
6.根据权利要求5所述的ROBO1 CAR-NK细胞，其特征在于，所述的跨膜结构域选自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种；优选地，所述的跨膜结构域为CD8跨膜结构域；和/或
所述的共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述的共刺激分子选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和OX40中的一种或多种；优选地，所述的共刺激信号传导区包含4-1BB和CD3ζ胞内结构域；优选地，所述嵌合抗原受体是结构为scFV-CD8-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白，所述SCFV-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸的序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示；更优选地，所述SCFV-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的编码核苷酸的序列如SEQ ID NO：2或SEQID NO：4所示。
7.根据权利要求5或6所述的ROBO1 CAR-NK细胞，其特征在于，所述细胞能够有效地杀伤或杀死肺癌细胞系、胰腺癌细胞系、肝癌细胞系、神经胶质瘤细胞系、乳腺细胞系、结肠癌细胞系或前列腺癌细胞系；优选地，所述细胞肺癌细胞系为H1299或A549；或，优选地，所述胰腺癌细胞系为ASPC-1或BXPC3；或，优选地，所述肝癌细胞系为HepG2；或，优选地，所述神经胶质瘤细胞系为U87-MG或SH-SY5Y；或，优选地，所述乳腺癌细胞系为MCF-7、HCC1143、HCC1187、HCC1599、HCC1806、HCC38、HCC1937或MDA-MB-453。
8.权利要求5至7中任一项所述ROBO1 CAR-NK细胞的制备方法，其包括如下步骤：
(1)合成和扩增编码权利要求1或2所述的核苷酸序列，并将所述核苷酸序列克隆到慢病毒表达载体上；
(2)利用慢病毒包装质粒和步骤(1)得到的慢病毒表达载体质粒感染细胞，包装和制备慢病毒；
(3)利用步骤(2)得到的慢病毒感染NK-92细胞，得到CAR-NK细胞。
9.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含有效治疗量的权利要求5至7中任一项所述的ROBO1 CAR-NK细胞或权利要求8所制备的ROBO1 CAR-NK细胞；优选地，所述药物组合物中Anti ROBO1 CAR-NK细胞与肿瘤细胞的效靶比为(0.5～1)：2，优选为(0.5～1)：1；更优选地，所述药物组合物还包括药学可接受的辅料，例如药学上可接受的注射剂用辅料；进一步优选地，所述药物组合物的剂型为水剂。
10.根据权利要求5至7中任一项所述的ROBO1 CAR-NK细胞，权利要求8所制备的ROBO1CAR-NK细胞，或权利要求9所述的药物组合物用于制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途；优选地，所述癌症为高表达Robo1的肿瘤及相关疾病；更优选地，所述癌症为肝癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤或肺癌；进一步优选地，所述癌症为乳腺癌。
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