CN115873133B - 一种用于治疗结肠癌的特异性识别抗原robo1的嵌合抗原受体 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于治疗结肠癌的特异性识别抗原ROBO1的嵌合抗原受体，嵌合抗原受体包括依次连接的靶向抗原ROBO1的单链抗体、铰链区、跨膜结构域和胞内结构域；靶向抗原ROBO1的单链抗体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中SEQ ID No:1中的X1为甘氨酸或丙氨酸，X2为赖氨酸、组氨酸、精氨酸中的其中一种，X3为赖氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸中的其中一种，X4为甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸中的其中一种，X5为天冬氨酸或谷氨酸。本发明的嵌合抗原受体能够修饰NK细胞，使表达特异性识别抗原ROBO1的嵌合抗原受体的NK细胞对结肠癌细胞具有显著的杀伤性能和高度的特异性。

Description

一种用于治疗结肠癌的特异性识别抗原ROBO1的嵌合抗原 受体

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗领域，具体地，涉及一种特异性识别抗原ROBO1的嵌合抗原受体(CAR)、引入CAR修饰的NK细胞(CAR-NK细胞)及其在制备治疗结肠癌药物中的应用。

背景技术

免疫细胞治疗，作为近些年一种新兴的治疗手段，因其快速的发展和取得的进展，引起了越来越多人的关注。CDl9特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T淋巴细胞(CAR-T细胞)在治疗如急性淋巴细胞性白血病，慢性淋巴细胞白血病和淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤方而取得了巨大的进步。CAR细胞技术的关键是利用基因工程手段，合成能够识别肿瘤相关抗原的CAR结构，再以逆转录病毒或慢病毒载体等方式感染细胞，经分离、扩增、激活的T淋巴细胞回输至其体内治疗。近年来，CAR-T细胞在治疗血液系统肿瘤患者方面取得了巨大的进步，为肿瘤患者带来了希望，但在治疗实体瘤方面因为效果差、副作用多仍不乐观，并且T细胞表面的程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)与其配体，即肿瘤细胞表面高表达的PD-L1结合，抑制了T细胞的杀伤活性。直至今日，CAR-T细胞在实体瘤的治疗方面仍未取得令人满意的临床进展。

自然杀伤(natural killer，NK)细胞是免疫系统的效应细胞，属于人体内抵挡病原体侵入和恶性肿瘤第一道防线的重要成分。不同于T细胞，NK细胞不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)限制性。NK细胞对肿瘤细胞的识别主要取决于其表面活化性受体传导的活化信号和抑制性受体传导的抑制信号的动态平衡调节。NK细胞的抑制性受体包括杀伤细胞免疫球蛋白样受体和异源二聚体C型凝集素受体，其可与靶细胞表面的MHC I结合并向胞内传递抑制信号，从而使NK细胞沉默。而NK细胞的活化性受体可与细胞表面的特异性配体结合，从而活化NK细胞。当NK细胞活化后，通过释放含有穿孔素、颗粒酶的胞浆颗粒的方式直接杀伤靶细胞、表达肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor，TNF)家族的分子和TNF相关凋亡诱导配体，诱导靶细胞凋亡以及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)等多种方式杀伤肿瘤细胞。

因为NK细胞识别靶细胞的特殊机制、广泛强大的杀伤肿瘤能力、短暂的生理周期等优点，受到越来越多人的关注。通常由于肿瘤患者体内NK细胞的质量、数量的下降以及在肿瘤微环境中，许多肿瘤细胞常常通过高表达MHCI类分子、分泌免疫抑制性因子等方式获得免疫逃逸的能力，这使得NK细胞在体内的作用发挥并不完全。为了充分发挥NK细胞对肿瘤细胞的广泛强大的杀伤作用，可以直接借鉴CAR-T细胞中CAR的结构，引入CAR修饰NK细胞并引导NK细胞对肿瘤细胞的靶向性，从而达到靶向抗肿瘤的目的。

ROBO(Roundabout)跨膜蛋白家族包括ROBO1、ROBO2、ROBO3、ROBO4四个成员，是一类保守的跨膜蛋白家族，其中ROBO1与肿瘤的关系最为密切。多个研究报道表明ROBO1在结肠癌组织中高表达，这使其适合作为癌症的特异性靶点。而目前CAR-NK细胞疗法在杀伤肿瘤方面存在着杀伤率低、靶向性低等缺陷，因此需要进一步研究设计出杀伤性强且特异性识别抗原ROBO1的嵌合抗原受体，从而在制备治疗结肠癌药物中发挥作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性识别抗原ROBO1的嵌合抗原受体和表达特异性识别抗原ROBO1的嵌合抗原受体的NK细胞，及其在制备治疗结肠癌药物中的应用。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于治疗结肠癌的特异性识别抗原ROBO1的嵌合抗原受体，嵌合抗原受体包括依次连接的靶向抗原ROBO1的单链抗体、铰链区、跨膜结构域和胞内结构域；靶向抗原ROBO1的单链抗体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中SEQ ID No:1中的X1为甘氨酸或丙氨酸，X2为赖氨酸、组氨酸、精氨酸中的其中一种，X3为赖氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸中的其中一种，X4为甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸中的其中一种，X5为天冬氨酸或谷氨酸。上述单链抗体靶向性更好，杀伤性能更强，尤其是针对与ROBO1表达相关的结肠癌细胞。其中，X1为SEQ ID No:1中第12、15、228、230位点；

X2为SEQ ID No:1中第38、52、60、76、102、106、131、141、156、183、185、202位点；X3为所述SEQ ID No:1中第122、211、221位点；X4为所述SEQ ID No:1中第28、93位点；X5为所述SEQ ID No:1中第40、69、81、128、149、164、175、191、200位点。

X1、X2、X3、X4、X5在序列表中均用X指代。

优选地，嵌合抗原受体的靶向抗原ROBO1的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No:2或SEQ ID No:3或SEQ ID No:4所示。

作为上述技术方案的进一步改进，上述嵌合抗原受体的铰链区为CD8α铰链区。

作为上述技术方案的进一步改进，上述嵌合抗原受体的跨膜结构域为NKG2D跨膜结构域。

作为上述技术方案的进一步改进，上述嵌合抗原受体的胞内结构域包含CD3ζ胞内结构域和2B4胞内结构域。

采用上述铰链区、跨膜结构域、胞内结构域与上述单链抗体构成的嵌合抗原受体在三维结构配合得比较好，更容易转染NK细胞，且转染效率高，从而使单链抗体在空间上更易于结合抗原，使得单链抗体靶向抗原ROBO1的特异性更强，杀伤肿瘤细胞的性能更好，尤其是针对与ROBO1表达相关的结肠癌细胞。

另一个方面，提供了一种核苷酸序列，核苷酸序列编码上述嵌合抗原受体。

另一个方面，提供了一种表达载体，表达载体中含有上述嵌合抗原受体的核苷酸序列。

优选地，表达载体为慢病毒表达载体。

另一个方面，提供了一种经基因工程改造的NK细胞，经基因工程改造的NK细胞由上述表达载体转染后得到，表达上述特异性识别抗原ROBO1的嵌合抗原受体。

优选地，NK细胞为NK92MI细胞系。NK92MI细胞易于获得扩增，不需纯化步骤，并且细胞毒性很强，高表达许多与细胞溶解相关的分子，例如穿孔素和颗粒酶。另外，NK92MI细胞也缺少KIRs家族的分子,抑制性受体的表达水平很低。抑制性受体信号的缺失使得其对肿瘤的杀伤能力要明显优于原代NK细胞或者其他经细胞因子活化的细胞。

在一个优选实施例中，制备表达特异性识别抗原ROBO1的CAR-NK细胞的具体步骤包括通过不同的助感染剂配方转染NK细胞。

优选地，上述助感染剂分别为聚凝胺、白介素2、白介素12和植物血凝素，这几种助感染剂协同作用，提升上述慢病毒表达载体对NK细胞的转染效率，从而获得更多的CAR-NK细胞；使用四种助感染剂辅助带有CAR的慢病毒对NK细胞进行转染，能够有效提高NK细胞的转染效率，获得更多的CAR-NK细胞。

另一个方面，提供了一种治疗结肠癌的药物组合物，药物组合物的有效成分包括上述经基因工程改造的NK细胞。

本发明的有益效果在于：本发明提供的特异性识别抗原ROBO1的CAR及其修饰后的CAR-NK细胞针对结肠癌细胞具有高度特异性和非常强的杀伤能力，为后续制备治疗结肠癌药物提供了广阔的研究与应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1对CAR-NK-ROBO1细胞进行培养时的细胞生长状态图。

图2为本发明实施例2对CAR-NK-ROBO1细胞进行培养时的细胞生长状态图。

图3为本发明实施例3对CAR-NK-ROBO1细胞进行培养时的细胞生长状态图。

图4为本发明实施例1～3和对比例1～3构建的特异性识别抗原CAR-NK-ROBO1细胞和阴性对照组(未经转染的NK92MI细胞)对于AGS胃癌细胞、HEPG2肝癌细胞、A549肺癌细胞、HT-29结肠癌细胞的杀伤对比图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例和实施例中的附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

1.嵌合抗原受体CAR的序列选择

CAR的基本结构由单链抗体、铰链区、跨膜结构域、胞内结构域四部分组成，本发明筛选出的CAR序列中靶向抗原ROBO1的单链抗体如SEQ NO：2所示。

2.制备CAR-NK细胞

S1.取适量生长状态较好的NK细胞悬液，300g离心5min收集NK细胞；

S2.去上清，用新鲜的无血清培养基重悬细胞；

S3.NK细胞按100万/孔(不超过1ml)接种于12孔板中；

S4.按MOI＝25向NK细胞中加入带有上述CAR的慢病毒，再加入助感染剂1(在感染体系中助感染剂1的终浓度为6μg/ml)；

S5.将12孔板放入培养箱中培养5h后，加入助感染剂2～4，其中助感染剂2在感染体系中的终浓度为1000U/ml，助感染剂3在感染体系中的终浓度为100U/ml，助感染剂4在感染体系中的终浓度为6μg/ml；

S6.将感染后的12孔板细胞放入培养箱继续培养24h后，去病毒并取样进行流式检测，GFP阳性的细胞为转染成功的细胞，通过计算CAR-NK细胞(GFP阳性细胞)与总细胞的比值，得到CAR-NK细胞感染的阳性率。将转染后的细胞进行流式分选，分选出GFP阳性的细胞群，即为阳性率较高的CAR-NK细胞。再将阳性率高的CAR-NK细胞继续培养扩增。在对CAR-NK-ROBO1细胞进行培养时，显微镜下对CAR-NK-ROBO1细胞进行观察并拍照，CAR-NK-ROBO1细胞的生长状态如图1所示。

其中，助感染剂1：终浓度为80mg/ml的葡聚糖(dextran)的水溶液；

助感染剂2：终浓度为5000000U/ml的白介素2(IL-2)、溶剂为0.5％人血清白蛋白(HSA)的溶液；

助感染剂3：终浓度为200000U/ml的白介素12(IL-12)、溶剂为0.5％人血清白蛋白(HSA)的溶液；

助感染剂4：终浓度为10mg/ml的植物血凝素(Phytohaemagglutinin,PHA)的水溶液；

无血清培养基：同立海源生物AS-01(NK细胞活化扩增试剂盒)的NK无血清培养基。

实施例2

本实施例参照实施例1提供的方式制备CAR-NK细胞，本实施例与实施例1的区别在于将实施例1所采用的CAR序列中靶向抗原ROBO1的单链抗体替换为如SEQ NO：3所示的氨基酸序列，其他的操作与实施例1严格保持一致，由此制得本实施例的CAR-NK-ROBO1细胞。其中，在对CAR-NK-ROBO1细胞进行培养时，显微镜下对CAR-NK-ROBO1细胞进行观察并拍照，CAR-NK-ROBO1细胞的生长状态如图2所示。

实施例3

本实施例参照实施例1提供的方式制备CAR-NK细胞，本实施例与实施例1的区别在于将实施例1所采用的CAR序列中靶向抗原ROBO1的单链抗体替换为如SEQ NO：4所示的氨基酸序列，其他的操作与实施例1严格保持一致，由此制得本实施例的CAR-NK-ROBO1细胞。其中，在对CAR-NK-ROBO1细胞进行培养时，显微镜下对CAR-NK-ROBO1细胞进行观察并拍照，CAR-NK-ROBO1细胞的生长状态如图3所示。

对比例1

本对比例参照实施例1提供的方式制备CAR-NK细胞，本对比例与实施例1的区别在于将实施例1所采用的CAR序列中靶向抗原ROBO1的单链抗体氨基酸序列的第15位点的X1替换为亮氨酸、第102位点的X2替换为缬氨酸、第211位点的X3替换为丙氨酸、第28位点的X4替换为谷氨酸、第81位点的X5替换为丝氨酸，其他的操作与实施例1严格保持一致，由此制得本实施例的CAR-NK-ROBO1细胞。

对比例2

本对比例参照实施例1提供的方式制备CAR-NK细胞，本对比例与实施例1的区别在于将实施例1所采用的CAR序列中靶向抗原ROBO1的单链抗体氨基酸序列的第15位点的X1替换为亮氨酸、第228位点的X1替换为谷氨酸、第102位点的X2替换为谷氨酸、第183位点的X2替换为缬氨酸、第122位点的X3替换为精氨酸、第211位点的X3替换为丙氨酸、第93位点的X4替换为天冬氨酸、第28位点的X4替换为丙氨酸、第81位点的X5替换为丝氨酸、第191位点的X5替换为赖氨酸，其他的操作与实施例1严格保持一致，由此制得本实施例的CAR-NK-ROBO1细胞。

对比例3

本对比例参照实施例1提供的方式制备CAR-NK细胞，本对比例与实施例1的区别在于将实施例1所采用的CAR序列中靶向抗原ROBO1的单链抗体氨基酸序列的第15位点的X1替换为亮氨酸、第228、230位点的X1替换为组氨酸、第102位点的X2替换为天冬氨酸、第183、185位点的X2替换为缬氨酸、第122位点的X3替换为精氨酸、第221位点的X3替换为谷氨酸、第93位点的X4替换为谷氨酸、第28位点的X4替换为丙氨酸、第81位点的X5替换为赖氨酸、第191、200位点的X5替换为甘氨酸，其他的操作与实施例1严格保持一致，由此制得本实施例的CAR-NK-ROBO1细胞。

测试例1

按照以下方式检测上述制备得到的CAR-NK细胞对AGS胃癌细胞的杀伤性能：

本测试例的参试对象为实施例1、2、3和对比实施例1、2、3所制得的CAR-NK细胞(称为CAR-NK-ROBO1细胞)，传代培养2个月后，按照以下方式检测其杀伤性能：

S1.洗板：吸掉板内液体，每个孔用高压灭菌水洗涤2次；再用NaOH溶液浸泡1-4h，用高压灭菌水洗涤2次；最后用DPBS润洗1次。

S2.铺板：将培养好的目标肿瘤细胞系消化、离心、重悬、台盼蓝染色计数，按1-10万活细胞/孔接种电流板，补加适量培养基，上机放入培养箱中监测。细胞生长曲线为平滑上升，且孔间差异不大，则视为细胞生长正常。

S3.加入上述制备得到的靶向ROBO1的CAR-NK细胞：以肿瘤细胞系生长曲线平缓期开端点为加NK细胞时间点。将待测CAR-NK细胞取出离心、重悬、台盼蓝染色计数，按肿瘤细胞接种量：NK＝3：1的比例加入电流板中，上机(实时细胞分析仪)放入培养箱中持续监测杀伤情况。采用未经转染的NK92MI细胞作为阴性对照组。

测试例2

具体操作同测试例1，只是将杀伤对象换成HEPG2肝癌细胞。

测试例3

具体操作同测试例1，只是将杀伤对象换成A549肺癌细胞。

测试例4

具体操作同测试例1，只是将杀伤对象换成HT-29结肠癌细胞。

上述实施例1～3和对比例1～3制备得到的CAR-NK细胞进行杀伤肿瘤细胞的测试，测试结果如图4所示。实施例1～3转染后的CAR-NK细胞(CAR-NK-ROBO1细胞)对于这四种肿瘤细胞相对于阴性对照组(没有转染的NK92MI细胞)，具有明显增强的杀伤能力，而对比例1～3转染后的CAR-NK细胞相对于阴性对照组对四种肿瘤细胞的杀伤效果不明显。且实施例1～3的CAR-NK细胞作用于HT-29结肠癌细胞杀伤效果显著，靶向性强。

以上测试结果说明，将单链抗体氨基酸序列的X1、X2、X3、X4或X5位点替换成其他氨基酸，对肿瘤细胞的杀伤效果不好，靶向性不高，因此本发明提供的嵌合抗原受体能够靶向ROBO1，其修饰的NK细胞显著提高对结肠癌细胞的杀伤能力，且具有高度的特异性和靶向性，为后续制备治疗ROBO1表达相关结肠癌药物提供了广泛的临床应用前景。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于治疗结肠癌的特异性识别抗原ROBO1的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括依次连接的靶向抗原ROBO1的单链抗体、铰链区、跨膜结构域和胞内结构域；所述嵌合抗原受体的靶向抗原ROBO1的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No:2或SEQ IDNo:3或SEQ ID No:4所示。

2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的铰链区为CD8α铰链区。

3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的跨膜结构域包含NKG2D跨膜结构域。

4.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的胞内结构域包含CD3ζ胞内结构域和2B4胞内结构域。

5.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述的嵌合抗原受体。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中含有如权利要求5所述的核酸。

7.如权利要求6所述表达载体，其特征在于，所述表达载体选自慢病毒载体。

8.一种经基因工程改造的NK细胞，其特征在于，所述NK细胞由如权利要求7所述表达载体转染后得到。

9.一种治疗结肠癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的有效成分包括如权利要求8所述经基因工程改造的NK细胞。