CN115746149A - 靶向人her2的car、car基因及其重组载体、car-m细胞及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及免疫治疗的技术领域，具体公开了靶向人HER2的CAR、CAR基因及其重组载体、CAR‑M细胞及其制备方法和应用。本申请公开了一种靶向人HER2的CAR，包括前导肽、胞外识别区、铰链区、跨膜区、胞内信号域；所述胞外识别区为结合肿瘤抗原的单链抗体；所述跨膜区为能够激活巨噬细胞吞噬信号的FcγRⅠ、FcγRⅡ、FcγRⅢ、FCER1G、CD36中的任意一种；所述胞内信号域为氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的P2结构域。本申请还公开了靶向人HER2的CAR基因及其重组载体。利用上述靶向人HER2的CAR制备的CAR‑M细胞对靶细胞具有较强的吞噬能力和杀伤能力。
Description
技术领域
本申请涉及免疫治疗的技术领域，具体涉及一种嵌合抗原受体及其应用、靶向人HER2的CAR、CAR基因及其重组载体、CAR-M细胞及其制备方法和应用。
背景技术
随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，生物治疗技术中的过继性免疫细胞治疗(adoptive cell therapy，ACT)在临床治疗中受到广泛应用，该方法是将体外激活的自体或异体免疫效应细胞输送给患者，随后，免疫效应细胞可以特异性识别并杀灭患者体内的癌细胞和突变的细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。
近年来，嵌合抗原受体-T细胞(CAR-T)在过继性免疫细胞治疗中应用较为广泛，上述CAR-T细胞是通过基因工程将嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)对T 细胞进行修饰，然后经过体外扩增再回输至病人体内，该方法在血液肿瘤治疗上的效果显著。然而，在实体肿瘤的临床治疗过程中，实体瘤细胞外基质会阻碍CAR-T细胞浸润；另外，实体肿瘤会产生具有免疫抑制特性的肿瘤微环境，使得CART细胞免疫治疗受到了影响。
针对实体肿瘤的免疫治疗难点，嵌合抗原受体-巨噬细胞(CAR-M)免疫治疗采用单核/巨噬细胞进行CAR构建，与CAR-T相比，CAR-M可以直接杀伤肿瘤细胞；也可以改善实体瘤肿瘤免疫微环境；且CAR-M更容易浸润到肿瘤内部，协同其他免疫细胞浸润肿瘤等。然而，目前对于CAR-M的研究较少，且巨噬细胞具有不会增殖的缺陷，使得CAR-M对肿瘤细胞的杀伤能力较低，从而极大的限制了CAR-M的应用。
发明内容
为了提高CAR-M细胞的杀伤能力，本申请提供靶向人HER2的CAR、CAR基因及其重组载体、CAR-M细胞及其制备方法和应用。
第一方面，本申请提供了一种靶向人HER2的CAR。
一种靶向人HER2的CAR，采用如下的技术方案：
一种靶向人HER2的CAR，包括前导肽、胞外识别区、铰链区、跨膜区、胞内信号域；
所述胞外识别区为结合肿瘤抗原的HER2单链抗体；所述跨膜区为能够激活巨噬细胞吞噬信号的FcγRⅠ、FcγRⅡ、FcγRⅢ、FCER1G、CD36中的任意一种；所述胞内信号域为氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的P2结构域。
优选地，所述前导肽为信号肽SP。
优选地，所述铰链区选自CD8和CD28 hinge中的任意一种。
可选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本申请筛选氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的P2结构域作为胞内信号域，并与前导肽、胞外识别区、铰链区、跨膜区进行组装连接，制备得到的嵌合抗原受体能够有效感染巨噬细胞，获得的CAR-M细胞对肿瘤细胞能够发挥高效的靶向性、吞噬作用和杀伤作用。
本申请以FcγRⅠ、FcγRⅡ、FcγRⅢ、FCER1G、CD36中的任意一种作为跨膜区，其中，FcγR家族可以识别并结合Ig的Fc片段，可以有效清除IgG-Ag复合物，具有较强的免疫作用；FCER1G中含有基于酪氨酸的免疫受体激活基序，能够从免疫受体传递激活信号；CD36主要表达于单核/巨噬细胞膜表面，可以介导吞噬的发生。即，上述5 种分子均能够激活巨噬细胞产生吞噬信号，促进CAR-M对肿瘤细胞的吞噬能力和杀伤能力。
第二方面，本申请提供了一种编码上述靶向人HER2的CAR的CAR基因。
第三方面，本申请提供了一种包括上述靶向人HER2的CAR或上述CAR基因的重组载体。
第四方面，本申请提供了一种包括上述重组载体的CAR-M细胞。
第五方面，本申请提供了上述CAR-M细胞的制备方法，是由所述重组载体导入巨噬细胞中获得。
优选地，所述巨噬细胞为小鼠骨髓来源巨噬细胞。
优选地，所述CAR-M细胞的制备方法，具体包括以下步骤：
从N端到C端顺序依次将所述前导肽、所述胞外识别区、所述铰链区、所述跨膜区与所述胞内信号域进行连接，得到所述靶向人HER2的CAR；
将所述靶向人HER2的CAR与慢病毒载体重组，构建得到所述重组载体；
将所述重组载体导入所述巨噬细胞中，得到所述CAR-M细胞。
优选地，所述重组载体导入所述巨噬细胞过程中，所用细胞培养基包括基础培养基和以下重量百分比的组分：0.003-0.008mg/mL硬脂酸钠、0.007-0.013mg/mL赤藓糖醇、0.16-0.24mg/mL转铁蛋白。
本申请利用上述细胞培养基，能够有效避免重组载体慢病毒被吞噬细胞吞噬，有利于重组载体转染至巨噬细胞中，从而有效增强CAR-M细胞对靶细胞的杀伤能力。
第六方面，本申请提供了所述靶向人HER2的CAR，所述CAR基因，所述重组载体以及所述CAR-M细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。
综上所述，本申请的技术方案具有以下效果：
本申请筛选P2结构域作为胞内信号域，并与前导肽、靶向人HER2单链抗体胞外识别区、铰链区、跨膜区进行组装连接，制备得到的CAR-M细胞对肿瘤细胞能够发挥高效的靶向性、吞噬作用和杀伤作用。
本申请利用硬脂酸钠、赤藓糖醇、转铁蛋白与基础培养基得到CAR-M细胞培养基，能够有效增强CAR-M细胞对靶细胞的杀伤能力。
附图说明
图1为本申请试验例1中不同CAR-M细胞对肿瘤细胞的吞噬能力。
具体实施方式
第一方面，本申请提供了一种靶向人HER2的CAR，包括前导肽、胞外识别区、铰链区、跨膜区、胞内信号域；
其中，前导肽为信号肽SP；胞外识别区为结合肿瘤抗原的HER2单链抗体；铰链区选自CD8和CD28 hinge中的任意一种；跨膜区为能够激活巨噬细胞吞噬信号的FcγR Ⅰ、FcγRⅡ、FcγRⅢ、FCER1G、CD36中的任意一种；胞内信号域为氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的P2结构域。
具体地，靶向人HER2的CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
第二方面，本申请提供了一种编码上述靶向人HER2的CAR的CAR基因。
第三方面，本申请提供了一种包括上述CAR基因的重组载体。
第四方面，本申请提供了一种包括上述重组载体的CAR-M细胞。
第五方面，本申请提供了上述CAR-M细胞的制备方法，由上述重组载体导入巨噬细胞中获得。
其中，巨噬细胞为小鼠骨髓来源巨噬细胞
上述CAR-M细胞的制备方法，具体包括以下步骤：
从N端到C端顺序依次将前导肽、胞外识别区、铰链区、跨膜区与胞内信号域进行连接，得到靶向人HER2的CAR；
将靶向人HER2的CAR与慢病毒载体重组，构建得到重组载体；
将重组载体导入小鼠骨髓来源巨噬细胞中，得到CAR-M细胞。
其中，CAR-M细胞制备过程中，所用CAR-M细胞培养基含有0.003-0.008mg/mL硬脂酸钠、0.007-0.013mg/mL赤藓糖醇、0.16-0.24mg/mL转铁蛋白的DMEM/F12培养基
第六方面，本申请提供了靶向人HER2的CAR，CAR基因，重组载体以及CAR-M 细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。
以下结合实施例、对比例以及性能检测试验对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例
实施例1
实施例1提供了一种CAR重组载体，CAR重组载体的制备具体包括以下步骤：
嵌合抗原受体的合成：通过实验筛选和调研，对靶向HER2的嵌合抗原受体分子进行组装，包括前导肽、胞外识别区、铰链区、跨膜区、胞内信号域；嵌合抗原受体分子从N端到C端顺序依次以信号肽SP(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)作为前导肽， HER2 scFv(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)作为胞外识别区，以CD8α结构域(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)作为铰链区，以FcγR IA结构域(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)作为跨膜区、以P2结构域(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)作为胞内信号域；合成嵌合抗原受体P2-CAR(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示、核苷酸序列如 SEQ ID NO.7所示)。
P2-CAR重组载体的构建：利用Spe I/Xho I双酶切上述合成的嵌合抗原受体P2-CAR 序列，利用Spe I/Xho I双酶切pLVX-EF1α-AcGFP1-N1载体，通过T4连接酶链接酶切后的嵌合抗原受体和载体，转化到感受态E.coli(DH5α)，经测序正确后，使用质粒纯化试剂盒提取(Qiagen)并纯化质粒，获得P2-CAR重组载体，用于后续实验。
实施例2
实施例2提供了一种P2-CAR-M细胞，P2-CAR-M细胞的制备具体包括以下步骤：
P2-CAR慢病毒的制备：将4×106个处于对数生长期的HEK293T细胞均匀接种于6孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中静置培养至细胞汇合度达到70％-80％，按3：1：1 比例分别取质粒P2-CAR、psPAX2、pMD2.G加入到装有Opti-MEM培养基的离心管中混匀，置于室温孵育，再加入转染试剂TurboFect Transfection Reagent，利用吸管枪头轻柔吹打混匀，置于室温孵育。
将上述孵育好的混合液缓慢滴加到接种了293T细胞的6孔板中，边滴加边轻轻摇动培养板，置于37℃、5％CO2培养18-24h后，弃掉6孔板各孔中的转染混合液，添加3mL 包含10％胎牛血清的Advanced DMEM完全培养基，将细胞培养板重置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h，收集病毒上清，在4000rpm下离心10min，利用0.45um滤膜过滤除去细胞碎片，在4℃、25000rpm超高速离心2h，获得P2-CAR慢病毒浓缩液，分装后置于-80℃保存。
P2-CAR-M细胞的制备：取小鼠单核巨噬细胞J774 A1接种于6孔板内，所用CAR-M细胞培养基为：含有0.005mg/mL硬脂酸钠、0.01mg/mL赤藓糖醇、0.2mg/mL转铁蛋白以及1LDMEM/F12培养基，待其生长到细胞汇合度至70％-80％时，以每9：1的比例向巨噬细胞的培养基中加入P2-CAR慢病毒病毒颗粒，在37℃、5％CO2培养箱中静置培养24h 后，更换新鲜CAR-M培养基；感染72h后，即完成巨噬细胞的慢病毒感染，得到P2-CAR-M 细胞；观察细胞生长情况及形态变化，传代至新的培养瓶或培养皿中进行扩增或者冻存。
对比例1
对比例1提供了一种CAR重组载体。
本对比例与实施例1的不同之处在于：以CD28结构域作为胞内信号域。
对比例2
对比例2提供了一种CAR重组载体。
本对比例与实施例1的不同之处在于：以CD3ζ结构域作为胞内信号域。
对比例3
对比例3提供了一种CAR-M细胞。
本对比例与实施例2的不同之处在于：所用嵌合抗原受体由对比例1制备得到。
对比例4
对比例4提供了一种CAR-M细胞。
本对比例与实施例2的不同之处在于：所用嵌合抗原受体由对比例2制备得到。
性能检测试验
试验例1
本试验例利用动物试验检测了实施例2中P2-CAR-M细胞与对比例3-4中CAR-M细胞对HER2阳性胃癌的抑制能力，考察CAR-M细胞对肿瘤细胞的吞噬能力。
检测方法具体包括以下步骤：用生理盐水重悬MKN45胃癌细胞，调整活细胞浓度为4×107个/mL，通过皮下注射的方式在6-8周龄的C57雄性小鼠30只后腿进行接种细胞悬液100μL/只。使用测径器测量肿瘤大小，以长出100mm3的肿瘤的实验小鼠作为小鼠HER2阳性胃癌模型；其中肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长径(mm) ×肿瘤短径2(mm2)×0.5。
将构建成功的小鼠HER2阳性胃癌模型分为4组，利用尾静脉注射的方式进行给药，三组分别给药PBS 100μL/只、活细胞浓度为1×106个/mL的实施例2中P2-CAR-M细胞 100μL/只、浓度为1×106个/mL的对比例3中CAR-M细胞100μL/只、浓度为1×106个/mL的对比例4中CAR-M细胞100μL/只，从给药第7天开始，每隔5天，使用测径器测量肿瘤大小。
检测结果：如图1所示。
通过图1可知，利用PBS对实验小鼠给药，实验小鼠的肿瘤大小呈现指数增大；利用对比例3-4中的CAR-M细胞对实验小鼠给药，实验小鼠的肿瘤生长得到一定的控制，但是肿瘤依旧呈现生长趋势；而利用实施例2中的P2-CAR-M细胞对实验小鼠给药，实验小鼠的肿瘤大小基本保持不变，肿瘤生长明显受到抑制。上述检测结果表明，本申请提供的P2-CAR-M细胞具有很好的抑制以及杀死肿瘤细胞的效果。
实施例3-11
上述实施例与实施例2的不同之处在于：所用CAR-M细胞培养基中各组分的含量不同。具体如表1所示。
表1实施例2-11中CAR-M细胞培养基中各组分的含量
试验例2
本试验例利用细胞生物学检测了实施例2-11中P2-CAR-M细胞对靶细胞的杀伤能力。
S1：取密度1×106个/mL的小鼠单核巨噬细胞J774 A1悬液，加入15μL、1mg/mL的Calcein-AM，37℃、5％CO2培养30min，每10min轻轻混匀；以1500rpm离心5分钟，去上清，用全培养基重悬，重复操作两遍，得到Calcein-AM标记的靶细胞；
S2：将实施例2-提供的P2-CAR-M细胞作为效应细胞，分别以3×104个/孔接种至96孔细胞培养板中，每组5个复孔，静置24h。然后按照效应细胞：靶细胞＝4：1加入 Calcein-AM标记的靶细胞；同时以靶细胞的试验组作为空白组，以加入2％Triton X-100+ 靶细胞的试验组作为对照组。
S3：37℃，5％二氧化碳培养箱培养8h后，向96孔板中加入浓度为150μg/mL的 D-luciferin，potassium salt底物，37℃避光孵育10min后，使用酶标仪对荧光强度进行采集分析，并通过以下公式计算P2-CAR-M细胞对靶细胞的杀伤能力：靶细胞杀伤率＝(试验组荧光强度-空白组荧光强度)/(对照组荧光强度-空白组荧光强度)*100％。
检测结果：如表2所示。
表2
结合表2，通过对比实施例2-13的检测结果，本申请利用硬脂酸钠、赤藓糖醇、转铁蛋白与基础培养基得到CAR-M细胞培养基，制备的CAR-M细胞对靶细胞的细胞杀伤率高达77.5％以上。即，本申请提供的CAR-M细胞培养基，能够有效增强CAR-M细胞对靶细胞的杀伤能力。
通过对比实施例2-4的检测结果，当控制CAR-M细胞培养基中硬脂酸钠的含量为0.003-0.008mg/mL时，能够进一步增强CAR-M细胞对靶细胞的杀伤能力。通过对比实施例2、5-6的检测结果，当控制CAR-M细胞培养基中赤藓糖醇的含量为0.007-0.013mg/mL 时，能够进一步增强CAR-M细胞对靶细胞的杀伤能力。通过对比实施例2、7-8的检测结果，当控制CAR-M细胞培养基中转铁蛋白的含量为0.16-0.24mg/mL时，能够进一步增强CAR-M细胞对靶细胞的杀伤能力。因此，本申请将上述三种组分分别控制为上述相应的含量范围内。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种靶向人HER2的CAR，其特征在于，包括前导肽、胞外识别区、铰链区、跨膜区、胞内信号域；
所述胞外识别区为结合肿瘤抗原的HER2单链抗体；所述跨膜区为能够激活巨噬细胞吞噬信号的FcγRⅠ、FcγRⅡ、FcγRⅢ、FCER1G、CD36中的任意一种；所述胞内信号域为氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的P2结构域。
2.根据权利要求1所述靶向人HER2的CAR，其特征在于，所述靶向人HER2的CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.一种CAR基因，其特征在于，所述CAR基因编码权利要求1-2中任一项所述靶向人HER2的CAR。
4.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求1所述靶向人HER2的CAR或权利要求3所述的CAR基因。
5.一种CAR-M细胞，其特征在于，包括权利要求4所述的重组载体。
6.如权利要求5所述的CAR-M细胞的制备方法，其特征在于，由权利要求4所述的重组载体导入巨噬细胞中获得。
7.根据权利要求6所述的CAR-M细胞的制备方法，其特征在于，所述巨噬细胞为小鼠骨髓来源巨噬细胞。
8.根据权利要求6所述的CAR-M细胞的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
从N端到C端顺序依次将所述前导肽、所述胞外识别区、所述铰链区、所述跨膜区与所述胞内信号域进行连接，得到所述靶向人HER2的CAR；
将所述靶向人HER2的CAR与慢病毒载体重组，构建得到所述重组载体；
将所述重组载体导入所述巨噬细胞中，得到所述CAR-M细胞。
9.权利要求1-2中任一项所述靶向人HER2的CAR，权利要求3所述的CAR基因，权利要求4所述的重组载体以及权利要求5所述的CAR-M细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。
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