CN112190718B - 基因传递载体及其制备方法、抗肿瘤药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及基因传递载体及其制备方法、抗肿瘤药物及其制备方法。本发明提供的基因传递载体由经修饰的聚α‑赖氨酸和透明质酸组成。实验表明，该基因传递载体能够有效提高治疗基因的内吞效率，增加基因转染效率，同时能够增加其在体内的长循坏时间，靶向肿瘤组织，促进其在肿瘤组织中的蓄集。本发明还利用该基因传递载体制备了同时担载免疫检查点沉默基因和/血管内皮因子沉默基因的抗肿瘤药物，消除了单一免疫检查点沉默基因的获得性耐受，VEGF‑A基因沉默协同PD‑L1沉默基因实现了增强的肿瘤免疫治疗效果。

Description

基因传递载体及其制备方法、抗肿瘤药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因传递载体及其制备方法、抗肿瘤药物及其制备方法。

背景技术

旨在激活患者自然免疫系统以攻击肿瘤的癌症免疫疗法在过去的几年中吸引了很多关注，增强针对癌细胞的免疫反应的相关技术已经广泛使用。其中，免疫检查点阻断疗法在各种类型的癌症临床治疗表现良好，甚至治愈了晚期转移患者。尽管针对靶向程序性死亡配体1(aPD-1)及其配体的抗体药物程序性死亡配体1(aPD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞抗原4(aCTLA-4)取得了巨大的成功，临床上观察到越来越多的对ICB治疗的适应性耐药。例如，在晚期黑色素瘤中，最初对抗PD-1治疗敏感的病人在3年内发生了肿瘤进展。遗憾的是，对ICB疗法的适应性耐药尚不清楚。有限的研究表明，自适应对ICB治疗的耐药性与多个抑制性免疫检查点的上调有关，包括PD-1，CTLA-4，T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)和淋巴细胞激活基因3(LAG-3)。此外，抑制性免疫检查点的上调可能导致PD-1/TIM-3或PD-1/LAG-3共表达耗竭型T细胞比例增加。耗竭型T细胞分泌炎性细胞因子和增殖的能力减弱，不利于抗肿瘤免疫治疗。

此外，不仅仅是适应性耐药，肿瘤免疫抑制微环境也限制了ICB治疗的临床疗效。肿瘤免疫抑制微环境的特点是肿瘤浸润性T细胞数量少，大量免疫抑制淋巴细胞及其分泌的免疫抑制细胞因子。先前有报道称ICB疗法与其他疗法联合使用治疗方法可以通过重新调节肿瘤免疫抑制微环境来增强抗肿瘤免疫反应。对于例如，化学疗法诱导的肿瘤细胞免疫原性细胞死亡促进了炎症微环境通过释放抗原和危险信号，与ICB治疗协同作用。透明质酸酶清除细胞外基质增强了免疫细胞的浸润肿瘤组织，增强了ICB治疗的疗效。然而，克服对ICB治疗的适应性耐药的研究投入的精力较少。因此，迫切需要制定综合治疗策略，同时消除适应性耐药和逆转肿瘤免疫抑制的微环境。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了基因传递载体及其制备方法、抗肿瘤药物及其制备方法。所述基因传递载体够有效提高治疗基因的内吞效率，增加基因转染效率，同时能够增加其在体内的长循坏时间，靶向肿瘤组织，促进其在肿瘤组织中的蓄集。

本发明提供一种基因传递载体，由经修饰的聚α-赖氨酸和透明质酸组成。

一些实施方案中，所述经修饰的聚α-赖氨酸和透明质酸的质量比为2.5：(0.05～2.5)，优选为2.5：(0.05～1.25)，更优选为2.5：0.1。

本发明对于透明质酸的来源不进行限定，可以市售，也可以自行合成。

一些实施方案中，所述修饰为N'-对甲苯磺酰基-L-精氨酸修饰。本发明中，经修饰的聚α-赖氨酸为经N'-对甲苯磺酰基-L-精氨酸修饰的聚α-赖氨酸。本发明对于对甲苯磺酰基保护的精氨酸修饰的聚α-赖氨酸来源不进行限定，可以市售，也可以按照本方法改性。优选具体为：将对甲苯磺酰基保护的精氨酸修饰到线性聚α-赖氨酸上。

其中，所述线性聚α-赖氨酸的聚合度优选为80～140，更优选为100～140，最优选为110～130。线性聚α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比优选为1：(10～100)，优选为1：(40～80)，更优选为1:(50～70)。

一些实施方案中，对甲苯磺酰基保护的精氨酸修饰的聚α-赖氨酸的分子量为10000～50000，优选为10000～25000；透明质酸的分子量为20000～50000，优选为30000～40000。

本发明提供的基因传递载体为纳米基因传递载体。其中，所述基因传递载体的粒径为60～200nm，优选为60～180nm，更优选为70～120nm。

本发明还提供了基因传递载体的制备方法，将经修饰的聚α-赖氨酸与透明质酸混合，涡旋、静置。

在所述混合前，先将经修饰的聚α-赖氨酸(PLL-RT)、HA分别溶于水中，获得PLL-RT水溶液和HA水溶液。本发明中，PLL-RT的水溶液浓度0.05～0.2mg/mL，更优选为0.05～0.15mg/mL，最优选为0.05～0.1mg/mL。HA的浓度0.002～0.008mg/mL，更优选为0.002～0.006mg/mL，最优选为0.002～0.004mg/mL。

混合时，将所述PLL-RT水溶液和HA水溶液等体积混合。所述混合在室温下进行。本发明对混合的方式没有特殊限制，本领域技术人员熟知的直接混合即可。

一些实施方案中，所述混合、涡旋和静置均在常温下进行；所述涡旋的时间为10～15s，所述静置的时间为10～15min。

经过上述混合、涡旋、静置后，获得PLL-RT-HA复合物，即本发明所述的基因传递载体。

本发明通过体外转染测试实验和药代动力学实验证明，本发明提供的基因传递载体够有效提高治疗基因的内吞效率，增加基因转染效率，同时能够增加其在体内的长循坏时间，靶向肿瘤组织，促进其在肿瘤组织中的蓄集。基于此，本发明还提供了所述基因传递载体在制备治疗和/或预防肿瘤的抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供了抗肿瘤药物，包含本发明上述基因传递载体和核酸。

具体地，本发明提供的抗肿瘤药物包含经修饰的聚α-赖氨酸、透明质酸和核酸。其中，所述经修饰的聚α-赖氨酸为经N'-对甲苯磺酰基-L-精氨酸修饰的聚α-赖氨酸。

一些实施方案中，所述经修饰的聚α-赖氨酸、透明质酸和核酸的质量比为2.5：(0.05～2.5):1，优选为2.5：(0.05～1.25):1，更优选为2.5：0.1:1。

一些实施方案中，所述核酸为：调控免疫检查点基因沉默的核酸和/或调控血管内皮因子基因沉默的核酸。本发明中，所提及的VEGF-A沉默基因，即调控免疫检查点基因沉默的核酸；免疫检查点(如PD-L1)沉默基因，即调控血管内皮因子基因沉默的核酸。

一些实施方案中，所述核酸为质粒DNA、shRNA、siRNA、miRNA中的至少一种。本发明中，所述核酸可以是沉默型的质粒DNA，即能够表达出shRNA、siRNA或miRNA，使免疫检查点基因、血管内皮因子基因沉默的环状质粒DNA。其中，沉默型质粒的大小为4000bp～10000bp。也可以是使免疫检查点、血管内皮因子等相关蛋白基因沉默的shRNA、siRNA或miRNA。

一些实施方案中，所述免疫检查点为PD-L1、CTLA-4、TIM-3和LAG-3中的至少一种。一些具体实施方案中，所述免疫检查点为PD-L1。

一个具体实施例中，所述核酸为：表达shVEGF-A的质粒DNA(pshVEGF-A)和表达shPD-L1的质粒DNA(pshPD-L1)。

本发明中，优选的为实现PD-L1基因沉默，pshPD-L1质粒的用量为0.25～1.5mg/kg，更优选为0.5～1.0mg/kg。优选的为实现获得性耐受的消除与肿瘤组织血管正常化，pshVEGF-A质粒的用量为0.25～1.5mg/kg，更优选为0.5～1.0mg/kg。

本发明利用所述的基因传递载体同时担载免疫检查点沉默基因和/血管内皮因子沉默基因，获得的抗肿瘤药物消除了单一免疫检查点沉默基因的获得性耐受，VEGF-A沉默基因协同免疫检查点(如PD-L1)沉默基因实现了增强的肿瘤免疫治疗效果。

本发明还提供了所述抗肿瘤药物的制备方法，将经修饰的聚α-赖氨酸、透明质酸和核酸混合反应。

在所述混合前，先将经修饰的聚α-赖氨酸(PLL-RT)、HA、核酸分别溶于水中，获得PLL-RT水溶液、HA水溶液和核酸溶液。其中，PLL-RT的水溶液的浓度为0.05～0.2mg/mL，HA水溶液的浓度为0.002～0.008mg/mL,核酸溶液的浓度0.02～0.08mg/mL。

本发明所述抗肿瘤药物的制备方法中，所述混合的顺序为：

将所述经修饰的聚α-赖氨酸与透明质酸混合后，再与所述核酸混合；或

将所述经修饰的聚α-赖氨酸与核酸混合后，再与透明质酸混合。

其中，所述经修饰的聚α-赖氨酸、透明质酸和核酸的质量比为2.5：(0.05～2.5):1，优选为2.5：(0.05～1.25)):1，更优选为2.5：0.1:1。

一些具体实施例中，将PLL-RT水溶液与HA水溶液混合后，涡旋10～15s，并在室温下静置10～15min，反应得到PLL-RT-HA复合物，再将PLL-RT-HA复合物与所述核酸溶液进行混合，涡旋10～15s，室温下静置10～15min，反应得到PLL-RT-HA-DNA复合物。

另一些实施例中，将PLL-RT水溶液与核酸溶液混合后，涡旋10～15s，并在室温下静置10～15min，反应得到PLL-RT-DNA复合物，再将PLL-RT-DNA复合物与HA水溶液进行混合，涡旋10～15s，室温下静置10～15min，反应得到PLL-RT-DNA-HA复合物。

本发明将正电性的PLL-RT与带负电的HA通过静电作用反应得到PLL-RT-HA复合物，随后担载治疗基因(调控免疫检查点和血管内皮生长因子基因沉默的核酸)构成纳米基因传递体系，即本发明抗肿瘤药物。该抗肿瘤药物能够有效提高治疗基因的内吞效率，增加基因转染效率，同时能够增加其在体内的长循坏时间，靶向肿瘤组织，促进其在肿瘤组织中的蓄集。

一些实施方案中，所述修饰为N'-对甲苯磺酰基-L-精氨酸修饰。本发明中，经修饰的聚α-赖氨酸为经N'-对甲苯磺酰基-L-精氨酸修饰的聚α-赖氨酸。本发明对于对甲苯磺酰基保护的精氨酸修饰的聚α-赖氨酸来源不进行限定，可以市售，也可以按照本方法改性。优选具体为：将对甲苯磺酰基保护的精氨酸修饰到线性聚α-赖氨酸上。

其中，所述线性聚α-赖氨酸的聚合度优选为80～140，更优选为100～140，最优选为110～130。线性聚α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比优选为1：(10～100)，优选为1：(40～80)，更优选为1:(50～70)。

一些实施方案中，对甲苯磺酰基保护的精氨酸修饰的聚α-赖氨酸的分子量为10000～50000，优选为10000～25000；透明质酸的分子量为20000～50000，优选为30000～40000。

本发明提供了基于高分子的基因传递载体或担载治疗基因(如免疫检查点和血管内皮因子)的纳米基因传递体系在生物医药领域的应用，本发明强调针对肿瘤治疗的纳米基因传递体系，但不限于肿瘤治疗领域，可根据选择担载的治疗基因类型定义应用领域。

本发明提供的基因传递载体够有效提高治疗基因的内吞效率，增加基因转染效率，同时能够增加其在体内的长循坏时间，靶向肿瘤组织，促进其在肿瘤组织中的蓄集。

本发明利用所述基因传递载体同时担载免疫检查点沉默基因与血管内皮生长因子(VEGF-A)沉默基因制得的抗肿瘤药物优异的抗肿瘤免疫治疗效果，通过以下机制实现，以免疫检查点为PD-L1为例进行说明:

1)联合疗法克服了单一PD-L1沉默基因的获得性耐受，其特征在于单一PD-L1基因沉默会上调T细胞表面的血管内皮生长因子受体VEGF-R2，通过VEGF-A与VEGF-R2的相互作用上调T细胞抑制性检查点，进而肿瘤组织中的耗竭型T细胞的含量增加，不利于抗肿瘤免疫治疗。因此，PD-L1基因沉默与VEGF-A基因沉默的联合疗法消除了单一PD-L1沉默基因的获得性耐受。

2)VEGF-A基因沉默实现了肿瘤组织的血管正常化，增加了肿瘤组织免疫细胞的浸润，缓解了肿瘤组织的乏氧，逆转了肿瘤免疫抑制的微环境，协同PD-L1沉默基因实现了优异的抗肿瘤免疫效果。

具体实施方式

本发明公开了基因传递载体及其制备方法、抗肿瘤药物及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的基因传递载体及其制备方法、抗肿瘤药物及其制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。本发明提供的实施例中涉及的试验按照以下方法进行：

1.细胞培养试验：在本发明中，选用B16F10细胞系，所述细胞培养的方法没有特殊限制，根据本领域技术人员熟知的方法即可。本发明中，优选含10％的胎牛血清对细胞进行培养，所述培养条件优选在体积分数为5％的二氧化碳的培养箱中连续培养，培养温度优选37℃。

2.细胞毒性试验：将B16F10细胞按照每孔1×10⁴的密度种植于96孔板中，培养过夜。将不同透明质酸质量比与不同复合顺序的纳米基因传递体系加入到细胞中，培养4h后，移去上清液，更换新鲜培养基，在孔板每孔加入20μL噻唑蓝溶液(5mg/mL)，37℃继续培养4h，加入二甲基亚砜溶解，于450nm下测定每孔吸光度值。细胞存活率采用以下公式计算：

细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100。

3.体外转染测试：将B16F10细胞按照每孔1×10⁴的密度种植于96孔板中，培养24h，后弃去培养基，加入新的培养基，将不同透明质酸质量比和不同复合顺序制备的纳米基因传递体系加入到细胞中，在本测试过程中荧光素酶质粒为报告基因。继续培养48h。48h后弃去培养基，在96孔板中加入20μL的细胞裂解液，后将孔板至于-80℃冰箱，4h后解冻，在孔板中加入20μL的荧光素酶底物，测量荧光产率，推算出蛋白表达量。

4.细胞内吞：将B16F10细胞按照每孔1×10⁶的密度种植于6孔板中，培养24h，后弃去培养基，加入新的培养基。在本测试过程中Cy5-DNA为报告基因，将优选透明质酸质量比的纳米基因传递体系，无透明质酸的基因传递体系，纯Cy5-DNA加入到细胞中，培养4h后去除培养基，在培养基中加入胰酶制成单细胞悬液，流式测试细胞内吞含量。

5.肿瘤接种：购买周龄6-8周的体重20g左右的C57BL/6小黑鼠，肿瘤接种前，取对数生长期的B16F10细胞，用胰蛋白酶消化，然后用细胞培养液混合胰蛋白酶，1×10³rpm离心5min，PBS洗涤两次，用PBS悬浮细胞。按每只小鼠2×10⁶细胞接种于小鼠背部。7天后，瘤径平均长大至5mm时进行后续实验。

6.药代动力学：购买周龄6-8周的体重20g左右的C57BL/6小黑鼠，在本测试过程中Cy5-DNA为报告基因，将优选透明质酸质量比的纳米基因传递体系，无透明质酸的基因传递体系，纯Cy5-DNA通过尾静脉注射到小鼠体内，在0.5h，1h，2h，4h，8h，12h，24h，尾静脉取血10μL，通过酶标仪检测血液中的Cy5-DNA的含量，进而得到纳米基因传递体系在体内的药代动力学。

7.体内抗肿瘤治疗：在购买周龄6-8周的体重20g左右的C57BL/6小黑鼠，按每只小鼠2×10⁶细胞接种于小鼠背部，7天后，瘤径平均长大至5mm时，将同时担载治疗质粒pshVEGF-A和pshPD-L1的纳米基因传递体系与对照PBS经尾静脉注射入小鼠体内，给药量和给药次数根据肿瘤抑制效果和老鼠健康状况而定，无特定要求。给药后跟踪肿瘤体积大小和老鼠体重的变化，整个实验过程共跟踪9天。

8.流式实验：荷瘤小鼠治疗结束后，处死小鼠。将所有治疗分组的肿瘤组织收集，研磨肿瘤组织，将研磨后的肿瘤组织过300目筛网，得到单细胞悬液。取10⁶细胞悬液于100μlPBS中，加入所要表征蛋白的荧光抗体4℃孵育45min，加入PBS润洗两遍，加入适量PBS，上流式细胞仪测量。

9.免疫荧光：荷瘤小鼠治疗结束后，处死小鼠。将所有治疗分组的肿瘤组织收集，将肿瘤组织石蜡包埋并切片。组织切片在70％-95％乙醇梯度溶液中脱蜡，山羊血清室温封闭60min，将组织切片与一抗4℃孵育12h，随后二抗室温孵育60min。随后在激光共聚焦显微镜中观察，并使用ImageJ进行半定量。

本发明制备的纳米基因传递体系具有良好的EPR效应，可实现对肿瘤的被动靶向，并且由于HA的存在，可以实现对于高表达CD44肿瘤组织的主动靶向，增加其在肿瘤组织中的分布，以及在肿瘤细胞中的转染效果。HA遮蔽层可增强纳米基因传递体系在体内的循环时间。该纳米基因传递体系能有效抑制肿瘤生长。该基因传递体系可通过担载不同的治疗基因，实现肿瘤的饥饿治疗，或者抗肿瘤免疫治疗，具有一定的普适性。本发明提供的抗肿瘤药物，所述载体担载的基因为VEGF-A基因和免疫检查点基因，具体实施例中担载的基因具体为VEGF-A基因和PD-L1基因。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1纳米基因传递载体制备

将对PLL-RT制成0.05～0.1mg/mL的水溶液，HA制成0.002-0.008mg/mL的水溶液，DNA制成0.02-0.08mg/mL的水溶液。按照顺序将PLL-RT与HA与DNA进行复合，PLL-RT与HA复合后静置10～15min,后与DNA水溶液复合后再次静置10～15min。或将PLL-RT先与DNA复合，后与HA复合，复合方法一致。固定PLL-RT与DNA的质量，调整HA的加入量得到不同比例的纳米纳米基因传递载体。PLL-RT与HA与DNA的质量比为2.5：(0.05～2.5):1。

表1不同HA用量与混合顺序制备纳米基因传递载体

实施例2纳米基因传递载体的粒径测试

随后使用电位粒径仪对所制备的纳米基因传递载体进行粒径检测，实验结果表明，对按照上述比例及复合顺序制得的纳米颗粒粒径稳定在70～210nm，具体结果见表2。

表2不同HA用量与复合顺序制备纳米基因传递载体的粒径

实验结果表明，随着透明质酸加入的量的增加，纳米基因传递载体的粒径经历了一个先降低后增加的过程，在质量比为2.5:0.1:1时，粒径达到最小。并且相较于先复合PLL-RT，DNAPLL-RT与HA先复合制得的纳米基因传递载体的粒径更小。

实施例3细胞毒性

将实施例1所制备的不同HA质量与不同复合顺序的纳米基因传递载体进行细胞毒性实验。将B16F10细胞按照每孔1×10⁴的密度种植于96孔板中，培养过夜。将不同透明质酸质量比与不同复合顺序的纳米基因传递载体加入到细胞中，培养4h后，移去上清液，更换新鲜培养基，在孔板每孔加入20μL噻唑蓝溶液(5mg/mL)，37℃继续培养4h，加入二甲基亚砜溶解，于450nm下测定每孔吸光度值。细胞存活率采用以下公式计算：细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100。结果如表3所示。

表3不同HA用量与复合顺序制备纳米基因传递载体的细胞存活率

结果表明，本发明制备的纳米基因传递载体未表现出明显的细胞毒性，具有良好的生物相容性。

实施例4体外转染测试

将B16F10细胞按照每孔1×10⁴的密度种植于96孔板中，培养24h，后弃去培养基，加入新的培养基，将不同透明质酸质量比和不同复合顺序(即混合反应的顺序)制备的纳米基因传递载体加入到细胞中，在本测试过程中荧光素酶质粒为报告基因。继续培养48h。48h后弃去培养基，在96孔板中加入20μL的细胞裂解液，后将孔板至于-80℃冰箱，4h后解冻，在孔板中加入20μL的荧光素酶底物，测量荧光产率，推算出蛋白表达量。结果如表4所示。

表4不同质量比与复合顺序下纳米基因传递载体的转染效率

结果表明，随着透明质酸加入的量的增加，纳米基因传递载体的粒径经历了一个先增加后降低的过程，在质量比为2.5:0.1:1时，纳米基因传递载体的转染效率达到最高。并且PLL-RT与HA先复合(即混合、反应)时，纳米基因传递载体的转染效率更佳相较于先复合PLL-RT与DNA。因此将纳米基因传递载体的各组分比例优选为2.5:0.1:1，且复合顺序优选为先将PLL-RT与HA复合，再与DNA复合。

实施例5药代动力学试验

购买周龄6-8周的体重20g左右的C57BL/6小黑鼠，在本测试过程中Cy5-DNA为报告基因，将优选透明质酸质量比的纳米基因传递载体，无透明质酸的基因传递载体，纯Cy5-DNA通过尾静脉注射到小鼠体内，在0.5h，1h，2h，4h，8h，12h，24h，尾静脉取血10μL，通过酶标仪检测血液中的Cy5-DNA的含量，进而得到纳米基因传递载体在体内的药代动力学。在24h时，血液中的Cy5-DNA浓度如表5所示。

表5 24h后血液中Cy5-DNA的浓度(μg/mL)

结果表明，本发明提供由透明质酸和PLL-RT组成的纳米基因传递载体中的透明质酸可有效延长其在血液中的循环时间。

实施例6 VEGF-A基因沉默联合PD-L1基因沉默克服获得性耐受

在购买周龄6-8周的体重20g左右的C57BL/6小黑鼠，按每只小鼠2×106细胞接种于小鼠背部，7天后，瘤径平均长大至5mm时，将担载治疗质粒pshPD-L1以及同时担载pshPD-L1&pshVEGF-A的纳米基因传递载体与对照PBS经尾静脉注射入小鼠体内，给药量和给药次数根据肿瘤抑制效果和老鼠健康状况而定，无特定要求。治疗后的肿瘤组织匀浆后进行流式实验，表征CD8T细胞表面PD-1，CTLA-4，TIM-3，LAG-3，VEGF-R2的表达情况，以及耗竭型T细胞的含量，结果见表6和表7。

表6 CD8T细胞表面PD-1，CTLA-4，TIM-3，LAG-3，VEGF-R2的表达情况

结果表明，在单一PD-L1沉默基因治疗组会上调CD8T细胞表面VEGF-R2的表达，并在VEGF-A的作用下上调PD-1，CTLA-4，TIM-3，LAG-3等抑制性检查点的表达。但联用VEGF-A基因沉默后，PD-1，CTLA-4，TIM-3，LAG-3等抑制性检查点的表达下调。

表7 PD-1/TIM-3与PD-1/LAG-3共表达耗竭型CD8T细胞的比例

结果显示，经过PD-L1沉默基因与VEGF-A沉默基因联合治疗之后耗竭型T细胞的比例明显降低。

实施例7 VGEF-A基因沉默导致的血管正常化表征

在购买周龄6-8周的体重20g左右的C57BL/6小黑鼠，按每只小鼠2×106细胞接种于小鼠背部，7天后，瘤径平均长大至5mm时，将担载不同量治疗质粒pshVGEF-A的纳米基因传递载体与对照PBS经尾静脉注射入小鼠体内，给药量和给药次数根据肿瘤抑制效果和老鼠健康状况而定，无特定要求。治疗后的肿瘤组织石蜡包埋切片进行免疫荧光染色，表征血管正常化程度，结果见表8。

表8不用pshVEGF-A质粒用量对血管正常化程度的影响

pshVEGF-A质粒用量	血管正常化程度
		0mg/kg	0.22
0.25mg/kg	0.45
		0.75mg/kg	0.74
1.5mg/kg	0.27

结果表明：随着pshPD-L1质粒用量增加，肿瘤组织的血管正常化的程度增加，当用量为0.75mg/kg时血管正常化程度最高，但继续增加质粒用量，血管正常化程度降低，这是由于过度的新生血管抑制不利于血管正常化。

实施例8血管正常化缓解肿瘤组织乏氧

在购买周龄6-8周的体重20g左右的C57BL/6小黑鼠，按每只小鼠2×106细胞接种于小鼠背部，7天后，瘤径平均长大至5mm时，将担载不同量治疗质粒pshVGEF-A以及同时担载的纳米基因传递载体与对照PBS经尾静脉注射入小鼠体内，给药量和给药次数根据肿瘤抑制效果和老鼠健康状况而定，无特定要求。小鼠在处死前90min，将盐酸哌莫硝唑(60g/20g)腹腔注射到每只小鼠中。收集肿瘤组织石蜡包埋，切片进行免疫荧光染色，使用ImageJ软件分析肿瘤缺氧区域的半定量结果，结果见表9。

表9不用pshVEGF-A质粒用量对肿瘤组织乏氧的影响

pshVEGF-A质粒用量	肿瘤组织乏氧
		0mg/kg	0.78
0.25mg/kg	0.56
		0.75mg/kg	0.11
1.5mg/kg	0.80

结果表明：随着pshVEGF-A质粒用量增加，肿瘤组织的乏氧得到缓解，当用量为0.75mg/kg时肿瘤组织乏氧得到最显著的缓解，这是由于血管正常化带来的氧气浸润增强。但继续增加质粒用量，肿瘤组织的乏氧程度增加，这是由于过度的新生血管抑制减少了氧气运输到肿瘤组织。

实施例9血管正常化增加了肿瘤组织中淋巴细胞的浸润：

在购买周龄6-8周的体重20g左右的C57BL/6小黑鼠，按每只小鼠2×106细胞接种于小鼠背部，7天后，瘤径平均长大至5mm时，将担载治疗质粒pshVGEF-A的纳米基因传递载体与对照PBS经尾静脉注射入小鼠体内，给药量和给药次数根据肿瘤抑制效果和老鼠健康状况而定，无特定要求。治疗后的肿瘤组织匀浆后进行流式实验，表征肿瘤组织中淋巴细胞的含量，结果见表10。

表10 pshVEGF-A质粒治疗后肿瘤组织中淋巴细胞的含量

结果表明，在经过pshVEGF-A质粒治疗过后，肿瘤组织中的血管正常化程度增加，进而肿瘤组织中的淋巴细胞浸润量增加。

实施例10体内抗肿瘤治疗效果测试

在购买周龄6-8周的体重20g左右的C57BL/6小黑鼠，按每只小鼠2×106细胞接种于小鼠背部，7天后，瘤径平均长大至5mm时，将担载治疗质粒pshPD-L1以及同时担载pshPD-L1&pshVEGF-A的纳米基因传递载体与对照PBS经尾静脉注射入小鼠体内，给药量和给药次数根据肿瘤抑制效果和老鼠健康状况而定，无特定要求。给药后测量肿瘤体重大小，整个实验过程共跟踪9天。治疗后的肿瘤生长情况见表11。

表11进行不同治疗后的肿瘤重量

结果表明，在联合基因治疗组，肿瘤重量最小，表明本发明提供的纳米纳米基因传递载体实现PD-L1与VEGF-A联合沉默疗法能够显著地抑制肿瘤的生长。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于，包括：

将经修饰的聚α-赖氨酸与透明质酸混合后，再与核酸混合，得到抗肿瘤药物；

所述经修饰的聚α-赖氨酸和透明质酸的质量比为2.5：（0.05~1.25）；

所述修饰为N'-对甲苯磺酰基-L-精氨酸修饰；经N'-对甲苯磺酰基-L-精氨酸修饰的聚α-赖氨酸的分子量为10000~50000；所述透明质酸的分子量为20000~50000；

所述核酸为：调控免疫检查点基因沉默的核酸和/或调控血管内皮因子基因沉默的核酸。

2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，

所述经修饰的聚α-赖氨酸、透明质酸和核酸的质量比为2.5：（0.05~1.25）:1。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述免疫检查点为PD-1、CTLA-4、TIM-3和LAG-3中的至少一种。