CN111235106A

CN111235106A - 一种靶向肿瘤细胞的Aptamer-CD3+T细胞及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN111235106A
Application number: CN202010209383.9A
Authority: CN
Inventors: 章晓联; 刘传刚
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2020-03-23
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2040-03-23
Also published as: CN111235106B

Abstract

本发明公开了一种靶向肿瘤细胞的Aptamer‑CD3⁺T细胞及其构建方法与应用。属于肿瘤免疫过继治疗技术领域。具体为用糖代谢途径和生物正交反应将特异靶向识别肿瘤细胞适配体（aptamer）偶联到CD3⁺T细胞上，制备可以靶向识别肿瘤细胞的Aptamer‑CD3⁺T细胞。以该Aptamer‑CD3⁺T细胞作为药物，可用其在体内外靶向抑制肿瘤细胞生长。本发明为肿瘤免疫治疗细胞制备提供了新的技术方法。

Description

一种靶向肿瘤细胞的Aptamer-CD3+T细胞及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域，提供了一种通过糖代谢标记和生物正交反应制备Aptamer-CD3⁺T细胞的新技术的方法，及制备的该Aptamer-CD3⁺T在肿瘤免疫治疗领域的应用。

背景技术

嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）技术是由识别肿瘤抗原单链抗体与 T 细胞的活化序列（信号传导分子的胞内段）相融合，利用单链抗体与肿瘤抗原高亲和力结合，既靶向杀伤肿瘤，又能克服肿瘤细胞下调 MHC 分子表达、降低抗原递呈的免疫逃逸作用。CAR-T细胞免疫疗法尽管在治疗血液肿瘤中有巨大的希望，但是同时也存在较大的副作用。绝大多数的CAR-T治疗技术使用病毒（如慢病毒或逆转录病毒作为治疗载体）改造T细胞，其中慢病毒或逆转录病毒整合入机体细胞基因组存在潜在的致病及致癌风险。多种肿瘤缺乏可用于制备CAR-T的scFv，严重限制了CAR-T免疫治疗技术的发展。CAR-T细胞免疫疗法带来一个巨大的临床风险就是细胞因子风暴。当CAR-T细胞快速杀死癌细胞时，产生的大量细胞因子会对宿主其他组织器官发起惊人的攻击，导致高烧、低压、休克甚至死亡。

糖代谢和生物正交反应（点击化学反应为其中一种)是近几年发展较快的一门糖生物学和化学生物学新技术。其原理是，叠氮基甘露糖胺（ManNAz）可有效的被细胞摄取，并通过糖代谢途径在其细胞表面表达出叠氮键，通过点击化学方式，可以与不同带有DBCO末端的小分子结合，用于细胞表面的功能化修饰，此过程简单易操作，且生物安全性高，无细胞毒副作用。用于活细胞糖蛋白标记、定量、示踪以及富集。

核酸适配体(aptamer)是一类被称作“核酸抗体”分子，其可代替抗体或单链抗体（scFv），它们对性质各异的众多靶标分子均具有较高的靶向特异性和亲和性，是分子靶向治疗的新方向。研究证明适配子可用于多种疾病的诊断和治疗，具有无毒、无免疫原性、能运载药物、容易修饰、成本低等功能。虽然寡核酸适配体能够靶向小鼠体内的肿瘤，但其靶向及抑制效果有限，且核酸在体内循环过程中，易被核酸酶降解，且体内稳定性差。

程序性死亡受体1 PD-1(programmed cell death protein 1，PD-1)，也称为CD279，是一种重要的免疫抑制分子。它可与肿瘤细胞表面的免疫抑制性配体分子PD-L1（programmed cell death protein ligand 1，PD-L1）通过负向调节免疫系统对机体细胞的反应，以及通过抑制T细胞炎症活动来调节免疫系统并促进自身耐受。PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂能够激活显著的、持久的抗肿瘤免疫反应，已经被批准用于包括晚期非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌和三阴性乳腺癌等多种肿瘤的治疗，是目前最具有前景的肿瘤治疗手段。但遗憾的是，约70%的晚期肿瘤患者对PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂治疗不反应，因此，探寻如何提高阻断PD-1/PD-L1通路治疗效果具有重要的研究意义，也是目前研究的热点。

因此，本领域迫切需要开发增强靶向PD-1/PD-L1通路治疗的敏感性及一种非转染的方式提供T细胞的靶向性的方法。本发明解决了该需求。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种靶向肿瘤细胞的Aptamer-CD3⁺T细胞。用糖代谢途径和生物正交反应将特异靶向识别肿瘤细胞适配体（aptamer）偶联到CD3⁺T细胞上，制备可以靶向识别肿瘤细胞的Aptamer-CD3⁺T细胞。以该Aptamer-CD3⁺T细胞作为药物，可用其在体内外靶向抑制肿瘤细胞生长。本发明为肿瘤免疫治疗细胞制备提供了新的方案。

本发明第二个目的，提供上述靶向肿瘤细胞的Aptamer-CD3⁺T细胞在制备用于过继免疫治疗的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，提供一种靶向肿瘤细胞的Aptamer-CD3⁺T细胞，通过以下步骤制得：

（1）分离获得CD3⁺T细胞，用含有激活细胞用抗体和ManNAz的培养基经体外激活扩大培养；

（2）通过糖代谢途径在CD3⁺T细胞表面表达叠氮键获得糖处理后的激活的CD3+T细胞，再将人工合成的DBCO化学分子修饰的核酸适配体，通过点击化学手段，共价偶联于糖处理后的激活的CD3⁺T细胞表面，获得Aptamer-CD3⁺T细胞。

该制备方法的基本原理为在CD3⁺T细胞激活培养的同时加入ManNAz，经细胞内代谢途径该糖中的叠氮基保留在唾液酸中，然后唾液酸随糖链修饰于细胞表面N糖蛋白，这样在加入DBCO修饰的适配体时通过Click反应将其偶联在T细胞上。

优选地，所述靶向肿瘤细胞的Aptamer-CD3⁺T细胞由如下方法制备获得：

（1）人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）制备；

（2）磁珠分选CD3⁺T 细胞；

（3）CD3⁺T细胞的培养、激活：

anti-CD28以及白细胞介素-2激活后的CD3⁺T细胞与叠氮修饰的甘露醇共培养，在CD3⁺T细胞表面表达叠氮键，获得糖处理后的激活的CD3⁺T细胞；

（4）S4F-CD3⁺T细胞制备：

将人工合成的DBCO修饰的S4F核酸适配体与步骤（3）糖处理后的激活的CD3⁺T细胞共培养，获得所述S4F-CD3⁺T，其中，

DBCO末端修饰的S4F核酸适配体的核苷酸序列如下：

DBCO-GATCTCTCTCTGCCCTAAGTCCGCACCCGTGCTTCCCTGT。

在本发明的一个具体实施例中体外检测T细胞激活效果，以上述S4F-CD3⁺T细胞为药物，细胞水平利用乳酸脱氢酶方法检测其对SGC-7901人胃癌肿瘤细胞的靶向杀伤效果。结果：制备的S4F-CD3⁺T体外经激活具备一定杀伤肿瘤细胞能力，且随着与SGC-7901细胞配比增加，杀伤效果逐步增强。

在本发明一个具体实施例中，利用裸鼠模型，进行体内S4F-CD3⁺T对裸鼠皮下荷瘤SGC-7901的靶向实验，采用持续测量肿瘤大小、剥离肿瘤观察以及活体成像监测肿瘤免疫治疗效果，流式及免疫荧光实验检测适配体S4F对CD3⁺T细胞向肿瘤细胞的靶向富集作用。结果表明过继S4F-CD3⁺T实验组肿瘤显著小于仅过继CD3⁺T实验组和过继偶联对照适配子CD3⁺T（NCS4F-CD3⁺T）实验组。

（1）鼠外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）制备；

（2）磁珠分选CD3⁺T 细胞；

（3）CD3⁺T细胞的培养、激活：

（4）aptPDL1-CD3⁺T细胞制备：

将人工合成的DBCO修饰的aptPDL1核酸适配体与步骤（3）糖处理后的激活的CD3⁺T细胞共培养，获得所述aptPDL1-CD3⁺T，其中，

DBCO末端修饰的aptPDL1核酸适配体的核苷酸序列如下：

DBCO- ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT。

在本发明一个具体实施例中，对BALB/c小鼠皮下种植CT26肿瘤细胞，在肿瘤周边过继上述构建的aptPDL1-CD3⁺T或NCaptPDL1-CD3⁺T（作为阴性对照），同时增设仅过继CD3⁺T细胞或T细胞重悬液1640培养基。结果显示，aptPDL1-CD3⁺T组肿瘤生长速度显著小于NCaptPDL1-CD3⁺T、仅CD3⁺T以及1640对照组的肿瘤生长速度。小鼠死亡统计曲线显示，mock组（注射T细胞稀释液1640培养基）在第15 d左右开始出现小鼠死亡，至第27 d时，小鼠全部死亡。仅CD3⁺T和NCaptPDL1-CD3⁺T组分别在第21、23 d出现死亡，而aptPDL1-CD3⁺T组在第28d时才出现小鼠死亡。并且到实验结束时，aptPDL1-CD3⁺T组小鼠生存率远高于其他3个对照组小鼠生存率。

在本发明一个具体实施例中，将aptPDL1-CD3⁺T联合PD-1封闭性抗体（clone29F.1A12; Biocell）应用于小鼠CT26结肠癌模型中，肿瘤大小统计分析显示， aptPDL1-CD3⁺T过继联合PD-1封闭性抗体治疗亦可抑制CT26肿瘤的增长速度。而且，将aptPDL1-CD3⁺T过继联合PD-1封闭性抗体治疗对CT26肿瘤的增长抑制效果最佳，所以将T细胞上PD-1免疫抑制性受体拮抗封闭后，显著增强T细胞的抗肿瘤效果。小鼠死亡统计曲线显示，aptPDL1-CD3⁺T过继联合PD-1封闭性抗体治疗组同aptPDL1-CD3⁺T治疗组一致，提高了小鼠生存率。而aptPDL1-CD3⁺T过继联合PD-1封闭性抗治疗组实验期间生存率100%，更大程度的提高了荷瘤小鼠的生存率。以上结果表明，aptPDL1-CD3⁺T过继联合PD-1封闭性抗体治疗具有协同效应，可以作为一种潜在的治疗肿瘤患者的手段。

第二方面，提供上述靶向肿瘤细胞的Aptamer-CD3⁺T细胞在制备用于过继免疫治疗肿瘤的药物中的应用。

优选地，所述Aptamer-CD3⁺T细胞为S4F-CD3⁺T或aptPDL1-CD3⁺T。

优选地，所述的肿瘤为胃癌或结肠癌。

第三方面，提供一种组合物，所述组合物包含上述aptPDL1-CD3⁺T细胞和PD-1封闭性抗体。

第四方面，提供上述组合物在制备用于过继免疫治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明的有益效果：

（1）本发明以糖代谢途径和生物正交反应将适配体结合到CD3⁺T细胞表面，增强CD3⁺T细胞的靶向性，消除采用病毒载体转染引发的潜在危险。

（2）本发明利用S4F核酸适配体修饰的CD3⁺T，使其具备良好的胃癌靶向性，提高CD3⁺T对胃癌的主动靶向杀伤能力。

（3）本发明表面修饰PD-L1核酸适配体的CD3⁺T，有效阻断结肠癌细胞表面PD-L1受体分子，抑制CD3⁺T细胞表面PD-1与其结合，提高CD3⁺T细胞杀伤作用。

（4）本发明表面修饰PD-L1核酸适配体的CD3⁺T和PD-1封闭性抗体联用具有协同效应。可以作为一种潜在的治疗肿瘤患者的手段。

（5）本发明利用糖代谢途径修饰的核酸适配体于CD3⁺T细胞表面，有效提高CD3⁺T细胞表面的靶向核酸效价，以及提高核酸适配体在体内的稳定性，降低核酸酶降解作用。

附图说明

图1为荧光共聚焦和流式检测DBCO-适配子可以偶联到CD3⁺T细胞上。

图2为 Aptamer-CD3⁺T细胞水平靶向杀伤肿瘤细胞。

图3为活体水平检测S4F-CD3⁺T对SGC-7901人胃癌细胞的靶向杀伤作用的实验流程图。

图4 为Aptamer-CD3⁺T体内靶向杀伤肿瘤细胞；

a 图为连续测量肿瘤大小统计结果；b 图为分别在第18、28、36天，每组取6只小鼠，剥离肿瘤对比大小结果；c 图为分别在第18、28、36天，进行小动物活体成像。

图5为在S4F-CD3⁺T实验组，肿瘤浸润T细胞显著增加。

图6为在S4F-CD3+T实验组，具有细胞毒性的肿瘤浸润T细胞显著增加。

图7为aptPDL1-CD3⁺T在小鼠体内显著抑制CT26肿瘤生长并提高小鼠生存率。

图8为aptPDL1-CD3⁺T过继治疗联合PD-1封闭抗体显著增强T细胞抗肿瘤能力和提高小鼠生存率。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】 CD3⁺T细胞的获取

首先以人外周血CD3⁺T细胞的获取为例。

一．外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）制备

1.取人源外周血50mL于抗凝管中，并加等体积PBS稀释；

2.稀释过后的血液缓慢加入含有等体积淋巴细胞分离液的离心管中，不超过离心管总体积2/3，20℃，400g/min离心15min（升速9、降速1）；

3.吸取云雾状液体于离心管中，300g，5min去掉多余液体；

4.加入红细胞裂解液3mL裂解5min；

5.加入5mL PBS 300g，5min洗1-2遍，备用。

备注：上述所用试剂材料均需提前无菌处理。

二．磁珠分选CD3⁺T 细胞（Pan T CellBiotin-Antibody Cocktail，阴性分选）

1. 将上述细胞转移到无菌15mL EP管中，800rpm，5min，去除培养基；

2. 然后，按照40μL/10⁷ total cells加入分选缓冲液 ,然后再按照10μL/10⁷ totalcells加入Biotin-Antibody Cocktail ，轻混匀，4℃，放置5min；

3. 然后，再次按照30μL/10⁷ total cells加入 buffer ，轻混匀；

4. 按照20μL/10⁷ total cells加入 Anti-Biotin MicroBeads ，轻混匀，4℃，放置10min；

5. 加入buffer定容至500μL；

6. 用3mLbuffer润洗柱子（LS柱子），弃掉流下液体，然后加入上述细胞悬液，并将柱子至于磁力架上，下方放置一干净15mLEP管回收滴下的细胞悬液，待上述细胞悬液滴完后，再加入3mLbuffer继续冲洗柱子；

7. 800rpm，5min，弃掉上清液体，细胞用1mL1640培养基重悬，并计数。

【实施例2】 CD3⁺T细胞的培养、激活及Aptamer-CD3⁺T细胞制备

一．CD3⁺T细胞的培养、激活

1. 培养基配置：

1640培养基：含10％FBS, 2mM谷氨酰胺（gluamine），1％MEM non-essential aminoacid solution, 100uM HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)，1mM 丙酮酸钠（sodium pyruvate）,1％antibiotic-antimycotic solution (双抗)；

2. 每个细胞培养板提前使用工作浓度为5μg/mL的anti-CD3预包被，分离细胞稀释为10⁶ 个/ml ，每个平板加入稀释后的细胞10ml，补充加入2μg/ml anti-CD28以及50U/ml的IL-2，37℃，5％CO₂继续培养3d；

3. 3d后换新鲜培养液一次，然后加入工作浓度为100μM ManNAz，继续按照上述方法扩大培养至7d。

二．Aptamer-CD3⁺T细胞制备

1、收集上述培养细胞，使用无血清1640培养基清洗两次，最后使用1mL无血清1640培养基重悬；

2、S4F适配子的核苷酸序列为GATCTCTCTCTGCCCTAAGTCCGCACCCGTGCTTCCCTGT，S4F为特异结合SGC-7901人胃癌肿瘤细胞适配子，为本实验室通过SELEX方法筛选获得。将筛选获得的S4F适配子送武汉擎科生物科技有限公司同时进行5’端DBCO合成修饰，3’端FITC绿色荧光合成修饰。在上述处理的细胞加入DBCO-S4F-FITC（工作浓度：300nM）适配子, 37℃培养箱避光孵育40min，然后无血清1640培养基洗涤三次，计数备用。然后分别进荧光共聚焦（图1a）和流式（图1b）检测，结果表明加入ManNAz培养T细胞组明显检测到绿色荧光信号，即糖代谢标记成功。

【实施例3】Aptamer-CD3⁺T细胞体外、体内对肿瘤靶向杀伤应用检测（以SGC-7901（人胃癌细胞）的适配子-S4F制备S4F-CD3⁺T细胞为例）

一、细胞水平LDH法检测S4F-CD3⁺T对SGC-7901人胃癌细胞的靶向杀伤作用

1.提前饲养状态良好的SGC-7901细胞；（10％FBS+DMEM）

2. 取上述S4F-CD3⁺T细胞稀释到以下三种浓度：20×10⁶个/mL ，10×10⁶个/mL ，5×10⁶个/mL，1×10⁶个/mL备用。

3.将SGC-7901细胞消化收集重悬，然后调整细胞浓度为1×10⁵个/mL。

4. 利用LDH释放试剂盒(货号: G1780,Promega)检测S4F-CD3⁺T细胞靶向杀伤裂解SGC-7901人胃癌细胞后释放出来的LDH，以此来判断S4F-CD3⁺T细胞的CTL活性：96孔培养板中每孔铺入SGC-7901人胃癌细胞，设置仅CD3⁺T细胞对照组。分别按照S4F-CD3⁺T细胞/SGC-7901人胃癌细胞比例20:1、10:1、5:1、 1:1 的比例加入CD3⁺T细胞。

5.同时，每个实验孔要设置对应的T细胞的自发释放孔、每块96孔板均设置SGC-7901人胃癌细胞自发释放孔、 SGC-7901人胃癌细胞最大释放孔、培养基背景孔、体积校正孔，每种处理各2-3个复孔。250 g离心1min以使细胞沉到培养板底部以充分接触，培养12小时。

6.在收样品检测前15 min，加入10 uL裂解液至SGC-7901人胃癌细胞最大释放孔以及体积校正孔中。

7.细胞培养12小时后，250 g 离心5 min，排枪转移50 uL上清到新的96孔板中。

8.每孔中加入50 mL Substrate Mix 到上清中，室温下避光反应30 min。

9. 每孔加50 mL终止液，检测490 nm的吸光值。

10.用以下公式计算杀伤活性：

%细胞毒性= （实验组 – 效应细胞自释 – 靶细胞自释） /（靶细胞最大释放 – 靶细胞自释）×100

结果：制备S4F-CD3⁺T体外经激活具备一定杀伤肿瘤细胞能力，且随着与SGC-7901细胞配比增加，杀伤效果逐步增强。如图2所示。

二、活体水平检测S4F-CD3⁺T对SGC-7901人胃癌细胞的靶向杀伤作用

1.体内实验流程如图3

在第0天，4-6周龄雌性裸鼠皮下荷瘤SGC-7901(tfRFP，红色荧光)，1x10⁷个/只；

2.第8天时，将荷瘤裸鼠随机分为3组，18只/组，分别为S4F-CD3⁺T实验组、CD3⁺T实验组、对照适配体CD3⁺T（NCS4F-CD3⁺T）（NCS4F， 5’-GCGTATCCTCTTCTCCACCTCGAGTCCAGCTCTGCCTCTG-3’）。然后每组再分为3小组，6只/小组；

3.实验全程，使用游标卡尺每2天测量一次肿瘤大小，并记录；

4.分别在第8、18、28天在肿瘤周边过继经体外改造的上述CD3⁺T细胞，2X10⁷个/只；

5.分别在第18、28、36天取每组中其中1小组实验小鼠进行实验（小鼠活体成像、剥离肿瘤对比大小以及流式间接免疫荧光检测CD3⁺T细胞浸润）；

6.直至第36天结束实验。

结果：如图4所示

a 图为连续测量肿瘤大小统计结果，结果表明过继S4F-CD3⁺T实验组肿瘤显著小于仅过继CD3⁺T实验组和过继偶联对照适配子CD3⁺T（NCS4F-CD3⁺T）实验组；

b 图为分别在第18、28、36天，每组取6只小鼠，剥离肿瘤对比大小结果，结果表明过继S4F-CD3⁺T实验组肿瘤显著小于仅过继CD3⁺T实验组和过继偶联对照适配子CD3⁺T（NCS4F-CD3⁺T）实验组；

c 图为分别在第18、28、36天，进行小动物活体成像，结果表明过继S4F-CD3⁺T实验组肿瘤显著小于仅过继CD3⁺T实验组和过继偶联对照适配子CD3⁺T（NCS4F-CD3⁺T）实验组；

综上，偶联S4F后，显著提高CD3⁺T对肿瘤杀伤效果。

【实施例5】肿瘤浸润总CD3⁺T、总CD3⁺CD4⁺T以及总CD3⁺CD8⁺T细胞显著增加

进一步探寻为什么S4F-CD3⁺T细胞过继免疫治疗后的小鼠肿瘤内检测到更多的肿瘤浸润T淋巴细胞，进而发挥显著的抑制肿瘤生长的作用。将肿瘤组织剥离后分别通过FCM和组织免疫荧光实验检测S4F-CD3⁺T细胞治疗组肿瘤浸润CD3⁺T细胞、CD3⁺CD4⁺T细胞以及CD3⁺CD8⁺T细胞含量是否增加。FCM结果显示，相比过继NCS4F-CD3⁺T细胞组和仅过继CD3⁺T细胞组，S4F-CD3⁺T细胞过继治疗组肿瘤浸润CD3⁺T细胞（图5a）、CD3⁺CD4⁺T细胞（图5b）以及CD3⁺CD8⁺T细胞（图5c）显著增加。同FCM结果一致，肿瘤组织免疫荧光实验显示，S4F-CD3⁺T细胞过继治疗组肿瘤浸润CD3⁺T细胞（图5d）、CD3⁺CD4⁺T细胞（图5e）以及CD3⁺CD8⁺T细胞（图5f）显著增加。以上结果表明，S4F适配子可以显著提高T细胞对肿瘤组织的富集靶向能力。

【实施例6】肿瘤浸润活化的CD3⁺T显著增加

CD69 早期被称为AIM (activation inducer molecule)、EA-1、Leu-23 和MLR-3，是C-型凝集素受体家族的成员。处于静息状态下的T细胞基本不表达CD69，而当T淋巴细胞被激活后CD69是最早表达的表面抗原，CD69可以作为共刺激信号协同促进T淋巴细胞的进一步活化和增殖，促进抗肿瘤作用。另外，活化T细胞高表达的一种膜型FasL，它可与靶细胞表面的Fas结合，然后通过激活细胞内胱天蛋白酶（caspase）参与的信号转导途径，诱导靶细胞的凋亡。以下通过FCM技术检测肿瘤浸润CD3⁺T细胞表达GraB、CD69、perforin、CD107a以及FasL的情况。

流式检测结果显示，相比对照实验组（NCS4F-CD3⁺T 和CD3⁺T组），S4F-CD3⁺T实验组表达CD69的肿瘤浸润CD3⁺T细胞比例显著增加（图6b）。另外，表达GraB（图6a）、perforin（图6c）、CD107a（图6d）以及Fas-L（图6e）肿瘤浸润CD3⁺T细胞比例也显著增加。以上结果表明将CD3⁺T细胞偶联特异靶向结合SGC-7901人胃癌肿瘤细胞的核酸适配子S4F后，不仅可以提高肿瘤浸润T细胞比例也可以使活化且具有细胞毒性的T细胞在肿瘤环境中的富集增加，进而增强了T细胞的抗肿瘤效果。

【实施例7】aptPDL1-CD3⁺T在小鼠体内显著抑制CT26肿瘤生长，提高小鼠生存率

为了检测在小鼠体内aptPDL1-CD3⁺T细胞是否对高表达PDL1的CT26小鼠结肠癌肿瘤细胞具有靶向抑制作用，使用ManNAz代谢标记鼠源CD3⁺T细胞，然后将DBCO修饰的aptPDL1（5’-ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACA

ATGCGTCCACTGCCCGT-3’）或NCaptPDL1（5’- ATGTGCTACATCATCTCTA

TCATACACATAGCGTCGAGTCCGCCA-3’）（作为阴性对照组）通过无铜点击（copper-freeclick）反应偶联于T细胞表面，构建成为aptPDL1-CD3⁺T或NCaptPDL1-CD3⁺T（图7a）。在第6 d时，将皮下种植CT26肿瘤细胞的BALB/c小鼠随机分为4组（6只/组）。分别在第6、16、26 d时，在肿瘤周边过继上述构建的aptPDL1-CD3⁺T或NCaptPDL1-CD3⁺T，同时增设仅过继CD3⁺T细胞或T细胞重悬液1640培养基（作为未治疗对照组），T细胞过继剂量为2 x 10⁶个/只（图7b）。实验期间，每三天使用游标卡尺测量一次肿瘤大小并观察记录小鼠死亡情况。肿瘤测量统计分析结果显示，aptPDL1-CD3⁺T组肿瘤生长速度显著小于NCaptPDL1-CD3⁺T、仅CD3⁺T以及1640对照组肿瘤生长速度（图7c）。小鼠死亡统计曲线显示，mock组（注射T细胞稀释液1640培养基）在第15 d左右开始出现小鼠死亡，至第27 d时，小鼠全部死亡。仅CD3⁺T和NCaptPDL1-CD3⁺T组分别在第21、23 d出现死亡，而aptPDL1-CD3⁺T组在第28 d时才出现小鼠死亡。并且我们发现到实验结束时，aptPDL1-CD3⁺T组小鼠生存率远高于其他3个对照组小鼠生存率（图7d）。

综上，构建aptPDL1-CD3⁺T靶向治疗高表达PDL1的肿瘤，可以显著抑制肿瘤生长速度，延缓肿瘤恶化进程，提高小鼠存活效率。进一步证明，通过糖代谢途径和生物正交-click反应设计aptamer-CD3⁺T用于靶向治疗肿瘤是一种非常有前途的治疗策略。

【实施例8】aptPDL1-CD3⁺T过继联合PD-1封闭抗体治疗显著增强抑制肿瘤生长能力和提高小鼠生存率

程序性死亡受体1 PD-1(programmed cell death protein 1，PD-1)，也称为CD279，是一种重要的免疫抑制分子。它可与肿瘤细胞表面的免疫抑制性配体分子PD-L1（programmedcell death protein ligand 1，PD-L1）通过负向调节免疫系统对机体细胞的反应，以及通过抑制T细胞炎症活动来调节免疫系统并促进自身耐受。然而，PD-1与PD-L1相互作用诱导T细胞过继治疗中CD8⁺T细胞耗竭，严重影响T细胞的抗肿瘤效果。

随着T细胞过继治疗的不断发展，PD-1封闭性抗体越来越广泛的被联合应用治疗肿瘤，PD-1封闭性抗体通过与T细胞上PD-1结合拮抗其与肿瘤细胞上PD-L1配体的相互作用，从而恢复T细胞的正常识别和防御攻击功能。进而增强T细胞的抗肿瘤效果，减慢肿瘤恶化进程。所以，将aptPDL1-CD3⁺T联合PD-1封闭性抗体（clone 29F.1A12; Biocell）应用于小鼠CT26结肠癌模型中，以此检测是否可以增强aptPDL1-CD3⁺T的抗肿瘤效果。按照上述方法荷瘤第6 d后，将荷瘤小鼠随机分为五组（6只/组）。同样，分别在第6、16、26 d时于肿瘤周边过继同上述方法准备的aptPDL1-CD3⁺T、aptPDL1-CD3⁺T（联合应用PD-1封闭性抗体）、aptPDL1-CD3⁺T（联合应用PD-1封闭性抗体的同型对照抗体）、CD3⁺T（联合应用PD-1封闭性抗体）以及仅CD3⁺T细胞，剂量为2 x 10⁷个/只。PD-1封闭性抗体及其同型对照抗体通过腹腔注射，剂量为12 mg/kg，第6 d起每3 d注射一次。同样记录小鼠肿瘤大小变化及观察记录小鼠死亡情况。

肿瘤大小统计分析显示，同aptPDL1-CD3⁺T过继治疗效果类似，CD3⁺T过继联合PD-1封闭性抗体治疗亦可抑制CT26肿瘤的增长速度。将aptPDL1-CD3⁺T过继联合PD-1封闭性抗体治疗对CT26肿瘤的增长抑制效果最佳，所以将T细胞上PD-1免疫抑制性受体拮抗封闭后，显著增强T细胞的抗肿瘤效果（图8a）。小鼠死亡统计曲线显示，CD3⁺T过继联合PD-1封闭性抗体治疗组同aptPDL1-CD3⁺T治疗组一致，提高了小鼠生存率。而aptPDL1-CD3⁺T过继联合PD-1封闭性抗体治疗组实验期间生存率100%，更大程度的提高了荷瘤小鼠的生存率（图8b）。以上结果表明，aptPDL1-CD3⁺T过继联合PD-1封闭性抗体治疗具有协同效应，可以作为一种潜在的治疗肿瘤患者的手段。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一种靶向肿瘤细胞的Aptamer-CD3+T细胞及其构建方法与应用

<150> 201910816784.8

<151> 2019-08-30

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatctctctc tgccctaagt ccgcacccgt gcttccctgt 40

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgggccaca tcaactcatt gatagacaat gcgtccactg cccgt 45

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgtatcctc ttctccacct cgagtccagc tctgcctctg 40

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtgctaca tcatctctat catacacata gcgtcgagtc cgcca 45

Claims

1.一种靶向肿瘤细胞的Aptamer-CD3⁺T细胞，其特征在于，通过以下步骤制得：

（2）通过糖代谢途径在CD3⁺T细胞表面表达叠氮键获得糖处理后的激活的CD3⁺T细胞，再将人工合成的DBCO化学分子修饰的核酸适配体，通过点击化学手段，共价偶联于糖处理后的激活的CD3⁺T细胞表面，获得Aptamer-CD3⁺T细胞。

2.根据权利要求1所述的靶向肿瘤细胞的Aptamer-CD3⁺T细胞，其特征在于，通过以下步骤制得：

（1）人外周血单个核细胞或小鼠脾脏细胞制备；

（2）磁珠分选CD3⁺T 细胞；

（3）CD3⁺T细胞的培养、激活：

anti-CD3、anti-CD28以及白细胞介素-2激活后的CD3⁺T细胞与叠氮修饰的甘露糖胺共培养，在CD3⁺T细胞表面表达叠氮基，获得糖处理后的激活的CD3⁺T细胞；

（4）Aptamer-CD3⁺T（S4F-CD3⁺T）细胞制备：

将人工合成的DBCO修饰的核酸适配体Aptamer（S4F）与步骤（3）糖处理后的激活的CD3⁺T细胞共培养，获得所述S4F-CD3⁺T，其中，

DBCO末端修饰的核酸适配体（S4F）的核苷酸序列如下：

DBCO-GATCTCTCTCTGCCCTAAGTCCGCACCCGTGCTTCCCTGT。

3.根据权利要求1所述的靶向肿瘤细胞的Aptamer-CD3⁺T细胞，其特征在于，通过以下步骤制得：

（2）磁珠分选CD3⁺T 细胞；

（3）CD3⁺T细胞的培养、激活：

anti-CD28抗体以及白细胞介素-2激活后的CD3⁺T细胞与叠氮修饰的甘露醇共培养，在CD3⁺T细胞表面表达叠氮键，获得糖处理后的激活的CD3⁺T细胞；

（4）aptPDL1-CD3⁺T细胞制备：

将人工合成的DBCO修饰的核酸适配体aptPDL1与步骤（3）糖处理后的激活的CD3⁺T细胞共培养，获得所述aptPDL1-CD3⁺T，其中，

DBCO末端修饰的aptPDL1核酸适配体的核苷酸序列如下：

DBCO- ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT。

4.权利要求1-3任一项所述的靶向肿瘤细胞的Aptamer-CD3⁺T细胞在制备用于过继免疫治疗肿瘤的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述Aptamer-CD3⁺T细胞为权利要求2所述的S4F-CD3⁺T或权利要求3所述的aptPDL1-CD3⁺T。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为胃癌或结肠癌。

7.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求3所述的aptPDL1-CD3⁺T细胞和PD-1封闭性抗体。

8.权利要求7所述的组合物在制备用于过继免疫治疗肿瘤的药物中的应用。