CN116239699B - 一种靶向cd276的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种靶向CD276的嵌合抗原受体及其应用。该嵌合抗原受体包括依次串联的靶向CD276的单链抗体、铰链区、跨膜区结构域和胞内区结构域；靶向CD276的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID：1所示。本发明提供的靶向CD276的嵌合抗原受体能够有效激活免疫功能细胞并使其对卵巢癌细胞具有高杀伤力。
Description
技术领域
本发明涉及细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种靶向CD276的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
卵巢恶性肿瘤又称卵巢癌，是女性生殖器官常见的肿瘤之一，其发病率仅次于宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。近几年来，由于对宫颈癌及子宫体癌的防治，取得了一定的成效，而有卵巢癌由于早期缺少症状不易被发现，且预后相对较差，因而在卵巢癌的防治方面成效甚微。
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)又称大颗粒性淋巴细胞，其在机体免疫中扮演者重要的角色，一方面，当机体发生感染或创伤时，NK细胞能够快速、广泛、特异识别抗原，及时清楚病原微生物和变异细胞，发挥固有免疫作用；另一方面，NK细胞能够参与适应性免疫应答，影响T细胞和B细胞的效应功能。与T细胞相比，NK细胞具有对抗体亲和力要求更低、抗体选择范围更大、不会在受试者体内引起排斥反应、杀伤速度快、杀伤效率高等优点，因此，近年来已逐步考虑采用NK细胞作为效应细胞应用于肿瘤的免疫治疗中。但是，采用NK细胞用于肿瘤的免疫治疗中，其对肿瘤的杀伤效果并不理想。
嵌合抗原受体(CAR)可以识别特定蛋白抗原的细胞表面受体，CAR结构主要由负责识别抗原的胞外结构域(受体胞外段或者单链抗体结构域)、提供伸展性的铰链区、跨膜区、胞内段联合共刺激分子组成。当CAR结构与肿瘤相关抗原抗体融合表达在NK细胞的膜表面时，能够赋予NK细胞特异性识别对应肿瘤细胞的能力，此时的NK细胞即为CAR-NK细胞。CAR结构的单链抗体结构域会影响其与肿瘤细胞表面蛋白抗原的特异性结合，进而影响CAR-NK细胞对肿瘤的杀伤效果。目前，针对NK细胞的CAR结构的改造尚缺乏研究。
CD276(Cluster of Differentiation 276)是人类CD276基因编码的Ⅰ型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，也称B7-H3。CD276蛋白在正常组织中表达量极低，而在卵巢癌组织中高度过表达，通常与患者的不良预后和较差的临床治疗结果相关，是一种较为理想的卵巢癌治疗靶点。
发明内容
本发明提供一种靶向CD276的嵌合抗原受体及其应用，以有效激活免疫功能细胞并使免疫功能细胞高效地杀灭卵巢癌细胞。
根据本发明的第一个方面，提供一种靶向CD276的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括依次串联的靶向CD276的单链抗体、铰链区、跨膜区结构域和胞内区结构域；靶向CD276的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID：1所示；靶向CD276的单链抗体的氨基酸序列的第12、221、236、238位氨基酸独立地选自甘氨酸、丙氨酸中的其中一种；靶向CD276的单链抗体的氨基酸序列的第42、44、69、71、91、102、161、176、182、186、198位氨基酸独立地选自赖氨酸、组氨酸、精氨酸中的其中一种；靶向CD276的单链抗体的氨基酸序列的第97、118、148位氨基酸独立地选自赖氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸中的其中一种；靶向CD276的单链抗体的氨基酸序列的第24、55、141位氨基酸独立地选自甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸中的其中一种；靶向CD276的单链抗体的氨基酸序列的第37、50、59、77、86、138、168、179、207位氨基酸独立地选自天冬氨酸、谷氨酸中的其中一种。
经过不断的摸索试验，本发明筛选出含有如SEQ ID：1所示的氨基酸序列的单链抗体，能够特异性靶向CD276，SEQ ID：1中所涉及的第12、24、37、42、44、50、55、59、69、71、77、86、91、97、102、118、138、141、148、161、168、176、179、182、186、198、207、221、236、238位氨基酸均用X表示，其中，第12、221、236、238位氨基酸可独立地选自甘氨酸或丙氨酸；第42、44、69、71、91、102、161、176、182、186、198位氨基酸可独立地选自赖氨酸或组氨酸或精氨酸；第97、118、148位氨基酸可独立地选自赖氨酸或甲硫氨酸或亮氨酸或缬氨酸；第24、55、141位氨基酸可独立地选自甲硫氨酸或异亮氨酸或亮氨酸；第37、50、59、77、86、138、168、179、207位氨基酸可独立地选自天冬氨酸或谷氨酸。
本发明提供的靶向CD276的嵌合抗原受体的靶向性高，能够靶向卵巢癌细胞的表面蛋白抗原CD276，有效激活相关免疫功能细胞，并使免疫功能细胞高效杀伤卵巢癌细胞，将其应用到NK细胞中得到的CAR-NK细胞对卵巢癌细胞杀伤效果显著高于NK细胞。
优选地，上述靶向CD276的单链抗体的氨基酸序列选自SEQ ID：2、SEQ ID：3、SEQID：4中的其中一种。
根据本发明的第二个方面，提供一种表达基因，该表达基因包含编码上述靶向CD276的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
根据本发明的第三个方面，提供一种表达载体，该表达载体含有上述表达基因。
优选地，上述表达载体为含有上述表达基因的慢病毒。
根据本发明的第四个方面，提供一种靶向CD276的CAR-NK细胞，该CAR-NK细胞表达上述靶向CD276的嵌合抗原受体。
本方案提供的CAR-NK细胞含有靶向CD276的嵌合抗原受体，赋予CAR-NK细胞高肿瘤杀伤效果，可靶向卵巢癌细胞的表面抗原蛋白CD276，使得CAR-NK细胞能够对卵巢癌细胞进行高效杀伤，其对卵巢癌细胞的杀伤效果显著高于NK细胞。
优选地，上述CAR-NK细胞由上述表达载体转染NK92MI细胞制备得到。
根据本发明的第五个方面，提供上述靶向CD276的CAR-NK细胞在制备用于治疗卵巢癌的药物中的应用。
根据本发明的第六个方面，提供一种用于治疗卵巢癌的药物组合物，该药物组合物含有上述靶向CD276的CAR-NK细胞。
优选地，上述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
本发明提供的CAR对CD276具有特异性，其在NK细胞中表达之后得到的CAR-NK细胞能够靶向CD276抗原，与卵巢癌细胞表面的CD276蛋白特异性结合，有效激活相关功能免疫细胞，从而实现对高表达CD276的卵巢癌患者进行有效治疗。本发明提供的靶向CD276的CAR-NK细胞能够释放大量的肿瘤杀伤细胞因子，对高表达CD276的卵巢癌细胞的毒性大，可以高效杀伤CD276高表达的卵巢癌细胞。并且，本发明提供的CAR-NK细胞的转染效率高。
附图说明
图1为本发明实施例1对表达CAR1-CD276的CD276 CAR-NK细胞进行培养时的细胞生长状态图。
图2为本发明实施例2对表达CAR2-CD276的CD276 CAR-NK细胞进行培养时的细胞生长状态图。
图3为本发明实施例3对表达CAR3-CD276的CD276 CAR-NK细胞进行培养时的细胞生长状态图。
图4为本发明实施例1～3和对比例1～3制得的CD276 CAR-NK细胞与NK92MI细胞对不同肿瘤细胞系的杀伤效果对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明提供的技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例按照如下步骤制备CD276 CAR-NK细胞：
1.CAR序列选择
本实施例提供的嵌合抗原受体(CAR)包括依次串联的靶向CD276的单链抗体、CD8α铰链区、NKG2D跨膜区结构域以及包含2B4胞内区和CD3ζ胞内区的胞内区结构域。经过不断的摸索试验，本发明筛选出含有如SEQ ID：2所示的氨基酸序列的单链抗体的嵌合抗原受体(简称CAR1-CD276)。
2.CAR-NK细胞的制备
(1)取适量生长状态较好NK92MI细胞悬液，300g离心5min，去上清，收集NK92MI细胞，并用新鲜的培养基重悬细胞，然后将NK92MI细胞按10万/孔接种于12孔板中；
(2)按MOI＝10向12孔板中加入带有上述CAR1-CD276和GFP的慢病毒，再加入第一助感染剂(第一助感染剂在转染体系中的终浓度为10μg/mL)；调节恒温离心机在30℃、1200g下空转预热10min，将12孔板迅速放置于离心机中，配平后，在30℃、1200g下离心5h；
(3)将12孔板放入培养箱中培养7h，向上述转染体系中加入第二助感染剂、第三助感染剂、第四助感染剂各2uL，将12孔板放入培养箱继续培养，得到表达CAR1-CD276的CD276CAR-NK细胞；
其中，第一助感染剂为：聚凝胺终浓度为10mg/mL的水溶液；第二助感染剂为：白介素-2终浓度为70000000U/mL、溶剂为0.5vol％人血清白蛋白的溶液；第三助感染剂为：白介素-12终浓度为7000000U/ml、溶剂为0.5vol％人血清白蛋白的溶液；第四助感染剂为：植物血凝素终浓度为90mg/mL的水溶液；
(4)CD276 CAR-NK细胞扩增：将表达CAR1-CD276的CD276 CAR-NK细胞培养扩增，GFP阳性比例可通过流式细胞仪进行检测，通过计算表达CAR1-CD276的CD276 CAR-NK细胞(GFP阳性细胞)与总细胞的比值，得到CD276 CAR-NK细胞感染的阳性率。将转染后的CD276CAR-NK细胞进行流式分选，分选出GFP阳性的细胞群，即为阳性率较高的CD276 CAR-NK细胞。再将阳性率高的CD276 CAR-NK细胞继续培养扩增。
步骤(4)中，在对CD276 CAR-NK细胞进行培养时，在显微镜下对CD276CAR-NK细胞进行观察并拍照，CD276 CAR-NK细胞的生长状态如图1所示。
实施例2
本实施例按照如下步骤制备CD276 CAR-NK细胞：
1.CAR序列选择
本实施例提供的嵌合抗原受体(CAR)包括依次串联的靶向CD276的单链抗体、CD8α铰链区、NKG2D跨膜区结构域以及包含2B4胞内区和CD3ζ胞内区的胞内区结构域。经过不断的摸索试验，本发明筛选出含有如SEQ ID：3所示的氨基酸序列的单链抗体的嵌合抗原受体(简称CAR2-CD276)。
2.CAR-NK细胞的制备方法与实施例1相同。
在对CD276 CAR-NK细胞进行培养时，在显微镜下对CD276 CAR-NK细胞进行观察并拍照，CD276 CAR-NK细胞的生长状态如图2所示。
实施例3
本实施例按照如下步骤制备CD276 CAR-NK细胞：
1.CAR序列选择
本实施例提供的嵌合抗原受体(CAR)包括依次串联的靶向CD276的单链抗体、CD8α铰链区、NKG2D跨膜区结构域以及包含2B4胞内区和CD3ζ胞内区的胞内区结构域。经过不断的摸索试验，本发明筛选出含有如SEQ ID：4所示的氨基酸序列的单链抗体的嵌合抗原受体(简称CAR3-CD276)。
2.CAR-NK细胞的制备方法与实施例1相同。
在对CD276 CAR-NK细胞进行培养时，在显微镜下对CD276 CAR-NK细胞进行观察并拍照，CD276 CAR-NK细胞的生长状态如图3所示。
对比例1
本对比例参照实施例1制备CD276 CAR-NK细胞，与实施例1的区别在于：本对比例所涉及的CAR序列中的单链抗体的氨基酸序列不同，其氨基酸序列如SEQ ID：5所示，其余步骤与实施例1保持一致。
对比例2
本对比例参照实施例1制备CD276 CAR-NK细胞，与实施例1的区别在于：本对比例所涉及的CAR序列中的单链抗体的氨基酸序列不同，具体为，将实施例1所涉及的CAR的单链抗体的氨基酸序列第12位氨基酸替换为脯氨酸，第141位氨基酸替换为谷氨酸。
对比例3
本对比例参照实施例1制备CD276 CAR-NK细胞，与实施例1的区别在于：本对比例所涉及的CAR序列中的单链抗体的氨基酸序列不同，具体为，将实施例1所涉及的CAR的单链抗体的氨基酸序列第221位氨基酸替换为赖氨酸，第42位氨基酸替换为甘氨酸，第118位氨基酸替换为异亮氨酸，第55位氨基酸替换为天冬氨酸，第138位氨基酸替换为甲硫氨酸。
测试例1检测含有CAR-CD276的慢病毒对NK92MI细胞的转染效率
本测试例的参试对象为实施例1～3和对比例1～3所制得的CD276 CAR-NK细胞，对其去病毒并取样，利用流式细胞仪进行检测，由于慢病毒经过GFP(绿色荧光蛋白)标记，因此进行流式检测时GFP阳性的细胞为转染成功的细胞，计算GFP阳性细胞与总细胞的比例，得到感染阳性率，即CD276 CAR-NK细胞的慢病毒转染效率。计算公式如下：CD276 CAR-NK细胞的慢病毒转染效率＝CD276 CAR-NK细胞/总细胞×100％。
表1 CD276 CAR-NK细胞的慢病毒转染效率
实施例1～3和对比例1～3所制得的CD276 CAR-NK细胞的慢病毒转染效率如表1所示。由表1可知，与对比例1～3相比，实施例1～3分别利用带有CAR1-CD276、CAR2-CD276、CAR3-CD276的慢病毒对NK92MI细胞进行转染，最终得到的转染效率更高，即得到的表达CAR1-CD276、CAR2-CD276、CAR3-CD276的CD276 CAR-NK细胞数量更多，这为CD276 CAR-NK细胞在肿瘤治疗方面的应用提供了更大的可能性。
测试例2检测CD276 CAR-NK细胞和NK92MI细胞对肿瘤细胞系的杀伤效果
本测试例的参试对象为实施例1～3和对比例1～3所制得的CD276 CAR-NK细胞以及NK92MI细胞，对肿瘤细胞系的杀伤效果进行检测，具体操作如下：
(1)洗板：吸掉板内液体，每个孔用高压灭菌水洗涤2次；再用NaOH溶液浸泡1～4小时，用高压灭菌水洗涤2次；最后用DPBS缓冲液润洗1次；
(2)铺板：分别将目标肿瘤细胞系(EC109、KY150、OVCAR-3、SKOV-3)消化、离心、重悬、台盼蓝染色计数，按照10万活细胞/孔的细胞密度接种于电流板中，并补加适量培养基，上机放入培养箱中进行监测，细胞生长曲线呈现平滑上升，且孔间差异不大，则视为细胞处于正常生长状态；
(3)在肿瘤细胞系生长曲线平缓期开端点，按照肿瘤细胞：NK细胞＝3：1的接种量分别向上述肿瘤细胞系中加入实施例1～3和对比例1～3得到的三种CD276 CAR-NK细胞和NK92MI细胞，上机(实时细胞分析仪)放入培养箱中对杀伤情况进行持续检测，结果如图4所示。
由图4可以看出，实施例1～3提供的CD276 CAR-NK细胞对EC109(人食管癌细胞)、KY150(人食管鳞癌细胞)、OVCAR-3(人卵巢癌细胞)、SKOV-3(人卵巢癌细胞)这四种肿瘤细胞均具有良好的杀伤作用，其杀伤效果显著高于未经任何改造的NK92MI细胞(阴性对照组)，并且，实施例1～3提供的CD276CAR-NK细胞对OVCAR-3和SKOV-3这两种人卵巢癌细胞的杀伤效果最好。另外，对比例1～3提供的CD276 CAR-NK细胞表达的CAR的单链抗体的氨基酸序列与实施例1不同，其对上述四种肿瘤细胞的杀伤比例显著低于实施例1。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种靶向CD276的嵌合抗原受体，其特征在于：
所述嵌合抗原受体包括依次串联的靶向CD276的单链抗体、铰链区、跨膜区结构域和胞内区结构域；
所述靶向CD276的单链抗体的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4中的其中一种。
2.一种表达基因，其特征在于：所述表达基因包含编码如权利要求1所述靶向CD276的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
3.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体含有如权利要求2所述表达基因。
4.如权利要求3所述表达载体，其特征在于：所述表达载体为含有所述表达基因的慢病毒。
5.一种靶向CD276的CAR-NK细胞，其特征在于：所述CAR-NK细胞表达如权利要求1所述靶向CD276的嵌合抗原受体。
6.如权利要求5所述靶向CD276的CAR-NK细胞，其特征在于：所述CAR-NK细胞由如权利要求3所述表达载体转染NK92MI细胞制备得到。
7.如权利要求5所述靶向CD276的CAR-NK细胞在制备用于治疗卵巢癌的药物中的应用。
8.一种用于治疗卵巢癌的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物含有如权利要求5所述靶向CD276的CAR-NK细胞。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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