CN116284443B - 一种可特异性识别Claudin18.2的嵌合抗原受体及应用其的CAR-NK细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种可特异性识别Claudin18.2的嵌合抗原受体及应用其的CAR‑NK细胞。该嵌合抗原受体包括依次串联的可特异性识别Claudin18.2的单链抗体、跨膜结构域和胞内结构域；可特异性识别Claudin18.2的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID：1所示。本发明提供的可特异性识别Claudin18.2的嵌合抗原受体能够有效激活免疫功能细胞并使免疫功能细胞高效地杀卵巢癌细胞和胃癌细胞。
Description
技术领域
本发明涉及细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种可特异性识别Claudin18.2的嵌合抗原受体及应用其的CAR-NK细胞。
背景技术
恶性肿瘤(如卵巢癌和胃癌等)一直是危害人类健康的主要重大疾病之一，在过去的几十年里，恶性肿瘤的发病率一直在不断地增加。卵巢癌是指生长在女性卵巢上的恶性肿瘤，在我国的发病率仅次于宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。2020中国卵巢癌的新发病例数已经超过5.5万例，其中有70％在发现的时候已经是晚期。由于晚期的卵巢癌的临床治疗效果并不理想，治疗后患者的5年生存率仅为39％～46％，年死亡例数高达3.7万例。胃癌则是我国最常见的恶性肿瘤之一，可发生于任何年龄，其发病率位居我国各类肿瘤的首位，严重威胁人民的身体健康。近年来，作为肿瘤的治疗策略之一的肿瘤免疫治疗在临床上取得重大的进展。
嵌合抗原受体(chemical antigen receptor，CAR)是可以识别特定蛋白(抗原)的细胞表面受体，当CAR结构与肿瘤相关抗原抗体融合表达在T细胞的细胞膜表面时，能够赋予T细胞特异性识别对应肿瘤细胞的能力，此时的T细胞为即为常说的CAR-T细胞。CAR-T细胞是通过在T细胞中转入能够靶向特定抗原的嵌合抗原受体得到的，当肿瘤细胞的表面含有该抗原时，通过这种方式得到的CAR-T细胞能够特异性识别并结合肿瘤细胞表面的抗原，对肿瘤细胞具有杀伤作用，进而清除肿瘤细胞以达到肿瘤治疗的目的。
目前，以嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T细胞)为代表的新一代免疫治疗技术和药物，在临床上取得了重大进展。虽然以CAR-T细胞在肿瘤的免疫治疗上取得了显著的疗效，但是同时也存在较大的副作用以及安全隐患，如细胞因子风暴、脱靶效应以及严重的过敏性反应等，这将严重限制CAR-T细胞在肿瘤的临床治疗中的应用。
与T细胞的杀伤模式相比，自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)的的杀伤模式对抗体亲和力要求更低，并且抗体选择范围更大，同时NK细胞的免疫原性以及对肿瘤的杀伤力均比T细胞高，因此，近年来已逐步考虑采用NK细胞作为CAR的载体细胞。
Claudin18.2(Claudin18亚型2)是位于细胞膜上的一个跨膜蛋白，其由CLDN18基因编码，属于Claudin蛋白家族。在正常情况下，Claudin18.2蛋白在正常组织中表达量极低，而在卵巢癌和胃癌等肿瘤组织中高度过表达，通常与卵巢癌患者、胃癌患者的不良预后和较差的临床治疗结果相关，是一种较为理想的肿瘤治疗靶点。
发明内容
本发明提供一种可特异性识别Claudin18.2的嵌合抗原受体及应用其的CAR-NK细胞，以有效激活免疫功能细胞并使免疫功能细胞高效地杀卵巢癌细胞和胃癌细胞。
根据本发明的第一个方面，提供一种可特异性识别Claudin18.2的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括依次串联的可特异性识别Claudin18.2的单链抗体、铰链区、跨膜结构域和胞内结构域；可特异性识别Claudin18.2的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID：1所示；可特异性识别Claudin18.2的单链抗体的氨基酸序列的第12、238、240位氨基酸独立地选自甘氨酸、丙氨酸中的其中一种；可特异性识别Claudin18.2的单链抗体的氨基酸序列的第36、45、51、109、114、142、168、173、194、205位氨基酸独立地选自赖氨酸、组氨酸、精氨酸中的其中一种；可特异性识别Claudin18.2的单链抗体的氨基酸序列的第29、91、131、149、215位氨基酸独立地选自赖氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸中的其中一种；可特异性识别Claudin18.2的单链抗体的氨基酸序列的第21、158、181、228位氨基酸独立地选自甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸中的其中一种；可特异性识别Claudin18.2的单链抗体的氨基酸序列的第61、66、76、87、135、176、202位氨基酸独立地选自天冬氨酸、谷氨酸中的其中一种。
经过不断的摸索试验，本发明筛选出含有如SEQ ID：1所示的氨基酸序列的单链抗体，能够特异性识别Claudin18.2，其中，SEQ ID：1中的第12、21、29、36、45、51、61、66、76、87、91、109、114、131、135、142、149、158、168、173、176、181、194、202、205、215、228、238、240位氨基酸均用X表示，第12、238、240位氨基酸可独立地选自甘氨酸或丙氨酸，第36、45、51、109、114、142、168、173、194、205位氨基酸可独立地选自赖氨酸或组氨酸或精氨酸，第29、91、131、149、215位氨基酸可独立地选自赖氨酸或甲硫氨酸或亮氨酸或缬氨酸，第21、158、181、228位氨基酸可独立地选自甲硫氨酸或异亮氨酸或亮氨酸，第61、66、76、87、135、176、202位氨基酸可独立地选自天冬氨酸或谷氨酸。
本发明提供的可特异性识别Claudin18.2的嵌合抗原受体的对卵巢癌细胞和胃癌细胞靶向性高，能够与卵巢癌、胃癌细胞的表面蛋白抗原Claudin18.2特异性结合，有效激活相关免疫细胞，并使免疫细胞高效杀伤卵巢癌细胞、胃癌细胞，将其应用到NK细胞中得到的CAR-NK细胞对卵巢癌细胞和胃癌细胞的杀伤效果显著高于NK细胞。
优选地，上述可特异性识别Claudin18.2的单链抗体的氨基酸序列选自SEQID：2、SEQ ID：3、SEQ ID：4中的其中一种。
根据本发明的第二个方面，提供一种核酸分子，该核酸分子包含编码上述可特异性识别Claudin18.2的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
根据本发明的第三个方面，提供一种载体，该载体含有上述核酸分子。
优选地，上述载体为含有上述核酸分子的慢病毒。
根据本发明的第四个方面，提供一种可特异性识别Claudin18.2的CAR-NK细胞，该CAR-NK细胞表达上述可特异性识别Claudin18.2的嵌合抗原受体。
本方案的CAR-NK细胞含有可特异性识别Claudin18.2的嵌合抗原受体，赋予CAR-NK细胞高肿瘤杀伤效果，可与肿瘤表面抗原蛋白Claudin18.2特异性结合，使得CAR-NK细胞能够对肿瘤细胞进行高效杀伤，其对肿瘤的杀伤效果显著高于NK细胞。并且，将该CAR-NK细胞用于肿瘤的临床治疗中，不会产生细胞因子风暴，且患者体内也不会产生严重的过敏性反应。
优选地，上述CAR-NK细胞由上述载体转染NK92MI细胞制备得到。
根据本发明的第五个方面，提供上述可特异性识别Claudin18.2的CAR-NK细胞在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
优选地，上述癌症包括卵巢癌、胃癌。
根据本发明的第六个方面，提供一种药物组合物，该药物组合物含有上述可特异性识别Claudin18.2的CAR-NK细胞。
优选地，上述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
本发明提供的CAR对Claudin18.2具有特异性，其在NK细胞中表达之后得到的CAR-NK细胞能够靶特异性识别Claudin18.2抗原，与卵巢癌细胞、胃癌细胞表面的Claudin18.2蛋白特异性结合，有效激活相关功能免疫细胞，从而实现对高表达Claudin18.2的卵巢癌患者和胃癌患者进行有效治疗。本发明提供的靶向Claudin18.2的CAR-NK细胞能够释放大量的肿瘤杀伤细胞因子，对高表达Claudin18.2的卵巢癌细胞和胃癌细胞的毒性大，可以高效杀伤Claudin18.2高表达的卵巢癌细胞和胃癌细胞。并且，本发明提供的CAR-NK细胞的转染效率高。
附图说明
图1为本发明实施例1对表达CAR1-Claudin18.2的CAR-NK细胞进行培养时的细胞生长状态图。
图2为本发明实施例2对表达CAR2-Claudin18.2的CAR-NK细胞进行培养时的细胞生长状态图。
图3为本发明实施例3对表达CAR2-Claudin18.2的CAR-NK细胞进行培养时的细胞生长状态图。
图4为本发明实施例1～3和对比例1～3制得的表达Claudin18.2 CAR-NK细胞与NK92MI细胞对不同肿瘤细胞系的杀伤效果对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明提供的技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例按照如下步骤制备Claudin18.2 CAR-NK细胞：
1.CAR的序列选择
本实施例提供的嵌合抗原受体(CAR)包括依次串联的可特异性识别Claudin18.2的单链抗体、CD8α铰链区、NKG2D跨膜区结构域以及包含2B4胞内区和CD3ζ胞内区的胞内区结构域。经过不断的摸索试验，本发明筛选出含有如SEQ ID：2所示的氨基酸序列的单链抗体的嵌合抗原受体(简称CAR1-Claudin18.2)。
2.CAR-NK细胞的制备
(1)取适量生长状态较好的NK92MI细胞悬液，于300g下离心5分钟，去上清，收集NK92MI细胞，并用第一培养基重悬NK92MI细胞，按MOI＝50加入带有上述CAR1-Claudin18.2的慢病毒，再加入葡聚糖溶液，补加入第一培养基至总体积为3mL，将12孔板置于37℃培养箱中预热10分钟；
(2)将恒温离心机调成1200g、37℃，10分钟离心预热至36℃，将上述预热后的12孔板转移至离心机中，于1200g、37℃下离心2h；
(3)离心结束后，补加1mL第二培养基后继续培养24～48h；之后，采用第三培养基扩大培养。
(4)当细胞传代至起始数10倍以上时，取细胞做流式检测阳性率，通过计算Claudin18.2 CAR-NK细胞(GFP阳性细胞)与总细胞的比值，得到Claudin18.2CAR-NK细胞感染的阳性率。将转染后的Claudin18.2 CAR-NK细胞进行流式分选，分选出GFP阳性的细胞群，即为阳性率较高的Claudin18.2 CAR-NK细胞。再将阳性率高的CAR-NK细胞继续培养扩增；
其中，第一细胞培养基为：含有0.5mM肌醇、0.5mM叶酸、0.05mM巯基乙醇、2vol％胎牛血清、2vol％马血清、2vol％双抗的MEM培养基；
第二细胞培养基为：含有1mM肌醇、0.5mM叶酸、0.1mM巯基乙醇、20vol％胎牛血清、30vol％马血清、1vol％双抗的MEM培养基；
第三细胞培养基为：含有2mM肌醇、0.1mM叶酸、0.005mM巯基乙醇、20vol％胎牛血清、5vol％马血清、0.5vol％双抗的MEM培养基。
步骤(4)中，在对Claudin18.2 CAR-NK细胞进行培养时，显微镜下对Claudin18.2CAR-NK细胞进行观察并拍照，Claudin18.2 CAR-NK细胞的生长状态如图1所示。
实施例2
本实施例按照如下步骤制备Claudin18.2 CAR-NK细胞：
1.CAR的序列选择
本实施例提供的嵌合抗原受体(CAR)包括依次串联的可特异性识别Claudin18.2的单链抗体、CD8α铰链区、NKG2D跨膜区结构域以及包含2B4胞内区和CD3ζ胞内区的胞内区结构域。经过不断的摸索试验，本发明筛选出含有如SEQ ID：3所示的氨基酸序列的单链抗体的嵌合抗原受体(简称CAR2-Claudin18.2)。
2.CAR-NK细胞的制备方法与实施例1相同。
在对Claudin18.2 CAR-NK细胞进行培养时，在显微镜下对Claudin18.2CAR-NK细胞进行观察并拍照，Claudin18.2 CAR-NK细胞的生长状态如图2所示。
实施例3
本实施例按照如下步骤制备Claudin18.2 CAR-NK细胞：
1.CAR的序列选择
本实施例提供的嵌合抗原受体(CAR)包括依次串联的可特异性识别Claudin18.2的单链抗体、CD8α铰链区、NKG2D跨膜区结构域以及包含2B4胞内区和CD3ζ胞内区的胞内区结构域。经过不断的摸索试验，本发明筛选出含有如SEQ ID：4所示的氨基酸序列的单链抗体的嵌合抗原受体(简称CAR3-Claudin18.2)。
2.CAR-NK细胞的制备方法与实施例1相同。
在对Claudin18.2 CAR-NK细胞进行培养时，在显微镜下对Claudin18.2CAR-NK细胞进行观察并拍照，Claudin18.2 CAR-NK细胞的生长状态如图3所示。
对比例1
本对比例参照实施例1制备Claudin18.2 CAR-NK细胞，与实施例1的区别在于：本对比例所涉及的CAR序列中的单链抗体的氨基酸序列不同，具体为，将实施例1所涉及的CAR的单链抗体的氨基酸序列第45位氨基酸替换为甘氨酸，第158位氨基酸替换为缬氨酸。
对比例2
本对比例参照实施例1制备Claudin18.2 CAR-NK细胞，与实施例1的区别在于：本对比例所涉及的CAR序列中的单链抗体的氨基酸序列不同，具体为，将实施例1所涉及的CAR的单链抗体的氨基酸序列第12位氨基酸替换为精氨酸，第91位氨基酸替换为天冬氨酸，第202位氨基酸替换为赖氨酸。
对比例3
本对比例参照实施例1制备Claudin18.2 CAR-NK细胞，与实施例1的区别在于：本对比例所涉及的CAR序列中的单链抗体的氨基酸序列不同，具体为，将实施例1所涉及的CAR的单链抗体的氨基酸序列第12位氨基酸替换为精氨酸，第45位氨基酸替换为甘氨酸，第91位氨基酸替换为天冬氨酸，第158位氨基酸序列替换为缬氨酸，第202位氨基酸替换为赖氨酸。
测试例1检测含有CAR-Claudin18.2的慢病毒对NK92MI细胞的转染效率
本测试例的参试对象为实施例1～3和对比例1～3所制得的Claudin18.2CAR-NK细胞，对其去病毒并取样，利用流式细胞仪进行检测，由于慢病毒经过GFP(绿色荧光蛋白)标记，因此进行流式检测时GFP阳性的细胞为转染成功的细胞，计算GFP阳性细胞与总细胞的比例，得到感染阳性率，即Claudin18.2CAR-NK细胞的慢病毒转染效率。计算公式如下：Claudin18.2 CAR-NK细胞的慢病毒转染效率＝Claudin18.2 CAR-NK细胞/总细胞×100％。
表1Claudin18.2 CAR-NK细胞的慢病毒转染效率
| 组别 | NK182细胞的慢病毒转染效率(％) |
| 实施例1 | 79.64 |
| 实施例2 | 78.16 |
| 实施例3 | 76.03 |
| 对比例1 | 59.27 |
| 对比例2 | 65.75 |
| 对比例3 | 60.92 |
实施例1～3和对比例1～3所制得的Claudin18.2 CAR-NK细胞的慢病毒转染效率如表1所示。由表1可知，与对比例1～3相比，实施例1～3分别利用带有CAR1-Claudin18.2、CAR2-Claudin18.2、CAR3-Claudin18.2的慢病毒对NK92MI细胞进行转染，最终得到的转染效率更高，即得到的表达CAR1-Claudin18.2、CAR2-Claudin18.2、CAR3-Claudin18.2的Claudin18.2 CAR-NK细胞数量更多，这为Claudin18.2 CAR-NK细胞在肿瘤治疗方面的应用提供了更大的可能性。。测试例2检测Claudin18.2 CAR-NK细胞和NK92MI细胞对肿瘤细胞系的杀伤效果
本测试例的参试对象为实施例1～3和对比例1～3所制得的Claudin18.2CAR-NK细胞以及NK92MI细胞，对肿瘤细胞系的杀伤效果进行检测，具体操作如下：
(1)洗板：吸掉板内液体，每个孔用高压灭菌水洗涤2次；再用NaOH溶液浸泡1～4小时，用高压灭菌水洗涤2次；最后用DPBS缓冲液润洗1次；
(2)铺板：分别将目标肿瘤细胞系(AGS-EBV、HO8910、SK-OV-3)消化、离心、重悬、台盼蓝染色计数，按照1～10万活细胞/孔的细胞密度接种于电流板中，并补加适量培养基，上机放入培养箱中进行监测，细胞生长曲线呈现平滑上升，且孔间差异不大，则视为细胞处于正常生长状态；
(3)以肿瘤细胞系生长曲线平缓期开端点，按照肿瘤细胞：NK细胞＝3：1的接种量分别向上述肿瘤细胞系中加入实施例1～3和对比例1～3得到的三种Claudin18.2 CAR-NK细胞和NK92MI细胞，上机(实时细胞分析仪)放入培养箱中对杀伤情况进行持续检测，结果如图4所示。
由图4可知，实施例1～3提供的Claudin18.2 CAR-NK细胞对AGS-EBV(人胃腺癌细胞)、HO8910(人卵巢癌细胞)、SK-OV-3(人卵巢腺癌细胞)均具有良好的杀伤作用，其杀伤效果显著高于未经任何改造的NK92MI细胞(阴性对照组)，并且实施例1～3提供的Claudin18.2 CAR-NK细胞对卵巢癌细胞HO8910的杀伤效果最好。另外，对比例1～3提供的Claudin18.2 CAR-NK细胞表达的CAR的单链抗体的氨基酸序列与实施例1不同，其对上述三种肿瘤细胞的杀伤比例均显著低于实施例1。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种可特异性识别Claudin18.2的嵌合抗原受体，其特征在于：
所述嵌合抗原受体包括依次串联的可特异性识别Claudin18.2的单链抗体、铰链区、跨膜结构域和胞内结构域；
所述可特异性识别Claudin18.2的单链抗体的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4中的其中一种。
2.一种核酸分子，其特征在于：所述核酸分子包含编码如权利要求1所述可特异性识别Claudin18.2的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
3.一种载体，其特征在于：所述载体含有如权利要求2所述核酸分子。
4.如权利要求3所述载体，其特征在于：所述载体为含有所述核酸分子的慢病毒。
5.一种可特异性识别Claudin18.2的CAR-NK细胞，其特征在于：所述CAR-NK细胞表达如权利要求1所述可特异性识别Claudin18.2的嵌合抗原受体。
6.如权利要求5所述可特异性识别Claudin18.2的CAR-NK细胞，其特征在于：所述CAR-NK细胞由如权利要求3所述载体转染NK92MI细胞制备得到。
7.如权利要求5所述可特异性识别Claudin18.2的CAR-NK细胞在制备用于治疗卵巢癌、胃癌的药物中的应用。
8.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物含有如权利要求5所述可特异性识别Claudin18.2的CAR-NK细胞。
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| CN113416260A (zh) * | 2021-04-14 | 2021-09-21 | 南京凯地医疗技术有限公司 | 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用 |
| CN113896801A (zh) * | 2021-10-08 | 2022-01-07 | 南京凯地医疗技术有限公司 | 靶向人Claudin18.2和NKG2DL的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Future of targeted therapy for gastrointestinal cancer:Claudin 18.2;Qian Niu等;《Oncology and Translational Medicine》;第7卷(第3期);102-107 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116284443A (zh) | 2023-06-23 |
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