CN112500484A

CN112500484A - 一种抗trop2抗体及其应用

Info

Publication number: CN112500484A
Application number: CN202110122765.2A
Authority: CN
Inventors: 肖彦羚; 陈才伟; 张亚飞; 戴平; 汪乃杰; 姜威
Original assignee: Meijie Transformation Medical Research Suzhou Co ltd
Current assignee: Meijie Transformation Medical Research Suzhou Co ltd
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2041-01-29
Also published as: CN112500484B

Abstract

本发明提供了一种抗TROP2抗体及其应用，所述抗TROP2抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID No.1所示的重链CDR1、SEQ ID No.2所示的重链CDR2和SEQ ID No.3所示的重链CDR3；所述轻链可变区包括SEQ ID No.4所示的轻链CDR1、SEQ ID No.5所示的轻链CDR2和SEQ ID No.6所示的轻链CDR3。本发明还提供了所述TROP2抗体的制备方法。本发明所述抗TROP2抗体能够用于酶联免疫吸附、免疫组织化学、免疫荧光、免疫印迹和流式细胞术检测装置的制备中，具有极好的特异性和抗原亲和力，应用前景十分广阔。

Description

一种抗TROP2抗体及其应用

技术领域

本发明属于免疫化学技术领域，尤其涉及一种抗TROP2抗体及其应用。

背景技术

肿瘤相关钙信号转导子2（Tumor-associated calcium signal transducer 2，TROP2）属于肿瘤相关钙信号转导子家族，由染色体1P32区域的TACSTD2基因编码表达，是一种I型跨膜蛋白。

在正常情况下TROP2主要表达在上皮细胞，并在胚胎发育过程中发挥作用。正常机体TROP2的表达不高，而肿瘤组织中表现为过表达。TROP2在各种人类上皮癌中均呈高表达，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌、头颈癌和卵巢癌等。研究表明，TROP2主要通过调节钙离子信号通路、细胞周期蛋白表达及降低纤黏蛋白黏附作用促进肿瘤细胞的生长、增殖和转移。TROP2也可以与Wnt信号级联中的β-连环蛋白相互作用，从而对癌基因的转录、细胞的增殖起促进作用。

有研究表明，伊立替康活性产物SN-38与人源抗TROP2抗体hRS7偶联的药物IMMU-132具有极佳的抗肿瘤效果，hRS7能将SN-38靶向定位到高表达TROP2的肿瘤细胞，使SN-38发挥断裂DNA的作用杀死肿瘤细胞。该药物的二期临床实验观察了69例转移性三阴性乳腺癌病人在接受IMMU-132治疗后的数据，其中达到部分缓解、完全缓解及稳定的患者肿瘤组织的TROP2呈现高表达，且TROP2高表达的患者生存率显著高于低表达患者。因此，检测TROP2表达情况能有效的指导IMMU-132等药物的使用。通过高灵敏的检测方法检测TROP2的表达水平对于提高癌症患者的生存率、延长生存期、避免过度化疗和提高生存质量有着重大意义。

因此，特异性好、灵敏度高的抗TROP2抗体具有极高的应用价值。CN102448492A公开了一种抗TROP2的单克隆抗体，该抗TROP2抗体由保藏号为PD08019、PD08020或PD08021中的任意一种杂交瘤细胞产生，制备得到的抗体对TROP2蛋白具有极好的亲和力，并且可以识别TROP2蛋白分子的不同区域，但鼠杂交瘤细胞的筛选极为复杂，工作量极大，因此限制了相应的应用。

目前，市面上同时兼具高特异性和高灵敏度的抗TROP2抗体极少，且制备方法较为复杂，能够用于免疫荧光检测和流式细胞术检测的抗体则更少。如何提供一种抗TROP2抗体及其制备方法，可以制备出特异性强、灵敏度高、应用范围广的抗TROP2的单克隆抗体，已成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种抗TROP2抗体及其应用，本发明所述抗TROP2抗体具有极好的特异性，与市售产品相比，对TROP2蛋白具有更高的亲和力，可应用于免疫组织化学检测、免疫荧光检测、流式细胞术检测和免疫印迹检测等相关试剂盒的制备中。

为达此目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种抗TROP2抗体，所述抗TROP2抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID No.1所示的重链CDR1、SEQ ID No.2所示的重链CDR2和SEQ ID No.3所示的重链CDR3；

所述轻链可变区包括SEQ ID No.4所示的轻链CDR1、SEQ ID No.5所示的轻链CDR2和SEQ ID No.6所示的轻链CDR3。

SEQ ID No.1：GIDLSSDA；

SEQ ID No.2：IHPAGVT；

SEQ ID No.3：GRYFGYASIDI；

SEQ ID No.4：QNVYDKNQ；

SEQ ID No.5：KAS；

SEQ ID No.6：AGVYTGNIY。

本发明中，CDR为互补决定区（complementarity-determining regions），位于抗体的可变区，可以与抗原决定簇结构互补结合。CDR均为环状结构，重链CDR与轻链CDR相互配合，共同形成能与抗原的三维结构互补的表面。抗体CDR的氨基酸序列决定了抗体的特异性和亲和性，本发明所述的具备上述CDR序列的抗体具有与TROP2蛋白特异性结合的能力，特异性好，灵敏度高，亲和力强。

优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

SEQ ID No.7：

METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSDAIFWVRQAPGEGLKYIGFIHPAGVTYYAAWARGRFTISRTSTTVDLKMTRLTTEDTATYFCGRYFGYASIDIWGPGTLVTVSS。

SEQ ID No.8：

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPSSTSAAVGGTVTINCQSSQNVYDKNQLSWFQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVECDDAATYYCAGVYTGNIYTFGGGTEVVVKG。

优选地，所述抗TROP2抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区。

优选地，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。

优选地，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。

SEQ ID No.9：

GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK。

SEQ ID No.10：

DPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC。

优选地，所述抗TROP2抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。

优选地，所述抗TROP2抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。

SEQ ID No.11：

METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSDAIFWVRQAPGEGLKYIGFIHPAGVTYYAAWARGRFTISRTSTTVDLKMTRLTTEDTATYFCGRYFGYASIDIWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK。

SEQ ID No.12：

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPSSTSAAVGGTVTINCQSSQNVYDKNQLSWFQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVECDDAATYYCAGVYTGNIYTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC。

第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括第一方面所述的抗TROP2抗体的编码基因。

第三方面，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒含有第二方面所述的核酸分子。

本发明中，通过将含有编码特异性抗体的序列的重组质粒导入细胞内，分泌相应的特异性抗体。传统方法制备的兔血清抗体均为多克隆抗体，纯度较差，容易产生假阳性，应用受到了限制；本发明制备的抗TROP2抗体为单克隆抗体，特异性好，应用广泛，灵敏度高，可应用于酶联免疫吸附、免疫组织化学、免疫荧光、免疫印迹和流式细胞术等相关的检测试剂盒中。

第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的抗TROP2抗体的制备方法，所述抗TROP2抗体的制备方法包括：

构建第三方面所述的重组质粒，将所述重组质粒导入细胞中，收集细胞培养上清，纯化，得到所述抗TROP2抗体。

本发明中，通过收集细胞的培养上清进行纯化即可获得纯度极高的单克隆抗体，与传统的抗体血清的制备相比，抗体的纯度更高，应用更广，特异性更好，成本也更低。

第五方面，本发明提供了一种TROP2检测试剂盒，所述TROP2检测试剂盒包括第一方面所述的抗TROP2抗体。

本发明中，制备得到的抗TROP2抗体均为单克隆抗体，特异性好，灵敏度高，亲和力强，可以满足免疫组化、免疫荧光和流式细胞术等相关检测对抗体的要求，还可以独立或与辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、生物素（Biotin）、异硫氰酸荧光素（FITC）、Cy3、Cy5和PE等连接，对样本进行检测，具有极其广阔的应用前景；抗体的制备方法简单，耗时较短，生产成本较低，为相关试剂盒的推广与使用创造了条件。

优选地，所述TROP2检测试剂盒还包括检测试剂。

优选地，所述检测试剂包括酶联免疫吸附（Enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）检测试剂、免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）检测试剂、免疫荧光检测试剂、免疫印迹（Western blot，WB）检测试剂或流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测试剂中的任意一种。

第六方面，本发明提供了第一方面所述的抗TROP2抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组质粒或第五方面所述的TROP2检测试剂盒中的任意一种或至少两种的组合在制备TROP2检测装置中的应用。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明所述抗TROP2抗体能够在相关检测中，特异性识别样本中的TROP2蛋白表达，且较市面上已有的商品化抗体，具有更好的特异性和灵敏度；

（2）本发明所述抗TROP2抗体具有极高的灵敏度和极好的特异性，与目前已有的市售产品相比，与抗原的亲和力更强，可以与TROP2蛋白特异性结合，并且可以与标记基团结合，可以应用于免疫吸附、免疫组织化学、免疫荧光、免疫印迹和流式细胞术等相关的检测试剂盒中，应用范围更广；

（3）本发明通过获取特异性抗体基因序列，并构建重组质粒，将重组质粒导入细胞内，收集细胞的培养产物，纯化后即可得到高纯度的抗TROP2单克隆抗体，与制备血清抗体及筛选杂交瘤细胞相比耗时更短，操作更为简单，成本更低，具有批量生产的潜能，为产品的推广与使用创造了条件。

附图说明

图1为本发明实施例1中KLH-多肽和裸肽的ELISA验证的结果图片；

图2为本发明实施例2中通过间接ELISA法筛选抗TROP2单克隆抗体的结果图片；

图3为本发明实施例3中纯化后的MJ1-1抗体的SDS-PAGE结果图片，图中，泳道1为BSA，泳道M为蛋白Marker，泳道2为纯化后的MJ1-1抗体；

图4为本发明实施例4中纯化后的MJ1-1抗体、EPR20043、SP293、SP294和SP295的ELISA实验的结果图片；

图5为本发明实施例5中纯化后的MJ1-1抗体、EPR20043、SP293、SP294和SP295对人体扁桃体组织、乳腺癌组织及正常结肠组织样本的IHC实验的结果图片（比例尺=200 μm）；

图6为本发明实施例6中纯化后的MJ1-1抗体对结直肠癌细胞系HCT116、前列腺癌细胞系PC-3、乳腺癌细胞系MCF-7和乳腺癌细胞系MDA-MB-231的WB实验的结果图片，图中，泳道M为蛋白marker；泳道1为阴性对照；泳道2为人结直肠癌细胞系HCT116细胞裂解液；泳道3为前列腺癌细胞系PC-3细胞裂解液；泳道4为乳腺癌细胞系MCF-7细胞裂解液；泳道5为乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞裂解液；

图7A为本发明实施例7中NCI-H441的MJ1-1抗体的FCM实验的结果图片；图7B为本发明实施例7中NCI-H441的SP293的FCM实验的结果图片；图7C为本发明实施例7中NCI-H441的EPR20043的FCM实验的结果图片；图7D为本发明实施例7中NCI-H441的同型对照的FCM实验的结果图片；

图8A为本发明实施例7中A549的MJ1-1抗体的FCM实验的结果图片；图8B为本发明实施例7中A549的SP293的FCM实验的结果图片；图8C为本发明实施例7中A549的EPR20043的FCM实验的结果图片；图8D为本发明实施例7中A549的同型对照的FCM实验的结果图片。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

材料：

抗体EPR20043购自Abcam，货号为ab214488；抗体SP293购自Abcam，货号为ab227689；抗体SP294购自Abcam，货号为ab227690；抗体SP295购自Abcam，货号为ab227691；

外周血淋巴细胞分选试剂盒购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，货号为LTS10965；

cDNA获取试剂盒购自Clontech，货号为634888；

PCR酶购自Invitrogen，货号12344040；

人体扁桃体组织、正常结肠组织及乳腺癌组织样本均来源于迈杰转化医学研究有限公司的组织样本库，是经过福尔马林固定、石蜡包埋的人体组织样本，均进行了病理证实，并有患者知情同意书；

全自动免疫组化染色机购自莱卡，货号为国械备20140277；

脱蜡液货号为国械备20140293；

免疫组化抗原修复缓冲液货号为国械备20150328；

DAB显色液货号为国械备20150558；

PE-驴抗兔IgG二抗购自biolegend，货号为406421；

Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeablization细胞流式检测试剂盒购自BD，货号为554714。

实施例1

本实施例合成人TROP2蛋白的C端多肽，并进行验证，具体步骤如下：

合成人TROP2蛋白（P09758）的Arg299-Leu323区域，氨基酸序列如SEQ ID No.13所示：

SEQ ID No.13：RRKSGKYKKVEIKELGELRKEPSL。

将合成多肽的N端与KLH偶联（KLH-多肽），作为免疫原，未与KLH偶联的裸肽用于抗体的检测。

采用间接免疫吸附验证合成的多肽的生物学功能，用100 µL浓度为2.5 µg/mL的裸肽及浓度为5 µg/mL的KLH-多肽包被ELISA板，加入100 µL浓度为1 µg/mL的EPR20043抗体，以抗体稀释液作为阴性对照，每孔再加入100 µL按1:5000稀释后的HRP-山羊抗兔IgG二抗，最后测定其在450 nm处的OD值。结果如图1所示。

由图可知，KLH-多肽和裸肽都可以与特异性抗体EPR20043结合，使吸光度增加，且裸肽与抗体的结合能力要好于KLH-多肽，这表明抗原多肽制备成功，可以用于后续的免疫及相关的检测中。

实施例2

本实施例制备抗TROP2单克隆抗体，具体步骤如下：

（1）免疫：

通过背部多点皮下注射，使用KLH-多肽免疫年龄为3个月、体重达到1.5 kg的新西兰大白兔（免疫前从耳缘静脉采集200 µL血清作为阴性对照）。首次免疫剂量为每只兔注射KLH-多肽500 µg，将抗原用生理盐水稀释至500 µL，与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后注射。每14 d背部皮下注射1次以加强免疫，剂量为每只兔注射KLH-多肽250 µg，将抗原用生理盐水稀释至500 µL，与等体积的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后注射。第3次加强免疫后7 d，从耳缘静脉取血，以裸肽作为抗原包被ELISA板，间接ELISA检测血清抗体效价，符合要求的兔使用无菌一次性EDTA抗凝采血管，股动脉采血20 mL。

（2）分选特异性B淋巴细胞

参照外周血淋巴细胞分选试剂盒中的操作步骤，分离兔外周血中的淋巴细胞，用培养基重悬后接种于10 cm培养皿中，在37℃下孵育2 h，收集上清中的悬浮细胞，在室温下，1000 rpm离心5 min，弃上清，用新鲜培养基重悬；

使用PBS溶液将裸肽稀释至5 μg/mL，加入新的10 cm培养皿中，在4℃下包被10 h，随后去除液体，用PBS溶液清洗3次；

将重悬后的细胞接种于包被后的培养皿中，在37℃下孵育2 h，去除上清，使用胰酶消化贴壁的细胞，收集细胞并进行重悬，随后在室温下，1000 rpm离心5 min，弃上清，得到特异性B淋巴细胞。

（3）制备兔抗人TROP2单克隆抗体：

参照试剂盒说明书上的方法，获取兔特异性B淋巴细胞的cDNA；

以所得cDNA作为模板，使用SEQ ID No.14~15扩增抗TROP2抗体的重链可变区，使用SEQ ID No.16~17扩增抗TROP2抗体的轻链可变区。

SEQ ID No.14：AAGCTTGCCACCATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTC；

SEQ ID No.15：CCATTGGTGAGGGTGCCCGAG；

SEQ ID No.16：AAGCTTGCCACCATGGACAYGAGGGCCCCCACTC；

SEQ ID No.17：CAGAGTRCTGCTGAGGTTGTAGGTAC。

对PCR产物进行TA克隆，测序后，将获得的碱基序列翻译成氨基酸序列，分析，获得包括恒定区在内的重链和轻链全长。

将编码重链的序列与编码轻链的序列分别构建到表达载体上，瞬时共转染至细胞内，通过间接ELISA法检测特异性抗体的表达，筛选结果如图2所示。

由图可知，共筛选出了16株阳性抗体，均可以与抗原特异性结合，使吸光度增大。挑选出灵敏度和特异性最好的1株，为MJ1-1，即本发明所述的抗TROP2抗体，用于后续实验。

实施例3

本实施例对实施例2中筛选到的MJ1-1单克隆抗体进行纯化，具体步骤如下：

将含有MJ1-1抗体的重链和轻链编码序列的表达载体瞬时共转染至293F细胞中，培养120 h后收集细胞培养物，使用抗体亲和介质和AKTA层析系统纯化培养上清中的单克隆抗体。使用SDS-PAGE验证抗体的纯度，结果如图3所述。

由图可以看出，纯化后的MJ1-1抗体的SDS-PAGE的条带的大小与预期相符，表明抗体纯化成功，抗体纯度在95%以上，可以用于后续的实验中。

实施例4

本实施例使用实施例3中纯化后的MJ1-1单克隆抗体进行ELISA实验，具体步骤如下：

用100 µL含有浓度为2.5 µg/mL的人TROP2蛋白的HCT116细胞裂解液对ELISA板进行包被，再分别加入100 µL纯化后的MJ1-1抗体、EPR20043、SP293、SP294和SP295，浓度均为1 µg/mL，以抗体稀释液作为阴性对照。再向每孔中加入100 µL按1:5000稀释后的HRP-山羊抗兔IgG二抗，最后测定其在450nm处的OD值。结果如图4所示。

由图可知，纯化后的抗体MJ1-1可以特异性识别并结合TROP2蛋白，可以用于ELISA相关的试剂盒中。与商品化的EPR20043、SP293、SP294和SP295抗体相比，MJ1-1组的OD值更高，说明抗体的特异性更好，灵敏度更高。

实施例5

本实施例使用实施例3中纯化后的MJ1-1单克隆抗体进行免疫组织化学实验，具体步骤如下：

取石蜡包埋的人体扁桃体组织、正常结肠组织及乳腺癌组织样本，其中，人体扁桃体组织和乳腺癌组织为阳性对照，正常结肠组织为阴性对照；样本经烤片后，在全自动免疫组化染色机上完成，具体程序如表1所示。

表1

结果如图5所示。由图可知，不同抗体的扁桃体组织和乳腺癌组织的染色结果均呈TROP2阳性，而正常结肠组织的染色结果均呈TROP2阴性，结果与预期相符，且图片背景干净，无染色，说明抗体的特异性均很好。将不同抗体的染色结果进行比较，可以看出MJ1-1的染色更深，说明MJ1-1的灵敏度更高。由此可知，MJ1-1可以用于IHC相关的试剂盒中，能够特异性检测样本中TROP2的表达，背景干净，且相较于商品化抗体，其灵敏度更高，更能满足不同TROP2表达水平的检测需求，应用价值更高。

实施例6

本实施例使用实施例3中纯化后的MJ1-1单克隆抗体进行免疫印迹实验，具体步骤如下：

取结直肠癌细胞系HCT116、前列腺癌细胞系PC-3、乳腺癌细胞系MCF-7和乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞裂解液（含蛋白10 µg）作为样本，配置12% SDS-PAGE蛋白胶并进行电泳；电泳结束后，将胶在1×转移液中浸泡10 min，PVDF膜用甲醇活化后，在100 V电压下转膜60 min；将膜置于含5%脱脂奶粉的PBST封闭液中，在37℃下封闭1 h；随后加入浓度为2 µg/mL的纯化后MJ1-1单克隆抗体，在室温下孵育60 min；加入10 mL按1:5000稀释后的HRP-山羊抗兔IgG二抗，室温孵育60 min；随后使用ChemiDoc™ MP成像系统曝光，结果如图6所示。

由图可知，HCT116、PC-3、MCF-7和MDA-MB-231的WB结果均显示为阳性，而阴性对照为阴性，这表明所述MJ1-1单克隆抗体可用于WB相关的试剂盒中，检测样本中TROP2蛋白的表达，检测的准确性和特异性均较好。

实施例7

本实施例使用实施例3中纯化后的MJ1-1单克隆抗体进行流式细胞术实验，具体步骤如下：

收集人肺腺癌细胞系NCI-H441、人非小细胞肺癌细胞系A549的细胞各1×10⁶个，用PBS清洗2次，参考Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeablization细胞流式检测试剂盒的说明书，对细胞进行固定和透膜。分别加入纯化的MJ1-1抗体、EPR20043和SP293各100µL，在室温下避光孵育30 min，以兔IgG作为同型对照进行相同的操作。加入100 µL按1:50稀释的PE-驴抗兔IgG二抗，在室温下避光孵育30 min。清洗后，用500 µL PBS溶液重悬细胞，用BD FACSCantoII流式细胞仪进行检测，收集细胞数目为20000个。NCI-H441的MJ1-1抗体、SP293、EPR20043和同型对照的检测结果如图7A、图7B、图7C和图7D所示，平均荧光强度（Mean fluorescence intensity，MFI）结果如表2所示；A549的MJ1-1抗体、SP293、EPR20043和同型对照的检测结果如图8A、图8B、图8C和图8D所示，平均荧光强度结果如表3所示。

表2

表3

由图可知，MJ1-1可以检测出NCI-H441和A549中TROP2的表达，且检测结果与已有的商品化抗体的检测结果一致，特异性较好，说明本发明的抗TROP2抗体MJ1-1可以用于FCM相关的试剂盒中；由表2和表3可知，MJ1-1对NCI-H441和A549的检测结果的MFI最高，说明MJ1-1抗体对TROP2蛋白的亲和力更强，达到相同的荧光强度时所需的最低抗体量较少，可以节约实验成本。

综上所述，本发明提供了一种抗TROP2抗体，与已有的市售产品相比，灵敏度更高，特异性更好，与抗原的结合能力更强，可应用于免疫吸附、免疫组织化学、免疫荧光、免疫印迹和流式细胞术等相关的检测试剂盒中，具有广阔的应用前景；所述抗TROP2抗体的制备方法简单易行，耗时较短，技术成熟，为产品的批量化生产创造了条件。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 迈杰转化医学研究（苏州）有限公司

<120> 一种抗TROP2抗体及其应用

<130> 2021

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Ile Asp Leu Ser Ser Asp Ala

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ile His Pro Ala Gly Val Thr

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Arg Tyr Phe Gly Tyr Ala Ser Ile Asp Ile

1 5 10

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gln Asn Val Tyr Asp Lys Asn Gln

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Lys Ala Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ala Gly Val Tyr Thr Gly Asn Ile Tyr

1 5

<210> 7

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro

20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser

35 40 45

Ser Asp Ala Ile Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Lys

50 55 60

Tyr Ile Gly Phe Ile His Pro Ala Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Ala Trp

65 70 75 80

Ala Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu

85 90 95

Lys Met Thr Arg Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly

100 105 110

Arg Tyr Phe Gly Tyr Ala Ser Ile Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu

115 120 125

Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 8

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser

20 25 30

Thr Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser

35 40 45

Gln Asn Val Tyr Asp Lys Asn Gln Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ala Gly Val Tyr Thr Gly Asn Ile Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu

115 120 125

Val Val Val Lys Gly

130

<210> 9

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn

35 40 45

Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys

65 70 75 80

Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala

85 90 95

Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly

100 105 110

Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

115 120 125

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

130 135 140

Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val

145 150 155 160

Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile

165 170 175

Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly

180 185 190

Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

195 200 205

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val

210 215 220

Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser

225 230 235 240

Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu

245 250 255

Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val

275 280 285

Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met

290 295 300

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser

305 310 315 320

Pro Gly Lys

<210> 10

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln

1 5 10 15

Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe

20 25 30

Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr

35 40 45

Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr

50 55 60

Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His

65 70 75 80

Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln

85 90 95

Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys

100

<210> 11

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro

20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser

35 40 45

Ser Asp Ala Ile Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Lys

50 55 60

Tyr Ile Gly Phe Ile His Pro Ala Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Ala Trp

65 70 75 80

Ala Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu

85 90 95

Lys Met Thr Arg Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly

100 105 110

Arg Tyr Phe Gly Tyr Ala Ser Ile Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu

115 120 125

Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu

130 135 140

Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys

145 150 155 160

Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser

165 170 175

Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser

180 185 190

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser

195 200 205

Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val

210 215 220

Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro

225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro

245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

260 265 270

Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile

275 280 285

Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln

290 295 300

Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln

305 310 315 320

Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala

325 330 335

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro

340 345 350

Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser

355 360 365

Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser

370 375 380

Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr

385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr

405 410 415

Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe

420 425 430

Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

435 440 445

Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 12

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser

20 25 30

Thr Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser

35 40 45

Gln Asn Val Tyr Asp Lys Asn Gln Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ala Gly Val Tyr Thr Gly Asn Ile Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu

115 120 125

Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val

145 150 155 160

Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly

165 170 175

Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser

180 185 190

Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr

195 200 205

Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr

210 215 220

Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys

225 230 235

<210> 13

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Arg Arg Lys Ser Gly Lys Tyr Lys Lys Val Glu Ile Lys Glu Leu Gly

1 5 10 15

Glu Leu Arg Lys Glu Pro Ser Leu

20

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aagcttgcca ccatggagac tgggctgcgc tggcttc 37

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccattggtga gggtgcccga g 21

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aagcttgcca ccatggacay gagggccccc actc 34

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cagagtrctg ctgaggttgt aggtac 26

Claims

1.一种抗TROP2抗体，其特征在于，所述抗TROP2抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID No.1所示的重链CDR1、SEQ ID No.2所示的重链CDR2和SEQ IDNo.3所示的重链CDR3；

2.根据权利要求1所述的抗TROP2抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

3.根据权利要求1所述的抗TROP2抗体，其特征在于，所述抗TROP2抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区；

所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示；

所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。

4. 根据权利要求1~3任一项所述的抗TROP2抗体，其特征在于，所述抗TROP2抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示；

所述抗TROP2抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括权利要求1~4任一项所述的抗TROP2抗体的编码基因。

6.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求5所述的核酸分子。

7.一种权利要求1~4任一项所述的抗TROP2抗体的制备方法，其特征在于，所述抗TROP2抗体的制备方法包括：

构建权利要求6所述的重组质粒，将所述重组质粒导入细胞中，收集细胞培养上清，纯化，得到所述抗TROP2抗体。

8.一种TROP2检测试剂盒，其特征在于，所述TROP2检测试剂盒包括权利要求1~4任一项所述的抗TROP2抗体；

所述TROP2检测试剂盒还包括检测试剂。

9.根据权利要求8所述的TROP2检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括酶联免疫吸附检测试剂、免疫组织化学检测试剂、免疫荧光检测试剂、免疫印迹检测试剂或流式细胞术检测试剂中的任意一种。

10.权利要求1~4任一项所述的抗TROP2抗体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的重组质粒或权利要求8或9所述的TROP2检测试剂盒中的任意一种或至少两种的组合在制备TROP2检测装置中的应用。