CN116789835A - 抗Trop2蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗Trop2蛋白的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及抗Trop2蛋白的单克隆抗体及其应用。所述抗Trop2蛋白的单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3‑5所示，所述重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8‑10所示。本发明提供的抗Trop2蛋白的单克隆抗体具有与Trop2蛋白特异性结合的能力，可以特异性识别人Trop2蛋白、小鼠Trop2蛋白以及大鼠Prp1蛋白以及表达相应蛋白的细胞和组织，具有较强的通用性和良好的特异性，用于免疫学诊断和检测领域时，与Trop2蛋白亲和力强，检测灵敏度高。

Description

抗Trop2蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及抗Trop2蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
人滋养层细胞表面糖蛋白抗原2(Trop2)，属于TACSTD家族，是由1号染色体短臂的1p32.1区域发现的TACSTD2基因编码表达的I型细胞表面糖蛋白，又名肿瘤相关钙离子信号转导子2(TACSTD2)、表皮糖蛋白1(EGP-1)、胃肠肿瘤相关抗原(GA733-1)、膜组分染色体1表面标记1(M1S1)等。Trop2蛋白的一级结构是一个36kDa的多肽，由323个氨基酸组成，通过N端糖基化进行翻译后修饰，二级结构属于跨膜蛋白，N-端为胞外域(Trop2EC)，该胞外域通过一个单向跨膜螺旋(TM)与由2个6氨基酸残基构成的疏水性多肽的胞内短尾(Trop2IC)连接，从而固定于细胞膜。Trop2蛋白在正常情况下表达有限，主要表达于上皮细胞并在胚胎器官发育过程中起重要作用，与上皮黏附分子EPCAM有较高的结构序列相似性。在许多肿瘤细胞中，Trop2基因表达上调，且Trop2蛋白在多种恶性肿瘤中过表达，该基因是一种与恶性肿瘤发生、侵袭和转移有关的癌基因。最新研究发现，Trop2在调节肿瘤细胞的自我更新、增殖和转化中起着至关重要的作用，它主要通过调节钙离子信号通路、细胞周期蛋白表达及降低纤黏蛋白黏附作用促进肿瘤细胞生长、增殖和转移；其也可以与Wnt信号级联中的β-连环蛋白相互作用，因而对细胞核癌基因的转录、细胞的增殖起作用。一些Trop2的信号转导类型Trop蛋白直接激活MAPK信号通路以及下游的AP-1、并下调p27蛋白的表达，从而增加细胞增殖能力。
定量评价Trop2基因或蛋白在实体瘤中的临床病理意义，在不同种类的实质瘤病患体内，此蛋白的过表达通常预示肿瘤的预后不良。有研究表明，Trop2基因过表达与较差的总生存期和较短的无病生存期显著相关，与人类实体瘤的低生存率相关，这揭示了Trop2蛋白可能是一种有价值的预测肿瘤预后的生物标志物和潜在的治疗靶点。另外，肿瘤的发展程度与Trop2的表达水平相关，可作为临床检测肿瘤恶性程度的标志物。因此，检测Trop2表达情况能有效的指导临床肿瘤治疗，对于提高肿瘤患者的生存率、延长生存期、避免过度化疗和提高生存质量有着重大意义。因此，开发特异性好、灵敏度高的抗Trop2抗体用于实现Trop2蛋白的检测具有极高的应用价值。目前，市面上高特异性的抗Trop2抗体较少，能够应用免疫学检测的抗体则更少。开发特异性强、具备良好的Trop2抗原结合能力的抗体，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中抗Trop2抗体特异性差、难以应用于免疫学检测的问题，本发明提供了一种抗Trop2蛋白的单克隆抗体及其应用。
为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种抗Trop2蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3-5所示，所述重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8-10所示。
进一步地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
进一步地，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
更进一步地，所述轻链为κ链，所述重链为IgG型。
进一步地，制备所述抗Trop2蛋白的单克隆抗体的免疫原为人Trop2蛋白第27位至274位氨基酸片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。
本发明第二方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸用于编码如上所述的抗Trop2蛋白的单克隆抗体。
进一步地，所述抗Trop2蛋白的单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO：12所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
本发明第三方面提供了一种表达载体，所述表达载体用于表达如上所述的多核苷酸。
本发明第四方面提供了如上所述的抗Trop2蛋白的单克隆抗体在检测Trop2蛋白中的应用。
进一步地，所述应用包括在酶联免疫吸附、免疫组织化学、免疫荧光、免疫印迹和流式细胞术中应用。
本发明第五方面提供了一种Trop2蛋白的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如上所述的抗Trop2蛋白的单克隆抗体。
进一步地，所述检测试剂盒还包括检测试剂，所述检测试剂包括酶联免疫吸附检测试剂、免疫组织化学检测试剂、免疫荧光检测试剂、免疫印迹检测试剂或流式细胞术检测试剂中的任意一种。
本发明的优点及积极效果为：
本发明提供的上述互补决定区序列的抗Trop2蛋白的单克隆抗体具有与Trop2蛋白包括天然Trop2蛋白和重组Trop2蛋白特异性结合的能力，可以特异性识别人Trop2蛋白、小鼠Trop2蛋白以及大鼠Prp1蛋白以及表达相应蛋白的细胞和组织，具有较强的通用性和良好的特异性，用于免疫学诊断和检测领域时，与Trop2蛋白亲和力强，检测灵敏度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例人Trop2蛋白与小鼠Trop2蛋白和大鼠Prp1蛋白的序列比对结果图；
图2为本发明实施例1的含兔单克隆抗体IH8重链的表达载体图谱；
图3为本发明实施例1的含兔单克隆抗体IH8轻链的表达载体图谱；
图4为本发明实施例2通过免疫印迹法测定兔单克隆抗体IH8与人Trop2蛋白的结合情况；
图5为本发明实施例2通过免疫印迹法测定兔单克隆抗体IH8与小鼠Trop2蛋白和大鼠Prp1蛋白的结合情况；
图6为本发明实施例3通过免疫荧光法测定兔单克隆抗体IH8与人Trop2蛋白的结合的亚细胞定位；
图7为本发明实施例4利用兔单克隆抗体IH8通过免疫组织化学法检测肺鳞癌组织样本中Trop2蛋白表达情况；
图8为本发明实施例4利用兔单克隆抗体IH8通过免疫组织化学法检测人胎盘组织样本中Trop2蛋白表达情况；
图9为本发明实施例4利用兔单克隆抗体IH8通过免疫组织化学法检测人扁桃体组织样本中Trop2蛋白表达情况。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明利用人源的人滋养层细胞表面糖蛋白抗原2(Trop2)完整胞外区片段免疫新西兰大白兔，筛选得到能够与Trop2特异性结合的单克隆抗体，该单克隆抗体具有高特异性和高亲和力，可以特异性识别Trop2蛋白及表达Trop2蛋白的细胞和组织，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。在此基础上完成了本发明。
在本发明的上下文中，术语“与Trop2蛋白特异性结合的单克隆抗体”、“抗Trop2蛋白的单克隆抗体”、“兔单克隆抗体”可互换使用，均指特异性结合Trop2蛋白(包括人Trop2)的单克隆抗体。“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。
术语“抗体”是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。典型的抗体分子由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成，轻链可分为两种，分别为kappa(κ)链和lambda(λ)链。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原结合位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(framework region，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过框架区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。框架区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。
术语“单克隆抗体”是指同质抗体群，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原或表位。“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为限制抗体的来源或制备方式。在一些实施例中，单克隆抗体通过杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法制备得到。
本发明实施例提供了一种抗Trop2蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链和所述重链均包括互补决定区(CDR)，为描述方便，所述轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，所述重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示；其中，LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
抗体互补决定区(CDR)的氨基酸序列决定了抗体的特异性和亲和性，本发明所述的具备上述CDR序列的单克隆抗体具有与Trop2蛋白包括天然Trop2蛋白和重组Trop2蛋白特异性结合的能力，可以特异性识别人Trop2蛋白、小鼠Trop2蛋白以及大鼠Prp1蛋白(由TACSTD2基因编码)以及表达相应蛋白的细胞和组织，具有较强的通用性，经免疫印迹、免疫荧光和免疫组织化学方法实验证实其特异性好，灵敏度高，亲和力强，适用于进行免疫学诊断和检测领域。
可选地，所述轻链和所述重链均包括框架区(FR)，所述框架区和所述互补决定区构成可变区，其中，轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
可选地，所述轻链和所述重链均包括恒定区，所述恒定区和所述可变区构成轻链或重链全长，抗体的恒定区通常通过公开查询即可获得，如：通过IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得重链恒定区，搜寻兔源IgG Kappa Creign获得轻链恒定区。
示例性地，包含所述恒定区的所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链为κ链；包含所述恒定区的所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，重链为IgG型。
可选地，所述抗Trop2蛋白的单克隆抗体的免疫原为人Trop2蛋白第27位至274位氨基酸片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。本发明选用人Trop2蛋白N末端的第27位(含)至第274位(含)氨基酸片段(全长共248个氨基酸)作为抗原或免疫原，为描述方便，以下简称人Trop2蛋白(27-274AA)，该蛋白片段为人Trop2蛋白的完整胞外区片段，具有人Trop2蛋白的功能，将其作为免疫原，可在免疫动物体内产生种类更丰富的抗体，并且抗体表位也更多。而且，人Trop2蛋白(27-274AA)与小鼠Trop2蛋白的序列相似度为82.11％，与大鼠该蛋白(Prp1蛋白)的序列相似度为81.71％(序列比对结果见图1)，可制备得到特异性识别和结合人Trop2蛋白、大鼠Prp1蛋白或小鼠Trop2蛋白的通用性抗体，该抗体不仅可用于人Trop2蛋白的相关研究，还可以用于大鼠和小鼠相关Trop2蛋白的研究。
为了获得更接近于天然蛋白状态的人Trop2蛋白，所述免疫原通过哺乳细胞表达系统产生，表达得到的重组蛋白包括人Trop2蛋白(27-274AA)。为便于纯化，所述重组蛋白还可以带有不影响其免疫原性的纯化标签，如组氨酸标签(6×His)。采用哺乳细胞表达系统获得大量纯化的免疫原，哺乳细胞表达系统有合适的翻译后修饰过程，得到的重组蛋白更接近天然蛋白状态，由其免疫获得的抗体能更好识别天然状态下的Trop2蛋白。
本发明另一实施例提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸用于编码如上所述的抗Trop2蛋白的单克隆抗体。
示例性地，所述抗Trop2蛋白的单克隆抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：12-13所示。
本发明再一实施例提供了一种表达载体，所述表达载体用于表达如上所述的多核苷酸。
通过将含有编码本发明单克隆抗体的多核苷酸序列的表达载体导入宿主细胞内，即可获得相应的特异性抗体。需要说明的是，在一些实施方式中，编码如本发明所述的抗Trop2蛋白的单克隆抗体的重链与轻链的多核苷酸可以克隆至一个表达载体中，每段核苷酸序连接到合适的启动子下游。如，编码重链与轻链的每段核苷酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核苷酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。在另一些实施方式中，编码如本发明所述的抗Trop2蛋白的单克隆抗体的重链与轻链的多核苷酸也可以别构建到两个载体上，这两个载体组成表达载体，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。前述的表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型，此为本领域的公知技术，在此不再详细介绍。
基于本发明提供的抗Trop2蛋白的单克隆抗体与Trop2蛋白良好的特异性和高的亲和力，本发明实施例还提供了如上所述的抗Trop2蛋白的单克隆抗体或如上所述的多核苷酸或如上所述的表达载体在检测Trop2蛋白中的应用，尤其是应用于酶联免疫吸附、免疫组织化学、免疫荧光、免疫印迹和流式细胞术等检测试剂盒中。
本发明制备得到的抗Trop2蛋白的抗体为单克隆抗体，特异性好，亲和力强，可以满足免疫学诊断和检测如酶联免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)、免疫荧光(Immunofluorescence，IF)、免疫印迹(Western blot，WB)和流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)等相关诊断和检测对抗体的要求，具有检测灵敏度高等优势。
本发明又一实施例提供了一种Trop2蛋白的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如上所述的抗Trop2蛋白的单克隆抗体。
所述检测试剂盒的优势与如上所述的抗Trop2蛋白的单克隆抗体或如上所述的多核苷酸或如上所述的表达载体在检测Trop2蛋白中的应用相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
在较佳的实施方式中，所述检测试剂盒还包括检测试剂，所述检测试剂包括酶联免疫吸附检测试剂、免疫组织化学检测试剂、免疫荧光检测试剂、免疫印迹检测试剂或流式细胞术检测试剂中的任意一种。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1抗Trop2蛋白的单克隆抗体制备
本实施例以哺乳细胞表达系统表达得到的人Trop2蛋白(27-274AA)(见SEQ IDNO：11)作为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，获得抗Trop2蛋白的兔单克隆抗体，包括重链和轻链，具有高特异性和高亲和力。
1、动物免疫
用来制备兔单克隆抗体的免疫原来自293F细胞表达的重组蛋白，该重组蛋白包括人Trop2蛋白(27-274AA)和组氨酸标签(6×His)，经镍柱亲和纯化，得到浓度为1.47mg/mL、纯度95％的可溶重组蛋白。以此重组蛋白为免疫原，分别免疫6只新西兰大白兔；每只大白兔免疫300μg，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后每间隔2周取150μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，用ELISA方法测定其针对人Trop2蛋白的滴度，并将最后一次免疫后血清纯化成抗体，采用免疫印迹(WB)方法和免疫组织化学(IHC)方法(TMA000-24-H Genaral组织芯片，购自百奥斯)检测内源样本(内源样本指细胞裂解液和组织芯片)和血清样本，确定抗体特异性，取血清滴度高且内源检测最好的兔子，用300μg免疫原皮下多点注射加强免疫一次，三天后牺牲动物，取脾脏。
2、分离和培养脾脏中B淋巴细胞
分离和培养脾脏中B淋巴细胞的方法参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A)”。
3、编码兔单克隆抗体基因的克隆
将培养后的B淋巴细胞上清用人Trop2重组蛋白包被的ELISA来鉴定阳性克隆，筛选标准为OD值大于0.7。之后将OD值大于0.7的单个B淋巴细胞培养增殖的阳性克隆的细胞收集裂解后用Quick-RNATMMicroPrep试剂盒(购自ZYMO公司)提取RNA，反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，PCR反应体系包括：4μLcDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL 2×GloriaHiFi(购自武汉爱博泰克生物科技有限公司)和6.5μL H2O。PCR扩增程序包括：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。其中，正向引物和反向引物的核苷酸序列如下所示：
轻链VH扩增引物对为：
正向引物：5’-tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac-3’(见SEQ ID NO：14)；
反向引物：5’-cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag-3’(见SEQ ID NO：15)。
重链VH扩增引物对为：
正向引物：5’-tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg-3’(见SEQ ID NO：16)；
反向引物：5’-gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg-3’(见SEQ ID NO：17)。
将扩增得到的cDNA进行测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成，得到如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区(VL)氨基酸序列和如SEQ ID NO：7所示的重链可变区(VH)氨基酸序列；之后查询IMGT在线数据库(www.imgt.org)获得恒定区的序列，得到如SEQ IDNO：1所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO：6所示的重链氨基酸序列，由此得到抗Trop2蛋白的单克隆抗体，命名为IH8。IH8涉及的具体序列见表1。
表1兔单克隆抗体IH8涉及的序列
4、兔单克隆抗体IH8的生产和纯化
为了获得多株识别人Trop2蛋白的兔单克隆抗体，将兔单克隆抗体的重链、轻链基因分别装载在表达载体pBR332上，表达载体的图谱分别见图2-3，将2个表达载体共转染293F细胞，转染后培养72-96h，获得的培养上清中含有识别人Trop2蛋白的抗体。使用protein A亲和凝胶树脂从培养上清中纯化出重组的识别人Trop2蛋白的兔单克隆抗体IH8，抗体验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。
实施例2免疫印迹法测定单克隆抗体IH8的特异性
细胞培养：在48孔细胞培养板中，传代培养高表达Trop2蛋白的MCF7细胞和A-431细胞以及不表达Trop2蛋白的U-118MG细胞，当汇合度处于70-80％时，吸出培养液上清，使用PBS溶液小心清洗细胞两次，备用。
免疫印迹实验：取高表达Trop2蛋白的MCF7细胞和A-431细胞以及不表达Trop2蛋白的U-118MG细胞裂解液样本，用免疫印迹的方法检测兔单克隆抗体IH8的识别特异性。具体操作如下：进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，按常规方法在电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上，将膜置于含3％脱脂奶粉的TBST封闭液中室温孵育1h，加入纯化后的兔单克隆抗体IH8(1：1000稀释)，4℃孵育过夜，之后用TBST洗膜后，加入1：10000稀释的羊抗兔二抗(Alexa594AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L))，室温孵育1h，再次用TBST洗膜，加入ECL显色液，显影，结果见图4。
进一步地，取表达Trop2蛋白的小鼠睾丸(Mouse testis)和肾脏组织(Mousekidney)裂解液样本以及表达Prp1蛋白的大鼠肾脏组织(Rat kidney)裂解液样本采用上述方法进行免疫印迹实验，结果见图5。
由图4-5可知，本发明的兔单克隆抗体IH8不仅能够识别并结合人Trop2蛋白，还能够识别小鼠睾丸和肾脏组织裂解液中的Trop2蛋白，同时识别大鼠肾脏组织裂解液中的Prp1蛋白(TACSTD2基因编码)，具有优良的特异性和较强的通用性。
实施例3免疫荧光法测定单克隆抗体IH8识别Trop2蛋白的亚细胞定位
细胞培养：在48孔细胞培养板中，传代培养MCF7细胞，当汇合度处于70-80％时，吸出培养液上清，使用PBS溶液小心清洗细胞两次，以备免疫荧光实验使用。
免疫荧光实验：向已清洗两次后的MCF7细胞培养孔加入5％山羊血清(TBS配制)300μL完全覆盖细胞进行封闭处理，细胞培养板密封好，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min。之后一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加1：200倍稀释的兔单克隆抗体IH8溶液，样本需完全覆盖，将孔板密封好，置于4℃孵育过夜。之后二抗孵育：在样本上滴加采用TBS缓冲液配制的与一抗种属对应的荧光二抗工作液(Alexa594AffiniPure GoatAnti-Rabbit IgG(H+L))，二抗稀释比1：200，至完全覆盖细胞，避光、37℃孵育1h。最后染核后进行镜检：滴加DAPI工作液(使用dH2O配制，DAPI溶液：dH2O体积比1：500)，避光、室温孵育10min；去除DAPI工作液，用TBST缓冲液洗涤1次，每次5min；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5min；加入抗荧光衰减封片剂，进行镜检，结果见图6，其中上图表示经单克隆抗体IH8检测出的Trop2蛋白在MCF7细胞中的定位信号(红色)，下图表示经DAPI染色(蓝色)和单克隆抗体IH8在MCF7细胞中的信号(红色)的共定位展示。
DAPI染细胞核为蓝色，Alexa594AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)显出来的阳性细胞为红色，由图6可知，细胞膜红色更亮；经查询UniProt公开信息，Trop2蛋白定位于细胞膜，实际检测与理论相符合，这说明了本发明的兔单克隆抗体IH8可用于免疫荧光检测Trop2蛋白。
实施例4免疫组织化学法进行组织芯片染色和鉴定
1、芯片选择
人Trop2蛋白在胎盘、胰腺、鼻黏膜上皮、肝脏、肾脏、肺等组织中有表达，且在胎盘和胰腺癌细胞器中高表达。本实施例使用TMA000-24-H Genaral组织芯片(购自百奥斯，货号：TMA000-24-H Genaral)进行免疫组织化学实验。芯片含扁桃体、结肠、卵巢、肝、结外NK/T细胞淋巴瘤、结肠浸润性腺癌、子宫内膜样癌、肝细胞癌、前列腺癌、高级别尿路上皮癌、卵巢浆性癌、肝胆管癌、恶性胶质瘤、乳腺、宫颈、肺、脑(神经元)、乳腺浸润性导管癌、宫颈鳞状细胞癌、肺鳞癌、人小细胞肺癌、胎盘、子宫内膜间质肉瘤和肺腺癌。
2、免疫组织化学法(IHC)染色及分析
IHC实验的操作参见TMA000-24-H Genaral组织芯片说明书，具体包括如下步骤：
样本准备和烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入56℃的恒温箱中烤片30min；同时将脱蜡液1缸一起放入56℃的恒温箱中；脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中，再一起从恒温箱中取出置于常温，5min后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，脱蜡液试剂缸每缸5min，无水乙醇试剂缸每缸3min；用流水清洗切片3min；前述的脱蜡液1-3购自无锡市江原实业技贸有限公司；
抗原修复：0.01M柠檬酸钠修复液(pH6.0)高压热修复；
内源性过氧化物酶灭活：用PBS缓冲液浸洗3次，每次1min，去除切片上的缓冲液；将切片完全浸入到3％过氧化氢溶液中，室温孵育10min；
封闭：用PBS缓冲液浸洗3次，每次3min，去除切片上的缓冲液；用免疫组化水笔圈定玻片上待检测组织区域，在圈定区域内滴加封闭液—PBS封闭液，将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于常温孵育30min，从滴加PBS封闭液开始计时；
一抗孵育：去除封闭液，在组织切片上滴加用抗体稀释液—PBS工作液稀释的一抗(为兔单克隆抗体IH8，一抗稀释比1：8100)，水平放置于孵育湿盒中，常温孵育60min；去除一抗工作液，PBS缓冲液快速漂洗1次，之后用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次；
二抗孵育：在组织切片上滴加即用型二抗工作液(Dako REAL EnVisionDetection System,Peroxidase/DAB,Rabbit/Mouse,HRP(品牌：Dako，货号：K5007))后水平放置于孵育湿盒中，常温孵育25min；去除切片上的二抗工作液，PBS缓冲液快速漂洗1次，之后用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次；
显色：在组织切片上滴加显色液工作液，显微镜下观察颜色变化情况，得到合适的染色强度后，将切片浸入大量蒸馏水中终止显色，终止显色后，将切片置入流水中清洗10min；
复染：将稍沥干的组织切片浸入Mayer’s苏木素复染1min，之后用流水清洗3min；
返蓝：将稍沥干的组织切片浸入碳酸锂饱和水溶液中蓝化3s，之后用流水清洗3min；
脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，浸泡期间需上下提拉数次，计时10s后取出；置于恒温鼓风干燥箱中高温(54-58℃)下完全干燥；
封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片，加胶量需适量，加封盖玻片后需完全覆盖组织，且不能有胶溢出；
最后进行切片扫描。
免疫组化染色结果分为：阳性(在特定组织和细胞中有棕褐色着色)和阴性(在特定组织和细胞中无棕褐色着色)，阳性结果必须在细胞和组织特定的抗原部位显色且背景低，即理论上应该显示棕褐色的细胞或组织着色程度中等、理论不应该着色的细胞和组织没有着色才能视为阳性，如人胎盘为滋养层细胞细胞膜中Trop2蛋白高表达，人扁桃体为鳞状上皮细胞细胞膜中Trop2蛋白高表达，人肺鳞癌肿瘤细胞细胞膜中Trop2蛋白高表达，应当着色，淋巴细胞无表达、不着色。
扫描结果显示，阳性对照样本中，14/15例阳性，具体为：1/1例人肺、1/1例人宫颈、1/1例人乳腺、1/1例人扁桃体、1/1例人肝细胞癌、1/1例人肺鳞癌、0/1例人结肠浸润性腺癌、1/1例人子宫内膜样癌、1/1例人宫颈鳞状细胞癌、1/1例人乳腺浸润性导管癌、1/1例人结外NK/T细胞淋巴瘤、1/1例人高级别尿路上皮癌、1/1例人胎盘、1/1例人前列腺癌、1/1例人小细胞肺癌细胞膜阳性(部分阳性结果展示见图7-9)，由此本发明的兔单克隆抗体IH8的灵敏度为14/15＝93.33％。阴性对照样本中，7/9例阴性，具体为：1/1例人肝、1/1例人卵巢、1/1例人结肠、1/1例人恶性胶质瘤、1/1例人脑(神经元)、0/1例人肝胆管癌、0/1例人肺腺癌、1/1例人卵巢浆液性癌、1/1例人子宫内膜间质肉瘤阴性，由此本发明的兔单克隆抗体IH8的特异度为7/9＝77.78％。总的来说，兔单克隆抗体IH8即抗Trop2蛋白的单克隆抗体免疫组织可满足部分病理样本的高准确性和高精度检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗Trop2蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3-5所示；
所述重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8-10所示。
2.根据权利要求1所述的抗Trop2蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
3.根据权利要求2所述的抗Trop2蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述轻链为κ链；
所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述重链为IgG型。
4.根据权利要求1所述的抗Trop2蛋白的单克隆抗体，其特征在于，制备所述抗Trop2蛋白的单克隆抗体的免疫原为人Trop2蛋白第27位至274位氨基酸片段，其氨基酸序列如SEQID NO：11所示。
5.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸用于编码如权利要求1-4任一项所述的抗Trop2蛋白的单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述抗Trop2蛋白的单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体用于表达如权利要求5-6任一项所述的多核苷酸。
8.如权利要求1-4任一项所述的抗Trop2蛋白的单克隆抗体在检测Trop2蛋白中的应用，其特征在于，所述应用包括在酶联免疫吸附、免疫组织化学、免疫荧光、免疫印迹和流式细胞术中应用。
9.一种Trop2蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求1-4任一项所述的抗Trop2蛋白的单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的Trop2蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括检测试剂，所述检测试剂包括酶联免疫吸附检测试剂、免疫组织化学检测试剂、免疫荧光检测试剂、免疫印迹检测试剂或流式细胞术检测试剂中的任意一种。
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