TW202336037A - 抗體分子及軛合物 - Google Patents

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Abstract

本揭露關於結合上皮生長因子受體（EGFR）和/或c-Met的抗體分子和含有該等抗體分子之軛合物。該等抗體分子和軛合物可應用於例如癌症之治療。

Description

抗體分子及軛合物
本揭露關於結合上皮生長因子受體（EGFR）和/或c-Met的抗體分子和含有該等抗體分子之軛合物。該等抗體分子和軛合物可應用於例如癌症之治療。
克服耐藥性係靶向癌症療法面臨的主要挑戰。有多種針對EGFR和c-MET的藥物已獲批准或正在臨床開發中，但原發性耐藥性（de novo resistance）和獲得性耐藥性（acquired resistance）限制了它們的長期功效（Ou, 2016；Boccaccio, 2014；Karamouzis, 2009；Corso, 2010；Chong, 2013；Bertotti, 2015；Benedettini, 2010；Bean, 2007；Bardelli, 2013；Bachleitner-Hofmann, 2008）。耐藥機制包括二級突變、致癌下游傳訊模組諸如KRAS的活化、配體上調和替代生長因子受體的擴增。例如，MET擴增或蛋白質過表現已被充分確定為EGFR抑制劑臨床耐藥的重要機制。同樣地，新出現的證據表明EGFR途徑活化可以賦予對c-MET靶向抑制劑的耐藥性（Engelman, 2007；Bertotti, 2015；Benedettini, 2010；Bean, 2007；Bardelli, 2013）。抗體藥物軛合物（ADC）係一類日益發展的靶向療法，其被設計為選擇性地將細胞毒性藥物直接遞送至腫瘤細胞（Angevin, 2017；Junutula, 2016；Lambert, 2017；Nasiri, 2018；Sau, 2017；Phillips, 2016）。在這種情況下，抗體靶向的抗原主要用作遞送細胞毒性藥物的手柄，並且殺傷機制通常不同於靶標的生物學。因此，ADC可能在很大程度上避免由於活化替代受體或下游傳訊途徑而產生的耐藥性，前提是存在靶標。然而，由於靶標在正常細胞上的接合而導致的不良事件會限制ADC的治療指數（Hinrichs, 2015；Donaghy, 2016；Sau, 2017）。雙特異性抗體技術可以藉由接合腫瘤細胞上的兩個不同靶標以在兩個靶標都存在時有效遞送細胞毒性有效負載來賦予ADC另外的特異性（Comer, 2018；Andreev, 2017；Kontermann, 2015；Lü, 2017；Brinkmann, 2017；Fan, 2015；Mazor, 2017）。然而，與正常非靶細胞相比，簡單地靶向兩種抗原不能保證對腫瘤細胞提高的選擇性，其中多種因素會影響給定雙特異性抗體的性質（Mazor, 2017；Mazor, 2015）。因此，需要開發雙特異性ADC，其在保護正常組織的同時提高對腫瘤細胞的靶向性。這樣的ADC將可能由於途徑改變而克服對靶向治療的抗性，同時藉由利用雙特異性抗體提供的選擇性靶向來維持治療窗。
上皮生長因子受體（EGFR、HER1、Erbb1）係人上皮生長因子受體（Human Epidermal Growth Factor Receptor，HER）酪胺酸激酶家族的基礎成員，該家族還包括HER2/Erbb2、HER3/Erbb3和HER4/Erbb4（Arteaga, 2014；Rocha-Lima, 2007；Seshacharyulu, 2012；Vecchione, 2011；Nicholson, 2001）。在生物製劑和小分子酪胺酸激酶抑制劑（TKI）類別中，針對EGFR的許多療法已獲批准（Troiani, 2016；Chong, 2013；Chan, 2017；Remon, 2018；Dokala, 2016）。儘管取得了該等成功，但基於EGFR在許多癌症類型中的廣泛表現譜，該等療法實現的臨床益處仍不及預期。有幾個因素導致了觀察到的臨床局限性，涉及主要歸因於傳訊途徑改變的固有和獲得性抗性機制（Chong, 2013）。例如，在結腸直腸癌（CRC）中，EGFR在65%-75%或更多的患者中過表現，然而當在未選擇的患者群體中作為單一療法投與時，抗EGFR抗體諸如西妥昔單抗和帕尼單抗的客觀反應率僅在約10%之範圍內（Cunningham, 2004；Saltz, 2004）。該等抗體僅對腫瘤表現野生型KRAS的患者（約50%-55%的患者）有效，其定義了可治療的患者群體（Jimeno, 2009；Knickelbein, 2015）。此外，由於另外的抗性機制，只有大約一半的符合條件的患者對治療有反應，並且最終均以失敗告終。用EGFR靶向劑治療患者通常會出現中度至重度皮膚毒性，發生在65%-90%的患者中（Lacouture, 2006）。該等皮膚毒性的嚴重程度可為3至4級（NCI-CTCAE標準），並且可能導致劑量調整或治療中斷。因此，儘管它在多種腫瘤類型中高度表現，但EGFR代表ADC方法的一個挑戰性靶標，這可能會加劇該等觀察到的毒性。與現有療法相比，開發可以有效靶向表現EGFR的腫瘤而不引起不可接受的EGFR相關毒性的ADC將可能治療更廣泛的EGFR陽性患者群體。
c-MET係原癌基因MET的基因產物，該原癌基因在染色體7上編碼。c-MET蛋白係主要在上皮細胞表面表現的受體酪胺酸激酶，其僅識別一種已知配體，即肝細胞生長因子（HGF），也稱為分散因子（Giordano, 1989；Prat, 1991）。c-MET/HGF訊息軸在調節許多正常過程中的增殖、分化、運動和形態發生方面具有重要作用，該等過程包括傷口癒合、組織再生和發育期間的器官發生（Organ, 2011）。已經報導了多種人類癌症的c-MET途徑的異常表現和失調，包括非小細胞肺癌、結腸直腸癌、胃腸癌、頭頸癌、胰臟癌、腎癌和肝細胞癌等（Organ, 2011；Birchmeier, 2003；Mo, 2017；Sierra, 2011；Trusolino, 2010；Peters, 2012；Vsiansky, 2018）。對於該等癌症適應症中的許多適應症，c-MET過表現與預後和存活呈負相關（Yan, 2015；Kim, 2017a；Kim, 2017b；Kim, 2017c；Li, 2011；Kondo, 2013；Miyamoto, 2011；Liu, 2015；Miyamoto, 2011；Xu, 2016；Sacco, 2015；Gisterek, 2011；Belalcazar, 2012；Guo, 2014；Cappuzzo, 2009）。此外，在一些癌症類型中，c-MET與癌症幹細胞表型相關，這涉及對EGFR靶向療法的抗性（Li, 2011；Boccaccio, 2014；Luraghi, 2014；Jun, 2013；De Bacco, 2012）。越來越多的文獻證明EGFR與c-MET傳訊途徑之間存在串擾和直接相互作用，並且該串擾在臨床中在功能上轉化為對EGFR和c-MET靶向療法的抗性（McDermott, 2010；Moores, 2016；Suda, 2010；Zucali, 2008；Liska, 2011；Huang, 2014；Boccaccio, 2014；Madoz-Gúrpide, 2016；Sohn, 2014；Rho, 2009；Puri, 2008；Peters, 2012；Karamouzis, 2009；Jun, 2013；Haura, 2013；Guo, 2008；Gou, 2016；Engelman, 2007；Cecchi, 2012；Bardelli, 2013）。基於c-MET在許多腫瘤類型中作為獨立的陰性預後指標的作用及其作為對EGFR抑制劑的抗性機制的暗示的充分證據，已經進行了許多努力來開發作為癌症治療劑的c-MET抑制劑。然而，儘管c-MET在多種腫瘤類型中高頻率表現，但有效的c-MET抑制劑的開發在臨床中遇到了巨大的挑戰和挫折（Zhang, 2015；Wu, 2017；Ariyawutyakorn, 2016；Marano, 2015；Garber, 2014）。例如，儘管克唑替尼（crizotinib）（c-MET和ALK的雙重抑制劑）已被批准用於治療非小細胞肺癌，但其他c-MET靶向藥物，諸如單臂c-MET抗體MetMAb（歐那土珠單抗（onartuzumab））和小分子抑制劑替萬替尼（tivantinib），由於缺乏療效而在晚期III期臨床試驗中失敗（Mo, 2017；Zhang, 2015；Wu, 2017；公司新聞稿）。對於寬c-MET表現譜與c-MET抑制劑的有限臨床反應之間的差異，似乎合理的假設係，該等腫瘤中僅有一部分係由c-MET途徑驅動的，因此，許多表現c-MET的腫瘤對阻斷c-MET傳訊活性的抑制劑不敏感。有幾種c-MET抑制劑正在進行臨床開發，並且該等項目中的一些正在尋求採用生物標誌物驅動的策略來確定腫瘤依賴於c-MET的患者比例（Choueiri, 2017；Zhang, 2016；Bouattour, 2018）。迄今為止的臨床經驗表明，與EGFR抑制劑一樣，新的c-MET訊息阻斷抑制劑的成功開發將僅使患有c-MET表現性腫瘤的患者總數的一部分受益。開發有效的c-MET定向ADC可以克服訊息阻斷c-MET抑制劑的一些局限性。
抗體藥物軛合物（ADC）的概念很簡單，目的係藉由使用抗體的精細特異性產生具有寬治療窗的藥物，以將細胞毒性彈頭精確遞送至癌細胞，而對正常組織造成的損傷極小（Comer, 2018；Nasiri, 2018；Sau, 2017；de Goeij, 2016；Bouchard, 2014；Junutula, 2016；Lambert, 2017）。儘管這個概念很簡單，但是實現ADC特性的理想組合已被證明具有挑戰性，如迄今為止批准的ADC數量有限所反映的（Tolcher, 2016）。近年來見證了一個不斷發展的領域，臨床階段ADC目前有70多種候選藥物正在開發中。儘管迄今為止取得了成功，並且新ADC在未來幾年有望覆蓋患者，但是仍然存在許多挑戰，並且存在很大的改進空間。最終，開發ADC的關鍵挑戰係平衡其功效和安全性。目前，有一種EGFR指導的ADC，即迪妥昔珠單抗莫福汀（depatuxizumab mafodotin，ABT-414），其處於由艾伯維公司（AbbVie）進行的神經膠母細胞瘤的III期臨床開發中（Phillips, 2016）。ABT-414之前在II期試驗中針對多種其他實性瘤適應症進行了測試（ClinicalTrials.gov: NCT01741727）。ADC在該等適應症中在耐受劑量下顯示出功效有限，並且在所治療的患者中經常觀察到令人擔憂的眼部毒性（Tolcher, 2014）。第二代EGFR ADC即ABBV-221處於臨床開發階段，但由於安全性問題而中斷（Phillips, 2018；Calvo, 2017；公司介紹）。目前，有一種c-MET靶向ADC即特立妥珠單抗瑞他汀（Telisotuzumab Vedotin，ABBV-399），其作為單一療法和與EGFR抑制劑埃羅替尼組合，進入腫瘤表現高水平c-MET的非小細胞肺癌（NSCLC）患者的II期臨床開發（Angevin, 2017；Wang, 2017）。在I期試驗中，c-MET ADC + EGFR TKI組合在該所選患者群體中顯示出臨床活性，周圍神經病變和皮疹係最常見的治療相關不良事件（Angevin, 2017；Calvo, 2017）。雙特異性抗體的性質允許微調每個靶標之間的相互作用以影響分子的總體性質，這可以產生具有可接受的治療窗的ADC（Comer, 2018）。這一概念已經在體外針對EGFR和c-MET進行了測試，但研究人員尚未展示與上述EGFR和c-MET ADC相比安全性或有效性有所提高的體內概念驗證（Sellmann, 2016）。因此，利用雙特異性抗體策略來開發展示出有效性和可接受的安全性特徵的EGFR-cMET ADC將是有益的。
根據以上考慮設計了本揭露。
本揭露提供了與先前技術中揭露的抗體分子相比具有所需生物物理和/或功能性質的組合的抗體分子和軛合物。
本揭露之方面涉及能夠結合EGFR和c-Met兩者之抗體分子。EGFR和c-Met在許多癌症類型中共表現，並且靶向這兩種分子的抗體分子（「雙特異性抗體分子」）提供了跨多種適應症的廣泛臨床益處的機會。與先前技術的單特異性EGFR或c-Met抗體相比，該抗體分子代表對癌症之改善的治療，因為本文所述之雙特異性抗體分子能夠同時結合兩種靶標，因此與正常組織相比，對共表現EGFR和c-MET的腫瘤的選擇性增加。
因此，在一個方面，本揭露提供了一種抗體分子，該抗體分子包含： 結合上皮生長因子受體（EGFR）之第一抗原結合結構域；以及 結合c-Met之第二抗原結合結構域， 其中該第一抗原結合結構域包含： (i) 包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： 具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列之HCDR1 具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列之HCDR2 具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列之HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 (ii) 包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： 具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列之LCDR1 具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列之LCDR2 具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列之LCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
具體地，含有該抗體分子的軛合物能夠選擇性地將藥物（也稱為「有效負載」或「彈頭」）遞送至共表現該等靶標的腫瘤並以高度效力治療該等腫瘤。該等實例證明，包含替代彈頭（例如微管溶素或拓撲異構酶I抑制劑）的不同軛合物在體外細胞毒性測定和體內癌症治療模型中均顯示出強大的細胞毒性活性。
因此，在另一方面，本揭露提供了一種包含與藥物軛合的本文所述之抗體分子的軛合物。在一些實例中，藥物係拓撲異構酶I抑制劑，例如具有式A*的拓撲異構酶抑制劑 。
在一些實例中，抗體分子與具有下式的拓撲異構酶I抑制劑軛合： （SG3932）。
在一些實例中，抗體分子包含以「低親和力」結合人EGFR之第一抗原結合結構域。如本文所用，「低親和力」係指以等於或高於10 nM的解離常數（Kd）結合人EGFR之第一抗原結合結構域。如本文所證明的，與包含以「較高親和力」結合人EGFR的EGFR抗原結合結構域之軛合物相比，包含這樣的低親和力EGFR抗原結合結構域的本文揭露的抗體和軛合物在正常組織中顯示出降低的靶上毒性，諸如皮膚毒性，並因此具有改善的安全性特徵。如本文所用，「較高親和力」或「高親和力」係指以低於10 nM的Kd結合人EGFR之第一抗原結合結構域。此外，本揭露證明了與包含較高親和力EGFR抗原結合結構域之軛合物相比，包含低親和力EGFR抗原結合結構域之軛合物在治療癌症方面更有效（例如，圖12）。
本揭露還提供了如本文定義的包含結合EGFR之第一抗原結合結構域之抗體分子和包含結合c-Met之第二抗原結合結構域之抗體分子。
此外，本揭露提供了包含本文定義的抗體分子或本文定義的軛合物之藥物組成物。
本揭露提供了全部如本文定義的抗體分子、軛合物和藥物組成物，用於治療人體或動物體的方法，諸如治療癌症之方法。本揭露提供了治療癌症之方法，包括投與如本文定義的抗體分子、軛合物或藥物組成物。具體地，本揭露提供了治療選自胰臟癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（NSCLC）和鱗狀頭頸癌（SQHN）的癌症之方法，包括投與如本文定義的抗體分子、軛合物或藥物組成物。在一些實例中，用於治療的癌症係NSCLC。
本揭露還提供了如本文定義的核酸、載體和宿主細胞。此外，本揭露提供了一種產生如本文定義的抗體分子之方法。
本揭露包括所描述的方面和較佳特徵的組合，除非明顯不容許或明確避免此類組合的情況外。
現在將參考附圖來討論本揭露之各方面和實例。對於熟悉該項技術者而言，其他方面和揭露內容將係顯而易見的。該文本中提及的所有文件均藉由援引併入本文。 靶標 EGFR
人EGFR（也稱為原癌基因c-ErbB-1、受體酪胺酸-蛋白激酶erbB-1和EC 2.7.10.1）係由UniProt P00533鑒定的蛋白質。由人 EGFR基因（也稱為 ERBB 、 ERBB1和 HER1）編碼的mRNA的選擇性剪接產生四種同種型：同種型1（UniProt：P00533-1，v2（上一次序列更新：1997年11月1日））；同種型2（UniProt：P00533-2，v1），其包含相對於同種型1的取代F404L和L405S，並且其缺乏對應於同種型1的位置406至1210的胺基酸序列；同種型3（UniProt：P00533-3，v1），其包含同種型1的位置628至705處的取代，並且其缺乏對應於同種型1的位置706至1210的胺基酸序列；以及同種型4（UniProt：P00533-4），其包含相對於同種型1的取代C628S，並且其缺乏對應於同種型1的位置629至1210的胺基酸序列。
EGFR的結構和功能在例如Ferguson, Annu Rev Biophys. [生物物理學年度評論] (2008) 37: 353-373中進行了綜述。EGFR係一種跨膜蛋白，係表皮生長因子家族（EGF家族）成員的受體。該受體包含大的胞外區、單跨跨膜結構域、胞內近膜結構域、酪胺酸激酶結構域和C端調節區。EGFR與配體的結合誘導EGFR的C端調節區中的幾個酪胺酸殘基（Y992、Y1045、Y1068、Y1148和Y1173）發生受體二聚化和自磷酸化。
異常的EGFR表現/活性與許多疾病有關，包括神經系統障礙和許多癌症。
在本說明書中，「EGFR」係指來自任何物種的EGFR並且包括來自任何物種的EGFR同種型、片段、變體或同源物。 c-Met
人c-Met（也稱為肝細胞生長因子受體（HGFR）或酪胺酸-蛋白激酶Met）係由UniProt P08581鑒定的蛋白質。由人 MET基因編碼的mRNA的選擇性剪接產生三種同種型：同種型1（UniProt：P08581-1，v4（上一次序列更新：2009年7月7日））；同種型2（UniProt：P08581-2），其中胺基酸序列「STWWKEPLNIVSFLFCFAS」插入在同種型1的位置755處；以及同種型3（UniProt：P08581-3）也稱為可溶性met變體4，其中對應於同種型1的位置755至764的胺基酸序列被「RHVNIALIQR」取代，並且其進一步缺乏對應於同種型1的位置765至1390的胺基酸序列。
c-Met的結構在例如Gherardi, 2003中進行了綜述，該文獻藉由援引以其全文併入本文。c-Met係由二硫鍵連接的α鏈（50 kDa）和β鏈（145 kDa）組成的異二聚體。c-Met包含介導結合肝細胞生長因子（HGF）的N端Sema結構域和胞內激酶結構域。在細胞表面處的配體結合誘導c-Met在其胞內結構域上的自磷酸化，該胞內結構域為下游訊息分子提供停泊位點並活化若干訊息級聯。
c-Met在上皮細胞表面的正常組織中表現。在許多人類腫瘤和癌症中觀察到c-Met過表現，這通常與轉移表型和不良預後相關。已觀察到高水平c-Met表現的癌症之實例包括非小細胞肺癌、胰臟癌、結腸直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、乳癌和食道-胃癌。在該等癌症中，經常觀察到EGFR和c-Met的共表現。 抗體分子
本揭露提供了抗體分子。根據本揭露之抗體分子可以以分離的形式提供，在沒有污染物的意義上，諸如能夠結合其他多肽和/或血清組分的抗體。
術語「抗體分子」描述了無論是天然的或部分或全部合成產生的免疫球蛋白。抗體分子可為人的或人源化的。抗體分子較佳的是單株抗體分子。抗體的實例係免疫球蛋白同種型，例如免疫球蛋白G（IgG），和它們的同種型亞類，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及其片段。
如本文所用，術語「抗體分子」因此包括抗體片段，只要它們顯示與相關靶分子的結合。抗體片段之實例包括Fv、scFv、Fab、scFab、F(ab') 2、Fab 2、雙抗體、三抗體、scFv-Fc、微型抗體和單結構域抗體（例如VhH）等）。除非上下文另有要求，否則如本文所用，術語「抗體分子」因此等同於「抗體分子或其片段」。
抗體分子及其構建和使用方法係本領域熟知的，並且在例如Holliger & Hudson, Nature Biotechnology [自然生物技術] 23(9):1126-1136 (2005)中描述。可以採用單選殖和其他抗體分子並使用重組DNA技術來產生保留原始抗體的特異性的其他抗體或嵌合分子。此類技術可以涉及將一種抗體分子的CDR或可變區引入不同的抗體分子中（EP-A-184187、GB 2188638A和EP-A-239400）。
鑒於當今與單株抗體技術相關的技術，可以製備針對大多數抗原的抗體分子。抗原結合結構域可為抗體的一部分（例如Fab片段）或合成的抗體片段（例如單鏈Fv片段（ScFv））。針對所選抗原的合適的單株抗體可以藉由已知技術製備，例如「Monoclonal Antibodies: A manual of techniques」[單株抗體：技術手冊], H Zola (CRC Press [CRC出版社], 1988) 中和「Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications」[單選殖融合瘤抗體：技術與應用], J G R Hurrell (CRC Press [CRC出版社], 1982) 中揭露的那些。Neuberger, 1988討論了嵌合抗體。
根據本揭露之抗體分子包含抗原結合結構域。「抗原結合結構域」描述了結合靶抗原的全部或部分的分子之部分。當抗原較大時，抗體可以僅結合至抗原的特定部分，該部分稱為表位。抗體抗原結合位點可以由一或多個抗體可變結構域提供。抗體抗原結合位點較佳地包含可變輕鏈（VL）區和可變重鏈（VH）區。抗原結合結構域的VH區和VL區一起構成Fv區。
抗原結合結構域通常包含六個互補決定區（CDR）；三個在VH區：HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及三個在VL區：LCDR1、LCDR2和LCDR3。這六個CDR一起定義了抗原結合結構域的互補位，該互補位係結合靶抗原的抗原結合結構域之一部分。
VH區和VL區包含每個CDR任一側的框架區（FR），其為CDR提供支架。從N末端到C末端，VH區包含以下結構：N末端-[HFR1]-[HCDR1]-[HFR2]-[HCDR2]-[HFR3]-[HCDR3]-[HFR4]-C末端；VL區包含以下結構：N末端-[LFR1]-[LCDR1]-[LFR2]-[LCDR2]-[LFR3]-[LCDR3]-[LFR4]-C末端。
有幾種不同的慣例用於定義抗體CDR和FR，諸如Kabat, 1991、Chothia, 1987中描述的那些；如LeFranc, 2015中描述的IMGT編號；以及如Retter, 2005中描述的VBASE2。本文描述的抗體分子之VH區和VL區的CDR和FR根據Kabat（Kabat, 1991）定義。
包含至少兩個抗原結合結構域（其中每個抗原結合結構域能夠結合不同的靶標）的抗體分子可被稱為「雙特異性抗體分子」。相比之下，僅結合單個靶標（例如EGFR或c-Met）的抗體分子被稱為「單特異性抗體分子」。本揭露提供了一種雙特異性抗體分子，該雙特異性抗體分子包含結合EGFR之第一抗原結合結構域和結合c-Met之第二抗原結合結構域。 抗 EGFR 抗原結合結構域
結合EGFR的抗原結合結構域包含能夠結合EGFR的抗體分子之CDR。在一些實例中，結合EGFR的抗原結合結構域另外包含能夠結合EGFR的抗體分子之FR。也就是說，在一些實例中，結合EGFR的抗原結合結構域包含能夠結合EGFR的抗體分子之VH區和VL區。
在一些實例中，結合EGFR的抗原結合結構域包含係或源自本文所述之EGFR結合抗體殖株（即抗EGFR抗體殖株RAA22或QD6）的VH/VL區的VH區和VL區。較佳的是，結合EGFR的抗原結合結構域包含係或源自RAA22的VH/VL區的VH區和VL區。
在一些實例中，結合EGFR的抗原結合結構域包含抗EGFR抗體殖株RAA22或QD6、較佳的是RAA22的三個HCDR或三個LCDR，較佳的是三個VH CDR和三個VL CDR。本文描述了抗體RAA22和QD6的VH和VL結構域序列，因此可以從所述序列確定所述抗體的三個VH和三個VL結構域CDR。
在一些實例中，結合EGFR的抗原結合結構域包含根據下文 (1) 或 (2) 的VH區： (1) 包含以下CDR的VH區： 具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列之HCDR1 具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列之HCDR2 具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列之HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代，或 (2) 包含以下CDR的VH區： 具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列之HCDR1 具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列之HCDR2 具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列之HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
較佳的是，結合EGFR的抗原結合結構域包含根據上文 (1) 的VH區。
在一些實例中，結合EGFR的抗原結合結構域包含根據上文 (1) 或 (2) 的VH區，其中該VH區另外包含根據以下 (3) 的FR： (3)    具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列之HFR1 具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列之HFR2 具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列之HFR3 具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列之HFR4， 或其變體，其中HFR1、HFR2、HFR3或HFR4中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在一些實例中，結合EGFR的抗原結合結構域包含VH區，該VH區包含根據上文 (1) 或 (2) 的CDR和根據上文 (3) 的FR。
在一些實例中，結合EGFR的抗原結合結構域包含根據下文 (4) 或 (5) 的VH區： (4) 包含根據 (1) 的CDR和根據 (3) 的FR的VH區， (5) 包含根據 (2) 的CDR和根據 (3) 的FR的VH區。
較佳的是，結合EGFR的抗原結合結構域包含根據上文 (4) 的VH區。
在一些實例中，結合EGFR的抗原結合結構域包含根據下文 (6) 或 (7) 的VH區： (6) 包含與SEQ ID NO: 16的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列之VH區。 (7) 包含與SEQ ID NO: 18的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列之VH區。
較佳的是，結合EGFR的抗原結合結構域包含根據上文 (6) 的VH區。
在一些實例中，結合EGFR的抗原結合結構域包含根據下文 (8) 或 (9) 的VL區： (8) 包含以下CDR的VL區： 具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列之LCDR1 具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列之LCDR2 具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列之LCDR3， 或其變體，其中LCDR1、LCDR2或LCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。 (9) 包含以下CDR的VL區： 具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列之LCDR1 具有SEQ ID NO: 66的胺基酸序列之LCDR2 具有SEQ ID NO: 67的胺基酸序列之LCDR3， 或其變體，其中LCDR1、LCDR2或LCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
較佳的是，結合EGFR的抗原結合結構域包含根據上文 (8) 的VL區。
在一些實例中，結合EGFR的抗原結合結構域包含根據上文 (8) 或 (9) 的VL區，其中該VL區另外包含根據以下 (10) 的FR： (10)     具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列之LFR1 具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列之LFR2 具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列之LFR3 具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列之LFR4， 或其變體，其中LFR1、LFR2、LFR3或LFR4中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在一些實例中，結合EGFR的抗原結合結構域包含VL區，該VH區包含根據上文 (8) 或 (9) 的CDR和根據上文 (10) 的FR。
在一些實例中，結合EGFR的抗原結合結構域包含根據下文 (11) 或 (12) 的VL區： (11) 包含根據 (8) 的CDR和根據 (10) 的FR的VL區。 (12) 包含根據 (9) 的CDR和根據 (10) 的FR的VL區。
較佳的是，結合EGFR的抗原結合結構域包含根據上文 (11) 的VL區。
在一些實例中，結合EGFR的抗原結合結構域包含根據下文 (13) 或 (14) 的VL區： (13) 包含與SEQ ID NO: 20的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列之VL區。 (14) 包含與SEQ ID NO: 22的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列之VL區。
較佳的是，結合EGFR的抗原結合結構域包含根據上文 (13) 的VL區。
在一些實例中，結合EGFR的抗原結合結構域包含根據上文 (1) 至 (7) 中任一項的VH區和根據上文 (8) 至 (14) 中任一項的VL區。在一些較佳的實例中，抗原結合結構域包含根據 (1)、(4) 和 (6) 中任一項的VH區和根據 (8)、(11) 和 (13) 中任一項的VL區。在其他實例中，抗原結合結構域包含根據 (2)、(5) 和 (7) 中任一項的VH區和根據 (9)、(12) 和 (14) 中任一項的VL區。 抗 c-Met 抗原結合結構域
結合c-Met的抗原結合結構域包含能夠結合c-Met的抗體分子之CDR。在一些實例中，結合c-Met的抗原結合結構域另外包含能夠結合c-Met的抗體分子之FR。也就是說，在一些實例中，結合c-Met的抗原結合結構域包含能夠結合c-Met的抗體分子之VH區和VL區。
在一些實例中，結合c-Met的抗原結合結構域包含係或源自本文所述之c-Met結合抗體殖株（即抗c-Met抗體殖株B09-GL）的VH/VL區的VH區和VL區。
在一些實例中，結合c-Met的抗原結合結構域包含c-Met結合抗體殖株B09-GL的三個HCDR或三個LCDR，較佳三個VH CDR和三個VL CDR。本文描述了抗體B09-GL的VH和VL結構域序列，因此可以從所述序列確定所述抗體的三個VH和三個VL結構域CDR。
在一些實例中，結合c-Met的抗原結合結構域包含根據下文 (15) 的VH區： (15) 包含以下CDR的VH區： 具有SEQ ID NO: 24的胺基酸序列之HCDR1 具有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列之HCDR2 具有SEQ ID NO: 26的胺基酸序列之HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在一些實例中，結合c-Met的抗原結合結構域包含根據上文 (15) 的VH區，其中該VH區另外包含根據以下 (16) 的FR： (16)     具有SEQ ID NO: 30的胺基酸序列之HFR1 具有SEQ ID NO: 31的胺基酸序列之HFR2 具有SEQ ID NO: 32的胺基酸序列之HFR3 具有SEQ ID NO: 33的胺基酸序列之HFR4， 或其變體，其中HFR1、HFR2、HFR3或HFR4中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在一些實例中，結合c-Met的抗原結合結構域包含根據下文 (17) 的VH： (17) 包含根據 (15) 的CDR和根據 (16) 的FR的VH區。
在一些實例中，結合c-Met的抗原結合結構域包含根據下文 (18) 的VH區： (18) 包含與SEQ ID NO: 38的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列之VH區。
在一些實例中，結合c-Met的抗原結合結構域包含根據下文 (19) 的VL區： (19) 包含以下CDR的VL區： 具有SEQ ID NO: 27的胺基酸序列之LCDR1 具有SEQ ID NO: 28的胺基酸序列之LCDR2 具有SEQ ID NO: 29的胺基酸序列之LCDR3， 或其變體，其中LCDR1、LCDR2或LCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在一些實例中，結合c-Met的抗原結合結構域包含根據上文 (19) 的VL區，其中該VL區另外包含根據以下 (20) 的FR： (20)     具有SEQ ID NO: 34的胺基酸序列之LFR1 具有SEQ ID NO: 35的胺基酸序列之LFR2 具有SEQ ID NO: 36的胺基酸序列之LFR3 具有SEQ ID NO: 37的胺基酸序列之LFR4， 或其變體，其中LFR1、LFR2、LFR3或LFR4中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在一些實例中，結合c-Met的抗原結合結構域包含根據下文 (21) 的VL區： (21) 包含根據 (19) 的CDR和根據 (20) 的FR的VL區。
在一些實例中，結合c-Met的抗原結合結構域包含根據下文 (22) 的VL區： (22) 包含與SEQ ID NO: 40的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列之VL區。
在一些實例中，結合c-Met的抗原結合結構域包含根據上文 (15) 至 (18) 中任一項的VH區和根據上文 (19) 至 (22) 中任一項的VL區。 雙特異性抗體分子的抗原結合結構域
本發明提供了一種包含第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域的抗體分子（即雙特異性抗體分子），該第一抗原結合結構域包含能夠結合EGFR的抗原結合結構域之CDR，該第二抗原結合結構域包含能夠結合c-Met的抗原結合結構域之CDR。在一些實例中，第一抗原結合結構域包含能夠結合EGFR的抗原結合結構域之CDR和FR，並且第二抗原結合結構域包含能夠結合c-Met的抗原結合結構域之CDR和FR。也就是說，在一些實例中，抗體分子包含第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域包含能夠結合EGFR的抗原結合結構域之VH區和VL區，並且該第二抗原結合結構域包含能夠結合c-Met的抗原結合結構域之VH區和VL區。
在一些實例中，結合EGFR之第一抗原結合結構域包含係或源自本文所述之EGFR結合抗體殖株（例如，抗EGFR抗體殖株RAA22或QD6，較佳的是RAA22）的VH/VL區的VH區和VL區，並且結合c-Met之第二抗原結合結構域包含係或源自本文所述之c-Met結合抗體殖株（例如，抗c-Met抗體殖株B09-GL）的VH/VL區的VH區和VL區。包含第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域的雙特異性抗體可以被稱為「RAA22/B09」或「RAA22/B09雙特異性抗體分子」，該第一抗原結合結構域結合EGFR並包含係或源自EGFR結合抗體殖株RAA22的VH/VL區的VH區和VL區，並且該第二抗原結合結構域結合c-Met並包含係或源自c-Met結合抗體殖株B09-GL的VH/VL區的VH區和VL區。
在一些實例中，第一抗原結合結構域包含： 根據上文 (1) 至 (7) 中任一項的VH區和根據上文 (8) 至 (14) 中任一項的VL區；以及 該第二抗原結合結構域包含： 根據上文 (15) 至 (18) 中任一項的VH區和根據上文 (19) 至 (22) 中任一項的VL區。
在一些較佳的實例中，第一抗原結合結構域包含： 根據上文 (1)、(4) 和 (6) 中任一項的VH區和根據上述 (8)、(11) 和 (13) 中任一項的VL區；以及 該第二抗原結合結構域包含： 根據上文 (15) 至 (18) 中任一項的VH區和根據上文 (19) 至 (22) 中任一項的VL區。
例如，在較佳的實例中，本揭露之抗體分子包含： 結合上皮生長因子受體（EGFR）之第一抗原結合結構域；以及 結合c-Met之第二抗原結合結構域， 其中該第一抗原結合結構域包含： (i) 包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： 具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列之HCDR1 具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列之HCDR2 具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列之HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 (ii) 包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： 具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列之LCDR1 具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列之LCDR2 具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列之LCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在另外較佳的實例中，第一抗原結合結構域包含： 包含與SEQ ID NO: 16的胺基酸序列具有至少70%序列同一性的胺基酸序列之VH區；以及 包含與SEQ ID NO: 20的胺基酸序列具有至少70%序列同一性的胺基酸序列之VL區， 和/或第二抗原結合結構域包含： 包含與SEQ ID NO: 38的胺基酸序列具有至少70%序列同一性的胺基酸序列之VH區；以及 包含與SEQ ID NO: 40的胺基酸序列具有至少70%序列同一性的胺基酸序列之VL區。 CDR 取代
在根據本揭露之其中一或多個胺基酸被另一種胺基酸取代的實例中，取代可為保守取代，例如根據下表。在一些實例中，中間列中同一框中的胺基酸被取代，即例如一種非極性胺基酸被另一種非極性胺基酸取代。在一些實例中，最右列中同一行中的胺基酸被取代，即例如G被A或P取代。
脂肪族 非極性 G A P
I L V
極性-不帶電荷 C S T M
N Q
極性-帶電荷 D E
K R
芳香族    H F W Y
在一些實例中，取代可為功能上保守的。也就是說，在一些實例中，與等效的未取代的抗原結合結構域相比，取代可以不影響（或可以基本上不影響）包含取代的抗原結合結構域之一或多種功能性質（例如結合親和力）。 恒定區
在一些實例中，本文所述之抗體分子包含免疫球蛋白重鏈恒定（CH）區。在一些實例中，CH係或源自IgG（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、IgA（例如IgA1、IgA2）、IgD、IgE或IgM的重鏈恒定區序列。
在一些實例中，CH區係人免疫球蛋白G1恒定區（IGHG1；UniProt：P01857-1，v1；SEQ ID NO: 42）或其片段。
在一些實例中，CH區包含與SEQ ID NO: 42、43、44、45、46、63或64的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列。在較佳的實例中，CH區包含與SEQ ID NO: 63或64的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列。
在一些實例中，抗體分子包含重鏈，該重鏈包含如本文所述之VH區和如本文所述之CH區或由它們組成。
在一些實例中，本文所述之抗體分子包含免疫球蛋白輕鏈恒定（CL）區或其片段。在一些實例中，CL區係或源自SEQ ID NO: 47或SEQ ID NO: 48中列出的κ CL區。在一些實例中，CL區係或源自SEQ ID NO: 49或SEQ ID NO: 65中列出的λ CL區。在一些實例中，抗體分子包含：係或源自SEQ ID NO: 47或48中列出的κ CL區的第一CL區；以及係或源自SEQ ID NO: 49或65中列出的λ CL區的第二CL區。
在一些實例中，本文所述之抗體分子包含： 第一重鏈，其中該第一重鏈包含該第一抗原結合結構域的該VH區，以及第一重鏈恒定（CH）區或其片段； 第一輕鏈，其中該第一輕鏈包含該第一抗原結合結構域的該VL區，以及第一輕鏈恒定（CL）區或其片段； 第二重鏈，其中該第二重鏈包含該第二抗原結合結構域的該VH區，以及第二重鏈恒定（CH）區或其片段；以及 第二輕鏈，其中該第二輕鏈包含該第二抗原結合結構域的該VL區，以及第二輕鏈恒定（CL）區或其片段。
第一CH區和第二CH區可以相同或不同。換句話說，第一CH區和第二CH區可以形成同二聚體或異二聚體。例如，不對稱雙特異性抗體分子具有不同的第一CH區和第二CH區，如下文更詳細地描述的。第一CL區和第二CL區可以相同或不同。在一些實例中，第一CL區係或源自SEQ ID NO: 47或48中列出的κ CL區；以及係或源自SEQ ID NO: 49或65中列出的λ CL區的第二CL區。
應當理解，當抗體分子包含第一VH區和第一CH區時，該等區一起形成抗體分子的第一重鏈，即第一VH區和第一CH區彼此連接。類似地，第二VH區和第二CH區形成抗體分子的第二重鏈；第一VL區和第一CL區形成抗體分子的第一輕鏈；並且第二VL區和第二CL區形成抗體分子的第二輕鏈。
在一些實例中，抗體分子包含具有與SEQ ID NO: 50中列出的B-09-GL重鏈、SEQ ID NO: 53中列出的QD6重鏈、SEQ ID NO: 56中列出的RAA22重鏈、SEQ ID NO: 59中列出的重鏈或SEQ ID NO: 60中列出的重鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列之重鏈。
在一些實例中，抗體分子包含第一重鏈和第二重鏈，其中 (i) 第一重鏈包含與SEQ ID NO: 56中列出的B-09-GL重鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列；以及 (ii)       第二重鏈包含與SEQ ID NO: 50中列出的RAA22重鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列。
在一些實例中，抗體分子包含第一重鏈和第二重鏈，其中 (i) 第一重鏈包含與SEQ ID NO: 59中列出的重鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列；以及 (ii)       第二重鏈包含與SEQ ID NO: 60中列出的重鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列。
在一些實例中，本文所述之抗體分子包含輕鏈，該輕鏈包含如本文所述之VL區和如本文所述之CL區或由它們組成。
在一些實例中，本文所述之抗體分子包含具有與SEQ ID NO: 52中列出的B-09-GL輕鏈、SEQ ID NO: 55中列出的QD6輕鏈、SEQ ID NO: 58中列出的RAA22輕鏈、SEQ ID NO: 61中列出的輕鏈或SEQ ID NO: 62中列出的輕鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列之輕鏈。
在一些實例中，本文所述之抗體分子包含第一輕鏈和第二輕鏈，其中 (i) 第一輕鏈包含與SEQ ID NO: 58中列出的RAA22輕鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列；以及 (ii)       第二輕鏈包含與SEQ ID NO: 52中列出的B-09-GL輕鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列。
在一些實例中，本文所述之抗體分子包含第一輕鏈和第二輕鏈，其中 (i) 第一輕鏈包含與SEQ ID NO: 61中列出的輕鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列；以及 (ii)       第二輕鏈包含與SEQ ID NO: 62中列出的輕鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性、更較佳的是至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之一的胺基酸序列。
本文所述之抗體分子的CH、CL、重鏈和/或輕鏈可包含一或多個修飾，例如消除或降低Fc效應子功能，促進異二聚體抗體分子的形成，增加同源重鏈和輕鏈配對的功效，和/或協助軛合物形成，如下文更詳細地描述。已經修飾的CH、CL、重鏈和輕鏈可分別稱為經修飾的CH、CL、重鏈和輕鏈。
抗體分子可在重鏈的CH區中包含突變以減少或消除抗體分子與一或多種Fcγ受體諸如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII和/或與補體的結合。這種突變消除或降低Fc效應子功能。用於減少或消除抗體分子與一或多種Fcγ受體和補體的結合的突變係已知的，並且包括例如Organesyan, 2008中描述的L234F/L235E/P331S的「三重突變」或「TM」。已知調節抗體效應子功能的其他突變在例如Wang, 2018中進行了描述。
因此，在一些實例中，第一重鏈和/或第二重鏈（較佳的是兩條）包含位置234處的苯丙胺酸（F）、位置235處的麩胺酸（E）和位置331處的絲胺酸（S），其中編號根據EU索引。例如，第一重鏈和第二重鏈中的一條或兩條（較佳的是兩條）可包含具有與SEQ ID NO: 42中列出的序列具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%序列同一性的胺基酸序列之CH區，並且包含位置234處的苯丙胺酸（F）、位置235處的麩胺酸（E）和位置331處的絲胺酸（S），其中編號按照EU索引。如實例（例如實例12）中所證明的，重鏈中包含TM被證明改善了示例性抗體分子和ADC的藥物動力學性質。
包含三重突變的CH區的實例係SEQ ID NO: 63和64。因此，在一些實例中，第一重鏈和第二重鏈中的一條包含具有與SEQ ID NO: 63中列出的序列具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%序列同一性的胺基酸序列之CH區，而另一條重鏈包含具有與SEQ ID NO: 64中列出的序列具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%序列同一性的胺基酸序列之CH區，其中CH區中的一個或兩個（較佳的是兩個）包含位置234處的苯丙胺酸、位置235處的麩胺酸和位置331處的絲胺酸，其中編號按照EU索引。
包含含有三重突變的CH區的重鏈的實例係SEQ ID NO: 59和60。因此，在一些實例中，第一重鏈和第二重鏈中的一條具有與SEQ ID NO: 59中列出的序列具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%序列同一性的胺基酸序列，而另一條重鏈具有與SEQ ID NO: 60中列出的序列具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%序列同一性的胺基酸序列，其中重鏈中的一條或兩條（較佳的是兩條）包含位置234處的苯丙胺酸、位置235處的麩胺酸和位置331處的絲胺酸，其中編號按照EU索引。
抗體分子的VL區和CL區以及VH區和CH1區一起構成Fab區。抗體分子的其餘部分構成Fc區。
除非另有說明，否則恒定結構域中的胺基酸殘基位置（包括如本文所述之胺基酸序列、取代、缺失和插入的位置）根據EU編號（Edelman, 2007）進行編號。 雙特異性形式
雙特異性抗體分子可以任何合適的形式提供。本文所述之雙特異性抗體分子的合適形式及其產生方法在Kontermann, MAbs 2012, 4(2):182-197以及Kontermann和Brinkmann 2015, 20(7): 838-847中進行了描述，這兩篇文獻均藉由援引以其全文併入本文。具體參見Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-19的圖2。
也可以藉由化學軛合由現有抗體產生雙特異性抗體分子。例如，可以使用同源或異源雙功能偶合試劑偶合（例如，如Graziano和Guptill, Methods Mol Biol. [分子生物學方法] 2004; 283:71-85中所述）偶合兩個IgG分子或兩個Fab'片段。
在一些實例中，雙特異性抗體分子可為免疫球蛋白G樣（IgG樣）雙特異性抗體分子。IgG樣雙特異性抗體分子可包含對一種抗原特異的Fv區、Fab區或sVD，對另一種抗原特異的Fv/Fab/sVD，以及Fc區。IgG樣雙特異性抗體分子可為對稱的或不對稱的。雙特異性抗體分子較佳的是不對稱的。
對稱IgG樣雙特異性抗體分子通常含有與IgG分子的重鏈或輕鏈的N端或C端融合的例如以scFv片段或可變單結構域的形式的抗原結合結構域。該等對稱IgG樣雙特異性抗體分子的特有性質係它們含有兩條相同的重鏈。此外，對稱IgG樣雙特異性抗體分子對於每個表位通常是二價的。如本文所用的化合價係指抗體分子中能夠結合單個表位的抗原結合區的數量。單選殖單特異性IgG抗體分子對於單個表位係二價的—其含有兩個抗原結合結構域，每個結構域能夠結合單個靶分子上的表位。對稱IgG樣雙特異性抗體分子對於每個表位係二價的—其通常含有四個抗原結合結構域，其中兩個能夠結合靶分子上的第一表位，並且其中兩個能夠結合靶分子上的第二表位。
對稱IgG樣雙特異性抗體分子之實例包括DVD-IgG、IgG-scFv、scFv-IgG、scFv 4-Ig、IgG-scFab、scFab-IgG、IgG-sVD、sVD-IgG、2合1-IgG、mAb 2、tandemab共同LC。該等可以藉由本領域已知的方法形成，例如化學交聯、體細胞雜交或氧化還原方法。
相比之下，不對稱IgG樣雙特異性抗體分子對於每個靶標通常是一價的。如例如Klein 2012中所述，一價雙特異性IgG的概念被認為具有獨特的治療優勢，因為它們 (i) 不會引起受體同源二聚化，(ii) 由於對每種抗原的親合力喪失而潛在地具有對非靶組織降低的毒性，並且 (iii) 當兩種抗原都被選擇性地限制或在靶細胞上大量表現時具有更好的選擇性。因此，在一些實例中，抗體分子係不對稱IgG樣雙特異性抗體分子。
不對稱IgG樣雙特異性抗體分子涉及兩條不同重鏈的異二聚化和同源輕鏈與重鏈的正確配對。重鏈的異源二聚化可以藉由幾種技術來解決，諸如杵臼結構（knobs-into-holes）、CH3的靜電轉向、CH3鏈交換的工程化結構域和白胺酸拉鍊。可以藉由使用該等重鏈異源二聚化技術中的一種連同使用共同的輕鏈、CH1與CL之間的結構域交叉、重鏈和輕鏈與連接子的偶合、來自兩個單獨的單選殖的重鏈-輕鏈二聚體的離體組裝、整個Fab結構域的介面工程化或CH1/CL介面的二硫化物工程化來確保輕鏈與重鏈的正確配對。
不對稱IgG樣雙特異性抗體分子之實例包括DuetMab、kih IgG、kih IgG共同LC、CrossMab、kih IgG-scFab、mAb-Fv、電荷對和SEED體。
在一些實例中，抗體分子在CH1、CH2和CH3結構域中的一者或多者中包含一或多個促進異源二聚體抗體分子的形成的修飾。例如，上述DuetMab抗體分子可另外包含一或多個CH1、CH2和CH3結構域中的一或多個修飾，其促進異二聚體抗體分子的形成。這可能涉及Ridgway 1996中描述的基於CH3結構域中促進重鏈異源二聚化的單個胺基酸取代的杵臼結構（KiH）策略。杵變體重鏈CH3的小胺基酸已被較大胺基酸替換，而臼變體的大胺基酸已被較小胺基酸替換。也可引入另外的修飾以穩定重鏈之間的締合。
增強異二聚化的CH3修飾包括例如一條重鏈上的Y407V/T366S/L368A和另一條重鏈上的T366W；以及一條重鏈上的S354C/T366W和另一條重鏈上的Y349C/Y407V/T366S/L368A，其中恒定區的編號按照EU索引。
增強異二聚化的CH3修飾的其他實例在例如Brinkmann和Kontermann, 2017 MABS 9(2), 182-212的表1中進行了描述，該文獻藉由援引具體併入本文。
在一些實例中，抗體分子包含形成異二聚體的第一重鏈和第二重鏈，其中第一重鏈和第二重鏈中的一條包含位置354處的半胱胺酸（C）殘基和位置366處的色胺酸（W）殘基，並且另一條重鏈包含位置349處的半胱胺酸（C）殘基、位置407處的纈胺酸（V）殘基、位置366處的絲胺酸（S）和位置368處的丙胺酸（A），其中恒定區的編號按照EU索引。例如，第一重鏈和第二重鏈中的一條可具有SEQ ID NO: 42中列出的序列，並且進一步包含位置354處的半胱胺酸（C）殘基和位置366處的色胺酸（W）殘基，並且另一條重鏈具有SEQ ID NO: 42中列出的序列，並且進一步包含位置349處的半胱胺酸（C）殘基、位置407處的纈胺酸（V）殘基、位置366處的絲胺酸（S）和位置368處的丙胺酸（A），其中恒定區的編號按照EU索引。
在一些實例中，抗體分子包含： (i) 包含第一經修飾的CH3區的第一重鏈，其中該第一經修飾的CH3區包含位置354處的半胱胺酸（C）殘基和位置366處的色胺酸（W）殘基；以及 (ii)       包含第二經修飾的CH3區的第二重鏈，其中該第二經修飾的CH3區包含位置349處的半胱胺酸（C）殘基、位置407處的纈胺酸（V）殘基、位置366處的絲胺酸（S）和位置368處的丙胺酸（A）， 其中恒定區的編號按照EU索引。
不對稱IgG樣雙特異性抗體分子的具體例示形式稱為「DuetMab」。DuetMab抗體分子使用KIH技術用於2個不同重鏈的異源二聚化，並藉由用工程化的二硫鍵替換CH1-CL介面之一中的天然二硫鍵來增加同源重鏈和輕鏈配對的效力。與DuetMab相關的揭露內容可以在例如美國專利案號9,527,927和Mazor 2015中找到，這兩篇參考文獻藉由援引以其全文併入本文。
在一些實例中，抗體分子包含： (a) 經修飾的CH區，其中經修飾的重鏈包含天然非半胱胺酸胺基酸到半胱胺酸胺基酸的取代；以及 (b) 經修飾的相應CL區，其中該經修飾的CL包含天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代， 其中： (i) 該第一重鏈包含該經修飾的CH區並且該第一輕鏈包含該經修飾的相應CL區；或 (ii)       該第二重鏈包含該經修飾的CH區並且該第二輕鏈包含該經修飾的相應CL區。
在一些實例中，由天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代產生的經修飾的CH區的取代的半胱胺酸和由天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代產生的經修飾的相應CL區的取代的半胱胺酸可以形成二硫鍵。
在一些實例中，經修飾的CH區包含位置126處的天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代；並且經修飾的相應CL區包含位置121處的天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸的取代，其中恒定區的編號按照EU索引。
在一些實例中，經修飾的CH區包含位置126處的天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代和位置219處的天然半胱胺酸胺基酸至非半胱胺酸胺基酸（例如至纈胺酸）的取代；並且經修飾的相應CL區包含位置121處的天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸的取代和位置214處的天然半胱胺酸胺基酸至非半胱胺酸胺基酸（例如至纈胺酸）的取代，其中恒定區的編號按照EU索引。
在一些實例中，抗體分子包含第二CH區和第二相應輕鏈，其中第二CH區和第二相應CL不包含天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代並且不包含天然半胱胺酸至非半胱胺酸胺基酸的取代。 軛合物
抗體分子可以與藥物軛合。在這種情況下，抗體分子可稱為「軛合物」或「抗體藥物軛合物」。這樣的軛合物可用於治療和/或診斷本文所述之疾病。如本文所用，藥物可稱為「有效負載」或「彈頭」。
在一些實例中，藥物包括細胞毒素、放射性同位素、免疫調節劑、細胞介素、淋巴因子、趨化因子、生長因子、腫瘤壞死因子、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微RNA、光活性治療劑、抗血管生成劑、促凋亡劑、肽、脂質、碳水化合物、螯合劑或它們的組合。
細胞毒素係一種能夠誘導被靶向的細胞死亡的化合物。通常，在抗體藥物軛合物的情況下，細胞毒素被遞送至抗體分子所靶向的細胞，在那裡它被釋放到細胞中並誘導細胞死亡。細胞毒素在抗體藥物軛合物中之用途在例如Chalouni和Doll 2018 J Exp Clin Cancer Res. [實驗與臨床癌症研究雜誌] 37(1):20中進行了描述。在一些實例中，細胞毒素係微管溶素、澳瑞他汀、美登木素生物鹼、拓撲異構酶抑制劑或吡咯并苯并二氮呯（PBD）。
在特定實例中，細胞毒素係或包含微管溶素。微管溶素係一類抑制細胞生長的四肽，其含有異白胺酸和三種其他複雜的非天然胺基酸Mep（R-N-mepipecolicacid）、Tuv（tubuvaline）和Tut（tubulyrosine）或Tup（tubuphenylalanine）。微管溶素係極其有效的細胞毒性分子，並且有效對抗多重耐藥細胞系（Domling, 2005）。該等化合物以低皮莫耳範圍內的IC50值顯示出針對一組癌細胞系測試的高細胞毒性；因此，它們作為抗癌治療劑係有意義的。參見例如WO 2012019123。微管溶素軛合物揭露於例如美國專利案號7,776,814中。在一些實例中，微管溶素係具有以下化學結構的微管溶素A：
在一些實例中，微管溶素係微管溶素1508，也稱為「AZ1508」並且在WO 2015157594中進行了更詳細的描述。微管溶素1508具有以下化學結構：
較佳的是，細胞毒素係或包含拓撲異構酶抑制劑。如本文所用的術語「拓撲異構酶抑制劑」係指抑制一或多種拓撲異構酶（拓撲異構酶I和II）的活性的細胞毒性劑，該等酶是藉由調節DNA超螺旋在DNA複製和轉錄中發揮重要作用的酶。因此，預期包含拓撲異構酶抑制劑作為細胞毒素的抗體藥物軛合物干擾涉及DNA的正常過程，因此導致細胞死亡。已經證明含有拓撲異構酶抑制劑的軛合物在臨床試驗中對多種含有腫瘤的細胞系有效以及具有抗癌活性。參見例如Ogitani, 2016a；Ogitani, 2016b；Cardillo, 2015；以及Bardia, 2017。
較佳的是抗體分子與拓撲異構酶I抑制劑軛合。拓撲異構酶I抑制劑之代表性實例包括但不限於喜樹鹼及其類似物拓撲替康、伊立替康、貝洛替康、依沙替康、勒托替康和西諾替康。拓撲異構酶II抑制劑之代表性實例包括但不限於安吖啶、柔紅黴素、多柔比星、表鬼臼毒素、玫瑰樹鹼、表柔比星、依託泊苷、雷佐生和替尼泊苷。
喜樹鹼化學結構之實例如下： 。
合適的拓撲異構酶I抑制劑這一般實例由以下化合物表示：
所述化合物表示為A*。
化合物（例如A*）較佳地具有用於連接（較佳地軛合）至本文所述之抗體分子（其可稱為「配體單元」或替代地「細胞結合劑」（CBA））的連接子。合適地，連接子以可切割的方式連接（例如軛合）至胺基殘基，例如本文所述之抗體分子的胺基酸。
用於軛合物的連接子的設計和選擇係本領域已知的，並且在例如Beck, 2017中進行了描述。本文使用的連接子可為 Beck, 2017中描述的任何連接子。
更特別地，合適的拓撲異構酶I抑制劑之實例由具有式「I」的以下化合物： 及其鹽和溶劑化物表示，其中R L係用於連接至本文所述之抗體分子的連接子，其中所述連接子較佳的是選自： (ia)： ， 其中 Q係： ，其中Q X使得Q為胺基酸殘基、二肽殘基、三肽殘基或四肽殘基； X係： ， 其中a = 0至5，b1 = 0至16，b2 = 0至16，c1 = 0或1，c2 = 0或1，d = 0至5，其中至少b1或b2 = 0（即b1和b2中只有一個可以不是0）並且至少c1或c2 = 0（即c1和c2中只有一個可以不是0）； G L係用於連接至本文所述之抗體或其抗原結合片段（例如配體單元或細胞結合劑）的連接子；或 (ib)： ， 其中R L1和R L2獨立地選自H和甲基，或與它們所鍵合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團；以及 e係0或1。
熟悉該項技術者將理解，多於一種所述藥劑（例如拓撲異構酶I抑制劑）可以軛合至抗體分子。
例如，本揭露之軛合物（例如抗體-藥物軛合物）可以具有通式IV： L - (D L) p (IV)或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中L係本文所述之抗體分子（例如配體單元或CBA），D L係具有連接子的藥物（例如藥物連接子單元），並且p係1至20的整數。
較佳的是，D L係具有式III的連接子之拓撲異構酶I抑制劑： 。
R LL係連接至本文所述之抗體分子（例如配體單元）的連接子，其中所述連接子較佳的是選自 (ia')： ， 其中Q和X如上文所定義並且G LL係連接至本文所述之抗體分子（例如配體單元或CBA）的連接子；以及 (ib')： ， 其中R L1和R L2如上文所定義。
載藥量由p表示，即每個抗體分子（例如配體單元）的拓撲異構酶I抑制劑（例如藥物單元）的數量。載藥量可以在1至20個藥物單元（D）/配體單元之範圍內。對於組成物，p表示組成物中軛合物的平均載藥量，並且p的範圍為1至20。在一些實例中，當藥物係拓撲異構酶抑制劑時，p範圍選自2至8，較佳4至8，甚至更較佳5至7，還更較佳5.5至6.5。如實例中所述，產生平均DAR為6 +/- 6%的包含拓撲異構酶I抑制劑SG3932的ADC。
因此，本揭露包括這樣的軛合物，該軛合物包含與至少一種拓撲異構酶I抑制劑（例如藥物單元，諸如上文所示的A*）共價連接的本文所述之抗體分子（例如配體單元或CBA）。所述抑制劑較佳地藉由連接子（例如連接子單元）諸如上文描述為R L和/或R LL的連接子連接至抗體分子。換句話說，本揭露包括本文所述之抗體分子（例如配體單元或CBA）與一或多種拓撲異構酶I抑制劑連接，較佳地通過連接子（例如藥物-連接子單元）。上文更全面描述的抗體分子（代表配體單元或CBA）係結合靶部分的靶向劑。更具體地，該抗體分子可以例如特異性結合靶細胞上的EGFR和cMET，從而將藥物單元遞送至靶細胞。因此，本揭露還提供了用ADC治療例如各種癌症和其他病症（例如與表現EGFR和cMET的細胞、較佳的是癌細胞的存在相關的癌症/病症）之方法。下文更詳細地描述該等方法。
上述拓撲異構酶I抑制劑的某些特徵係特別較佳的並且可以如下所示更詳細地定義。例如，將概述特徵Q X（例如在上述1a的連接子內）的較佳實例。
以下偏好可以應用於如上所述之本揭露之所有方面，或者可以涉及單個方面。該等偏好能以任何組合被組合在一起。 Q X
在一個實例中，Q係胺基酸殘基。胺基酸可為天然胺基酸或非天然胺基酸。例如，Q可以選自：Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg、和Trp，其中Cit係瓜胺酸。
在一個實例中，Q包含二肽殘基。二肽中的胺基酸可為天然胺基酸和非天然胺基酸的任何組合。在一些實例中，二肽包含天然胺基酸。當連接子係組織蛋白酶不穩定連接子時，二肽係組織蛋白酶介導的切割的作用位點。然後，二肽係組織蛋白酶的識別位點。
在一個實例中，Q選自： NH-Phe-Lys- C=O、 NH-Val-Ala- C=O、 NH-Val-Lys- C=O、 NH-Ala-Lys- C=O、 NH-Val-Cit- C=O、 NH-Phe-Cit- C=O、 NH-Leu-Cit- C=O、 NH-Ile-Cit- C=O、 NH-Phe-Arg- C=O、 NH-Trp-Cit- C=O、和 NH-Gly-Val- C=O； 其中Cit係瓜胺酸。
較佳的是，Q選自： NH-Phe-Lys- C=O、 NH-Val-Ala- C=O、 NH-Val-Lys- C=O、 NH-Ala-Lys- C=O、和 NH-Val-Cit- C=O。
更較佳的是，Q選自 NH-Phe-Lys- C=O、 NH-Val-Cit- C=O或 NH-Val-Ala- C=O。
其他合適的二肽組合包括： NH-Gly-Gly- C=O、 NH-Gly-Val- C=O NH-Pro-Pro- C=O、和 NH-Val-Glu- C=O。
可以使用其他二肽組合，包括由Dubowchik等人, Bioconjugate Chemistry[生物軛合化學], 2002, 13,855-869描述的那些，將其藉由援引併入本文。
在一些實例中，Q係三肽殘基。三肽中的胺基酸可為天然胺基酸和非天然胺基酸的任何組合。在一些實例中，三肽包含天然胺基酸。當連接子係組織蛋白酶不穩定連接子時，三肽係組織蛋白酶介導的切割的作用位點。然後，三肽係組織蛋白酶的識別位點。特別感興趣的三肽連接子係： NH-Glu-Val-Ala- C=O NH-Glu-Val-Cit- C=O NH-αGlu-Val-Ala- C=O NH-αGlu-Val-Cit- C=O
在一些實例中，Q係四肽殘基。四肽中的胺基酸可為天然胺基酸和非天然胺基酸的任何組合。在一些實例中，四肽包含天然胺基酸。當連接子係組織蛋白酶不穩定連接子時，四肽係組織蛋白酶介導的切割的作用位點。然後，四肽係組織蛋白酶的識別位點。特別感興趣的四肽連接子係： NH-Gly-Gly-Phe-Gly C=O；以及 NH-Gly-Phe-Gly-Gly C=O。
在一些實例中，四肽係： NH-Gly-Gly-Phe-Gly C=O。
在上述肽殘基的表示中， NH-表示殘基的N末端，並且- C=O表示殘基的C末端。C末端結合至A*的NH。
Glu表示麩胺酸的殘基，即： αGlu表示當經由α鏈結合時的麩胺酸的殘基，即：
在一個實例中，在適當的情況下，胺基酸側鏈被化學保護。側鏈保護基團可為如上所討論的基團。被保護的胺基酸序列可被酶切割。例如，包含Boc側鏈保護的Lys殘基的二肽序列可被組織蛋白酶切割。
胺基酸側鏈的保護基團係本領域熟知的，並且描述於Novabiochem公司目錄中，並且如上所述。 G L G L可以選自：
(G L1-1) (G L6)
(G L1-2) (G L7)
(G L2) (G L8)
(G L3-1) 其中NO 2基團係視需要的 (G L9)
(G L3-2) 其中NO 2基團係視需要的 (G L10)
(G L3-3) 其中NO 2基團係視需要的 (G L11)
(G L3-4) 其中NO 2基團係視需要的 (G L12)
(G L4) 其中Hal = I、Br、Cl (G L13)
(G L5) (G L14)
其中Ar表示C 5-6伸芳基基團，例如伸苯基，並且X'表示C 1-4烷基。
在一些實例中，G L選自G L1-1和G L1-2。在該等實例中的一些中，G L係G L1-1。 G LL G LL可以選自：
(G LL1-1) (G LL8-1)
(G LL1-2) (G LL8-2)
(G LL2) (G LL9-1)
(G LL3-1) (G LL9-2)
(G LL3-2) (G LL10)
(G LL-4) (G LL11)
(G LL5) (G LL12)
(G LL6) (G LL13)
(G LL7) (G LL14)
其中Ar表示C 5-6伸芳基基團，例如伸苯基，並且X'表示C 1-4烷基。CBA表示細胞結合劑或配體單元。
在一些實例中，G LL選自G LL1-1和G LL1-2。在該等實例中的一些中，G LL係G LL1-1。 XX較佳為： ，
其中a = 0至5，b1 = 0至16，b2 = 0至16，c = 0或1，d = 0至5，其中至少b1或b2 = 0並且至少c1或c2 = 0。
a可為0、1、2、3、4或5。在一些實例中，a係0至3。在該等實例中的一些中，a係0或1。在其他實例中，a係0。
b1可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些實例中，b1係0至12。在該等實例中的一些中，b1係0至8，並且可為0、2、3、4、5或8。
b2可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些實例中，b2係0至12。在該等實例中的一些中，b2係0至8，並且可為0、2、3、4、5或8。較佳的是，b1和b2中只有一個可以不是0。
c1可為0或1。c2可為0或1。較佳的是，c1和c2中只有一個可以不是0。
d可為0、1、2、3、4或5。在一些實例中，d係0至3。在該等實例中的一些中，d係1或2。在其他實例中，d係2。在其他實例中，d係5。
在X的一些實例中，a係0，b1係0，c1係1，c2係0並且d係2，並且b2可為0至8。在該等實例中的一些中，b2係0、2、3、4、5或8。在X的一些實例中，a係1，b2係0，c1係0，c2係0並且d係0，並且b1可為0至8。在該等實例中的一些中，b1係0、2、3、4、5或8。在X的一些實例中，a係0，b1係0，c1係0，c2係0並且d係1，並且b2可為0至8。在該等實例中的一些中，b2係0、2、3、4、5或8。在X的一些實例中，b1係0，b2係0，c1係0，c2係0並且a和d中的一個係0。a和d中的另一個係1至5。在該等實例中的一些中，a和d中的另一個係1。在該等實例中的其他實例中，a和d中的另一個係5。在X的一些實例中，a係1，b2係0，c1係0，c2係1，d係2，並且b1可為0至8。在該等實例中的一些中，b2係0、2、3、4、5或8。
在一些實例中，R L具有式Ib。在一些實例中，R LL具有式Ib'。
R L1和R L2可以獨立地選自H和甲基，或與它們所結合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團。
在一些實例中，R L1和R L2均為H。在一些實例中，R L1係H並且R L2係甲基。在一些實例中，R L1和R L2均為甲基。
在一些實例中，R L1和R L2與它們所鍵合的碳原子一起形成環丙烯基團。在一些實例中，R L1和R L2與它們所鍵合的碳原子一起形成環丁烯基。
在基團Ib中，在一些實例中，e係0。在其他實例中，e係1並且硝基基團可以在環的任何可用位置。在該等實例中的一些中，它處於鄰位。在該等實例的其他實例中，它處於對位。
在其中以單一鏡像異構物或以鏡像異構物富集的形式提供本文所述之化合物的一些實例中，鏡像異構物富集形式具有大於60 : 40、70 : 30、80 : 20或90 : 10的鏡像異構物比率。在其他實例中，鏡像異構物比率大於95 : 5、97 : 3或99 : 1。
在一些實例中，R L選自：
(i)
(ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
(vii)
(viii)
(ix)
在一些實例中，R LL係衍生自上述R L基團的基團。
已經概述了上述偏好，現在描述某些較佳的拓撲異構酶I-連接子（例如，藥物連接子單元）式。
在一些實例中，式 I化合物具有式 I P ： ； 及其鹽和溶劑化物，其中R LP係用於連接至本文所述之抗體或其抗原結合片段的連接子，其中所述連接子選自： (ia)： ， 其中 Q P係： ，其中Q XP使得Q P為胺基酸殘基、二肽殘基或三肽殘基； X P係： ， 其中aP = 0至5，bP = 0至16，cP = 0或1，dP = 0至5； G L係用於連接至本文所述之抗體或其抗原結合片段（例如，配體單元）的連接子； (ib)： ， 其中R L1和R L2獨立地選自H和甲基，或與它們所鍵合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團；以及 e係0或1。
aP可為0、1、2、3、4或5。在一些實例中，aP係0至3。在該等實例中的一些中，aP係0或1。在其他實例中，aP係0。
bP可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些實例中，b係0至12。在該等實例中的一些中，bP係0至8，並且可為0、2、4或8。
cP可為0或1。
dP可為0、1、2、3、4或5。在一些實例中，dP係0至3。在該等實例中的一些中，dP係1或2。在其他實例中，dP係2。
在X P的一些實例中，aP係0，cP係1並且dP係2，並且bP可為0至8。在該等實例中的一些中，bP係0、4或8。
上述對於具有式 I的化合物的Q X的偏好可以適用於Q XP（例如，在適當的情況下）。
上述對於具有式 I的化合物的G L、R L1、R L2和e的偏好可以適用於具有式 I P 的化合物。
在一些實例中，式 IV的軛合物具有式 IV P ： L - (D LP) p( IV P ) 或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中L係本文所述之抗體或其抗原結合片段（例如，配體單元），D LP係拓撲異構酶I抑制劑（例如，藥物連接子單元）並且具有式III P： ； R LLP係連接至該抗體或其抗原結合片段（例如，配體單元）的連接子，其中所述連接子選自 (ia')： ， 其中Q P和X P如以上所定義，並且G LL係連接至本文所述之抗體或其抗原結合片段（例如，配體單元）的連接子；以及 (ib')： ， 其中R L1和R L2如以上所定義；以及 p係1至20的整數。
在一些實例中，式 I化合物具有式 I P2 ： ； 及其鹽和溶劑化物，其中R LP2係用於連接至本文所述之抗體或其抗原結合片段的連接子，其中所述連接子選自： (ia)： ， 其中 Q係： ，其中Q X使得Q為胺基酸殘基、二肽殘基、三肽殘基或四肽殘基； X P2係： ， 其中aP2 = 0至5，b1P2 = 0至16，b2P2 = 0至16，cP2 = 0或1，dP2 = 0至5，其中至少b1P2或b2P2 = 0（即b1和b2中只有一個可以不是0）； G L係用於連接至本文所述之抗體或其抗原結合片段（例如，配體單元）的連接子； (ib)： ， 其中R L1和R L2獨立地選自H和甲基，或與它們所鍵合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團；以及 e係0或1。
aP2可為0、1、2、3、4或5。在一些實例中，aP2係0至3。在該等實例中的一些中，aP2係0或1。在其他實例中，aP2係0。
b1P2可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些實例中，b1P2係0至12。在該等實例中的一些中，b1P2係0至8，並且可為0、2、3、4、5或8。
b2P2可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些實例中，b2P2係0至12。在該等實例中的一些中，b2P2係0至8，並且可為0、2、3、4、5或8。
較佳的是，b1P2和b2P2中只有一個可以不是0。
cP2可為0或1。
dP2可為0、1、2、3、4或5。在一些實例中，dP2係0至3。在該等實例中的一些中，dP2係1或2。在其他實例中，dP2係2。在其他實例中，dP2係5。
在X P2的一些實例中，aP2係0，b1P2係0，cP2係1並且dP2係2，並且b2P2可為0至8。在該等實例中的一些中，b2P2係0、2、3、4、5或8。在X P2的一些實例中，aP2係1，b2P2係0，cP2係0並且dP2係0，並且b1P2可為0至8。在該等實例中的一些中，b1P2係0、2、3、4、5或8。在X P2的一些實例中，aP2係0，b1P2係0，cP2係0並且dP2係1，並且b2P2可為0至8。在該等實例中的一些中，b2P2係0、2、3、4、5或8。在X P2的一些實例中，b1P2係0，b2P2係0，cP2係0並且aP2和dP2中的一個係0。aP2和d中的另一個係1至5。在該等實例中的一些中，aP2和d中的另一個係1。在該等實例中的其他實例中，aP2和dP2中的另一個係5。
上述對於具有式 I的化合物的Q X的偏好可以適用於式Ia P2中的Q X（例如，在適當的情況下）。
上述對於具有式 I的化合物的G L、R L1、R L2和e的偏好可以適用於具有式 I P2 的化合物。
在一些實例中，式 IV的軛合物具有式 IV P2 ： L - (D LP2) p( IV P2 ) 或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中L係本文所述之抗體或其抗原結合片段（例如，配體單元），D LP2係拓撲異構酶I抑制劑（例如，藥物連接子單元）並且具有式III P2： ； R LLP2係連接至該抗體或其抗原結合片段（例如，配體單元）的連接子，其中所述連接子選自 (ia')： ， 其中Q和X P2如以上所定義，並且G LL係連接至該抗體或其抗原結合片段的連接子；以及 (ib')： ， 其中R L1和R L2如以上所定義；以及 p係1至20的整數。
特別合適的拓撲異構酶I抑制劑包括具有以下式的那些： (SG3932)； (SG4010)； (SG4057)； (SG4052)；和/或 。
SG3932係特別較佳的。因此，在較佳的實例中，本文所述之抗體分子軛合至具有下式的拓撲異構酶I抑制劑（例如SG3932）： （SG3932）。
為了避免疑問，數字「8」指定，方括號內的結構重複八次。因此，SG3932的另一種表示係： 。
SG4010的另一種表示係： 。
SG4057的另一種表示係： 。
SG4052的另一種表示係： 。
本文所述之任何抗體或其抗原結合片段可以軛合至所述拓撲異構酶I抑制劑中的一或多種。 拓撲異構酶 I 抑制劑之合成
為了完成，現在將描述用於製備一或多種較佳的拓撲異構酶I抑制劑的某些通用合成路線。
具有式I的化合物（其中R L具有式Ia）可以從具有式2的化合物： ； （其中R L*係-QH）藉由連接具有式3的化合物： ， 或其活化版本來合成。
這樣的反應可以在醯胺偶合條件下進行。
具有式2的化合物可以藉由具有式4的化合物： ； （其中R L*prot係-Q-Prot N，其中Prot N係胺保護基團）的去保護合成。
具有式4的化合物可以藉由具有式5的化合物： ； 與化合物A3的偶合，使用弗裡德蘭德反應（Friedlander reaction）合成。
具有式5的化合物可以從具有式6的化合物： ； 藉由除去三氟乙醯胺保護基團來合成。
具有式6的化合物可以藉由以下偶合合成：R L*prot-OH至化合物I7。
具有式I的化合物（其中R L具有式Ia或Ib）可以從化合物I11藉由化合物R L-OH或其活化形式的偶合來合成。
胺保護基團： 胺保護基團係熟悉該項技術者已知的。特別參考以下文獻中的合適的保護基團的揭露：Greene's Protecting Groups in Organic Synthesis [有機合成中的格林氏保護基團], 第四版, John Wiley & Sons [約翰威利父子公司], 2007 (ISBN 978-0-471-69754-1), 第696-871頁。
載藥量（p）係每個抗體分子的藥物（例如微管溶素或拓撲異構酶抑制劑）的平均數量。在本揭露之組成物中，載藥量的範圍為每個抗體分子1至20種藥物（D）。例如，載藥量的範圍可以為每個抗體分子1至10種藥物（D），即其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種藥物共價連接至抗體分子。軛合物的組成包括與1至10種藥物軛合的抗體分子之集合。在本揭露之化合物結合至離胺酸的情況下，載藥量的範圍可以為每個抗體分子1至80種藥物（D），但是上限可能較佳的是40、20、10或8。軛合物的組成包括與1至80、1至40、1至20、1至10或1至8種藥物軛合的抗體分子之集合。
來自軛合反應的軛合物製劑中每個抗體的藥物的平均數量可以藉由常規方法諸如UV、逆相HPLC、HIC、質譜、ELISA測定和電泳表徵。還可以確定軛合物在p方面的定量分佈。藉由ELISA，可以確定特定軛合物製劑中p的平均值（Hamblett, 2004；Sanderson, 2005）。然而，藉由ELISA的抗體-抗原結合和檢測限制不能辨別p（藥物）值的分佈。另外，用於檢測軛合物的ELISA測定不能確定藥物部分附接至抗體分子的位置，諸如重鏈或輕鏈片段，或特定胺基酸殘基。在一些實例中，均質軛合物（其中p係來自具有其他載藥量的軛合物的確定值）的分離、純化和表徵可以藉由例如逆相HPLC或電泳來實現。此類技術也適用於其他類型的軛合物。
對於一些軛合物，p可能受到抗體分子上附接位點數量的限制。例如，抗體分子可以僅具有一個或幾個半胱胺酸硫醇基團，或者可以僅具有一個或幾個足夠反應性的硫醇基團，可以通過所述基團附接連接子。
通常，在軛合反應期間，與抗體分子軛合的藥物少於理論最大值。抗體分子可以含有例如許多不與連接子（L）反應的離胺酸殘基。僅最具反應性的離胺酸基團可與胺反應性連接子試劑反應。而且，僅最具反應性的半胱胺酸硫醇基團可以與硫醇反應性連接子試劑反應。通常，抗體分子不含有許多（如果有的話）可與藥物部分連接的游離和反應性半胱胺酸硫醇基團。軛合物的抗體分子中的大多數半胱胺酸硫醇殘基以二硫橋形式存在，必須在部分或全部還原條件下用還原劑（如二硫蘇糖醇（DTT）或TCEP）還原。軛合物的負載（藥物/抗體比）可以通過幾種不同的方式進行控制，包括：(i) 限制相對於抗體的莫耳過量的藥物連接子，(ii) 限制軛合反應時間或溫度，以及 (iii) 半胱胺酸硫醇修飾的部分或限制性還原條件。
某些抗體分子具有可還原的鏈間二硫鍵，即半胱胺酸橋。藉由用還原劑例如DTT（二硫蘇糖醇）處理，可使抗體分子具有反應性以與連接子試劑進行軛合。因此，每個半胱胺酸橋理論上將形成兩個反應性硫醇親核體。該過程也被稱為「經典軛合」，並且差異於諸如在已被工程化到抗體分子中的特定位點的半胱胺酸處發生軛合之方法。通過離胺酸與2-亞胺基硫烷（尤特奇試劑（Traut's reagent））反應，可以將另外的親核基團引入抗體，從而導致胺轉化為硫醇。
藉由經典軛合，藉由部分還原抗體，然後用所希望的連接子-藥物反應來製備具有隨機軛合至天然半胱胺酸殘基的藥物的ADC。例如，可以藉由在pH 8.0添加約3莫耳當量的DTT，隨後在約37°C下孵育約2小時，將濃度為5 mg/mL的抗體部分還原。然後可以將還原反應在冰中冷卻，並例如通過滲濾除去過量的DTT。然後可以以約1 : 10的連接子-藥物/硫醇莫耳比添加連接子-藥物。軛合反應可以在約10% v/v DMSO的存在下進行。軛合後，可以添加過量游離的半胱胺酸（超過連接子-藥物約2倍莫耳比）以淬滅未反應的連接子-藥物以產生半胱胺酸-連接子-藥物加合物。然後可以將反應混合物進行純化（例如，藉由疏水性相互作用層析法），並將緩衝液更換為PBS。可以使用標準方法（諸如疏水性相互作用層析法和還原逆相層析法）確定載藥量分佈，如別處所述。
使用藉由涉及 N-烷基馬來醯亞胺的抗體分子鏈間二硫鍵的還原產生的溶劑可及硫醇的直接軛合來製備軛合物的方法係已知的。其他方法使用 N-羥基琥珀醯亞胺酯在離胺酸的一級胺處軛合藥物。這樣的方法在例如Gébleux和Casi, Pharmacol Ther (2016) 167: 48-59中進行了綜述，其藉由援引全文併入本文。
單獨地或除了上述經典軛合方法之外，還可以使用位點特異性軛合，即其中載藥量和軛合位點受到控制的方法。這可以藉由例如在特定殘基處工程化半胱胺酸、用生物正交反應性或酶連接方法用非天然胺基酸替換殘基來實現。位點特異性軛合的一種方法在Dimasi, 2017中進行了描述，該文獻藉由援引全文併入本文，並且涉及將半胱胺酸插入抗體分子的特定位置。
半胱胺酸胺基酸可以在抗體分子中的反應位點處工程化並且不形成鏈內或分子間二硫鍵（Junutula, 2008；Dornan, 2009；US 7521541；US 7723485；WO 2009/052249）。工程化半胱胺酸硫醇可以與具有硫醇反應性親電基團諸如馬來醯亞胺或α-鹵代醯胺的本文所述之連接子或藥物-連接子反應以與半胱胺酸工程化抗體分子和藥物形成軛合物。因此可以設計、控制和知道藥物的位置。由於工程化半胱胺酸硫醇基團通常以高產率與硫醇反應性連接子試劑或藥物連接子試劑反應，因此可以控制載藥量。藉由在重鏈或輕鏈上的單個位點進行取代，對IgG抗體進行工程化以引入半胱胺酸胺基酸，在對稱抗體上給出兩個新的半胱胺酸。如果需要，可以達到接近2的載藥量，其中軛合產物接近均質性。
在一些實例中，本揭露之軛合物的抗體分子包含CH區並且藥物在插入在CH區的位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸處化學軛合，其中恒定區的編號按照EU索引。因此，抗體分子與藥物之間的連接可以通過該插入的半胱胺酸胺基酸和連接子上的末端馬來醯亞胺基團。
包含插入在CH區的位置239與240之間的半胱胺酸的CH區的實例係SEQ ID NO: 43和SEQ ID NO: 45。包含CH區的重鏈的實例係SEQ ID NO: 50、53和56，該CH區包含插入在CH區的位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸。
在其他實例中，軛合物的抗體分子不包含插入到CH區中的任何胺基酸殘基。在特定實例中，軛合物的抗體分子不包含插入到CH區中的半胱胺酸胺基酸（例如在位置239與240之間，其中恒定區的編號按照EU索引）。如實例（例如實例12）中所證明的，在使用經典軛合將藥物-連接子軛合至天然半胱胺酸的情況下，插入的半胱胺酸不是必需的。
不包含插入到CH區中的任何胺基酸殘基的CH區的實例係SEQ ID NO: 44、46、63和64。包含不包含插入到CH區中的任何胺基酸殘基的CH區的重鏈的實例係SEQ ID NO: 51、54、57、59和60。
當抗體分子的一個以上親核或親電基團與藥物-連接子中間體或連接子試劑反應，然後與藥物試劑反應時，則所得產物係軛合化合物的混合物，其中附接在抗體上的藥物分佈為例如1、2、3等。液相層析法（如聚合逆相（PLRP）和疏水相互作用（HIC））可以藉由藥物負載值來分離混合物中的化合物。可以分離具有單個藥物負載值（p）的軛合物的製劑，但是，該等單個負載值軛合物仍可能是異質混合物，因為藥物可以經由連接子附接到抗體分子上的不同位點。
因此，本揭露之軛合物組成物包括抗體-藥物軛合物化合物的混合物，其中抗體具有一或多個藥物部分（例如微管溶素或拓撲異構酶抑制劑）並且其中藥物部分可以在各種胺基酸殘基處連接至抗體分子。
在一些實例中，每個抗體分子的微管溶素藥物部分的平均數量在1至8之範圍內。在一些實例中，該範圍選自1至6、1至4、1至3，較佳的是1至2，更較佳的是1.5至2，甚至更較佳的是1.8至2，還更較佳的是1.9至2。
如上文已經描述，在一些實例中，ADC的抗體分子可以在重鏈的CH區中包含一或多個突變以減少或消除抗體分子與一或多種Fcγ受體的結合。因此，本文所述之ADC的第一重鏈和/或第二重鏈可以包含位置234處的苯丙胺酸（F）、位置235處的麩胺酸（E）和位置331處的絲胺酸（S），其中編號按照EU索引。 抗體分子和軛合物的功能性質
本文所述之抗體分子和軛合物可以藉由參考某些功能性質來表徵。 結合親和力
本文所述之抗體分子和軛合物的特徵可以在於結合對EGFR具有特定親和力的EGFR的抗原結合結構域和/或結合對c-Met具有特定親和力的c-Met的抗原結合結構域。抗體分子或軛合物與同源抗原諸如人、小鼠或食蟹猴EGFR或c-Met的結合親和力可藉由表面等離振子共振（SPR），使用例如Biacore測定。可以使用抗體分子確定結合親和力，例如作為包含結合EGFR之第一抗原結合結構域和結合c-Met之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體分子的一部分。替代性地，可以使用對EGFR或c-Met具有單特異性的抗體分子確定結合親和力。在一些實例中，使用如實例2.1中所述之BIACore確定結合親和力。
結合親和力通常藉由Kd（抗原結合結構域與其抗原之間的平衡解離常數）測量。眾所周知，Kd值越低，抗原結合結構域的結合親和力越高。例如，以10 nM的Kd結合靶標的抗原結合結構域將被認為以高於以100 nM的Kd結合相同靶標的抗原結合結構域之親和力結合所述靶標。
提及人EGFR可以指包含EGFR胞外結構域的多肽，諸如具有SEQ ID NO: 68中列出的胺基酸序列之多肽。提及小鼠EGFR可以指由可從義翹神州（SinoBiological）獲得的目錄號51091-M08H的分子產生的多肽。提及食蟹猴EGFR可以指SEQ ID NO: 69中列出的胺基酸序列。提及人c-Met可以指具有SEQ ID NO: 70中列出的胺基酸序列之多肽。提及小鼠c-Met可以指具有SEQ ID NO: 90中列出的胺基酸序列之多肽或指由可從義翹神州獲得的目錄號50622-M08H的分子產生的多肽。提及食蟹猴c-Met可以指SEQ ID NO: 71中列出的胺基酸序列。 EGFR 親和力
本文所述之抗體分子和軛合物可包含以低親和力結合EGFR的抗原結合結構域。已知EGFR在正常組織例如皮膚中以低水平表現。預期以低親和力結合EGFR的抗體分子和軛合物有利地在正常組織中顯示出降低的靶上毒性，同時仍能夠靶向表現高水平EGFR的腫瘤，從而提高安全性。此外，如本文所證明的，與包含更高親和力EGFR抗原結合結構域之軛合物相比，包含該低親和力EGFR抗原結合結構域之軛合物在治療癌症方面更有效。
結合EGFR的抗原結合結構域可以以Kd等於或高於10 nM、15 nM、20 nM、25 nM、30 nM、35 nM或40 nM的親和力結合人EGFR。替代性地，結合EGFR的抗原結合結構域可以以介於10和100 nM之間、介於20和100 nM之間、介於30和100 nM之間、介於40和100 nM之間、介於10和80 nM之間、介於20和80 nM之間、介於30和80 nM之間、介於40和80 nM之間、介於10和70 nM之間、介於20和70 nM之間、介於30和70 nM之間、介於40和70 nM之間、介於10和60 nM之間、介於20和60 nM之間、介於30和60 nM之間、介於40和60 nM之間、介於10和50 nM之間、介於20和50 nM之間、介於30和50 nM之間或介於40和50 nM之間的Kd結合人EGFR。
結合EGFR的抗原結合結構域可以以低於包含分別在SEQ ID NO: 53和55中列出的抗體分子QD6的重鏈序列和輕鏈序列的抗原結合結構域之親和力的親和力結合人EGFR。
例如，結合EGFR的抗原結合結構域可以以Kd係包含分別在SEQ ID NO: 53和55中列出的抗體分子QD6的重鏈序列和輕鏈序列的抗原結合結構域結合人EGFR的Kd的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍或7倍的親和力結合人EGFR。替代性地，結合EGFR的抗原結合結構域可以以Kd係包含分別在SEQ ID NO: 53和55中列出的抗體分子QD6的重鏈序列和輕鏈序列的抗原結合結構域結合人EGFR的Kd的介於2倍和10倍之間、介於3倍和10倍之間、介於4倍和10倍之間、介於5倍和10倍之間、介於6倍和10倍之間、介於7倍和10倍之間、介於2倍和9倍之間、介於3倍和9倍之間、介於4倍和9倍之間、介於5倍和9倍之間、介於6倍和9倍之間、介於7倍和9倍之間、介於2倍和8倍之間、介於3倍和8倍之間、介於4倍和8倍之間、介於5倍和8倍之間、介於6倍和8倍之間、介於7倍和8倍之間的親和力結合人EGFR。
結合EGFR的抗原結合結構域可以以與包含分別在SEQ ID NO: 16和20中列出的抗體分子RAA22的可變重鏈區序列和可變輕鏈區序列的抗原結合結構域之親和力相似的親和力結合人EGFR。例如，結合EGFR的抗原結合結構域可以以Kd與包含分別在SEQ ID NO: 16和20中列出的抗體分子RAA22的可變重鏈區序列和可變輕鏈區序列的抗原結合結構域結合人EGFR的Kd相差不到5倍、相差不到4倍、相差不到3倍、相差不到2倍、相差不到1倍或相差不到0.5倍的親和力結合人EGFR。
結合EGFR的抗原結合結構域也可以結合食蟹猴EGFR。例如，結合EGFR的抗原結合結構域可以以Kd小於700 nM、小於600 nM、小於500 nM、小於400 nM、小於300 nM或小於250 nM的親和力結合食蟹猴EGFR。替代性地，結合EGFR的抗原結合結構域可以以Kd介於100和700 nM之間、介於100和600 nM之間、介於100和500 nM之間、介於100和400 nM之間、介於100和300 nM之間、介於150和250 nM之間、介於100和200 nM之間的親和力結合食蟹猴EGFR。結合EGFR的抗原結合結構域可以以小於或等於抗原結合結構域結合人EGFR的Kd的10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍的Kd結合食蟹猴EGFR。
結合EGFR的抗原結合結構域也可以結合小鼠EGFR。例如，結合EGFR的抗原結合結構域可以以Kd小於1 µM、小於900 nM、小於800 nM、小於700 nM、小於600 nM或小於650 nM的親和力結合小鼠EGFR。替代性地，結合EGFR的抗原結合結構域可以以介於100 nM和1 µM之間、介於200 nM和900 nM之間、介於300 nM和800 nM之間、介於400 nM和700 nM之間、介於400 nM和600 nM之間或介於450 nM和550 nM之間的Kd結合小鼠EGFR。
較佳的是，結合EGFR的抗原結合結構域能夠結合人EGFR和食蟹猴EGFR。這種交叉反應性係有利的，因為它允許在臨床前開發期間在食蟹猴中進行抗體分子和軛合物的劑量和安全性測試。甚至更較佳的是，結合EGFR的抗原結合結構域能夠結合人EGFR、食蟹猴EGFR和小鼠EGFR。例如，結合EGFR的抗原結合結構域能夠以上述Kd值結合人EGFR、食蟹猴EGFR和小鼠EGFR（例如以介於10-100 nM之間的Kd結合人EGFR，以介於100和700 nM之間的Kd結合食蟹猴EGFR和以介於100 nM和1 µM之間的Kd結合小鼠EGFR）。 c-Met 親和力
結合c-Met的抗原結合結構域可以以Kd低於20 nM、15 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM或2.5 nM的親和力結合人c-Met。替代性地，結合c-Met的抗原結合結構域可以以Kd介於1和20 nM之間、介於1和15 nM之間、介於1和10 nM之間、介於1和9 nM之間、介於1和8 nM之間、介於1和7 nM之間、介於1和6 nM之間、介於1和5 nM之間、介於1和4 nM之間、介於1和3 nM之間、介於1和2.5 nM之間、介於2和2.5 nM之間的親和力結合人c-Met。
結合c-Met的抗原結合結構域可以結合食蟹猴c-Met。例如，結合c-Met的抗原結合結構域可以以Kd低於30 nM、25 nM、20 nM、15 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM或2.5 nM的親和力結合食蟹猴c-Met。替代性地，結合c-Met的抗原結合結構域可以以Kd介於1和20 nM之間、介於1和15 nM之間、介於1和10 nM之間、介於1和9 nM之間、介於1和8 nM之間、介於1和7 nM之間、介於1和6 nM之間、介於1和5 nM之間、介於1和4 nM之間、介於1和3 nM之間、介於1和2.5 nM之間、介於2和2.5 nM之間的親和力結合食蟹猴c-Met。結合c-Met的抗原結合結構域可以以Kd小於或等於抗原結合結構域結合人c-Met的Kd的10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍、1倍的親和力結合食蟹猴c-Met。
較佳的是，結合c-Met的抗原結合結構域能夠結合人c-Met和食蟹猴c-Met。這種交叉反應性係有利的，因為它允許在臨床前開發期間在食蟹猴中進行抗體分子的劑量和安全性測試。例如，結合c-Met的抗原結合結構域能夠以上述Kd值結合人c-Met和食蟹猴c-Met（例如以介於1和20 nM之間的Kd結合人c-Met和以介於1和20 nM之間的Kd結合食蟹猴c-Met）。 特異性結合
本文所述之抗體分子和軛合物可包含結合EGFR的抗原結合結構域，其係特異性結合EGFR的抗原結合結構域。本文所述之抗體分子和軛合物可包含結合c-Met的抗原結合結構域，其係特異性結合c-Met的抗原結合結構域。本文所述之抗體分子和軛合物可包含結合EGFR之第一抗原結合結構域（其係特異性結合EGFR之第一抗原結合結構域）和結合c-Met之第二抗原結合結構域（其係特異性結合c-Met之第一抗原結合結構域）。
術語「特異性」可指抗原結合結構域將不顯示與除其特異性結合配偶體（此處為EGFR或c-Met）以外的分子的任何顯著結合的情況。此類分子被稱為「非靶分子」。術語「特異性」也適用於抗體分子對許多抗原攜帶的特定表位（諸如EGFR或c-Met上的表位）具有特異性的情況，在這種情況下抗體分子將能夠結合攜帶該表位的各種抗原。
在一些實例中，如果與非靶分子的結合程度小於抗體與靶標的結合的約10%，如例如藉由ELISA、SPR、生物膜干涉技術（BLI）、微量熱泳動（MST）或藉由放射免疫測定法（RIA）所測量的，則認為抗體分子或軛合物未表現出與非靶標分子的任何顯著結合。替代性地，結合特異性可以用結合親和力來反映，其中本文所述之抗體分子或軛合物以比對另一種非靶分子的親和力大至少0.1個數量級的親和力結合EGFR和/或c-Met。在一些實例中，本揭露之抗體分子或軛合物以比對另一種非靶分子的親和力大至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5或2.0個數量級之一的親和力結合EGFR和/或c-Met。
EGFR係ErbB受體家族即以下四種密切相關的受體酪胺酸激酶的亞家族的成員：EGFR、HER2、HER3和HER4。RAA22抗原結合結構域不顯示與HER2、HER3和HER4結合，表明該抗原結合結構域特異性結合EGFR。因此，在較佳的情況下，結合EGFR的抗原結合結構域不結合或不顯示與HER2、HER3或HER4的任何顯著結合。
c-Met係包括Ron和Sema 4a的受體酪胺酸激酶亞家族的成員。B09-GL抗原結合結構域不顯示與Ron和Sema 4a結合，表明該抗原結合結構域特異性結合c-Met。因此，在較佳的實例中，結合c-Met的抗原結合結構域不結合或不顯示與Ron、Sema 4a的任何顯著結合。 同時接合
包含本文所述之結合EGFR之第一抗原結合結構域和結合c-Met之第二抗原結合結構域的抗體分子和軛合物的特徵可在於這兩個抗原結合結構域同時接合它們各自的EGFR和c-Met靶標的能力。具有同時接合EGFR和c-Met的能力的抗體分子和軛合物預期係有利的，因為已知許多腫瘤共表現EGFR和c-Met兩者，並且因此可被本揭露之抗體分子靶向。因此，在一些實例中，抗體分子或軛合物能夠同時接合EGFR和c-Met。
可以例如藉由使用表現大致等量的EGFR和c-Met的細胞系和包含具有EGFR和c-Met抗原結合結構域的抗體分子之軛合物的體外細胞毒性測定來確定同時接合。如果軛合物中的單個抗原結合結構域獨立地起遞送藥物的作用，則預期阻斷該細胞系中的任一靶標將僅適度地降低軛合物的活性，使IC50移動2倍或更少，因為靶標以相似的水平存在。EGFR和c-Met靶標在該測定中可藉由使用例如結合EGFR或c-Met上相同區域但缺乏能夠誘導細胞毒性的藥物的單特異性抗體分子來阻斷。例如，單特異性抗體分子可以含有與測試的軛合物相同的結合EGFR的抗原結合結構域，或相同的結合c-Met的抗原結合結構域。另一方面，如果軛合物需要同時接合以有效地將軛合物遞送到細胞中，則阻斷任一靶標將可能對軛合物的活性具有更大的影響。也就是說，如果在使用該測定時阻斷任一靶標後IC50發生至少2倍、較佳的是至少5倍、甚至更較佳的是至少10倍的變化，則認為抗體分子能夠同時接合兩個靶標。
確定同時接合的另一種方法係在體外細胞毒性測定中比較雙特異性EGFR-c-Met軛合物與一價、單特異性對照軛合物的活性。對照軛合物包含一個針對EGFR或c-Met的抗原結合結構域和一個非結合同種型抗體對照抗原結合結構域。如果雙特異性軛合物中的每個抗原結合結構域獨立地起作用，則預期結果將是每個單特異性對照軛合物將僅適度地比雙特異性軛合物效力低，並且差異將係相加的。替代性地，如果雙特異性軛合物的兩個抗原結合結構域藉由同時結合而協同作用，則預期雙特異性軛合物的活性與單特異性對照抗體相比有較大差異。也就是說，如果雙特異性軛合物導致IC50的變化大於使用單特異性對照軛合物觀察到的IC50變化的總和，則認為抗體分子能夠同時接合兩個靶標。
該等測量同時接合的方法的更多詳細資訊可以在實例中找到。 抗體內化
本文所述之抗體分子和軛合物可藉由它們介導有效內化的能力來表徵。這對於軛合物特別有用，因為它確保軛合物內化到細胞中並遞送到溶酶體，在溶酶體中抗體分子隨後被降解並且藥物釋放到細胞中，在細胞中它發揮其細胞作用，例如細胞毒性。
細胞對抗體分子或軛合物的內化可藉由將活細胞與抗體分子接觸並在足夠的內化時間後檢測抗體分子或軛合物來分析。內化可以藉由檢測抗體分子或軛合物的定位來確定。當抗體分子或軛合物保留在細胞表面上時（例如在細胞表面上檢測到，和/或在細胞內未檢測到），確定抗體分子或軛合物未被內化。當在細胞內檢測到抗體分子或軛合物時（例如定位於細胞質或細胞器），確定抗體分子或軛合物已被內化。
用於顯現抗體分子或軛合物係否能夠介導有效內化的示例性方法包括用在酸性pH下顯示螢光的pH敏感性染料標記抗體分子，並將該等標記的抗體分子或軛合物添加到細胞。可藉由監測螢光來檢測細胞內化。如果觀察到的螢光在一定時間段（例如48小時）大於標記的非結合對照抗體分子或軛合物的螢光，則認為抗體分子或軛合物能夠介導內化並遞送至溶酶體。這種顯現抗體內化的方法的更多詳細資訊可以在實例中找到。
包含結合EGFR之第一抗原結合結構域和結合c-Met之第二抗原結合結構域的抗體分子或軛合物之特徵在於與EGFR或c-Met單特異性對照相比它們介導更有效內化的能力。預期表現出這種性質的抗體分子和軛合物係有利的，因為預期它們對共表現兩種靶標的腫瘤細胞表現出更大的選擇性，並且可以使抗體分子在不表現出顯著水平的共表現的正常組織中的影響最小化。 體外活性
本文所述之抗體分子或軛合物的特徵可在於它們的細胞毒性活性，即它們殺死細胞的能力。細胞毒性活性可以使用體外細胞活力測定諸如CellTiter-Glo ®（Promega）測定來測量。在一些實例中，細胞係表現EGFR和c-Met兩者的細胞。
抗體分子的效力可以表示為IC50值。IC50係抗體分子的半數抑制濃度。在功能測定中，IC50係將生物響應降低其最大值的50%的濃度。IC50可以藉由本領域已知的任何數目的手段來計算。
在一些實例中，當使用體外細胞活力測定測量時，本文所述之具有細胞毒性活性的抗體分子或軛合物具有小於4000 pM、小於3500 pM、小於3000 pM、小於2500 pM、小於2000 pM、小於1500 pM、小於1000 pM、小於500 pM、小於400 pM、小於300 pM、小於250 pM、小於200 pM、小於150 pM或小於100 pM的IC50。在一些實例中，本文所述之抗體分子或軛合物可具有60 pM至500 pM的IC50。
在一些實例中，與表現低水平的EGFR和c-Met中的一種或另一種的細胞相比，本文所述之抗體分子或軛合物能夠增加對表現顯著量的EGFR和c-Met兩者的細胞（例如腫瘤細胞）的殺傷。表現顯著量的EGFR和c-Met的細胞可以藉由測量細胞表面的相對受體密度來確定。例如，在細胞表面以大於15,000的相對受體密度表現EGFR和c-Met的細胞可以被認為是表現顯著量的EGFR和c-Met兩者的細胞，以及在細胞表面以15,000或更低的相對受體密度表現EGFR和c-Met之一的細胞。相對EGFR和c-Met密度可例如使用如實例中所述之Quantum MESF定量FACS測定套組（kit）測量。
表現顯著量的EGFR和c-Met的細胞的實例可以包括NCI H596、HCC 827 GR Pool、A549、NCI H1792、NCI H1975、NCI H292和NCI H358細胞系。以低相對受體密度表現EGFR和c-Met之一的細胞之實例可以包括A427、NCI H23和NCI H661（Ag陰性）細胞系。該等細胞系可通過ATCC獲得。
在一些實例中，本文所述之抗體分子或軛合物能夠在對酪胺酸激酶抑制劑（TKI）有抗性的細胞中具有細胞毒性活性。TKI抗性細胞的實例可包括NCI H1975（EGFR突變：T790M、L858R）和HCC827 GR Pool（EGFR Δ746-750缺失+ MET擴增）。 體內活性
在一些實例中，本文所述之抗體分子或軛合物能夠抑制癌症的發展或進展。
癌症可為表現EGFR和c-Met兩者的癌症。癌細胞可以在細胞表面表現EGFR和c-Met。癌症可為例如肺癌（諸如非小細胞肺癌（NSCLC））、胰臟癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、頭頸癌、卵巢癌或神經膠母細胞瘤。
可以例如使用體內模型分析給定抗體分子或軛合物抑制癌症發展或進展的能力。例如，體內模型可涉及測量患者來源的異種移植物（PDX）模型中的腫瘤生長。該示例性方法的更多詳細資訊在實例中進行了描述。
對癌症發展的抑制可以藉由觀察投與抗體分子或軛合物後腫瘤生長減慢或腫瘤大小減小來推斷，例如藉由測量腫瘤生長抑制（%TGI）。%TGI可以藉由以下方法測量：將投與抗體分子或軛合物的那些受試者在第0天測量的腫瘤大小與在研究時間結束時測量的腫瘤大小進行比較，並將其與在相同時間段內投與對照抗體分子或軛合物的受試者的腫瘤生長進行比較。這樣，根據下式，%TGI可以定義為治療（TX）組與對照（C）組之間相對於第0天的腫瘤生長百分比：%TGI = (1 -(TX 最終-TX 初始)/(C 最終-C 初始)) x 100。
在一些實例中，本文所述之抗體分子或軛合物具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的%TGI。
癌症發展的抑制可以藉由觀察響應於抗體分子治療的癌症症狀的延遲或預防發作和/或嚴重程度降低來推斷。癌症進展的抑制可以藉由觀察響應於抗體分子治療的延遲、預防和/或減少的侵襲和/或轉移來推斷。
本文所述之抗體分子可能能夠抑制癌症的發展或進展，使其低於在沒有用抗體分子治療（或用適當的對照治療）的情況下的癌症的發展/進展的小於100%，例如99%或更小、95%或更小、90%或更小、85%或更小、75%或更小、70%或更小、65%或更小、60%或更小、55%或更小、50%或更小、45%或更小、40%或更小、35%或更小、30%或更小、25%或更小、20%或更小、15%或更小、10%或更小、5%或更小或1%或更小中的一個。在一些實例中，本文所述之抗體分子能夠抑制癌症的發展或進展至在沒有用抗體分子治療（或用適當的對照治療）的情況下的癌症的發展/進展水平的小於1倍，例如 ≤ 0.99倍、≤ 0.95倍、≤ 0.9倍、≤ 0.85倍、≤ 0.8倍、≤ 0.85倍、≤ 0.75倍、≤ 0.7倍、≤ 0.65倍、≤ 0.6倍、≤ 0.55倍、≤ 0.5倍、≤ 0.45倍、≤ 0.4倍、≤ 0.35倍、≤ 0.3倍、≤ 0.25倍、≤ 0.2倍、≤ 0.15倍、≤ 0.1倍中的一個。
在一些實例中，癌症包含在細胞表面表現高水平EGFR和/或高水平c-Met的癌細胞。測量EGFR和c-Met水平的方法係本領域已知的，並且包括例如免疫組織化學。
在一些實例中，與表現低水平的EGFR和c-Met中的一種或另一種的細胞相比，本文所述之抗體分子或軛合物能夠增加對顯示高水平的EGFR和c-Met兩者的細胞中的癌症的發展或進展的抑制。 核酸、載體、宿主細胞、表現和純化
本揭露提供了一或多種編碼本文所述之抗體分子的核酸分子。在一些實例中，核酸分子包含編碼本文揭露的抗體分子之重鏈可變區的多核苷酸序列、編碼本文揭露的抗體分子之輕鏈可變區的多核苷酸序列或兩者。
在一些實例中，一或多種核酸分子係例如從其他核酸或天然存在的生物物質中純化或分離的。技術者使用本領域熟知的方法製備此類核酸分子將沒有困難。
一或多種核酸分子可以編碼以下的VH結構域和/或VL結構域，較佳VH結構域和VL結構域：抗EGFR抗體殖株RAA22、抗EGFR抗體殖株QD6、抗c-Met抗體殖株B09-GL，較佳的是抗EGFR抗體殖株RAA22或抗c-Met抗體殖株B09-GL。本文描述了該等抗體的VH和VL結構域序列。在核酸編碼本揭露之抗體分子的VH和VL結構域或重鏈和輕鏈的情況下，這兩個結構域或鏈可以在兩個單獨的核酸分子上編碼。
例如，核酸分子可以包含： (i) SEQ ID NO: 17中列出的RAA22的VH結構域核酸序列，和/或SEQ ID NO: 21中列出的RAA22的VL結構域核酸序列； (ii)       SEQ ID NO: 19中列出的QD6的VH結構域核酸序列，和/或SEQ ID NO: 23中列出的QD6的VL結構域核酸序列；或 (iii)      SEQ ID NO: 39中列出的B09-GL的VH結構域核酸序列，和/或SEQ ID NO: 41中列出的B09-GL的VL結構域核酸序列。
核酸分子可以編碼重鏈和/或輕鏈，較佳的是以下的重鏈和輕鏈：抗EGFR抗體殖株RAA22、抗EGFR抗體殖株QD6、抗c-Met抗體殖株B09-GL，較佳的是抗EGFR抗體殖株RAA22或抗c-Met抗體殖株B09-GL。本文描述了該等抗體分子的重鏈和輕鏈序列。
本揭露還提供了一種包含編碼本文所述抗體分子的核酸分子的載體。
分離的核酸分子可用於表現本揭露之抗體分子。核酸通常將以用於表現的重組載體的形式提供。因此，本揭露之另一方面提供了一種包含如上所述之核酸的載體。可以選擇或構建合適的載體，該等載體含有適當的調節序列，包括啟動子序列、終止子片段、聚腺苷酸化序列、強化子序列、標誌基因和其他適當的序列。較佳的是，載體含有適當的調節序列以驅動核酸在宿主細胞中的表現。載體可為質體、病毒例如噬菌體或噬菌粒，視情況而定。
如本文所述之核酸分子或載體可以引入宿主細胞中。用於將核酸或載體引入宿主細胞的技術在本領域中係成熟的。並且可以採用任何合適的技術。適於產生重組抗體分子的一系列宿主細胞係本領域已知的，包括細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物宿主細胞。較佳的宿主細胞係哺乳動物細胞，諸如CHO、NS0或HEK細胞，例如HEK293細胞。
本揭露之另一方面提供了一種產生本揭露之抗體分子的方法，包括在宿主細胞中表現編碼抗體分子的核酸和視需要分離和/或純化由此產生的抗體分子。培養宿主細胞的方法係本領域熟知的。該方法還可以包括分離和/或純化抗體分子。用於純化重組抗體分子的技術係本領域熟知的，並且包括例如HPLC、FPLC或親和層析，例如使用蛋白A或蛋白L。在一些實例中，可以使用抗體分子上的親和標籤進行純化。該方法還可以包括將抗體分子配製成藥物組成物，視需要與如下所述之藥學上可接受的賦形劑或其他物質一起配製。 治療
如上文所解釋，EGFR和c-Met的共表現與許多癌症類型相關，並且靶向這兩種分子的抗體分子，特別是包含此類抗體分子的軛合物提供了跨多種適應症的廣泛臨床益處的機會。
因此，如本文所述之抗體分子或軛合物可用於治療應用，特別係用於治療癌症。
如本文所述之抗體分子、軛合物或藥物組成物可用於治療人或動物體的方法中。本揭露之相關方面提供了： (i) 一種本文所述之抗體分子或軛合物，其用作藥物， (ii) 一種本文所述之抗體分子或軛合物，其用於治療疾病或病症的方法中， (iii) 一種本文所述之抗體分子或軛合物，其用於製備用於治療疾病或病症的藥物；以及， (iv) 一種治療個體的疾病或病症的方法，其中該方法包括向個體投與治療有效量的如本文所述之抗體分子或軛合物。
個體可為患者，較佳的是人類患者。
治療可為其中實現一些期望的治療效果的任何治療或療法，例如，抑制或延遲病症的進展，並且包括降低進展的速率、停止進展的速率、改善病症、治癒或緩解病症（無論是部分的還是全部的）、預防、改善、延遲、減輕或阻止病症的一或多種症狀和/或體征，或延長個體或患者的存活超過在沒有治療的情況下所預期的。
所描述的治療方法可以包括除了抗體分子或軛合物之外向個體投與至少一種另外的治療。因此，本文所述之抗體分子或軛合物可單獨或與一或多種其他治療組合投與於個體。在將抗體分子或軛合物與另一種治療組合投與於個體的情況下，可以將另外的治療與投與抗體分子或軛合物同時、順序或分開投與於個體。在另外的治療與抗體分子或軛合物同時投與的情況下，抗體分子和另外的治療可以作為組合製劑投與於個體。例如，另外的療法可為用於待治療的疾病的已知療法或治療劑。
雖然抗體分子可以單獨投與，但是抗體分子或軛合物通常以藥物組成物的形式投與，該藥物組成物除抗體分子或軛合物之外還可以包含至少一種組分。因此，本揭露之另一方面提供了一種包含如本文所述之抗體分子或軛合物的藥物組成物。還提供了一種包括將抗體分子或軛合物配製成藥物組成物之方法。
除了抗體分子或軛合物之外，藥物組成物還可以包含藥學上可接受的賦形劑、載劑、緩衝劑、穩定劑或熟悉該項技術者熟知的其他材料。如本文所用，術語「藥學上可接受的」涉及化合物、材料、組成物和/或劑型，其在合理的醫學判斷範圍內適用於與受試者（例如，人）的組織接觸而沒有過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理的益處/風險比相稱。每種載劑、賦形劑等在與配製物的其他成分相容的意義上也必須是「可接受的」。載劑或其他材料的確切性質將取決於投與途徑，其可以藉由輸注、注射或任何其他合適的途徑，如下所述。
投與可為「治療有效量」，這足以對個體顯示益處。投與的實際量以及投與的速率和時程將取決於所治療的物質的性質和嚴重程度、所治療的特定個體、個體的臨床狀況、病症的原因、組成物的遞送部位、抗體分子的類型、投與的方法、投與的時間表和醫療從業者已知的其他因素。治療的處方，例如對劑量的決定等，在普通醫生和其他醫生的責任範圍內，並且可以取決於所治療的疾病的症狀嚴重程度和/或進展。抗體分子的適當劑量係本領域熟知的（Ledermann, 1991；以及Bagshawe, 1991）。可以使用本文或Physician's Desk Reference [醫師案頭參考] (2003)中指出的適合於所投與的抗體分子之具體劑量。抗體分子的治療有效量或合適劑量可以藉由比較動物模型中的體外活性和體內活性來確定。將小鼠和其他試驗動物中的有效劑量外推至人的方法係已知的。精確劑量將取決於許多因素，包括待治療區域的大小和位置，以及抗體分子的精確性質。
在較佳的實例中，本文所述之抗體分子或軛合物可用於治療癌症之方法中。
癌症的特徵可為惡性癌細胞的異常增殖。當提及特定類型的癌症諸如乳癌時，這係指相關組織諸如乳腺組織的惡性細胞的異常增殖。位於乳房中但由另一組織諸如卵巢組織的惡性細胞異常增殖引起的繼發性癌症不是本文所指的乳癌，而是卵巢癌。
癌症可為原發性或繼發性癌症。因此，本文所述之抗體分子或軛合物可用於治療個體的癌症之方法，其中該癌症係原發性腫瘤和/或腫瘤轉移。
待使用本文所述之抗體分子或軛合物治療的癌症的腫瘤可以共表現EGFR和c-Met。在一個實例中，可以確定腫瘤共表現EGFR和c-Met。用於確定靶標表現的方法係本領域已知的並且包括例如免疫組織化學。
例如，待使用本文所述之抗體分子或軛合物治療的癌症可以選自由以下組成之群組：肺癌（諸如非小細胞肺癌（NSCLC））、胰臟癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌、胃癌、頭頸癌、卵巢癌或神經膠母細胞瘤。
在較佳的實例中，待使用本文所述之抗體分子或軛合物治療的癌症選自由以下組成之群組：肺癌（諸如非小細胞肺癌（NSCLC））、胰臟癌、大腸癌、結腸直腸癌和頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN或SQHN）。在一個實例中，待治療的癌症係非小細胞肺癌（NSCLC）。在一個實例中，癌症係頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN）。
在癌症的情況下，治療可以包括抑制癌症生長，包括完全癌症緩解，和/或抑制癌症轉移，以及抑制癌症復發。癌症生長通常係指指示癌症內的變化為更發展的形式的多個指標中的任一個。因此，用於測量癌症生長抑制的指標包括癌細胞存活的減少、腫瘤體積或形態的減少（例如，如使用電腦斷層掃描（CT）、超音波掃描或其他成像方法所確定的）、延遲的腫瘤生長、腫瘤脈管系統的破壞、遲發型超敏皮膚測試中改善的性能、抗癌免疫細胞或其他抗癌免疫反應的活性的增加，以及腫瘤特異性抗原水平的降低。活化或增強個體對癌性腫瘤的免疫反應可以提高個體抵抗癌症生長（特別是個體已經存在的癌症的生長）的能力和/或降低個體癌症生長的傾向。
以其特定形式或根據用於執行所揭露的功能的方式、或者用於獲得所揭露的結果的方法或過程來表現的在前面的說明書或在以下申請專利範圍或在附圖中揭露的特徵，視情況可以單獨地，或者以此類特徵的任何組合的方式用於以其各種形式來實現本揭露。
雖然已經結合上述示例性實例描述了本揭露，但是當給出本揭露時，許多等同的修改和變化對於熟悉該項技術者將係顯而易見的。因此，上述揭露的示例性實例被認為是說明性的而非限制性的。在不脫離本揭露之精神和範圍的情況下，可以對所描述的實例進行各種改變。
為了避免任何疑問，提供本文提供的任何理論解釋是為了提高讀者的理解。諸位發明人不希望受到任何該等理論解釋的束縛。
本文使用的任何章節標題只是出於組織之目的，而不應被解釋為限制所描述的主題。
除非上下文另有要求，否則在本說明書（包括後面的申請專利範圍）全篇，詞語「包含」和「包括」及變型應當被理解為暗指包括所陳述的整數或步驟或者多個整數或步驟的群組，但不排除任何其他整數或步驟或者多個整數或步驟的群組。
必須指出的是，如本說明書和所附申請專利範圍中所用，除非上下文另外明確指出，否則單數形式「一」、「一種（個）」和「該」包括複數指示物。本文可以將範圍表述為「約」一個特定值，和/或至「約」另一個特定值。在表述此類範圍時，另一個實例包括從該一個特定值開始和/或到另一個特定值。類似地，藉由使用先行詞「約」將值表述為近似值時，應該理解該特定值形成了另一個實例。相對於數值的術語「約」係視需要的並且意指例如+/-10%。 實例 實例 1 - RAA22/B09 DuetMab 設計和構建
該實例描述了能夠結合EGFR和c-Met兩者的雙特異性抗體分子的產生。 1.1 抗 cMET 抗體 0021U3-B09 的分離和鑒定
基本上如（Vaughan, 1996）所述，在重組哺乳動物表現的生物素化單體人cMET（米迪繆尼公司（MedImmune））上的一系列重複淘選選擇循環中從大型天然人scFv噬菌體展示文庫中分離cMET特異性scFv抗體。來自第2輪選擇輸出的ScFv在細菌周質中表現並篩選它們在HGF:cMET HTRF®（均相時間分辨螢光）配體受體抑制結合測定中抑制人cMET受體與HGF配體結合的能力。選擇表現出強抑制作用的最佳命中（hit）並進行DNA定序。基本上如（Persic; 1997）所述，然後將獨特的基因轉化為人免疫球蛋白G2（IgG2）抗體，並在哺乳動物細胞中產生。然後基於它們在HGF:cMET HTRF®結合測定中的抑制作用對純化的抗體進行排序。選擇最有效的抗體0021U3-B09用於進一步表徵。 1.2 抗 cMET 抗體 0021U3-B09 的優化。
為了最小化潛在的免疫性，特異性靶向並改變0021U3-B09的可變構架區中的非Vernier構架殘基（Foote和Winter 1992）以匹配最接近的人種系序列。在VH區，七個胺基酸殘基發生突變以匹配參考人種系序列IGHV1-8*01。在VL區，三個殘基發生突變以匹配參考人種系序列IGKV1-5*03。VH和VL區中的所有殘基均成功地改變為種系殘基而不喪失活性。基本上如（Kunkel 1985）所述，使用基於雜交的誘變方法對0021U3-B09進行親和力優化。使用標準分子生物學技術，藉由VH互補決定區3（CDR3）的寡核苷酸定向誘變，創建了來源於0021U3-B09序列的大型scFv文庫。對文庫進行基於親和力的溶液相選擇，以選擇對人和食蟹猴cMET抗原具有更高親和力的變體。篩選來自CDR靶向選擇輸出的粗製scFv周質提取物以提高HGF:cMET HTRF®結合測定中的抑制活性。對與親本0021U3-B09相比表現出顯著改善的抑制作用的變體進行DNA定序，並將獨特的基因轉化為人IgG2。然後根據它們的抑制作用對純化的抗體進行排序。選擇最有效的抗體B09-57用於進一步表徵。 1.3 抗 EGFR 抗體 Tdev-0004 的分離和鑒定。
基本上如（Vaughan, 1996）所述，在重組哺乳動物表現的生物素化單體人EGFR（米迪繆尼公司）上的一系列重複淘選選擇循環中從大型天然人scFv噬菌體展示文庫中分離EGFR特異性scFv抗體。在ELISA中篩選來自第3輪選擇輸出的ScFv展示噬菌體與人和食蟹猴EGFR的結合。選擇顯示交叉反應性的最佳命中並進行DNA定序。基本上如（Persic, 1997）所述，然後將獨特的基因轉化為人免疫球蛋白G1（IgG1）抗體，並在哺乳動物細胞中產生。然後藉由流動式細胞分析術基於純化的抗體與表現EGFR的細胞系A431的結合對純化的抗體進行排序。選擇表現出特異性細胞結合的抗體Tdev-0004用於進一步表徵。 1.4 抗 EGFR 抗體 Tdev-0004 的優化。
藉由優化抗EGFR Tdev-0004 mAb衍生變體RAA22和QD6。Tdev-0004的VL構架與參考人種系序列IGLV2-11*01/IGLJ2具有100%匹配（參見https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/Idlink.cgi?seqname=IGLV2-11*01&taxid=9606&dbname=IG_DB%2Fimgt.Homo_sapiens.V.f.orf.p） ，然而，VH框架與最接近的人種系IGHV1-69*01/JH4具有79%同源性（參見https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/Idlink.cgi?seqname=IGHV1-69*01&taxid=9606&dbname=IG_DB%2Fimgt.Homo_sapiens.V.f.orf.p）。為了最小化潛在的免疫性，最初藉由突變所有13個非種系構架殘基使VH區完全種系化。在種系化後，完全種系化變體與食蟹猴EGFR的結合顯著受損。為了恢復與食蟹猴EGFR的結合，四個非種系殘基：K68、I73、R76和T78被選擇性回復突變。胺基酸殘基藉由Kabat編號系統編號（Kabat和Wu 1991）。所得的部分種系變體（命名為H4）被用作親和力優化的模板序列。根據製造商的說明書，使用QuikChange Lightning多位點定向誘變套組（安捷倫公司（Agilent）），藉由對所有六個CDR的簡約誘變對變體H4進行親和力優化。單個胺基酸誘變的VH和VL文庫在細菌中表現為Fab片段，並在ELISA中篩選與人和食蟹猴EGFR的改善的結合。對與親本H4相比表現出提高的結合的變體進行DNA定序，並將獨特的基因轉化為人IgG1。鑒定了在CDRH3中具有單個突變的變體RAA22。為了進一步提高親和力，將單個陽性突變組合以創建組合文庫，篩選與人和食蟹猴EGFR結合增強的變體。鑒定了在CDRL2、CDRL3和CDRH3中具有四個組合突變的變體QD6。 1.5 一價雙特異性抗 EGFR/cMET DuetMab 抗體的產生。
抗cMET mAb B09-57和抗EGFR mAb RAA22和QD6的可變結構域用於在DuetMab平臺的骨架上構建一價雙特異性抗EGFR/cMET抗體（Mazor, 2015）。具體地，將抗cMET B09-57的VH基因插入到攜帶「杵」突變（T366W）和替代的鏈間半胱胺酸突變（F126C和C219V）的人γ-1恒定重鏈中。將B09-57的VL基因在構架中插入到被設計成與「杵」重鏈配對的攜帶相應的替代鏈間半胱胺酸突變（S121C和C214V）的人κ恒定結構域。類似地，將抗EGFR RAA22和親和力優化的QD6的VH基因插入到攜帶「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）的人γ-1恒定重鏈中，而將RAA22和B09-57的VL基因在構架中插入到被設計成與「臼」重鏈配對的人λ恒定結構域中。此外，「杵」和「臼」重鏈的CH3結構域中的兩個殘基突變為半胱胺酸（「杵」中的S354C和「臼」中的Y349C）以形成穩定的二硫鍵。Fc結構域被進一步工程化以在絲胺酸239（C239i/「Maia」）後攜帶半胱胺酸插入，其被設計成使得能夠進行攜帶馬來醯亞胺的細胞毒性藥物的位點特異性軛合（Dimasi, 2017）。胺基酸殘基藉由Kabat編號系統編號（Kabat和Wu 1991）。組裝的一價雙特異性抗EGFR/cMET DuetMab抗體被命名為RAA22/B09-57和QD6/B09-57（ 圖 1）。從哺乳動物細胞產生DuetMab抗體，如前所述（Mazor, 2017）。
根據本實例產生的DuetMab的重鏈和輕鏈的胺基酸序列提供於下表中：
   RAA22/B09-57 QD6/B09-57
EGFR重鏈 56 53
c-Met重鏈 50 50
EGFR輕鏈 58 55
c-Met輕鏈 52 52
實例 2 - 生物化學和生物物理學性質
本實例測試了RAA22、QD6和B09-57單株抗體和RAA22/B09-57和QD6/B09-57雙特異性抗體分子的各種生物化學和生物物理學性質，包括它們分別對EGFR和c-Met的結合親和力以及它們同時結合兩種抗原的能力。 2.1 DuetMab 和親本 mAb 對 EGFR 和 cMET 的結合親和力。
使用BIAcore T200儀器（賓夕法尼亞州匹茲堡的通用電氣醫療集團（GE Healthcare, Pittsburgh, PA））上的抗體捕獲測定，在25°C下藉由SPR確定重組人、食蟹猴和鼠EGFR和cMET抗原的EGFR-cMET DuetMAb的動力學速率常數（kon和koff）和平衡解離常數（K D）。將小鼠抗人IgG固定在CM4感測器晶片上，最終表面密度為約2000共振單位（RU）。還使用相同的固定化方案在該感測器晶片上製備了參照流動細胞表面。製備5-20 nM的測試製品抗體和對照製品抗體在儀器緩衝液（HBS-EP緩衝液；0.01M HEPES，pH 7.4，0.15M NaCl，3 mM EDTA和0.005% P-20）中之溶液，以及純化的EGFR（0.27 - 200 nM人，0.4 - 900 nM食蟹猴和4-1000 nM鼠）或cMET蛋白（0.27至66 nM人和0.27 - 22 nM食蟹猴）在儀器緩衝液中的3倍系列稀釋液。使用序貫方法用於動力學測量。首先將抗體以10 µL/分鐘的流速注射到捕獲表面上。在捕獲的抗體的結合穩定後，將單一濃度的分析物以75 µL/分鐘的流速注射到捕獲表面和參照表面上。得到的結合響應曲線產生締合相數據。在注射分析物之後，然後將流切換回儀器緩衝液15分鐘以允許收集解離相數據，接著是10 mM甘胺酸，pH 1.5的1分鐘脈衝，以在晶片上再生抗體捕獲表面。從各濃度分析物的雙份注射中記錄針對測試製品抗體和對照製品抗體的結合反應。此外，在整個注射系列過程中，穿插若干緩衝液注射。選擇緩衝液注射與參照細胞反應一起使用以校正原始數據組的注射偽影和/或非特異性結合相互作用，通常稱為「雙重參照」。將校正的結合數據全域擬合至1 : 1結合模型（Biacore T200評估軟體2.0，賓夕法尼亞州匹茲堡的通用電氣醫療集團）。計算的動力學參數（k on和k off）和以k off/k on確定的K D示於 表 1中。 [ 表 1] DuetMab 和親本 IgG 對 EGFR 和 cMET 抗原之動力學
抗體 抗原 K on （ M -1s -1 ） K off （ s -1 ） K D （ nM ）
RAA22 IgG 人EGFR 4.41 × 10 4 2.06 × 10 -3 46.6
食蟹猴EGFR 3.54 × 10 4 6.01 × 10 -3 169.8
小鼠EGFR 4.03 × 10 4 1.90 × 10 -2 488.0
人cMET 在200 nM下未檢測到結合
食蟹猴cMET
小鼠cMET
QD6 IgG 人EGFR 1.48 × 10 5 2.92 × 10 -4 2.0
食蟹猴EGFR 1.14 × 10 5 2.88 × 10 -4 2.5
小鼠EGFR 1.67 × 10 5 7.35 × 10 -4 4.4
人cMET ND
食蟹猴cMET
小鼠cMET
B09-57 IgG 人EGFR 在200 nM下未檢測到結合
食蟹猴EGFR
小鼠EGFR
人cMET 5.63 × 10 5 8.82 × 10 -4 1.6
食蟹猴cMET 1.04 × 10 6 1.94 × 10 -3 1.9
小鼠cMET 在200 nM下未檢測到結合
RAA22/B09-57 DuetMab 人EGFR 4.47 × 10 4 2.01 × 10 -3 45.0
食蟹猴EGFR 2.78 × 10 4 5.48 × 10 -3 197.0
小鼠EGFR 3.54 × 10 4 2.06 × 10 -2 575.4
人cMET 4.43 × 10 5 9.86 × 10 -4 2.2
食蟹猴cMET 9.74 × 10 5 2.12 × 10 -3 2.2
小鼠cMET ND
QD6/B09-57 DuetMab 人EGFR 6.35 × 10 4 3.74 × 10 -4 5.9
食蟹猴EGFR 2.10 × 10 5 5.85 × 10 -4 2.8
小鼠EGFR 1.26 × 10 5 7.80 × 10 -4 6.2
人cMET 4.25 × 10 5 6.96 × 10 -4 1.6
食蟹猴cMET 9.58 × 10 5 2.06 × 10 -3 2.2
小鼠cMET ND
aND：未確定。使用BIACore儀器進行EGFR和cMET的可溶性單體形式的動力學測量。K D由數據的非線性擬合計算為k off/k on的比率。
從以上數據可以看出，與QD6/B09-57相比，雙特異性抗體分子QD6/B09-57以高親和力（約2 nM kD）結合人c-Met並且以高親和力（約6 nM kD）結合人EGFR，而雙特異性抗體分子RAA22/B09-57以類似高親和力（約2 nM kD）結合人c-Met，但以降低的親和力（約45 nM kD）結合人EGFR。 2.2 DuetMab 與 EGFR 和 cMET 的同時結合。
基本上如（Mazor, 2015）所述，在Octet384儀器上藉由生物層干涉測量法測量對重組人EGFR和cMET蛋白的同時結合研究。簡言之，最初在NI-NTA生物感測器上捕獲在測定緩衝液[PBS pH7.2，3 mg/mL牛血清白蛋白（BSA），0.05%（v/v）Tween 20]中的5 µg/mL的His-標記的cMET抗原。在洗滌步驟除去任何未結合的蛋白質後，分別負載的生物感測器進行連續的締合和解離相互作用，首先與66 nM的抗體相互作用，然後與500 nM的EGFR抗原相互作用。使用Octet384軟體v.9.0對數據進行非線性擬合，由此計算締合和解離曲線。如 圖 2所示，DuetMab表現出與兩種抗原同時結合，而親本抗cMET IgG僅表現出與cMET的特異性結合，並且兩種抗EGFR IgG不表現出與負載cMET的感測器的結合。 2.3 EGFR 和 c-Met 特異性
藉由ELISA確定EGFR和cMET物種同種同源物和密切相關的家族成員的特異性。簡言之，在PBS中以1 µg/mL製備抗原溶液並將50微升包被在半面積ELISA測定板上。洗滌板，並在室溫下用含有0.005% Tween-20的1% BSA的PBS（PBS-T）封閉一小時。將孔在PBS-T中洗滌4次。如 圖 3所示，使用一抗，其中：R374（非結合IgG1同種型對照抗體）、B09（抗cMET抗體）、QD6（抗EGFR抗體）、RAA22（抗EGFR抗體）、QD6/B09（雙特異性EGFR/c-MET DuetMAb）、RAA22/B09（雙特異性EGFR/c-MET DuetMAb）、PaniX（抗EGFR抗體）、MetMab（抗cMET抗體）和Mab11311（抗HER4抗體）。除了HER4結合mAb對照MAB1131（該系列以1 µg/mL開始）之外，將孔與以1 : 3稀釋系列稀釋於PBS-T中的50微升所示一抗一起孵育，以10 µg/mL開始並以0.002 µg/mL結束。將孔在PBS-T中洗滌4次，然後將50 µl在PBS-T中以1:5000稀釋的山羊抗人Fab HRP-標記的二抗添加到各孔中並在室溫下孵育一小時。向所有孔中添加50微升TMB底物溶液並在室溫下孵育5-30分鐘，直到在陽性對照孔中觀察到強訊息。向所有孔中添加50微升TMB終止溶液，在SpectraMax M5酶標儀上在450nm處讀取吸光度。在SoftMax Pro 5軟體中分析數據並使用GraphPad Prism 7繪圖軟體繪圖。
為了確定物種交叉反應性，如上所述進行ELISA測定。如 圖 3A所示，高親和力EGFR IgG QD6以及一價雙特異性EGFR/cMET DuetMAb QD6/B09與人、食蟹猴和小鼠EGFR結合並在ELISA測定中給出強訊息。相比之下，與QD6相比，降低親和力的EGFR IgG RAA22與人、食蟹猴和小鼠EGFR結合較弱。與小鼠EGFR的結合較弱，但可檢測。相應的一價雙特異性EGFR/cMET DuetMAb RAA22/B09顯示出相對於二價親本IgG RAA22與人和食蟹猴EGFR的結合仍然較弱，並且顯示出與小鼠EGFR的標稱結合。cMET IgG B09以及所有雙特異性變體顯示出與人和食蟹猴cMET相當的結合。沒有檢測到任何抗體與小鼠cMET的結合。該等結果與在BIAcore儀器上藉由表面電漿共振測定的結合動力學一致（上表1）。
如 圖 3B所示，親本IgG或衍生的雙特異性抗體都沒有表現出與任何EGFR HER家族蛋白、HER2、HER3或HER4的可測量的結合。類似地，沒有抗體顯示與cMET家族成員Ron（CD136）或Semaphorin 3a的顯著結合。
該等結果證明，親本IgG和得到的雙特異性抗體與它們的同源靶標特異性結合，而與密切相關的家族物種沒有可檢測的結合。 實例 3 - 使用 pH 敏感性染料監測抗體內化和運輸至酸化隔室
抗體藥物軛合物（ADC）的功效部分依賴於抗體介導有效內化和遞送至溶酶體的能力，其中抗體隨後被降解。這種溶酶體降解因此釋放細胞毒性彈頭並允許其對靶腫瘤細胞發揮其細胞效應。另一方面，正常非腫瘤組織中的靶標表現可導致降低ADC的治療窗之毒性。本揭露之雙特異性抗體的設計旨在使ADC在表現出很少或沒有靶標共表現的正常組織中的影響最小化，同時使ADC向共表現兩種靶標的腫瘤細胞的遞送最大化。為了評估使用EGFR親和力降低的雙特異性抗體RAA22/B09的雙重靶向是否提供相對於單一靶標接合的選擇性優勢，我們使用pH敏感性染料標記的抗體進行研究以比較雙特異性mAb與包含雙特異性的一價親本抗體的內化效率。
使用用pHAb pH敏感性染料（普洛麥格公司（Promega））標記的抗體促進抗體內化和運輸至酸化的細胞內隔室（諸如溶酶體和核內體）的視覺化。該染料在pH ＞ 7時顯示非常低的螢光，但在酸性pH時變為強螢光，在約pH 5時達到最大值。簡言之，根據製造商的建議，用pHAb胺反應性染料標記抗體。標記的抗體係：R347 IgG1同種型對照、一價雙特異性對照抗體抗EGFR抗體RAA22/R347和抗cMET B09/R347，以及EGFR/cMET一價雙特異性抗體RAA22/B09。將共表現中等水平EGFR（約33,000相對受體密度）和cMET（約50,000相對受體密度）的NCI-H1975肺癌細胞以100微升體積在補充有10%胎牛血清的RPMI生長培養基中以2 × 10 5個細胞/mL的密度鋪板到透明底黑壁96孔測定板中。將板在加濕培養箱中在37°C和5% CO 2下培養過夜。然後將板在冰上冷卻30分鐘，然後在預冷的生長培養基中添加不同濃度的pHAb標記的雙特異性和一價對照抗體。將培養物在冰上再冷卻30分鐘，然後使用Cy3過濾器在Operetta高含量成像系統上讀取螢光，並將該初始讀數指定為時間零點。將板移回37°C培養箱，並在3、6、24、30和48小時獲取額外讀數。
使用1.25 µg/mL的pHAb標記的mAb處理NCI H1975細胞的代表性內化實驗顯示於 圖 4中。非結合IgG1同種型對照抗體R347在任何時間點均未顯示可檢測的螢光。EGFR/cMET雙特異性抗體RAA22/B09在處理後3小時表現出細胞內螢光並且螢光強度持續增加直至48小時。一價EGFR結合對照抗體RAA22/R347從24小時開始顯示非常弱的螢光，其在48小時沒有顯著增加。一價單特異性cMET結合對照抗體B09/R347在24小時顯示中等螢光，進一步增加48小時。然而，單特異性cMET抗體的螢光訊息的強度與雙特異性RAA22/B09相比係中等的，表明在本文測試的雙靶標表現細胞系中，雙特異性抗體具有比單特異性親本抗體更大的內化效率。當用0.625 µg/mL的pHAb標記的mAb處理細胞時，雙特異性抗體與單特異性對照之間的差異甚至更顯著（ 圖 5）。單特異性抗體即使在48小時也顯示非常小的螢光，而雙特異性RAA22/B09抗體在處理後3小時再次顯示細胞內螢光並且螢光強度持續增加直至48小時。該等結果與雙靶向雙特異性抗體介導有效內化到共表現EGFR和cMET的細胞中的假設一致。同時，與雙特異性抗體相比，單特異性親本抗體顯示出降低的吸收和螢光強度。該等結論的邏輯擴展表明雙特異性抗體在僅表現一種但不表現兩種靶標的組織中可能表現得更像單特異性抗體，這對於EGFR和cMET通常是真實的。特別值得注意的是，pHAb標記的親和力降低的EGFR對照mAb RAA22/R347表現出可忽略的吸收和螢光。這種降低的與EGFR的結合可以使ADC在表現顯著水平的EGFR但很少或沒有cMET的正常組織諸如皮膚中的影響最小化。 實例 4 - 使用共聚焦顯微鏡監測抗體內化
標記的DuetMab的內化動力學：使用活細胞共聚焦螢光顯微鏡在體外評估RAA22/B09和QD6/B09抗體。 4.1 材料和方法
H1975和HCC827細胞來自ATCC。RAA22/B09、QD6/B09和單組衍生物來自米迪繆尼公司。QD6/B09和來源於非特異性人IgG1 NMGC的具有IgG Fab組的單組特異性對照QD6/IgG和B09/IgG來自米迪繆尼公司。RAA22/B09和來源於非特異性人IgG1 R347的單組特異性對照RAA22/IgG和B09/IgG來自米迪繆尼公司。RPMI（11875-093）、HEPES（15630106）、丙酮酸鈉（11360070）、AlexaFluor® 647（A-20186）單株抗體標記套組、Zeba™自旋脫鹽柱（87767）和CellTracker™ Blue CMAC（C2110）來自加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命科技公司（Life Technologies, Carlsbad, CA）。Accutase細胞脫離溶液（423201）來自加利福尼亞州聖達戈的百進生化技術公司（BioLegend, San Diego, CA）。HyClone熱滅活胎牛血清（SH30071.03HI）來自麻塞諸塞州瑪律伯勒的通用生命科學公司（GE Life Sciences, Marlborough, MA）。PBS（21-040）來自紐約州康寧的康寧公司（Corning Incorporated, Corning, NY）。FcR阻斷試劑（130-059-901）來自加利福尼亞州奧本的美天旎生物技術有限公司（Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA）。聚丙烯圓底管（352063）來自加利福尼亞州聖荷西的BD生物科學公司（BD Biosciences, San Jose, CA）。CellCarrier 384孔微量培養板來自珀金埃爾默公司（PerkinElmer Inc.）（目錄號6007550，麻塞諸塞州沃爾瑟姆（Waltham，MA））。 AlexaFluor軛合物的製備
根據製造商說明書使用抗體標記套組將單株抗體與AlexaFluor-647染料軛合。簡言之，將50-100微克在碳酸氫鈉緩衝液（pH = 8.3）中的抗體與反應性染料試劑在溫和攪拌下在室溫下孵育1小時。根據製造商的說明書，使用帶40K MWCO並用1X PBS平衡的Zeba™旋轉脫鹽柱，藉由粒徑排阻層析法除去未摻入的染料。 用於染色的細胞的培養和製備
使用含有10%胎牛血清（FBS）的培養基RPMI-1640將貼壁H1975或HCC827細胞在CO2培養箱中的T-75燒瓶中培養至初始接種後達到80%-90%匯合。在實驗當天，使用Accutase將生長在T-75燒瓶中的貼壁單層解離成細胞懸浮液。將分離的細胞用1x PBS洗滌兩次，使用300xg離心5分鐘。然後將細胞以2 × 106個細胞/mL的濃度重懸於無酚RPMI中並用於染色。 用於成像的細胞染色
將2 × 106個細胞/mL的細胞懸浮液與在無酚RPMI中製備的1μM CellTracker™ Blue CMAC在37°C下在CO2培養箱中孵育30分鐘。藉由在4°C下以300xg離心5分鐘用無酚RPMI洗滌兩次來除去未摻入的CellTracker™ Blue CMAC染料。然後將細胞在冰上冷卻並用10 ul FcR阻斷試劑每1 × 106個細胞阻斷15分鐘。將2 × 10 5個細胞等分到5mL圓底試管中，並與最終濃度為2.5 µg/mL的螢光抗體一起孵育。在4°C下藉由離心除去未結合的螢光試劑後，將細胞重懸於含有100 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉和1% FBS的無酚RPMI中。將細胞以每孔50,00個細胞的密度轉移到384孔成像板的多個孔中，並且在圖像獲取之前在4°C下以2,200 rpm短暫離心2分鐘。 使用共聚焦螢光顯微術獲得細胞圖像
將成像板（384孔格式）中的染色細胞如先前所述（Vainshtein, 2015）在Opera共聚焦螢光成像系統上成像或轉移到具有40X/1.2NA LCIPlan Apo物鏡的Zeiss Axio Observer.Z1倒置顯微鏡（紐約州桑伍德的蔡司顯微鏡公司（Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, NY））上。對於使用蔡司顯微鏡的實驗，使用培養箱XLmulti S DARK（德國埃爾巴赫的培康股份有限公司（PeCon Gmbh, Erbach, Germany））將成像環境保持在37°C、5% CO2和70%濕度下。用405、488、561和63 nm固態雷射器（紐約州桑伍德的蔡司顯微鏡公司）照射樣本。使用具有Evolve 512 EMCCD（亞利桑那州圖森的光度計公司（Photometrics, Tuscon, AZ））的Yokogawa CSU-X1旋轉盤單元（日本東京的橫河電機株式會社（Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan））在指定時間獲取一系列圖像。在圖像獲取之前，使用染色細胞的等分試樣確定曝光參數，諸如雷射功率、曝光時間、相機增益等。使用ZEN 2.3（紐約州桑伍德的蔡司顯微鏡公司）處理圖像並使用Columbus軟體（麻塞諸塞州沃爾瑟姆的珀金埃爾默公司）分析。 圖像內化分析演算法
先前描述了用於抗體內化定量的演算法（Vainsthein, 2015），具有以下更新和修改。用於反覆運算影像處理的參考通道源自細胞的CellTracker™ Blue CMAC（CTB）染色。訊息通道仍然來源於成像器的抗體-AlexaFluor-647通道。使用演算法定義的參數藉由演算法處理圖像，該等參數最初被設置為預設值，然後針對每種細胞類型和實驗進行優化。圖像的CTB染色用於使用閾值來識別細胞，以檢測圖像上具有比其周圍的排除區域更高強度的區域，該等排除區域具有低於閾值的螢光強度訊息。其餘已識別的細胞對象被指定為「總細胞」。在形態學特性面積（介於120-600 µm2之間的物體）和圓度（＞ 0.5）上進一步選擇細胞過濾。然後使用演算法定義的參數在物件邊界周圍構建接受細胞中的「膜區域」和「細胞質區域」。每個區域的螢光強度用於監測抗體相關的AlexaFluor-647訊息。每個區域的螢光強度報告為接受細胞中所有圖元總和之平均值。
細胞質中抗體相關螢光的累積用於定量抗體內化的動力學。為了確保由於細胞染色和螢光強度的可變性導致的結果的可比性，用每個時間點的總細胞訊息將細胞質訊息歸一化，並使用以下公式指定為內化分率：內化分率 = 強度(細胞質)/(強度(細胞質) + 強度(膜))。藉由使用以下公式對數據進行曲線擬合，由內化時間過程計算內化速率常數kint：F細胞質(t) = (1−e−kint ⋅t) ⋅F最大,細胞質，其中F最大,細胞質係每個細胞的細胞質強度與每個細胞的總強度的最大比率。使用Graphpad Prism（加利福尼亞州拉霍亞的格拉夫派得軟體公司（GraphPad Software, La Jolla, CA））進行數據的曲線擬合。內化半衰期（T ½）計算為ln(2)與kint之比。 4.2 RAA22/B09 和 QD6/B09 的體外內化
AlexaFluor647（AF647）主要標記的DuetMab的內化動力學：使用EGFR和c-MET表現細胞系H1975在體外評估RAA22/B09和QD6/B09抗體。將每種抗體預結合到細胞上，然後使用活細胞共聚焦螢光顯微鏡監測抗體從細胞表面到細胞質的易位。 圖 6示出了兩種抗體在經受內化條件之前（T = 0）主要定位於細胞表面，並且在1小時（T = 1 h）後易位至細胞質區域（藍色）。在內化的時間過程中每5分鐘獲取動力學圖像，並使用定量演算法（參見上文）處理以確定內化動力學常數和半衰期。 圖 6b示出了QD6/B09和RAA22/B09的非常可比較的內化動力學，其中半衰期分別為37.5 ± 10.6分鐘和43.2 ± 15.5分鐘。
為了評估抗體內化的模式並研究每個組對DuetMab的整體內化的貢獻，我們評估了在表現EGFR和c-MET的H1975細胞中針對duet QD6/B09的單組特異性對照抗體分子QD6/IgG和B09/IgG以及針對duet RAA22/B09的RAA22/IgG和B09/IgG的內化。由於只有一個組對靶受體係特異性的，因此對照抗體只能通過一個受體內化，從而消除了作為內化模式的雙重受體靶向和交聯。
QD6/B09（ 圖 7A）和RAA22/B09（ 圖 7B）的內化曲線呈現與細胞質中相應增加的mAb-AF647訊息一致減少的膜mAb-Fl647訊息的非常類似的模式，這是內化的典型曲線。然而，它們的單組構建體顯示出非常不同的內化曲線。單組QD6/IgG具有與QD6/B09 DuetMab幾乎相同的內化時間過程（ 圖 7A，左側和中間），表明QD6/B09 duet的內化主要由分子的EGFR-組驅動，B09-組的貢獻最小。實際上，B09/IgG構建體顯示非常小的內化水平（ 圖 7B，右側）。膜訊息的快速和廣泛減少對應於細胞質訊息的非常適度的增加，可能係由於預先結合的B09/IgG從細胞表面上的c-MET受體廣泛解離。抗體的解離隨後導致B09/IgG的適度內化。該等結果表明，QD6/B09 duet的內化主要由分子的EGFR-組驅動，B09-組的貢獻最小。
相比之下，當與其單組對照抗體相比時，RAA22/B09 DuetMab顯示出非常不同的內化曲線。如圖7B所示，RAA22/B09 DuetMab的細胞質強度值分別比RAA22-IgG和B09-IgG高10.98倍和4.70倍。雖然B09/IgG的低效內化可能歸因於其顯著的解離（如上所述），但是RAA22/IgG確實經歷了快速內化。然而，由於EGFR-組的親和力較低，因此RAA22/IgG分子的數目（基於螢光強度）比RAA22-B09 DuetMab少10.98倍。與單組構建體相反，進入細胞質的duet RAA22/B09 mAb的顯著增加量表明，兩個抗體組必須與靶受體接合以驅動內化。該發現表明，QD6/B09和RAA22/B09 DuetMab具有不同的內化機制，其中QD6/B09主要由EGFR組驅動，但RAA22/B09需要EGFR和c-MET組兩者用於接合。 4.3 RAA22/B09 在具有不同水平的靶受體的細胞系中的內化
由於EGFR和c-MET組與靶受體的結合促進了RAA22/B09受體在H1975細胞中的內化，我們檢測了EGFR和c-Met受體數量的增加是否會影響內化性質。在H1975細胞中藉由西方墨點法確定的相應受體水平對於EGFR為約33,000並且對於c-MET為約50,000，並且在HCC827細胞中對於EGFR為約790,000並且對於c-MET為約523,000。RAA22/B09在H1975（中等受體）和HCC827（高受體）細胞中的內化曲線顯示在HCC827細胞中內化顯著增加（ 圖 8）。
正如預期的那樣，對應於EGFR和c-MET RAA22/B09的總體水平分別增加23.9倍和10.4倍，與HCC827細胞的結合平均比H1975高8.9倍（T = 0，3.1 × 10 7MFI對3.5 × 10 6MFI）。在HCC827細胞中內化水平（藉由峰值細胞質強度判斷）高21.7倍，表明在表現高水平靶受體的細胞中，進入細胞質的抗體濃度顯著較高。重要的是，除了顯著不同的強度之外，HCC827與H1975細胞之間的內化曲線（隨時間變化的膜和細胞質訊息）也顯著不同。在高表現HCC827細胞中，RAA22/B09-AF647膜訊息的降低對應於RAA22-B09細胞質訊息的相互增加，其中總RAA22/B09訊息在時間過程中維持，表明與兩種受體的強雙組抗體相互作用和隨後的內化。在H1975細胞中，總強度和細胞膜強度同時降低，表明預結合抗體的部分可能已經從細胞表面解離並且不能在細胞內內化。對於HCC827細胞中RAA22/IgG和B09/IgG的內化，觀察到類似的指示解離的曲線，其中單組接合不提供有效結合並且易於解離（ 圖 9A和 B）。該數據表明，當RAA22/B09在H1975細胞中進行內化時，存在受體相互作用的混合模式（單組和雙組接合）。總之，該等數據表明靶細胞受體表現水平係RAA22/B09內化的程度和效率的重要決定因素。 實例 5 - 與微管溶素 AZ1508 的軛合 5.1 位點特異性軛合
微管溶素藥物與RAA22/B09抗體分子的軛合基本上如先前在Thompson, 2016和US20150291657A1中所述進行。 5.2 可開發性評估
評估了未軛合的DuetMAb中間體（cMet-EGFR DuetMAb，RAA22-B09）和由與2分子微管溶素AZ1508軛合的DuetMAb組成的抗體-藥物軛合物（ADC）的可開發性。微管溶素EGFR-cMET ADC的可開發性評估包括對序列傾向性、穩定性、生物化學/生物物理特性和可製造性的評估。 序列傾向性
評估了RAA22-B09的胺基酸序列中已知傾向性的存在，包括CDR區中的脫醯胺位點、氧化位點和引入的糖基化位點。該分析未顯示被視為高風險的任何序列傾向性。 穩定性
對在20 mM組胺酸、240 mM蔗糖、pH 6.0中濃度為50 mg/ml的mAb中間體RAA22-B09和在20 mM組胺酸、7%蔗糖，pH 6.0中濃度為5 mg/ml的軛合ADC進行穩定性研究。將材料填充在HDPE瓶中。
在經歷3次凍融循環（從-80°C至室溫）後和在5°C、25°C和40°C下孵育後測試材料。
1個月後分析樣本；2個月後材料也在5°C下儲存和在25°C下儲存。
觀察到mAb中間體的可見顆粒。然而，該等顆粒被認為是開發的低風險，並且可以在軛合之前藉由過濾容易地除去。ADC實際上保持沒有可見顆粒。
在5°C、25°C和40°C下的ADC穩定性研究過程中沒有觀察到變化。未觀察到游離藥物含量的增加。
在5°C和25°C下儲存mAb中間體和ADC後，觀察到單體純度的最小變化。
在指定溫度下孵育4週後，ADC保持細胞毒性活性。結論是ADC表現出良好的熱穩定性。 生物化學/生物物理性質
藉由差示掃描量熱法（DSC）測定mAb中間體和ADC的熱解鏈溫度。發現軛合不會顯著降低解鏈溫度。軛合後觀察到均質群體。
總之，cMET-EGFR mAb中間體（RAA22-B09-Maia）和相應的具有AZ1508有效負載的ADC在可開發性方面被認為是低風險的。 5.3 大鼠、小鼠和食蟹猴血清中 RAA22/B09-AZ1508 的體外穩定性分析
將RAA22/B09-AZ1508在0.2 µM過濾的大鼠、小鼠和食蟹猴血清中稀釋至最終濃度為200 μg/mL，並在37°C下孵育零、一、三和七天。將NHS-活化的瓊脂糖珠（通用電氣醫療集團）用1X磷酸鹽緩衝鹽水（PBS；pH 7.4）洗滌三次，通過以1 x 1000g離心一分鐘，以除去異丙醇儲存溶液。將十分之一體積的碳酸氫鈉（1 M [v/v]）添加到重組EGFR-ECD蛋白（2.12 mg/mL，批號：C20202OCT14C）中，並將6 mL該混合物與3 mL經洗滌的NHS-活化的瓊脂糖珠一起孵育。將珠混合物在室溫下孵育過夜。用1X PBS（pH 7.4）洗滌珠三次以除去未結合的EGFR。根據製造商的建議，藉由使用Agilent 1200系列HPLC和Tosoh Bioscience TSKgel G3000粒徑排阻層析柱比較EGFR的結合量與起始量，確定固定化效率為93%。藉由在室溫下將100 μL的RAA22/B09-AZ1508-血清孵育混合物與50 μL EGFR珠孵育30分鐘，從血清中回收RAA22/B09-AZ1508；然後用1X PBS緩衝液連續洗滌三次並用100 μL抗體洗脫緩衝液（IgG洗脫緩衝液；賽默科技公司（Thermoscientific））。藉由rLCMS分析洗脫液以計算剩餘的完整ADC的量。在與具有電灑游離源的Agilent 6520精確品質TOF LC/MS聯用的Agilent 1290系列HPLC上使用簡化逆相質譜法（rLCMS），使用採用Agilent MassHunter數據獲取和層析處理軟體獲得的峰高強度計算剩餘ADC。將約2 μg（35 μL）還原洗脫液上樣到Poroshell 300SB-C3柱（2.1 × 75 mm，255 Agilent）上，並在6分鐘256後使用60% B的梯度以0.4 mL/min的流速洗脫（溶劑A：0.1%甲酸水溶液；溶劑B：0.1%甲酸的乙腈溶液）。完整的軛合和未軛合或修飾ADC種類的峰高強度用於藉由將完整的軛合峰高強度除以總ADC種類峰高強度來計算剩餘的ADC百分比。結果示於下 表 2中。 [ 表 2]
該等數據顯示了整個有效負載從ADC去軛合的速率和ADC藉由從小鼠、大鼠和食蟹猴血清中的微管溶素彈頭釋放O-乙醯基而進行的離體代謝。結果表明，當在37°C下與來自三個物種中任一種的血清一起孵育時下一週後，軛合的有效負載的損失小於或等於10%。來自ADC的微管溶素彈頭的脫-O-乙醯化的初始速率在三種物種中似乎略有不同，但在第7天，所有三個物種的脫-O-乙醯化的量相似，為約40%。 實例 6 - ADC 體外細胞毒性
在該實例中，在一組癌細胞系中測量EGFR/cMET雙特異性ADC的體外效力。 6.1  細胞系組的定量FACS表徵
進行FACS以定量測試細胞系中的相對EGFR和c-Met密度。 抗體標記
根據製造商說明書（英傑公司（Invitrogen）目錄號A20186），使用Alexa Fluor 647單株抗體標記套組標記PanIX、抗EGFR-cMet和R347純化的抗體。使用NanoDrop ND -1000分光光度計計算抗體濃度和螢光染料與蛋白質（F:P）的比率。 流動式細胞分析術
收穫細胞並洗滌成單細胞懸浮液。藉由Vi-Cell XLR分析儀（貝克曼庫爾特公司（Beckman Coulter））確定細胞數目和存活力（≥ 90%）。在冰冷的FACS緩衝液（磷酸鹽緩衝鹽水pH 7.4、5% FBS、0.1%疊氮化鈉）中將細胞濃度調節至5 × 106個細胞/ml，並以250,000個細胞/孔鋪板於96孔u型底聚苯乙烯板中。在冷FACS緩衝液中以不同濃度（0.15 -40 μg/mL）一式兩份連續稀釋Alexa 647軛合的抗體，以提供結合曲線。將細胞和一抗在黑暗中在濕冰上孵育20分鐘。將細胞用冷FACS緩衝液洗滌2次並固定在200 μL冰冷的2%多聚甲醛（PFA）中。對於數據獲取，Alexa 647的激發和發射波長為650/668 nm，通過Red Laser 640nm。藉由具有FACSDiva™軟體的Becton-Dickenson LSR II機器收集來自每個樣本的兩萬個事件。使用FlowJo軟體分析結果。 EGFR、EGFR-cMet的分析；Quantum MESF（等量可溶性螢光染料分子）
藉由使用Quantum Alexa Fluor 647 MESF珠（目錄號647C，班斯實驗室（Bangs Laboratories））評估細胞上的EGFR、EGFR-cMet的量，使用與上述列出的樣本相同的流動式細胞分析術設置，每個樣本（LSRII）採集10,000個事件。使用QuickCal程式（www.bangslabs.com）建立使通道值與MESF單位的螢光強度相關的標準曲線。平均螢光強度（MFI）與存在的螢光染料的量成正比，用於計算每個細胞的分子數。由Quickcal程式計算的MESF除以抗體F:P比率，得到校正的ABC（抗體結合能力）。 6.2 確定 ADC 細胞毒活性的方法
如下在多種細胞系中測試了ADC細胞毒性活性。將細胞以96孔板的每孔10,000個細胞的密度以100 μL的體積鋪板在其推薦的補充有10%胎牛血清的培養基中。藉由在培養基中連續稀釋抗體原液來製備3X濃度的待測試抗體的每個劑量。將五十微升每種測試製品一式三份添加到細胞中，使得最終抗體濃度範圍為60 nM至0.0009 nM。將經處理的細胞在37°C下在潮濕培養箱中培養72小時。根據製造商的說明書，使用來自普洛麥格公司的CellTiter-Glo發光活力測定來測定代謝活性。將數據繪製為相對於未處理對照的代謝活性百分比。使用GraphPad Prism軟體，使用最大生存力（未處理的細胞）與最大響應（峰抑制）之間的邏輯非線性回歸分析來確定IC 50值。 6.3 結果 — 細胞系組中的體外 ADC 活性
使用CellTiter-Glo發光活力測定在一組癌細胞系中測量EGFR/cMET雙特異性ADC的體外效力。如 表 3所示，較高親和力QD6/B09-AZ1508和較低親和力RAA22/B09-AZ1508在具有一系列靶標表現水平的細胞系中都表現出廣泛的活性。 [ 表 3] - EGFR-cMET DuetMAb ADC 的體外活性
細胞系 相對EGFR密度 相對cMET密度 高親和力ADC QD6/B09-AZ1508 降低的EGFR親和力ADC RAA22/B09-AZ1508
IC50 (pM) 最大值 抑制% IC50 (pM) 最大值 抑制%
HCC 827親本 1, 513, 899 236, 933 96 79% 132 55%
NCI H596 938,023 28,353 274 54% 3,237 67%
HCC 827 GR池 760, 040 523, 298 33 66% 168 59%
A549 88, 385 16, 483 118 45% 667 36%
NCI H1792 63,820 20,658 81 80% 200 81%
NCI H1975 33, 086 50, 339 178 65% 255 65%
NCI H292 96,538 16,497 91 79% 271 62%
A427 20,236 9,734 6,959 12% 40,220 58%
NCI H358 15,065 16,429 168 29% 3,017 30%
NCI H23 9,843 21,669 ＞ 60,000 約5% 8,096 46%
NCI H661（Ag陰性） ND - 9,906 ND - 8, 114 ＞ 60,000 0 ＞ 66,667 10%
總體上，對EGFR具有較低的親和力的ADC在共表現顯著量的EGFR和cMET兩者的廣泛範圍的細胞系中表現出相當的（稍微降低）效力。通常，當一種或另一種靶標在細胞表面具有約15,000或更低的低相對受體密度時，兩種ADC均顯示降低的效力。這種作用在親和力較低的變體中更顯著，該親和力較低的變體似乎對較低水平的cMET更敏感。 實例 7 - ADC 細胞毒性體外概念驗證（ POC ）實驗
為了進一步測試降低親和力的EGFR-cMET抗體的雙特異性接合對於最佳ADC遞送係必需的假設，我們進行了體外實驗以確定各個抗體組對雙特異性ADC活性的相對貢獻。在第一個實驗中，我們使用過量的未設組親本抗體來阻斷EGFR或cMET，然後在體外細胞毒性測定中測量雙特異性EGFR-cMET ADC的活性。對於該實驗，我們使用了以大致相等的量表現中等水平的EGFR和cMET的細胞系。如果雙特異性ADC的各個組獨立地起遞送ADC的作用，則預期阻斷該細胞系中的任一靶標將僅適度地降低ADC的活性，使IC 50移動兩倍或更少，因為靶標以相似的水平存在。另一方面，如果ADC需要雙重靶標接合以有效地將ADC遞送到細胞中，則阻斷任一靶標將可能對雙特異性ADC的活性具有更大的影響。在一項相關實驗中，我們比較了雙特異性EGFR-cMET ADC與由一個EGFR或cMET結合組和一個非結合同種型抗體對照組組成的一價、單特異性對照抗體的活性。類似地，如果每個組獨立地起作用，則預期結果將是每個單特異性對照ADC將僅適度地比雙特異性ADC效力低，並且差異將是相加的。替代性地，如果雙特異性的兩個組協同作用，則預期雙特異性ADC的活性與單特異性對照抗體相比有較大差異。 7.1 方法
如下在NCI-H1975細胞系中測試了ADC的細胞毒性活性。將細胞以96孔板的每孔10,000個細胞的密度鋪板在其推薦的補充有10%胎牛血清的培養基中，對於阻斷實驗，體積為50 μL，而對於一價ADC實驗，體積為100 μL。對於未設組mAb阻斷實驗，將50 μL的300 μg/mL的EGFR IgG（RAA22）或cMET IgG（B09）溶液添加到孔中並在37°C下在加濕培養箱中預孵育一小時。藉由在培養基中4X連續稀釋抗體原液來製備3X濃度的待測試抗體的每個劑量。將五十微升單獨的培養基、同種型對照IgG ADC（R347-AZ1508）或EGFR-cMET ADC（RAA22/B09-AZ1508）一式三份添加到細胞中，使得最終抗體濃度範圍從67 nM降至0.0009 nM。對於一價ADC實驗，將50 μL同種型對照ADC（R347-AZ1508）、一價EGFR ADC（RAA22/R347-AZ1508）、一價抗cMET ADC（B09/R347-AZ1508）、一價ADC的等莫耳組合或EGFR-cMET ADC（RAA22/B09-AZ1508）的3X儲備液一式三份以開始於60 nM並且結束於0.009 nM的4X稀釋系列添加。將經處理的細胞在37°C下在潮濕培養箱中培養72小時。根據製造商的說明書，使用來自普洛麥格公司的CellTiter-Glo發光活力測定來測定代謝活性。將數據繪製為相對於未處理對照的代謝活性百分比。使用GraphPad Prism軟體，使用最大生存力（未處理的細胞）與最大響應（峰抑制）之間的邏輯非線性回歸分析來確定IC 50值。 7.2 結果和結論 — 雙重靶向概念的體外證明（ mAb 阻斷實驗和一價 ADC ）
我們進行了體外實驗以檢查各個抗體組對雙特異性ADC的細胞毒性活性的相對貢獻，如上文所述。如 圖 10中的代表性實驗所示，用cMET IgG RAA22預處理NCI H1975細胞導致EGFR-cMET ADC（RAA22/B09-AZ1508）的IC 50從約60 pM轉變為3,480 pM，相差約60倍。用抗cMET IgG B09處理導致IC 50轉變為680 pM，相差大於11倍。類似地，當用一價單特異性EGFR ADC（RAA22/R347-AZ1508）處理NCI H1975細胞時，與雙特異性EGFR-cMET ADC的316 pM相比，IC 50為約20,500 pM，相差約65倍（ 圖 11）。一價單特異性抗cMET ADC（B09/R347-AZ1508）的IC 50為2,772 pM，與雙特異性抗體相比相差約13倍。
總之，該等數據表明，EGFR-cMET ADC有效靶向共表現兩種靶標的腫瘤細胞主要由ADC的雙特異性接合來驅動。此外，該等結果表明，EGFR親和力降低的結合組不足以在不存在cMET結合的情況下促進有效的ADC遞送，如當cMET組被未設組抗體阻斷時效力的顯著降低和一價EGFR對照ADC、RAA22/R347-AZ1508的弱細胞毒性所證明的。總之，該等結果與以下假設一致：雙特異性ADC（RAA22/B09-AZ1508）的EGFR結合組的降低的親和力將促進ADC遞送至EGFR和cMET共表現腫瘤，同時表現出對主要僅表現一種靶標的細胞的降低的細胞毒性。當僅EGFR可用於接合時，這種作用最為顯著，這對於減輕表現顯著水平的EGFR但相對較少的cMET的正常器官諸如皮膚中的EGFR驅動的毒性有影響。 實例 8 - ADC 在患者來源的異種移植物（ PDX ）模型中的體內藥理學
人類癌症的患者來源的異種移植物（PDX）模型已成為基於腫瘤細胞系的腫瘤異種移植物的成熟替代物。PDX模型係根據患者的原發性腫瘤組織直接植入免疫缺乏小鼠體內以在小鼠體內產生增殖的腫瘤而建立的。由此產生的腫瘤隨後在另外的小鼠中繁殖，無需體外培養，以建立可用於植入研究小鼠的低傳代PDX腫瘤組織庫。PDX模型的一個關鍵特徵係它們在很大程度上保持組織學和基因組異質性並保留相應的原始患者腫瘤的基因表現譜。與使用已適應體外生長的腫瘤細胞選殖群體的基於腫瘤細胞系的異種移植物模型相比，PDX模型的特徵旨在更準確地複製真實人類腫瘤的特徵，從而提高臨床前小鼠模型的預測價值。實際上，許多研究已經顯示PDX模型對標準護理治療的反應和抗性特徵與具有給定腫瘤特徵的人類受試者的臨床數據密切相關。
儘管PDX模型提供了改進，但標準體內藥理學研究設計存在限制，即使當應用於PDX模型時。對於每個腫瘤模型，一項典型的研究測試了多種劑量水平的藥物治療以及一或多種陽性或陰性對照化合物，每個治療組有足夠的小鼠來支援模型內統計。用於此類研究設計的小鼠數量相對較多，而PDX模型的成本較高，這可能會限制可以實際測試給定化合物的腫瘤模型的數量。傳統研究設計的替代/補充方法係小鼠PDX試驗，這是一種根據人類臨床試驗設計之後進行的基於群體的方法。在該方法中，對於每種化合物，通常以從先前的劑量範圍發現研究建立的單一劑量水平治療單個小鼠，對於每種模型具有視需要的治療對照組。由於每個模型所需的小鼠數量較少，因此可以測試許多PDX模型，每個代表獨特的人類腫瘤。不是依賴於模型內統計，而是在整個測試的腫瘤模型群體中評估響應。該方法可以提供對不同範圍的靶標表現、分子表型、腫瘤亞型或其他感興趣的臨床相關特徵的響應率的更準確估計。此外，可以在PDX試驗中測試的大量獨特模型可以使更有意義的探索性基因組學、轉錄組學或表現譜研究能夠開始早期搜索響應或抗性的相關性。對於本文概述的示例性研究，我們採用了「全員」方法，在START Discovery測試了所有可用的NSCLC模型，而不管靶標表現水平或分子表型如何。 8.1 方法
在德克薩斯州聖安東尼奧的南德克薩斯加速研究治療公司（START, San Antonio, TX）進行小鼠PDX試驗。START獲得了AAALAC International（國際實驗室動物護理評估和認證協會）的認可，並符合阿斯利康動物護理和福利全球標準。所有模型均為在START開發的。患者來源的異種移植物（START-PDX）模型由活的人類腫瘤組織或體液建立，並且已經在動物體內連續傳代有限次數以維持腫瘤異質性。將無胸腺裸體(Crl:NU(NCr)-Foxn1nu)/CB-17 Scid (CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl)小鼠單側植入從宿主動物身上採集的腫瘤片段，每個移植來自特定的傳代批次。在其估計開始日期之前約一週開始記錄研究前腫瘤體積。當腫瘤達到合適的腫瘤體積起始（TVI）範圍（125-250 mm 3）時，將動物隨機分成治療組和對照組，並開始靜脈內（IV）給藥（第0天）；在整個研究過程中單獨跟蹤動物。在第0天開始初始給藥；所有群組中的動物均按重量靜脈內給藥（0.01 ml/g；10 ml/kg）。每7天對藥物治療的動物給藥，總共4次給藥。從第0天開始，藉由數位卡尺測量腫瘤尺寸，並記錄每隻治療動物和對照動物的估計腫瘤體積；使用以下公式計算腫瘤體積：TV = 寬度 2× 長度 × 0.52。腫瘤生長觀察在最後一次給藥後持續一週。每隻動物在達到腫瘤體積（TV）終點（腫瘤體積 ≥ 1 cm 3）或28天的研究時間終點時處死，以先到者為準。對於一些腫瘤生長緩慢的PDX模型，觀察期有所延長。根據下式，腫瘤生長抑制（%TGI）定義為治療（TX）組與對照（C）組之間相對於第0天的腫瘤生長百分比：%TGI = 1 -(TX 最終-TX 初始)/(C 最終-C 初始)。腫瘤消退百分比定義為在研究終點根據下式計算的經治療動物中的腫瘤相對於第0天腫瘤體積（初始給藥日）的腫瘤減小百分比：%消退 = (TX 最終平均值- TX 初始平均值)/(TX 初始平均值) x 100。 8.2 結果和結論
如 圖 12所示，高親和力EGFR-cMET ADC、QD6/B09-AZ1508和對EGFR具有較低的親和力的變體RAA22/B09-AZ1508在許多測試的PDX模型中誘導腫瘤生長抑制或消退。令人驚訝的是，與較高親和力的ADC相比，較低親和力的ADC顯示出觀察到的響應的數量和深度增加的總體趨勢。對於對降低的親和力ADC反應最小的PDX模型，這種活性趨勢略微反轉，這與較低的cMET表現有些相關。該等觀察提高了較低的親和力EGFR-cMET ADC的活性部分地由cMET表現水平驅動的可能性。兩種雙特異性抗體的EGFR結合組來源於相同的小鼠EGFR交叉反應性抗體（參見 實例 1）。QD6/B09抗體對小鼠EGFR的固有結合親和力為約6 nM，而RAA22/B09雙特異性抗體的親和力為約575 nM。較低的EGFR親和力的活性之出乎意料的改善可以歸因於來自正常組織（諸如皮膚）中的EGFR吸收的降低的影響，從而導致ADC的更高的總體循環暴露。無論如何，該等數據表明，降低EGFR-cMET雙特異性抗體對EGFR的親和力不會損害所得ADC的體內功效，但與較高親和力ADC相比出乎意料地提高了活性。 8.3 不同劑量的 PDX 研究
進行了進一步的實驗以在PDX模型中測試不同劑量的ADC。如實例8.1中所述進行該實驗，不同之處在於將腫瘤體積達到 ≥ 2cm 3的個體小鼠從研究中移除並將最終測量值包括在組平均值中直至平均值達到體積終點或研究達到63天的時間終點。對於示例性研究，在1和2 mg/kg的劑量水平下測試高親和力EGFR-cMET ADC、QD6/B09-AZ1508，並且在1、2和3 mg/kg下測試對EGFR具有較低的親和力的變體RAA22/B09-AZ1508。
如 圖 13所示，高親和力EGFR-cMET ADC、QD6/B09-AZ1508和對EGFR具有較低親和力的變體RAA22/B09-AZ1508在測試劑量下在PDX模型中誘導腫瘤生長抑制活性。根據實例8.2中所述和 圖 12中所示的結果，較低親和力的ADC通常比高親和力ADC更有效。在所有四種測試的模型中，較低親和力的ADC在2或3 mg/kg劑量水平下誘導消退，表明較低親和力的ADC在適度劑量下係有效的。該等數據提供了進一步的證據，即降低EGFR-cMET雙特異性抗體對EGFR的親和力並沒有降低所得ADC的體內功效，而是與較高親和力ADC相比提高了體內功效。 實例 9 - ADC 在原位胰腺 PDX 模型中的功效
皮下體內腫瘤模型係檢驗抗癌劑功效的主要手段。然而，當解釋體內結果時，該腫瘤植入部位伴隨有許多需要考慮的限制。該等缺陷包括腫瘤血管形成和腫瘤生長和反應中缺乏組織特異性基質。為了應對該等挑戰，我們比較了高親和力和低親和力EGFR-cMET雙特異性抗體-藥物軛合物在胰腺PDX模型MEDI-PANC-08的皮下和原位模型中的體內功效。為了原位跟蹤這種腫瘤的生長，我們開發了一種表現螢光素酶的PDX變體（MEDI-PANC-08 LUC），其生長可以使用成像進行追蹤。 9.1 方法
所有實驗均在AAALAC（實驗動物護理評估和認可協會）認可的機構中進行，根據米迪繆尼公司的IACUC（機構動物護理和使用委員會）對實驗動物進行人道治療和護理的指導方針。每天監測動物的發病率和死亡率。 皮下PDX模型
本研究中使用的MEDI-PANC-08胰腺PDX模型來自Internal MedImmune PDX庫。PDX腫瘤最初在接種NSG（NOD.Cg-Prkdc scidIl2rg tm1Wjl/SzJ）小鼠中繁殖，以產生足夠的腫瘤材料接種效力研究。一旦腫瘤達到800-1200 mm 3，藉由CO 2窒息人道地處死小鼠。在無菌條件下分離腫瘤，切成約2 mm 3的塊，並使用11號套管針皮下植入個體NSG小鼠的右側腹。在達到約150-250 mm3的尺寸時，將小鼠隨機（基於腫瘤體積）分成治療組，並用ADC（Q1Wx4）治療。以1、2和3 mg/kg QD6/B09（高親和力）和RAA2/B09（低親和力）檢查了兩種EGFR-cMET雙特異性ADC。還在3 mg/kg下測試了同種型對照ADC（R347-AZ1508）。在即將使用之前，將所有抗體-藥物軛合物在緩衝液（25mM組胺酸、7%蔗糖、0.02% PS80、pH 6.0）中稀釋，並通過尾靜脈進行靜脈內投與。每週兩次收集腫瘤和體重測量值，並使用等式(LxW2)/2計算腫瘤體積，其中L和W分別指長度和寬度尺寸。 原位PDX模型
表現螢光素酶的PDX模型（MEDI-PANC-08 LUC）在NSG種子小鼠中皮下生長，體積為800-1200 mm 3，收穫腫瘤並切成約2 mm 3的碎片。隨後將腫瘤碎片縫合到NSG小鼠的胰腺（第零天）。使用IVIS光譜體內成像系統每週測定螢光素酶訊息。簡言之，在成像前10分鐘，腹膜內（i.p.）注射200ul溶解在DPBS（15 mg/ml）中的螢光素。將小鼠在3%異氟醚下麻醉，右側臥並測量發光。腫瘤植入後十四天，當清楚地檢測到發光訊息時，基於發光將小鼠隨機分組到各自的組中。用同種型對照（R347-AZ1508，3 mg/kg-Q1Wx4）、吉西他濱（75 mg/kg，Q2Dx5）和RAA2/B09ADC（2和3 mg/kg - Q1Wx4）治療小鼠。每週測量發光。研究終點包括體重減輕、身體狀況惡化和嗜睡。使用Living Image軟體（珀金埃爾默公司（Perkin Elmer））分析數據，並以平均輻射率[p/s/cm2/sr]對時間作圖。 9.2 結果和討論
為了幫助選擇EGFR-CMET雙特異性ADC的適當EGFR親和力組合，在使用MEDI-PANC-08胰腺PDX模型的體內功效研究中比較了高親和力和低親和力EGFR-cMET雙特異性ADC。如 圖 14的分圖A和B所示，在2個分子之間觀察到截然不同的差異。高親和力QD6/B09 ADC在所測試的3個劑量水平中的任一個下都沒有顯示出功效。相比之下，低親和力RAA2/B09 ADC在第65天時使腫瘤完全消退，隨後在3 mg/kg劑量水平下腫瘤重新生長並且在2 mg/kg下腫瘤生長受到抑制。
雖然皮下腫瘤模型已成為體內功效研究的工作要點，但主要缺陷在於腫瘤不是在原發部位生長，因此任何藥物反應可能無法真正反映患者的反應。為了解決這一問題，使用經轉基因修飾以穩定表現螢光素酶的MEDI-PANC-08腫瘤開發了胰臟癌的原位模型。在胰腺上手術植入後，允許腫瘤建立，隨後基於發光訊息隨機化。然後用低親和力RAA2/B09 EGFR-cMET ADC、同種型對照或吉西他濱（一種化療藥物）治療小鼠。治療後，每週測量發光。如 圖 14的分圖C所示，未治療組和同種型對照組中的發光隨著時間的推移而增加，其中動物由於身體狀況不佳和大的、可觸知的腹部腫瘤而從研究中移除。吉西他濱顯示發光信號初始減少，在第21天左右達到最低點，此後信號隨著時間的推移而增加，並在第49天將該組從研究中移除。在原位模型中，2 mg/kg和3 mg/kg劑量水平的RAA2/B09 ADC均引起發光信號降低，在第60天達到接近背景水平。與皮下研究相比，2mg/kg劑量水平表現出更好的產生腫瘤消退的活性。在研究結束時屍檢顯示發光信號接近背景的腫瘤的動物不再顯示可見的腫瘤，因此支援發光信號與腫瘤體積之間的相關性。
總之，在皮下PDX胰腺PDX模型中，與高親和力QD6/B09 ADC相比，低親和力EGFR-cMET RAA2/B09 ADC顯示出改善的功效，在3 mg/kg下觀察到腫瘤消退。在使用經工程化以穩定表現螢光素酶的相同PDX腫瘤（MEDI-PANC-08）的原位模型中也觀察到這種功效。使用發光作為腫瘤體積的替代物，在2和3 mg/kg下RAA2/B09 ADC顯示出優於皮下模型的療效，產生腫瘤消退。 實例 10 - 安全性和藥物動力學
進行藥物動力學（PK）分析以比較低親和力和高親和力EGFR-cMET ADC的血漿PK參數，包括小鼠和食蟹猴中的峰值和總暴露量、清除率和半衰期。關鍵目標係確定降低對EGFR的親和力是否會影響EGFR-cMET雙特異性ADC的循環暴露。在小鼠和食蟹猴中收集QD6/B09-57-AZ1508和RAA/B09-57-AZ1508的不同劑量水平的PK樣本。進行非房室分析以基於物種和劑量水平的總ADC濃度估計QD6/B09-57-AZ1508和RAA22/B09-57-AZ1508的PK參數。
總之，在小鼠和食蟹猴中，與QD6/B09-57-AZ1508相比，RAA22/B09-57-AZ1508顯示出更高的暴露量和延長的t½，這表明在較低親和力的RAA22/B09-57-AZ1508中PK得到改善。 10.1 臨床前 PK 測定的生物分析
目標化合物（QD6/B09-57-AZ1508和RAA22/B09-57-AZ1508）濃度和總抗體濃度用一種免疫捕獲LC-MS/MS測定法測量。簡言之，將多選殖抗人抗體與磁珠軛合。然後將25 µL血漿樣本在PBS中稀釋並與磁珠一起孵育。捕獲後，磁珠經過多次洗滌，然後在內標存在下用胰蛋白酶消化。通過添加酸來淬滅該消化。然後將液體內容物轉移至注射板。
使用逆相層析（RPLC）分離人抗體Fc區和裂解彈頭上的特徵性胰蛋白酶肽，然後使用多重反應監測（MRM）進行檢測。Fc區上的特徵性肽用於計算總Ab，而消化釋放的彈頭用於計算ADC。本實驗中使用的內標係同位素標記的肽或蛋白質（SiluMAb，西格瑪奧德里奇公司（Sigma-Aldrich））或同位素標記的彈頭。分析物與內標的峰面積比用於計算標準曲線。
藉由將不同水平的目標化合物摻加到與樣本相同的基質中來製作標準曲線和QC。定量範圍覆蓋100 ng/mL-15,000 ng/mL，稀釋QC覆蓋高達525,000 ng/mL。用最簡單的可能模型擬合標準曲線。除定量下限（LLOQ）為25%外，所有水平的測定準確度和精密度均在20%以內。 10.2 小鼠中的 QD6/B09-57-AZ1508 PK
包括在NCA分析中的小鼠研究總結在 表 4中。 [ 表 4] RAA22/B09-57-AZ1508 和 QD6/B09-57-AZ1508 的小鼠研究列表
研究 研究標題 研究設計
03-EGFR cMET-ADC-PK -15-003- A cMET-EGFR-AZ1508在裸鼠體內的藥物動力學研究 （QD6/B09-57-AZ1508） 單次IV劑量為1、3、5和10 mg/kg；在0.5、4、24、48、72、144和240小時收集血漿；ADC和總Ab的LC-MS/MS分析
RAA22/B09-AZ1508小鼠PK研究- 2016年10月 cMET-EGFR DuetMAb RAA22/B09-AZ1508在裸鼠體內的藥物動力學研究 單次IV劑量為0.5、1、3、5和10 mg/kg；在0.5小時、4小時、1天、2天、3天、6天、10天和14天收集血漿；ADC和總Ab的LC-MS/MS分析
RAA22/B09-57-AZ1508和QD6/B09-57-AZ1508在小鼠中的平均PK濃度-時間曲線呈現於 圖 15中。
在測試的劑量水平下，RAA22/B09-57-AZ1508和QD6/B09-57-AZ1508在小鼠中都表現出線性PK，在0.5 mg/kg至10 mg/kg的RAA22/B09-57-AZ1508和1 mg/kg至10 mg/kg的QD6/B09-57-AZ1508中分別觀察到與劑量成比例的暴露（C max和AUC），可比較的CL和t 1/2。
RAA22/B09-57-AZ1508與QD6/B09-57-AZ1508之間的PK比較在針對兩種化合物測試的1、3、5、10 mg/kg劑量水平下評估，並且基於NCA的平均PK參數總結於 表 5中。結果表明，RAA22/B09-57-AZ1508的CL較慢、暴露較高並且t 1/2延長，其中RAA22/B09-57-AZ1508的平均AUC與QD6/B09-57-AZ1508相比顯示出2至2.91倍的增加；RAA22/B09-57-AZ1508的平均t 1/2為4.24至6.38天，QD6/B09-57-AZ1508為2.57至3.33天，表示RAA22/B09-57-AZ1508的t 1/2增加1.27至2.32倍。 [ 表 5] 小鼠中 RAA22/B09-57-AZ1508 與 QD6/B09-57-AZ1508 之間劑量水平的平均 NCA PK 參數
劑量（ mg/kg ） 1 mg/kg 3 mg/kg 5 mg/kg 10 mg/kg
分子 RAA22/B09-57-AZ1508 QD6/B09-57-AZ1508 RAA22/B09-57-AZ1508 QD6/B09-57-AZ1508 RAA22/B09-57-AZ1508 QD6/B09-57-AZ1508 RAA22/B09-57-AZ1508 QD6/B09-57-AZ1508
C 最大 （ mg/mL ） 12.8 11.3 51.1 31.0 90.7 44.8 198 134
AUC （ mg* 天 /mL ） 41.0 20.5 136 57.5 230 87.9 494 170
t½ （天） 5.97 2.57 4.24 3.33 6.38 3.28 5.31 2.95
CL （ mL/kg/ 天） 20.8 45.7 20.0 46.9 18.5 50.8 17.3 53.8
10.3 食蟹猴中的 QD6/B09-57-AZ1508 PK
NCA分析中包括的食蟹猴研究總結在 表 6中。 [ 表 6] RAA22/B09-57-AZ1508 和 QD6/B09-57-AZ1508 的食蟹猴研究列表
研究 研究標題 研究設計
20102256 RAA22/B09-Maia-AZ1508：評價食蟹猴安全性和藥物動力學的靜脈重複劑量毒性研究 IV推注Q3 Wk x 2
20067678 食蟹猴靜脈推注EGFR cMET的8週劑量範圍發現研究 IV推注Q3 Wk x 3
20067312 在食蟹猴中藉由靜脈途徑的8週單次遞增劑量的 EGFRcMet-ADC（EGFRcMet-1508） 單次遞增IV給藥
RAA22/B09-57-AZ1508和QD6/B09-57-AZ1508在食蟹猴中的平均PK濃度-時間曲線呈現於 圖 16中。
RAA22/B09-57-AZ1508在食蟹猴中在2 mg/kg至5 mg/kg下表現出線性PK，其中觀察到與劑量成比例的暴露（C max和AUC），可比較的CL和t 1/2。
QD6/B09-57-AZ1508在食蟹猴中表現出0.67 mg/kg至3 mg/kg的非線性PK，顯示出超過劑量比例的暴露（C max和AUC），並且在較低劑量水平下觀察到較快的CL和較短的t 1/2。
食蟹猴中RAA22/B09-57-AZ1508與QD6/B09-57-AZ1508之間的PK比較在針對兩種化合物測試的2和3 mg/kg劑量水平下評估，並且基於NCA的平均PK參數總結於 表 7中。結果表明，RAA22/B09-57-AZ1508的CL較慢、暴露較高並且t 1/2延長，其中RAA22/B09-57-AZ1508的平均AUC與QD6/B09-57-AZ1508相比顯示出1.90至2.43倍的增加；RAA22/B09-57-AZ1508的平均t 1/2為4.30至5.90天，QD6/B09-57-AZ1508為0.969至1.07天，表示RAA22/B09-57-AZ1508的t 1/2增加4.44至5.51倍。 [ 表 7] 猴子中 RAA22/B09-57-AZ1508 與 QD6/B09-57-AZ1508 之間劑量水平的平均 NCA PK 參數
劑量（ mg/kg ） 2 mg/kg 3 mg/kg
分子 RAA22/B09-57-AZ1508 QD6/B09-57-AZ1508 * RAA22/B09-57-AZ1508 QD6/B09-57-AZ1508
C 最大 （ mg/mL ） 59.1 47.5 86.6 73.3
AUC （ mg* 天 /mL ） 116 47.6 179 94.4
t½ （天） 5.90 1.07 4.30 0.969
CL （ mL/kg/ 天） 16.7 42.2 16.5 31.6
總之，該等數據表明，在小鼠和食蟹猴中，與高親和力QD6/B09-57-AZ1508相比，低親和力RAA22/B09-57-AZ1508顯示出更高的暴露和更長的循環半衰期。該等數據與以下假設一致，即降低對EGFR的親和力會降低與正常組織中存在的EGFR的結合，從而減輕正常組織吸收的影響並改善血漿PK參數。 實例 11 - 具有拓撲異構酶 I 抑制劑作為有效負載的 ADC
設計了實驗來測試與不同有效負載（一種拓撲異構酶I抑制劑，而不是前述實例中使用的微管溶素）軛合的RAA22/B09-57雙特異性分子的功效和安全性。
將根據實例1產生的DuetMab RAA22/B09（在絲胺酸239後具有「Maia」半胱胺酸插入）雙特異性抗體通過與雙特異性抗體中的天然半胱胺酸「經典」軛合而與拓撲異構酶抑制劑SG3932軛合。
使用PDX試驗研究了EGFR/cMET拓撲異構酶I抑制劑ADC的功效。使用從胰臟癌、大腸癌、NSCLC和鱗狀頭頸癌（SQHN）腫瘤獲得的多種不同的PDX模型，基本上如上文實例8所述進行PDX試驗。給動物注射10 mg/kg的單劑量EGFR-cMET Maia Topo ADC。 圖 17中報導了使用EGFR-cMET Maia Topo ADC的PDX試驗的結果。
如 圖 17所示，在許多測試的PDX模型中，EGFR-cMET Maia Topo ADC誘導腫瘤生長抑制或消退。因此，該等結果證明含有拓撲異構酶I抑制劑的RAA22/B09-57ADC在代表多種腫瘤類型的PDX模型中係有效的。 實例 12 - 改善 ADC 的 PK 之突變
在實例11中產生和測試的具有拓撲異構酶I抑制劑的ADC使用在絲胺酸239後含有「Maia」半胱胺酸插入的RAA22/B09雙特異性抗體。然而，鑒於SG3932與天然半胱胺酸軛合，Maia半胱胺酸插入不是必需的。因此，我們尋求修飾實例11中產生的RAA22/B09 Maia Topo ADC以除去該半胱胺酸插入。
還認識到，如果Fc主鏈的效應子功能降低或除去，則可能減輕免疫毒性並改善藥物動力學。因此，我們還引入了L234F/L235E/P331S（EU編號）的「三重突變體（TM）」，其先前已被證明可以降低抗體分子中的Fc效應子功能（Organesyan, 2008；Hay, 2016）。
新產生的「EGFR-cMET TM」分子，包含來自RAA22和B09的可變區，除去了239i突變並引入了TM，具有下表中所示的胺基酸序列：
   EGFR-cMET TM
EGFR重鏈 59
c-Met重鏈 60
EGFR輕鏈 61
c-Met輕鏈 62
為了與SG3932軛合，將50 mM三(2-羧乙基)膦（TCEP）的磷酸鹽緩衝鹽水pH 7.4（PBS）溶液（12.5莫耳當量/抗體）添加到EGFR-cMET TM雙特異性抗體的含有PBS和1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的還原緩衝液溶液中，並且最終抗體濃度為約3 mg/mL。使還原混合物在37°C下在溫和（60 rpm）振盪的定軌振盪器中孵育2小時。使反應混合物冷卻至室溫45分鐘。然後添加SG3932作為DMSO溶液（12.5莫耳當量/抗體），達到10%（ v/v）的最終DMSO濃度。將溶液在室溫下孵育2小時，然後藉由添加N-乙醯基半胱胺酸（5微莫耳/SG3932）猝滅，並在室溫下孵育15分鐘。使用0.2 uM無菌過濾器過濾反應混合物，然後在2-8°C下儲存過夜。通過切向流過濾單元（TFF），使用表面積為375 cm 2的mPES、MidiKros® 30 kDa纖維過濾器去除到含有30 mm組胺酸、30 mM精胺酸、pH 6.8的緩衝液中。使用純軛合物藉由UHPLC-RP監測游離藥物去除的程度。在完全除去游離藥物後，對ADC進行緩衝液更換。在無菌氣氛下使用0.22 µm過濾器過濾ADC，然後添加聚山梨醇酯-80至0.02%（w/v）的最終濃度。
在Shimadzu Recience系統上使用Thermo Scientific MAbPac 50 mm × 2.1 mm柱在214 nm和330 nm（SG3932特異性）下用水和乙腈對ADC還原樣本進行梯度洗脫的UHPLC分析揭示了每抗體6.0個SG3932分子的藥物/抗體比率（DAR）。
使用PDX試驗研究了EGFR cMET TM ADC的功效。使用從胰腺、結腸、NSCLC和SQHN腫瘤獲得的一系列不同PDX模型，基本上如上文實例8所述進行PDX試驗。給動物注射5 mg/kg的單劑量EGFR-cMET TM ADC。 圖 18中報導了使用EGFR-cMET TM ADC的PDX試驗的結果。該實驗的結果證明，EGFR-cMET TM ADC能夠在許多測試的PDX模型中誘導腫瘤生長抑制或消退。
在PDX模型SQHN-02和PANC-08中比較EGFR-cMET TM ADC（「TM ADC」）與實例11中產生的EGFR-cMET Maia Topo ADC（「Maia ADC」）的功效。給動物投與2.5 mg/kg、5 mg/kg或10 mg/kg的每種ADC並監測腫瘤生長。該實驗還包括未處理的對照（「未處理的」）和用未軛合的EGFR-cMET TM（TM mAb）給藥的動物。結果如 圖 19所示。
結果證明，EGFR-cMET TM ADC和EGFR-cMET Maia Topo ADC在所測試的劑量範圍下在減少腫瘤生長/誘導腫瘤消退方面同樣有效（「等效」）。這表明使用三重突變體去除S239i突變和消除Fc效應子功能不會負面影響該等腫瘤模型中的功效。
EGFR-cMET TM ADC還顯示可有效減少表現野生型或突變型EGFR的NSCLC腫瘤的生長。結果顯示EGFR-cMET TM ADC在野生型和突變型EGFR PDX模型中都具有活性，如 圖 20所示。這是有利的，因為這表明ADC將能夠在多種治療環境中和在一系列不同EGFR基因型中提供益處。
最後，在NOD-SCID小鼠中進行藥物動力學（PK）研究以比較實例11中產生的EGFR-cMET TM ADC（「TM ADC」）和EGFR-cMET Maia Topo ADC（「Maia ADC」）。主要如實例10所述進行實驗。
該等PK研究的代表性結果提供於 圖 21中。如該圖所示，與EGFR-cMET Maia Topo ADC（t ½= 3.0天；CL = 39.7 ml/天/kg）相比，EGFR-cMET TM ADC表現出更長的半衰期（t ½= 5.0天）和降低的藥物清除率（CL = 14.8 ml/天/kg）。因此，結果表明，與實例10中製備的EGFR-cMET Maia Topo ADC相比，本文所述之EGFR-cMET TM ADC顯示出改善的PK。當比較未軛合的EGFR-cMET TM抗體（「TM mAb」）和未軛合的EGFR-cMET Maia（「Maia ADC」）時，也觀察到PK的類似改善。 實例 13 - 在用 EGFR-CMET TOP1i TM ADC 處理後的 EGFR 和 cMet 受體降解
如下藉由西方墨點分析進行抗體介導的受體降解：將HCC827 GR池細胞以6 × 10 5細胞/孔接種在12孔培養板（Corning/Costar）的2 ml含有10%熱滅活胎牛血清（HI FBS，吉布科公司（Gibco））的RPMI（吉布科公司）培養基中。使細胞在37°C和5% CO 2培養箱中黏附並生長過夜。第二天早晨，小心吸出生長培養基，並用1 mL含有表9中確定的測試mAb的新鮮生長培養基處理細胞，每種mAb的最終濃度為10微克/mL。將細胞在37°C下在5% CO 2的加濕生長室中孵育24小時。然後小心吸去培養基，並用2 mL不含鈣和鎂的Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水（DPBS）洗滌細胞一次。藉由添加150微升含有完全蛋白酶抑制劑混合物（羅氏公司（Roche））和PhosStop磷酸酶抑制劑混合物（羅氏公司）的M-per哺乳動物蛋白提取試劑（賽默飛世爾公司（Thermo Scientific））裂解細胞。為了促進更完全的裂解，將板轉移到-80°C並進行一次凍融循環。將所得裂解物轉移到微量離心管，並藉由在4°C微量離心管中以最大速度（14,000 RPM）離心10分鐘除去細胞碎片，將上清液轉移到乾淨的微量離心管中，並在分析前儲存在-80°C。藉由使用Pierce BCA蛋白質測定套組（賽默飛世爾公司）測量蛋白質濃度。
對於西方墨點分析，使用4× LDS（英傑公司）和10×樣本還原劑（英傑公司）製備樣本以達到在16微升體積中10微克蛋白質（1× LDS和1×樣本還原劑）的最終蛋白質濃度。將樣本在95°C下加熱10分鐘，然後冷卻至室溫並短暫離心。將10微克蛋白質/樣本在MOPS緩衝液中上樣到4%-12% Bis-Tris凝膠（NuPage，英傑公司）上，並在200 V恒定電壓下進行一小時電泳。根據製造商的方案，使用iBlot轉移裝置（英傑公司）將分離的蛋白質轉移到膜[聚偏二氟乙烯（PDVF）]上。在室溫下用Pierce無蛋白T20（PBS）封閉緩衝液（賽默飛世爾公司）封閉印漬一小時。然後與初級特異性抗體在4oC下[（總cMET的1 : 4,500稀釋度；總EGFR的1 : 2,500稀釋度和1 : 15,000 β-肌動蛋白]（細胞傳訊技術公司（Cell Signaling Technologies））下在封閉緩衝液中孵育過夜。使用SuperSignal West Dura ECL試劑（Pierce/賽默飛世爾公司），用山葵過氧化物酶（HRP）標記的二抗（Jackson Immunoresearch）檢測特異性結合的抗體。用GE Image Quant LAS 4000捕獲圖像。 [表9]：在受體降解分析中使用的測試mAb
試劑 描述
R347-TM hIgG 對照IgG
RAA22/R347 EGFR mAb EGFR虛擬組mAb，包含分別為SEQ ID No: 18和20的EGFR結合VH和VL結構域，以及與cMet結合組相對的R347 VH和VL結構域序列，並且沒有TOP1i有效負載
B09/R347 cMET mAb cMet虛擬組mAb，包含分別為SEQ ID No: 38和40的cMet結合VH和VL結構域，以及與EGFR結合組相對的R347 VH和VL結構域序列，並且沒有TOP1i有效負載
EGFR/cMET雙特異性mAb 包含分別為SEQ ID No: 18和20的EGFR結合VH和VL結構域和分別為SEQ ID No: 38和40的cMet結合VH和VL結構域，但沒有TOP1i有效負載
EGFR-cMet TOP1i TM ADC 包含SEQ ID NO: 59的第1重鏈，SEQ ID NO: 60的第2重鏈，SEQ ID NO: 61的第1輕鏈和SEQ ID NO: 62的第2輕鏈，加上TOP1i有效負載SG3932
埃萬妥單抗 如例如US 9593164 B2的請求項1中所述
結果如圖22所示，表明R347虛擬組mAb或其組合不誘導顯著的受體下調，而雙特異性則誘導顯著的受體下調。這與當EGFR和cMet靶標都參與時mAb內化係最佳的假設一致。此外，EGFR-cMET mAb似乎會引起cMet的一些降解和與EGFR-cMet TOP1i TM ADC相當量的EGFR降解。此外，EGFR-cMet TOP1i TM ADC似乎比埃萬妥單抗（一種最近批准的EGFR-cMet雙特異性藥物，據報導其誘導受體降解）誘導更多的cMet降解。 參考文獻
上文引用了許多出版物以便更全面地描述和揭露本揭露以及本揭露所屬領域的技術水平。下面提供了該等參考文獻的完整引用。該等參考文獻中的每一篇參考文獻整體併入本文。
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Molecular Cloning, A Laboratory Manual.[分子選殖實驗指南] 第3版, 2001, Cold Spring Harbor, New York [紐約州冷泉港]：Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社]） 序列附件 抗 EGFR 抗體殖株 RAA22 的 CDR 序列HCDR1 - DNDFS（SEQ ID NO: 1） HCDR2 - AIVAVFRTETYAQKFQD（SEQ ID NO: 2） HCDR3 - RLMSAISGPGAPLLM（SEQ ID NO: 3） LCDR1 - TGTSSDVGGYNYVS（SEQ ID NO: 4） LCDR2 - DVSKRPS（SEQ ID NO: 5） LCDR3 - SSYTSSDTLEI（SEQ ID NO: 6） 抗 EGFR 抗體殖株 QD6 的 CDR 序列HCDR1 - DNDFS（SEQ ID NO: 1） HCDR2 - AIVAVVRTETYAQKFQD（SEQ ID NO: 7） HCDR3 - RLMSAISGPGAPLLM（SEQ ID NO: 3） LCDR1 - TGTSSDVGGYNYVS（SEQ ID NO: 4） LCDR2 - DVSERPS（SEQ ID NO: 66） LCDR3 - FSYTSSDTLEI（SEQ ID NO: 67） 抗 EGFR 抗體殖株 RAA22 和 QD6 的 FR 序列HFR1 - QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS（SEQ ID NO: 8） HFR2 - WVRQAPGQGLEWMG（SEQ ID NO: 9） HFR3 - RVKITADISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCAR（SEQ ID NO: 10） HFR4 - WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 11） LFR1 - QSALTQPRSVSGSPGQSVTISC（SEQ ID NO: 12） LFR2 - WYQQHPGKAPKLMIY（SEQ ID NO: 13） LFR3 - GVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC（SEQ ID NO: 14） LFR4 - FGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 15） 抗 EGFR 抗體殖株 RAA22 的可變重鏈（ VH ）區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 16 ）QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDNDFSWVRQAPGQGLEWMGAIVAVFRTETYAQKFQDRVKITADISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCARRLMSAISGPGAPLLMWGQGTLVTVSS 抗 EGFR 抗體殖株 RAA22 的 VH 區的核酸序列（ SEQ ID NO: 17 ）：CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAAGCCAGCGGCGGCACCTTCAGCGACAACGACTTTAGCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGA ATGGATGGGAGCCATCGTGGCCGTGTTCCGGACAGAGACATACGCCCAGAAATTCCAGGACAGAGTGAA AATCACCGCCGACATCAGCACCAGAACCACCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCAGACGGCTGATGTCTGCCATCTCTGGACCTGGCGCTCCTCTGCTCATGTGGGGACAGGGAACACTGGTCACCGTGTCCAGC 抗 EGFR 抗體殖株 QD6 的 VH 區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 18 ）：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDNDFSWVRQAPGQGLEWMGAIVAVVRTETYAQKFQDRVKITADISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCARRLMSAISGPGAPLLMWGQGTLVTVSS 抗 EGFR 抗體殖株 QD6 的 VH 區的核酸序列（ SEQ ID NO: 19 ）：CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAAGCCAGCGGCGGCACCTTCAGCGACAACGACTTTAGCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGA ATGGATGGGAGCCATCGTGGCCGTGGTCCGGACAGAGACATACGCCCAGAAATTCCAGGACAGAGTGAA AATCACCGCCGACATCAGCACCAGAACCACCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCAGACGGCTGATGTCTGCCATCTCTGGACCTGGCGCTCCTCTGCTCATGTGGGGACAGGGAACACTGGTCACCGTGTCCAGC 抗 EGFR 抗體殖株 RAA22 的可變輕鏈（ VL ）區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 20 ）：QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSDTLEIFGGGTKLTVL 抗 EGFR 抗體殖株 RAA22 的 VL 區的核酸序列（ SEQ ID NO: 21 ）：CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAA ACTCATGATTTATGATGTCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGC AACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGTTCATATA CAAGCAGCGACACTCTCGAAATATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA 抗 EGFR 抗體殖株 QD6 的 VL 區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 22 ）：QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSERPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCFSYTSSDTLEIFGGGTKLTVL 抗 EGFR 抗體殖株 QD6 的 VL 區的核酸序列（ SEQ ID NO: 23 ）：CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAA ACTCATGATTTATGATGTCAGTGAACGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGC AACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCTTCTCATATA CAAGCAGCGACACTCTCGAAATATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA 抗 c-Met 抗體殖株 B09-GL 的 CDR 序列HCDR1 - DYYIH（SEQ ID NO: 24） HCDR2 - WMNPNSGNTGYAQKFQG（SEQ ID NO: 25） HCDR3 - GQGYTHS（SEQ ID NO: 26） LCDR1 - RASEGIYHWLA（SEQ ID NO: 27） LCDR2 - KASSLAS（SEQ ID NO: 28） LCDR3 - QQYSNYPPT（SEQ ID NO: 29） 抗 c-Met 抗體殖株 B09-GL 的 FR 序列HFR1 - QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT（SEQ ID NO: 30） HFR2 - WVRQATGQGLEWMG（SEQ ID NO: 31） HFR3 - RVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR（SEQ ID NO: 32） HFR4 - WGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 33） LFR1 - DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC（SEQ ID NO: 34） LFR2 - WYQQKPGKAPKLLIY（SEQ ID NO: 35） LFR3 - GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC（SEQ ID NO: 36） LFR4 - FGGGTKLEIK（SEQ ID NO: 37） 抗 c-Met 抗體殖株 B09-GL 的可變重鏈（ VH ）區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 38 ）：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGQGYTHSWGQGTMVTVSS 抗 c-Met 抗體殖株 B09-GL 的 VH 區的核酸序列（ SEQ ID NO: 39 ）：CAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCAGCGTGAAGGTCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGCCAGGCCACAGGCCAGGGACTGGAA TGGATGGGCTGGATGAACCCCAACAGCGGCAACACCGGCTACGCCCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATGACCCGGGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGTGCCAGAGGCCAGGGCTACACCCACAGCTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACAGTGTCCAGC 抗 c-Met 抗體殖株 B09-GL 的可變輕鏈（ VL ）區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 40 ）：DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASEGIYHWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSNYPPTFGGGTKLEIK 抗 c-Met 抗體殖株 B09-GL 的 VL 區的核酸序列（ SEQ ID NO: 41 ）：GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCACCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCGAGGGCATCTACCACTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCT GCTGATCTACAAGGCCAGCAGCCTGGCCAGCGGAGTCCCTAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCAGCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAACTACCCCCCCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG 人免疫球蛋白 G1 重鏈恒定（ CH ）區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 42 ）：ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 經修飾以包括「杵」突變、鏈間半胱胺酸突變、半胱胺酸以形成穩定化二硫鍵並且具有半胱胺酸插入的人免疫球蛋白 G1 CH 區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 43 ）：以下取代標有下劃線： 「杵」突變（T366W）；鏈間半胱胺酸突變（F126C和C219V）；穩定化半胱胺酸突變（S354C）；以及半胱胺酸插入（C239i），其中殘基的編號根據EU索引。 ASTKGPSV CPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS VDKTHTCPPCPAPELLGGPS C VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP CREEMTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 經修飾以包括「杵」突變、鏈間半胱胺酸突變、半胱胺酸以形成穩定化二硫鍵並且沒有半胱胺酸插入的人免疫球蛋白 G1 CH 區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 44 ）：以下取代標有下劃線： 「杵」突變（T366W）；鏈間半胱胺酸突變（F126C和C219V）；以及穩定化半胱胺酸突變（S354C），其中殘基的編號根據EU索引。 ASTKGPSV CPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS VDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP CREEMTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 經修飾以包括「臼」突變、半胱胺酸以形成穩定化二硫橋並且具有半胱胺酸插入的人免疫球蛋白 G1 CH 區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 45 ）：以下取代標有下劃線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；穩定化半胱胺酸突變（Y349C）；以及半胱胺酸插入（C239i），其中殘基的編號根據EU索引。 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS C VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 經修飾以包括「臼」突變、半胱胺酸以形成穩定化二硫鍵並且沒有半胱胺酸插入的人免疫球蛋白 G1 CH 區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 46 ）：以下取代標有下劃線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；以及穩定化半胱胺酸突變（Y349C），其中殘基的編號根據EU索引。 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 野生型人免疫球蛋白 κ 恒定區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 47 ）：RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 經修飾以包括 S121C 和 C214V 取代的人免疫球蛋白 κ 恒定區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 48 ）：以下取代標有下劃線： S121C和C214V，其中編號根據EU索引 RTVAAPSVFIFPP C DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE V 人免疫球蛋白 λ 恒定區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 49 ）：GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 具有半胱胺酸插入的抗 c-Met 抗體殖株 B09-GL 的重鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 50 ）：以下取代標有下劃線： 「杵」突變（T366W）；鏈間半胱胺酸突變（F126C和C219V）；穩定化半胱胺酸突變（S354C）；以及半胱胺酸插入（C239i），其中殘基的編號根據EU索引。 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGQGYTHSWGQGTMVTVSSASTKGPSV C PLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKS V DKTHTCPPCPAPELLGGPS C VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP C REEMTKN QVSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有半胱胺酸插入的抗 c-Met 抗體殖株 B09-GL 的重鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 51 ）：以下取代標有下劃線： 「杵」突變（T366W）；鏈間半胱胺酸突變（F126C和C219V）；以及穩定化半胱胺酸突變（S354C），其中殘基的編號根據EU索引。 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGQGYTHSWGQGTMVTVSSASTKGPSV C PLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKS V DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP C REEMTKNQ VSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗 c-Met 抗體殖株 B09-GL 的輕鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 52 ）：以下取代標有下劃線： S121C和C214V，其中編號根據EU索引 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASEGIYHWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSNYPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP C DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE V 具有半胱胺酸插入的抗 EGFR 抗體殖株 QD6 的重鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 53 ）：以下取代標有下劃線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；穩定化半胱胺酸突變（Y349C）；以及半胱胺酸插入（C239i），其中殘基的編號根據EU索引。 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDNDFSWVRQAPGQGLEWMGAIVAVVRTETYAQKFQDRVKITADISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCARRLMSAISGPGAPLLMWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS C VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 沒有半胱胺酸插入的抗 EGFR 抗體殖株 QD6 的重鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 54 ）：以下取代標有下劃線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；以及穩定化半胱胺酸突變（Y349C），其中殘基的編號根據EU索引。 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDNDFSWVRQAPGQGLEWMGAIVAVVRTETYAQKFQDRVKITADISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCARRLMSAISGPGAPLLMWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 抗 EGFR 抗體殖株 QD6 的輕鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 55 ）：QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSERPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCFSYTSSDTLEIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 具有半胱胺酸插入的抗 EGFR 抗體殖株 RAA22 的重鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 56 ）：以下取代標有下劃線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；穩定化半胱胺酸突變（Y349C）；以及半胱胺酸插入（C239i），其中殘基的編號根據EU索引。 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDNDFSWVRQAPGQGLEWMGAIVAVFRTETYAQKFQDRVKITADISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCARRLMSAISGPGAPLLMWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS C VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 沒有半胱胺酸插入的抗 EGFR 抗體殖株 RAA22 的重鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 57 ）：以下取代標有下劃線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；以及穩定化半胱胺酸突變（Y349C），其中殘基的編號根據EU索引。 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDNDFSWVRQAPGQGLEWMGAIVAVFRTETYAQKFQDRVKITADISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCARRLMSAISGPGAPLLMWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS C VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 抗 EGFR 抗體殖株 RAA22 的輕鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 58 ）：QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSDTLEIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 「 EGFR-cMET TM 」抗體中抗 EGFR 的重鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 59 ）：以下取代標有下劃線： 三重突變（TM；L234F、L235E和P331S）；「杵」突變（T366W）；鏈間半胱胺酸突變（F126C和C219V）；穩定化半胱胺酸突變（S354C），其中殘基的編號根據EU索引。 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDNDFSWVRQAPGQGLEWMGAIVAVFRTETYAQKFQDRVKITADISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCARRLMSAISGPGAPLLMWGQGTLVTVSSASTKGPSV C PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS V DKTHTCPPCPAPE FE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA S IEKTISKAKGQPREPQVYTLPP C REEMTKNQVSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 「 EGFR-cMET TM 」抗體中抗 c-Met 的重鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 60 ）：以下取代標有下劃線： 三重突變（TM；L234F、L235E和P331S）；「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；以及穩定化半胱胺酸突變（Y349C），其中殘基的編號根據EU索引。 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGQGYTHSWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPE FE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA S IEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQ VSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 「 EGFR-cMET TM 」抗體中抗 EGFR 的輕鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 61 ）：以下取代標有下劃線： S121C和C214V，其中編號根據EU索引 QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSDTLEIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPP C SEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTE V S 「 EGFR-cMET TM 」抗體中抗 c-Met 的輕鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 62 ）：DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASEGIYHWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLASGVPSRFSGSGSGTEFTLT ISSLQPDDFATYYCQQYSNYPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 經修飾以包括「杵」突變、半胱胺酸以形成穩定化二硫橋、沒有半胱胺酸插入並且具有 TM 的人免疫球蛋白 G1 CH 區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 63 ）：以下取代標有下劃線： 三重突變（TM；L234F、L235E和P331S）；「杵」突變（T366W）；鏈間半胱胺酸突變（F126C和C219V）；穩定化半胱胺酸突變（S354C），其中殘基的編號根據EU索引。 ASTKGPSV C PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS V DKTHTCPPCPAPE FE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA S IEKTISKAKGQPREPQVYTLPP C REEMTKNQVSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 經修飾以包括「臼」突變、半胱胺酸以形成穩定化二硫橋、沒有半胱胺酸插入並且具有 TM 的人免疫球蛋白 G1 CH 區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 64 ）：以下取代標有下劃線： 三重突變（TM；L234F、L235E和P331S）；「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；以及穩定化半胱胺酸突變（Y349C），其中殘基的編號根據EU索引。 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPE FE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA S IEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 經修飾以包括 S121C 和 C214V 取代的人免疫球蛋白 λ 恒定區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 65 ）：GQPKAAPSVTLFPP C SEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTE V S 人EGFR細胞外結構域的胺基酸序列（SEQ ID NO: 68）： LEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERI PLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADS YEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQ ELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKN LCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCN LLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPS 食蟹猴EGFR細胞外域的胺基酸序列（SEQ ID NO: 69）： LEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERI PLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSEFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADS YEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDTLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQ ELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKN LCYANTINWKKLFGTSSQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCQNVSRGRECVDKCN ILEGEPREFVENSECIQCHPECLPQVMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCARNGPKIPS 人c-Met細胞外結構域的胺基酸序列（SEQ ID NO: 70）： ECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQC PDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSK PGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHC FNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSG PSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKC VRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTM NTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLNSVSVP RMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPV MISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVI VQPDQNFT 食蟹猴c-Met細胞外結構域的胺基酸序列（SEQ ID NO: 71）： ECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETAIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPNQC PDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPHHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYIHAFESNNFIYFLTVQRETLNAQTFHTRIIRFCSLNSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCF NRTLLRNSSGCEARRDEYRAEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFVKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHPLNQNGYTLVVTGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKC VRSEECPSGTWTQQICLPAIYKVFPTSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTM NTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPIITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGK TCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLHSVSVP RMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPV MISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVI VQPDQNFT
無
現在將參考附圖來討論說明本揭露原理之實例和實驗，其中：
[ 圖 1A]. RAA22/B09-57之圖形描述。所示的是抗EGFR RAA22的Fab、抗cMET B09-57的Fab以及臼（Hole）和杵（Knob）重鏈。結構繪製係單個結構域結構的合成。
[ 圖 1B]. QD06/B09-57之圖形描述。所示的是抗EGFR QD06的Fab、抗cMET B09-57的Fab以及臼（Hole）和杵（Knob）重鏈。結構繪製係單個結構域結構的合成。
[ 圖 2].藉由Octet分析進行使用抗原捕獲形式的同時結合研究。負載有人cMET抗原的感測器首先與抗體然後與人EGFR抗原進行連續的締合和解離相互作用。Ass = 締合；Diss = 解離；NI-NTA = 鎳-次氮基三乙酸。
[ 圖 3A]. ELISA結果顯示EGFR和c-Met物種交叉反應性。與人、食蟹猴和小鼠EGFR結合的高親和力單特異性EGFR IgG QD6以及一價雙特異性EGFR/cMET DuetMAb QD6/B09。親和力降低的單特異性EGFR IgG RAA22與QD6和相應的一價雙特異性EGFR/c-Met DuetMAb RAA22/B09相比與人、食蟹猴和小鼠EGFR的結合更弱，顯示出相對於二價親本IgG RAA22與人和食蟹猴EGFR的結合仍然較弱，並且顯示出與小鼠EGFR的標稱結合。單特異性c-Met IgG B09以及所有雙特異性變體顯示與人和食蟹猴c-Met相當的結合，但與小鼠c-Met沒有可檢測的結合。
[ 圖 3B] ELISA結果顯示EGFR和c-Met家族特異性。所測試的抗體均未顯示出與任何EGFR HER家族蛋白（HER2、HER3或HER4）或任何c-Met家族成員（Ron（CD136）或Semaphorin 3a）的任何可感知的結合。
[ 圖 4] . RAA22/B09雙特異性mAb的內化和向酸化細胞內隔室的運輸使用用pHAb pH敏感性染料（普洛麥格公司（Promega））標記的抗體顯現。對照抗體包括R347同種型對照和一價雙特異性對照抗體抗EGFR RAA22/R347和抗cMET B09/R347。將pHAb標記的抗體與NCI-H1975肺癌細胞一起在37°C和5% CO 2的加濕培養箱中以1.25 ug/mL的濃度孵育。在指定時間點使用Cy3過濾器在Operetta高含量成像系統上捕獲螢光圖像。細胞螢光強度隨時間增加被認為是內化和向酸性細胞內隔室的運輸的證據，如藉由pH敏感性螢光劑所測量的。
[ 圖 5]與圖4一樣，RAA22/B09雙特異性mAb的內化和向酸化細胞內隔室的運輸使用用pHAb pH敏感性染料標記的抗體顯現，但細胞用0.625 ug/mL的較低濃度的抗體處理。
[ 圖 6A]. QD6/B09和RAA22/B09單株抗體（mAb）在H1975細胞中內化的動力學。(a) 在內化開始時和1小時後，用針對細胞質的CellTracker Blue CMAC（藍色）以及用2.5 ug/mL QD6/B09-AlexaFluor647（品紅色，上圖）或2.5 ug/mL RAA22/B09AlexaFluor-647（品紅色，下圖）標記的細胞的圖像疊加。細胞用CellTracker Blue CMAC標記，然後在2-8°C下與mAbs-AlexaFuor6457結合，並經受以下內化條件：（37°C、70%濕度和5% CO2）。
[ 圖 6B]. QD6/B09和RAA22/B09單株抗體（mAb）在H1975細胞中內化的動力學。mAb-AlexaFluor647內化的時間過程藉由使用演算法（材料和方法）對動力學圖像進行定量分析來確定。使用演算法（Vainshtein, 2015）處理以5分鐘間隔拍攝的動力學圖像以確定細胞質中的抗體積聚。對於QD6/B09-AlexaFluor647（紅色）與RAA22/B09-AlexaFluor647（藍色），細胞質中的抗體訊息歸一化為細胞中的抗體螢光（細胞質中的級分）顯示為三個獨立實驗之一。使用方程F 細胞質(t) = (1−e − k int ⋅ t)⋅F 最大 , 細胞質的曲線擬合，從內化的時間過程計算內化速率常數（kint），其中F 最大 , 細胞質係每個細胞的細胞質強度與每個細胞的總強度的最大比率。由k int計算的QD6/B09的T ½為37.5 ± 10.6 min，RAA22/B09為43.2 ± 15.5（n = 3）。
[ 圖 7A] .QD6/B09 DuetMab及其各自的單組對照抗體的內化曲線。通過每個構建體各自的膜和細胞質訊息的時間進程顯示內化曲線。QD6/B09組係使用Opera共聚焦螢光顯微鏡獲得的。
[ 圖 7B]. RAA22/B09 DuetMab及其各自的單組對照抗體的內化曲線。通過每個構建體各自的膜和細胞質訊息的時間進程顯示內化曲線。使用Zeiss旋轉盤共聚焦螢光顯微鏡獲得該組。
QD6/B09和QD6/IgG的相同曲線圖表明QD6/B09 DuetMab的EGFR-組驅動的內化模式，而RAA22/B09 DuetMab需要EGFR和c-MET組的接合以有效內化。
[ 圖 8A]. RAA22/B09-AZD1508 ADC在表現中等和高靶標c-MET和EGFR細胞表面受體的細胞中的內化曲線。所示的是H1975細胞中RAA22/B09-AF647 ADC的膜、細胞質和總訊息。示出了2的一個代表性實驗。H1975細胞顯示總強度和細胞膜強度的同時下降，表明抗體從細胞表面解離。
[ 圖 8B]等同於圖8A，但在HCC827細胞中。HCC827細胞在整個實驗時間過程中具有穩定的總訊息。膜訊息的降低係衍生的抗體內化。
[ 圖 9A]. RAA22/B09-AZD1508 ADC單臂對照抗體在HCC827細胞中的內化。由於通過單組結合與EGFR的結合較弱，RAA22/IgG單組的強度曲線比RAA22/B09低約10倍。
[ 圖 9B] B09/IgG單組與細胞膜解離，表現為總訊息和膜訊息隨時間同時下降。
[ 圖 10]. EGFR或cMETR的阻斷降低體外雙特異性ADC活性。NCI H1975細胞用過量的未設組親本抗體預處理以阻斷EGFR或cMET。接著，將EGFR-cMET ADC（RAA22/B09-AZ1508）以4X系列稀釋系列添加到細胞中，最終濃度為67 nM至0.0009 nM。將經處理的細胞在加濕培養箱中在37°C和5% CO 2下培養72小時。使用CellTiter-Glo發光活力測定（普洛麥格公司）測定代謝活性。將數據繪製為相對於未處理對照的代謝活性百分比。使用GraphPad Prism軟體，使用最大生存力（未處理的細胞）與最大響應（峰抑制）之間的邏輯非線性回歸分析來確定IC50值。
[ 圖 11]. 與雙特異性EGFR/cMET ADC相比，針對EGFR或cMET的一價ADC具有降低的體外活性。藉由將每個結合組與非結合同種型對照組（R347）配對以產生EGFR ADC（RAA22/R347-AZ1508）和抗cMET ADC（B09/R347-AZ1508）來構建一價ADC。將ADC以4X系列稀釋系列添加到NCI H1975細胞中，最終濃度為67 nM至0.0009 nM。如圖9所述確定代謝活性百分比。
[ 圖 12A]示出了為確定高親和力（QD6/B09-AZ1508）和低親和力（RAA22/B09-AZ1508）EGFR-cMET ADC在免疫缺乏小鼠中的大量人類癌症患者來源的異種移植物（PDX）模型中的功效而進行的小鼠PDX試驗的結果。對於代表不同人類腫瘤的每個PDX模型，在單個小鼠中以3 mg/kg的單劑量水平測試每種化合物。計算生長大於初始體積的腫瘤相對於未治療的對照腫瘤的腫瘤生長百分比（%T/C），並計算顯示與初始腫瘤體積相比尺寸減小的腫瘤的腫瘤消退百分比。(A) 示出了每個模型中的高親和力和低親和力ADC的直接比較，並且
[ 圖 12B]示出了QD6/B09-AZ1508的以功效等級排序的瀑布圖。
[ 圖 12C]示出了RAA22/B09-AZ1508的以功效等級排序的瀑布圖。
[ 圖 13]. PDX模型中的劑量範圍發現體內功效研究在單側植入從宿主動物身上採集的腫瘤片段的無胸腺裸體小鼠中進行。如圖中所示，在1和2 mg/kg的劑量水平下測試高親和力EGFR-cMET ADC、QD6/B09-AZ1508，並且在1、2和3 mg/kg下測試對EGFR具有較低的親和力的變體RAA22/B09-AZ1508。在開始給藥後每週兩次進行腫瘤體積測量，並繪製為腫瘤體積隨時間變化的線圖。誤差條代表平均值的標準誤差（SEM），插圖示出了每個模型的EGFR和cMET的免疫組織化學染色，其來自取自該模型早期傳代的腫瘤組織。
[ 圖 14A]皮下和原位胰腺PDX模型中EGFR-cMET雙特異性ADC的體內功效。 A)高親和力QD6/B09 ADC在皮下MEDI-PANC-08 PDX模型、● -未處理、■ -R347-AZ1508（3 mg/kg - Q1Wx4）、▲ - QD6/B09-1508（1 mg/kg - Q1Wx4）、▼ - QD6/B09-1508（2 mg/kg - Q1Wx4）和Â - QD6/B09-1508（3 mg/kg - Q1Wx4）中的體內功效。每週兩次測量腫瘤體積。
[ 圖 14B]低親和力RAA2/B09 ADC在皮下MEDI-PANC-08 PDX模型、● -未處理、■ -R347-AZ1508（3 mg/kg - Q1Wx4）、▲ - RAA2/B09-1508（1 mg/kg - Q1Wx4）、▼ - RAA2/B09-1508（2 mg/kg - Q1Wx4）和Â - RAA2/B09-1508（3 mg/kg - Q1Wx4）中的體內功效。每週兩次測量腫瘤體積。
[ 圖 14C]原位MEDI-PANC-08 LUC（螢光素酶表現）PDX模型的螢光素酶成像。使用IVIS光譜體內成像系統每週對小鼠成像。使用設置在最大訊息（第21天對照Gp）與背景之間的輻射率標度（平均輻射率[p/s/cm2/sr]）對所有組和時間點的圖像進行歸一化。
[ 圖 14D]低親和力RAA2/B09 ADC在皮下MEDI-PANC-08 PDX模型、● -未處理、■ -吉西他濱（75 mg/kg - Q3/4Dx5）、▲ - π R347-AZ1508（3 mg/kg - Q1Wx4）、▼ - RAA2/B09-1508（2 mg/kg - Q1Wx4）和Â - RAA2/B09-1508（3 mg/kg - Q1Wx4）中的體內功效。治療天數用箭頭表示，每週兩次測量腫瘤體積。在分圖 A和 B中顯示的數據係組平均腫瘤體積（mm 3）± SEM，在分圖D中係組平均輻射率[p/s/cm2/sr] ± SEM。
[ 圖 15A]小鼠中RAA22/B09-57-AZ1508的平均濃度-時間曲線和平均NCA PK參數。目標化合物濃度和總抗體濃度用一種免疫捕獲LC-MS/MS測定法測量。 圖 15B小鼠中QD6/B09-57-AZ1508的平均濃度-時間曲線和平均NCA PK參數。目標化合物濃度和總抗體濃度用一種免疫捕獲LC-MS/MS測定法測量。
使用逆相層析（RPLC）分離人抗體Fc區和裂解彈頭上的特徵性胰蛋白酶肽，然後使用多重反應監測（MRM）進行檢測。Fc區上的特徵性肽（VVSVLTVLHQDWLNGK）用於計算總Ab，而消化釋放的彈頭用於計算RAA22/B09 ADC。本實驗中使用的內標係同位素標記的肽或蛋白質（SiluMAb，西格瑪奧德里奇公司（Sigma-Aldrich））或同位素標記的彈頭。分析物與內標的峰面積比用於計算標準曲線。
藉由將不同水平的RAA22/B09 ADC摻加到與樣本相同的基質中來製作標準曲線和QC。定量範圍覆蓋100 ng/mL-15,000 ng/mL，稀釋QC覆蓋高達525,000 ng/mL。用最簡單的可能模型擬合標準曲線。除LLOQ為25%外，所有水平的測定準確度和精密度均在20%以內。
[ 圖 16A]猴中RAA22/B09-57-AZ1508的平均濃度-時間曲線。收集食蟹猴血漿樣本並使用如圖15中所述之免疫捕獲LC-MS/MS測定和非隔室PK分析進行處理。
[ 圖 16B]猴中QD6/B09-57-AZ1508的平均濃度-時間曲線。收集食蟹猴血漿樣本並使用如圖15中所述之免疫捕獲LC-MS/MS測定和非隔室PK分析進行處理。
[ 圖 16C]係猴中QD6/B09-57-AZ1508的平均NCA PK參數。20067312中3 mg/kg QD6/B09-57-AZ1508的NCA PK參數基於第二次給藥後的PK數據。所有其他結果均基於第一次給藥後的PK數據。收集食蟹猴血漿樣本並使用如圖15中所述之免疫捕獲LC-MS/MS測定和非隔室PK分析進行處理。 圖 17作為PDX試驗，在代表免疫缺乏小鼠中多種類型的人類癌症的患者來源的異種移植物（PDX）模型中評估了EGFR-cMET Maia Topoi ADC。對於代表獨特的人類腫瘤的每個PDX模型，在單個小鼠中以10 mg/kg的劑量水平測試化合物。計算生長大於初始體積的腫瘤相對於未治療的對照腫瘤的腫瘤生長百分比（%T/C）（根據下式，將腫瘤生長抑制（%TGI）定義為治療（TX）組與對照（C）組之間相對於第0天的腫瘤生長百分比：%TGI = 1 - (TX最終 - TX初始)/(C最終 - C初始)）。並且計算顯示與初始腫瘤體積相比顯示尺寸減小的腫瘤的腫瘤消退百分比（根據下式，將腫瘤消退百分比定義為在研究終點根據下式計算的經治療動物中的腫瘤相對於第0天腫瘤體積（初始劑量日）的腫瘤減小百分比：%消退 = (TX最終平均值 - TX初始平均值)/(TX初始平均值) × 100）。
[ 圖 18]作為PDX試驗，在代表免疫缺乏小鼠中多種類型的人類癌症的患者來源的異種移植物（PDX）模型中評估了EGFR-cMET Topoi TM ADC。對於代表獨特的人類腫瘤的每個PDX模型，在單個小鼠中以5 mg/kg的劑量水平測試化合物。計算生長大於初始體積的腫瘤相對於未治療的對照腫瘤的腫瘤生長百分比（%T/C）（根據下式，將腫瘤生長抑制（%TGI）定義為治療（TX）組與對照（C）組之間相對於第0天的腫瘤生長百分比：%TGI = 1 - (TX最終 - TX初始)/(C最終 - C初始)）。並且計算顯示與初始腫瘤體積相比顯示尺寸減小的腫瘤的腫瘤消退百分比（根據下式，將腫瘤消退百分比定義為在研究終點根據下式計算的經治療動物中的腫瘤相對於第0天腫瘤體積（初始劑量日）的腫瘤減小百分比：%消退 = (TX最終平均值 - TX初始平均值)/(TX初始平均值) × 100）。
[ 圖 19A]在SQHN-02 PDX模型中評估了具有不同IgG Fc形式（Maia和TM）的兩種不同EGFR-cMET ADC的可比性。在3個劑量水平下測試了ADC：2.5、5和10 mg/kg，並將腫瘤生長與未治療的對照動物進行了比較。每個治療組和對照組共治療了10隻動物。
[ 圖 19B]在Panc-08 PDX模型中評估了具有不同IgG Fc形式（Maia和TM）的兩種不同EGFR-cMET ADC的可比性。在3個劑量水平下測試了ADC：2.5、5和10 mg/kg，並將腫瘤生長與未治療的對照動物進行了比較。每個治療組和對照組共治療了10隻動物。
[ 圖 20]描述了來自上述圖17的非小細胞肺癌NSCLC PDX模型的結果，突出了已知的EGFR突變狀態和組織學。
[ 圖 21]將EGFR-cMET雙特異性抗體INT-009（RAA22/B09-Maia裸mAb）和INT-009-SG3932 DAR8 ADC（「MAIA ADC」）與B09/RAA2-IgG1-TM鏡像mAb（INT-017）和TM-鏡像-SG3932 DAR6 ADC（「TM ADC」）在NOD-SCID小鼠中以5 mg/kg的治療劑量進行藥物動力學比較。
[ 圖 22] 示出了用EGFR-cMET Topoi TM ADC與埃萬妥單抗（Amivantamab）治療後EGFR和cMet受體降解的比較。
無
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Claims (46)

  1. 一種抗體分子，其包含： 結合上皮生長因子受體（EGFR）之第一抗原結合結構域；以及 結合c-Met之第二抗原結合結構域， 其中該第一抗原結合結構域包含： (i) 包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： 具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列之HCDR1 具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列之HCDR2 具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列之HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 (ii) 包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： 具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列之LCDR1 具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列之LCDR2 具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列之LCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
  2. 如請求項1所述之抗體分子，其中該第一抗原結合結構域包含： (i) 包含以下CDR的VH區： 具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列之HCDR1 具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列之HCDR2 具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列之HCDR3；以及 (ii) 包含以下CDR的VL區： 具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列之LCDR1 具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列之LCDR2 具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列之LCDR3。
  3. 如請求項1或請求項2所述之抗體分子，其中該第一抗原結合結構域以以下Kd的親和力結合人EGFR： (i) 等於10 nM或更高； (ii) 等於30 nM或更高；或 (iii) 等於40 nM或更高。
  4. 如請求項1或請求項2所述之抗體分子，其中該第一抗原結合結構域以以下Kd的親和力結合人EGFR： (i) 介於10和100 nM之間； (ii) 介於20和80 nM之間； (iii) 介於30和75 nM之間；或 (iv) 介於35和50 nM之間。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之抗體分子，其中該第一抗原結合結構域以低於包含抗體分子QD6的可變重鏈區序列和可變輕鏈區序列的抗原結合結構域之親和力的親和力結合人EGFR，該等序列分別在SEQ ID NO: 18和22中列出。
  6. 如前述請求項中任一項所述之抗體分子，其中該第一抗原結合結構域包含： 包含與SEQ ID NO: 16的胺基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列同一性的胺基酸序列之VH區；以及 包含與SEQ ID NO: 20的胺基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列同一性的胺基酸序列之VL區。
  7. 如前述請求項中任一項所述之抗體分子，其中該第二抗原結合結構域包含： (i) 包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： 具有SEQ ID NO: 24的胺基酸序列之HCDR1 具有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列之HCDR2 具有SEQ ID NO: 26的胺基酸序列之HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 (ii) 包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： 具有SEQ ID NO: 27的胺基酸序列之LCDR1 具有SEQ ID NO: 28的胺基酸序列之LCDR2 具有SEQ ID NO: 29的胺基酸序列之LCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
  8. 如請求項7所述之抗體分子，其中該第二抗原結合結構域包含： (i) 包含以下CDR的VH區： 具有SEQ ID NO: 24的胺基酸序列之HCDR1 具有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列之HCDR2 具有SEQ ID NO: 26的胺基酸序列之HCDR3；以及 (ii) 包含以下CDR的VL區： 具有SEQ ID NO: 27的胺基酸序列之LCDR1 具有SEQ ID NO: 28的胺基酸序列之LCDR2 具有SEQ ID NO: 29的胺基酸序列之LCDR3。
  9. 如請求項7或請求項8所述之抗體分子，其中該第二抗原結合結構域以以下Kd的親和力結合cMet： (i) 低於10 nM；或 (ii) 低於5 nM。
  10. 如請求項3至5和請求項9中任一項所述之抗體分子，其中該親和力藉由表面電漿共振測量。
  11. 如請求項7至10中任一項所述之抗體分子，其中該第二抗原結合結構域包含： 包含與SEQ ID NO: 38的胺基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列同一性的胺基酸序列之VH區；以及 包含與SEQ ID NO: 40的胺基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列同一性的胺基酸序列之VL區。
  12. 如前述請求項中任一項所述之抗體分子，其中抗體分子包含： 第一重鏈，其中該第一重鏈包含該第一抗原結合結構域的該VH區，以及第一重鏈恒定（CH）區或其片段； 第一輕鏈，其中該第一輕鏈包含該第一抗原結合結構域的該VL區，以及第一輕鏈恒定（CL）區或其片段； 第二重鏈，其中該第二重鏈包含該第二抗原結合結構域的該VH區，以及第二重鏈恒定（CH）區或其片段；以及 第二輕鏈，其中該第二輕鏈包含該第二抗原結合結構域的該VL區，以及第二輕鏈恒定（CL）區或其片段。
  13. 如請求項12所述之抗體分子，其中該第一CH區和該第二CH區包含與SEQ ID NO: 42的胺基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列同一性的胺基酸序列。
  14. 如請求項12或請求項13所述之抗體分子，其中該第一重鏈和該第二重鏈形成異二聚體，視需要其中該第一重鏈和該第二重鏈中的一條包含位置354處的半胱胺酸（C）殘基和位置366處的色胺酸（W）殘基，並且另一條重鏈包含位置349處的半胱胺酸（C）殘基、位置407處的纈胺酸（V）殘基、位置366處的絲胺酸（S）和位置368處的丙胺酸（A），其中該恒定區的編號按照EU索引。
  15. 如請求項12至14中任一項所述之抗體分子，其中該抗體分子包含： (a)    經修飾的CH區，其中該經修飾的CH區包含天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代；以及 (b)   經修飾的相應CL區，其中該經修飾的CL包含天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代， 其中： (i)    該第一重鏈包含該經修飾的CH區並且該第一輕鏈包含該經修飾的相應CL區；或 (ii)   該第二重鏈包含該經修飾的CH區並且該第二輕鏈包含該經修飾的相應CL區，並且 其中該經修飾的CH區的取代的半胱胺酸和該經修飾的相應輕鏈的取代的半胱胺酸能夠形成二硫鍵。
  16. 如請求項15所述之抗體分子，其中該經修飾的CH區包含位置126處的天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代；並且該經修飾的相應CL區包含位置121處的天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代，其中該恒定區的編號按照EU索引。
  17. 如請求項12至16中任一項所述之抗體分子，其中該第一CH區和/或該第二CH區包含突變以減少或消除該抗體分子與一或多種Fcγ受體的結合。
  18. 如請求項12至17中任一項所述之抗體分子，其中該第一CH區和/或該第二CH區包含位置234處的苯丙胺酸、位置235處的麩胺酸和位置331處的絲胺酸，其中該恒定區的編號按照EU索引。
  19. 如請求項12至18中任一項所述之抗體分子，其中  該第一CH區包含與SEQ ID NO: 45、46或63中列出的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列；並且該第二CH區包含與SEQ ID NO: 43、44或64中列出的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列，並且視需要其中該第一CL區包含與SEQ ID NO: 49或65中列出的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列；並且該第二CL區包含與SEQ ID NO: 47或48中列出的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列。
  20. 如請求項19所述之抗體分子，其中該第一CH區包含與SEQ ID NO: 63中列出的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列；並且該第二CH區包含與SEQ ID NO: 64中列出的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列，並且其中該第一CL區包含與SEQ ID NO: 65中列出的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列；並且該第二CL區包含與SEQ ID NO: 47中列出的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列。
  21. 如請求項19所述之抗體分子，其中該第一重鏈包含與SEQ ID NO: 56、57或59中列出的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列；並且該第二重鏈包含與SEQ ID NO: 50、51或60中列出的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列，並且視需要其中該第一輕鏈包含與SEQ ID NO: 58或61中列出的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列；並且該第二輕鏈包含與SEQ ID NO: 52或62中列出的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列。
  22. 如請求項20所述之抗體分子，其中該第一重鏈包含具有SEQ ID NO: 59中列出的序列之胺基酸序列；該第二重鏈包含具有SEQ ID NO: 60中列出的序列之胺基酸序列；該第一輕鏈包含具有SEQ ID NO: 61中列出的序列之胺基酸序列；並且該第二輕鏈包含具有SEQ ID NO: 62中列出的序列之胺基酸序列。
  23. 如前述請求項中任一項所述之抗體分子，其中： (i)    結合EGFR的該第一抗原結合結構域結合食蟹猴EGFR； (ii)   結合EGFR的該第一抗原結合結構域結合小鼠EGFR； (iii)  結合c-Met的該第二抗原結合結構域結合食蟹猴c-Met； (iv)  該第一抗原結合結構域對EGFR具有特異性； (v)   該第二抗原結合結構域對c-Met具有特異性； (vi)  該抗體分子能夠同時接合EGFR和c-Met； (vii) 該抗體分子能夠被內化到細胞中； (viii)       當在體外細胞活力測定中測量時，該抗體分子具有細胞毒性活性；和/或 (ix) 該抗體分子能夠阻斷EGFR和/或c-Met的配體依賴性傳訊。
  24. 一種抗體分子，其包含： 結合上皮生長因子受體（EGFR）之第一抗原結合結構域； 其中該第一抗原結合結構域包含： (i) 包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： 具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列之HCDR1 具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列之HCDR2 具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列之HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 (ii) 包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： 具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列之LCDR1 具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列之LCDR2 具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列之LCDR3， 或其變體，其中LCDR1、LCDR2或LCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
  25. 一種抗體分子，其包含： 結合c-MET之第一抗原結合結構域； 其中該第一抗原結合結構域包含： (i) 包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： 具有SEQ ID NO: 24的胺基酸序列之HCDR1 具有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列之HCDR2 具有SEQ ID NO: 26的胺基酸序列之HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個被另一個胺基酸取代；以及 (ii) 包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： 具有SEQ ID NO: 27的胺基酸序列之LCDR1 具有SEQ ID NO: 28的胺基酸序列之LCDR2 具有SEQ ID NO: 29的胺基酸序列之LCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中的一或多個中的一個或兩個或三個被另一個胺基酸取代。
  26. 一種軛合物，其包含與藥物軛合的如前述請求項中任一項所述之抗體分子。
  27. 如請求項26所述之軛合物，其中該藥物包括細胞毒素、放射性同位素、免疫調節劑、細胞介素、淋巴因子、趨化因子、生長因子、腫瘤壞死因子、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微RNA、光活性治療劑、抗血管生成劑、促凋亡劑、肽、脂質、碳水化合物、螯合劑或它們的組合。
  28. 如請求項26或請求項27所述之軛合物，其中該藥物係具有式A*的拓撲異構酶I抑制劑 。
  29. 如請求項28所述之軛合物，其中該拓撲異構酶I抑制劑具有式I： ， 或其鹽或溶劑化物，其中R L係用於連接該抗體分子的連接子，視需要其中所述連接子選自： (ia)： ， 其中 Q係： ，其中Q X使得Q為胺基酸殘基、二肽殘基、三肽殘基或四肽殘基； X係： ， 其中a = 0至5，b1 = 0至16，b2 = 0至16，c1 = 0或1，c2 = 0或1，d = 0至5，其中至少b1或b2 = 0（即b1和b2中只有一個可以不是0）並且至少c1或c2 = 0（即c1和c2中只有一個可以不是0）； G L係用於連接該抗體分子的連接子；或 (ib)： ， 其中R L1和R L2獨立地選自H和甲基，或與它們所結合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團；以及 e係0或1。
  30. 如請求項26至29中任一項所述之軛合物，其具有式IV： L - (D L) p (IV)或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物， 其中： L係該抗體分子； D L係具有連接子的藥物；以及 p係1至20的整數。
  31. 如請求項30所述之軛合物，其中p係選自2至8、3至7、4至7或5至7的範圍。
  32. 如請求項30或31所述之軛合物，其中D L係具有式III的連接子之拓撲異構酶I抑制劑： ， R LL係連接到該抗體分子的連接子，其中該連接子選自 (Ia')： ， 其中Q和X如請求項29中所定義，並且G LL係連接到該抗體分子的連接子；以及 (Ib')： ， 其中R L1和R L2如請求項29中所定義。
  33. 如請求項26至32中任一項所述之軛合物，其中該抗體分子與具有下式的拓撲異構酶I抑制劑軛合： （SG3932）。
  34. 如請求項26至33中任一項所述之軛合物，其中： (i)    該軛合物能夠同時接合EGFR和c-Met； (ii)   該軛合物能夠被內化到細胞中； (iii)  當在體外細胞活力測定中測量時，該軛合物具有細胞毒性活性；和/或 (iv)  當在體內模型中測量時，該軛合物能夠抑制癌症的發展或進展。
  35. 一種藥物組成物，其包含如請求項1至25中任一項所述之抗體分子或如請求項26至34中任一項所述之軛合物，以及藥學上可接受的載劑。
  36. 如請求項1-25中任一項所述之抗體分子、如請求項26-34中任一項所述之軛合物或如請求項35所述之藥物組成物，其在治療人體或動物體的方法中使用。
  37. 如請求項1-25中任一項所述之抗體分子、如請求項26-34中任一項所述之軛合物或如請求項35所述之藥物組成物，其在治療癌症之方法中使用。
  38. 一種治療癌症之方法，包括向有需要的受試者投與如請求項1至25中任一項所述之抗體分子、如請求項26至34中任一項所述之軛合物或如請求項35所述之藥物組成物。
  39. 如請求項1-25中任一項所述之抗體分子、如請求項26-34中任一項所述之軛合物或如請求項35所述之藥物組成物在製備用於治療癌症的藥物中之用途。
  40. 如請求項37所述使用的抗體分子、軛合物或藥物組成物、如請求項38所述之治療方法或如請求項39所述之用途，其中該癌症係肺癌（諸如非小細胞肺癌（NSCLC））、胰臟癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN或SQHN）、卵巢癌或神經膠母細胞瘤。
  41. 如請求項37所述使用的抗體分子、軛合物或藥物組成物、如請求項38所述之治療方法或如請求項39所述之用途，其中該癌症係肺癌（諸如非小細胞肺癌（NSCLC））或頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN或SQHN）。
  42. 一種核酸或多種核酸，視需要分離的，其編碼如請求項1-25中任一項所述之抗體分子。
  43. 一種表現載體或多種表現載體，其包含如請求項42所述之一種核酸或多種核酸。
  44. 一種重組宿主細胞，其包含如請求項42所述之一種核酸或多種核酸，或如請求項43所述之一種表現載體或多種表現載體。
  45. 一種產生如請求項1至25中任一項所述之抗體分子之方法，該方法包括在產生該抗體分子的條件下培養如請求項44所述之重組宿主細胞。
  46. 如請求項45所述之方法，進一步包括分離和/或純化該抗體分子。
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