KR101555548B1 - 신규한 ｅｇｆｒ 항체 단편 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 EGFR(Epidermal growth factor receptor)에 특이적으로 결합 가능한 신규 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 단백질을 포함하는 항암 치료용 약제학적 조성물 또는 암 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 단백질은 기존 항체 치료제와 비교하여 EGFR에 대한 결합능이 우수하고, 항체 절편을 이용하게 때문에 조직이나 종양으로의 침투율이 높으며, 박테리아 등의 숙주세포에서 효율적으로 생산 가능하여 경제적으로 제조할 수 있다.

Description

신규한 ＥＧＦＲ 항체 단편{A New Antibody Fragment for EGFR}
본 발명은 암 치료용 약제학적 조성물 또는 암 진단용 조성물로 사용될 수 있는 신규한 항 EGFR 단백질에 관한 것이다.
EGFR (HER1)은 세포표면에 존재하는 수용체 HER 패밀리의 하나로 EGF, TGF-alpha, Epiregulin 등의 리간드들과 결합하여 세포의 성장과 사멸에 있어 중요한 역할을 담당하고 있다. 암과 관련해서 특히 주목을 받게 된 것은 면역염색을 통해 조사한 결과 많은 종류의 암세포에서 EGFR 발현이 증가되어 있으며 이런 EGFR의 증가가 예후와도 밀접한 관련성이 있다는 보고들이 있었다. 이에 따라 EGFR 신호를 억제하여 암을 치료하려는 시도가 있어 왔는데 EGFR 블로킹 항체인 세툭시맙(cetuximab)과 저분자의 EGFR 티로신 키나아제 억제제(EGFR-TK1)인 gefitinib(iressa), erlotinib(tarceva) 등이 등장하여 임상에 사용되게 되었다.
EGFR-TK1는 같은 EGFR을 타겟으로 하지만 세툭시맙과 달리 폐암을 그 적응증으로 하고 있는데 EGFR-TK1는 EGFR 발현이 예후와 밀접하게 관련이 있는 것으로 알려진 암들에서는 효과가 별로 없고 관련성이 아주 미약한 폐암에서 효과를 나타내어 EGFR 발현량에 따른 신호 차이와는 다른 기전이 존재함을 시사하고 있으며 치료용 항체가 암세포에 세포독성 효과를 나타내기 위해서는 몇 가지 작용기전이 복합적으로 이용되는데, 대부분은 ADCC(antibody-dependent cellular cytotoxicity) 또는 CDC(complement-dependent cytotoxicity)를 통한 면역 체계를 통해 효과를 나타내다.
항체는 구조적으로 중쇄의 불변 영역(Fc 부분)의 차이에 따라 IgG, IgA, IgM, IgD, 및 IgE 등 5가지로 분류되며, 항체의 아이소타입 중 IgG1과 IgG3는 ADCC, CDC의 기능이 강하고, IgG2는 ADCC의 기능이 없고, 약한 CDC의 기능이 있으며, IgG4는 약한 ADCC의 기능이 있으나 CDC의 기능은 없다고 알려져 있다. 항암분야에서 개발되어진 항체의 경우 ADCC와 CDC 기능이 높다고 알려진 IgG1 아이소타입이 가장 많이 개발되어져 왔다.
EGFR은 모노머 형태로 존재하다가 EGF가 결합하게 되면 다이머 형태를 이뤄 키나아제가 활성화되어 신호를 전달하게 된다. 치료용 항체 세툭시맙의 경우 리간드 대신에 EGFR에 결합함으로써 키나아제 활성과 하위 신호를 억제하게 된다. 이로 인해 세포성장을 억제하고, 세포 사멸을 유도하게 되는데 이러한 결합으로 수용체의 활성화 및 그로 인한 신호전달 통로가 억제되며, 그 결과 종양세포의 정상조직 침투 및 새로운 부위로의 종양확산이 감소하게 된다. 또한 종양세포가 화학요법 및 방사선 요법으로 인한 손상을 복구하는 능력을 억제하고, 종양 내 새로운 혈관 형성을 억제함으로써 종양증식을 전반적으로 억제하는 것으로 판단된다.
또한 EGFR을 타겟으로 하는 항체의 치료 기작이 EGFR의 신호전달을 억제함으로써 나타난다는 것의 증거로 세툭시맙과 파니투무맙(panitumumab)의 경우 EGFR의 하위 신호 전달 물질인 KRAS의 유전자 돌연변이에 의해 영향을 받는다는 보고들이 있다. 이러한 KRAS 돌연변이는 대장암의 40~45%에서 발견되는데 암 환자의 생체지표(바이오마커) 검사를 통해 KRAS라는 유전자 돌연변이 여부를 확인해서 돌연변이가 없는 경우에 사용하고 있다.
항체는 일반적으로 Y형태로 약 150 kDa의 4중체(tetramer)로 항원과 특이적으로 결합하는 부위인 가변영역(variable region 또는 V)과 결합된 항원을 제거하는 역할을 하는 불변영역(constant region 또는 C)으로 구분된다. 가변영역은 항원에 대한 특이성을 갖고 있으며 항체마나 서로 다르며, 불변영역은 동일한 기능을 하며 항체마다 동일하다.
항체 투입의 목적이 항원과 결합시킴으로써 항원의 작용을 봉쇄한다거나 혹은 수용체와 결합시켜 그 기능을 억제하는 것이라면 굳이 효과기 즉 Fc 부위가 필요 없을 수 있다. 이러한 경우 IgG 대신에 Fab 과 같은 항체 절편을 사용하는 경우가 많다.
항체절편은 항체 분자에서 작용 기능(effector function)을 나타내는 Fc 영역을 제외한 항원결합 도메인들을 말하며, 주로 Fab, single-chain antibody fragment(scFv) 및 3세대 항체 절편(예, single domain, minibody 등)이 포함되며, 이 항체 절편들은 주로 인간화 항체나 인간 항체의 서열을 갖는다.
항체절편은 전체 IgG에 비하여 크기가 작기 때문에 조직이나 종양으로의 침투율이 좋고, 박테리아에서 생산할 수 있으므로 생산 비용이 적게 드는 장점을 지니고 있으며 이러한 장점들로 인해 현재 개발 중이거나 사용 중인 항체절편은 인체 내에서의 반감기가 짧아 생체 진단용으로 적합하게 사용 중이며, PEGylation으로 반감기를 늘려 치료용 항체로 개발하고 있고, 박테리아의 독소를 결합(conjugation)시켜 약물 전달용으로 개발하거나, cytotoxic T 세포에 결합하는 항체 절편과의 이중특이성(bispecific) 항체를 제조하여 암치료제로 개발하는 등 다양하게 이용하고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 EGFR에 효과적으로 결합하여 암 질환을 치료 및 진단할 수 있는 항체 절편을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, EGFR 항체 절편인 미니바디가 기존 항체 치료제와 비교하여 EGFR에 대한 결합능이 우수하다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 EGFR(Epidermal growth factor receptor)과 결합 가능한 단백질을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 서열식(I)을 포함하는 EGFR(Epidermal growth factor receptor)과 결합 가능한 단백질을 제공한다:
서열식 (I)
VL-X-VH-Hinge-CH3
상기 식에서,
VL은 서열목록 제2서열의 경쇄 가변 도메인이고;
X는 1 내지 50의 아미노산 서열을 갖는 링커이고;
VH는 서열목록 제1서열의 중쇄 가변 도메인이고;
Hinge는 서열목록 제14서열 또는 제24서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인이고;
CH3은 서열목록 제15서열 또는 제25서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인이고;
n은 1 내지 5의 정수를 나타낸다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 서열식(I)을 포함하는, EGFR과 결합 가능한 단백질을 제공한다:
서열식 (I)
VL-X-VH-Hinge-CH3
상기 식에서,
VL은 서열목록 제2서열의 경쇄 가변 도메인이고;
X는 1 내지 50의 아미노산 서열을 갖는 링커이고;
VH는 서열목록 제1서열의 중쇄 가변 도메인이고;
Hinge-CH3은 서열목록 제8서열 또는 서열목록 제8서열의 아미노산 중 1 이상의 시스테인이 알라닌으로 치환된 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인이고;
n은 1 내지 5의 정수를 나타낸다.
본 발명자들은 EGFR에 효과적으로 결합하여 암 질환을 치료할 수 있는 항체 절편을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, EGFR 항체 절편인 미니바디가 기존 항체 치료제와 비교하여 EGFR에 대한 결합능이 우수하다는 것을 확인하였다.
본 명세서에서 미니바디(minibody)는 Fc 부분 일부를 제거한 항체 절편을 의미하며, VL-X-VH-Hinge-CH3로 통용된다.
본 명세서에서 용어 “VH”는 세툭시맙의 아미노산 서열 중 중쇄 가변 도메인(heavy chain variable domain)을, “VL”는 경쇄 가변 도메인(light chain variable domain)을 나타낸다. “Hinge”는 전체 IgG1 아미노산 서열에서 유래된 힌지 부위(hinge region)를, “CH3”는 중쇄 불변 도메인(heavy chain constant domain)의 CH3를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 VH 및 VL은 링커(X)로 연결된다.
본 발명에 이용되는 링커는 당업계에서 링커로 이용되는 어떠한 펩타이드 링커도 가능하며, 본 발명의 경우 “경쇄 가변 도메인(VL)-링커-중쇄 가변 도메인(VH)” 구조를 갖는다. 이 구조에서, 링커는 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 인위적으로 연결하는 작용을 하는 일정 길이의 아미노산 서열을 의미한다.
상기 링커로서 이용되는 것은 당업계에 공지된 어떠한 펩타이드 링커도 포함한다. 이 펩타이드 링커는 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 충분한 거리로 이격시켜 각각의 가변 도메인이 적합한 이차 및 삼차 구조로 폴딩 되도록 한다. 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션을 가질 수 있는 능력; (b) 에피토프와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재. 바람직한 펩타이드 링커는 Gly, Glu, Asn, Lys, Ser 및 Pro 잔기를 포함한다. Thr 및 Ala과 같은 다른 중성 아미노산들도 링커 서열에 포함될 수 있다. 링커에 적합한 아미노산 서열은 Maratea et al., Gene 40:39-46(1985); Murphy et al., Proc . Natl . Acad Sci. USA 83:8258-8562(1986); 미국 특허 제4,935,233호, 제4,751,180호 및 제5,990,275호에 개시되어 있다. 링커 서열은 1-50 아미노산 잔기, 바람직하게는 10-20 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 바람작한 링커 서열은, “Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser”, “Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser”, “Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly” 또는 “Gly Ser Thr Ser Gly Lys Pro Ser Glu Gly Lys Gly”이며, 보다 바람직하게는 서열목록 제3서열 또는 제13서열의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 Hinge는 서열목록 제14서열의 아미노산 서열을 가지며, 바람직하게는 상기 Hinge에 존재하는 1 이상의 시스테인 잔기가 알라닌으로 치환된 것이며, 보다 바람직하게는 서열목록 제24서열의 2개의 시스테인 잔기가 모두 알라닌으로 치환된 것이다.
본 발명의 CH3는 서열목록 제15서열의 아미노산 서열을 가지며, 바람직하게는 상기 CH3에 존재하는 1 이상의 시스테인 잔기가 알라닌으로 치환된 것이며, 보다 바람직하게는 서열목록 제25서열의 2개의 시스테인 잔기가 모두 알라닌으로 치환된 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 Hinge-CH3은 서열목록 제8서열의 아미노산 중 2개의 시스테인이 알라닌으로 치환된 것이며, 보다 바람직하게는 서열목록 제8서열의 아미노산 중 4개의 시스테인이 알라닌으로 치환된 것이다.
상기 Hinge 또는 CH3의 시스테인을 알라닌으로 치환시키면 EGFR에 대한 결합능을 크게 증가시킬 수 있다.
본 발명의 미니바디는 상기 기술된 VH, VL, 링커, Hinge 및 CH3의 특성을 갖는 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 배열(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 배열된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 배열 방법은 당업계에 공지되어 있다. 서열 배열에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman(1981), Adv . Appl . Math . 2:482; Needleman and Wunsch(1970), J. Mol . Bio . 48:443-53; Pearson and Lipman(1988), Methods in Mol . Biol . 24: 307-31; Higgins and Sharp(1988), Gene 73:237-44; Higgins and Sharp(1989), CABIOS 5:151-3; Corpet et al.(1988), Nuc . Acids Res. 16:10881-90; Huang et al.(1992), Comp . Appl . BioSci . 8:155-65 and Pearson et al.(1994), Meth. Mol . Biol . 24:307-31에 개시되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 단백질은 서열목록 제26서열의 MI005, 서열목록 제27서열의 MI010 또는 서열목록 제28서열의 MI012인 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit(1980), Nucleotide Analogs, John Wiley, New York; Uhlman 및 Peyman(1990), ChemicalReviews, 90:543-584).
본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 배열하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 배열된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “벡터”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 파아지미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함되며, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.
본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al.(2001), Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL λ프로모터, pR λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli(예컨대, BL21, HB101, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C.(1984), J. Bacteriol ., 158:1018-1024) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pL λ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D.(1980), Ann . Rev . Genet., 14:399-445)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈(pET28a, pET21a 등) 및 pUC19 등), 파아지미드(예: pComb3X), 파아지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 유전체로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 단백질의 아미노 말단부위 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 필요에 따라 다른 서열과 융합될 수도 있으며, 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 형질전환체, 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 대장균이고 보다 바람직하게는 E. coli BL21(DE3), E. coli ER2537, E. coli ER2738, E. coli XL-1 Blue, E. coli JM109, E. coli DH 시리즈, E. coli TOP10, E. coli TG1 및 E. coli HB101이다. 가장 바람직하게는 숙주세포는 E. coli BL21(DE3)이다. 본 발명에서는 대장균을 이용하여 단백질을 발현시켜 적은 비용으로 대량 생산이 가능하다.
본 발명의 벡터를 형질전환체 내로 운반하는 방법은, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al.(1973), Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al.(1973), Proc . Natl . Acac . Sci. USA, 9:2110-2114; 및 Hanahan, D.(1983), J. Mol . Biol ., 166:557-580) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al.(1988), Nucleic . AcidsRes ., 16:6127-6145) 등에 의해 실시될 수 있다.
형질전환체 내로 주입된 벡터는 형질전환체 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 본 발명의 단백질을 얻게 된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 단백질의 제조 방법을 제공한다.
상기 단백질 제조에서 형질전환된 숙주세포의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 배양 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James M. Lee, Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions, 138-176)에 개시되어 있다. 세포 배양은, 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 하다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다.
형질전환된 숙주세포를 배양하여 수득한 단백질은 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며 추가로 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전 및 크로마토그래피 등을 이용하여 고 순도로 정제하여 사용될 수 있다. 그 중에서 크로마토그래피를 이용하는 방법이 가장 많이 사용되며, 컬럼의 종류와 순서는 항체의 특성, 배양방법 등에 따라 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등에서 선택할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 방법으로 제조한 단백질은 EGFR에 대하여 특이적으로 결합하므로 단백질 단독 또는 통상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 항암 치료용 약제학적 조성물 또는 암 진단용 조성물로 사용가능하다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 조성물이 적용되는 질환인 암은 직장암, 피부암, 담관암, 방광암, 뇌종양, 유방암, 자궁경부암, 융모암, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 다발성 골수종, AIDS-관련 백혈병 및 성인 T-세포 림프종/백혈병, 상피내암, 간암, 폐암, 림프종, 신경모세포종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 고환암, 갑상선암 또는 신세포암이고, 보다 바람직하게는 직장결장암 또는 두경부 편평세포암이다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's PharmaceuticalSciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
용어, “약제학적 유효량”은 본 발명의 단백질을 이용하여 암을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 암조직 주변의 동맥내 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 가글제, 오인트먼트제, 고형제, 카타플라스마제를 포함하는 외형제의 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여, 즉 상기 단백질에 다른 치료제를 혼합한 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 다른 치료제는 화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 무기입자이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 EGFR에 대한 본 발명의 단백질을 포함하는 암 진단 키트를 제공한다.
EFGR에 대한 본 발명의 단백질은, 생물학적 시료에 적용되어 암의 발생 여부를 진단할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어“생물학적 시료”란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포등을 들 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 단백질과 반응시켜서 암의 발생 여부를 확인할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 EGFR(Epidermal growth factor receptor)에 특이적으로 결합 가능한 신규 단백질을 제공한다.
(ⅱ) 또한, 본 발명은 상기 단백질을 포함하는 항암 치료용 약제학적 조성물 또는 암 진단용 조성물을 제공한다.
(ⅲ) 본 발명의 단백질은 기존 항체 치료제와 비교하여 EGFR에 대한 결합능이 우수하고, 항체 절편을 이용하게 때문에 조직이나 종양으로의 침투율이 높으며, 박테리아 등의 숙주세포에서 효율적으로 생산 가능하여 경제적으로 제조할 수 있다.
도 1은 세툭시맙(cetuximab)의 중쇄 및 경쇄 서열을 나타낸다.
도 2는 세툭시맙의 유전자 서열을 나타낸다.
도 3은 scFv(pET28a-VL-L-VH) 클로닝 모식도를 나타낸다.
도 4는 scFv PCR 및 클로닝 결과를 나타낸다.
도 5는 SDS-PAGE를 통한 scFv 단백질의 IPTG induction을 확인한 것이다.
도 6은 Hinge-CH3 도메인 유전자 합성 염기서열을 나타낸다.
도 7은 미니바디(minibody) 클로닝 모식도를 나타낸다.
도 8은 미니바디 클로닝 결과를 나타낸다.
도 9는 미니바디 단백질 발현 결과를 나타낸다.
도 10은 미니바디 단백질 정제 결과를 나타낸다.
도 11은 Hinge 부위 결실(△H)을 나타낸다.
도 12는 Hinge 부위 결실된 미니바디 클로닝 모식도를 나타낸다.
도 13은 Hinge 부위 결실된 미니바디 단백질 발현 결과를 나타낸다.
도 14는 Hinge 부위 결실된 미니바디 단백질 정제 결과를 나타낸다.
도 15는 시스테인 점돌연변이 과정을 나타낸 모식도이다.
도 16은 Hinge-CH3 도메인을 나타낸다.
도 17은 시스테인이 알라닌으로 치환된 Hinge-CH3 도메인을 나타낸다.
도 18은 2개(왼쪽) 또는 4개(오른쪽)의 시스테인이 알라닌으로 치환된 미니바디 단백질 정제 결과를 나타낸다.
도 19는 치환된 미니바디 단백질의 homogeneity를 나타낸다.
도 20은 미니바디의 시스테인 치환에 따른 sEGFR 결합 값의 변화를 나타낸다.
도 21은 A431 세포주에 결합한 미니바디를 FACS로 측정한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
1. scFv(single chain Fv) 컨스트럭트 제작
(1) scFv 컨스트럭트 클로닝
scFv의 VH와 VL 도메인을 클로닝하기 위해 세툭시맙(cetuximab)의 아미노산(도 1, SEQ ID NO. 1 및 2)을 근거로 하여 DNA 염기서열을 Genescript에 의뢰하여 합성을 진행하였다(도 2). 이를 이용해 VH와 VL 도메인에 해당하는 부위에 PCR 프라이머를 제작(표 1)하고 이때 프라이머에 링커(L) (GGGGSGGGGSGGGGS)(SEQ ID NO. 3)를 삽입하여 2nd PCR을 통해 VL-L-VH 유전자를 클로닝하였고, 이를 제한효소 처리를 통해 His-tag이 있는 대장균 발현 벡터인 pET28a 벡터에 클로닝 하였다(도 3 및 4).
scFv 제작을 위한 PCR 프라이머
No Primer Sequence (5' → 3')
1 VL forward_BamH1 TCCGGATCCGATATTCTGCTGACCCA (SEQ ID NO. 4)
2 VH/linker reverse GAACCGCCACCGCCCGCGCTAACCGTCA (SEQ ID NO. 5)
3 VL/Linker forward GGTGGCGGTAGTGGCGGTGGCGGTTCCCAAGTCCAACTGAAAC (SEQ ID NO. 6)
4 VH reverse_Hind3 TGGTAGAGGCAAGCTTTTACGCGCTAACCG (SEQ ID NO. 7)
(2) scFv 컨스트럭트 대장균 발현 확인
클로닝된 유전자의 발현을 확인하기 위해 대장균 발현세포주인 BL21(DE3) 세포에 42℃ 열 충격(heat shock)을 통해 형질전환 시킨 후 IPTG induction을 통해 약 28 kDa 크기의 scFv 발현을 확인하였다(도 5).
2. Minibody(scFv-Hinge-C H 3) 단백질 제조
(1) Minibody(scFv-Hinge-C H 3) 컨스트럭트 클로닝
앞서 제작한 scFv 유전자에 Hinge-CH3 도메인을 삽입하기 위해 해당 염기서열을 Bioneer에 의뢰하여 유전자 합성을 진행하였다(도 6, SEQ ID NO. 8). scFv 유전자와 합성된 Hinge-CH3 도메인 유전자를 제한효소를 이용하여 pET21a 발현벡터에 클로닝 하였다(도 7 및 8). Minibody의 Hinge-CH3 도메인 클로닝을 위한 프라이머 서열은 표 2와 같다.
Minibody의 Hinge-CH3 도메인 클로닝을 위한 PCR 프라이머 서열
No Primer Sequence (5' → 3')
1 LLH-pET21a-For CGCCATATGGATATTCTGCTGACCCAGAGCC (SEQ ID NO. 9)
2 LHCC-pET21a-His-Rev CGCCTCGAGTTTACCCGGAGACAGGCTCAG (SEQ ID NO. 10)
(2) Minibody 단백질 발현
클로닝된 유전자를 BL21(DE3) 발현세포에 42℃ 열 충격을 통해 형질전환하고 IPTG induction을 통해 대략 44 kDa의 minibody 크기에서 발현된 단백질을 확인하였다(도 9).
(3) Minibody 단백질 정제
Anti-EGFR 항체절편을 항체의 구조에서 알 수 있듯이 VL(light chain variable region), VH(light chain variable region) 도메인에 각각 도메인 내부에 이황화 결합이 각각의 구조적으로 안정화시켜 항체절편과 EGFR(HER1)사이의 상호작용의 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 또한, hinge 도메인의 2개의 시스테인이 도메인 상호 내부 사이의 이황화 결합은 항체가 서로 다이머를 형성하는데 단백질 구조적으로 중요한 역할을 수행하고 있으며, CH3 도메인의 2개의 시스테인은 CH3 도메인 내에서 이황화 결합을 형성하여 CH3 도메인에서 형성되는 β-sheet들 사이에 단백질을 구조적으로 안정화 시켜 항체의 안정성을 높여주고 있다. 이러한 항체내의 많은 이황화 결합에 의하여 항체절편을 E-coli에서 발현시키면 일반적으로 봉입체(inclusion body) 형태로 발현된다. 이를 정제하기 위하여 항체절편을 변성(denaturation)시켜 다시 항체의 기능을 가지는 형태로 폴딩을 유도하는 리폴딩 방법(refolding method)을 진행하였다.
항체절편의 생산을 위하여 숙주세포로는 E-coli codonPlus(DE3)를 이용하였으며, 플라스미드로는 pET21를 사용하여 C-terminal 6xHis를 가진 항체절편인 MI005(scFv-Hinge-CH3-6xHis) 1L를 발현시켜 리폴딩 방법에 따라 정제를 수행하였다(도 10).
실험결과에서 보듯이 MI005 컨스트럭트를 pET21에서 발현한 결과 soluble form으로는 발현되지 않고 대부분의 발현은 봉입체(inclusion body) 형태로 발현됨을 알 수 있고 리폴딩을 수행한 후 MI005의 불순물을 제거하기 위하여 NI-NTA resin을 사용하여 IMAC 정제를 수행한 후 이온 교환 칼럼인 SP 칼럼을 사용하여 최종 시료를 제조하였고 정제된 시료를 가지고 활성을 측정하였다.
3. Hinge region deletion (△H)
전체 면역글로불린에서 hinge 부위의 경우 항체의 중쇄의 CH1과 CH2 도메인을 연결하여 hinge 부위 안에 존재하는 2개의 시스테인이 inter molecular interaction으로 전체 Ig의 생체 내 올리고머 형태인 테트라머를 이루는데 중요한 역할을 하게 된다. 이에 대장균에서 모노머 형태로 발현시키려고 하는 항체절편의 경우 이러한 hinge 부위, 혹은 2개의 시스테인의 역할에 대한 검증이 필요하였다.
이에 본 연구에서 기본 골격인 minibody형태인 scFv-Hinge-CH3 구조에서 Hinge를 제거하고 scFv에 CH3 도메인을 바로 연결한 scFv-CH3 컨스트럭트를 클로닝하고 발현 정제를 진행하였다.
(1) Minibody △H ( scFv - C H 3 ) 클로닝
Minibody 유전자에서 hinge 부위를 제거하기 위해 합성된 Hinge-CH3 유전자를 표 3의 프라이머를 이용하여 CH3 부위만 증폭하였다(도 11). 이때 사용된 프라이머는 5' 말단에 HindⅢ, 3' 말단에는 XhoⅠ 제한효소 부위가 삽입되도록 디자인되었으며, PCR 반응을 통해 증폭된 CH3 부위는 제한효소를 이용하여 scFv(VL-L-VH) 유전자에 클로닝 되었다(도 12).
CH3 부위 증폭을 위한 PCR 프라이머 서열
No Primer Sequence (5' → 3')
1 NH-CH3-pET21a-For CGCAAGCTTGGACAGCCGCGTGAACCG (SEQ ID NO. 11)
2 LHCC-pET21a-His-Rev CGCCTCGAGTTTACCCGGAGACAGGCTCAG (SEQ ID NO. 12)
(2) Minibody △H 단백질 발현
클로닝된 유전자를 BL21(DE3) 발현세포에 42℃ 열 충격을 통해 형질전환하고 IPTG induction을 통해 대략 44 kDa의 minibody 크기에서 발현된 단백질을 확인하였다(도 13).
(3) Minibody △H 단백질 정제
항체절편의 hinge 부위의 검증을 위하여 제작한 컨스트럭트는 VL 도메인과 VH 도메인을 연결하는 링커(15aa)와 링커(18aa)(GSTSGSGKPGSGEGSTKG, SEQ ID NO. 13)를 사용하였고, 제작한 컨스트럭트는 MI005 컨스트럭트에서 hinge 도메인만을 제거하여 MI007(scFv-CH3) 플라스미드를 pET21를 사용하여 제작하였다. 발현 형태는 봉입체(inclusion body)로 발현되며 C-말단에 6xHis를 가진 형태로 MI005와 같은 방식인 리폴딩의 방법으로 단백질을 정제하였고, 생산된 단백질을 가지고 활성 평가를 진행하였다(도 14).
실험 결과에서 보듯이 같은 플랫폼을 가지며 hinge를 가진 MI005 컨스트럭트와 MI007 컨스트럭트를 비교하여 보면 확연한 차이를 보이지는 않았다. hinge의 유무로 항체절편의 안정성과 활성에 주는 영향을 단언할 수 없다고 판단되었다. 이것은 VH에 직접적으로 CH3를 연결하는 것이 항체의 구조적으로 안정화를 꽤할 수 없다는 판단으로 hinge 부위에 존재하는 시스테인을 다른 아미노산으로 치환하여 영향치를 보는 것이 좋을 것으로 판단되었다. 많은 좀 더 안정된 형태의 항체절편을 생산하였고, 생산된 시료를 가지고 활성을 측정하였다.
4. Cysteine change(2 Cys , 4 Cys )
Hige 부위를 없애지 않은 상태에서 항체의 올리고머 상태에 영향을 주어 이질적인(inhomogeneous한) 항체 절편을 만들 수 있는 hinge 부위에 존재하는 2개의 시스테인을 제거하였다. 그러므로, 2개의 시스테인을 치환한 hinge 부위는 단순히 VH 도메인과 CH3 도메인 사이를 연결하는 링커로만 사용하는 컨스트럭트를 제작하여 단백질 물성의 변화를 관찰하였다. 또한, CH3 도메인 단독으로 다이머 형태로 존재한다는 보고로 인공적 항체 절편의 구조적 안정을 이룰 수 있도록 CH3 도메인내에 존재하는 2개의 시스테인을 제거하여 CH3내에 존재하는 이황화 결합을 제거하였다. 이러한 점돌연변이는 단백질 폴딩시에 일어날 수 있는 비-특이적 이황화 결합 형성을 제거하여 단일 종의(homogeneous한) 항체 절편을 생산할 수 있을 거라 생각하였다.
(1) 시스테인 점돌연변이 ( cysteine → alanine )
Hinge 부위에 존재하는 시스테인 잔기의 알라닌 치환은 Dpn Ⅰmediated site-directed mutagenesis 방법을 이용하여 점돌연변이를 통해 진행하였다(도 15). minibody의 Hinge-CH3 도메인에는 총 4개의 시스테인 잔기가 존재하는데 hinge 도메인에 2개, CH3 도메인에 2개의 시스테인 잔기를 가지고 있다 (도 16, SEQ ID NO. 14 및 15).
본 연구에서는 시스테인 잔기를 알라닌으로 치환하여 hinge 부위를 링커 역할로 사용할 수 있는지 확인하기 위해 hinge에 존재하는 시스테인 잔기 2개를 알라닌으로 치환시킨 컨스트럭트(MI010)와 hinge와 CH3 도메인에 존재하는 시스테인 잔기 4개를 모두 알라닌으로 치환시킨 컨스트럭트(MI012)를 제작하였다(도 17, SEQ ID NO. 24 및 25). 점돌연변이는 시스테인 잔기 1개부터 4개까지 순차적으로 치환시켜 진행하였다(표 4).
점돌연변이 프라이머 서열
No Primer Sequence (5' → 3')
1 1cys Hinge-CH3-1Cys-Change-For AAATCACCTAAGAGCGCGGATAAAACACATACGGC (SEQ ID NO. 16)
2 Hinge-CH3-1Cys-Change-Rev GCCGTATGTGTTTTATCCGCGCTCTTAGGTGATTT (SEQ ID NO. 17)
3 2cys Hinge-CH3-2Cys-Change-For GATAAAACACATACGGCGCCAGGACAGCCGCGTGA (SEQ ID NO. 18)
4 Hinge-CH3-2Cys-Change-Rev TCACGCGGCTGTCCTGGCGCCGTATGTGTTTTATC (SEQ ID NO. 19)
5 3cys Hinge-CH3-3Cys-Change-For CAGGTGTCATTGACAGCGTTAGTTAAAGGTTTTTATCCA (SEQ ID NO. 20)
6 Hinge-CH3-3Cys-Change-Rev TGGATAAAAACCTTTAACTAACGCTGTCAATGACACCTG (SEQ ID NO. 21)
7 4cys Hinge-CH3-4Cys-Change-For GGGAACGTTTTTAGTGCGTCCGTGATGCATGAAGC (SEQ ID NO. 22)
8 Hinge-CH3-4Cys-Change-Rev GCTTCATGCATCACGGACGCACTAAAAACGTTCCC (SEQ ID NO. 23)
이렇게 점돌연변이된 유전자는 DNA 시퀀싱을 통해 치환된 아미노산을 확인하였다.(표 5)
시스테인 점돌연변이 서열 비교
No Construct ID Amino acid sequence
1 MI005
(SEQ ID NO. 26)		 MDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAKLEPKSPKSCDKTHTCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLEHHHHHH-
2 MI010
(SEQ ID NO. 27)		 MDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAKLEPKSPKSADKTHTAPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLEHHHHHH-
3 MI012
(SEQ ID NO. 28)		 MDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAKLEPKSPKSADKTHTAPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTALVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSASVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLEHHHHHH-
(2) Minibody -2 Cys ( MI010 ), Minibody -4 Cys ( MI012 ) 단백질 정제
항체절편의 hinge 도메인에 존재하는 2개의 시스테인을 제거하여 제작한 컨스트럭트는 VL 도메인과 VH 도메인을 연결하는 링커(15aa)를 사용하였고, 제작한 컨스트럭트는 MI005 컨스트럭트에서 hinge 도메인에 존재하는 2개의 시스테인을 알라닌으로 치환하여 제작하여 MI010[scFv-Hinge(2cysΔ)-CH3]와 hinge 도메인에 존재하는 2개의 시스테인을 알라닌으로 치환한 후 CH3내에 존재하는 2개의 시스테인을 알라닌으로 치환한 MI012[scFv-Hinge(2cysΔ)-CH3(2cysΔ)]를 플라스미드를 pET21를 사용하여 제작하였다. 발현 형태는 봉입체(inclusion body)로 발현되며 C-말단에 6xHis를 가진 형태로 MI005와 같은 방식으로 리폴딩의 방법으로 단백질을 정제하였고, 생산된 단백질을 가지고 활성 평가를 진행하였다(도 18).
실험 결과에서 MI010[Hinge(2cysΔ)]과 MI012[Hinge(2cysΔ)-CH3(2cysΔ]에서는 hinge가 제거된 형태보다는 hinge의 기능인 올리고머화(oligomerization)를 제거하여 단순히 VH 도메인과 CH3 도메인을 연결하는 링커로서의 기능만을 사용하였다. 도 18에서 보듯이 리폴딩 정제능에서도 같은 플랫폼을 사용한 MI005와 비교하여 보면 확연히 정제능이 향상하였고, 리폴딩 수율도 증가하였다.
또한, MI012의 경우는 정제능만이 아니라 homogeneity도 증가되어 HPLC 분석에서 homogeneous 피크가 도출되었고, size는 대략 40 kD에 해당되는 결과를 얻었다(도 19). 각각 생산된 시료를 가지고 활성을 측정하였다.
실험결과
정제된 minibody 단백질의 항원(EGFR) 결합능을 측정하기 위해 ELISA(enzyme-linked immuosorbent assay)와 유세포분석기(Flow cytometer)를 이용한 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 두 실험방법을 이용하였다.
1. sEGFR binding ELISA Minibody 활성 측정
정제된 단백질이 minibody인지 확인하기 위해 CH3 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅으로 확인하고, 항원인 EGFR과의 결합능을 갖고 있는지 확인하기 위해 앞서 선별한 ELISA를 이용하여 진행하였다. 최종적으로 ELISA값이 높게 나온 단백질에 대해 A431 세포를 이용한 유세포 분석을 통해 세포 표면에 발현되고 있는 EGFR에 minibody가 결합하는지 확인하였다.
실험은 96 웰 ELISA 플레이트에 sEGFR을 100 ng/웰 농도로 넣어주고, 이를 4℃에서 밤새 반응하였다. 상층액을 제거하고, sigma에서 구입한 블로킹 용액을 희석 한 후, 200 ㎕씩 각 웰에 분주하여 4℃ 에서 밤새 블로킹하였다. 제작된 minibody 또는 cetuximab을 각각 100 ㎕씩 분주하고 실온에서 1시간 반응 한 후, PBST로 3회간 세척하였다. Mouse anti-human IgG, CH3 domain secondary antibody A567H(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 1:100으로 희석하여 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 반응하였다. PBST로 3회 세척하고, 2차 항체 IgG antimouse HRP(Koma biotech)를 1:3,000 희석하여 100 ㎕씩 웰에 분주 한 후 실온에서 1시간 반응하였다. 상층액을 제거하고, PBST로 3회 세척 후 TMB 발색시약을 100 ㎕씩 분주 하였다. 발색된 웰에 1 M의 H2SO4를 100 ㎕ 넣어 반응을 중지 시키고, 플레이트는 마이크로플레이트 리더를 이용해 450 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다(표 6).
Figure 112013035802916-pat00001
실험결과 sEGFR에 대한 결합능은 Minibody > Minibody△H > Minibody-2cys > Minibody-4cys 순으로 나타났으며 Hinge 부위와 CH3 부위의 시스테인을 모두 치환한 것에서 sEGFR의 결합 값이 가장 높게 나타난 것을 확인하였다.
2. Minibody 의 시스테인 치환에 따른 sEGFR 결합 값의 정량적 변화 확인
세포질에서 발현되는 단백질에서의 활성 형태를 높이기 위해 Hinge 부위의 시스테인을 치환한 컨스트럭트를 디자인하였고 이러한 컨스트럭트의 변화에 따라 정제 공정에서의 수득률과 sEGFR 결합 값의 변화를 정량적으로 확인하기 위해 cetuximab을 표준으로 하여 상대적인 정량값을 계산하였다.
실험은 96 웰 ELISA 플레이트에 sEGFR을 100 ng/웰 농도로 넣어주고, 이를 4℃에서 밤새 반응하였다. 상층액을 제거하고, sigma에서 구입한 블로킹 용액을 희석 한 후, 200 ㎕씩 각 웰에 분주하여 4℃에서 밤새 블로킹하였다. Cetuximab은 최고 농도 2 ㎍/㎖부터 4배수로 단계 희석하여 준비하였다. 제작된 minibody 또는 cetuxiamb을 각각 100 ㎕씩 분주하고 실온에서 1시간 반응 한 후, PBST로 3회간 세척하였다. Mouse anti-human IgG, CH3 domain secondary antibody A567H (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 1:100으로 희석하여 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 반응하였다. PBST로 3회 세척하고, 2차 항체 IgG antimouse HRP(Koma biotech)를 1:3,000 희석하여 100 ㎕씩 웰에 분주 한 후 실온에서 1시간 반응하였다. 상층액을 제거하고, PBST로 3회 세척 후 TMB 발색시약을 100 ㎕씩 분주하였다. 발색된 웰에 1M의 H2SO4를 100 ㎕ 넣어 반응을 중지 시키고, 플레이트는 마이크로플레이트 리더를 이용해 450 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다(도 20).
실험결과 시스테인 치환 전의 minibody(MI005)의 경우 cetuximab 대비 86 ng/㎖ 수준의 활성을 나타낸 반면 hinge 부위의 시스테인을 모두 치환한 minibody-4cys(MI012)의 경우 그 값이 3.3 ㎍/㎖까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 세포질에서 발현 정제한 minibody의 hinge 부위의 시스테인이 리폴딩 과정에서 기능적인 구조를 갖는데 중요한 역할을 한다는 것을 확인할 수 있었다.
3. A431 세포주에 발현되어 있는 EGFR 과 Minibody 결합 확인( FACS )
Minibody가 세포주에서 발현되고 있는 EGFR과 결합하는지 최종적으로 확인하기 위해 A431 세포를 이용하여 FACS를 진행하였다.
실험은 배양한 A431 세포를 0.25% trypsin/EDTA 처리하여 단일 세포로 떼어낸 후 PBS 10 ㎖을 넣고 1500 rpm에서 3분간 원심분리 한 뒤 상층액은 버려서 세척을 진행하였다. 펠렛은 10 ㎖ PBS로 다시 suspension하여 계수하였다. 계수한 세포는 5X106 cell/㎖의 농도로 희석한 후 100 ㎕ 씩 5 ㎖ 튜브에 담았다. 세포가 담겨진 튜브에 정제된 단백질을 100 ㎕ 넣고 4℃에서 1시간 반응 시켰으며, 반응 후 3 ㎖ PBS를 넣고 1500 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 제거함으로써 세척을 진행하였다. 다음 anti-His-FITC(abcam)항체를 PBS로 1:100희석하여 100 ㎕씩 넣은 후 다시 4℃에서 30분간 반응 시켰으며, 반응 후 3 ㎖ PBS를 넣고 1500 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 버리고 펠렛은 300 ㎕ PBS로 suspension하여 FACS로 측정하였다(도 21).
실험결과 EGFR을 발현하고 있는 A431 세포주에 결합함을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SINIL PHARM LTD. <120> A New Antibody Fragment for EGFR <130> DP-2013-0104 <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-EGFR heavy chain variable domain <400> 1 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-EGFR light chain variable domain <400> 2 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 15aa <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL forward_BamH1 <400> 4 tccggatccg atattctgct gaccca 26 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH/linker reverse <400> 5 gaaccgccac cgcccgcgct aaccgtca 28 <210> 6 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL/Linker forward <400> 6 ggtggcggta gtggcggtgg cggttcccaa gtccaactga aac 43 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH reverse_Hind3 <400> 7 tggtagaggc aagcttttac gcgctaaccg 30 <210> 8 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge-CH3 domain <400> 8 Lys Leu Glu Pro Lys Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 1 5 10 15 Pro Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 20 25 30 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 35 40 45 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 50 55 60 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 65 70 75 80 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 85 90 95 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 100 105 110 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Glu 115 120 125 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LLH-pET21a-For <400> 9 cgccatatgg atattctgct gacccagagc c 31 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LHCC-pET21a-His-Rev <400> 10 cgcctcgagt ttacccggag acaggctcag 30 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NH-CH3-pET21a-For <400> 11 cgcaagcttg gacagccgcg tgaaccg 27 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LHCC-pET21a-His-Rev <400> 12 cgcctcgagt ttacccggag acaggctcag 30 <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 18 aa <400> 13 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge_original <400> 14 Glu Pro Lys Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 1 5 10 15 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3_original <400> 15 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge-CH3-1Cys-Change-For <400> 16 aaatcaccta agagcgcgga taaaacacat acggc 35 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge-CH3-1Cys-Change-Rev <400> 17 gccgtatgtg ttttatccgc gctcttaggt gattt 35 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge-CH3-2Cys-Change-For <400> 18 gataaaacac atacggcgcc aggacagccg cgtga 35 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge-CH3-2Cys-Change-Rev <400> 19 tcacgcggct gtcctggcgc cgtatgtgtt ttatc 35 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge-CH3-3Cys-Change-For <400> 20 caggtgtcat tgacagcgtt agttaaaggt ttttatcca 39 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge-CH3-3Cys-Change-Rev <400> 21 tggataaaaa cctttaacta acgctgtcaa tgacacctg 39 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge-CH3-4Cys-Change-For <400> 22 gggaacgttt ttagtgcgtc cgtgatgcat gaagc 35 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge-CH3-4Cys-Change-Rev <400> 23 gcttcatgca tcacggacgc actaaaaacg ttccc 35 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge (C > A) <400> 24 Glu Pro Lys Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Ala Pro 1 5 10 15 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 (C > A) <400> 25 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Ala Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Ala Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 26 <211> 374 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MI005 <400> 26 Met Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro 1 5 10 15 Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr 20 25 30 Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu 65 70 75 80 Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro 85 90 95 Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys 115 120 125 Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr 130 135 140 Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser 165 170 175 Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile 180 185 190 Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu 195 200 205 Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr 210 215 220 Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ala Lys Leu Glu Pro Lys Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 245 250 255 Thr Cys Pro Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 260 265 270 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 275 280 285 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 290 295 300 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 305 310 315 320 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 325 330 335 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 340 345 350 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Glu 355 360 365 His His His His His His 370 <210> 27 <211> 374 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MI010 <400> 27 Met Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro 1 5 10 15 Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr 20 25 30 Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu 65 70 75 80 Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro 85 90 95 Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys 115 120 125 Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr 130 135 140 Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser 165 170 175 Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile 180 185 190 Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu 195 200 205 Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr 210 215 220 Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ala Lys Leu Glu Pro Lys Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His 245 250 255 Thr Ala Pro Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 260 265 270 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 275 280 285 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 290 295 300 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 305 310 315 320 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 325 330 335 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 340 345 350 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Glu 355 360 365 His His His His His His 370 <210> 28 <211> 374 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MI012 <400> 28 Met Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro 1 5 10 15 Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr 20 25 30 Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu 65 70 75 80 Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro 85 90 95 Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys 115 120 125 Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr 130 135 140 Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser 165 170 175 Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile 180 185 190 Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu 195 200 205 Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr 210 215 220 Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ala Lys Leu Glu Pro Lys Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His 245 250 255 Thr Ala Pro Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 260 265 270 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Ala Leu Val 275 280 285 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 290 295 300 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 305 310 315 320 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 325 330 335 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Ala Ser Val Met His Glu Ala Leu His 340 345 350 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Glu 355 360 365 His His His His His His 370

Claims (15)

  1. 하기 서열식(I)을 포함하는, EGFR(Epidermal growth factor receptor)과 결합 가능한 단백질:
    서열식 (I)
    VL-X-VH-Hinge-CH3
    상기 식에서,
    VL은 서열목록 제2서열의 경쇄 가변 도메인이고;
    X는 1 내지 50의 아미노산 서열을 갖는 링커이고;
    VH는 서열목록 제1서열의 중쇄 가변 도메인이고;
    Hinge는 서열목록 제24서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인이고;
    CH3은 서열목록 제15서열 또는 제25서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인이다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 서열목록 제27서열의 MI010 또는 서열목록 제28서열의 MI012인 것을 특징으로 하는 단백질.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 X는 서열목록 제3서열 또는 제13서열인 것을 특징으로 하는 단백질.
  7. 제 1 항의 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
  8. 제 7 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pET 발현벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 pET 발현벡터는 pET28a 또는 pET21a인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  11. 제 8 항의 재조합 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  13. 제 11 항의 형질전환체를 배양하여 제 1 항의 단백질을 제조하는 방법.
  14. 제 1 항의 단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  15. 제 1 항의 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물.
KR1020130045066A 2013-04-23 2013-04-23 신규한 ｅｇｆｒ 항체 단편 KR101555548B1 (ko)

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