KR102617443B1 - 항원 결합 도메인 및 사이토카인 삼량체 도메인을 포함하는 융합 단백질 - Google Patents
항원 결합 도메인 및 사이토카인 삼량체 도메인을 포함하는 융합 단백질 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102617443B1 KR102617443B1 KR1020220046740A KR20220046740A KR102617443B1 KR 102617443 B1 KR102617443 B1 KR 102617443B1 KR 1020220046740 A KR1020220046740 A KR 1020220046740A KR 20220046740 A KR20220046740 A KR 20220046740A KR 102617443 B1 KR102617443 B1 KR 102617443B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- monomer
- fusion protein
- leu
- cytokine
- ala
- Prior art date
Links
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 106
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 106
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 title claims abstract description 89
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 title claims abstract description 89
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 47
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 239000013638 trimer Substances 0.000 title claims description 66
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 250
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 15
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 93
- 102100032101 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Human genes 0.000 claims description 83
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 claims description 78
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 61
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 56
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 51
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 43
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 39
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 39
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 34
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 32
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 26
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 26
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 18
- 102220576032 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain_Q94S_mutation Human genes 0.000 claims description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 9
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 5
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 4
- 101000638161 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 108010039471 Fas Ligand Protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101710131437 Gene 39 protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000764263 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000638255 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 8 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004473 OX40 Ligand Human genes 0.000 claims description 2
- 108010042215 OX40 Ligand Proteins 0.000 claims description 2
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 claims description 2
- 102100032100 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 2
- 208000035896 Twin-reversed arterial perfusion sequence Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037979 autoimmune inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 claims description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 32
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 31
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 31
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 26
- 239000002585 base Substances 0.000 description 24
- CSFVADKICPDRRF-KKUMJFAQSA-N Leu-His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CN=CN1 CSFVADKICPDRRF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 20
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 18
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 14
- SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N Arg-Ala-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 13
- CBHVAFXKOYAHOY-NHCYSSNCSA-N Asn-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CBHVAFXKOYAHOY-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 13
- VSXBYIJUAXPAAL-WDSKDSINSA-N Gln-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O VSXBYIJUAXPAAL-WDSKDSINSA-N 0.000 description 13
- MLSKFHLRFVGNLL-WDCWCFNPSA-N Gln-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MLSKFHLRFVGNLL-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 13
- KOSWSHVQIVTVQF-ZPFDUUQYSA-N Leu-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KOSWSHVQIVTVQF-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 13
- IZFVRRYRMQFVGX-NRPADANISA-N Val-Ala-Gln Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N IZFVRRYRMQFVGX-NRPADANISA-N 0.000 description 13
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 13
- 108010031491 threonyl-lysyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 13
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 12
- RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 12
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 12
- QPCVIQJVRGXUSA-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN QPCVIQJVRGXUSA-LURJTMIESA-N 0.000 description 12
- TVUWMSBGMVAHSJ-KBPBESRZSA-N Gly-Leu-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 TVUWMSBGMVAHSJ-KBPBESRZSA-N 0.000 description 12
- HFPVRZWORNJRRC-UWVGGRQHSA-N Gly-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN HFPVRZWORNJRRC-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 12
- GMIWMPUGTFQFHK-KCTSRDHCSA-N His-Ala-Trp Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(O)=O GMIWMPUGTFQFHK-KCTSRDHCSA-N 0.000 description 12
- DQZCEKQPSOBNMJ-NKIYYHGXSA-N His-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DQZCEKQPSOBNMJ-NKIYYHGXSA-N 0.000 description 12
- HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N L-Met-L-Phe Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- RTXKJFWHEBTABY-IHPCNDPISA-N Ser-Trp-Tyr Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CC=C(C=C3)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N RTXKJFWHEBTABY-IHPCNDPISA-N 0.000 description 12
- ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N Val-Ala-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 12
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 12
- 108010068488 methionylphenylalanine Proteins 0.000 description 12
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 12
- 108010025826 prolyl-leucyl-arginine Proteins 0.000 description 12
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 12
- AJOKKVTWEMXZHC-DRZSPHRISA-N Phe-Ala-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 AJOKKVTWEMXZHC-DRZSPHRISA-N 0.000 description 11
- BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N Thr-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 11
- 108010043240 arginyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 11
- 108010037274 Member 9 Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Proteins 0.000 description 10
- 102000011769 Member 9 Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Human genes 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 9
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 8
- QLSRIZIDQXDQHK-RCWTZXSCSA-N Arg-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QLSRIZIDQXDQHK-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 8
- XTMZYFMTYJNABC-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N XTMZYFMTYJNABC-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 8
- DONWIPDSZZJHHK-HJGDQZAQSA-N Asp-Lys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O DONWIPDSZZJHHK-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 8
- FHPXTPQBODWBIY-CIUDSAMLSA-N Glu-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FHPXTPQBODWBIY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 8
- MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 8
- PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 8
- PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 8
- ZLCLYFGMKFCDCN-XPUUQOCRSA-N Gly-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(O)=O ZLCLYFGMKFCDCN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 8
- FULZDMOZUZKGQU-ONGXEEELSA-N Gly-Val-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)CN FULZDMOZUZKGQU-ONGXEEELSA-N 0.000 description 8
- SBVMXEZQJVUARN-XPUUQOCRSA-N Gly-Val-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SBVMXEZQJVUARN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 8
- HZWWOGWOBQBETJ-CUJWVEQBSA-N His-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O HZWWOGWOBQBETJ-CUJWVEQBSA-N 0.000 description 8
- DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 8
- SQUFDMCWMFOEBA-KKUMJFAQSA-N Leu-Ser-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 SQUFDMCWMFOEBA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 8
- XFIHDSBIPWEYJJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XFIHDSBIPWEYJJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 8
- LLSUNJYOSCOOEB-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LLSUNJYOSCOOEB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 8
- NHCKESBLOMHIIE-IRXDYDNUSA-N Phe-Gly-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 NHCKESBLOMHIIE-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 8
- CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N Pro-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 8
- YXHYJEPDKSYPSQ-AVGNSLFASA-N Pro-Leu-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 YXHYJEPDKSYPSQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 8
- HWLKHNDRXWTFTN-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Cys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O HWLKHNDRXWTFTN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 8
- BTKUIVBNGBFTTP-WHFBIAKZSA-N Ser-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O BTKUIVBNGBFTTP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 8
- GHPQVUYZQQGEDA-BIIVOSGPSA-N Ser-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O GHPQVUYZQQGEDA-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 8
- FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 8
- XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N Thr-Gly-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 8
- SCSVNSNWUTYSFO-WDCWCFNPSA-N Thr-Lys-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SCSVNSNWUTYSFO-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 8
- BCBFMJYTNKDALA-UFYCRDLUSA-N Val-Phe-Phe Chemical compound N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O BCBFMJYTNKDALA-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 8
- OWFGFHQMSBTKLX-UFYCRDLUSA-N Val-Tyr-Tyr Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O)N OWFGFHQMSBTKLX-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 8
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 8
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 8
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 8
- QKCZZAZNMMVICF-DCAQKATOSA-N Gln-Leu-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QKCZZAZNMMVICF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 7
- PRBLYKYHAJEABA-SRVKXCTJSA-N Gln-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PRBLYKYHAJEABA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 6
- 101000638251 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Proteins 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- VWWKKDNCCLAGRM-GVXVVHGQSA-N (2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]propanoyl]amino]acetyl]amino]-3-methylbutanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VWWKKDNCCLAGRM-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- DVWVZSJAYIJZFI-FXQIFTODSA-N Ala-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DVWVZSJAYIJZFI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 5
- SMCGQGDVTPFXKB-XPUUQOCRSA-N Ala-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N SMCGQGDVTPFXKB-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 5
- DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N Ala-Leu-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N 0.000 description 5
- HICVMZCGVFKTPM-BQBZGAKWSA-N Asp-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O HICVMZCGVFKTPM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 5
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 5
- SBCYJMOOHUDWDA-NUMRIWBASA-N Glu-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SBCYJMOOHUDWDA-NUMRIWBASA-N 0.000 description 5
- XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N Gly-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 5
- YYXJFBMCOUSYSF-RYUDHWBXSA-N Gly-Phe-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YYXJFBMCOUSYSF-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 5
- CQGSYZCULZMEDE-SRVKXCTJSA-N Leu-Gln-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CQGSYZCULZMEDE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 5
- CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N Leu-Gln-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N1CCCC1C(O)=O CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 5
- DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N Lys-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 5
- ROOQMPCUFLDOSB-FHWLQOOXSA-N Phe-Phe-Gln Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 ROOQMPCUFLDOSB-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 5
- KDBHVPXBQADZKY-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 KDBHVPXBQADZKY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 5
- IDQFQFVEWMWRQQ-DLOVCJGASA-N Ser-Ala-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O IDQFQFVEWMWRQQ-DLOVCJGASA-N 0.000 description 5
- MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N Ser-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N 0.000 description 5
- GYDFRTRSSXOZCR-ACZMJKKPSA-N Ser-Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O GYDFRTRSSXOZCR-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 5
- HKHCTNFKZXAMIF-KKUMJFAQSA-N Ser-Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CC1=CC=C(O)C=C1 HKHCTNFKZXAMIF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 5
- JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- UUJHRSTVQCFDPA-UFYCRDLUSA-N Tyr-Tyr-Val Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 UUJHRSTVQCFDPA-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 5
- RUCNAYOMFXRIKJ-DCAQKATOSA-N Val-Ala-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN RUCNAYOMFXRIKJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 5
- TZVUSFMQWPWHON-NHCYSSNCSA-N Val-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N TZVUSFMQWPWHON-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 5
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 5
- WMYJZJRILUVVRG-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O WMYJZJRILUVVRG-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 4
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KVRLNEILGGVBJX-IHRRRGAJSA-N Val-His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)CC1=CN=CN1 KVRLNEILGGVBJX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 4
- GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N Val-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- YBZMTKUDWXZLIX-UWVGGRQHSA-N Arg-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YBZMTKUDWXZLIX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 3
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 3
- 229950005972 urelumab Drugs 0.000 description 3
- 229950003520 utomilumab Drugs 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 102000002627 4-1BB Ligand Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- IIMZHVKZBGSEKZ-SZMVWBNQSA-N Gln-Trp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IIMZHVKZBGSEKZ-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 101710165434 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229950002916 avelumab Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 238000002849 thermal shift Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 235000006491 Acacia senegal Nutrition 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- SBGXWWCLHIOABR-UHFFFAOYSA-N Ala Ala Gly Ala Chemical compound CC(N)C(=O)NC(C)C(=O)NCC(=O)NC(C)C(O)=O SBGXWWCLHIOABR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BLGHHPHXVJWCNK-GUBZILKMSA-N Ala-Gln-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BLGHHPHXVJWCNK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102100040410 Alpha-methylacyl-CoA racemase Human genes 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N Cellulose, microcrystalline Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- CAXXTYYGFYTBPV-IUCAKERBSA-N Gln-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CAXXTYYGFYTBPV-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- DTRUBYPMMVPQPD-YUMQZZPRSA-N Gly-Gln-Arg Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O DTRUBYPMMVPQPD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QGDOOCIPHSSADO-STQMWFEESA-N Gly-Met-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O QGDOOCIPHSSADO-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- AWHJQEYGWRKPHE-LSJOCFKGSA-N His-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AWHJQEYGWRKPHE-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- BPOHQCZZSFBSON-KKUMJFAQSA-N His-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O BPOHQCZZSFBSON-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 101000891254 Homo sapiens Alpha-methylacyl-CoA racemase Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- 125000003798 L-tyrosyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N Leu-Gly-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- KYIIALJHAOIAHF-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 KYIIALJHAOIAHF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010030544 Peptidyl-Lys metalloendopeptidase Proteins 0.000 description 1
- UHRNIXJAGGLKHP-DLOVCJGASA-N Phe-Ala-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UHRNIXJAGGLKHP-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- LJUUGSWZPQOJKD-JYJNAYRXSA-N Phe-Arg-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)Cc1ccccc1)C(O)=O LJUUGSWZPQOJKD-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101001099106 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CAAX prenyl protease 2 Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- VFEHSAJCWWHDBH-RHYQMDGZSA-N Thr-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VFEHSAJCWWHDBH-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N Thr-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- 208000003721 Triple Negative Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- ZJPSMXCFEKMZFE-IHPCNDPISA-N Trp-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZJPSMXCFEKMZFE-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N Val-Leu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 101000745889 Xenopus laevis Cytochrome P450 26A1 Proteins 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960003008 blinatumomab Drugs 0.000 description 1
- 229940101815 blincyto Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010026364 glycyl-glycyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 102000045108 human EGFR Human genes 0.000 description 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007919 intrasynovial administration Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000007056 liver toxicity Effects 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- -1 malditol Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 108010093296 prolyl-prolyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009834 selective interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000007655 standard test method Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 208000022679 triple-negative breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 229940054967 vanquish Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 링커로 연결된 제 1 단량체 및 제 2 단량체(dimer)와 제 3 단량체(monomer)가 노브-인투-홀에 의해 결합된 사이토카인 삼량체 도메인 및 항체의 불변 영역(Fc)를 상기 사이토카인 삼량체 도메인으로 대체하여 제조한, 항체 및 사이토카인 삼량체 도메인이 결합된 새로운 형태의 융합 단백질(RACE(Receptor-Antibody Conjugated (cell) Engager))에 대한 것으로, 본 발명에 따른 RACE는 타겟 수용체에 대해 모항체보다 우수한 결합능을 보일 뿐만 아니라 항원 및 타겟 수용체에 대해 우수한 동시 결합능을 보임을 확인한 바, 이를 이중특이성 약학적 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 항원 결합 도메인 및 사이토카인 삼량체 도메인을 포함하는 융합 단백질, 이의 생산방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
항 CD19 항체(Anti-CD19 antibody)와 항 CD3 항체(Anti-CD3 antibody)를 이용하여 설계된 CD19/CD3 연결자 블리나투모맙(blincyto, Amgen)의 승인은 면역세포의 호밍(homing)을 통해 종양의 치료를 유도하는 이중특이성 면역항암제의 개발을 가속화시켰다.
항 CD3 항체는 주로 T 세포의 표면에 존재하는 CD3 엡실론(CD3 epsilon, CD3e) 분자를 표적하는 분자로, T 세포의 활성화를 유도하며, 이중특이성 항체에 의하여 결합한 타겟 항원을 발현한 세포를 표적하여 세포사멸을 유도한다. 이와 같은 CD3를 표적하는 이중특이성 항체의 경우 짧은 시간안에 T 세포의 활성을 급격하게 촉진하여 타겟 세포의 사멸을 촉진하며, 이러한 과정에서 때로는 사이토카인의 급격한 분비를 유도하기도 한다. 이는 T 세포 표면에 상주하여 세포의 일차적인 활성을 유도하는 CD3 분자가 가지고 있는 본질적인 특성에서 기인하는 것으로 여겨지고 있다.
T 세포를 포함한 면역세포의 활성은 공동자극인자들과 억제인자들 사이의 균형에 의하여 조절된다. 면역세포의 활성을 돕는 공동자극인자들은 크게 두 종류의 패밀리 단백질로 구분되는데, 이에는 CD28, ICOS(Inducible Costimulatory Molecule) 등을 포함하는 B7 수용체 패밀리(B7 receptor family) 단백질들과 4-1BB, OX40 등을 포함하는 TNF 수용체 단백질들이 있다. 특히 이러한 공동자극인자 단백질들은 활성화된 T세포에서 발현되는 유도성 분자로 잘 알려져 있어, 상기한 CD3 항체가 가지고 있는 독성 측면에서의 문제점을 완화시켜줄 수 있을 것이라 여겨진다.
4-1BB 리간드(CD137L)는 항원제시세포에 발현되어 4-1BB 수용체로 신호전달을 하는 것으로 알려져 있다. 4-1BB 리간드는 세포막에 함입된 막단백질의 형태와, 막결합부위 윗부분이 잘려나온 수용성의 형태 두 가지로 존재하는데, 수용성 4-1BB 리간드는 4-1BB 수용체의 신호전달에 기여하지 못하는 반면 막단백질 형태의 4-1BB 리간드는 4-1BB 수용체를 발현하고 있는 T 세포 또는 NK 세포의 활성화를 강하게 유도한다. 이를 통해 4-1BB 신호의 촉진이 종양의 성장을 억제할 수 있음이 보고된 바 있다. 이에 따라 4-1BB을 기능적으로 활성화시킬 수 있는 여러 종류의 항체분자가 종양 치료의 목적으로 개발되었다.
흥미롭게도 4-1BB 리간드와 4-1BB 수용체의 결합을 억제하며 4-1BB 수용체의 응집을 돕는 활성형 항체(예를 들면 유토밀루맙(Utomilumab), Pfizer)의 경우에는 단독으로는 충분한 활성을 갖지 못하지만, Fc-수용체와 결합하는 경우에는 일부 활성을 갖는 것이 관찰되었다. 반면에 4-1BB 리간드와 4-1BB 수용체가 결합한 상태에서 추가적으로 결합하여 4-1BB 수용체와 리간드 복합체의 응집을 돕는 활성형 항체(예를 들면 우렐루맙(Urelumab), BMS-663513, BMS)의 경우에는 Fc-수용체의 도움 없이도 충분한 활성을 갖지만 체내에서 Fc-수용체에 기인한 강한 독성을 보임이 관찰되었다. 실제로 우렐루맙은 이러한 간 독성으로 인하여 임상시험이 중단되었다(NCT00612664).
이 외에도 4-1BB 리간드 자체를 사용하여 종양억제효능을 가진 분자를 설계하고자 하는 시도들도 있었으나, 최소한의 변화로 리간드의 내재적인 구조를 유지하며, 종양 특이적으로 작용할 수 있는 이가(bivalent)의 분자 설계에 있어 유의미한 성과는 거두지 못한 실정이다.
본 발명자들은 리간드의 내재적인 구조를 유지하며, 종양 특이적으로 작용할 수 있는 분자 설계에 대해 연구하던 중, 사이토카인(Cytokine) 삼량체 도메인을 개발하였으며, 특히, 항원 결합 도메인과 노브-인투-홀(knob-into-hole) 구조로 연결된 사이토카인 삼량체 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제조하기 위한 방법을 도출하고, 이러한 방법으로 제조된 융합 단백질의 각 타겟에 대한 결합능을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 융합 단백질을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질의 생산 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 항체 및 종양괴사인자 슈퍼패밀리 삼량체 융합 단백질 생산 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 면역세포의 기능 비활성화에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항원 결합 도메인; 및 사이토카인(cytokine) 삼량체 도메인(domain)을 포함하는, 융합 단백질을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
더불어 본 발명은 Fab의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 링커로 연결된 제 1 단량체 및 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하도록 연결된 제 1벡터; Fab의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 제 3 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하도록 연결된 제 2 벡터; 및 Fab의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제 3벡터;를 포함하는 융합 단백질 생산용 벡터 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 감염시키는 단계를 포함하는, 융합 단백질의 생산 방법을 제공한다.
더불어 본 발명은 Fab의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 링커로 연결된 제 1 단량체 및 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하도록 연결된 제 1벡터; Fab의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 제 3 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하도록 연결된 제 2 벡터; 및 Fab의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제 3벡터;를 포함하는 제 1항의 융합 단백질 생산용 벡터 조성물을 숙주 세포에 감염시키는 단계를 포함하는 융합 단백질의 생산 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 종양괴사인자 슈퍼패밀리(Tumor necrosis factor superfamily, TNFSF)의 제 1 및 제 2 단량체를 포함하는 이량체; 및 종양괴사인자 슈퍼패밀리(Tumor necrosis factor superfamily, TNFSF)의 제 3 단량체; 를 포함하는 삼량체를 형성하는 종양괴사인자 슈퍼패밀리에 있어서, 1) 상기 이량체 및 제 3 단량체 사이에 존재하는 2개의 계면 중 1 계면을 선택하는 단계; 2) 상기 선택된 1 계면에 위치한 제 1 또는 제 2 단량체와 제 3 단량체 사이에 6Å이하의 거리에 위치한 아미노산 쌍을 제 1 또는 제 2 단량체; 및 제 3 단량체에서 하나씩 선택하는 단계; 3) 상기 선택된 아미노산 쌍에서 제 3 단량체 부위에 돌연변이를 유도하여 노브를 형성하는 단계; 4) 상기 제 3 단량체의 노브와 짝이 되며, 구조적인 충돌을 일으키는 자연형(Wild type, WT)의 제 1 또는 제 2 단량체의 아미노산 잔기를 선별하는 단계; 및 5) 상기 선별된 제 1 또는 제 2 단량체의 아미노산 잔기에 돌연변이를 유도하여 홀을 형성하는 단계; 및 6) 상기 제 3 단량체의 노브와 제 1 또는 제 2 단량체의 홀의 노브-인투-홀 상호작용을 유도하는 단계;를 포함하고, 상기 이량체 및 제 3 단량체에는 Fab의 중쇄가 연결되어 있는 것인, 항체 및 종양괴사인자 슈퍼패밀리 삼량체 융합 단백질 생산방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질을 포함하는, 면역세포의 기능 비활성화에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 링커로 연결된 제 1 단량체 및 제 2 단량체(dimer)와 제 3 단량체(monomer)를 포함하는 사이토카인 삼량체 도메인, 바람직하게는 링커로 연결된 제 1 단량체 및 제 2 단량체(dimer);와 제 3 단량체(monomer)가 노브-인투-홀에 의해 결합된 사이토카인 삼량체 도메인 및 항체의 불변 영역(Fc)을 상기 삼량체 도메인으로 대체하여 제조한, 항체 및 사이토카인 삼량체 도메인이 결합된 새로운 형태의 융합 단백질 RACE(Receptor-Antibody Conjugated (cell) Engager)에 대한 것으로, 본 발명에 따른 RACE의 제조방법은 삼량체의 순도와 생산성을 높이고, 이를 통해 제조된 RACE는 타겟 수용체에 대해 모항체보다 우수한 결합능을 보일 뿐만 아니라 항원 및 타겟 수용체에 대해 우수한 동시 결합능을 보임을 확인한 바, 이를 이중특이성 약학적 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 이에 포함되는 단위체 단백질(Unit proteins)(A) 및 상기 단위체 단백질을 포함하는 융합 단백질(B)을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 사이토카인 삼량체 도메인에 있어서, 노브-인투-홀(knob-into-hole) 구조를 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 사이토카인 삼량체 도메인에 있어서, 이량체와 단량체 사이의 상호작용 부위와 그 거리(A), 각각의 상호작용(B)을 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 사이토카인 삼량체 도메인에 있어서, 노브가 한 방향에만 생기는 경우 또는 노브와 홀이 동시에 생기는 경우를 비교한 도이다.
도 5는 3 종의 각각 다른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체 도메인을 포함하는 융합 단백질의 순도를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체 도메인을 포함하는 융합 단백질에 있어서, 노브-인투-홀 구조의 형성 여부(A), 생산량(B) 및 순도(C)를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 사이토카인 삼량체 도메인의 구조를 확인하여, 이량체와 단량체가 노브-인투-홀 구조를 형성한 것을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 사이토카인 삼량체 도메인의 구조 및 이량체를 연결하는 링커를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 사이토카인 삼량체 도메인에 있어서, 노브-인투-홀 구조가 형성되지 않은 경우, 단백질 힌지의 미스매치(mismatch)된 이황화 결합을 갖는 단백질 확인(A) 및 미스매치 힌지 타입과 발생율(B)을 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체 도메인을 포함하는 융합 단백질의 구조 및 크기를 나타낸 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 포함하는 융합 단백질의 열역학적인 안정성을 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 포함하는 융합 단백질의 항원에 대한 결합 친화도를 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 포함하는 융합 단백질의 타겟 수용체에 대한 결합 친화도를 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 포함하는 융합 단백질의 항원 및 타겟 수용체에 대한 동시 결합능을 확인한 결과이다.
도 15는 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 포함하는 융합 단백질의 4-1BB 신호전달 정도를 평가한 결과이다.
도 16은 고형암 세포주들에서 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 포함하는 융합 단백질의 온-타겟(on-target) 신호전달과 오프-타겟(off-target) 신호전달 정도를 평가한 결과로, RACE-02C(A)와 RACE-02B(B)에 대한 결과이다.
도 17은 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터의 모식도이다.
도 18은 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 포함하는 융합단백질의 암을 유발한 동물모델에서의 치료 효과를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 사이토카인 삼량체 도메인에 있어서, 노브-인투-홀(knob-into-hole) 구조를 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 사이토카인 삼량체 도메인에 있어서, 이량체와 단량체 사이의 상호작용 부위와 그 거리(A), 각각의 상호작용(B)을 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 사이토카인 삼량체 도메인에 있어서, 노브가 한 방향에만 생기는 경우 또는 노브와 홀이 동시에 생기는 경우를 비교한 도이다.
도 5는 3 종의 각각 다른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체 도메인을 포함하는 융합 단백질의 순도를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체 도메인을 포함하는 융합 단백질에 있어서, 노브-인투-홀 구조의 형성 여부(A), 생산량(B) 및 순도(C)를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 사이토카인 삼량체 도메인의 구조를 확인하여, 이량체와 단량체가 노브-인투-홀 구조를 형성한 것을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 사이토카인 삼량체 도메인의 구조 및 이량체를 연결하는 링커를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 사이토카인 삼량체 도메인에 있어서, 노브-인투-홀 구조가 형성되지 않은 경우, 단백질 힌지의 미스매치(mismatch)된 이황화 결합을 갖는 단백질 확인(A) 및 미스매치 힌지 타입과 발생율(B)을 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체 도메인을 포함하는 융합 단백질의 구조 및 크기를 나타낸 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 포함하는 융합 단백질의 열역학적인 안정성을 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 포함하는 융합 단백질의 항원에 대한 결합 친화도를 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 포함하는 융합 단백질의 타겟 수용체에 대한 결합 친화도를 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 포함하는 융합 단백질의 항원 및 타겟 수용체에 대한 동시 결합능을 확인한 결과이다.
도 15는 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 포함하는 융합 단백질의 4-1BB 신호전달 정도를 평가한 결과이다.
도 16은 고형암 세포주들에서 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 포함하는 융합 단백질의 온-타겟(on-target) 신호전달과 오프-타겟(off-target) 신호전달 정도를 평가한 결과로, RACE-02C(A)와 RACE-02B(B)에 대한 결과이다.
도 17은 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터의 모식도이다.
도 18은 본 발명에 따른 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 포함하는 융합단백질의 암을 유발한 동물모델에서의 치료 효과를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 항원 결합 도메인; 및 사이토카인(cytokine) 삼량체 도메인(domain)을 포함하는, 융합 단백질을 제공한다.
상기 사이토카인 삼량체 도메인은 제 1 단량체 및 제 2 단량체를 포함하는 이량체(dimer)와 제 3 단량체(monomer)가 결합된 것을 특징으로 하며, 상기 이량체는 링커로 연결된 제 1 단량체 및 제 2 단량체인 것을 특징으로 한다. 상기 이량체에 있어서, 제 1 단량체의 N 또는 C 말단이 제 2 단량체의 N 또는 C 말단과 상호 링커로 연결된 것을 특징으로 한다.
상기 링커는 당 분야에 공지된 링커 중 사이토카인의 제 1 단량체 및 제 2 단량체를 연결할 수 있는 링커라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 G1-G4S 사이의 짧은 펩티드 링커로 연결하였다. 상기 G1은 서열 G를 포함하고, 상기 G4S는 서열 GGGGS를 포함한다.
특히 본 발명의 사이토카인 삼량체 도메인에 있어서, 상기 사이토카인은 자연적으로 삼량체를 형성할 수 있으나, 자연 상태의 삼량체 구조를 이용하여 이에 항체가 결합된 융합 단백질을 제조하는 경우, 삼량체 각각에 대한 항체의 Fab 3 부분을 연결하는 힌지 부분에 미스매치 이황화 결합이 발생하여, 순도와 생산성이 떨어지는 문제점이 있다. 따라서 보다 높은 순도로 생산성을 높이기 위해서는 이량체를 구성하는 제 1 단량체 또는 제 2 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기와 제 3 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기가 노브-인투-홀(knob-into-hole) 구조를 형성하는 것이 바람직하다. 상기 노브-인투-홀 구조는 사이토카인과 수용체의 결합 영역 외의 영역에 형성되는 것이 바람직하다.
더불어 상기 1개 이상의 아미노산 잔기는 단백질 계면(surface)에 위치하는 것을 특징으로 한다. 특히 상기 제 1 단량체 및 제 2 단량체는 링커를 통해 텐덤(tandem)하게 연결되어 있는 바, 제 3 단량체에 생성되는 노브의 계면 위치에 따라 홀이 제 1 단량체에 생성될 수도 있고, 제 2 단량체에 생성될 수도 있다.
상기와 같은 노브-인투-홀 구조를 통해, 홀이 형성된 이량체를 이루는 제 1 또는 제 2 단량체 중 하나와 노브가 형성된 제 3 단량체는 선별적인 상호작용이 유도되고, 홀이 형성되지 않은 나머지 제 1 또는 제 2 단량체와 제 3 단량체의 계면에서는 구조적 방해(steric hinderance)를 유도할 수 있으며, 이를 통해 원하는 계면과의 상호작용을 유도하고, 자연상태의 삼량체를 이용하는 경우 유발되는 미스매치를 방지할 수 있다. 즉 예컨대 본 발명에서는 제 1 단량체의 홀과 제 3 단량체의 노브가 형성된 계면에서 상호작용이 유도되고 제 2 단량체와 제 3 단량체 사이에서는 구조적 방해가 유도될 수 있거나; 제 2 단량체의 홀과 제 3 단량체의 노브가 형성된 계면에서 상호작용이 유도되고 제 1 단량체와 제 3 단량체 사이에서는 구조적 방해가 유도될 수 있다.
한편, 단백질-단백질 상호작용(protein-protein interaction)에 있어서, 중요한 3가지의 상호작용[a) 수소결합(hydrogen bond)= 2.4-3.2Å) 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)= 3.2-3.9Å) 전하 상호작용(charge interaction)=~4Å은 통상적으로 4Å이내의 거리에서 일어난다.
따라서 본 발명의 제 1 단량체, 제 2 단량체 또는 제 3 단량체의 아미노산 잔기에 있어서, 상기 제 1 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기와 제 3 단량체의 아미노산 잔기는 6Å이하의 거리에 위치할 수 있으며, 상기 제 2 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기와 제 3 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기는 6Å이하의 거리에 위치할 수 있다. 바람직하게는 상기 제 1 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기와 제 3 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기는 4Å이하의 거리에 위치할 수 있으며, 상기 제 2 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기와 제 3 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기는 4Å이하의 거리에 위치할 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 제 1 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기와 제 3 단량체의 아미노산 잔기는 2 내지 4Å의 거리에 위치할 수 있으며, 상기 제 2 단량체의 1 개 이상의 아미노산 잔기와 제 3 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기는 2 내지 4Å의 거리에 위치할 수 있다.
그러므로 아미노산 잔기는 이량체와 단량체 사이에 6Å이하의 거리, 바람직하게는 4Å이하의 거리, 보다 바람직하게는 2 내지 4Å거리에 위치하는 아미노산 잔기 중 선택 가능하며, 예컨대 사이토카인이 4-1BBL 단량체 및 이량체로 이루어지는 경우, F92, F238, Q94, F144, V234, Q146, E148, F199, Y142, L203, R202, Q200 및 A180으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 아미노산의 변이 위치는 NCBI의 TNFSF9(TNF superfamily member 9)의 아미노산 서열을 기반으로 결정하였다(accession number: NM_003811.3)
보다 바람직하게는 각 단량체의 아미노산 변이가 야기되어, 이를 통해 노브-인투-홀 구조를 형성할 수 있다. 따라서 상기 아미노산 잔기는 F92W, F238V, Q94S, Q94Y, F144I, V234H, V234F, V234R, Q146S, E148G, F199L, Y142T, L203A, R202V, R202W, R202F, F199W 및 A180E로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
보다 바람직하게는 상기 아미노산 잔기는 2개의 아미노산 잔기가 쌍을 이루어 노브-인투-홀을 형성하는 것일 수 있다. 보다 더 바람직하게는 상기 아미노산 잔기는 R202W과 Q94S가 쌍을 이루어 노브-인투-홀 구조를 형성하는 것을 특징으로 한다.
사이토카인, 예컨대 4-1BBL에 있어서, 이량체(dimer, (제 1 단량체와 제 2 단량체가 링커로 연결))의 E148G(Hole 형성)와 단량체(monomer, (제 3 단량체)의 A180E(Knob 형성)가 노브-인투-홀을 형성하는 삼량체를 제조할 수 있다. 또한, 이량체(제 1 단량체와 제 2 단량체가 링커로 연결)의 R202V(Hole 형성)와 단량체(제 3 단량체)의 V234R(Knob 형성)가 노브-인투-홀을 형성하는 삼량체를 제조할 수 있다. 더불어 이량체(제 1 단량체와 제 2 단량체가 링커로 연결)의 Q94S(Hole 형성)와 단량체(제 3 단량체)의 R202W(Knob 형성)가 노브-인투-홀을 형성하는 삼량체를 제조할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 사이토카인, 예컨대 4-1BBL에 있어서, 이량체(제 1 단량체와 제 2 단량체가 링커로 연결)의 Q94S(Hole 형성)와 단량체(제 3 단량체)의 R202W(Knob 형성)가 노브-인투-홀을 형성하는 삼량체를 제조하였다.
더불어 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기와 같이 노브-인투-홀 구조를 형성한 이량체와 단량체 사이에는 두 개의 계면이 형성된다(Interface A, Interface B(노브-인투-홀(KiH)). 따라서 본 발명은 최소한의 변화로 선별적인 삼량체화를 달성하기 위한 것으로, Interface B(노브-인투-홀(KiH)이 적용된 반대쪽 계면은 자연형태의 계면을 유지할 수 있다. 그러므로 본 발명에 따른 삼량체는 3개의 단량체가 평행한 삼량체(parallel trimer) 구조를 유지하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 융합 단백질에 있어서, 상기 항원 결합 도메인은 항체 또는 항체의 단편이다.
본 발명의 융합 단백질에 있어서, 상기 항체 또는 항체의 단편은 목적하는 항원에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편이라면 어느 것이든 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 리툭시맙(rituximab), 세툭시맙(cetuximab), 트라스트쥬맙(trastuzumab) 및 아벨루맙(avelumab)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 항체 및 사이토카인 삼량체 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제조하였다.
상기 항체의 단편은 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, di-scFv, 및 VHH(variable heavy chain domains of heavy chain antibody)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
특히 상기 항체의 단편은 N 말단 또는 C 말단이 사이토카인 삼량체와 연결되어 융합 단백질을 형성한다. 보다 바람직하게는 상기 항체의 단편은 하기 구조를 갖는 F(ab')2일 수 있다: 상기 F(ab')2의 제1 힌지(Hinge)는 링커로 연결된 제 1 단량체 또는 제 2 단량체에 연결되며; 상기 F(ab')2’의 제2 힌지는 제 3 단량체에 연결된 구조.
본 발명의 융합 단백질에 있어서, 상기 사이토카인은 자연적 상태에서 수용체에 삼량체로 결합하는 것을 특징으로 한다.
따라서 상기 사이토카인은 바람직하게는 자연 상태에서 삼량체 형성이 가능한 종양괴사인자 슈퍼패밀리(Tumor necrosis factor superfamily, TNFSF)일 수 있으며, 바람직하게는 TNFα, Dif, Necrosin, TNFβ, TNFSF1B, TNFγ, CD252, Gp34, CD134L, CD154, TRAP, Gp39, T-BAM, CD178, APTL, CD95L, CD70, CD153, 및 4-1 BBL으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있고, 보다 바람직하게는 4-1 BBL일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명의 융합 단백질에 있어서, 상기 4-1BB의 전체 서열(Accession number: NM_003811.3) 중에서 세포외부로 노출되어 있는 구형단백질 도메인을 사용하였는 바(G90-T241), 상기 4-1BBL은 서열번호 17로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
GMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVT(서열번호 17)
보다 더 바람직하게는 상기 융합 단백질에 포함된 삼량체 4-1BBL는 하기 구조를 갖는 것일 수 있다: 제 1의 4-1BBL 단량체와 제 2의 4-1BBL 단량체가 링커로 연결되어 있으며; 제 1의 4-1BBL 단량체 또는 제 2의 4-1BBL 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기와 제 3의 4-1BBL 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기가 노브-인투-홀(knob-into-hole) 구조를 형성함.
본 발명의 일실시예로 제조한 4-1 BBL 기반의 융합 단백질의 구조는 도 1에 나타내었다. 본 발명의 융합 단백질은 도 1A와 같은 단위체 단백질로 구성되어 도 1B와 같은 구조를 가진다. 보다 구체적으로 1) 4-1BB 리간드 이량체를 포함한 항체 중쇄, 2) 4-1BB 리간드 단량체를 포함한 항체 중쇄, 3) 항체의 경쇄 이렇게 세 종류로 구성된다. 도 1B에 있어서, 상단부의 항원결합 단편은 힌지(hinge)를 통해서 하단부의 4-1BB 리간드 삼량체와 연결된다. 복합체의 형성은 힌지에 존재하는 2개의 이황화결합과 4-1BB 리간드 삼량체 사이에 존재하는 소수성 상호작용을 통하여 이루어진다. 특히 리간드 삼량체 사이의 소수성 상호작용은 노브-인투-홀 모듈을 통하여 4-1BB 리간드 이량체와 4-1BB 리간드 단량체 사이에서 선별적으로 이루어지는데, 이를 통해 단백질의 물성과 순도를 크게 향상시킬 수 있다. 4-1BBL 단량체는 항상 노브를 포함한 구조를 가지는데 이는 단량체가 포함된 중쇄의 동종삼량체화를 방지하기 위하여 꼭 필요하다. 4-1BB 리간드 이량체는 2개의 단량체 사이에 존재하는 짧은 아미노산 링커를 통하여 연결되며 맞은편 단량체의 '노브'와 상호작용하는 부위에 '홀'을 가지고 있다.
상기를 기반으로 한 본 발명의 사이토카인 삼량체 도메인의 구체예에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단량체 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 이량체를 포함할 수 있다. 상기 이량체에 있어서, 170번째 아미노산 서열(G)에서 2개의 단량체가 링커로 연결된 것일 수 있다. 또는, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 단량체 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 이량체를 포함할 수 있다. 상기 이량체에 있어서, 508-510번째 염기서열의 GGA에서 2개의 단량체가 링커로 연결된 것일 수 있다.
본 발명의 사이토카인 삼량체 도메인의 다른 구체예에 있어서, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단량체(202번째 아미노산 서열에서 R에서 W로 변이됨) 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 이량체(94번째 아미노산 서열에서 Q에서 S로 변이됨)를 포함할 수 있다. 상기 이량체에 있어서, 170번째 아미노산 서열(G)에서 2개의 단량체가 링커로 연결된 것일 수 있다. 더불어 상기 단량체와 이량체는 상기 아미노산 변이 위치에서 노브-인투-홀 구조를 형성할 수 있다. 또는, 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 포함하는 단량체(202번째 염기서열에서 AGA가 TGG로 변이됨)와 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는 이량체(94번째 염기서열에서 CAG가 AGC로 변이됨)를 포함할 수 있다. 상기 이량체에 있어서, 508-510번째 염기서열의 GGA에서 2개의 단량체가 링커로 연결된 것일 수 있다.
본 발명의 사이토카인 삼량체 도메인의 또 다른 구체예에 있어서, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단량체(180번째 아미노산 서열에서 A에서 E로 변이됨) 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 이량체(148번째 아미노산 서열에서 E에서 G로 변이됨)를 포함할 수 있다. 상기 이량체에 있어서, 170번째 아미노산 서열(G)에서 2개의 단량체가 링커로 연결된 것일 수 있다. 더불어 상기 단량체와 이량체는 상기 아미노산 변이 위치에서 노브-인투-홀 구조를 형성할 수 있다. 또는, 서열번호 11로 표시되는 염기서열을 포함하는 단량체(180번째 염기서열에서 GCT가 GAA로 변이됨) 및 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 포함하는 이량체(148번째 염기서열에서 CAA가 GGA로 변이됨)를 포함할 수 있다. 상기 이량체에 있어서, 508-510번째 염기서열의 GGA에서 2개의 단량체가 링커로 연결된 것일 수 있다.
본 발명의 사이토카인 삼량체 도메인의 또 다른 구체예에 있어서, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단량체(234번째 아미노산 서열에서 V에서 R로 변이됨) 및 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 이량체(202번째 아미노산 서열에서 R에서 V로 변이됨)를 포함할 수 있다. 상기 이량체에 있어서, 170번째 아미노산 서열(G)에서 2개의 단량체가 링커로 연결된 것일 수 있다. 더불어 상기 단량체와 이량체는 상기 아미노산 변이 위치에서 노브-인투-홀 구조를 형성할 수 있다. 또는, 서열번호 15로 표시되는 염기서열을 포함하는 단량체(234번째 염기서열에서 GTG가 AGA로 변이됨) 및 서열번호 16으로 표시되는 염기서열을 포함하는 이량체(202번째 염기서열에서 AGA가 GTG로 변이됨)를 포함할 수 있다. 상기 이량체에 있어서, 508-510번째 염기서열의 GGA에서 2개의 단량체가 링커로 연결된 것일 수 있다.
따라서 본 발명의 융합 단백질에 있어서, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단량체(monomer) 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 이량체(dimer)를 포함하는 사이토카인 삼량체 도메인; 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단량체 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 이량체를 포함하는 사이토카인 삼량체 도메인; 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단량체 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 이량체를 포함하는 사이토카인 삼량체 도메인; 및 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단량체 및 서열번호 14으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 이량체를 포함하는 사이토카인 삼량체 도메인;으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 사이토카인 삼량체 도메인을 포함할 수 있다.
상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열은 이와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함하는데에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질 또는 펩타이드의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열은 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있는 어떤 방법이라도 제한없이 사용할 수 있다.
더불어 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 염기서열은 상기 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 염기 서열에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 염기 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 융합 단백질의 사이토카인 삼량체 도메인에 있어서, 노브-인투-홀 구조는 단량체와 이량체에서 각각 발생한 아미노산 변이를 통해 생성되는 것을 특징으로 한다. 이는 자연 상태에서 삼량체로 존재하는 종양괴사인자 슈퍼패밀리(Tumor necrosis factor superfamily, TNFSF)의 삼량체 조립에 있어서, 항체(Fab)를 연결하는 힌지(hinge) 부분의 서열상의 오조립(misassembly)이 발생하면서 미스매치된 이황화물(mismatched disulfide)이 생성되는 것을 방지하기 위한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터의 모식도는 도 17에 나타내었다. 도 17에 있어서, 벡터의 유전자 부위에 경쇄, 중쇄 이량체 및/또는 중쇄 단량체가 포함되는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 Fab의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 링커로 연결된 제 1 단량체 및 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하도록 연결된 제 1벡터; Fab의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 제 3 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하도록 연결된 제 2 벡터; 및 Fab의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제 3벡터;를 포함하는 융합 단백질 생산용 벡터 조성물을 제공한다.
상기 융합 단백질 생산용 벡터 조성물을 사용하는 경우, 삼량체 중 이량체 및 Fab 중쇄, 삼량체 중 단량체 및 Fab 중쇄를 각각 제조한 후, 삼량체 형성을 유도할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 제작물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 감염시키는 단계를 포함하는, 융합 단백질의 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 Fab의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 링커로 연결된 제 1 단량체 및 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하도록 연결된 제 1벡터; Fab의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 제 3 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하도록 연결된 제 2 벡터; 및 Fab의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제 3벡터;를 포함하는 제 1항의 융합 단백질 생산용 벡터 조성물을 숙주 세포에 감염시키는 단계를 포함하는 융합 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서 상기 "재조합 벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명에 따른 항원 결합 도메인; 및 사이토카인(cytokine) 삼량체 도메인(domain)을 포함하는, 융합 단백질은 항원에 대한 결합능이 모항체보다 우수하였고, 사이토카인 타겟 수용체에 대한 결합능이 모항체보다 우수하였으며, 동시에 결합할 수 있음을 확인한 바, 각 타겟(단백질)이 발현된 세포의 결합을 성공적으로 유도할 수 있음을 확인하였다.
더불어 본 발명은 본 발명은 종양괴사인자 슈퍼패밀리(Tumor necrosis factor superfamily, TNFSF)의 제 1 및 제 2 단량체를 포함하는 이량체; 및 종양괴사인자 슈퍼패밀리(Tumor necrosis factor superfamily, TNFSF)의 제 3 단량체; 를 포함하는 삼량체를 형성하는 종양괴사인자 슈퍼패밀리에 있어서, 1) 상기 이량체 및 제 3 단량체 사이에 존재하는 2개의 계면 중 1 계면을 선택하는 단계; 2) 상기 선택된 1 계면에 위치한 제 1 또는 제 2 단량체와 제 3 단량체 사이에 6Å이하의 거리에 위치한 아미노산 쌍을 제 1 또는 제 2 단량체; 및 제 3 단량체에서 하나씩 선택하는 단계; 3) 상기 선택된 아미노산 쌍에서 제 3 단량체 부위에 돌연변이를 유도하여 노브를 형성하는 단계; 4) 상기 제 3 단량체의 노브와 짝이 되며, 구조적인 충돌을 일으키는 자연형(Wild type, WT)의 제 1 또는 제 2 단량체의 아미노산 잔기를 선별하는 단계; 및 5) 상기 선별된 제 1 또는 제 2 단량체의 아미노산 잔기에 돌연변이를 유도하여 홀을 형성하는 단계; 및 6) 상기 제 3 단량체의 노브와 제 1 또는 제 2 단량체의 홀의 노브-인투-홀 상호작용을 유도하는 단계;를 포함하고, 상기 이량체 및 제 3 단량체에는 Fab의 중쇄가 연결되어 있는 것인, 항체 및 종양괴사인자 슈퍼패밀리 삼량체 융합 단백질 생산방법을 제공한다.
상기 항체 및 종양괴사인자 슈퍼패밀리 삼량체 융합 단백질 생산방법 중 상기 2)단계에 있어서, 상기 아미노산 쌍은 1 계면에 위치한 제 1 또는 제 2 단량체와 제 3 단량체 사이에 6Å이하의 거리, 바람직하게는 4Å이하의 거리, 보다 바람직하게는 2 내지 4Å거리에 위치할 수 있다.
상기 항체 및 종양괴사인자 슈퍼패밀리 삼량체 융합 단백질 생산 방법에 있어서, 노브에 대한 구조적인 충돌을 일으키는 아미노산 잔기는 시뮬레이션(simulation)을 통해 해당 잔기를 후보(Candidate)인 글리신(Glycine, G), 발린(Valine, V), 세린(Serine, S) 및 알라닌(Alanine, A)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기로 변경하며 유추할 수 있다.
더불어 상기 1) 단계의 선택된 계면에서는 노브-인투-홀 결합이 이루어지며, 나머지 선택되지 않은 계면의 단량체 사이에는 구조적 방해(steric hinderance)가 유도되는 것을 특징으로 한다. 상기 구조적 방해를 통해 원하는 계면과의 상호작용을 유도할 수 있다. 따라서 자연상태의 삼량체를 이용한 융합 단백질을 생산하는 경우 유발될 수 있는 항체(Fab)를 연결하는 힌지 부분의 미스매치된 이황화물의 생성을 방지할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 노브-인투-홀 구조가 적용되지 않은 사이토카인과 항체를 결합한 융합단백질의 경우, 시스테인 잔기가 쌍을 이루어 이황화결합을 형성하는 힌지 영역 근처에서 짝을 이루지 못한 시스테인 잔기가 발견되거나, 또는 3개의 힌지 모두 비대칭적으로 짝을 이루고 있는 이황화결합이 발견되는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명에 따른 생산 방법은 생산된 항체 및 종양괴사인자 슈퍼패밀리 삼량체 융합 단백질에 있어서, 힌지 부분의 비정상적 이황화결합에 의한 불균질성을 방지할 수 있는 최적의 방법인 바, 융합 단백질의 생산성과 순도를 증대시킬 수 있으며, 상기 융합 단백질을 보다 안정적인 치료용 단백질로서 제공할 수 있는 방법이다.
상기 이량체는 링커로 연결된 제 1 단량체 및 제 2 단량체인 것을 특징으로 한다. 상기 이량체에 있어서, 제 1 단량체의 N 또는 C 말단이 제 2 단량체의 N 또는 C 말단과 상호 링커로 연결된 것을 특징으로 한다. 상기 링커는 당 분야에 공지된 링커 중 사이토카인의 제 1 단량체 및 제 2 단량체를 연결할 수 있는 링커라면 제한없이 사용할 수 있다.
또한 상기 항체의 단편(Fab)에 있어서, 목적하는 항원에 결합할 수 있는 항체의 단편이라면 어느 것이든 제한없이 사용될 수 있다.
더불어 본 발명은 상기 생산방법에 의해 생산된 항체 및 종양괴사인자 슈퍼패밀리 삼량체 융합 단백질을 제공한다.
상기 생산방법에 의해 생산된 항체 및 종양괴사인자 슈퍼패밀리 삼량체 융합 단백질에 있어서, 앞서 기술한 융합 단백질에 대한 설명이 동일하게 적용가능하다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질을 포함하는, 면역세포의 기능 비활성화에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 면역세포의 기능 비활성화에 의한 질환은 암, 면역질환, 자가면역질환, 중추신경질환, 퇴행성신경질환, 자가면역질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 상기 암은 유방암, 폐암, 대장암 및 결장직장암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 상기 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골 내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 사용된 특정 유효성분의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 세포주 준비
Freestyle293F 세포주(Gibco™, R79007)를 Freestyle 293F 발현 배양액 (Gibco™, 12338018)를 이용하여 37 ℃, 8% CO2의 조건에서 120RPM으로 혼탁배양하였다. 더불어 Raji-B 세포주(CCL-86™, ATCC), MDA-MB-231 세포주(HTB-26™, ATCC), SW-480 세포주(10228, KCLB)는 RPMI1640(Welgene)에 10%(v/v)의 FBS(Fetal bovine serum, Gibco™)을 첨가한 배양액을 이용하였고, PC-9 세포주 (CVCL_B260) 및 HT-29 세포주(HTB-38™, ATCC)는 DMEM(Welgene)에 10% (v/v)의 FBS를 첨가한 배양액을 이용하여 37 ℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
실시예 1. 사이토카인(cytokine) 삼량체 도메인(domain) 및 항체 도메인을 연결한 융합 단백질 제조
1-1. 유전자 준비
본 발명에 따른 융합 단백질의 구성을 위하여 다음 세 종류의 암호화 서열을 설계하였다. 1) 항체의 경쇄 2) 항체 중쇄의 항원결합부위 C 말단에 4-1BB 리간드 단량체가 연결된 서열 3) 항체 중쇄의 항원결합부위 C 말단에 4-1BB 리간드 이량체가 연결된 서열.
이에 있어, 인간 4-1BB 리간드 단백질이 사용되었고, 이에 해당하는 유전자(NM_003811.3)는 Geneart를 이용하여 합성하였다. 본 발명에서는 4-1BB 리간드 단백질의 전체 서열 중에서 세포외부로 노출되어 있는 구형단백질 도메인이 사용되었다(G90-T241). 유전자의 클로닝 및 돌연변이 생성은 게이트웨이 클로닝(gateway cloning)을 이용하여 수행하였다.
1-2. 융합 단백질 생산을 위한 벡터 제작
항체의 Fc 부위가 사이토카인 삼량체로 교체된 융합 단백질(이하, RACE(Receptor-Antibody Conjugated (cell) Engager)로 명칭)를 제조하기 위하여, Fab 중쇄와 사이토카인 이량체에 대한 제 1 벡터, Fab 중쇄 및 사이토카인 단량체에 대한 제 2 벡터 및 경쇄에 대한 제 3 벡터를 제작하였다.
이때 사이토카인(cytokine)인 4-1BB 리간드의 삼량체 도메인에 있어서, 돌연변이 형성을 위한 아미노산 잔기는 Pymol software와 Dynamut server (http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut/)를 활용한 시뮬레이션을 통해 선정하였다.
4-1BB 리간드의 일부 서열(G90-T241)을 단위체로 한 삼량체 도메인을 구성하였다. 구체적으로 제조되는 삼량체의 물성과 순도를 크게 향상시키고, 단량체가 포함된 중쇄의 동종 삼량체화를 방지하기 위하여, 노브-인투-홀(Knob-into -hole) 구조를 이용하여 삼량체가 형성되도록 하였다. 이를 위하여 1) 4-1BB 리간드 이량체를 포함한 항체 중쇄, 2) 4-1BB 리간드 단량체를 포함한 항체 중쇄를 이용하여 이량체 및 단량제 사이에 존재하게 되는 2개의 계면 중 한 개의 계면에만 노브-인투-홀이 형성되도록 하였고, 최소한의 변화로 선별적인 삼량체화를 달성하도록 하였다. 노브는 4-1BB 리간드 단량체에 형성되고, 홀은 4-1BB 리간드의 이량체 중 하나에 형성되도록 하였다. 삼량체의 각 유닛과 이의 결합 형태를 도 1에 나타내었고, 각 유닛들의 계면에 형성될 수 있는 노브-인투-홀에 대하여 도 2에 나타내었다.
상기와 같이 형성한 삼량체 도메인의 구조 분석은 인간 4-1BBL 단백질 복합체 구조(PDB code: 6A3V, 2X29)를 기반으로 하여 Pymol software (https://pymol.org/2/)를 이용하여 진행하였다.
이를 통해 확인한 4-1BB 리간드 이량체와 단량체 사이의 상호작용 부위를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 상호작용 계면에서 4Å미만의 거리에 있는 아미노산이 확인되었다(도 3A). 더불어 도 3A의 각 아미노산들이 이루고 있는 상호작용을 도 3B에 점선 (수소결합) 또는 실선(소수성 상호작용)으로 나타내었다.
상기와 같이 도출된 아미노산 잔기들에 변이를 유발하여, 이량체와 단량체 사이에 노브-인투-홀 구조를 형성하도록 하였으며, 야생형과 각 변이의 노브-인투-홀 형성 여부에 대한 모식도를 돌연변이유발(mutagenesis)을 통하여 예측해 도 4에 나타내었다.
상기 4-1BB 리간드는 자연 상태에서 삼량체로 존재한다. 상기 삼량체의 조립(assembly)에 있어 항체(Fab)를 연결하는 힌지(hinge) 부분의 서열상의 오조립(misassembly)이 발생하면서 미스매치된 이황화물(mismatched disulfide)이 생성된다. 이를 해결하기 위해서 본 발명은 노브-인투-홀 구조를 이용하여 삼량체를 생산하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 단량체의 아미노산 잔기에 변이를 주지 않으면 노브-인투-홀 구조가 형성되지 않으며(도 4 중 좌측), 한 단량체의 아미노산 잔기에만 변이를 주면 변이가 발생된 계면의 한쪽에만 노브가 적용되어 자연 상태의 계면과의 상호작용이 구조적 방해(steric hinderance)를 받을 수 있다(도 4 중 중앙). 따라서 본 발명과 같이 두 개의 단량체의 아미노산에 변이를 모두 주었을 때 각각 노브와 홀이 적용되어 안정적인 상보적 구조를 형성할 수 있다(도 4 중 우측 참고).
상기 내용을 고려하여 항체 및 자연형의 사이토카인 서열을 삽입한 중쇄-사이토카인(이량체)에 대한 제 1 벡터, 중쇄-사이토카인(단량체)에 대한 제 2 벡터, 항체 경쇄에 대한 제 3 벡터를 제조하였다. 그 후 상기 이량체 및 단량체에 돌연변이를 유발하여 노브-인투-홀 구조의 형성을 유도하였다.
보다 구체적으로 상기 노브-인투-홀 구조 형성에 있어서, 이량체(제 1 단량체와 제 2 단량체가 링커로 연결)의 Q94S(Hole 형성)와 단량체(제 3 단량체)의 R202W(Knob 형성) 노브-인투-홀을 형성하도록 제조하였다.
먼저 클로닝(cloninig)에 사용할 템플레이트(template (항체의 중쇄, 항체의 경쇄, 4-1BBL(WT) 이량체 및 단량체))를 진아트(Geneart (Thermofisher))에 의뢰하여 합성하였다. 이때 상기 이량체에 있어서, 508-510번째 염기서열에 링커에 해당하는 GGA(Glycine) 서열을 넣어 합성하였다. 또한 상기 항체로 리툭시맙(rituximab, Drugbank accession number(DB00073)) 세툭시맙(cetuximab, Drugbank accession number(DB00002)), 트라스트쥬맙(trastuzumab, Drugbank accession number(DB00072)) 또는 아벨루맙(avelumab, Drugbank accession number(DB11945)) 4 종류의 항체를 사용하였다. 이후 pCMV 벡터를 기반으로 게이트웨이 클로닝을 이용하여 각각에 대한 클로닝을 수행하였다. 보다 구체적으로 pCMV 벡터의 MCS(multiple cloning site)에 항체 중쇄(VH-CH1-힌지(hinge))의 말단으로 4-1BBL-링커-4-1BBL(이량체)을 연결한 항체 중쇄-사이토카인 이량체를 삽입한 제 1 벡터를 제조하였다. 이를 위하여 항체의 중쇄에 대한 첫번째 단편, 4-1BBL 이량체 중 첫 번째 단량체에 대한 두 번째 단편, 4-1BBL 이량체 중 두 번째 단량체에 대한 세 번째 단편을 하기 표 1의 프라이머를 이용해 증폭한 후 게이트웨이 클로닝을 수행하였다.
| 방향 | 서열(5'→3') | |
| 첫 번째 단편 | 정방향 | tacacgtacttagtcgctgaagctcttcTATGGGATGGAGCTATATC |
| 역방향 | taggtacgaactcgattgacggctcttcATCCCCCCAGGAGTTCAGG | |
| 두 번째 단편 | 정방향 | tacacgtacttagtcgctgaagctcttcAGGAGGCATGTTTGCCCAGC |
| 역방향 | taggtacgaactcgattgacggctcttcAGCCTCCTGTCACTCTGAACAGGCC | |
| 세 번째 단편 | 정방향 | tacacgtacttagtcgctgaagctcttcAGGCATGTTTGCCCAGC |
| 역방향 | aggtacgaactcgattgacggctcttcAGAGTTATGTCACTCTGAACAGGCC |
더불어 pCMV 벡터의 MCS에 항체 중쇄(VH-CH1-힌지)의 말단으로 4-1BBL을 연결한 항체 중쇄-사이토카인 단량체를 삽입한 제 2 벡터를 제조하였다. 이를 위하여 항체의 중쇄에 대한 첫번째 단편 및 4-1BBL 단량체에 대한 두 번째 단편을 하기 표 2의 프라이머를 이용해 증폭한 후 게이트웨이 클로닝을 수행하였다.
| 방향 | 서열(5'→3') | |
| 첫 번째 단편 | 정방향 | tacacgtacttagtcgctgaagctcttcTATGGGATGGAGCTATATC |
| 역방향 | taggtacgaactcgattgacggctctt ATCCCCCCAGGAGTTCAGG | |
| 두 번째 단편 | 정방향 | tacacgtacttagtcgctgaagctcttcAGGAGGCATGTTTGCCCAGC |
| 역방향 | aggtacgaactcgattgacggctcttcAGAGTTATGTCACTCTGAACAGGCC |
또한 pCMV 벡터의 MCS에 항체 경쇄를 삽입한 제 3 벡터를 제조하였다. 이때 하기 표 3의 프라이머를 사용하여 단편을 증폭한 후 게이트웨이 클로닝을 수행하였다
| 방향 | 서열(5'→3') | |
| 단일단편 | 정방향 | TACACGTACTTAGTCGCTGAAGCTCTTCTAGATCTGTGGCTGCACCA |
| 역방향 | AGGTACGAACTCGATTGACGGCTCTTCATCTCTTCACTTCCACCTT |
그 후 상기 제 1 벡터의 이량체 및 제 2 벡터의 단량체에 돌연변이를 적용하기 위한 게이트웨이 클로닝을 수행하였다. 이때 하기 표 4의 프라이머를 이용하였다. 그 결과 제 1 벡터의 이량체에는 Q94S의 돌연변이가 적용되었고, 제 2 벡터의 단량체에는 R202W의 돌연변이가 적용되었다.
| 방향 | 서열(5'→3') | |
| 이량체 (Q94S) |
정방향 | tacacgtacttagtcgctgaagctcttcTagcCTGGTGGCCCAGAATG |
| 역방향 | taggtacgaactcgattgacggctcttcAgctGGCAAACATGCCTCC | |
| 단량체 (R202W) |
정방향 | tacacgtacttagtcgctgaagctcttcTtggCTGCTGCACCTGTCTG |
| 역방향 | gtacgaactcgattgacggctcttcAccaGCCTTGGAAGCCAAAGGC |
각 유전자의 삽입 여부 및 서열 검증은 유전자 시퀀싱(sequencing)을 통해 확인하였다(코스모진텍에 의뢰).
1-3. 제 1 벡터, 제 2 벡터 및 제 3벡터를 이용한 RACE의 형질감염 및 생산
RACE의 형질감염 및 발현을 위해서 상기 실험예 1에서 준비한 Freestyle293F 세포를 사용하였다. 형질감염 24시간 전에 Freestyle293F 세포주를 1×106/ml의 농도로 준비하였다. 상기 세포에 Fectopro(Polyplus, 116-010) 시약 및 상기에서 준비한 제 1 벡터, 제 2 벡터 및 제 3 벡터를 이용하여 형질감염을 수행하였다. 보다 구체적으로, 세포주 1ml 당 1μg의 DNA(제 1 벡터, 제 2 벡터 및 제 3 벡터를 1 : 1 : 2의 부피비율로 혼합), 1μl의 Fectopro 시약을 첨가해주는 방법으로 수행하였다. 일시적으로 형질감염된 세포를 5일간 추가적으로 혼탁배양한 후 (37 ℃, 8% CO2, 120 RPM), 1500g으로 30 분동안 원심분리하여 분비형 단백질이 포함된 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액은 이후 정제를 위하여 최장 3일간 냉장보관하였다.
실시예 2. RACE의 정제 및 순도 분석
상기 실시예 1-2-3으로부터 수득한 상등액으로부터 AKTA go (Cytiva)와 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 RACE를 정제하였다. 친화성 크로마토그래피는 CH1-xL column (Thermo)을 사용하였다. 크로마토그래피에 사용된 세정용액(PBS, pH 7.4)과 용출용액(100mM 아세트산나트륨(sodium acetate) pH 4.0)은 사용 직전에 제조, 여과하여 pH 측정 후 사용하였다. 용출하여 수득한 분획 중에서 단백질이 포함되어 있는 분획을 함께 수거하고, 이를 PBS 용액을 이용해 Amicon® Ultra (30kda, 15ml) 필터로 투석하여 보관하였다.
정제한 RACE의 순도분석을 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC(high-performance liquid chromatography), agilent 1260)를 이용하여 크기배제 크로마토그래피(PL1580-3250, agilent)를 수행하였다. 크기배제 크로마토그래피를 통한 대략적인 단백질 크기의 예측은 크기를 알고 있는 표준단백질 (5190-2242, agilent)을 이용한 시험으로 결정하였다. 순도분석에는 150mM sodium phosphate pH 7.0의 완충용액이 사용되었다.
그 결과 도 5와 같이, 본 발명에 따른 아벨루맙-41BBL(RACE-04L)의 순도는 97.24%(도 5 내 PD-L1 targeting (4AL) 그래프 참고)였고, 세툭시맙-41BBL(RACE-02B)의 순도는 96.47%(도 5 내 EGFR targeting (Cetuximab) 그래프 참고)였으며, 트라스트쥬맙-41BBL(RACE-02C)의 순도는 96.91%(도 5 내 HER2 targeting(Herceptin) 그래프 참고)로, 본 발명에 따라 제조된 RACE 모두 우수한 생산성 및 순도를 보여주었다.
더불어 본 발명에 따른 리툭시맙-41BBL(RACE-01C)에 있어서, 노브-인투-홀(Q94S/R202W)이 적용된 경우, 도 6A와 같이, 4-1BB 리간드 이량체(홀)와 4-1BB 리간드 단량체(노브)가 성공적으로 4-1BB 리간드 삼량체를 구성함을 확인하였고, 이러한 삼량체가, 홀(Q94S)을 포함한 중쇄-이량체와 노브(R202W)를 포함한 중쇄-단량체, 그리고 경쇄로 구성되어 있음을 확인하였다. 더불어 상기와 동일한 방법으로 본 발명에 따른 리툭시맙-41BBL(RACE-01C)의 정제 및 순도를 분석한 결과, Fc 이량체를 가지고 있는 정상적인 항체와 유사한 정도의 생산량을 보였으며(도 6B), CH1을 기반으로 한 1차 정제 이후에 96% 이상의 높은 순도의 단백질로 분리됨을 확인하였다(도 6C).
실시예 3. RACE의 구조 분석
4-1BBL 삼량체 도메인의 구조를 인간 4-1BBL 단백질 복합체 구조(PDB code : 6A3V, 2X29)를 기반으로 하여 Pymol software (https://pymol.org/2/)를 이용하여 분석하였다.
그 결과 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 이량체를 구성하는 4-1BBLa의 C 말단은 4-1BBLb의 N 말단과 G1-G4S 사이의 짧은 펩티드 링커로 연결되어 4-1BB 리간드 이량체를 포함한 중쇄의 안정적인 발현에 기여함을 확인하였다. 또한 이량체에 홀이 형성되고 단량체에 노브가 형성되어 삼량체를 구성하는 것을 확인하였다.
실시예 4. 미스매치(Mismatch)가 삼량체 형성에 미치는 영향 확인
본 발명에 따른 RACE에 결합된 4-1BB 리간드에 있어서, 노브-인투-홀 구조 적용이 단백질 힌지(hinge)에 미치는 영향을 이황화결합 분석을 LC(Vanquish, Thermo), MS(Q Exactive Plus, Thermo)를 통하여 확인하였다. 단백질 절편 형성을 위하여 1mg/ml 농도의 분석시료와 표준 시료들, 예를 들어 엔도프로테이나아제(Endoproteinase Lys-C (Sigma, USA)), 키모트립신(Chymotrypsin (Promega)), Glu-C (Promega, Sequencing Grade)을 사용하였다.
상기 분석시료는 다음과 같이 준비하였다. 상기 실시예 1-2-1. 및 1-2-2.의 제 2 벡터(항체 중쇄-단량체) 및 제 3 벡터(항체 경쇄)에 있어서, 상기 항체로 리툭시맙을 사용하였고, 상기 단량체로 자연형의 4-1BBL을 사용하여 제조한 재조합벡터를 상기 1-2-3.과 동일한 방법으로 Freestyle293F 세포에 동시에 형질감염한 후 해당 단백질이 과발현된 세포의 상등액을 수득하였다. 상기 분석시료는 자연형의 4-1BBL 서열을 가진 RACE 중쇄 단량체와 경쇄를 통해 만들어진 단백질로 총 3개의 항체결합단편(Fab)와 힌지영역을 가지고 있는 RACE 삼량체의 구조를 가지고 있다. 이때 단백질 힌지에 생기는 비정상적인 이황화결합의 양상을 관찰하여 노브 인투홀 구조를 통한 힌지의 이량화가 구조적인 안정성, 균질성에 미치는 영향을 확인하였다.
더불어 이황화 결합에 의하여 다량체화되는 단백질의 특성을 확인하기 위하여, SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel)를 이용해 전기영동(Mini-protein tetra, Bio-Rad)을 수행하였다. 이때 환원조건, 비환원조건에서 각 단백질의 크기를 비교하였다. 전기영동이 완료된 겔을 쿠마씨-블루(Coomassie-blue) 시약을 이용하여 염색하였고, LAS-500 (cytiva)을 이용하여 결과를 분석하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 노브-인투-홀이 적용되지 않은 자연상태의 4-1BB 리간드에 있어서, 4-1BB 리간드 이량체를 A, 4-1BB 리간드 단량체를 B 경쇄를 L이라 할때, 노브가 적용되지 않은 자연상태의 단량체인 B와 L을 과발현시킨 세포주에서는 잘못 조립된 B3L3, B2L2와 같은 물질이 관찰되었다(도 9A 중 하단 SDS-PAGE 결과). 특히 3개의 힌지를 가지고 있는 B3L3의 경우에는 두 개의 시스테인 잔기가 쌍을 이루어 이황화결합을 형성하는 힌지 영역 근처에서 짝을 이루지 못한 시스테인 잔기가 발견되거나, 또는 3개의 힌지 모두 비대칭적으로 짝을 이루고 있는 이황화결합이 발견되기도 하였다(도 9B 참고). 이러한 현상은 키모트립신과 Lys-C를 동시에 처리한 실험군(YK)에서 두드러지게 나타났고, Glu-C와 Lys-C를 동시에 처리한 실험군(EK)에서도 미미하게 나타났다. 이러한 불균질성은 치료용 단백질에서는 절대로 없어야 할 특징으로써, 최종적인 삼량체의 순도와 생산성을 높이기 위해서는 반드시 단량체의 개량(knob의 부여)이 필요한 것을 명확히 확인하였다.
실시예 5. 항체 도메인 및 사이토카인 삼량체를 연결하여 제조한 융합 단백질(RACE) 및 특성 분석
5-1. 크기 분석
실시예 1에서 제조한 융합 단백질(RACE) 플랫폼에는 다양한 종류의 항원 결합 단편이 목적에 따라 결합될 수 있으며, 항체 도메인과 결합되는 RACE의 구조 모식도를 도 10에 나타내었다.
또한, RACE의 도메인 구조를 N 말단에서 C 말단까지 나열하여 상기 도 10에 나타내었다. 본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 힌지로 연결된 4-1BB 리간드의 단량체는 노브 모듈을 가지고 있으며, 4-1BB 리간드의 이량체는 홀 모듈을 가지고 있다.
5-2. TSA(Thermal shift assay) 분석
RACE의 안정성 및 용융 온도(Tm) 값 측정은 SYPRO™ Orange (S6650, Thermo) 시약을 이용하여 표준시험법을 참고하여 수행하였다(Curr Protoc Protein Sci. 2015; 79: 28.9.1-28.9.14).
리툭시맙-41BBL(RACE-01C)과 그 모항체인 리툭시맙의 열역학적인 안정성을 비교하였고, 트라스트쥬맙-41BBL(RACE-02C)과 그 모항체인 트라스트쥬맙의 열역학적인 안정성을 비교하여 도 11에 나타내었다. 그 결과 본 발명에 따른 리툭시맙-41BBL(RACE-01C) 및 트라스트쥬맙-41BBL(RACE-02C)은 모두 65℃ 이상의 Tm 값을 가지며, 모항체의 특성을 모사하는 것을 확인하였다.
5-3. 결합 친화도 측정
본 발명에 따른 세툭시맙-41BBL(RACE-02B)의 항원(EGFR)에 대한 결합을 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)을 이용한 Biacore (cytiva)를 사용하여 확인하였다. 먼저 결합력의 측정을 위하여 항원인 EGFR(10001-H08H, Sino) 또는 4-1BB(10041-H08H, Sino)를 센서칩인 CM5칩(29149604, cytiva) 표면에 아민 커플링(amine coupling)을 통하여 고정한 후 정해진 농도의 세툭시맙-41BBL(RACE-02B)을 첨가하였다. HBS(HEPES-buffered saline) 완충액을 사용하여 180초 동안의 결합, 300초 동안의 해리를 확인하였다.
그 결과 도 12와 같이, 본 발명에 따른 세툭시맙-41BBL(RACE-02B)은 모항체인 세툭시맙과 유사한 결합능을 보임을 확인하였다.
더불어 도 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 세툭시맙-41BBL(RACE-02B)은 결합할 수 있는 결합부위를 각 단량체의 사이에 각각 1개씩 총 3개를 가지고 있어 4-1BB 수용체에 대한 안정적인 결합양상을 보였고(도 13 상단), 이는 4-1BB 수용체에 대한 응집성 항체인 유토밀루맙(Pfizer, (4-1BB 리간드 경쟁적 결합))에 비하여 훨씬 더 강력한 결합능을 보여주었다.
5-4. RACE의 동시 결합능 확인
더불어 본 발명에 따른 세툭시맙-41BBL(RACE-02B)의 타겟에 대한 동시 결합능을 확인하였다. 도 14 좌측의 모식도와 같이 CM5칩 표면에 4-1BB 수용체를 고정시킨 후 세툭시맙-41BBL(RACE-02B)와의 결합을 관찰하였고(A-I, D-I), 그 상태에서 추가적인 EGFR과의 결합을 차례로 관찰하였다(A-II, D-II).
그 결과 본 발명에 따른 세툭시맙-41BBL(RACE-02B)은 양쪽 타겟에 동시에 결합할 수 있음을 확인하였으므로, 각 단백질이 발현된 세포의 결합을 성공적으로 유도할 수 있음을 확인하였다.
5-5. 4-1BB 리포터 어세이
4-1BB 바이오어세이(J2332, Promega)를 이용하여 본 발명에 따른 리툭시맙-41BBL(RACE-01C)에 의한 4-1BB 신호전달 정도를 평가하였다. 상기 제조사의 지침에 따라 수행하였으며, 타겟 항원에 대한 신호 의존성을 확인하기 위하여 상기 실험예 1의 CD20 발현 Raji B 세포주를 사용하였다. 신호의 상대값은 GloMax® (Promega)를 이용하여 GloMax®Discover Microplate Reader (GM30000, promega)로 측정하였다.
그 결과 도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 리툭시맙-41BBL(RACE-01C)는 농도 의존적으로 NF-KB 리포터 신호를 증폭시킴을 확인하였다(도 15 중 우측 참고).
실시예 6. 고형암 세포에서 RACE 신호매개 과정 확인
고형암 세포에서 본 발명에 따른 융합 단백질의 신호 매개 과정을 확인하였다. 이를 위하여 상기 실험예 1에 기재된, 아주 미비하게 Her2을 발현한다고 알려진 MDA-MB-231 세포주(유방암 세포주), EGFR을 과발현한다고 알려진 PC-9 세포주(폐선암종 세포주), HT-29 세포주(대장암 세포주), SW480 세포주(결장직장암 세포주)에 본 발명에 따른 트라스트쥬맙-41BBL(RACE-02C), 세툭시맙-41BBL(RACE-02B) 또는 리툭시맙-41BBL(RACE-01C)를 상기 실시예 5-5.와 동일한 방법으로 처리하고 각각의 4-1BB 신호전달 정도를 평가하였다.
MDA-MB-231 세포주에 대한 온-타겟(on-target) 신호전달과 오프-타겟(off-target) 신호전달 정도를 도 16A에 나타내었다. MDA-MB-231 세포주의 경우 삼중음성 유방암으로 분류될 정도로 타겟 단백질인 HER2를 아주 미미하게 발현하고 있음에도 불구하고 해당 단백질에 결합할 수 있는 트라스트쥬맙-41BBL(RACE-02C) 처리시 농도에 따라 신호전달 정도가 민감하게 증가되는 것이 관찰된 반면, 해당 세포에 전혀 발현되지 않는 항원인 CD20을 타겟으로 하고 있는 리툭시맙-41BBL(RACE-01C)가 처리된 경우 오프-타겟에 있어서, 농도에 따른 신호증가가 관찰되지 않았다. 더불어 EGFR 단백질이 표면에 발현된 세 종류의 종양세포주에서 EGFR 발현 정도와 또 온-타겟 신호전달과 오프-타겟 신호전달 정도 차이를 도 16B에 나타내었다. 상기 도 16B에 있어서, cell line-on으로 표기된 것(Ex, SW480-on, HT-29-on, PC9-on)은 on-target 효과 즉, 각각의 타겟 세포에 발현하고 있는 EGFR에 결합할 수 있는 세툭시맙을 이용하여 제작된 세툭시맙-41BBL(RACE-02b)를 처리한 후 이에 대한 신호전달 정도를 확인한 결과이다. 반면, 동일한 세포주에 -off로 표기된 것(Ex, SW480-off, HT-29-off, PC9-off)은 약물의 off-target 효과 즉, 각각의 타겟 세포가 전혀 발현하고 있지 않은 CD20에 결합할 수 있는 리툭시맙-41BBL(RACE-01C)을 처리한 후 발생하는 신호의 정도를 확인한 결과이다.
그 결과 EGFR을 과발현하고 있는 세 종류의 세포에 대하여 세툭시맙-41BBL(RACE-02B) 처리시 농도에 비례한 신호전달을 확인할 수 있었으며 각 세포주에 전혀 발현되지 않는 CD20 단백질에 대한 리툭시맙-41BBL(RACE-01C)- target-off을 처리한 경우 신호전달을 전혀 확인할 수 없어, 전통적으로 4-1BBL 타겟 치료제의 문제점이었던 오프-타겟 독성(toxicity)이 전혀 없음을 확인하였다.
더불어 본 발명에 따른 융합 단백질 세툭시맙-41BBL(RACE-02B)은 타겟 항원 특이적으로, 4-1BB 응집형 항체인 유토밀루맙보다 훨씬 우월한 정도로 4-1BB 신호전달을 유도함을 확인하였다(도 16B).
실시예 7. 암을 유발한 동물모델에서의 효능 확인
세툭시맙-41BBL(RACE-02B)의 항암 효능을 암을 유발한 동물모델에서 확인하였다. 먼저 Balb-c 마우스에서 자발적으로 자라는 마우스 대장암 세포(CT26)의 표면에 인간의 EGFR을 발현하도록 제작하고, 해당 hEGFR-CT26 세포(5×105/100μL)를 인간 4-1BB의 세포 외 도메인을 발현하고 있는 인간화 마우스 (Balb-c)의 피하에 이식하였다(Gempharmatech 사에 의뢰). 이식된 종양의 크기가 평균적으로 100mm3에 도달했을 때를 기점으로 다음 군의 항체를 미정맥으로 Q3D (3일에 한 번씩), 총 6회 투여하였다: 대조군 (5mg/kg, human IgG(Sigma에서 구입(14506))), 세툭시맙-41BBL(RACE-02B): 0.5mg/kg, 2mg/kg. 각 실험군의 종양의 크기(TV = 0.5 a × b2)는 주 2회, 캘리퍼(caliper)로 측정하였다. 상기에 있어서, a는 종양의 장축이고, b는 종양의 단축이다.
그 결과 도 18에 나타낸 바와 같이, 세툭시맙-41BBL(ARCE-02B)는 대조군인 인간 IgG 항체에 비해서 유의미한 종양 억제능을 보여주었다.
종합적으로 본 발명은 제 1 단량체 및 제 2 단량체가 링커로 연결된 이량체와 제 3 단량체가 노브-인투-홀에 의해 결합된 사이토카인 삼량체 도메인 및 항체의 불변 영역(Fc)를 상기 사이토카인 삼량체 도메인으로 대체하여 제조한, 항체 및 사이토카인 삼량체 도메인이 결합된 새로운 형태의 융합 단백질(RACE)에 대한 것으로, 본 발명에 따른 노브-인투-홀로 결합된 사이토카인 삼량체 도메인은 4-1BB 수용체에 대한 응집성 항체보다 훨씬 더 강력한 결합능을 보여주었고, 이를 포함하는 융합 단백질은 양쪽 타겟에 대해 우수한 결합능을 보임을 확인한 바, 각 타겟(단백질)이 발현된 세포의 결합을 성공적으로 유도할 수 있음을 확인하였다.
<110> CTCELLS, Inc.
<120> A fusion protein comprising an antigen binding domain and a
cytokine trimer domain
<130> 1-2P-1
<150> KR 10-2022-0022526
<151> 2022-02-21
<160> 17
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 169
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RACE-WT_Heavy chain I (monomer, WT)
<400> 1
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp
20 25 30
Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
35 40 45
Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
50 55 60
Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val
65 70 75 80
Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
85 90 95
Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
100 105 110
Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln
115 120 125
Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu
130 135 140
His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala
145 150 155 160
Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
165
<210> 2
<211> 322
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RACE-WT_Heavy chain II (dimer, WT, G1 linker)
<400> 2
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp
20 25 30
Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
35 40 45
Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
50 55 60
Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val
65 70 75 80
Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
85 90 95
Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
100 105 110
Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln
115 120 125
Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu
130 135 140
His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala
145 150 155 160
Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu
165 170 175
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
180 185 190
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
195 200 205
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
210 215 220
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
225 230 235 240
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
245 250 255
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
260 265 270
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
275 280 285
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
290 295 300
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
305 310 315 320
Val Thr
<210> 3
<211> 507
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RACE-WT_Heavy chain I (hinge + downstream, 4-1BBL monomer)
<400> 3
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg aggcatgttt 60
gcccagctgg tggcccagaa tgtgctgctg attgatggcc ctctgagctg gtacagcgat 120
cctggacttg ctggcgttag cctgactggc ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa 180
ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 240
gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc tctgagatct 300
gctgctggtg cagctgccct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgccag cagcgaggcc 360
agaaatagcg cctttggctt ccaaggcaga ctgctgcacc tgtctgctgg acagagactg 420
ggagtgcacc tccacacaga agccagagca agacacgcct ggcagctgac acaaggcgct 480
acagtgctgg gcctgttcag agtgaca 507
<210> 4
<211> 966
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RACE-WT_Heavy chain II (hinge + downstream, 4-1BBL dimer)
<400> 4
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg aggcatgttt 60
gcccagctgg tggcccagaa tgtgctgctg attgatggcc ctctgagctg gtacagcgat 120
cctggacttg ctggcgttag cctgactggc ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa 180
ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 240
gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc tctgagatct 300
gctgctggtg cagctgccct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgccag cagcgaggcc 360
agaaatagcg cctttggctt ccaaggcaga ctgctgcacc tgtctgctgg acagagactg 420
ggagtgcacc tccacacaga agccagagca agacacgcct ggcagctgac acaaggcgct 480
acagtgctgg gcctgttcag agtgacagga ggcatgtttg cccagctggt ggcccagaat 540
gtgctgctga ttgatggccc tctgagctgg tacagcgatc ctggacttgc tggcgttagc 600
ctgactggcg gcctgagcta caaagaggac accaaagaac tggtggtggc caaggccggc 660
gtgtactacg tgttctttca gctggaactg cggagagtgg tggccggcga aggatctgga 720
tctgtgtctc tggcactgca tctgcagcct ctgagatctg ctgctggtgc agctgccctg 780
gctctgacag ttgatctgcc tcctgccagc agcgaggcca gaaatagcgc ctttggcttc 840
caaggcagac tgctgcacct gtctgctgga cagagactgg gagtgcacct ccacacagaa 900
gccagagcaa gacacgcctg gcagctgaca caaggcgcta cagtgctggg cctgttcaga 960
gtgaca 966
<210> 5
<211> 169
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RACE-modified I_Heavy chain I (hinge + downstream, 4-1BBL
monomer, R202W)
<400> 5
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp
20 25 30
Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
35 40 45
Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
50 55 60
Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val
65 70 75 80
Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
85 90 95
Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
100 105 110
Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln
115 120 125
Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Trp Leu Gly Val His Leu
130 135 140
His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala
145 150 155 160
Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
165
<210> 6
<211> 322
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RACE-modified I_Heavy chain II (hinge + downstream, 4-1BBL dimer,
Q94S, G1 linker)
<400> 6
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Gly Met Phe Ala Ser Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp
20 25 30
Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
35 40 45
Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
50 55 60
Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val
65 70 75 80
Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
85 90 95
Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
100 105 110
Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln
115 120 125
Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu
130 135 140
His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala
145 150 155 160
Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu
165 170 175
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
180 185 190
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
195 200 205
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
210 215 220
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
225 230 235 240
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
245 250 255
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
260 265 270
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
275 280 285
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
290 295 300
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
305 310 315 320
Val Thr
<210> 7
<211> 507
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RACE-modified I_Heavy chain I (hinge + downstream, 4-1BBL
monomer, R202W)
<400> 7
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg aggcatgttt 60
gcccagctgg tggcccagaa tgtgctgctg attgatggcc ctctgagctg gtacagcgat 120
cctggacttg ctggcgttag cctgactggc ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa 180
ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 240
gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc tctgagatct 300
gctgctggtg cagctgccct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgccag cagcgaggcc 360
agaaatagcg cctttggctt ccaaggctgg ctgctgcacc tgtctgctgg acagagactg 420
ggagtgcacc tccacacaga agccagagca agacacgcct ggcagctgac acaaggcgct 480
acagtgctgg gcctgttcag agtgaca 507
<210> 8
<211> 966
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RACE-modified I_Heavy chain II (hinge + downstream, 4-1BBL dimer,
Q94S, G1 linker)
<400> 8
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg aggcatgttt 60
gccagcctgg tggcccagaa tgtgctgctg attgatggcc ctctgagctg gtacagcgat 120
cctggacttg ctggcgttag cctgactggc ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa 180
ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 240
gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc tctgagatct 300
gctgctggtg cagctgccct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgccag cagcgaggcc 360
agaaatagcg cctttggctt ccaaggcaga ctgctgcacc tgtctgctgg acagagactg 420
ggagtgcacc tccacacaga agccagagca agacacgcct ggcagctgac acaaggcgct 480
acagtgctgg gcctgttcag agtgacagga ggcatgtttg cccagctggt ggcccagaat 540
gtgctgctga ttgatggccc tctgagctgg tacagcgatc ctggacttgc tggcgttagc 600
ctgactggcg gcctgagcta caaagaggac accaaagaac tggtggtggc caaggccggc 660
gtgtactacg tgttctttca gctggaactg cggagagtgg tggccggcga aggatctgga 720
tctgtgtctc tggcactgca tctgcagcct ctgagatctg ctgctggtgc agctgccctg 780
gctctgacag ttgatctgcc tcctgccagc agcgaggcca gaaatagcgc ctttggcttc 840
caaggcagac tgctgcacct gtctgctgga cagagactgg gagtgcacct ccacacagaa 900
gccagagcaa gacacgcctg gcagctgaca caaggcgcta cagtgctggg cctgttcaga 960
gtgaca 966
<210> 9
<211> 169
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RACE-modified II_Heavy chain I (hinge + downstream, 4-1BBL
monomer, A180E)
<400> 9
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp
20 25 30
Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
35 40 45
Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
50 55 60
Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val
65 70 75 80
Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
85 90 95
Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Glu Leu Thr Val Asp
100 105 110
Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln
115 120 125
Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu
130 135 140
His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala
145 150 155 160
Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
165
<210> 10
<211> 322
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RACE-modified II_Heavy chain II (hinge + downstream, 4-1BBL
dimer, E148G, G1 linker)
<400> 10
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp
20 25 30
Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
35 40 45
Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
50 55 60
Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Gly Leu Arg Arg Val
65 70 75 80
Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
85 90 95
Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
100 105 110
Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln
115 120 125
Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu
130 135 140
His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala
145 150 155 160
Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu
165 170 175
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
180 185 190
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
195 200 205
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
210 215 220
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
225 230 235 240
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
245 250 255
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
260 265 270
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
275 280 285
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
290 295 300
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
305 310 315 320
Val Thr
<210> 11
<211> 507
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RACE-modified II_Heavy chain I (hinge + downstream, 4-1BBL
monomer, A180E)
<400> 11
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg aggcatgttt 60
gcccagctgg tggcccagaa tgtgctgctg attgatggcc ctctgagctg gtacagcgat 120
cctggacttg ctggcgttag cctgactggc ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa 180
ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 240
gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc tctgagatct 300
gctgctggtg cagctgccct ggaactgaca gttgatctgc ctcctgccag cagcgaggcc 360
agaaatagcg cctttggctt ccaaggctgg ctgctgcacc tgtctgctgg acagagactg 420
ggagtgcacc tccacacaga agccagagca agacacgcct ggcagctgac acaaggcgct 480
acagtgctgg gcctgttcag agtgaca 507
<210> 12
<211> 966
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RACE-modified II_Heavy chain II (hinge + downstream, 4-1BBL
dimer, E148G, G1 linker)
<400> 12
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg aggcatgttt 60
gccagcctgg tggcccagaa tgtgctgctg attgatggcc ctctgagctg gtacagcgat 120
cctggacttg ctggcgttag cctgactggc ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa 180
ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctgggact gcggagagtg 240
gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc tctgagatct 300
gctgctggtg cagctgccct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgccag cagcgaggcc 360
agaaatagcg cctttggctt ccaaggcaga ctgctgcacc tgtctgctgg acagagactg 420
ggagtgcacc tccacacaga agccagagca agacacgcct ggcagctgac acaaggcgct 480
acagtgctgg gcctgttcag agtgacagga ggcatgtttg cccagctggt ggcccagaat 540
gtgctgctga ttgatggccc tctgagctgg tacagcgatc ctggacttgc tggcgttagc 600
ctgactggcg gcctgagcta caaagaggac accaaagaac tggtggtggc caaggccggc 660
gtgtactacg tgttctttca gctggaactg cggagagtgg tggccggcga aggatctgga 720
tctgtgtctc tggcactgca tctgcagcct ctgagatctg ctgctggtgc agctgccctg 780
gctctgacag ttgatctgcc tcctgccagc agcgaggcca gaaatagcgc ctttggcttc 840
caaggcagac tgctgcacct gtctgctgga cagagactgg gagtgcacct ccacacagaa 900
gccagagcaa gacacgcctg gcagctgaca caaggcgcta cagtgctggg cctgttcaga 960
gtgaca 966
<210> 13
<211> 169
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RACE-modified III_Heavy chain I (hinge + downstream, 4-1BBL
monomer, V234R)
<400> 13
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp
20 25 30
Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
35 40 45
Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
50 55 60
Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val
65 70 75 80
Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
85 90 95
Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
100 105 110
Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln
115 120 125
Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Trp Leu Gly Val His Leu
130 135 140
His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Arg Gln Leu Thr Gln Gly Ala
145 150 155 160
Thr Arg Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
165
<210> 14
<211> 322
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RACE-modified III_Heavy chain II (hinge + downstream, 4-1BBL
dimer, R202V, G1 linker)
<400> 14
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp
20 25 30
Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
35 40 45
Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
50 55 60
Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val
65 70 75 80
Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
85 90 95
Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
100 105 110
Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln
115 120 125
Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu
130 135 140
His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala
145 150 155 160
Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu
165 170 175
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
180 185 190
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
195 200 205
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
210 215 220
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
225 230 235 240
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
245 250 255
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
260 265 270
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
275 280 285
Ala Gly Gln Val Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
290 295 300
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
305 310 315 320
Val Thr
<210> 15
<211> 507
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RACE-modified III_Heavy chain I (hinge + downstream, 4-1BBL
monomer, V234R)
<400> 15
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg aggcatgttt 60
gcccagctgg tggcccagaa tgtgctgctg attgatggcc ctctgagctg gtacagcgat 120
cctggacttg ctggcgttag cctgactggc ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa 180
ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 240
gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc tctgagatct 300
gctgctggtg cagctgccct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgccag cagcgaggcc 360
agaaatagcg cctttggctt ccaaggcaga ctgctgcacc tgtctgctgg acagagactg 420
ggagtgcacc tccacacaga agccagagca agacacgcct ggcagctgac acaaggcgct 480
acaagactgg gcctgttcag agtgaca 507
<210> 16
<211> 966
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RACE-modified III_Heavy chain II (hinge + downstream, 4-1BBL
dimer, R202V, G1 linker)
<400> 16
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg aggcatgttt 60
gcccagctgg tggcccagaa tgtgctgctg attgatggcc ctctgagctg gtacagcgat 120
cctggacttg ctggcgttag cctgactggc ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa 180
ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 240
gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc tctgagatct 300
gctgctggtg cagctgccct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgccag cagcgaggcc 360
agaaatagcg cctttggctt ccaaggcaga ctgctgcacc tgtctgctgg acagagactg 420
ggagtgcacc tccacacaga agccagagca agacacgcct ggcagctgac acaaggcgct 480
acagtgctgg gcctgttcag agtgacagga ggcatgtttg cccagctggt ggcccagaat 540
gtgctgctga ttgatggccc tctgagctgg tacagcgatc ctggacttgc tggcgttagc 600
ctgactggcg gcctgagcta caaagaggac accaaagaac tggtggtggc caaggccggc 660
gtgtactacg tgttctttca gctggaactg cggagagtgg tggccggcga aggatctgga 720
tctgtgtctc tggcactgca tctgcagcct ctgagatctg ctgctggtgc agctgccctg 780
gctctgacag ttgatctgcc tcctgccagc agcgaggcca gaaatagcgc ctttggcttc 840
caaggcagac tgctgcacct gtctgctgga caggtgctgg gagtgcacct ccacacagaa 900
gccagagcaa gacacgcctg gcagctgaca caaggcgcta cagtgctggg cctgttcaga 960
gtgaca 966
<210> 17
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-1BBL
<400> 17
Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly
1 5 10 15
Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr
20 25 30
Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys
35 40 45
Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val
50 55 60
Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro
65 70 75 80
Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu
85 90 95
Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly
100 105 110
Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His
115 120 125
Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr
130 135 140
Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
145 150
Claims (34)
- 항원 결합 도메인; 및
제 1 사이토카인(cytokine) 단량체 및 제 2 사이토카인 단량체를 포함하는 이량체(dimer)와 제 3 사이토카인 단량체(monomer)가 결합된 사이토카인 삼량체 도메인(domain)을 포함하고,
상기 사이토카인은 종양괴사인자 슈퍼패밀리(Tumor necrosis factor superfamily, TNFSF)이며,
상기 제 1 사이토카인 단량체 또는 제 2 사이토카인 단량체의 1개 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기와 제 3 사이토카인 단량체의 1개 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기가 노브-인투-홀(knob-into-hole) 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 이량체는 상기 제 1 사이토카인 단량체 및 제 2 사이토카인 단량체가 링커로 연결된 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 제 3항에 있어서,
상기 제 1 사이토카인 단량체의 N 또는 C 말단이 제 2 사이토카인 단량체의 N 또는 C 말단과 상호 링커로 연결된 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 제 1 사이토카인 단량체 및 제 2 사이토카인 단량체를 포함하는 이량체에 홀 구조가 형성되고, 제 3 사이토카인 단량체에 노브 구조가 형성되는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 노브-인투-홀(knob-into-hole) 구조는 사이토카인과 수용체의 결합 영역 외의 영역에 형성되는 것인, 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 1개 이상의 아미노산 잔기는 단백질 계면(surface)에 위치하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 제 1 사이토카인 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기와 제 3 사이토카인 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기는 6Å 이하의 거리에 위치하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 제 1항에 있어서,
상기 제 2 사이토카인 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기와 제 3 사이토카인 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기는 6Å 이하의 거리에 위치하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 종양괴사인자 슈퍼패밀리는 TNFα, Dif, Necrosin, TNFβ, TNFSF1B, TNFγ, CD252, Gp34, CD134L, CD154, TRAP, Gp39, T-BAM, CD178, APTL, CD95L, CD70, CD153, 및 4-1 BBL으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 종양괴사인자 슈퍼패밀리는 4-1BBL인 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 제 1항에 있어서,
상기 항원 결합 도메인은 항체 또는 항체의 단편인 것인, 융합 단백질.
- 제 14항에 있어서,
상기 항체의 단편은 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제 14항에 있어서,
상기 항체의 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, di-scFv, 및 VHH(variable heavy chain domains of heavy chain antibody)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인, 융합 단백질.
- 제 14항에 있어서,
상기 항체의 단편은 N 말단 또는 C 말단이 사이토카인 삼량체와 연결된 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 제 14항에 있어서,
상기 항체의 단편은 하기 구조를 갖는 F(ab')2인 것을 특징으로 하는, 융합 단백질:
상기 F(ab')2의 제1 힌지(Hinge)는 제 1 단량체 또는 제 2 단량체에 연결되며;
상기 F(ab')2의 제2 힌지는 제 3 단량체에 연결된 구조.
- 제 1항에 있어서,
상기 사이토카인은 자연적 상태에서 수용체에 삼량체로 결합하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 제 13항에 있어서,
상기 아미노산 잔기는 F92, F238, Q94, F144, V234, Q146, E148, F199, Y142, L203, R202, Q200 및 A180으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 제 20항에 있어서,
상기 아미노산 잔기는 F92W, F238V, Q94S, Q94Y, F144I, V234H, V234F, V234R, Q146S, E148G, F199L, Y142T, L203A, R202V, R202W, R202F, F199W 및 A180E로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 제 21항에 있어서,
상기 아미노산 잔기는 A180E 및 E148G으로 이루어진 쌍, V234R 및 R202V로 이루어진 쌍, R202W 및 Q94S쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 쌍으로 노브-인투-홀 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 제13항에 있어서,
상기 4-1BBL는 서열번호 17로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 제13항에 있어서,
상기 4-1BBL는 하기 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질:
제 1의 4-1BBL 단량체와 제 2의 4-1BBL 단량체가 링커로 연결되어 있으며;
제 1의 4-1BBL 단량체 또는 제 2의 4-1BBL 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기와 제 3의 4-1BBL 단량체의 1개 이상의 아미노산 잔기가 노브-인투-홀(knob-into-hole) 구조를 형성함.
- 제1항, 제3항, 제4항, 제6항 내지 제10항, 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항, 제3항, 제4항, 제6항 내지 제10항, 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
- 제1항, 제3항, 제4항, 제6항 내지 제10항, 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 감염시키는 단계를 포함하는, 융합 단백질의 생산 방법.
- Fab의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 링커로 연결된 제 1 단량체 및 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하도록 연결된 제 1벡터;
Fab의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 제 3 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하도록 연결된 제 2 벡터; 및
Fab의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제 3벡터;를 포함하는 제 1항의 융합 단백질 생산용 벡터 조성물.
- 제 28항에 따른 벡터 조성물을 숙주 세포에 감염시키는 단계를 포함하는 제 1항의 융합 단백질의 생산 방법.
- 종양괴사인자 슈퍼패밀리(Tumor necrosis factor superfamily, TNFSF)의 제 1 및 제 2 단량체를 포함하는 이량체; 및 종양괴사인자 슈퍼패밀리(Tumor necrosis factor superfamily, TNFSF)의 제 3 단량체; 를 포함하는 삼량체를 형성하는 종양괴사인자 슈퍼패밀리에 있어서,
1) 상기 이량체 및 제 3 단량체 사이에 존재하는 2개의 계면 중 1 계면을 선택하는 단계;
2) 상기 선택된 1 계면에 위치한 제 1 또는 제 2 단량체와 제 3 단량체 사이에 6Å이하의 거리에 위치한 아미노산 쌍을 제 1 또는 제 2 단량체; 및 제 3 단량체에서 하나씩 선택하는 단계;
3) 상기 선택된 아미노산 쌍에서 제 3 단량체 부위에 돌연변이를 유도하여 노브를 형성하는 단계;
4) 상기 제 3 단량체의 노브와 짝이 되며, 구조적인 충돌을 일으키는 자연형(Wild type, WT)의 제 1 또는 제 2 단량체의 아미노산 잔기를 선별하는 단계; 및
5) 상기 선별된 제 1 또는 제 2 단량체의 아미노산 잔기에 돌연변이를 유도하여 홀을 형성하는 단계; 및
6) 상기 제 3 단량체의 노브와 제 1 또는 제 2 단량체의 홀의 노브-인투-홀 상호작용을 유도하는 단계;를 포함하고,
상기 이량체 및 제 3 단량체에는 Fab의 중쇄가 연결되어 있는 것인,
항체 및 종양괴사인자 슈퍼패밀리 삼량체 융합 단백질 생산방법.
- 제 30항에 있어서,
상기 1) 단계의 선택된 계면에서는 노브-인투-홀 결합이 이루어지며, 나머지 선택되지 않은 계면의 단량체 사이에는 구조적 방해(steric hinderance) 가 유도되는 것인, 생산방법.
- 제 30항의 생산방법에 의해 생산된 항체 및 종양괴사인자 슈퍼패밀리 삼량체 융합 단백질.
- 제13항에 따른 융합 단백질을 포함하는, 암, 면역질환, 자가면역질환, 중추신경질환, 퇴행성신경질환, 자가면역질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 면역세포의 기능 비활성화에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP22856867.1A EP4255924A4 (en) | 2022-02-21 | 2022-06-22 | FUSION PROTEIN WITH AN ANTIGEN BINDING DOMAIN AND A CYTOKINE TRIMER |
| JP2023515077A JP2024515912A (ja) | 2022-02-21 | 2022-06-22 | 抗原結合ドメインおよびサイトカイン三量体ドメインを含む融合タンパク質 |
| CN202280005585.9A CN117295758A (zh) | 2022-02-21 | 2022-06-22 | 包含抗原结合结构域及细胞因子三聚体结构域的融合蛋白 |
| US18/041,845 US12122813B2 (en) | 2022-02-21 | 2022-06-22 | Fusion protein comprising an antigen binding domain and a cytokine trimer domain |
| PCT/KR2022/008883 WO2023158027A1 (en) | 2022-02-21 | 2022-06-22 | A fusion protein comprising an antigen binding domain and a cytokine trimer domain |
| AU2022316521A AU2022316521B2 (en) | 2022-02-21 | 2022-06-22 | A fusion protein comprising an antigen binding domain and a cytokine trimer domain |
| CA3189227A CA3189227A1 (en) | 2022-02-21 | 2022-06-22 | A fusion protein comprising an antigen binding domain and a cytokine trimer domain |
| TW112104310A TW202342551A (zh) | 2022-02-21 | 2023-02-07 | 包含抗原結合結構域及細胞因數三聚體結構域的融合蛋白 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20220022526 | 2022-02-21 | ||
| KR1020220022526 | 2022-02-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230125696A KR20230125696A (ko) | 2023-08-29 |
| KR102617443B1 true KR102617443B1 (ko) | 2023-12-27 |
Family
ID=87802418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220046740A KR102617443B1 (ko) | 2022-02-21 | 2022-04-15 | 항원 결합 도메인 및 사이토카인 삼량체 도메인을 포함하는 융합 단백질 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102617443B1 (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019086499A1 (en) | 2017-11-01 | 2019-05-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Novel tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules |
| US20200291089A1 (en) * | 2017-02-16 | 2020-09-17 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof |
-
2022
- 2022-04-15 KR KR1020220046740A patent/KR102617443B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20200291089A1 (en) * | 2017-02-16 | 2020-09-17 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof |
| WO2019086499A1 (en) | 2017-11-01 | 2019-05-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Novel tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230125696A (ko) | 2023-08-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102562519B1 (ko) | IL-15/IL-15Rα FC-융합 단백질 및 PD-1 항체 단편을 포함하는 이중특이성 이종이량체 융합 단백질 | |
| KR20210091710A (ko) | PD-1 표적화 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질 및 병용요법에서의 이의 용도 | |
| KR20210069641A (ko) | IL-12 이종이량체 Fc-융합 단백질 | |
| KR20160077036A (ko) | 불변 쇄 변형된 이특이적, 5가 및 6가 ig-m 항체 | |
| CN111269315B (zh) | 针对bcma的单克隆抗体 | |
| TW201444872A (zh) | 抗Ｃ－ＭＥＴ串聯Ｆｃ雙特異性抗體 | |
| CN115916233A (zh) | 靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白 | |
| EP3833391A1 (en) | SIRP1alpha TARGETED CHIMERIC PROTEINS AND USES THEREOF | |
| JP2021520829A (ja) | ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ Ｆｃ融合タンパク質およびＴＩＭ−３抗原結合ドメインを含む、ＴＩＭ−３標的化ヘテロ二量体融合タンパク質 | |
| CN115916827A (zh) | 免疫活化Fc结构域结合分子 | |
| JP2022552183A (ja) | 特性が改善されたｐｄ－１標的化ｉｌ－１５／ｉｌ－１５ｒαｆｃ融合タンパク質 | |
| KR20230108288A (ko) | 항tspan8-항cd3 이중 특이성 항체 및 항tspan8 항체 | |
| KR20230141817A (ko) | 이중특이 항체 | |
| KR20230171465A (ko) | 항cldn4-항cd137 이중특이성 항체 | |
| US20230235090A1 (en) | Bispecific antibody and use thereof | |
| WO2020097350A1 (en) | Modulation of dendritic cell lineages | |
| CN112930195B (zh) | 抗人Fn14抗体 | |
| WO2023045977A1 (zh) | 白介素2突变体以及其融合蛋白 | |
| KR102617443B1 (ko) | 항원 결합 도메인 및 사이토카인 삼량체 도메인을 포함하는 융합 단백질 | |
| US12122813B2 (en) | Fusion protein comprising an antigen binding domain and a cytokine trimer domain | |
| US20230272026A1 (en) | A fusion protein comprising an antigen binding domain and a cytokine trimer domain | |
| TW202342551A (zh) | 包含抗原結合結構域及細胞因數三聚體結構域的融合蛋白 | |
| CN117295758A (zh) | 包含抗原结合结构域及细胞因子三聚体结构域的融合蛋白 | |
| CN112961245B (zh) | 一种靶向cd96的双特异性抗体及其制备方法和用途 | |
| KR20230029671A (ko) | 항-인간 nr1 항체 유도체 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |