CN117295758A

CN117295758A - 包含抗原结合结构域及细胞因子三聚体结构域的融合蛋白

Info

Publication number: CN117295758A
Application number: CN202280005585.9A
Authority: CN
Inventors: 孙卡雨; 朴柾炫; 李大熙; 长世逸; 李庭旼; 尹智慧; 郑钟宽
Original assignee: Ctcells
Current assignee: Ctcells
Priority date: 2022-02-21
Filing date: 2022-06-22
Publication date: 2023-12-26

Abstract

本发明涉及由接头连接的第一单体以及第二单体(dimer)与第三单体(monomer)通过杵臼结合的细胞因子三聚体结构域以及由上述细胞因子三聚体结构域替代抗体的恒定区(Fc)来制备的抗体与细胞因子三聚体结构域结合的新形式的融合蛋白RACE(受体‑抗体共轭(细胞)衔接物(Receptor‑Antibody Conjugated(cell)Engager))，确认到本发明的RACE不仅对目标受体表现出比母抗体更为优秀的结合能力，还对抗原及目标受体表现出优秀的同时结合能力，因此可以有用地将其用作双特异性药物组合物。

Description

包含抗原结合结构域及细胞因子三聚体结构域的融合蛋白

技术领域

本发明涉及包含抗原结合结构域及细胞因子三聚体结构域的融合蛋白、其生产方法以及其用途。

背景技术

利用抗CD19抗体(Anti-CD19 antibody)与抗CD3抗体(Anti-CD3antibody)设计的CD19/CD3连接子博纳吐单抗(blincyto，Amgen公司)的许可加速了通过免疫细胞的归巢(homing)来治疗肿瘤的双特异性免疫抗癌剂的开发。

抗CD3抗体为主要以存在于T细胞表面的CD3ε(CD3 epsilon，CD3e)分子为目标的分子，诱导T细胞的激活，通过双特异性抗体以表达结合的目标抗原为目标来诱导细胞凋亡。以这样的CD3为目标的抗体在短时间内急速促进T细胞的活性来促进靶细胞的凋亡，在这样的过程中，有时还诱导细胞因子的急剧分泌。这被视作是常驻在T细胞表面来诱导细胞的第一活性的CD3分子所具有的本质特性引起的。

包括T细胞在内的免疫细胞的活性通过共刺激因子与抑制因子之间的均衡来调节。帮助免疫细胞活性的共刺激因子大体分为两个种类的家族蛋白质，即，包括CD28、诱导型共刺激分子(ICOS，Inducible Costimulatory Molecule)等在内的B7受体家族(B7receptor family)蛋白质与包括4-1BB、OX40等在内的TNF受体蛋白。尤其这些共刺激因子蛋白质已知为在激活的T细胞中表达的诱导性分子，认为这可以缓解CD3抗体所具有的毒性方面的问题。

4-1BB配体(CD137L)抑制在抗原递呈细胞中表达并向4-1BB受体传递信号。4-1BB配体以包含于细胞膜中的膜蛋白的形态以及膜结合位点顶部分被切割下来的水溶性的形态这两种形态存在，水溶性4-1BB配体对4-1BB受体的信号传递不起作用，膜蛋白形态的4-1BB配体强力诱导表达4-1BB受体的T细胞或自然杀伤(NK)细胞的激活。据报告，通过上述机制，4-1BB信号的促进可以抑制肿瘤的生长。据此，以肿瘤治疗为目的，能够功能性地激活4-1BB的多种抗体分子被开发出来。

有趣的是，在抑制4-1BB配体与4-1BB受体的结合并帮助4-1BB受体的凝集的激活型抗体(例如乌托鲁单抗(Utomilumab)，Pfizer公司)的情况下，虽然其单独不具有充分的活性，但在与Fc-受体结合的情况下，观察到具有部分活性。与之相反，在4-1BB配体与4-1BB受体结合的状态下通过追加结合来帮助4-1BB受体与配体复合物的凝集的激活型抗体(例如乌瑞芦单抗(Urelumab)，BMS-663513，BMS公司)即使没有Fc-受体的帮助也具有充分的活性，但观察到在体内显出因Fc-受体引起的强毒性。实际上，乌瑞芦单抗就是因这样的强毒性而中断临床试验的(NCT00612664)。

此外，也有过通过使用4-1BB配体本身来设计具有肿瘤移植功效的分子的尝试，但在以最小的变化保持配体的内在结构且能够特异性地对肿瘤起作用的二价(bivalent)分子的设计中尚未取得有意义的成果。

发明内容

技术问题

本发明人在研究有关保持配体的内在结构且能够特异性地对肿瘤起作用的分子设计的过程中，开发出细胞因子(Cytokine)三聚体结构域，尤其导出用来制备包含以杵臼(knob-into-hole)结构与抗原结合结构域连接的细胞因子三聚体结构域的融合蛋白的方法，确认到通过该方法制备的融合蛋白对各目标的结合能力，从而完成本发明。

因此，本发明的目的在于，提供融合蛋白。

并且，本发明的再一目的在于，提供编码融合蛋白的多核苷酸。

并且，本发明的还有一目的在于，提供包含编码融合蛋白的多核苷酸的载体。

并且，本发明的另一目的在于，提供融合蛋白的生产方法。

并且，本发明的又一目的在于，提供抗体与肿瘤坏死因子超家族三聚体的融合蛋白的生产方法。

并且，本发明的又一目的在于，提供用于预防或治疗因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病的药物组合物。

并且，本发明的又一目的在于，提供治疗因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病的方法。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供一种融合蛋白，包含：抗原结合结构域；以及细胞因子三聚体结构域(domain)。

为了实现上述再一目的，本发明提供编码本发明的融合蛋白的多核苷酸。

为了实现上述另一目的，本发明提供包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸的载体。

同时，本发明提供用于生产融合蛋白的载体组合物，包含：第一载体，编码Fab的重链的多核苷酸与编码通过接头连接的第一单体和第二单体的多核苷酸可操作地连接；第二载体，编码Fab的重链的多核苷酸与编码第三单体的多核苷酸可操作地连接；以及第三载体，包含编码Fab的轻链的多核苷酸。

为了实现上述另一目的，本发明提供融合蛋白的生产方法，包括向宿主细胞转染包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸的载体的步骤。

同时，本发明还提供融合蛋白的生产方法，包括向宿主细胞转染包含用于生产上述融合蛋白的载体组合物的步骤，上述载体组合物包含：第一载体，编码Fab的重链的多核苷酸与编码通过接头连接的第一单体和第二单体的多核苷酸可操作地连接；第二载体，编码Fab的重链的多核苷酸与编码第三单体的多核苷酸可操作地连接；以及第三载体，包含编码Fab的轻链的多核苷酸。

为了实现上述又一目的，本发明提供抗体与肿瘤坏死因子超家族三聚体的融合蛋白的生产方法，上述肿瘤坏死因子超家族形成包含二聚体及肿瘤坏死因子超家族的第三单体的三聚体，上述二聚体包含肿瘤坏死因子超家族(Tumor necrosis factorsuperfamily，TNFSF)的第一单体及第二单体，上述生产方法包括：步骤1)，在存在于上述二聚体与第三单体之间的两个表面中选择一个表面；步骤2)，在第一单体或第二单体以及第三单体中各选择一个在上述所选择的一个表面中的第一单体或第二单体与第三单体之间位于以下的距离处的氨基酸对；步骤3)，在上述选择的氨基酸对中的第三单体位点诱导突变来形成杵；步骤4)，筛选与上述第三单体的杵配对并引起结构碰撞的野生型(Wildtype，WT)的第一单体或第二单体的氨基酸残基；步骤5)，在上述筛选的第一单体或第二单体的氨基酸残基中诱导突变来形成臼；以及步骤6)，诱导上述第三单体的杵与第一单体或第二单体的臼的杵臼相互作用。在上述二聚体及第三单体中连接有Fab的重链。

为了实现上述又一目的，本发明提供包含本发明的融合蛋白的用于预防或治疗因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病的药物组合物。

为了实现上述又一目的，本发明提供治疗因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病的方法，包括向对象施用本发明的融合蛋白的步骤。

发明的效果

本发明涉及包含由接头连接的第一单体与第二单体(dimer)以及第三单体(monomer)的细胞因子三聚体结构域，优选地，涉及通过使用上述三具体结构替换通过杵臼结合由接头连接的第一单体以及第二单体与第三单体(monomer)的细胞因子三聚体结构域及抗体的恒定区(Fc)来制备的抗体与细胞因子三聚体结构域结合的新形式的融合蛋白RACE(受体-抗体共轭(细胞)衔接物(Receptor-Antibody Conjugated(cell)Engager))，本发明的RACE的制备方法提高三聚体的纯度和生产性，确认到通过该方法制备的RACE不仅对目标受体表现出比母抗体更为优秀的结合能力，还对抗原及目标受体表现出优秀的同时结合能力，因此可以有用地将其用作双特异性药物组合物。

附图说明

图1为示出本发明的融合蛋白所包含单位蛋白(Unit proteins)(A部分)以及包含上述单位蛋白的融合蛋白(B部分)的图。

图2为用于说明本发明的细胞因子三聚体结构域的杵臼结构的图。

图3为示出本发明的细胞因子三聚体结构域的二聚体与单体之间的相互作用位点和其距离(A部分)、各个相互作用(B部分)的结果。

图4为比较本发明的细胞因子三聚体结构域中只在一个方向生成杵的情况或者同时生成杵与臼的情况的图。

图5为确认三种包含各不相同的抗体结构域及细胞因子三聚体结构域的融合蛋白的纯度的结果。

图6为在本发明的包含抗体结构域及细胞因子三聚体结构域的融合蛋白中确认杵臼结构形成与否(A部分)、生产量(B部分)及纯度(C部分)的结果。

图7为通过确认本发明的细胞因子三聚体结构域的结构来确认二聚体与单体形成杵臼结构的结果。

图8为示出本发明的细胞因子三聚体结构域的结构及连接二聚体的接头的图。

图9为在本发明的细胞因子三聚体结构域中，在未形成杵臼结构的情况下，确认具有蛋白质铰链错配(mismatch)的二硫键蛋白质(A部分)以及确认错配的铰链类型和发生率(B部分)的结果。

图10为示出本发明的包含抗体结构域及细胞因子三聚体结构域的融合蛋白的结构及大小的结果。

图11为确认本发明的包含抗体结构域及细胞因子三聚体的融合蛋白的热力学稳定性的结果。

图12为确认本发明的包含抗体结构域及细胞因子三聚体的融合蛋白对抗原的结合亲和度的结果。

图13为确认本发明的包含抗体结构域及细胞因子三聚体的融合蛋白对目标受体的结合亲和度的结果。

图14为确认本发明的包含抗体结构域及细胞因子三聚体的融合蛋白对抗原及目标受体的同时结合能力的结果。

图15为评估本发明的包含抗体结构域及细胞因子三聚体的融合蛋白的4-1BB信号传递程度的结果。

图16为在实体癌细胞株中评估本发明的包含抗体结构域及细胞因子三聚体的融合蛋白的上靶(on-target)信号传递和脱靶(off-target)信号传递程度的结果，其中A部分表示RACE-02C的结果，B部分表示RACE-02B(B)的结果。

图17为包含编码本发明的包含抗体结构域及细胞因子三聚体的融合蛋白的多核苷酸的载体的示意图。

图18为在诱发癌症的动物模型中确认本发明的包含抗体结构域及细胞因子三聚体的融合蛋白的治疗效果的结果。

具体实施方式

以下，详细说明本发明。

本发明提供一种融合蛋白，包含：抗原结合结构域；以及细胞因子三聚体结构域。

上述细胞因子三聚体结构域的特征在于，由包含第一单体及第二单体的二聚体与第三单体结合而成，上述二聚体的特征在于，通过接头连接第一单体与第二单体。在上述二聚体中，第一单体的N或C末端分别通过接头与第二单体的N或C末端相互连接。

上述接头只要是本发明所属技术领域中公知的接头中能够连接细胞因子的第一单体与第二单体的接头就可以不受限制地使用。在本发明的一实施例中，G₁-G₄S之间通过短的肽接头来连接。上述G₁包含序列G，上述G₄S包含序列GGGGS(序列34)。

尤其，在本发明的细胞因子三聚体结构域中，虽然上述细胞因子可以自然地形成三聚体，但在利用自然状态的三聚体结构来制备其与抗体结合的融合蛋白的情况下，在与各个三聚体连接的抗体的Fab 3部分的铰链部分发生错配二硫键，从而具有降低纯度和生产性的问题。因此，为了以更高的纯度提高生产性，优选地，使构成二聚体的第一单体或第二单体的一个以上氨基酸残基与第三单体的一个以上氨基酸残基形成杵臼结构。优选地，在细胞因子与受体的结合区域以外的区域形成上述杵臼结构。

同时，上述一个以上氨基酸残基的特征在于，位于蛋白质表面(surface)。尤其，上述第一单体与第二单体通过接头以串联(tandem)的方式连接，根据在第三单体中生成的杵的表面位置，臼可以在第一单体中生成，也可以在第二单体中生成。

通过上述杵臼结构，形成臼的构成二聚体的第一单体或第二单体中的一个与形成杵的第三单体可以诱导选择性的相互作用，而在未形成臼的剩下的第一单体或第二单体与第三单体的表面可以诱导位阻效应(steric hinderance)，通过此来诱导与所希望的表面的相互作用，从而可以防止利用自然状态的三聚体时诱发的错配。即，例如在本发明中，可以在形成第一单体的臼与第三单体的杵的表面上诱导相互作用，在第二单体与第三单体之间诱导位阻效应；或者可以在形成第二单体的臼与第三单体的杵的表面上诱导相互作用，在第一单体与第三单体之间诱导位阻效应。

另一方面，在蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction)中，重要的三种相互作用(a)氢键b)疏水性相互作用c)电荷相互作用/>)通常都在/>以内的距离上发生。

因此，在本发明的第一单体、第二单体或第三单体的氨基酸残基中，上述第一单体的一个以上氨基酸残基与第三单体的氨基酸残基可以位于以下的距离处，上述第二单体的一个以上氨基酸残基与第三单体的一个以上氨基酸残基可以位于/>以下的距离处。优选地，上述第一单体的一个以上氨基酸残基与第三单体的氨基酸残基可以位于/>以下的距离处，上述第二单体的一个以上氨基酸残基与第三单体的一个以上氨基酸残基可以位于/>以下的距离处。更优选地，上述第一单体的一个以上氨基酸残基与第三单体的氨基酸残基可以位于/>至/>的距离处，上述第二单体的一个以上氨基酸残基与第三单体的一个以上氨基酸残基可以位于/>至/>的距离处。

因此，可以在二聚体与单体之间的以下的距离处选择氨基酸残基，优选地，可以在二聚体与单体之间的/>以下的距离处选择氨基酸残基，更优选地，可以在二聚体与单体之间的/>至/>的距离处选择氨基酸残基，例如，在由4-1BBL单体与二聚体形成的情况下，细胞因子可以为选自由F92、F238、Q94、F144、V234、Q146、E148、F199、Y142、L203、R202、Q200及A180组成的组中的一种以上。

上述氨基酸的变异位点基于NCBI的TNFSF9(TNF超家族成员9(TNF superfamilymember 9))的氨基酸序列来决定(检索号(accession number)：NM_003811.3)。

更优选地，可以通过引起各单体的氨基酸变异来形成杵臼结构。因此，上述氨基酸残基可以为选自由F92W、F238V、Q94S、Q94Y、F144I、V234H、V234F、V234R、Q146S、E148G、F199L、Y142T、L203A、R202V、R202W、R202F、F199W及A180E组成的组中的一种以上。

更优选地，上述氨基酸残基可以通过两个氨基酸残基组成对来形成杵臼。更加优选地，上述氨基酸残基的特征在于，通过R202W与Q94S组成对来形成杵臼结构。

在细胞因子中，例如在4-1BBL中，可以制备二聚体(通过接头连接第一单体与第二单体)的E148G(形成臼(Hole))与单体(第三单体)的A180E(形成杵(Knob))形成杵臼的三聚体。并且，可以制备二聚体(通过接头连接第一单体与第二单体)的R202V(形成臼)与单体(第三单体)的V234R(形成杵)形成杵臼的三聚体。同时，可以制备二聚体(通过接头连接第一单体与第二单体)的Q94S(形成臼)与单体(第三单体)的R202W(形成杵)形成杵臼的三聚体。

根据本发明的一实施例，在细胞因子中，例如在4-1BBL中，制备了二聚体(通过接头连接第一单体与第二单体)的Q94S(形成臼)与单体(第三单体)的R202W(形成杵)形成杵臼的三聚体。

同时，如图2所示，在形成如上所述的杵臼结构的二聚体与单体之间形成两个表面(Interface A、Interface B(杵臼(KiH))。因此，本发明在Interface B(采用杵臼(KiH)的对侧表面)可以保持自然形态的表面，从而以最小化的变化来实现选择性的三聚体化。因此，本发明的三聚体的特征在于，保持三个单体平行的三聚体(parallel trimer)结构。

在本发明的融合蛋白中，上述抗原结合结构域为抗体或抗体片段。

在本发明的融合蛋白中，上述抗体或抗体片段只要是能够与目标的抗原结合的抗体或其片段，就可以不受限制地使用。在本发明的一实施例中，制备包含选自由利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)及阿维鲁单抗(avelumab)组成的组中的一种抗体及细胞因子三聚体结构域的融合蛋白。

上述抗体片段可以包含轻链可变区及重链可变区，优选地，可以为选自由Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、di-scFv及VHH(重链抗体的重链可变区(variable heavy chaindomains of heavy chain antibody))组成的组中的一种以上。

尤其，上述抗体片段通过N末端或C末端与细胞因子三聚体连接来形成融合蛋白。更优选地，上述抗体片段可以为具有下述结构的F(ab')2：上述F(ab')2的第一铰链(Hinge)与通过接头连接的第一单体或第二单体连接；上述F(ab')2的第二铰链与第三单体连接。

在本发明的融合蛋白中，上述细胞因子的特征在于，在自然状态下通过三聚体与受体结合。

因此，优选地，上述细胞因子可以为能够在自然状态下形成三聚体的肿瘤坏死因子超家族，优选地，可以为选自由TNFα、Dif、Necrosin、TNFβ、TNFSF1B、TNFγ、CD252、Gp34、CD134L、CD154、TRAP、Gp39、T-BAM、CD178、APTL、CD95L、CD70、CD153及4-1BBL组成的组中的一种以上，更优选地，可以为4-1BBL。

根据本发明的一实施例，在本发明的融合蛋白中，使用上述4-1BB的全部序列(检索号：NM_003811.3)中向细胞外部露出的球形蛋白质结构域(G90-T241)，上述4-1BBL的特征在于，包含由序列17表示的核苷酸序列。

GMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVT(序列17)。

更优选地，上述融合蛋白中所包含的三聚体4-1BBL可以具有下述结构：第一4-1BBL单体与第二4-1BBL单体通过接头连接；第一4-1BBL单体或第二4-1BBL单体的一个以上氨基酸残基与第三4-1BBL单体的一个以上氨基酸残基形成杵臼结构。

通过本发明一实施例制备的基于4-1BBL的融合蛋白的结构如图1所示。本发明的融合蛋白由图1的A部分所示的单位蛋白构成，具有图1的B部分所示的结构。更具体地，由如下三种构成：1)包含4-1BB配体二聚体的抗体重链；2)包含4-1BB配体单体的抗体重链；以及3)抗体的轻链。在图1的B部分中，上端部的抗原结合片段通过铰链与下端部的4-1BB配体三聚体连接。复合体的形成通过存在于铰链中的两个二硫键和存在于4-1BB配体三聚体之间的疏水性相互作用来实现。尤其，配体三聚体之间的疏水性相互作用通过杵臼模块在4-1BB配体二聚体与4-1BB配体单体之间选择性地形成，通过此可以大幅提高蛋白质的物性和纯度。4-1BBL单体已知具有包含杵的结构，这是防止单体所包含的重链的同种三聚体化所必需的。4-1BB配体二聚体通过存在与两个单体之间的短的氨基酸接头来连接，在相应的单体的与“杵”发生相互作用的位点具有“臼”。

在基于上述内容的本发明的细胞因子三聚体结构域的具体例中，可以包含单体及二聚体，上述单体包含由序列1表示的氨基酸序列，上述二聚体包含由序列2表示的氨基酸序列。在上述二聚体中，两个单体可以在第170位氨基酸序列(G)中通过接头连接。或者，可以包含单体及二聚体，上述单体包含由序列3表示的核苷酸序列，上述二聚体包含由序列4表示的核苷酸序列。在上述二聚体中，两个单体可以在第508位-第510位核苷酸序列的GGA中通过接头连接。

在本发明的细胞因子三聚体结构域的再一具体例中，可以包含单体和二聚体，上述单体包含由序列5表示的氨基酸序列(在第202位氨基酸序列中，由R变异为W)，上述二聚体包含由序列6表示的氨基酸序列(在第94位氨基酸序列中，由Q变异为S)。在上述二聚体中，两个单体可以在第170位氨基酸序列(G)中通过接头连接。同时，上述单体与二聚体可以在上述氨基酸变异的位置形成杵臼结构。或者，可以包含单体和二聚体，上述单体包含由序列7表示的核苷酸序列(在第202位氨基酸序列中，由AGA变异为TGG)，上述二聚体包含由序列8表示的核苷酸序列(在第94位氨基酸序列中，由CAG变异为AGC)。在上述二聚体中，两个单体可以在第508位-第510位核苷酸序列的GGA中通过接头连接。

在本发明的细胞因子三聚体结构域的还有一具体例中，可以包含单体和二聚体，上述单体包含由序列9表示的氨基酸序列(在第180位氨基酸序列中，由A变异为E)，上述二聚体包含由序列10表示的氨基酸序列(在第148位氨基酸序列中，由E变异为G)。在上述二聚体中，两个单体可以在第170位氨基酸序列(G)中通过接头连接。同时，上述单体与二聚体可以在上述氨基酸变异的位置形成杵臼结构。或者，可以包含单体和二聚体，上述单体包含由序列11表示的核苷酸序列(在第180位氨基酸序列中，由GCT变异为GAA)，上述二聚体包含由序列12表示的核苷酸序列(在第148位氨基酸序列中，由CAA变异为GGA)。在上述二聚体中，两个单体可以在第508位-第510位核苷酸序列的GGA中通过接头连接。

在本发明的细胞因子三聚体结构域的另一具体例中，可以包含单体和二聚体，上述单体包含由序列13表示的氨基酸序列(在第234位氨基酸序列中，由V变异为R)，上述二聚体包含由序列14表示的氨基酸序列(在第202位氨基酸序列中，由R变异为V)。在上述二聚体中，两个单体可以在第170位氨基酸序列(G)中通过接头连接。同时，上述单体与二聚体可以在上述氨基酸变异的位置形成杵臼结构。或者，可以包含单体和二聚体，上述单体包含由序列15表示的核苷酸序列(在第234位氨基酸序列中，由GTG变异为AGA)，上述二聚体包含由序列16表示的核苷酸序列(在第202位氨基酸序列中，由AGA变异为GTG)。在上述二聚体中，两个单体可以在第508位-第510位核苷酸序列的GGA中通过接头连接。

因此，在本发明的融合蛋白中，可以包含选自由包含含有由序列1表示的氨基酸序列的单体以及含有由序列2表示的氨基酸序列二聚体的细胞因子三聚体结构域、包含含有由序列5表示的氨基酸序列的单体及含有由序列6表示的氨基酸序列的二聚体的细胞因子三聚体结构域、包含含有由序列9表示的氨基酸序列的单体及含有由序列10表示的氨基酸序列的二聚体的细胞因子三聚体结构域以及包含含有由序列13表示的氨基酸序列的单体及含有由序列14表示的氨基酸序列的二聚体的细胞因子三聚体结构域组成的组中的一种细胞因子三聚体结构域。

本发明所属技术领域的普通技术人员应该明确的是，上述由序列1、序列2、序列5、序列6、序列9、序列10、序列13及序列14表示的氨基酸序列在包括发挥与之同等的生物学活性的氨基酸序列的变异方面是受限的。这样的氨基酸变异基于氨基酸侧链取代物相对相似性，例如，基于疏水性、亲水性、电荷、大小等来形成。通过对氨基酸侧链取代物的代销、形状及种类的分析可知：精氨酸、赖氨酸及组氨酸都是带阳电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸及丝氨酸具有相似的大小；苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸具有相似的形状。因此，基于这些考虑事项，可以在生物学上将精氨酸、赖氨酸及组氨酸；丙氨酸、甘氨酸及丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸看作功能等同物。

在导入变异方面，可以考虑氨基酸的疏水指数(hydropathic index)。根据疏水性和电荷赋予各氨基酸疏水指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。

在赋予蛋白质或肽的交互生物功能(interactive biological function)方面，氨基酸的疏水指数非常重要。使用具有相似疏水指数的氨基酸取代才能保有相似的生物活性，这是公知的事实。在参照疏水指数导入变异的情况下，优选地，在疏水指数差为±2以内的氨基酸之间取代，更优选地，在疏水指数差为±1以内的氨基酸之间取代，更加优选地，在疏水指数差为±0.5以内的氨基酸之间取代。

另一方面，众所周知的是，具有相似的亲水值(hydrophilicity value)的氨基酸之间的取代也引起具有同等生物活性的蛋白质或肽。赋予各氨基酸残基如下亲水值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

在参照亲水值导入变异的情况下，优选地，在亲水值差为±2以内的氨基酸之间取代，更优选地，在亲水值差为±1以内的氨基酸之间取代，更加优选地，在亲水值差为±0.5以内的氨基酸之间取代。

在整体上不变更分子活性的肽中的氨基酸交换是本发明所属技术领域中公知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最通常发生的交换是氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly间的交换。

若考虑上述具有生物学同等活性的变异，则本发明的由序列1、序列2、序列5、序列6、序列9、序列10、序列13及序列14表示的氨基酸序列应解释为包含与序列表中记载的序列实质相同(substantial identity)的序列。上述实质相同是指，将本发明的由序列1、序列2、序列5、序列6、序列9、序列10、序列13及序列14表示的氨基酸序列与任意其他序列对齐后，当利用本发明所属技术领域的通常使用的算法分析对齐的序列时，最少显出80％以上的同源性，更优先地，显出90％以上的同源性。用于序列比较的对其方法可以不受限制地使用本发明所属技术领域中公知的任意方法。

同时，由序列3、序列4、序列7、序列8、序列11、序列12、序列15及序列16表示的核苷酸序列可以包含与由上述序列3、序列4、序列7、序列8、序列11、序列12、序列15及序列16表示的核苷酸序列具有70％以上的序列同源性的核苷酸序列，更优选地，可以包含具有80％以上的序列同源性的核苷酸序列，更加优选地，可以包含具有90％以上的序列同源性的核苷酸序列，最优选地，可以包含具有95％以上的序列同源性的核苷酸序列。有关核苷酸序列的“序列同源性的％”通过比较两个以最佳方式排列的比较区域来确认，相对于两个序列的最佳排列的参考序列(不包含追加或删除)，比较区域中的核苷酸序列的一部分可以包含追加或删除(即，缺口)。

如前所述，在本发明的融合蛋白的细胞因子三聚体结构域中，杵臼结构的特征在于，通过分别在单体和二聚体中发生的氨基酸变异来生成。这是为了在自然状态下以三聚体存在的肿瘤坏死因子超家族的三聚体组装中，防止在发生连接抗体(Fab)的铰链部分的序列上的错误安装(misassembly)的同时生成错配的二硫化物(mismatched disulfide)。

并且，本发明提供编码本发明的融合蛋白的多核苷酸。

同时，本发明提供包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸的载体。

上述载体的示意图如图17所示。如图17所示，本发明的特征在于，在载体的基因位点包含轻链、重链二聚体和/或重链单体。

并且，本发明提供用于生产融合蛋白的载体组合物，包含：第一载体，编码Fab的重链的多核苷酸与编码通过接头连接的第一单体和第二单体的多核苷酸可操作地连接；第二载体，编码Fab的重链的多核苷酸与编码第三单体的多核苷酸可操作地连接；以及第三载体，包含编码Fab的轻链的多核苷酸。

在使用上述用于生产融合蛋白的载体组合物的情况下，可以在分别制备三聚体中的二聚体及Fab重链、三聚体中的单体及Fab重链后，诱导三聚体的形成。

在本发明中，上述“载体”是指为了能够在适当的宿主内表达目标基因而包含以可操作性的方式与适当的调节序列连接的基因的核苷酸序列的基因制备物，上述调节序列可以包含开始转录的启动子、用于调节该转录的算子序列以及调节转录及解读的终止的序列。本发明的载体只要是能够在细胞内复制的就不受特别限制，可以使用本发明所属技术领域中公知的任意载体，例如，可以为质粒、柯斯质粒、噬菌体颗粒、病毒载体。

同时，本发明提供融合蛋白的生产方法，包括向宿主细胞转染包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸的载体的步骤。

并且，本发明还提供融合蛋白的生产方法，包括向宿主细胞转染包含用于生产上述融合蛋白的载体组合物的步骤，上述载体组合物包含：第一载体，编码Fab的重链的多核苷酸与编码通过接头连接的第一单体和第二单体的多核苷酸可操作地连接；第二载体，编码Fab的重链的多核苷酸与编码第三单体的多核苷酸可操作地连接；以及第三载体，包含编码Fab的轻链的多核苷酸。

在本发明中，“重组载体”在以可操作的方式与所要表达的目标多肽的编码基因连接的情况下，可以用作能够在适当的宿主细胞中高效表达上述目标多肽的目标多肽的表达载体，上述重组载体可以在宿主细胞中表达。优选地，宿主细胞可以为真核细胞，可以根据宿主细胞的种类适当选择启动子(promoter)、终止子(terminator)、增强子(enhancer)等表达调节序列、用于膜靶向化或分泌的序列等并根据目的多种多样地组合。

根据本发明的一实施例，确认到本发明的包含抗原结合结构域以及细胞因子三聚体结构域融合蛋白对抗原的结合能力比母抗体优秀，对细胞因子目标受体的结合能力比母抗体优秀，确认到可以同时结合，可以成功诱导表达各目标(蛋白质)的细胞的结合。

同时，本发明提供抗体与肿瘤坏死因子超家族三聚体的融合蛋白的生产方法，上述肿瘤坏死因子超家族形成包含二聚体及肿瘤坏死因子超家族的第三单体的三聚体，上述二聚体包含肿瘤坏死因子超家族的第一单体及第二单体，上述生产方法包括：步骤1)，在存在于上述二聚体与第三单体之间的两个表面中选择一个表面；步骤2)，在第一单体或第二单体以及第三单体中各选择一个在上述所选择的一个表面中的第一单体或第二单体与第三单体之间位于以下的距离处的氨基酸对；步骤3)，在上述选择的氨基酸对中的第三单体位点诱导突变来形成杵；步骤4)，筛选与上述第三单体的杵配对并引起结构碰撞的野生型的第一单体或第二单体的氨基酸残基；步骤5)，在上述筛选的第一单体或第二单体的氨基酸残基中诱导突变来形成臼；以及步骤6)，诱导上述第三单体的杵与第一单体或第二单体的臼的杵臼相互作用。在上述二聚体及第三单体中连接有Fab的重链。

在上述抗体与肿瘤坏死因子超家族三聚体的融合蛋白的生产方法的上述步骤2)中，上述氨基酸对可以位于在一个表面的第一单体或第二单体与第三单体之间的以下的距离处，优选地，可以位于/>以下的距离处，更优选地，可以位于/>至/>的距离处。

在上述抗体与肿瘤坏死因子超家族三聚体的融合蛋白的生产方法中，引起有关杵的结构冲突的氨基酸残基可以通过模拟(simulation)将相关残基更换为作为候选(Candidate)的选自由甘氨酸(Glycine，G)、缬氨酸(Valine，V)、丝氨酸(Serine，S)及丙氨酸(Alanine，A)组成的组中的任一种氨基酸残基来类推。

同时，本发明的特征在于，在上述步骤1)中选择的表面中形成杵臼结合，在剩下的未选择的表面的单体之间诱导位阻效应。可以通过上述位阻效应诱导与所希望的表面的相互作用。由此可以防止利用自然状态的三聚体生产融合蛋白时可能诱发的连接抗体(Fab)的铰链部分的错配二硫化物的生成。

根据本发明的一实施例，确认到在不采用杵臼结构的细胞因子与抗体结合的融合蛋白的情况下，在半胱氨酸残基配对形成二硫键的铰链区附近发现未配对的半胱氨酸残基，或者发现三个铰链都非对称地形成配对的二硫键。

因此，本发明的生产方法是能够防止所生产的抗体与肿瘤坏死因子超家族三聚体的融合蛋白中出现因铰链部分非正常二硫键引起的不均匀性的最佳方法，可以增大融合蛋白的生产性和纯度，是能够将上述融合蛋白提供为更为稳定的治疗用蛋白质的方法。

上述二聚体的特征在于，为通过接头连接的第一单体与第二单体。上述二聚体的特征在于，第一单体的N或C末端与第二单体的N或C末端通过接头相互连接。上述接头只要是本发明所属技术领域中公知的接头中能够连接细胞因子的第一单体与第二单体的接头就可以不受限制地使用。

并且，在上述抗体片段(Fab)中，只要是能够与目标抗原结合的抗体片段就可以不受限制地使用。

同时，本发明提供通过上述生产方法生产的抗体与肿瘤坏死因子超家族三聚体的融合蛋白。

在通过上述生产方法生产的抗体与肿瘤坏死因子超家族三聚体的融合蛋白中，可以同样适用前述有关融合蛋白的说明。

并且，本发明提供包含本发明的融合蛋白的用于预防或治疗因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病的药物组合物。

并且，本发明提供治疗因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病的方法，包括向对象施用本发明的融合蛋白的步骤。

优选地，上述对象为包括人类在内的哺乳动物，包括需要治疗因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病的患者、正在治疗因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病的患者以及已经治疗因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病的患者，还可以包括已接受因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病的手术治疗的患者。

另外，本发明的融合蛋白可以与现有的药物或治疗方法结合来治疗因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病。当与本发明的融合蛋白并用治疗时，可以与其他药物或治疗方法共同或依次处理来治疗因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病。

上述因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病可以为选自由癌症、免疫疾病、自身免疫性疾病、中枢神经疾病、退行性神经疾病、自身免疫性疾病及炎症性疾病组成的组中的一种以上，上述癌症可以为选自由乳腺癌、肺癌、大肠癌及结肠直肠癌组成的组中的一种以上。

在本发明中，上述药物组合物的特征在于，可以为胶囊、片剂、颗粒、注射剂、软膏剂、粉末或饮料形态，上述药物组合物的特征在于，以人类为对象。上述药物组合物可以根据通常的方法配制为散剂、颗粒剂、胶囊、片剂、水性悬浮液等口服剂型、外用剂、栓剂及灭菌注射溶液的形态来使用，但不限定于此。

本发明的药物组合物可以包含药学上可接收的载体。口服给药时，药学上可接受的载体可以使用结合剂、滑泽剂、崩解剂、赋形剂、可溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮化剂、色素、香料等，在注射剂的情况下，可以混合缓冲剂、保存剂、无痛化剂、可溶剂、等渗剂、稳定剂等来使用，在局部给药用的情况下，可以使用基剂、赋形剂、润滑剂、保存剂等。本发明的药物组合物的剂型可以通过与上述药学上可接收的载体混合来多种多样地制备。例如，口服给药时可以制备为片剂、包衣片剂、胶囊、药水(elixir)、缓释片、糖浆剂、圆片等形态，注射剂可以制备为单位给药安碚瓶或多次给药的形态。

另一方面，适于制剂化的载体、赋形剂及稀释剂的例可以使用乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油等。并且，还可以包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂、防腐剂等。

本发明的药物组合物的给药途径包括口服、静脉内、肌肉内、动脉内、骨髓内、硬膜内、心脏内、经皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、肠道、病灶、舌下或直肠，但不限定于此。上述“胃肠外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜腔内、胸骨内、硬膜内、病灶内及颅骨内注射或注入技术。本发明的药物组合物还能够以用于直肠给药的栓剂的形态来给药。

本发明的药物组合物可以根据包括所使用的特定有效成分的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、代谢率、药物配合及所要预防或治疗的特定疾病的严重程度在内的多种因素来多种多样地变化，上述药物组合物的给药量可以通过相关从业者根据患者的状态、体重、疾病的程度、药物形态、给药途径及期间来适当地选择。优选地，可以在考虑上述所有因素的情况下以不引起副作用的最小的量获得最大效果的量来给药，更优选地，以1μg/体重kg/day～10000μg/体重kg/day的有效剂量一天分数次给药，更加优选地，以10mg/体重kg/day～1000mg/体重kg/day的有效剂量一天分数次给药。上述给药量无论在哪个方面都不限定本发明的范围。

上述本发明的内容只要不相互矛盾，就可以同等地采用，本发明所属技术领域的普通技术人员加以适当变更来实施的也应包括在本发明的范畴内。

以下，通过实施例详细说明本发明，但本发明的范围不限定于下述实施例。

实验例1.准备细胞株

利用Freestyle 293F表达培养液(Gibco^TM，12338018)在37℃、8％CO₂的条件下，以120RPM的转速悬浮培养Freestyle293F细胞株(Gibco^TM，R79007)。同时，利用向RPMI1640(Welgene公司)加入10％(v/v)的胎牛血清(FBS，Fetal bovine serum，Gibco^TM)的培养液以37℃、8％CO₂的条件培养Raji-B细胞株(CCL-86^TM，ATCC公司)、MDA-MB-231细胞株(HTB-26^TM，ATCC公司)、SW-480细胞株(10228，KCLB公司)，利用向DMEM(Welgene公司)中加入10％(v/v)的胎牛血清的培养液以37℃、5％CO₂的条件培养PC-9细胞株(CVCL_B260)以及HT-29细胞株(HTB-38^TM，ATCC公司)。

实施例1.制备连接细胞因子三聚体结构域与抗体结构域的融合蛋白

1-1.准备基因

为了构成本发明的融合蛋白，设计如下三种编码序列：1)抗体的轻链，2)抗体重链的抗原结合位点C末端连接4-1BB配体单体的序列，3)抗体重链的抗原结合位点C末端连接4-1BB配体二聚体的序列。

其中，使用人类4-1BB配体蛋白，利用Geneart合成与此相关基因(NM_003811.3)。在本发明中使用了4-1BB配体蛋白的全部序列中向细胞外部露出的球形蛋白结构域(G90-T241)。基因的克隆及突变生成利用Gateway克隆(gateway cloning)来进行。

1-2.制备用于生产融合蛋白的载体

为了制备抗体的Fc位点替换为细胞因子三聚体的融合蛋白(以下称为“RACE”(受体-抗体共轭(细胞)衔接物))，制备了有关Fab重链与细胞因子二聚体的第一载体、有关Fab重链与细胞因子单体的第二载体以及有关轻链的第三载体。

在此情况下，在作为细胞因子的4-1BB配体的三聚体结构域中，通过利用Pymolsoftware和Dynamut server(http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut/)的模拟来选定用于形成突变的氨基酸残基。

构成了以4-1BB配体的一部分序列(G90-T241)作为单位体的三聚体结构域。具体地，为了大幅提高制备的三聚体的物性和纯度，防止包含单体的重链的同源三聚体化，利用杵臼结构来形成三聚体。为此，利用1)包含4-1BB配体二聚体的抗体重链，以及2)包含4-1BB配体单体的抗体种重链，只在二聚体及单体之间存在的两个表面中的一个表面上形成杵臼，从而以最小的变化实现选择性的三聚体化。杵在4-1BB配体单体中形成，臼在4-1BB配体的二聚体中的一个形成。三聚体的各单元和它们的结合形态如图1所示，能够在各单元的表面形成的杵臼如图2所示。

基于人类4-1BBL蛋白复合物结构(PDB code：6A3V，2X29)利用Pymol software(https://pymol.org/2/)来进行如上所述形成的三聚体结构域的结构分析。

通过此确认的4-1BB配体二聚体与单体之间的相互作用位点如图3所示。

如图3所示，在相互作用表面中确认到位于小于的距离处的氨基酸(图3的A部分)。同时，在图3的B部分中以虚线(氢键)或实线(疏水性相互作用)示出图3的A部分中各氨基酸形成的相互作用。

在如上所述导出的氨基酸残基中诱发变异来在二聚体与单体之间形成杵臼结构，通过突变诱发(mutagenesis)预测的野生型与各变异的杵臼形成与否的示意图如图4所示。

上述4-1BB配体在自然状态下以三聚体的形式存在。在上述三聚体的组装过程中，连接抗体(Fab)的铰链部分的序列上的错误安装的同时生成错配的二硫化物。为了解决这个问题，本发明利用杵臼结构来生产三聚体。

如图4所示，若不在单体的氨基酸残基发生变异，则不形成杵臼结构(图4中的左侧)，若只在单体的氨基酸残基发生变异，只在发生变异的表面一侧应用杵，与自然状态的表面的相互作用会受到位阻效应(图4中的中心)。因此，当如本发明一样在两个单体的氨基酸都发生变异时，分别应用杵与臼，从而可以形成稳定的互补结构(参考图4中的右侧)。

考虑到上述内容，制备了有关插入抗体及野生型细胞因子序列的重链-细胞因子(二聚体)的第一载体、有关重链-细胞因子(单体)的第二载体、有关抗体轻链的第三载体。然后，在上述二聚体及单体中诱导突变来诱导杵臼结构的形成。

更具体地，在上述杵臼结构的形成方面，以二聚体(第一单体与第二单体通过接头来连接)的Q94S(形成臼)与单体(第三单体)的R202W(形成杵)形成杵臼的方式来制备。

首先，依靠Geneart(Thermofisher公司)合成用于克隆(cloninig)的模板(template，(抗体的重链、抗体的轻链、4-1BBL(WT)二聚体以及单体))。在此情况下，在上述二聚体中，在第508-510为核苷酸序列中放入相当于接头的GGA(甘氨酸)序列来合成。并且，使用利妥昔单抗(Drugbank accession number(DB00073))、西妥昔单抗(Drugbankaccession number(DB00002))、曲妥珠单抗(Drugbank accession number(DB00072))或阿维鲁单抗(Drugbank accession number(DB11945))这四种抗体作为上述抗体。然后，基于pCMV载体利用Gateway克隆进行各个克隆。更具体地，制备向pCMV载体的多克隆位点(MCS，multiple cloning site)插入通过抗体重链(VH-CH1-铰链)的末端连接4-1BBL-接头-4-1BBL(二聚体)的抗体重链-细胞因子二聚体的第一载体。为此，利用下述表1所示的引物扩增有关抗体重链的第一个片段、有关4-1BBL二聚体中第一个单体的第二个片段、有关4-1BBL二聚体中第二个单体的第三个片段后进行Gateway克隆。

表1

同时，制备向pCMV载体的多克隆位点(MCS)插入通过抗体重链(VH-CH1-铰链)的末端连接4-1BBL的抗体重链-细胞因子单体的第二载体。为此，利用下述表2所示的引物扩增有关抗体重链的第一个片段及有关4-1BBL单体的第二个片段后进行Gateway克隆。

表2

并且，制备了向pCMV载体的多克隆位点插入抗体轻链的第三载体。在此情况下，利用下述表3所示的引物扩增片段后进行Gateway克隆。

表3

/>

然后，进行用于在上述第一载体的二聚体及第二载体的单体中应用突变的Gateway克隆。在此情况下，使用下述表4所示的引物。结果，在第一载体的二聚体中应用Q94S的突变，第二载体的单体中应用R202W的突变。

表4

通过基因排序(sequencing)确认各基因的插入与否并验证序列(委托Cosmogenetech公司)。

1-3.利用第一载体、第二载体及第三载体转染及生产RACE

为了RACE的转染及表达，使用了上述实验例1中准备的Freestyle293F细胞。在转染24小时前，以1×10⁶/ml的浓度准备Freestyle293F细胞株。在上述细胞中利用Fectopro(Polyplus，116-010)试剂以及在上述内容中准备的第一载体、第二载体及第三载体进行转染。更具体地，进行向酶1ml的细胞株加入1μg的脱氧核糖核酸(DNA)(以1∶1∶2的体积比例混合第一载体、第二载体以及第三载体)、1μl的Fectopro试剂的方法。将临时转染的细胞追加悬浮培养5天后(37℃、8％CO₂、120RPM)，以1500g离心分离30分钟来分离包含分泌型蛋白质的上清液。为了之后的纯化，将分离的上层液冷藏保管最多三天。

实施例2.RACE的纯化及纯度分析

利用AKTA go(Cytiva公司)和亲和层析法(affinity chromatography)从上述实施例1-2-3中获得的上清液中纯化RACE。亲和层析法使用CH1-xL column(Thermo公司)。在使用前制备、过滤层析法中使用的洗涤溶液(磷酸盐缓冲溶液(PBS)，pH7.4)和洗脱溶液(100mM的乙酸钠(sodium acetate)pH4.0)并测定pH后使用。在通过洗脱获得的分馏物中收集包含蛋白质的分馏物，将其利用磷酸盐缓冲溶液通过Ultra(30kda，15ml)过滤器透析来保管。

为了分析纯化的RACE的纯度，利用高效液相色谱(HPLC(high-performanceliquid chromatography)，agilent 1260)进行尺寸排阻色谱(PL1580-3250，agilent公司)。通过尺寸排阻色谱的大约的蛋白质的大小的预测是通过利用已知大小的标准蛋白质(5190-2242，agilent公司)的试验确定的。纯度分析中使用150mM的磷酸钠(sodiumphosphate pH 7.0)的缓冲液。

结果如图5所示。本发明的阿维鲁单抗-41BBL(RACE-04L)的纯度为97.24％(参考图5内的PD-L1 targeting(4AL)曲线图)，西妥昔单抗-41BBL(RACE-02B)的纯度为96.47％(参考图5内的EGFR targeting(Cetuximab)曲线图)，曲妥珠单抗-41BBL(RACE-02C)的纯度为96.91％(参考图5内的HER2 targeting(Herceptin)曲线图)，根据本发明制备的RACE均显出优秀的生产性及纯度。

同时，在本发明的利妥昔单抗-41BBL(RACE-01C)中，在应用杵臼(Q94S/R202W)的情况下，如图6的A部分所示，确认到4-1BB配体二聚体(臼)与4-1BB配体单体(杵)成功构成4-1BB配体三聚体，确认到这样的三聚体由包含臼(Q94S)的重链-二聚体、包含杵(R202W)的重链-单体以及轻链构成。同时，通过与上述相同的方法进行本发明的利妥昔单抗-41BBL(RACE-01C)的纯化及纯度分析的结果，显出与具有Fc二聚体的正常抗体相似程度的生产量(图6的B部分)，在基于CH1的一次纯化后，确认到分离出96％以上的高纯度的蛋白质(图6的C部分)。

实施例3.RACE的结构分析

基于人类4-1BBL蛋白复合物结构(PDB code：6A3V，2X29)利用Pymol software(https://pymol.org/2/)来分析4-1BBL三聚体结构域的结构。

结果如图7及图8所示，确认到构成二聚体的4-1BBL_a的C末端与4-1BBL_b的N末端通过G₁-G₄S之间的短的肽接头连接，从而对包含4-1BB配体二聚体的重链的稳定表达做出贡献。并且，确认到通过在二聚体中形成臼在单体中形成杵来构成三聚体。

实施例4.确认对错配给三聚体的形成带来的影响

在与本发明的RACE结合的4-1BB配体中，通过LC(Vanquish，Thermo公司)、MS(QExactive Plus，Thermo公司)分析二硫键来确认杵臼结构的应用给蛋白质铰链带来的影响。为了形成蛋白质切片，使用1mg/ml浓度的分析试样和标准试样，例如，蛋白内切酶(Endoproteinase Lys-C(Sigma公司，美国(USA)))、胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin(Promega公司))、Glu-C(Promega公司，Sequencing Grade)。

以如下方式准备上述分析试样。在上述实施例1-2-1.及实施例1-2-2.的第二载体(抗体重链-单体)及第三载体(抗体轻链)中，将使用利妥昔单抗用作上述抗体，使用野生型4-1BBL用作上述单体的来制备的重组载体以与上述1-2-3.相同的方法同时转染到Freestyle293F细胞中后，获得过表达相关蛋白质的细胞的上清液。上述分析试样为通过具有野生型的4-1BBL序列的RACE重链单体与轻链来制备的蛋白质，具有共有三个抗体结合片段(Fab)与铰链区域的RACE三聚体的结构。在此情况下，通过观察蛋白质铰链中产生的不正常的二硫键的状态确认到通过杵臼结构的铰链的二聚体化对结构的稳定性、均匀性带来的影响。

同时，为了确认通过二硫键多聚体化的蛋白质的特性，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE，Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel)进行电泳(Mini-protein tetra，Bio-Rad公司)。在此情况下，在还原条件、非还原条件下比较各蛋白质的大小。利用考马斯蓝(Coomassie-blue)试剂染色电泳结束的凝胶，利用LAS-500(cytiva公司)分析结果。

如图9所示，在未应用杵臼的自然状态的4-1BB配体中，当4-1BB配体二聚体表示为A，4-1BB配体单体表示为B，轻链表示为L时，在过表达未应用杵的自然状态的单体B和L的细胞株中观察到组装错误的B3L3、B2L2等物质(图9的A部分中下端的SDS-PAGE结果)。尤其在具有三个铰链的B3L3的情况下，在两个半胱氨酸残基通过配对来形成二硫键的铰链区附近发现未配对的半胱氨酸残基，或者发现三个铰链都非对称地形成配对的二硫键(参考图9的B部分)。这种现象在同时处理糜蛋白酶与Lys-C的实验组(YK)中表现得尤为突出，但在同时处理Glu-C与Lys-C的实验组(EK)中表现得微乎其微。这样的不均匀性是治疗用蛋白质中绝不能有的特征，明确确认到必须通过改良单体(赋予杵)来提高最终三聚体的纯度和生产性的必要性。

实施例5.通过连接抗体结构域与细胞因子三聚体来制备的融合蛋白(RACE)及特性分析

5-1.大小分析

实施例1中制备的融合蛋白(RACE)平台可以根据目的结合多种抗原结合片段，与抗体结构域结合的RACE的结构示意图如图10所示。

并且，在图10中通过从N末端罗列至C末端来示出RACE的结构域结构。在本发明的融合蛋白中，通过铰链连接的4-1BB配体的单体具有杵模块，4-1BB配体的二聚体具有臼模块。

5-2.热漂移测定(TSA，Thermal shift assay)分析

利用SYPRO^TMOrange(S6650，Thermo公司)试剂参考标准试验方法进行RACE的稳定性及熔融温度(Tm)值的测定(Curr Protoc Protein Sci.2015；79:28.9.1-28.9.14)。

比较利妥昔单抗-41BBL(RACE-01C)与作为其母抗体的利妥昔单抗的热力学稳定性，比较曲妥珠单抗-41BBL(RACE-02C)与作为其母抗体的曲妥珠单抗的热力学稳定性，如图11所示。结果确认到，本发明的利妥昔单抗-41BBL(RACE-01C)及曲妥珠单抗-41BBL(RACE-02C)都具有65℃以上的Tm值，都具有与母抗体相似的特性。

5-3.测定结合亲和度

通过利用表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)的Biacore(cytiva公司)确认本发明的西妥昔单抗-41BBL(RACE-02B)对抗原(EGFR)的结合。首先，为了测定结合力，在作为传感器芯片的CM5芯片(29149604，cytiva公司)表面通过氨基偶联(aminecoupling)固定作为抗原的EGFR(10001-H08H，Sino公司)或4-1BB(10041-H08H，Sino公司)后，加入规定浓度的西妥昔单抗-41BBL(RACE-02B)。使用HEPES缓冲盐水(HBS，HEPES-buffered saline)缓冲液确认180秒钟时间的结合，300秒钟时间的解离。

结果如图12所示，本发明的西妥昔单抗-41BBL(RACE-02B)显出与作为母抗体的西妥昔单抗相似的结合能力。

同时，如图13所示，本发明的西妥昔单抗-41BBL(RACE-02B)能够结合的结合位点在各单体之间各有一个共三个，显出对4-1BB受体的稳定的接合状态(图13上端)，这比作为对4-1BB受体的凝集性抗体的乌托鲁单抗(Pfizer公司，与4-1BB配体竞争性结合)显出更为强力的结合能力。

5-4.确认RACE的同时结合能力

同时，确认了本发明的西妥昔单抗-41BBL(RACE-02B)对目标的同时结合能力。如图14左侧的示意图所示，在CM5芯片表面固定4-1BB受体后，观察与西妥昔单抗-41BBL(RACE-02B)的结合(A-I、D-I)，在此状态下依次观察追加的与EGFR的结合(A-II、D-II)。

结果确认到本发明的西妥昔单抗-41BBL(RACE-02B)能够同时与两侧目标结合，确认到可以成功诱导表达各蛋白质的细胞的结合。

5-5.4-1BB报告基因分析

利用4-1BB生物测定(J2332，Promega公司)评估通过本发明的利妥昔单抗-41BBL(RACE-01C)的4-1BB信号传递程度。根据生产公司的说明书进行分析，为了确认对目标抗原的信号依赖性，使用上述实验例1的CD20表达Raji B细胞株。利用(Promega公司)通过/>Discover酶标仪(Microplate Reader)(GM30000，promega公司)测定信号的相对值。

结果如图15所示，确认到本发明的利妥昔单抗-41BBL(RACE-01C)浓度依赖性地扩增NF-KB报告基因信号(参考图15中的右侧)。

实施例6.在实体癌细胞中确认RACE信号介导过程

在实体癌细胞中确认了本发明的融合蛋白的信号介导过程。为此，以与上述实施例5-5相同的方法向上述实验例1中记载的已知非常不完全地表达Her2的MDA-MB-231细胞株(乳腺癌细胞株)、已知过表达EGFR的PC-9细胞株(肺腺癌细胞株)、HT-29细胞株(大肠癌细胞株)、SW480细胞株(结肠直肠癌细胞株)处理本发明的曲妥珠单抗-41BBL(RACE-02C)、西妥昔单抗-41BBL(RACE-02B)或利妥昔单抗-41BBL(RACE-01C)来评估各4-1BB信号的传递程度。

图16的A部分示出对MDA-MB-231细胞株的上靶信号传递和脱靶信号传递。在MDA-MB-231细胞株的情况下，尽管作为目标蛋白质的HER2表达的微乎其微，但当处理能够与相关蛋白质结合的曲妥珠单抗-41BBL(RACE-02C)时，观察到信号传递程度随浓度敏感地增加，达到分类为三阴性乳腺癌的程度，与之相反，在处理以相关细胞完全不表达的抗原CD20为目标的利妥昔单抗-41BBL(RACE-01C)的情况下，在脱靶方面，未观察到信号随浓度的增加。同时，在三种表面表达EGFR蛋白的肿瘤细胞株中，EGFR表达程度、上靶信号传递及脱靶信号传递程度的差异如图16的B部分所示。在上述图16的B部分中，在细胞株上标记“-on”(cell line-on)(例如(Ex)SW480-on、HT-29-on、PC9-on)表示上靶效果，即，在处理可通过利用与各靶细胞中表达的EGFR结合的西妥昔单抗制备的西妥昔单抗-41BBL(RACE-02b)后，确认的与此相关的信号传递程度的结果。相反，在相同细胞株标记“-off”(例如SW480-off、HT-29-off、PC9-off)的表示药物的脱靶效果，即，处理能够与各个靶细胞完全不表达的CD20结合的利妥昔单抗-41BBL(RACE-01C)后确认的产生信号的程度的结果。

结果，在对过表达EGFR的三种细胞处理西妥昔单抗-41BBL(RACE-02B)时，可以确认到与浓度成比例的信号传递，在处理与各细胞株完全不表达的CD20蛋白相关的利妥昔单抗-41BBL(RACE-01C)-target-off时，完全确认不到信号传递，从而确认到完全没有过去成为4-1BBL靶向治疗剂的问题的脱靶毒性(toxicity)。

同时，确认到本发明的融合蛋白西妥昔单抗-41BBL(RACE-02B)目标抗原特异性地以比作为4-1BB凝集型抗体的乌托鲁单抗显著优秀的程度诱导4-1BB信号传递(图16B)。

实施例7.确认在诱发癌症的动模型中的功效

在诱发癌症的动物模型中确认了西妥昔单抗-41BBL(RACE-02B)的抗癌功效。首先，为了在Balb-c小鼠中自发生长的小鼠大肠癌细胞(CT26)的表面表达人类的EGFR，将相关hEGFR-CT26细胞(5×10⁵/100μL)移植到表达人类4-1BB的细胞外结构域的人类化小鼠(Balb-c)的皮下(委托Gempharmatech公司)。以移植的肿瘤的大小平均到达100mm³时为起点，通过尾静脉以Q3D(三天一次)的方式给药如下组的抗体共6次：对照组(5mg/kg，人类(human)IgG(从Sigma公司购入(14506)))、西妥昔单抗-41BBL(RACE-02B)(0.5mg/kg，2mg/kg)。使用卡尺(caliper)每周测量两次各实验组的肿瘤的大小(TV＝0.5a×b²)，其中，a为肿瘤的长轴，b为肿瘤的短轴。

结果如图18所示，与对照组的人类IgG抗体相比，西妥昔单抗-41BBL(ARCE-02B)显出显著的肿瘤抑制能力。

综上所述，本发明涉及第一单体与第二单体通过接头连接而成的二聚体通过杵臼与第三单体结合的细胞因子三聚体结构域以及由上述细胞因子三聚体结构域取代抗体的恒定区(Fc)来制备的抗体与细胞因子三聚体结构域结合的新形式的融合蛋白(RACE)，本发明的通过杵臼结合的细胞因子三聚体结构域对4-1BB受体显出比凝集性抗体更为强力的结合能力，确认到包含其的融合蛋白对两侧目标都显出优秀的结合能力，确认到可以成功诱导表达各目标(蛋白质)的细胞的结合。

序列表

<110> CTCELLS公司

<120> 包含抗原结合结构域及细胞因子三聚体结构域的融合蛋白

<130> OP22014

<150> 10-2022-0022526

<151> 2022-02-21

<150> 10-2022-0046740

<151> 2022-04-15

<160> 34

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 169

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RACE-WT_重链 I (单体, WT)

<400> 1

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp

20 25 30

Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu

35 40 45

Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala

50 55 60

Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val

65 70 75 80

Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln

85 90 95

Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp

100 105 110

Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln

115 120 125

Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu

130 135 140

His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala

145 150 155 160

Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr

165

<210> 2

<211> 322

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RACE-WT_重链 II (二聚体, WT, G1 linker)

<400> 2

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp

20 25 30

Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu

35 40 45

Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala

50 55 60

Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val

65 70 75 80

Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln

85 90 95

Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp

100 105 110

Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln

115 120 125

Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu

130 135 140

His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala

145 150 155 160

Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu

165 170 175

Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser

180 185 190

Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys

195 200 205

Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val

210 215 220

Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly

225 230 235 240

Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly

245 250 255

Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu

260 265 270

Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser

275 280 285

Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg

290 295 300

His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg

305 310 315 320

Val Thr

<210> 3

<211> 507

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RACE-WT_重链 I (铰链 + downstream, 4-1BBL 单体)

<400> 3

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg aggcatgttt 60

gcccagctgg tggcccagaa tgtgctgctg attgatggcc ctctgagctg gtacagcgat 120

cctggacttg ctggcgttag cctgactggc ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa 180

ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 240

gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc tctgagatct 300

gctgctggtg cagctgccct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgccag cagcgaggcc 360

agaaatagcg cctttggctt ccaaggcaga ctgctgcacc tgtctgctgg acagagactg 420

ggagtgcacc tccacacaga agccagagca agacacgcct ggcagctgac acaaggcgct 480

acagtgctgg gcctgttcag agtgaca 507

<210> 4

<211> 966

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RACE-WT_重链 II (铰链 + downstream, 4-1BBL 二聚体)

<400> 4

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg aggcatgttt 60

gcccagctgg tggcccagaa tgtgctgctg attgatggcc ctctgagctg gtacagcgat 120

cctggacttg ctggcgttag cctgactggc ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa 180

ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 240

gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc tctgagatct 300

gctgctggtg cagctgccct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgccag cagcgaggcc 360

agaaatagcg cctttggctt ccaaggcaga ctgctgcacc tgtctgctgg acagagactg 420

ggagtgcacc tccacacaga agccagagca agacacgcct ggcagctgac acaaggcgct 480

acagtgctgg gcctgttcag agtgacagga ggcatgtttg cccagctggt ggcccagaat 540

gtgctgctga ttgatggccc tctgagctgg tacagcgatc ctggacttgc tggcgttagc 600

ctgactggcg gcctgagcta caaagaggac accaaagaac tggtggtggc caaggccggc 660

gtgtactacg tgttctttca gctggaactg cggagagtgg tggccggcga aggatctgga 720

tctgtgtctc tggcactgca tctgcagcct ctgagatctg ctgctggtgc agctgccctg 780

gctctgacag ttgatctgcc tcctgccagc agcgaggcca gaaatagcgc ctttggcttc 840

caaggcagac tgctgcacct gtctgctgga cagagactgg gagtgcacct ccacacagaa 900

gccagagcaa gacacgcctg gcagctgaca caaggcgcta cagtgctggg cctgttcaga 960

gtgaca 966

<210> 5

<211> 169

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RACE-modified I_重链 I (铰链 + downstream, 4-1BBL

单体, R202W)

<400> 5

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp

20 25 30

Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu

35 40 45

Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala

50 55 60

Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val

65 70 75 80

Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln

85 90 95

Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp

100 105 110

Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln

115 120 125

Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Trp Leu Gly Val His Leu

130 135 140

His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala

145 150 155 160

Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr

165

<210> 6

<211> 322

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RACE-modified I_重链 II (铰链 + downstream, 4-1BBL 二聚体,

Q94S, G1 linker)

<400> 6

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Gly Met Phe Ala Ser Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp

20 25 30

Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu

35 40 45

Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala

50 55 60

Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val

65 70 75 80

Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln

85 90 95

Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp

100 105 110

Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln

115 120 125

Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu

130 135 140

His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala

145 150 155 160

Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu

165 170 175

Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser

180 185 190

Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys

195 200 205

Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val

210 215 220

Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly

225 230 235 240

Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly

245 250 255

Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu

260 265 270

Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser

275 280 285

Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg

290 295 300

His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg

305 310 315 320

Val Thr

<210> 7

<211> 507

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RACE-modified I_重链 I (铰链 + downstream, 4-1BBL

单体, R202W)

<400> 7

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg aggcatgttt 60

gcccagctgg tggcccagaa tgtgctgctg attgatggcc ctctgagctg gtacagcgat 120

cctggacttg ctggcgttag cctgactggc ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa 180

ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 240

gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc tctgagatct 300

gctgctggtg cagctgccct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgccag cagcgaggcc 360

agaaatagcg cctttggctt ccaaggctgg ctgctgcacc tgtctgctgg acagagactg 420

ggagtgcacc tccacacaga agccagagca agacacgcct ggcagctgac acaaggcgct 480

acagtgctgg gcctgttcag agtgaca 507

<210> 8

<211> 966

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RACE-modified I_重链 II (铰链 + downstream, 4-1BBL 二聚体,

Q94S, G1 linker)

<400> 8

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg aggcatgttt 60

gccagcctgg tggcccagaa tgtgctgctg attgatggcc ctctgagctg gtacagcgat 120

cctggacttg ctggcgttag cctgactggc ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa 180

ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 240

gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc tctgagatct 300

gctgctggtg cagctgccct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgccag cagcgaggcc 360

agaaatagcg cctttggctt ccaaggcaga ctgctgcacc tgtctgctgg acagagactg 420

ggagtgcacc tccacacaga agccagagca agacacgcct ggcagctgac acaaggcgct 480

acagtgctgg gcctgttcag agtgacagga ggcatgtttg cccagctggt ggcccagaat 540

gtgctgctga ttgatggccc tctgagctgg tacagcgatc ctggacttgc tggcgttagc 600

ctgactggcg gcctgagcta caaagaggac accaaagaac tggtggtggc caaggccggc 660

gtgtactacg tgttctttca gctggaactg cggagagtgg tggccggcga aggatctgga 720

tctgtgtctc tggcactgca tctgcagcct ctgagatctg ctgctggtgc agctgccctg 780

gctctgacag ttgatctgcc tcctgccagc agcgaggcca gaaatagcgc ctttggcttc 840

caaggcagac tgctgcacct gtctgctgga cagagactgg gagtgcacct ccacacagaa 900

gccagagcaa gacacgcctg gcagctgaca caaggcgcta cagtgctggg cctgttcaga 960

gtgaca 966

<210> 9

<211> 169

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RACE-modified II_重链 I (铰链 + downstream, 4-1BBL

单体, A180E)

<400> 9

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp

20 25 30

Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu

35 40 45

Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala

50 55 60

Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val

65 70 75 80

Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln

85 90 95

Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Glu Leu Thr Val Asp

100 105 110

Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln

115 120 125

Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu

130 135 140

His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala

145 150 155 160

Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr

165

<210> 10

<211> 322

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RACE-modified II_重链 II (铰链 + downstream, 4-1BBL

二聚体, E148G, G1 linker)

<400> 10

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp

20 25 30

Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu

35 40 45

Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala

50 55 60

Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Gly Leu Arg Arg Val

65 70 75 80

Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln

85 90 95

Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp

100 105 110

Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln

115 120 125

Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu

130 135 140

His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala

145 150 155 160

Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu

165 170 175

Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser

180 185 190

Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys

195 200 205

Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val

210 215 220

Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly

225 230 235 240

Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly

245 250 255

Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu

260 265 270

Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser

275 280 285

Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg

290 295 300

His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg

305 310 315 320

Val Thr

<210> 11

<211> 507

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RACE-modified II_重链 I (铰链 + downstream, 4-1BBL

单体, A180E)

<400> 11

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg aggcatgttt 60

gcccagctgg tggcccagaa tgtgctgctg attgatggcc ctctgagctg gtacagcgat 120

cctggacttg ctggcgttag cctgactggc ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa 180

ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 240

gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc tctgagatct 300

gctgctggtg cagctgccct ggaactgaca gttgatctgc ctcctgccag cagcgaggcc 360

agaaatagcg cctttggctt ccaaggctgg ctgctgcacc tgtctgctgg acagagactg 420

ggagtgcacc tccacacaga agccagagca agacacgcct ggcagctgac acaaggcgct 480

acagtgctgg gcctgttcag agtgaca 507

<210> 12

<211> 966

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RACE-modified II_重链 II (铰链 + downstream, 4-1BBL

二聚体, E148G, G1 linker)

<400> 12

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg aggcatgttt 60

gccagcctgg tggcccagaa tgtgctgctg attgatggcc ctctgagctg gtacagcgat 120

cctggacttg ctggcgttag cctgactggc ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa 180

ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctgggact gcggagagtg 240

gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc tctgagatct 300

gctgctggtg cagctgccct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgccag cagcgaggcc 360

agaaatagcg cctttggctt ccaaggcaga ctgctgcacc tgtctgctgg acagagactg 420

ggagtgcacc tccacacaga agccagagca agacacgcct ggcagctgac acaaggcgct 480

acagtgctgg gcctgttcag agtgacagga ggcatgtttg cccagctggt ggcccagaat 540

gtgctgctga ttgatggccc tctgagctgg tacagcgatc ctggacttgc tggcgttagc 600

ctgactggcg gcctgagcta caaagaggac accaaagaac tggtggtggc caaggccggc 660

gtgtactacg tgttctttca gctggaactg cggagagtgg tggccggcga aggatctgga 720

tctgtgtctc tggcactgca tctgcagcct ctgagatctg ctgctggtgc agctgccctg 780

gctctgacag ttgatctgcc tcctgccagc agcgaggcca gaaatagcgc ctttggcttc 840

caaggcagac tgctgcacct gtctgctgga cagagactgg gagtgcacct ccacacagaa 900

gccagagcaa gacacgcctg gcagctgaca caaggcgcta cagtgctggg cctgttcaga 960

gtgaca 966

<210> 13

<211> 169

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RACE-modified III_重链 I (铰链 + downstream, 4-1BBL

单体, V234R)

<400> 13

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp

20 25 30

Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu

35 40 45

Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala

50 55 60

Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val

65 70 75 80

Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln

85 90 95

Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp

100 105 110

Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln

115 120 125

Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Trp Leu Gly Val His Leu

130 135 140

His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Arg Gln Leu Thr Gln Gly Ala

145 150 155 160

Thr Arg Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr

165

<210> 14

<211> 322

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RACE-modified III_重链 II (铰链 + downstream, 4-1BBL

二聚体, R202V, G1 linker)

<400> 14

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp

20 25 30

Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu

35 40 45

Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala

50 55 60

Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val

65 70 75 80

Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln

85 90 95

Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp

100 105 110

Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln

115 120 125

Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu

130 135 140

His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala

145 150 155 160

Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Gly Gly Met Phe Ala Gln Leu

165 170 175

Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser

180 185 190

Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys

195 200 205

Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val

210 215 220

Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly

225 230 235 240

Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly

245 250 255

Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu

260 265 270

Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser

275 280 285

Ala Gly Gln Val Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg

290 295 300

His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg

305 310 315 320

Val Thr

<210> 15

<211> 507

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RACE-modified III_重链 I (铰链 + downstream, 4-1BBL

单体, V234R)

<400> 15

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg aggcatgttt 60

gcccagctgg tggcccagaa tgtgctgctg attgatggcc ctctgagctg gtacagcgat 120

cctggacttg ctggcgttag cctgactggc ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa 180

ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 240

gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc tctgagatct 300

gctgctggtg cagctgccct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgccag cagcgaggcc 360

agaaatagcg cctttggctt ccaaggcaga ctgctgcacc tgtctgctgg acagagactg 420

ggagtgcacc tccacacaga agccagagca agacacgcct ggcagctgac acaaggcgct 480

acaagactgg gcctgttcag agtgaca 507

<210> 16

<211> 966

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RACE-modified III_重链 II (铰链 + downstream, 4-1BBL

二聚体, R202V, G1 linker)

<400> 16

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg aggcatgttt 60

gcccagctgg tggcccagaa tgtgctgctg attgatggcc ctctgagctg gtacagcgat 120

cctggacttg ctggcgttag cctgactggc ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa 180

ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 240

gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc tctgagatct 300

gctgctggtg cagctgccct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgccag cagcgaggcc 360

agaaatagcg cctttggctt ccaaggcaga ctgctgcacc tgtctgctgg acagagactg 420

ggagtgcacc tccacacaga agccagagca agacacgcct ggcagctgac acaaggcgct 480

acagtgctgg gcctgttcag agtgacagga ggcatgtttg cccagctggt ggcccagaat 540

gtgctgctga ttgatggccc tctgagctgg tacagcgatc ctggacttgc tggcgttagc 600

ctgactggcg gcctgagcta caaagaggac accaaagaac tggtggtggc caaggccggc 660

gtgtactacg tgttctttca gctggaactg cggagagtgg tggccggcga aggatctgga 720

tctgtgtctc tggcactgca tctgcagcct ctgagatctg ctgctggtgc agctgccctg 780

gctctgacag ttgatctgcc tcctgccagc agcgaggcca gaaatagcgc ctttggcttc 840

caaggcagac tgctgcacct gtctgctgga caggtgctgg gagtgcacct ccacacagaa 900

gccagagcaa gacacgcctg gcagctgaca caaggcgcta cagtgctggg cctgttcaga 960

gtgaca 966

<210> 17

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4-1BBL

<400> 17

Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly

1 5 10 15

Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr

20 25 30

Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys

35 40 45

Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val

50 55 60

Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro

65 70 75 80

Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu

85 90 95

Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly

100 105 110

Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His

115 120 125

Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr

130 135 140

Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr

145 150

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一个片段正向

<400> 18

tacacgtact tagtcgctga agctcttcta tgggatggag ctatatc 47

<210> 19

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一个片段反向

<400> 19

taggtacgaa ctcgattgac ggctcttcat ccccccagga gttcagg 47

<210> 20

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二个片段正向

<400> 20

tacacgtact tagtcgctga agctcttcag gaggcatgtt tgcccagc 48

<210> 21

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二个片段反向

<400> 21

taggtacgaa ctcgattgac ggctcttcag cctcctgtca ctctgaacag gcc 53

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第三个片段正向

<400> 22

tacacgtact tagtcgctga agctcttcag gcatgtttgc ccagc 45

<210> 23

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第三个片段反向

<400> 23

aggtacgaac tcgattgacg gctcttcaga gttatgtcac tctgaacagg cc 52

<210> 24

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一个片段正向

<400> 24

tacacgtact tagtcgctga agctcttcta tgggatggag ctatatc 47

<210> 25

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一个片段反向

<400> 25

taggtacgaa ctcgattgac ggctcttatc cccccaggag ttcagg 46

<210> 26

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二个片段正向

<400> 26

tacacgtact tagtcgctga agctcttcag gaggcatgtt tgcccagc 48

<210> 27

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二个片段反向

<400> 27

aggtacgaac tcgattgacg gctcttcaga gttatgtcac tctgaacagg cc 52

<210> 28

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单个片段正向

<400> 28

tacacgtact tagtcgctga agctcttcta gatctgtggc tgcacca 47

<210> 29

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单个片段反向

<400> 29

aggtacgaac tcgattgacg gctcttcatc tcttcacttc cacctt 46

<210> 30

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 二聚体（Q94S）正向

<400> 30

tacacgtact tagtcgctga agctcttcta gcctggtggc ccagaatg 48

<210> 31

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 二聚体（Q94S）反向

<400> 31

taggtacgaa ctcgattgac ggctcttcag ctggcaaaca tgcctcc 47

<210> 32

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单体（R202W）正向

<400> 32

tacacgtact tagtcgctga agctcttctt ggctgctgca cctgtctg 48

<210> 33

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单体（R202W）反向

<400> 33

gtacgaactc gattgacggc tcttcaccag ccttggaagc caaaggc 47

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 34

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，包含：

抗原结合结构域；以及

细胞因子三聚体结构域。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，上述细胞因子三聚体结构域由包含第一单体及第二单体的二聚体与第三单体结合而成。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，上述二聚体为通过接头连接的第一单体和第二单体，上述第一单体的N末端或C末端通过接头与第二单体的N末端或C末端相互连接。

4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，上述三聚体的第一单体或第二单体的一个以上氨基酸残基与第三单体的一个以上氨基酸残基形成杵臼结构。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，在包含上述第一单体及第二单体的二聚体中形成臼结构，在第三单体中形成杵结构。

6.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，上述杵臼结构在细胞因子与受体的结合区域外的区域形成。

7.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，上述一个以上氨基酸残基位于蛋白质表面。

8.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，上述第一单体的一个以上氨基酸残基与第三单体的一个以上氨基酸残基位于以下的距离处。

9.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，上述第二单体的一个以上氨基酸残基与第三单体的一个以上氨基酸残基位于以下的距离处。

10.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，上述氨基酸残基为选自由F92、F238、Q94、F144、V234、Q146、E148、F199、Y142、L203、R202、Q200及A180组成的组中的一种以上。

11.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，上述氨基酸残基为选自由F92W、F238V、Q94S、Q94Y、F144I、V234H、V234F、V234R、Q146S、E148G、F199L、Y142T、L203A、R202V、R202W、R202F、F199W及A180E组成的组中的一种以上。

12.根据权利要求11所述的融合蛋白，其特征在于，上述氨基酸残基通过选自由A180E与E148G组成的对、V234R与R202V组成的对、R202W与Q94S组成的对组成的组中的一种以上的对形成杵臼结构。

13.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，上述抗原结合结构域为抗体或抗体片段。

14.根据权利要求13所述的融合蛋白，其特征在于，上述抗体片段包含轻链可变区及重链可变区。

15.根据权利要求13所述的融合蛋白，其特征在于，上述抗体片段为选自由Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、di-scFv以及VHH组成的组中的一种以上。

16.根据权利要求13所述的融合蛋白，其特征在于，上述抗体片段的N末端或C末端与细胞因子三聚体连接。

17.根据权利要求13所述的融合蛋白，其特征在于，上述抗体片段为具有下述结构的F(ab')2：

上述F(ab')2的第一铰链与第一单体或第二单体连接；

上述F(ab')2的第二铰链与第三单体连接。

18.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，上述细胞因子在自然状态下与受体结合为三聚体。

19.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，上述细胞因子为肿瘤坏死因子超家族。

20.根据权利要求19所述的融合蛋白，其特征在于，上述肿瘤坏死因子超家族为选自由TNFα、Dif、Necrosin、TNFβ、TNFSF1B、TNFγ、CD252、Gp34、CD134L、CD154、TRAP、Gp39、T-BAM、CD178、APTL、CD95L、CD70、CD153及4-1BBL组成的组中的一种以上。

21.根据权利要求19所述的融合蛋白，其特征在于，上述肿瘤坏死因子超家族为4-1BBL。

22.根据权利要求21所述的融合蛋白，其特征在于，上述4-1BBL包含由序列17表示的氨基酸序列。

23.根据权利要求21所述的融合蛋白，其特征在于，上述4-1BBL具有下述结构：

第一4-1BBL单体与第二4-1BBL单体通过接头连接；

第一4-1BBL单体或第二4-1BBL单体的一个以上氨基酸残基与第三4-1BBL单体的一个以上氨基酸残基形成杵臼结构。

24.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1至23中任一项所述的融合蛋白。

25.一种载体，其特征在于，包含编码权利要求1至23中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸。

26.一种融合蛋白的生产方法，其特征在于，包括向宿主细胞转染包含编码权利要求1至23中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸的载体的步骤。

27.一种载体组合物，用于生产权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，包含：

第一载体，编码Fab的重链的多核苷酸与编码通过接头连接的第一单体和第二单体的多核苷酸可操作地连接；

第二载体，编码Fab的重链的多核苷酸与编码第三单体的多核苷酸可操作地连接；以及

第三载体，包含编码Fab的轻链的多核苷酸。

28.一种生产权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包括向宿主细胞转染权利要求27所述的载体组合物的步骤。

29.一种抗体与肿瘤坏死因子超家族三聚体的融合蛋白的生产方法，上述肿瘤坏死因子超家族形成包含二聚体及肿瘤坏死因子超家族的第三单体的三聚体，上述二聚体包含肿瘤坏死因子超家族的第一单体及第二单体，其特征在于，

包括：

步骤1)，在存在于上述二聚体与第三单体之间的两个表面中选择一个表面；

步骤2)，在第一单体或第二单体以及第三单体中各选择一个在上述所选择的一个表面中的第一单体或第二单体与第三单体之间位于以下的距离处的氨基酸对；

步骤3)，在上述选择的氨基酸对中的第三单体位点诱导突变来形成杵；

步骤4)，筛选与上述第三单体的杵配对并引起结构碰撞的野生型的第一单体或第二单体的氨基酸残基；

步骤5)，在上述筛选的第一单体或第二单体的氨基酸残基中诱导突变来形成臼；以及

步骤6)，诱导上述第三单体的杵与第一单体或第二单体的臼的杵臼相互作用，

在上述二聚体及第三单体中连接有Fab的重链。

30.根据权利要求29所述的生产方法，其特征在于，在上述步骤1)中选择的表面中形成杵臼结合，在剩余未选择表面的单体之间诱导位阻效应。

31.一种通过权利要求29所述的生产方法生产的抗体与肿瘤坏死因子超家族三聚体的融合蛋白。

32.一种用于预防或治疗因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1至23中任一项所述的融合蛋白。

33.根据权利要求32所述的用于预防或治疗因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病的药物组合物，其特征在于，上述因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病为选自由癌症、免疫疾病、自身免疫性疾病、中枢神经疾病、退行性神经疾病、自身免疫性疾病以及炎症性疾病组成的组中的一种以上。

34.一种治疗因宿主免疫细胞的功能灭活或损伤引起的疾病的方法，其特征在于，包括向对象施用权利要求1至23中任一项所述的融合蛋白的步骤。