TW202342551A - 包含抗原結合結構域及細胞因數三聚體結構域的融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及由接頭連接的第一單體以及第二單體(dimer)與第三單體(monomer)通過杵臼結合的細胞因子三聚體結構域以及由上述細胞因子三聚體結構域替代抗體的恆定區(Fc)來製備的抗體與細胞因子三聚體結構域結合的新形式的融合蛋白RACE(受體-抗體共軛(細胞)銜接物(Receptor-Antibody Conjugated (cell) Engager))，確認到本發明的RACE不僅對目標受體表現出比母抗體更為優秀的結合能力，還對抗原及目標受體表現出優秀的同時結合能力，因此可以有用地將其用作雙特異性藥物組合物。

Description

包含抗原結合結構域及細胞因數三聚體結構域的融合蛋白
本發明涉及包含抗原結合結構域及細胞因子三聚體結構域的融合蛋白、其生產方法以及其用途。
利用抗CD19抗體(Anti-CD19 antibody)與抗CD3抗體(Anti-CD3 antibody)設計的CD19/CD3連接子博納吐單抗(blincyto，Amgen公司)的許可加速了通過免疫細胞的歸巢(homing)來治療腫瘤的雙特異性免疫抗癌劑的開發。
抗CD3抗體為主要以存在於T細胞表面的CD3ε(CD3 epsilon，CD3e)分子為目標的分子，誘導T細胞的激活，通過雙特異性抗體以表達結合的目標抗原為目標來誘導細胞凋亡。以這樣的CD3為目標的抗體在短時間內急速促進T細胞的活性來促進靶細胞的凋亡，在這樣的過程中，有時還誘導細胞因子的急劇分泌。這被視作是常駐在T細胞表面來誘導細胞的第一活性的CD3分子所具有的本質特性引起的。
包括T細胞在內的免疫細胞的活性通過共刺激因子與抑制因子之間的均衡來調節。幫助免疫細胞活性的共刺激因子大體分為兩個種類的家族蛋白質，即，包括CD28、誘導型共刺激分子(ICOS，Inducible Costimulatory Molecule)等在內的B7受體家族(B7 receptor family)蛋白質與包括4-1BB、OX40等在內的TNF受體蛋白。尤其這些共刺激因子蛋白質已知為在激活的T細胞中表達的誘導性分子，認為這可以緩解CD3抗體所具有的毒性方面的問題。
4-1BB配體(CD137L)抑制在抗原遞呈細胞中表達並向4-1BB受體傳遞信號。4-1BB配體以包含於細胞膜中的膜蛋白的形態以及膜結合位點頂部分被切割下來的水溶性的形態這兩種形態存在，水溶性4-1BB配體對4-1BB受體的信號傳遞不起作用，膜蛋白形態的4-1BB配體强力誘導表達4-1BB受體的T細胞或自然殺傷(NK)細胞的激活。據報告，通過上述機制，4-1BB信號的促進可以抑制腫瘤的生長。據此，以腫瘤治療為目的，能夠功能性地激活4-1BB的多種抗體分子被開發出來。
有趣的是，在抑制4-1BB配體與4-1BB受體的結合並幫助4-1BB受體的凝集的激活型抗體(例如烏托魯單抗(Utomilumab)，Pfizer公司)的情况下，雖然其單獨不具有充分的活性，但在與Fc-受體結合的情况下，觀察到具有部分活性。與之相反，在4-1BB配體與4-1BB受體結合的狀態下通過追加結合來幫助4-1BB受體與配體複合物的凝集的激活型抗體(例如烏瑞蘆單抗(Urelumab)，BMS-663513，BMS公司)即使沒有Fc-受體的幫助也具有充分的活性，但觀察到在體內顯出因Fc-受體引起的强毒性。實際上，烏瑞蘆單抗就是因這樣的强毒性而中斷臨床試驗的(NCT00612664)。
此外，也有過通過使用4-1BB配體本身來設計具有腫瘤移植功效的分子的嘗試，但在以最小的變化保持配體的內在結構且能夠特異性地對腫瘤起作用的二價(bivalent)分子的設計中尚未取得有意義的成果。
技術問題
本發明人在研究有關保持配體的內在結構且能夠特異性地對腫瘤起作用的分子設計的過程中，開發出細胞因子(Cytokine)三聚體結構域，尤其導出用來製備包含以杵臼(knob-into-hole)結構與抗原結合結構域連接的細胞因子三聚體結構域的融合蛋白的方法，確認到通過該方法製備的融合蛋白對各目標的結合能力，從而完成本發明。
因此，本發明的目的在於，提供融合蛋白。
並且，本發明的再一目的在於，提供編碼融合蛋白的多核苷酸。
並且，本發明的還有一目的在於，提供包含編碼融合蛋白的多核苷酸的載體。
並且，本發明的另一目的在於，提供融合蛋白的生產方法。
並且，本發明的又一目的在於，提供抗體與腫瘤壞死因子超家族三聚體的融合蛋白的生產方法。
並且，本發明的又一目的在於，提供用於預防或治療因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病的藥物組合物。
並且，本發明的又一目的在於，提供治療因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病的方法。
技術方案
為了實現上述目的，本發明提供一種融合蛋白，包含：抗原結合結構域；以及細胞因子三聚體結構域(domain)。
為了實現上述再一目的，本發明提供編碼本發明的融合蛋白的多核苷酸。
為了實現上述另一目的，本發明提供包含編碼本發明的融合蛋白的多核苷酸的載體。
同時，本發明提供用於生產融合蛋白的載體組合物，包含：第一載體，編碼Fab的重鏈的多核苷酸與編碼通過接頭連接的第一單體和第二單體的多核苷酸可操作地連接；第二載體，編碼Fab的重鏈的多核苷酸與編碼第三單體的多核苷酸可操作地連接；以及第三載體，包含編碼Fab的輕鏈的多核苷酸。
為了實現上述另一目的，本發明提供融合蛋白的生產方法，包括向宿主細胞轉染包含編碼本發明的融合蛋白的多核苷酸的載體的步驟。
同時，本發明還提供融合蛋白的生產方法，包括向宿主細胞轉染包含用於生產上述融合蛋白的載體組合物的步驟，上述載體組合物包含：第一載體，編碼Fab的重鏈的多核苷酸與編碼通過接頭連接的第一單體和第二單體的多核苷酸可操作地連接；第二載體，編碼Fab的重鏈的多核苷酸與編碼第三單體的多核苷酸可操作地連接；以及第三載體，包含編碼Fab的輕鏈的多核苷酸。
為了實現上述又一目的，本發明提供抗體與腫瘤壞死因子超家族三聚體的融合蛋白的生產方法，上述腫瘤壞死因子超家族形成包含二聚體及腫瘤壞死因子超家族的第三單體的三聚體，上述二聚體包含腫瘤壞死因子超家族(Tumor necrosis factor superfamily，TNFSF)的第一單體及第二單體，上述生產方法包括：步驟1)，在存在於上述二聚體與第三單體之間的兩個表面中選擇一個表面；步驟2)，在第一單體或第二單體以及第三單體中各選擇一個在上述所選擇的一個表面中的第一單體或第二單體與第三單體之間位於6Å以下的距離處的氨基酸對；步驟3)，在上述選擇的氨基酸對中的第三單體位點誘導突變來形成杵；步驟4)，篩選與上述第三單體的杵配對並引起結構碰撞的野生型(Wild type，WT)的第一單體或第二單體的氨基酸殘基；步驟5)，在上述篩選的第一單體或第二單體的氨基酸殘基中誘導突變來形成臼；以及步驟6)，誘導上述第三單體的杵與第一單體或第二單體的臼的杵臼相互作用。在上述二聚體及第三單體中連接有Fab的重鏈。
為了實現上述又一目的，本發明提供包含本發明的融合蛋白的用於預防或治療因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病的藥物組合物。
為了實現上述又一目的，本發明提供治療因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病的方法，包括向對象施用本發明的融合蛋白的步驟。
發明的效果
本發明涉及包含由接頭連接的第一單體與第二單體(dimer)以及第三單體(monomer)的細胞因子三聚體結構域，較佳地，涉及通過使用上述三聚體結構替換通過杵臼結合由接頭連接的第一單體以及第二單體與第三單體(monomer)的細胞因子三聚體結構域及抗體的恆定區(Fc)來製備的抗體與細胞因子三聚體結構域結合的新形式的融合蛋白RACE(受體-抗體共軛(細胞)銜接物(Receptor-Antibody Conjugated (cell) Engager))，本發明的RACE的製備方法提高三聚體的純度和生產性，確認到通過該方法製備的RACE不僅對目標受體表現出比母抗體更為優秀的結合能力，還對抗原及目標受體表現出優秀的同時結合能力，因此可以有用地將其用作雙特異性藥物組合物。
以下，詳細說明本發明。
本發明提供一種融合蛋白，包含：抗原結合結構域；以及細胞因子三聚體結構域。
上述細胞因子三聚體結構域的特徵在於，由包含第一單體及第二單體的二聚體與第三單體結合而成，上述二聚體的特徵在於，通過接頭連接第一單體與第二單體。在上述二聚體中，第一單體的N或C末端分別通過接頭與第二單體的N或C末端相互連接。
上述接頭只要是本發明所屬技術領域中公知的接頭中能夠連接細胞因子的第一單體與第二單體的接頭就可以不受限制地使用。在本發明的一實施例中，G 1-G 4S之間通過短的肽接頭來連接。上述G 1包含序列G，上述G 4S包含序列GGGGS(序列34)。
尤其，在本發明的細胞因子三聚體結構域中，雖然上述細胞因子可以自然地形成三聚體，但在利用自然狀態的三聚體結構來製備其與抗體結合的融合蛋白的情况下，在與各個三聚體連接的抗體的Fab 3部分的鉸鏈部分發生錯配二硫鍵，從而具有降低純度和生產性的問題。因此，為了以更高的純度提高生產性，較佳地，使構成二聚體的第一單體或第二單體的一個以上氨基酸殘基與第三單體的一個以上氨基酸殘基形成杵臼結構。較佳地，在細胞因子與受體的結合區域以外的區域形成上述杵臼結構。
同時，上述一個以上氨基酸殘基的特徵在於，位於蛋白質表面(surface)。尤其，上述第一單體與第二單體通過接頭以串聯(tandem)的方式連接，根據在第三單體中生成的杵的表面位置，臼可以在第一單體中生成，也可以在第二單體中生成。
通過上述杵臼結構，形成臼的構成二聚體的第一單體或第二單體中的一個與形成杵的第三單體可以誘導選擇性的相互作用，而在未形成臼的剩下的第一單體或第二單體與第三單體的表面可以誘導位阻效應(steric hinderance)，通過此來誘導與所希望的表面的相互作用，從而可以防止利用自然狀態的三聚體時誘發的錯配。即，例如在本發明中，可以在形成第一單體的臼與第三單體的杵的表面上誘導相互作用，在第二單體與第三單體之間誘導位阻效應；或者可以在形成第二單體的臼與第三單體的杵的表面上誘導相互作用，在第一單體與第三單體之間誘導位阻效應。
另一方面，在蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction)中，重要的三種相互作用(a)氫鍵(hydrogen bond)=2.4-3.2Å，b)疏水性相互作用(hydrophobic interaction)=3.2-3.9Å，c)電荷相互作用(charge interaction)=～4Å)通常都在4Å以內的距離上發生。
因此，在本發明的第一單體、第二單體或第三單體的氨基酸殘基中，上述第一單體的一個以上氨基酸殘基與第三單體的氨基酸殘基可以位於6Å以下的距離處，上述第二單體的一個以上氨基酸殘基與第三單體的一個以上氨基酸殘基可以位於6Å以下的距離處。較佳地，上述第一單體的一個以上氨基酸殘基與第三單體的氨基酸殘基可以位於4Å以下的距離處，上述第二單體的一個以上氨基酸殘基與第三單體的一個以上氨基酸殘基可以位於4Å以下的距離處。更佳地，上述第一單體的一個以上氨基酸殘基與第三單體的氨基酸殘基可以位於2Å至4Å的距離處，上述第二單體的一個以上氨基酸殘基與第三單體的一個以上氨基酸殘基可以位於2Å至4Å的距離處。
因此，可以在二聚體與單體之間的6Å以下的距離處選擇氨基酸殘基，較佳地，可以在二聚體與單體之間的4Å以下的距離處選擇氨基酸殘基，更佳地，可以在二聚體與單體之間的2Å至4Å的距離處選擇氨基酸殘基，例如，在由4-1BBL單體與二聚體形成的情况下，細胞因子可以為選自由F92、F238、Q94、F144、V234、Q146、E148、F199、Y142、L203、R202、Q200及A180組成的群組中的一種以上。
上述氨基酸的變異位點基於NCBI的TNFSF9(TNF超家族成員9(TNF superfamily member 9))的氨基酸序列來决定(檢索號(accession number)：NM_003811.3)。
更佳地，可以通過引起各單體的氨基酸變異來形成杵臼結構。因此，上述氨基酸殘基可以為選自由F92W、F238V、Q94S、Q94Y、F144I、V234H、V234F、V234R、Q146S、E148G、F199L、Y142T、L203A、R202V、R202W、R202F、F199W及A180E組成的群組中的一種以上。
更佳地，上述氨基酸殘基可以通過兩個氨基酸殘基組成對來形成杵臼。更加較佳地，上述氨基酸殘基的特徵在於，通過R202W與Q94S組成對來形成杵臼結構。
在細胞因子中，例如在4-1BBL中，可以製備二聚體(通過接頭連接第一單體與第二單體)的E148G(形成臼(Hole))與單體(第三單體)的A180E(形成杵(Knob))形成杵臼的三聚體。並且，可以製備二聚體(通過接頭連接第一單體與第二單體)的R202V(形成臼)與單體(第三單體)的V234R(形成杵)形成杵臼的三聚體。同時，可以製備二聚體(通過接頭連接第一單體與第二單體)的Q94S(形成臼)與單體(第三單體)的R202W(形成杵)形成杵臼的三聚體。
根據本發明的一實施例，在細胞因子中，例如在4-1BBL中，製備了二聚體(通過接頭連接第一單體與第二單體)的Q94S(形成臼)與單體(第三單體)的R202W(形成杵)形成杵臼的三聚體。
同時，如圖2所示，在形成如上所述的杵臼結構的二聚體與單體之間形成兩個表面(Interface A、Interface B(杵臼(KiH))。因此，本發明在Interface B(採用杵臼(KiH)的對側表面)可以保持自然形態的表面，從而以最小化的變化來實現選擇性的三聚體化。因此，本發明的三聚體的特徵在於，保持三個單體平行的三聚體(parallel trimer)結構。
在本發明的融合蛋白中，上述抗原結合結構域為抗體或抗體片段。
在本發明的融合蛋白中，上述抗體或抗體片段只要是能夠與目標的抗原結合的抗體或其片段，就可以不受限制地使用。在本發明的一實施例中，製備包含選自由利妥昔單抗(rituximab)、西妥昔單抗(cetuximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)及阿維魯單抗(avelumab)組成的群組中的一種抗體及細胞因子三聚體結構域的融合蛋白。
上述抗體片段可以包含輕鏈可變區及重鏈可變區，較佳地，可以為選自由Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、di-scFv及VHH(重鏈抗體的重鏈可變區(variable heavy chain domains of heavy chain antibody))組成的群組中的一種以上。
尤其，上述抗體片段通過N末端或C末端與細胞因子三聚體連接來形成融合蛋白。更佳地，上述抗體片段可以為具有下述結構的F(ab')2：上述F(ab')2的第一鉸鏈(Hinge)與通過接頭連接的第一單體或第二單體連接；上述F(ab')2的第二鉸鏈與第三單體連接。
在本發明的融合蛋白中，上述細胞因子的特徵在於，在自然狀態下通過三聚體與受體結合。
因此，較佳地，上述細胞因子可以為能夠在自然狀態下形成三聚體的腫瘤壞死因子超家族，較佳地，可以為選自由TNFα、Dif、Necrosin、TNFβ、TNFSF1B、TNFγ、CD252、Gp34、CD134L、CD154、TRAP、Gp39、T-BAM、CD178、APTL、CD95L、CD70、CD153及4-1BBL組成的群組中的一種以上，更佳地，可以為4-1BBL。
根據本發明的一實施例，在本發明的融合蛋白中，使用上述4-1BB的全部序列(檢索號：NM_003811.3)中向細胞外部露出的球形蛋白質結構域(G90-T241)，上述4-1BBL的特徵在於，包含由序列17表示的氨基酸序列。
GMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVT(序列17)。
更佳地，上述融合蛋白中所包含的三聚體4-1BBL可以具有下述結構：第一4-1BBL單體與第二4-1BBL單體通過接頭連接；第一4-1BBL單體或第二4-1BBL單體的一個以上氨基酸殘基與第三4-1BBL單體的一個以上氨基酸殘基形成杵臼結構。
通過本發明一實施例製備的基於4-1BBL的融合蛋白的結構如圖1所示。本發明的融合蛋白由圖1的A部分所示的單位蛋白構成，具有圖1的B部分所示的結構。更具體地，由如下三種構成：1)包含4-1BB配體二聚體的抗體重鏈；2)包含4-1BB配體單體的抗體重鏈；以及3)抗體的輕鏈。在圖1的B部分中，上端部的抗原結合片段通過鉸鏈與下端部的4-1BB配體三聚體連接。複合體的形成通過存在於鉸鏈中的兩個二硫鍵和存在於4-1BB配體三聚體之間的疏水性相互作用來實現。尤其，配體三聚體之間的疏水性相互作用通過杵臼模塊在4-1BB配體二聚體與4-1BB配體單體之間選擇性地形成，通過此可以大幅提高蛋白質的物性和純度。4-1BBL單體已知具有包含杵的結構，這是防止單體所包含的重鏈的同種三聚體化所必需的。4-1BB配體二聚體通過存在與兩個單體之間的短的氨基酸接頭來連接，在相應的單體的與“杵”發生相互作用的位點具有“臼”。
在基於上述內容的本發明的細胞因子三聚體結構域的具體例中，可以包含單體及二聚體，上述單體包含由序列1表示的氨基酸序列，上述二聚體包含由序列2表示的氨基酸序列。在上述二聚體中，兩個單體可以在第170位氨基酸序列(G)中通過接頭連接。或者，可以包含單體及二聚體，上述單體包含由序列3表示的核苷酸序列，上述二聚體包含由序列4表示的核苷酸序列。在上述二聚體中，兩個單體可以在第508位-第510位核苷酸序列的GGA中通過接頭連接。
在本發明的細胞因子三聚體結構域的再一具體例中，可以包含單體和二聚體，上述單體包含由序列5表示的氨基酸序列(在第202位氨基酸序列中，由R變異為W)，上述二聚體包含由序列6表示的氨基酸序列(在第94位氨基酸序列中，由Q變異為S)。在上述二聚體中，兩個單體可以在第170位氨基酸序列(G)中通過接頭連接。同時，上述單體與二聚體可以在上述氨基酸變異的位置形成杵臼結構。或者，可以包含單體和二聚體，上述單體包含由序列7表示的核苷酸序列(在第202位氨基酸序列中，由AGA變異為TGG)，上述二聚體包含由序列8表示的核苷酸序列(在第94位氨基酸序列中，由CAG變異為AGC)。在上述二聚體中，兩個單體可以在第508位-第510位核苷酸序列的GGA中通過接頭連接。
在本發明的細胞因子三聚體結構域的還有一具體例中，可以包含單體和二聚體，上述單體包含由序列9表示的氨基酸序列(在第180位氨基酸序列中，由A變異為E)，上述二聚體包含由序列10表示的氨基酸序列(在第148位氨基酸序列中，由E變異為G)。在上述二聚體中，兩個單體可以在第170位氨基酸序列(G)中通過接頭連接。同時，上述單體與二聚體可以在上述氨基酸變異的位置形成杵臼結構。或者，可以包含單體和二聚體，上述單體包含由序列11表示的核苷酸序列(在第180位氨基酸序列中，由GCT變異為GAA)，上述二聚體包含由序列12表示的核苷酸序列(在第148位氨基酸序列中，由CAA變異為GGA)。在上述二聚體中，兩個單體可以在第508位-第510位核苷酸序列的GGA中通過接頭連接。
在本發明的細胞因子三聚體結構域的另一具體例中，可以包含單體和二聚體，上述單體包含由序列13表示的氨基酸序列(在第234位氨基酸序列中，由V變異為R)，上述二聚體包含由序列14表示的氨基酸序列(在第202位氨基酸序列中，由R變異為V)。在上述二聚體中，兩個單體可以在第170位氨基酸序列(G)中通過接頭連接。同時，上述單體與二聚體可以在上述氨基酸變異的位置形成杵臼結構。或者，可以包含單體和二聚體，上述單體包含由序列15表示的核苷酸序列(在第234位氨基酸序列中，由GTG變異為AGA)，上述二聚體包含由序列16表示的核苷酸序列(在第202位氨基酸序列中，由AGA變異為GTG)。在上述二聚體中，兩個單體可以在第508位-第510位核苷酸序列的GGA中通過接頭連接。
因此，在本發明的融合蛋白中，可以包含選自由包含含有由序列1表示的氨基酸序列的單體以及含有由序列2表示的氨基酸序列二聚體的細胞因子三聚體結構域、包含含有由序列5表示的氨基酸序列的單體及含有由序列6表示的氨基酸序列的二聚體的細胞因子三聚體結構域、包含含有由序列9表示的氨基酸序列的單體及含有由序列10表示的氨基酸序列的二聚體的細胞因子三聚體結構域以及包含含有由序列13表示的氨基酸序列的單體及含有由序列14表示的氨基酸序列的二聚體的細胞因子三聚體結構域組成的群組中的一種細胞因子三聚體結構域。
本發明所屬技術領域的普通技術人員應該明確的是，上述由序列1、序列2、序列5、序列6、序列9、序列10、序列13及序列14表示的氨基酸序列在包括發揮與之同等的生物學活性的氨基酸序列的變異方面是受限的。這樣的氨基酸變異基於氨基酸側鏈取代物相對相似性，例如，基於疏水性、親水性、電荷、大小等來形成。通過對氨基酸側鏈取代物的代銷、形狀及種類的分析可知：精氨酸、賴氨酸及組氨酸都是帶陽電荷的殘基；丙氨酸、甘氨酸及絲氨酸具有相似的大小；苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸具有相似的形狀。因此，基於這些考慮事項，可以在生物學上將精氨酸、賴氨酸及組氨酸；丙氨酸、甘氨酸及絲氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸看作功能等同物。
在導入變異方面，可以考慮氨基酸的疏水指數(hydropathic index)。根據疏水性和電荷賦予各氨基酸疏水指數：異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；穀氨醯胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。
在賦予蛋白質或肽的交互生物功能(interactive biological function)方面，氨基酸的疏水指數非常重要。使用具有相似疏水指數的氨基酸取代才能保有相似的生物活性，這是公知的事實。在參照疏水指數導入變異的情况下，較佳地，在疏水指數差為±2以內的氨基酸之間取代，更佳地，在疏水指數差為±1以內的氨基酸之間取代，更加較佳地，在疏水指數差為±0.5以內的氨基酸之間取代。
另一方面，衆所周知的是，具有相似的親水值(hydrophilicity value)的氨基酸之間的取代也引起具有同等生物活性的蛋白質或肽。賦予各氨基酸殘基如下親水值：精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；穀氨醯胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
在參照親水值導入變異的情况下，較佳地，在親水值差為±2以內的氨基酸之間取代，更佳地，在親水值差為±1以內的氨基酸之間取代，更加較佳地，在親水值差為±0.5以內的氨基酸之間取代。
在整體上不變更分子活性的肽中的氨基酸交換是本發明所屬技術領域中公知的(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979)。最通常發生的交換是氨基酸殘基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly間的交換。
若考慮上述具有生物學同等活性的變異，則本發明的由序列1、序列2、序列5、序列6、序列9、序列10、序列13及序列14表示的氨基酸序列應解釋為包含與序列表中記載的序列實質相同(substantial identity)的序列。上述實質相同是指，將本發明的由序列1、序列2、序列5、序列6、序列9、序列10、序列13及序列14表示的氨基酸序列與任意其他序列對齊後，當利用本發明所屬技術領域的通常使用的算法分析對齊的序列時，最少顯出80%以上的同源性，更優先地，顯出90%以上的同源性。用於序列比較的對其方法可以不受限制地使用本發明所屬技術領域中公知的任意方法。
同時，由序列3、序列4、序列7、序列8、序列11、序列12、序列15及序列16表示的核苷酸序列可以包含與由上述序列3、序列4、序列7、序列8、序列11、序列12、序列15及序列16表示的核苷酸序列具有70%以上的序列同源性的核苷酸序列，更佳地，可以包含具有80%以上的序列同源性的核苷酸序列，更加較佳地，可以包含具有90%以上的序列同源性的核苷酸序列，最佳地，可以包含具有95%以上的序列同源性的核苷酸序列。有關核苷酸序列的“序列同源性的”通過比較兩個以最佳方式排列的比較區域來確認，相對於兩個序列的最佳排列的參考序列(不包含追加或刪除)，比較區域中的核苷酸序列的一部分可以包含追加或刪除(即，缺口)。
如前所述，在本發明的融合蛋白的細胞因子三聚體結構域中，杵臼結構的特徵在於，通過分別在單體和二聚體中發生的氨基酸變異來生成。這是為了在自然狀態下以三聚體存在的腫瘤壞死因子超家族的三聚體組裝中，防止在發生連接抗體(Fab)的鉸鏈部分的序列上的錯誤安裝(misassembly)的同時生成錯配的二硫化物(mismatched disulfide)。
並且，本發明提供編碼本發明的融合蛋白的多核苷酸。
同時，本發明提供包含編碼本發明的融合蛋白的多核苷酸的載體。
上述載體的示意圖如圖17所示。如圖17所示，本發明的特徵在於，在載體的基因位點包含輕鏈、重鏈二聚體和/或重鏈單體。
並且，本發明提供用於生產融合蛋白的載體組合物，包含：第一載體，編碼Fab的重鏈的多核苷酸與編碼通過接頭連接的第一單體和第二單體的多核苷酸可操作地連接；第二載體，編碼Fab的重鏈的多核苷酸與編碼第三單體的多核苷酸可操作地連接；以及第三載體，包含編碼Fab的輕鏈的多核苷酸。
在使用上述用於生產融合蛋白的載體組合物的情况下，可以在分別製備三聚體中的二聚體及Fab重鏈、三聚體中的單體及Fab重鏈後，誘導三聚體的形成。
在本發明中，上述“載體”是指為了能夠在適當的宿主內表達目標基因而包含以可操作性的方式與適當的調節序列連接的基因的核苷酸序列的基因製備物，上述調節序列可以包含開始轉錄的啓動子、用於調節該轉錄的算子序列以及調節轉錄及解讀的終止的序列。本發明的載體只要是能夠在細胞內複製的就不受特別限制，可以使用本發明所屬技術領域中公知的任意載體，例如，可以為質粒、柯斯質粒、噬菌體顆粒、病毒載體。
同時，本發明提供融合蛋白的生產方法，包括向宿主細胞轉染包含編碼本發明的融合蛋白的多核苷酸的載體的步驟。
並且，本發明還提供融合蛋白的生產方法，包括向宿主細胞轉染包含用於生產上述融合蛋白的載體組合物的步驟，上述載體組合物包含：第一載體，編碼Fab的重鏈的多核苷酸與編碼通過接頭連接的第一單體和第二單體的多核苷酸可操作地連接；第二載體，編碼Fab的重鏈的多核苷酸與編碼第三單體的多核苷酸可操作地連接；以及第三載體，包含編碼Fab的輕鏈的多核苷酸。
在本發明中，“重組載體”在以可操作的方式與所要表達的目標多肽的編碼基因連接的情况下，可以用作能夠在適當的宿主細胞中高效表達上述目標多肽的目標多肽的表達載體，上述重組載體可以在宿主細胞中表達。較佳地，宿主細胞可以為真核細胞，可以根據宿主細胞的種類適當選擇啓動子(promoter)、終止子(terminator)、增强子(enhancer)等表達調節序列、用於膜靶向化或分泌的序列等並根據目的多種多樣地組合。
根據本發明的一實施例，確認到本發明的包含抗原結合結構域以及細胞因子三聚體結構域融合蛋白對抗原的結合能力比母抗體優秀，對細胞因子目標受體的結合能力比母抗體優秀，確認到可以同時結合，可以成功誘導表達各目標(蛋白質)的細胞的結合。
同時，本發明提供抗體與腫瘤壞死因子超家族三聚體的融合蛋白的生產方法，上述腫瘤壞死因子超家族形成包含二聚體及腫瘤壞死因子超家族的第三單體的三聚體，上述二聚體包含腫瘤壞死因子超家族的第一單體及第二單體，上述生產方法包括：步驟1)，在存在於上述二聚體與第三單體之間的兩個表面中選擇一個表面；步驟2)，在第一單體或第二單體以及第三單體中各選擇一個在上述所選擇的一個表面中的第一單體或第二單體與第三單體之間位於6Å以下的距離處的氨基酸對；步驟3)，在上述選擇的氨基酸對中的第三單體位點誘導突變來形成杵；步驟4)，篩選與上述第三單體的杵配對並引起結構碰撞的野生型的第一單體或第二單體的氨基酸殘基；步驟5)，在上述篩選的第一單體或第二單體的氨基酸殘基中誘導突變來形成臼；以及步驟6)，誘導上述第三單體的杵與第一單體或第二單體的臼的杵臼相互作用。在上述二聚體及第三單體中連接有Fab的重鏈。
在上述抗體與腫瘤壞死因子超家族三聚體的融合蛋白的生產方法的上述步驟2)中，上述氨基酸對可以位於在一個表面的第一單體或第二單體與第三單體之間的6Å以下的距離處，較佳地，可以位於4Å以下的距離處，更佳地，可以位於2Å至4Å的距離處。
在上述抗體與腫瘤壞死因子超家族三聚體的融合蛋白的生產方法中，引起有關杵的結構衝突的氨基酸殘基可以通過模擬(simulation)將相關殘基更換為作為候選(Candidate)的選自由甘氨酸(Glycine，G)、纈氨酸(Valine，V)、絲氨酸(Serine，S)及丙氨酸(Alanine，A)組成的群組中的任一種氨基酸殘基來類推。
同時，本發明的特徵在於，在上述步驟1)中選擇的表面中形成杵臼結合，在剩下的未選擇的表面的單體之間誘導位阻效應。可以通過上述位阻效應誘導與所希望的表面的相互作用。由此可以防止利用自然狀態的三聚體生產融合蛋白時可能誘發的連接抗體(Fab)的鉸鏈部分的錯配二硫化物的生成。
根據本發明的一實施例，確認到在不採用杵臼結構的細胞因子與抗體結合的融合蛋白的情况下，在半胱氨酸殘基配對形成二硫鍵的鉸鏈區附近發現未配對的半胱氨酸殘基，或者發現三個鉸鏈都非對稱地形成配對的二硫鍵。
因此，本發明的生產方法是能夠防止所生產的抗體與腫瘤壞死因子超家族三聚體的融合蛋白中出現因鉸鏈部分非正常二硫鍵引起的不均勻性的最佳方法，可以增大融合蛋白的生產性和純度，是能夠將上述融合蛋白提供為更為穩定的治療用蛋白質的方法。
上述二聚體的特徵在於，為通過接頭連接的第一單體與第二單體。上述二聚體的特徵在於，第一單體的N或C末端與第二單體的N或C末端通過接頭相互連接。上述接頭只要是本發明所屬技術領域中公知的接頭中能夠連接細胞因子的第一單體與第二單體的接頭就可以不受限制地使用。
並且，在上述抗體片段(Fab)中，只要是能夠與目標抗原結合的抗體片段就可以不受限制地使用。
同時，本發明提供通過上述生產方法生產的抗體與腫瘤壞死因子超家族三聚體的融合蛋白。
在通過上述生產方法生產的抗體與腫瘤壞死因子超家族三聚體的融合蛋白中，可以同樣適用前述有關融合蛋白的說明。
並且，本發明提供包含本發明的融合蛋白的用於預防或治療因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病的藥物組合物。
並且，本發明提供治療因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病的方法，包括向對象施用本發明的融合蛋白的步驟。
較佳地，上述對象為包括人類在內的哺乳動物，包括需要治療因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病的患者、正在治療因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病的患者以及已經治療因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病的患者，還可以包括已接受因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病的手術治療的患者。
另外，本發明的融合蛋白可以與現有的藥物或治療方法結合來治療因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病。當與本發明的融合蛋白併用治療時，可以與其他藥物或治療方法共同或依次處理來治療因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病。
上述因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病可以為選自由癌症、免疫疾病、自身免疫性疾病、中樞神經疾病、退行性神經疾病、自身免疫性疾病及炎症性疾病組成的群組中的一種以上，上述癌症可以為選自由乳腺癌、肺癌、大腸癌及結腸直腸癌組成的群組中的一種以上。
在本發明中，上述藥物組合物的特徵在於，可以為膠囊、片劑、顆粒、注射劑、軟膏劑、粉末或飲料形態，上述藥物組合物的特徵在於，以人類為對象。上述藥物組合物可以根據通常的方法配製為散劑、顆粒劑、膠囊、片劑、水性懸浮液等口服劑型、外用劑、栓劑及滅菌注射溶液的形態來使用，但不限定於此。
本發明的藥物組合物可以包含藥學上可接收的載體。口服給藥時，藥學上可接受的載體可以使用結合劑、滑澤劑、崩解劑、賦形劑、可溶劑、分散劑、穩定劑、懸浮化劑、色素、香料等，在注射劑的情况下，可以混合緩衝劑、保存劑、無痛化劑、可溶劑、等滲劑、穩定劑等來使用，在局部給藥用的情况下，可以使用基劑、賦形劑、潤滑劑、保存劑等。本發明的藥物組合物的劑型可以通過與上述藥學上可接收的載體混合來多種多樣地製備。例如，口服給藥時可以製備為片劑、包衣片劑、膠囊、藥水(elixir)、緩釋片、糖漿劑、圓片等形態，注射劑可以製備為單位給藥安碚瓶或多次給藥的形態。
另一方面，適於製劑化的載體、賦形劑及稀釋劑的例可以使用乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、海藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂或礦物油等。並且，還可以包含填充劑、抗凝劑、潤滑劑、濕潤劑、香料、乳化劑、防腐劑等。
本發明的藥物組合物的給藥途徑包括口服、靜脈內、肌肉內、動脈內、骨髓內、硬膜內、心臟內、經皮、皮下、腹腔內、鼻腔內、腸道、病灶、舌下或直腸，但不限定於此。上述“胃腸外”包括皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、滑膜腔內、胸骨內、硬膜內、病灶內及顱骨內注射或注入技術。本發明的藥物組合物還能夠以用於直腸給藥的栓劑的形態來給藥。
本發明的藥物組合物可以根據包括所使用的特定有效成分的活性、年齡、體重、一般健康狀况、性別、飲食、給藥時間、給藥途徑、代謝率、藥物配合及所要預防或治療的特定疾病的嚴重程度在內的多種因素來多種多樣地變化，上述藥物組合物的給藥量可以通過相關從業者根據患者的狀態、體重、疾病的程度、藥物形態、給藥途徑及期間來適當地選擇。較佳地，可以在考慮上述所有因素的情况下以不引起副作用的最小的量獲得最大效果的量來給藥，更佳地，以1μg/體重kg/day～10000μg/體重kg/day的有效劑量一天分數次給藥，更加較佳地，以10mg/體重kg/day～1000mg/體重kg/day的有效劑量一天分數次給藥。上述給藥量無論在哪個方面都不限定本發明的範圍。
上述本發明的內容只要不相互矛盾，就可以同等地採用，本發明所屬技術領域的普通技術人員加以適當變更來實施的也應包括在本發明的範疇內。
以下，通過實施例詳細說明本發明，但本發明的範圍不限定於下述實施例。
實驗例1．準備細胞株
利用Freestyle 293F表達培養液(Gibco™，12338018)在37℃、8% CO 2的條件下，以120RPM的轉速懸浮培養Freestyle293F細胞株(Gibco™，R79007)。同時，利用向RPMI1640(Welgene公司)加入10%(v/v)的胎牛血清(FBS，Fetal bovine serum，Gibco™)的培養液以37℃、8% CO 2的條件培養Raji-B細胞株(CCL-86™，ATCC公司)、MDA-MB-231細胞株(HTB-26™，ATCC公司)、SW-480細胞株(10228，KCLB公司)，利用向DMEM(Welgene公司)中加入10%(v/v)的胎牛血清的培養液以37℃、5% CO 2的條件培養PC-9細胞株(CVCL_B260)以及HT-29細胞株(HTB-38™，ATCC公司)。
實施例1．製備連接細胞因子三聚體結構域與抗體結構域的融合蛋白
1-1．準備基因
為了構成本發明的融合蛋白，設計如下三種編碼序列：1)抗體的輕鏈，2)抗體重鏈的抗原結合位點C末端連接4-1BB配體單體的序列，3)抗體重鏈的抗原結合位點C末端連接4-1BB配體二聚體的序列。
其中，使用人類4-1BB配體蛋白，利用Geneart合成與此相關基因(NM_003811.3)。在本發明中使用了4-1BB配體蛋白的全部序列中向細胞外部露出的球形蛋白結構域(G90-T241)。基因的克隆及突變生成利用Gateway克隆(gateway cloning)來進行。
1-2．製備用於生產融合蛋白的載體
為了製備抗體的Fc位點替換為細胞因子三聚體的融合蛋白(以下稱為“RACE”(受體-抗體共軛(細胞)銜接物))，製備了有關Fab重鏈與細胞因子二聚體的第一載體、有關Fab重鏈與細胞因子單體的第二載體以及有關輕鏈的第三載體。
在此情况下，在作為細胞因子的4-1BB配體的三聚體結構域中，通過利用Pymol software和Dynamut server(http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut/)的模擬來選定用於形成突變的氨基酸殘基。
構成了以4-1BB配體的一部分序列(G90-T241)作為單位體的三聚體結構域。具體地，為了大幅提高製備的三聚體的物性和純度，防止包含單體的重鏈的同源三聚體化，利用杵臼結構來形成三聚體。為此，利用1)包含4-1BB配體二聚體的抗體重鏈，以及2)包含4-1BB配體單體的抗體種重鏈，只在二聚體及單體之間存在的兩個表面中的一個表面上形成杵臼，從而以最小的變化實現選擇性的三聚體化。杵在4-1BB配體單體中形成，臼在4-1BB配體的二聚體中的一個形成。三聚體的各單元和它們的結合形態如圖1所示，能夠在各單元的表面形成的杵臼如圖2所示。
基於人類4-1BBL蛋白複合物結構(PDB code：6A3V，2X29)利用Pymol software(https://pymol.org/2/)來進行如上所述形成的三聚體結構域的結構分析。
通過此確認的4-1BB配體二聚體與單體之間的相互作用位點如圖3所示。
如圖3所示，在相互作用表面中確認到位於小於4Å的距離處的氨基酸(圖3的A部分)。同時，在圖3的B部分中以虛線(氫鍵)或實線(疏水性相互作用)示出圖3的A部分中各氨基酸形成的相互作用。
在如上所述導出的氨基酸殘基中誘發變異來在二聚體與單體之間形成杵臼結構，通過突變誘發(mutagenesis)預測的野生型與各變異的杵臼形成與否的示意圖如圖4所示。
上述4-1BB配體在自然狀態下以三聚體的形式存在。在上述三聚體的組裝過程中，連接抗體(Fab)的鉸鏈部分的序列上的錯誤安裝的同時生成錯配的二硫化物。為了解决這個問題，本發明利用杵臼結構來生產三聚體。
如圖4所示，若不在單體的氨基酸殘基發生變異，則不形成杵臼結構(圖4中的左側)，若只在單體的氨基酸殘基發生變異，只在發生變異的表面一側應用杵，與自然狀態的表面的相互作用會受到位阻效應(圖4中的中心)。因此，當如本發明一樣在兩個單體的氨基酸都發生變異時，分別應用杵與臼，從而可以形成穩定的互補結構(參考圖4中的右側)。
考慮到上述內容，製備了有關插入抗體及野生型細胞因子序列的重鏈-細胞因子(二聚體)的第一載體、有關重鏈-細胞因子(單體)的第二載體、有關抗體輕鏈的第三載體。然後，在上述二聚體及單體中誘導突變來誘導杵臼結構的形成。
更具體地，在上述杵臼結構的形成方面，以二聚體(第一單體與第二單體通過接頭來連接)的Q94S(形成臼)與單體(第三單體)的R202W(形成杵)形成杵臼的方式來製備。
首先，依靠Geneart(Thermofisher公司)合成用於克隆(cloninig)的模板(template，(抗體的重鏈、抗體的輕鏈、4-1BBL(WT)二聚體以及單體))。在此情况下，在上述二聚體中，在第508-510為核苷酸序列中放入相當於接頭的GGA(甘氨酸)序列來合成。並且，使用利妥昔單抗(Drugbank accession number(DB00073))、西妥昔單抗(Drugbank accession number(DB00002))、曲妥珠單抗(Drugbank accession number(DB00072))或阿維魯單抗(Drugbank accession number(DB11945))這四種抗體作為上述抗體。然後，基於pCMV載體利用Gateway克隆進行各個克隆。更具體地，製備向pCMV載體的多克隆位點(MCS，multiple cloning site)插入通過抗體重鏈(VH-CH1-鉸鏈)的末端連接4-1BBL-接頭-4-1BBL(二聚體)的抗體重鏈-細胞因子二聚體的第一載體。為此，利用下述表1所示的引物擴增有關抗體重鏈的第一個片段、有關4-1BBL二聚體中第一個單體的第二個片段、有關4-1BBL二聚體中第二個單體的第三個片段後進行Gateway克隆。
表1
方向 序列(5'→3') SEQ ID NO
第一個片段 正向 tacacgtacttagtcgctgaagctcttcTATGGGATGGAGCTATATC 18
第一個片段 反向 taggtacgaactcgattgacggctcttcATCCCCCCAGGAGTTCAGG 19
第二個片段 正向 tacacgtacttagtcgctgaagctcttcAGGAGGCATGTTTGCCCAGC 20
第二個片段 反向 taggtacgaactcgattgacggctcttcAGCCTCCTGTCACTCTGAACAGGCC 21
第三個片段 正向 tacacgtacttagtcgctgaagctcttcAGGCATGTTTGCCCAGC 22
第三個片段 反向 aggtacgaactcgattgacggctcttcAGAGTTATGTCACTCTGAACAGGCC 23
同時，製備向pCMV載體的多克隆位點(MCS)插入通過抗體重鏈(VH-CH1-鉸鏈)的末端連接4-1BBL的抗體重鏈-細胞因子單體的第二載體。為此，利用下述表2所示的引物擴增有關抗體重鏈的第一個片段及有關4-1BBL單體的第二個片段後進行Gateway克隆。
表2
方向 序列(5'→3') SEQ ID NO
第一個片段 正向 tacacgtacttagtcgctgaagctcttcTATGGGATGGAGCTATATC 24
反向 taggtacgaactcgattgacggctcttATCCCCCCAGGAGTTCAGG 25
第二個片段 正向 tacacgtacttagtcgctgaagctcttcAGGAGGCATGTTTGCCCAGC 26
反向 aggtacgaactcgattgacggctcttcAGAGTTATGTCACTCTGAACAGGCC 27
並且，製備了向pCMV載體的多克隆位點插入抗體輕鏈的第三載體。在此情况下，利用下述表3所示的引物擴增片段後進行Gateway克隆。
表3
方向 序列(5'→3') SEQ ID NO
單個片段 正向 TACACGTACTTAGTCGCTGAAGCTCTTCTAGATCTGTGGCTGCACCA 28
反向 AGGTACGAACTCGATTGACGGCTCTTCATCTCTTCACTTCCACCTT 29
然後，進行用於在上述第一載體的二聚體及第二載體的單體中應用突變的Gateway克隆。在此情况下，使用下述表4所示的引物。結果，在第一載體的二聚體中應用Q94S的突變，第二載體的單體中應用R202W的突變。
表4
方向 序列(5'→3') SEQ ID NO
二聚體 (Q94S) 正向 tacacgtacttagtcgctgaagctcttcTagcCTGGTGGCCCAGAATG 30
反向 taggtacgaactcgattgacggctcttcAgctGGCAAACATGCCTCC 31
單體 (R202W) 正向 tacacgtacttagtcgctgaagctcttcTtggCTGCTGCACCTGTCTG 32
反向 gtacgaactcgattgacggctcttcAccaGCCTTGGAAGCCAAAGGC 33
通過基因排序(sequencing)確認各基因的插入與否並驗證序列(委托Cosmogenetech公司)。
1-3．利用第一載體、第二載體及第三載體轉染及生產RACE
為了RACE的轉染及表達，使用了上述實驗例1中準備的Freestyle293F細胞。在轉染24小時前，以1×10 6/ml的濃度準備Freestyle293F細胞株。在上述細胞中利用Fectopro(Polyplus，116-010)試劑以及在上述內容中準備的第一載體、第二載體及第三載體進行轉染。更具體地，進行向酶1ml的細胞株加入1μg的脫氧核糖核酸(DNA)(以1∶1∶2的體積比例混合第一載體、第二載體以及第三載體)、1μl的Fectopro試劑的方法。將臨時轉染的細胞追加懸浮培養5天後(37℃、8% CO 2、120RPM)，以1500g離心分離30分鐘來分離包含分泌型蛋白質的上清液。為了之後的純化，將分離的上層液冷藏保管最多三天。
實施例2．RACE的純化及純度分析
利用AKTA go(Cytiva公司)和親和層析法(affinity chromatography)從上述實施例1-2-3中獲得的上清液中純化RACE。親和層析法使用CH1-xL column(Thermo公司)。在使用前製備、過濾層析法中使用的洗滌溶液(磷酸鹽緩衝溶液(PBS)，pH7.4)和洗脫溶液(100mM的乙酸鈉(sodium acetate)pH4.0)並測定pH後使用。在通過洗脫獲得的分餾物中收集包含蛋白質的分餾物，將其利用磷酸鹽緩衝溶液通過Amicon® Ultra(30kda，15ml)過濾器透析來保管。
為了分析純化的RACE的純度，利用高效液相色譜(HPLC(high-performance liquid chromatography)，agilent 1260)進行尺寸排阻色譜(PL1580-3250，agilent公司)。通過尺寸排阻色譜的大約的蛋白質的大小的預測是通過利用已知大小的標準蛋白質(5190-2242，agilent公司)的試驗確定的。純度分析中使用150mM的磷酸鈉(sodium phosphate pH 7.0)的緩衝液。
結果如圖5所示。本發明的阿維魯單抗-41BBL(RACE-04L)的純度為97.24%(參考圖5內的PD-L1 targeting(4AL)曲線圖)，西妥昔單抗-41BBL(RACE-02B)的純度為96.47%(參考圖5內的EGFR targeting(Cetuximab)曲線圖)，曲妥珠單抗-41BBL(RACE-02C)的純度為96.91%(參考圖5內的HER2 targeting(Herceptin)曲線圖)，根據本發明製備的RACE均顯出優秀的生產性及純度。
同時，在本發明的利妥昔單抗-41BBL(RACE-01C)中，在應用杵臼(Q94S/R202W)的情况下，如圖6的A部分所示，確認到4-1BB配體二聚體(臼)與4-1BB配體單體(杵)成功構成4-1BB配體三聚體，確認到這樣的三聚體由包含臼(Q94S)的重鏈-二聚體、包含杵(R202W)的重鏈-單體以及輕鏈構成。同時，通過與上述相同的方法進行本發明的利妥昔單抗-41BBL(RACE-01C)的純化及純度分析的結果，顯出與具有Fc二聚體的正常抗體相似程度的生產量(圖6的B部分)，在基於CH1的一次純化後，確認到分離出96%以上的高純度的蛋白質(圖6的C部分)。
實施例3．RACE的結構分析
基於人類4-1BBL蛋白複合物結構(PDB code：6A3V，2X29)利用Pymol software(https://pymol.org/2/)來分析4-1BBL三聚體結構域的結構。
結果如圖7及圖8所示，確認到構成二聚體的4-1BBL a的C末端與4-1BBL b的N末端通過G 1-G 4S之間的短的肽接頭連接，從而對包含4-1BB配體二聚體的重鏈的穩定表達做出貢獻。並且，確認到通過在二聚體中形成臼在單體中形成杵來構成三聚體。
實施例4．確認對錯配給三聚體的形成帶來的影響
在與本發明的RACE結合的4-1BB配體中，通過LC(Vanquish，Thermo公司)、MS(Q Exactive Plus，Thermo公司)分析二硫鍵來確認杵臼結構的應用給蛋白質鉸鏈帶來的影響。為了形成蛋白質切片，使用1mg/ml濃度的分析試樣和標準試樣，例如，蛋白內切酶(Endoproteinase Lys-C(Sigma公司，美國(USA)))、胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin(Promega公司))、Glu-C(Promega公司，Sequencing Grade)。
以如下方式準備上述分析試樣。在上述實施例1-2-1.及實施例1-2-2.的第二載體(抗體重鏈-單體)及第三載體(抗體輕鏈)中，將使用利妥昔單抗用作上述抗體，使用野生型4-1BBL用作上述單體的來製備的重組載體以與上述1-2-3.相同的方法同時轉染到Freestyle293F細胞中後，獲得過表達相關蛋白質的細胞的上清液。上述分析試樣為通過具有野生型的4-1BBL序列的RACE重鏈單體與輕鏈來製備的蛋白質，具有共有三個抗體結合片段(Fab)與鉸鏈區域的RACE三聚體的結構。在此情况下，通過觀察蛋白質鉸鏈中產生的不正常的二硫鍵的狀態確認到通過杵臼結構的鉸鏈的二聚體化對結構的穩定性、均勻性帶來的影響。
同時，為了確認通過二硫鍵多聚體化的蛋白質的特性，利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE，Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel)進行電泳(Mini-protein tetra，Bio-Rad公司)。在此情况下，在還原條件、非還原條件下比較各蛋白質的大小。利用考馬斯藍(Coomassie-blue)試劑染色電泳結束的凝膠，利用LAS-500(cytiva公司)分析結果。
如圖9所示，在未應用杵臼的自然狀態的4-1BB配體中，當4-1BB配體二聚體表示為A，4-1BB配體單體表示為B，輕鏈表示為L時，在過表達未應用杵的自然狀態的單體B和L的細胞株中觀察到組裝錯誤的B3L3、B2L2等物質(圖9的A部分中下端的SDS-PAGE結果)。尤其在具有三個鉸鏈的B3L3的情况下，在兩個半胱氨酸殘基通過配對來形成二硫鍵的鉸鏈區附近發現未配對的半胱氨酸殘基，或者發現三個鉸鏈都非對稱地形成配對的二硫鍵(參考圖9的B部分)。這種現象在同時處理糜蛋白酶與Lys-C的實驗組(YK)中表現得尤為突出，但在同時處理Glu-C與Lys-C的實驗組(EK)中表現得微乎其微。這樣的不均勻性是治療用蛋白質中絕不能有的特徵，明確確認到必須通過改良單體(賦予杵)來提高最終三聚體的純度和生產性的必要性。
實施例5．通過連接抗體結構域與細胞因子三聚體來製備的融合蛋白(RACE)及特性分析
5-1．大小分析
實施例1中製備的融合蛋白(RACE)平臺可以根據目的結合多種抗原結合片段，與抗體結構域結合的RACE的結構示意圖如圖10所示。
並且，在圖10中通過從N末端羅列至C末端來示出RACE的結構域結構。在本發明的融合蛋白中，通過鉸鏈連接的4-1BB配體的單體具有杵模塊，4-1BB配體的二聚體具有臼模塊。
5-2．熱漂移測定(TSA，Thermal shift assay)分析
利用SYPRO™ Orange(S6650，Thermo公司)試劑參考標準試驗方法進行RACE的穩定性及熔融溫度(Tm)值的測定(Curr Protoc Protein Sci. 2015；79: 28.9.1-28.9.14)。
比較利妥昔單抗-41BBL(RACE-01C)與作為其母抗體的利妥昔單抗的熱力學穩定性，比較曲妥珠單抗-41BBL(RACE-02C)與作為其母抗體的曲妥珠單抗的熱力學穩定性，如圖11所示。結果確認到，本發明的利妥昔單抗-41BBL(RACE-01C)及曲妥珠單抗-41BBL(RACE-02C)都具有65℃以上的Tm值，都具有與母抗體相似的特性。
5-3．測定結合親和度
通過利用表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)的Biacore(cytiva公司)確認本發明的西妥昔單抗-41BBL(RACE-02B)對抗原(EGFR)的結合。首先，為了測定結合力，在作為傳感器芯片的CM5芯片(29149604，cytiva公司)表面通過氨基偶聯(amine coupling)固定作為抗原的EGFR(10001-H08H，Sino公司)或4-1BB(10041-H08H，Sino公司)後，加入規定濃度的西妥昔單抗-41BBL(RACE-02B)。使用HEPES緩衝鹽水(HBS，HEPES-buffered saline)緩衝液確認180秒鐘時間的結合，300秒鐘時間的解離。
結果如圖12所示，本發明的西妥昔單抗-41BBL(RACE-02B)顯出與作為母抗體的西妥昔單抗相似的結合能力。
同時，如圖13所示，本發明的西妥昔單抗-41BBL(RACE-02B)能夠結合的結合位點在各單體之間各有一個共三個，顯出對4-1BB受體的穩定的接合狀態(圖13上端)，這比作為對4-1BB受體的凝集性抗體的烏托魯單抗(Pfizer公司，與4-1BB配體競爭性結合)顯出更為强力的結合能力。
5-4．確認RACE的同時結合能力
同時，確認了本發明的西妥昔單抗-41BBL(RACE-02B)對目標的同時結合能力。如圖14左側的示意圖所示，在CM5芯片表面固定4-1BB受體後，觀察與西妥昔單抗-41BBL(RACE-02B)的結合(A-I、D-I)，在此狀態下依次觀察追加的與EGFR的結合(A-II、D-II)。
結果確認到本發明的西妥昔單抗-41BBL(RACE-02B)能夠同時與兩側目標結合，確認到可以成功誘導表達各蛋白質的細胞的結合。
5-5．4-1BB報告基因分析
利用4-1BB生物測定(J2332，Promega公司)評估通過本發明的利妥昔單抗-41BBL(RACE-01C)的4-1BB信號傳遞程度。根據生產公司的說明書進行分析，為了確認對目標抗原的信號依賴性，使用上述實驗例1的CD20表達Raji B細胞株。利用GloMax®(Promega公司)通過GloMax®Discover酶標儀(Microplate Reader)(GM30000，promega公司)測定信號的相對值。
結果如圖15所示，確認到本發明的利妥昔單抗-41BBL (RACE-01C)濃度依賴性地擴增NF-KB報告基因信號(參考圖15中的右側)。
實施例6．在實體癌細胞中確認RACE信號介導過程
在實體癌細胞中確認了本發明的融合蛋白的信號介導過程。為此，以與上述實施例5-5相同的方法向上述實驗例1中記載的已知非常不完全地表達Her2的MDA-MB-231細胞株(乳腺癌細胞株)、已知過表達EGFR的PC-9細胞株(肺腺癌細胞株)、HT-29細胞株(大腸癌細胞株)、SW480細胞株(結腸直腸癌細胞株)處理本發明的曲妥珠單抗-41BBL(RACE-02C)、西妥昔單抗-41BBL (RACE-02B)或利妥昔單抗-41BBL(RACE-01C)來評估各4-1BB信號的傳遞程度。
圖16的A部分示出對MDA-MB-231細胞株的上靶信號傳遞和脫靶信號傳遞。在MDA-MB-231細胞株的情况下，儘管作為目標蛋白質的HER2表達的微乎其微，但當處理能夠與相關蛋白質結合的曲妥珠單抗-41BBL(RACE-02C)時，觀察到信號傳遞程度隨濃度敏感地增加，達到分類為三陰性乳腺癌的程度，與之相反，在處理以相關細胞完全不表達的抗原CD20為目標的利妥昔單抗-41BBL(RACE-01C)的情况下，在脫靶方面，未觀察到信號隨濃度的增加。同時，在三種表面表達EGFR蛋白的腫瘤細胞株中，EGFR表達程度、上靶信號傳遞及脫靶信號傳遞程度的差異如圖16的B部分所示。在上述圖16的B部分中，在細胞株上標記“-on”(cell line-on)(例如(Ex)SW480-on、HT-29-on、PC9-on)表示上靶效果，即，在處理可通過利用與各靶細胞中表達的EGFR結合的西妥昔單抗製備的西妥昔單抗-41BBL(RACE-02b)後，確認的與此相關的信號傳遞程度的結果。相反，在相同細胞株標記“-off”(例如SW480-off、HT-29-off、PC9-off)的表示藥物的脫靶效果，即，處理能夠與各個靶細胞完全不表達的CD20結合的利妥昔單抗-41BBL(RACE-01C)後確認的產生信號的程度的結果。
結果，在對過表達EGFR的三種細胞處理西妥昔單抗-41BBL (RACE-02B)時，可以確認到與濃度成比例的信號傳遞，在處理與各細胞株完全不表達的CD20蛋白相關的利妥昔單抗-41BBL(RACE-01C)-target-off時，完全確認不到信號傳遞，從而確認到完全沒有過去成為4-1BBL靶向治療劑的問題的脫靶毒性(toxicity)。
同時，確認到本發明的融合蛋白西妥昔單抗-41BBL(RACE-02B)目標抗原特異性地以比作為4-1BB凝集型抗體的烏托魯單抗顯著優秀的程度誘導4-1BB信號傳遞(圖16B)。
實施例7．確認在誘發癌症的動模型中的功效
在誘發癌症的動物模型中確認了西妥昔單抗-41BBL(RACE-02B)的抗癌功效。首先，為了在Balb-c小鼠中自發生長的小鼠大腸癌細胞(CT26)的表面表達人類的EGFR，將相關hEGFR-CT26細胞(5×10 5/100μL)移植到表達人類4-1BB的細胞外結構域的人類化小鼠(Balb-c)的皮下(委托Gempharmatech公司)。以移植的腫瘤的大小平均到達100mm 3時為起點，通過尾靜脈以Q3D(三天一次)的方式給藥如下組的抗體共6次：對照組(5mg/kg，人類(human)IgG(從Sigma公司購入(14506)))、西妥昔單抗-41BBL(RACE-02B)(0.5mg/kg，2mg/kg)。使用卡尺(caliper)每周測量兩次各實驗組的腫瘤的大小(TV=0.5a×b 2)，其中，a為腫瘤的長軸，b為腫瘤的短軸。
結果如圖18所示，與對照組的人類IgG抗體相比，西妥昔單抗-41BBL(ARCE-02B)顯出顯著的腫瘤抑制能力。
綜上所述，本發明涉及第一單體與第二單體通過接頭連接而成的二聚體通過杵臼與第三單體結合的細胞因子三聚體結構域以及由上述細胞因子三聚體結構域取代抗體的恆定區(Fc)來製備的抗體與細胞因子三聚體結構域結合的新形式的融合蛋白(RACE)，本發明的通過杵臼結合的細胞因子三聚體結構域對4-1BB受體顯出比凝集性抗體更為强力的結合能力，確認到包含其的融合蛋白對兩側目標都顯出優秀的結合能力，確認到可以成功誘導表達各目標(蛋白質)的細胞的結合。
無
圖1為示出本發明的融合蛋白所包含單位蛋白(Unit proteins)(A部分)以及包含上述單位蛋白的融合蛋白(B部分)的圖。 圖2為用於說明本發明的細胞因子三聚體結構域的杵臼結構的圖。 圖3為示出本發明的細胞因子三聚體結構域的二聚體與單體之間的相互作用位點和其距離(A部分)、各個相互作用(B部分)的結果。 圖4為比較本發明的細胞因子三聚體結構域中只在一個方向生成杵的情况或者同時生成杵與臼的情况的圖。 圖5為確認三種包含各不相同的抗體結構域及細胞因子三聚體結構域的融合蛋白的純度的結果。 圖6為在本發明的包含抗體結構域及細胞因子三聚體結構域的融合蛋白中確認杵臼結構形成與否(A部分)、生產量(B部分)及純度(C部分)的結果。 圖7為通過確認本發明的細胞因子三聚體結構域的結構來確認二聚體與單體形成杵臼結構的結果。 圖8為示出本發明的細胞因子三聚體結構域的結構及連接二聚體的接頭的圖。 圖9為在本發明的細胞因子三聚體結構域中，在未形成杵臼結構的情况下，確認具有蛋白質鉸鏈錯配(mismatch)的二硫鍵蛋白質(A部分)以及確認錯配的鉸鏈類型和發生率(B部分)的結果。 圖10為示出本發明的包含抗體結構域及細胞因子三聚體結構域的融合蛋白的結構及大小的結果。 圖11為確認本發明的包含抗體結構域及細胞因子三聚體的融合蛋白的熱力學穩定性的結果。 圖12為確認本發明的包含抗體結構域及細胞因子三聚體的融合蛋白對抗原的結合親和度的結果。 圖13為確認本發明的包含抗體結構域及細胞因子三聚體的融合蛋白對目標受體的結合親和度的結果。 圖14為確認本發明的包含抗體結構域及細胞因子三聚體的融合蛋白對抗原及目標受體的同時結合能力的結果。 圖15為評估本發明的包含抗體結構域及細胞因子三聚體的融合蛋白的4-1BB信號傳遞程度的結果。 圖16為在實體癌細胞株中評估本發明的包含抗體結構域及細胞因子三聚體的融合蛋白的上靶(on-target)信號傳遞和脫靶(off-target)信號傳遞程度的結果，其中A部分表示RACE-02C的結果，B部分表示RACE-02B(B)的結果。 圖17為包含編碼本發明的包含抗體結構域及細胞因子三聚體的融合蛋白的多核苷酸的載體的示意圖。 圖18為在誘發癌症的動物模型中確認本發明的包含抗體結構域及細胞因子三聚體的融合蛋白的治療效果的結果。
無
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Claims (34)

  1. 一種融合蛋白，包含： 抗原結合結構域；以及 細胞因子三聚體結構域。
  2. 如請求項1所述的融合蛋白，其中，上述細胞因子三聚體結構域由包含第一單體及第二單體的二聚體與第三單體結合而成。
  3. 如請求項2所述的融合蛋白，其中，上述二聚體為通過接頭連接的第一單體和第二單體，上述第一單體的N末端或C末端通過接頭與第二單體的N末端或C末端相互連接。
  4. 如請求項2所述的融合蛋白，其中，上述三聚體的第一單體或第二單體的一個以上氨基酸殘基與第三單體的一個以上氨基酸殘基形成杵臼結構。
  5. 如請求項4所述的融合蛋白，其中，在包含上述第一單體及第二單體的二聚體中形成臼結構，在第三單體中形成杵結構。
  6. 如請求項4所述的融合蛋白，其中，上述杵臼結構在細胞因子與受體的結合區域外的區域形成。
  7. 如請求項4所述的融合蛋白，其中，上述一個以上氨基酸殘基位於蛋白質表面。
  8. 如請求項4所述的融合蛋白，其中，上述第一單體的一個以上氨基酸殘基與第三單體的一個以上氨基酸殘基位於6Å以下的距離處。
  9. 如請求項4所述的融合蛋白，其中，上述第二單體的一個以上氨基酸殘基與第三單體的一個以上氨基酸殘基位於6Å以下的距離處。
  10. 如請求項4所述的融合蛋白，其中，上述氨基酸殘基為選自由F92、F238、Q94、F144、V234、Q146、E148、F199、Y142、L203、R202、Q200及A180組成的群組中的一種以上。
  11. 如請求項4所述的融合蛋白，其中，上述氨基酸殘基為選自由F92W、F238V、Q94S、Q94Y、F144I、V234H、V234F、V234R、Q146S、E148G、F199L、Y142T、L203A、R202V、R202W、R202F、F199W及A180E組成的群組中的一種以上。
  12. 如請求項11所述的融合蛋白，其中，上述氨基酸殘基通過選自由A180E與E148G組成的對、V234R與R202V組成的對、R202W與Q94S組成的對組成的群組中的一種以上的對形成杵臼結構。
  13. 如請求項1所述的融合蛋白，其中，上述抗原結合結構域為抗體或抗體片段。
  14. 如請求項13所述的融合蛋白，其中，上述抗體片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區。
  15. 如請求項13所述的融合蛋白，其中，上述抗體片段為選自由Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、di-scFv以及VHH組成的群組中的一種以上。
  16. 如請求項13所述的融合蛋白，其中，上述抗體片段的N末端或C末端與細胞因子三聚體連接。
  17. 如請求項13所述的融合蛋白，其中，上述抗體片段為具有下述結構的F(ab')2： 上述F(ab')2的第一鉸鏈與第一單體或第二單體連接； 上述F(ab')2的第二鉸鏈與第三單體連接。
  18. 如請求項1所述的融合蛋白，其中，上述細胞因子在自然狀態下與受體結合為三聚體。
  19. 如請求項1所述的融合蛋白，其中，上述細胞因子為腫瘤壞死因子超家族。
  20. 如請求項19所述的融合蛋白，其中，上述腫瘤壞死因子超家族為選自由TNFα、Dif、Necrosin、TNFβ、TNFSF1B、TNFγ、CD252、Gp34、CD134L、CD154、TRAP、Gp39、T-BAM、CD178、APTL、CD95L、CD70、CD153及4-1BBL組成的群組中的一種以上。
  21. 如請求項19所述的融合蛋白，其中，上述腫瘤壞死因子超家族為4-1BBL。
  22. 如請求項21所述的融合蛋白，其中，上述4-1BBL包含由序列17表示的核苷酸序列。
  23. 如請求項21所述的融合蛋白，其中，上述4-1BBL具有下述結構： 第一4-1BBL單體與第二4-1BBL單體通過接頭連接； 第一4-1BBL單體或第二4-1BBL單體的一個以上氨基酸殘基與第三4-1BBL單體的一個以上氨基酸殘基形成杵臼結構。
  24. 一種多核苷酸，其中，編碼請求項1至23中任一項所述的融合蛋白。
  25. 一種載體，其中，包含編碼請求項1至23中任一項所述的融合蛋白的多核苷酸。
  26. 一種融合蛋白的生產方法，其中，包括向宿主細胞轉染包含編碼請求項1至23中任一項所述的融合蛋白的多核苷酸的載體的步驟。
  27. 一種載體組合物，用於生產請求項1所述的融合蛋白，其中，包含： 第一載體，編碼Fab的重鏈的多核苷酸與編碼通過接頭連接的第一單體和第二單體的多核苷酸可操作地連接； 第二載體，編碼Fab的重鏈的多核苷酸與編碼第三單體的多核苷酸可操作地連接；以及 第三載體，包含編碼Fab的輕鏈的多核苷酸。
  28. 一種生產請求項1所述的融合蛋白的方法，其中，包括向宿主細胞轉染請求項27所述的載體組合物的步驟。
  29. 一種抗體與腫瘤壞死因子超家族三聚體的融合蛋白的生產方法，上述腫瘤壞死因子超家族形成包含二聚體及腫瘤壞死因子超家族的第三單體的三聚體，上述二聚體包含腫瘤壞死因子超家族的第一單體及第二單體，其中， 包括： 步驟1)，在存在於上述二聚體與第三單體之間的兩個表面中選擇一個表面； 步驟2)，在第一單體或第二單體以及第三單體中各選擇一個在上述所選擇的一個表面中的第一單體或第二單體與第三單體之間位於6Å以下的距離處的氨基酸對； 步驟3)，在上述選擇的氨基酸對中的第三單體位點誘導突變來形成杵； 步驟4)，篩選與上述第三單體的杵配對並引起結構碰撞的野生型的第一單體或第二單體的氨基酸殘基； 步驟5)，在上述篩選的第一單體或第二單體的氨基酸殘基中誘導突變來形成臼；以及 步驟6)，誘導上述第三單體的杵與第一單體或第二單體的臼的杵臼相互作用， 在上述二聚體及第三單體中連接有Fab的重鏈。
  30. 如請求項29所述的生產方法，其中，在上述步驟1)中選擇的表面中形成杵臼結合，在剩餘未選擇表面的單體之間誘導位阻效應。
  31. 一種通過請求項29所述的生產方法生產的抗體與腫瘤壞死因子超家族三聚體的融合蛋白。
  32. 一種用於預防或治療因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病的藥物組合物，其中，包含請求項1至23中任一項所述的融合蛋白。
  33. 如請求項32所述的用於預防或治療因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病的藥物組合物，其中，上述因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病為選自由癌症、免疫疾病、自身免疫性疾病、中樞神經疾病、退行性神經疾病、自身免疫性疾病以及炎症性疾病組成的群組中的一種以上。
  34. 一種治療因宿主免疫細胞的功能滅活或損傷引起的疾病的方法，其中，包括向對象施用請求項1至23中任一項所述的融合蛋白的步驟。
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