JP2021513366A - 抗ｐｄ−１／抗ｈｅｒ２天然抗体構造ヘテロダイマー系の二重特異性抗体及びその製造方法 - Google Patents

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Abstract

抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２天然抗体構造サンプルヘテロダイマー系二重特異性抗体及びその製造方法であり、具体的には、天然ＩｇＧの特性を有していながらも、重鎖と軽鎖とのミスマッチングがない、高度に安定したヘテロダイマー系抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体及びその製造方法を提供し、該二重特異性抗体は、同時に２つの標的分子と結合することができ、多様な疾病治療方面においても、さらに優れた効果を示す。

Description

本発明は、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ−２天然抗体構造サンプルヘテロダイマー系の二重特異性抗体及びその製造方法に係り、さらに詳細には、天然ＩｇＧの特性を有していながらも、重鎖と軽鎖とのミスマッチングがない、高度に安定したヘテロダイマー系の抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体及びその製造方法に関する。
単一クローン抗体は、単一抗原決定基にだけ作用する高特異性抗体であり、癌、炎症、自家免疫疾患、感染性疾患などにすでに広範囲に利用されている。しかし、そのような治療分子は、単独で使用された場合には、十分な薬効を示すことができない。それは、疾病の複雑性によるものであり、例えば、癌または炎症性疾病は、一般的に、多様な疾病媒介体の分子通路と信号通路との間期（interphase）作用と係わる。その場合、単一標的を有する分子は、最適の治療効果を提供することができず、同時に、多数の標的または同一標的における多くのサイトに位置した分子を遮断することにより、治療効果を改善させることができる。同時に、二重特異性分子のような多特異性分子は、単一分子であるので、それを利用した二重標的治療は、新薬開発過程を簡素化させることができる。多特異性分子を使用した薬混合と比較すれば、患者及び医療提供者のいずれにおいて、さらに便利な方法である。
各種異なる形式の二重特異性抗体または二重機能分子が、当該分野で周知されている。最初の二重特異性抗体は、化学的方法を応用し、二重カップリング試薬を使用し、従来のＩｇＧ分子を、Ｆａｂ’断片または（Ｆａｂ’）断片に連結したものである。しかし、そのように、化学的にカップリングされた二重特異性抗体には、生産作業の強度、異種共役物の精製、同種共役物、及び本来の単一特異性抗体またはその断片の除去における複雑性及び低い効率のような多くの制限がある。
二重特異性抗体生産に使用される他の方法は、ハイブリッド・ハイブリドーマ（または、四員ハイブリドーマ）技術を使用するものであり、それは、異なる抗体を分泌する２つのハイブリドーマ細胞株が体細胞融合し、二重特異性抗体を生産する方法である。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖とがなす任意的対のうち、混合物の１／１０だけが要求される機能性二重特異性抗体であるので、精製過程が複雑になり、生産収率が低下する。
ＷＯ２０１３０６０８６７においては、ヘテロダイマー二重特異性抗体の大規模生産方法を敍述している。前記方法においては、まず、二種の混合されたホモダイマー系抗体を還元させた後、前記二種のホモダイマー抗体のＣＨ３区域に、非対称アミノ酸突然変異を導入することにより、異なる抗体のＦａｂアーム（arm）の交換を促進した後、最後に、酸化ヒンジ領域のチェーン間の二硫化結合を介し、安定した二重特異性抗体を形成する。
ＷＯ２００９０８９００４においては、ヘテロダイマータンパク質製造方法を敍述した。前記方法は、ＣＨ３−ＣＨ３界面に位置するアミノ酸を、電荷を帯びるアミノ酸に突然変異させることにより、静電作用を介し、ヘテロダイマーの形成促進やホモダイマー形成には、不利である。
ＵＳ５７３１１６８においては、「突起・空洞」戦略を利用し、ヘテロダイマーＩｇＧを製造する方法を敍述している。前記方法は、第１鎖ＣＨ３領域の界面にある小さいアミノ酸を大きいアミノ酸に代替して「突起」を形成し、同時に第２鎖ＣＨ３領域のそれと相応する大きいアミノ酸を小さいアミノ酸に突然変異させ、「空洞」を形成するのである。臼と杵との相互作用は、ヘテロダイマーＩｇＧの形成には、有利であるが、ホモダイマー形成には不利である。
ＷＯ２０１２０５８７６８においては、安定した高特異性ヘテロダイマーＩｇＧの製造方法を敍述している。前記方法は、陰性と陽性との設計及び構造、並びにコンピュータモデル志向タンパク質工程技術を組み合わせて使用し、ＩｇＧＩ ＣＨ３構造領域の多数のアミノ酸を突然変異させることにより、安定しており、ホモダイマー不純物含量が低いヘテロダイマーＩｇＧを形成する。
プログラムされた細胞死滅受容体ェ（ＰＤ−１：programmed death receptor−１）は、最近注目されている免疫チェックポイント（immune checkpoint）であり、主にＴ細胞の活性化制御に関与し、免疫反応の強度及び持続時間を調節することができる。正常な状況において、ＰＤ−１は、有機体組織の自家免疫寛容を可能にして維持することができ、炎症反応過程において、免疫系統が過度に活性化され、自家組織の損傷回避において肯定的な作用を行うが、病理状況において、ＰＤ−１は、腫瘍免疫、及び多様な自己免疫疾患の発生及び発展の過程に関与する（Anticancer Agents Med Chem. 2015; 15 (3): 307-13. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 2014 Mar; 7 (1): 1-17. Trends Mol Med. 2015 Jan; 21 (1): 24-33. Immunity. 2013 Jul 25; 39 (1): 61-73. J Clin Oncol. 2015 Jun 10; 33 (17): 1974-82）。
ＰＤ−１は、ＣＤ２８ファミリーに属するが、ＣＴＬＡ４のようなＣＤ２８ファミリーの他の構成要素とは異なり、二硫化結合でもって、共有ダイマーを形成することができ、ＰＤ−１は、モノマー形態で存在する。ＰＤ−１の構造は、主に、細胞外免疫グロブリン可変領域ドメイン、並びに疎水性の膜貫通領域及び細胞内領域を含み、該細胞内領域は、２つの独立したリン酸化作用サイトを含み、リン酸化作用サイトは、それぞれ免疫受容体チロシン基盤抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）と免疫受容体チロシン基盤の転移モチーフ（ＩＴＳＭ）とである。ＰＤ−１の誘導性は、主に活性化されたＴ細胞表面に発現され、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単核細胞、ＤＣ細胞にも発現される。ＰＤ−１のリガンドは、ＰＤ−Ｌ１（programmed death rigand １）、ＰＤ−Ｌ２（programmed death ligand ２）を含み、前記リガンドは、Ｂ７に属し、そのうちＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単核細胞、大食細胞、ＤＣ細胞、内皮細胞、表皮細胞のような多様な免疫細胞表面で誘導性発現を行うが、ＰＤ−Ｌ２は、大食細胞、ＤＣ細胞、Ｂ細胞のような一部免疫細胞においてのみ誘導性発現を行う（Autoimmun Rev, 2013, 12 (11): 1091-1100. Front Immunol, 2013, 4: 481. Nat Rev Cancer, 2012, 12 (4): 252-264. Trends Mol Med. 2015 Jan; 21 (1): 24-33）。
１９８０年代に、Denis Slamonが、最初に、１８９件の原発性乳癌病例から、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２：human epidermal growth factor receptor ２）遺伝子が、３０％の病例において、いずれも過度に増加することを発見し、ＨＥＲ２が、全体生存率及び再発時期と密接に関連していることを明らかにした（Salman DJ et al, Science, 235: 177-182, 1985）。現在の研究によれば、およそ２５〜３０％の乳癌患者において、ＨＥＲ２がいずれも過多発現され（Revillion F et al, Eur J Cancer, 34: 791-808, 1998）、それは、いずれも腫瘍の悪性生長程度と関連する（Wright C et al, Cancer Res, 49: 2087-2090, 1989）。
トラスツズマブ（Trastuzumab）は、抗ＨＥＲ２細胞区域外のヒト化単一クローン抗体（Carter P et al, PNAS, 89 (10): 4285-4289, 1992）である。しかし、トラスツズマブが臨床に応用されたときの抗癌効果は、前臨床実験に比べ、低い場合が多いので、一般的に、化学治療剤などと薬混合して使用しなければならない（Slamon DJ et al, N Engl J Med, 344:783-792, 2001）。
エフェクター細胞を集めることができる二重機能抗体を設計することは、抗体の効能を向上させる効果的手段である。現在まで、最も多くの研究がなされたのは、ＣＤ３分子の機能を利用するものである。ＣＤ３分子によるキラーＴ細胞の活性化を介し、標的腫瘍を効果的に除去することができる（Haas C et al, Immunobiology, 214: 441-453, 2009）。そのうち、Micromet社で開発した組み換え二重機能Ｔ細胞刺激抗体は、ＢｉＴＥとして非常に有望であるが、最大の問題点は、血漿半減期が非常に短く、人体における半減期が１時間に過ぎないという点である（Loffler A et al，Blood, 95: 2098-2103）。それは、ＢｉＴＥ自体の構造によるものであり、ＢｉＴＥは、２つの単一鎖型抗体断片によって形成され、分子量は、６０ｋＤａに過ぎないだけではなく、抗体分子内において、半減期延長に重要な役割を行うＦｃ断片が欠失している。
カツマキソマブ（Catumaxomab）は、他種の有望な多機能性抗体であり、ＣＤ３及びＥｐＣＡＭを標的にするヘテロＩｇ分子であり、現在、前記製品は、複数癌の治療において使用を許可受けている状態である（Jager M et al, Cancer Res, 72: 24-32, 2012）。臨床２期にあるさらに他の多機能性抗体は、エルツマキソマブ（Ertumaxomab）であり、ＣＤ３及びＨＥＲ２を標的にする。該ヘテロ抗体の１分岐の重鎖及び軽鎖は、鼠のＩｇＧによるものであり、ＣＤ３を標的にし、他の１分岐の重鎖及び軽鎖は、マウスのＩｇＧによるものであり、ＨＥＲ２を標的にする。ここで、それに伴う問題点は、そのような製品の生産が非常に困難であるということである。二重機能性エルツマキソマブが発現されるクローンを獲得するためには、まず、ＣＤ３抗体を発現する１つの二倍体ハイブリドーマ、及びＨＥＲ２抗体を発現する１つの二倍体ハイブリドーマを獲得した後、２つのハイブリドーマをさらに混成させ、抗ＣＤ３及び抗ＨＥＲ２を発現することができる二重機能抗体である四倍体ハイブリドーマを獲得しなければならないためである。しかし、普通の単一標的抗体を形成するためには、二倍体ハイブリドーマ１つの獲得だけが必要であるので、それと比較すれば、二重機能抗体の生産過程がはるかに複雑であり、また四倍体ハイブリドーマの獲得がさらに困難であり、鼠の出処のために、免疫原性が非常に高い結果につながるのである。
また、抗ＣＤ３の抗体の最も明らかな副作用は、体内サイトカインの短時間内の増加、すなわち、サイトカインストームとも称する現象をもたらすのである。従って、免疫細胞を腫瘍細胞に集める新たな二重機能抗体を開発する必要がある。
混合投薬は、順に、二種または何種かの抗体を注射したり、抗体を同一剤形にしたりすることを必要とする。しかし、一方、順に抗体を注射することは、患者の治療協助性を低下させ、痛症を増大させてしまう。他方、異なる抗体の物理化学的性質には違いがあるので、異なる抗体を同一剤形に作ることは、非常に困難であるか、あるいはほぼ不可能である。
そのような観点から、ＰＤ−１とＨＥＲ２との信号チャネルを同時に遮断することができる新型治療薬物への研究が依然として必要である。
本発明は、天然ＩｇＧ構造の特徴を有し、重鎖と軽鎖とのミスマッチがなく、高度に安定したヘテロダイマー系であり、同時に、ＰＤ−１及びＨＥＲ２を遮断することができる二重機能抗体及びその製造方法を公開している。前記二重機能抗体は、ＰＤ−１及びＨＥＲ２を同時に高発現する腫瘍細胞に選択的に結合する傾向があり、効果的であって特異な殺傷効果を発揮し、また毒性による副作用も比較的低い。
本発明の第１側面は、ヘテロダイマー系の二重特異性抗体に係わるものである。前記二重特異性抗体は、ＰＤ−１と特異性結合が可能な第１抗原結合部位、及びＨＥＲ２と特異性結合が可能な第２抗原結合部位を含み、そのうち、前記ヘテロダイマーは、１または多数の二硫化結合を介して鎖連結された第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖を含み、前記第１Ｆｃ鎖及び前記第２Ｆｃ鎖は、共有結合またはリンカーを介し、それぞれＰＤ−１抗原結合部位及びＨＥＲ２抗原結合部位に連結されるか、あるいは前記第１Ｆｃ鎖及び前記第２Ｆｃ鎖は、共有結合またはリンカーを介し、それぞれＨＥＲ２抗原結合部位及びＰＤ−１抗原結合部位に連結され、二重ＰＤ−１抗原結合部位内の免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１０で示されている通りであり、ＰＤ−１抗原結合部位中の免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１２で示されている通りであり、第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖は、下記のような位置において、５個アミノ酸の置換を含み、
第１Ｆｃ鎖においては、３６６番目及び３９９番目のアミノ酸が置換され、第２Ｆｃ鎖においては、３５１番目、４０７番目及び４０９番目のアミノ酸が置換され、
前記アミノ酸置換を含む第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖は、それぞれホモダイマーを形成する傾向なしに、互いにヘテロダイマーを形成する傾向がさらに強く、
そのうち、アミノ酸位置は、Kabat ＥＵ索引番号体系によって番号が付される。
一部実施例において、第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖とのアミノ酸置換は、下記の通りである：
ａ）Ｌ３５１Ｇ、Ｌ３５１Ｙ、Ｌ３５１Ｖ、Ｌ３５１Ｐ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｅ、Ｌ３５１ＫまたはＬ３５１Ｗ；
ｂ）Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｐ、Ｔ３６６ＷまたはＴ３６６Ｖ；
ｃ）Ｄ３９９Ｃ、Ｄ３９９Ｎ、Ｄ３９９Ｉ、Ｄ３９９Ｇ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９ＴまたはＤ３９９Ａ；
ｄ）Ｙ４０７Ｌ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｐ、Ｙ４０７Ｆ、Ｙ４０７ＴまたはＹ４０７Ｈ；及び
ｅ）Ｋ４０９Ｃ、Ｋ４０９Ｐ、Ｋ４０９Ｓ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｖ、Ｋ４０９ＱまたはＫ４０９Ｒ。
一部実施例において、アミノ酸置換は：
ａ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒの置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｅ、Ｙ４０７及びＫ４０９Ｖの置換；
ｂ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃの置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｇ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｃの置換；
ｃ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃの置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ及びＫ４０９Ｐの置換；
ｄ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｎの置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｖ、Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓの置換；
ｅ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｗ及びＤ３９９Ｇの置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｄ、Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓの置換；
ｆ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｉの置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｐ、Ｙ４０７Ｆ及びＫ４０９Ｆの置換；
ｇ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｖ及びＤ３９９Ｔの置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｋ、Ｙ４０７Ｔ及びＫ４０９Ｑの置換；並びに
ｈ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ａの置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｗ、Ｙ４０７Ｈ及びＫ４０９Ｒの置換；を含む。
一部実施例において、第１Ｆｃ鎖のアミノ酸は、Ｔ３６６ＬとＤ３９９Ｒとで置換され、第２Ｆｃ鎖のアミノ酸は、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７及びＫ４０９Ｖで置換される。
一部実施例において、Ｆｃ鎖は、ＩｇＧによる。
一部実施例において、ＰＤ−１抗原結合機能領域及びＨＥＲ２抗原結合機能領域は、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ断片である。
一部実施例において、ＰＤ−１抗原結合機能領域及びＨＥＲ２抗原結合機能領域は、いずれもＦａｂ断片である。
一部実施例において、ＰＤ−１抗原結合機能領域及びＨＥＲ２抗原結合機能領域のうち一つは、Ｆａｂ断片であり、他の一つは、ｓｃＦＶ断片である。
一部実施例において、Ｆａｂ断片は、異なる第１重鎖可変領域及び第２重鎖可変領域、並びに異なる第１軽鎖可変領域及び第２軽鎖可変領域を含む。
一部実施例において、第１Ｆｃ鎖、及びそれと連結されるＰＤ−１抗原結合部位、並びに第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結されるＨＥＲ２抗原結合部位、または第１Ｆｃ鎖、及びそれと連結されるＨＥＲ２抗原機能結合部位、並びに第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結されるＰＤ−１抗原結合部位は、単独で存在するか、あるいは還元剤と同時に存在する場合、ホモダイマーを形成する重量比率がいずれも５０％未満である。
一部実施例において、二重特異性抗体のアミノ酸配列は、配列番号２，４，６，８，１０，１２及び１４から選択される。一部実施例において、二重特異性抗体のアミノ酸配列は、配列番号２，４，６，８，１０，１２及び１４の対応組み合わせから選択される。
本発明の第２側面は、分離されたポリヌクレオチドに係わるものであり、そのコードは、第１側面で説明されたヘテロダイマー系の二重特異性抗体の通りである。
一部実施例において、ポリヌクレオチドの配列は、配列番号１，３，５，７，９，１１及び１３から選択される。一部実施例において、ポリヌクレオチドの配列は、配列番号１，３，５，７，９，１１及び１３の対応組み合わせである。
本発明の第３側面は、第２側面で説明された分離されたポリヌクレオチドを含む組み換えプラスミドに係わるものである。
一部実施例において、発現ベクターは、ｐＣＤＮＡを改変して得られたプラスミドベクターＸ０ＧＣである。
本発明の第４側面は、第２側面で説明された分離されたポリヌクレオチド、または第３側面で説明された組み換え発現ベクターを含む宿主細胞に係わるものである。
一部実施例において、該宿主細胞は、ヒト胚芽腎臓細胞ＨＥＫ２９３、またはＨＥＫ２９３細胞を基に改変して得られたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｅ、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ、またはＣＨＯ細胞を基に改変して得られたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯである。
本発明の第５側面は、第１側面で説明されたヘテロダイマー系の二重特異性抗体、第２側面で説明された分離されたポリヌクレオチド、第３側面で説明された組み換え発現ベクター、または第４側面で説明された宿主細胞及び薬理学的で受容可能な担体を含む組成物に係わるものである。
本発明の第６側面は、第１側面で説明されたヘテロダイマー系の二重特異性抗体を生産する方法に係わるものであり、次のような段階を含む：
１）第２側面で説明された分離されたポリヌクレオチド、または第３側面で敍述された組み換え発現ベクターをそれぞれ宿主細胞内で発現させる段階；
２）宿主細胞内でそれぞれ発現されるタンパク質を還元させる段階；及び
３）還元されたタンパク質を混合した後、混合物を酸化させる段階。
一部実施例において、該宿主細胞は、ヒト胚芽腎臓細胞ＨＥＫ２９３、またはＨＥＫ２９３細胞を基に改変を進めて得られたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｅ、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ、またはＣＨＯ細胞を基に改変して得られたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞から選択される。
一部実施例において、還元段階は、１）還元反応を行い、前記還元剤は、２−メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、その他化学誘導体、またはその組み合わせを含む段階、２）還元剤を除去する段階を含む。
一部実施例において、酸化段階は、空気中で酸化する段階であり、酸化剤が存在する状況で行われる酸化反応も含み、前記酸化剤は、Ｌ−ジヒドロアスコルビン酸またはその他化学的誘導体から選択される。
一部実施例において、前記実施例は、分離精製段階をさらに含む。
本発明の第７側面は、第１側面で説明されたヘテロダイマー系の二重特異性抗体、及び／または第２側面で説明された分離されたポリヌクレオチド、及び／または第３側面で説明された組み換え発現ベクター、及び／または第４側面で説明された宿主細胞、及び／または第５側面で説明された組成物の、個体の疾患を予防及び／または治療する薬物における用途に係わるものである。
本発明の第８側面は、個体疾患の予防及び／または治療に利用される、第１側面で説明されたヘテロダイマー系の二重特異性抗体、及び／または第２側面で説明された分離されたポリヌクレオチド、及び／または第３側面で説明された組み換え発現ベクター、及び／または第４側面で説明された宿主細胞、及び／または第５側面で説明された組成物に係わるものである。
本発明の第９側面は、疾病を予防及び／または治療する方法に係わるものであり、第１側面で説明されたヘテロダイマー系の二重特異性抗体、及び／または第２側面で説明された分離されたポリヌクレオチド及び／または、第３側面で説明された組み換え発現ベクター、及び／または第４側面で説明された宿主細胞、及び／または第５側面で説明された組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む。
一部実施例において、該個体は、哺乳動物、望ましくは、ヒトである。
一部実施例において、前記疾病は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平細胞癌、非小細胞性肺癌、鼻咽頭癌腫、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、黒色腫瘍のような疾病から選択される。
本発明は、全く新規の抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２天然抗体構造サンプルであるヘテロダイマー系の二重特異性抗体を設計し、前記二重特異性抗体は、天然ＩｇＧの特性を有しながらも、重鎖と軽鎖とのミスマッチがなく、高度に安定したヘテロダイマー系の抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体である。前記二重特異性抗体は、同時に二種の標的分子であるＰＤ−１及びＨＥＲ−２と結合することができ、多様な疾病治療分野において、さらに効果的である。
抗ＰＤ−１発現物の溶出ピーククロマトグラムを図示する図である。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の構造を図示する図である。 重鎖と軽鎖との半抗体を図示した構造図である。 重鎖と軽鎖との半抗体のＳＥＬ−ＨＰＬＣ分析結果を図示し、ＡとＢは、それぞれ抗ＰＤ−１半抗体と抗ＨＥＲ２半抗体との分析結果を示す。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子のＳＥＬ−ＨＰＬＣ分析結果を図示するグラフである。 精製された抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子のＳＥＬ−ＨＰＬＣ純度分析結果を図示するグラフである。 Ａは、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体が、ＰＤ−１に対する有する親和力を図示し、Ｂは、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体が、ＨＥＲ２に対する有する親和力を図示している。 ＰＤ−１単一クローン抗体とＨＥＲ２との組み合わせが、同時にＰＤ−１及びＨＥＲ２と結合することができず、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体だけが同時に２つの抗原と結合する活性を有することを図示するグラフである。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体が、ＳＫ−ＢＲ−３細胞及びＣＨＯ／ＰＤ−１細胞の相互接近を誘発しうることを図示する図である。 Ａ及びＢは、それぞれ抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合とＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２結合とを遮断し、二価単クローン抗体の遮断活性を比較的良好に維持することができることを図示するグラフである。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体が、ＰＤ−１単一クローン抗体に匹敵するＴ細胞制御活性を示し、サイトカインＩＦＮ−γの分泌を顕著に促進させることを図示するグラフである。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体が、ＨＥＲ２単一クローン抗体に匹敵する腫瘍細胞殺傷制御活性を示す図示するグラフである。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体が、ＰＤ−１単一クローン抗体、ＨＥＲ２単一クローン抗体よりさらに強い抗腫瘍薬効を有し、薬物投与を中断した後にも、良好な腫瘍制御作用を示すことを図示するグラフである。
定義：
共有原子価連結とは、ヘテロダイマー系の二重特異性抗体において、２つのＦｃ鎖のうちいずれか１つのＦｃ鎖と、それと連結された抗原結合機能領域とを、共有結合により、１つの分子に連結することを示す。そのうちＦｃ鎖は、１または多数の共有原子価連結（または、二硫化結合鎖）を介して連結された第１抗原結合部位及び第２抗原結合部位を含み、前記第１Ｆｃ鎖及び前記第２Ｆｃ鎖は、それぞれ共有原子価連結（イミン結合またはペプチド結合）を介し、１つの抗原結合部位に連結され、該抗原結合部位は、抗原のような標的分子との特異性相互作用が発生する部位であり、その作用は、高度の選択性を有しており、１つの標的分子を識別する配列は、一般的に、他の分子配列を識別することができない。
代表的な抗原結合部位は、抗体の可変領域、抗体可変領域の構造変異体、受容体の結合領域、リガンド結合領域、または酵素結合領域を含む。
１または多数の二硫化結合鎖間の連結は、第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖とが、１または多数の二硫化結合鎖間の連結を介し、ヘテロダイマー断片を形成することを示す。本発明において、１または多数の二硫化結合の形成は、第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、または第１Ｆｃ鎖、第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結された抗原結合部位が、同一細胞内で合成されるときに形成されるものでもあり、また第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、または第１Ｆｃ鎖、第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結された抗原結合部位が、異なる細胞内において、それぞれ形成された後、体外還元方法によって形成されるものでもある。
第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖は、共有原子価連結を介して結合断片で構成され、共有原子価連結は、二硫化結合を含み、各鎖は、少なくとも免疫グロブリン重鎖不変領域の一部分を含み、前記第１鎖及び前記第２鎖は、アミノ酸配列上においては、異なり、少なくとも１位置のアミノ酸差を含む。本発明中の第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖において、同一鎖間には、強力な相互排斥作用が存在し、異なる鎖間には、吸引作用が存在する。従って、細胞内で共同発現されるとき、第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、または第１Ｆｃ鎖、第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結される抗原結合部位は、ヘテロダイマーを形成する傾向がさらに強い。第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、または第１Ｆｃ鎖、第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結された抗原結合部位をそれぞれ２つの宿主細胞内で発現させるとき、第１Ｆｃ鎖または第１Ｆｃ鎖と、それと連結された抗原結合部位は、ホモダイマーを形成する傾向を有さず、第２Ｆｃ鎖または第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結された抗原結合部位も、ホモダイマーを形成する傾向を有さない。本発明において、第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、または第１Ｆｃ鎖、第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結された抗原結合機能構造が、それぞれ２つの宿主細胞内で発現されるだけではなく、還元剤が存在する場合、ホモダイマーの比率は、５０％未満であり、すなわち、モノマー（一本鎖Ｆｃ鎖または一本鎖Ｆｃ鎖、及びそれと連結された抗原結合部位）の比率は、５０％より大きい。
免疫グロブリンは、四本鎖ポリペプチド結合を有する対称構造であり、そのうち２本は、比較的大きい相対分子量であり、比較的大きい同一の重鎖であり、４５０〜５５０個のアミノ酸残基を含み、相対分子量は、５５，０００〜７０，０００Ｄａであり、他の２本は、相対分子量が比較的小さく、互いに同一な軽鎖（Ｌ鎖）であり、２１０個のアミノ酸残基を含み、相対分子質量は、約２４，０００Ｄａである。異なる免疫グロブリンの重鎖と軽鎖とのうち、Ｎ末端に近接した約１１０個のアミノ酸配列は、変化が非常に激しく、それらを可変領域（Ｖ区域（variable region））と称し、Ｃ末端に近接した残余アミノ酸の配列は、相対的に安定しているので、それらを不変領域（Ｃ区域（constant region））と称する。重鎖における可変領域は、およそ重鎖長の１／４を占め、不変領域は、およそ重鎖長の３／４を占める。周知の５種Ｉｇの種類は、ＩｇＧ（γ）、ＩｇＡ（α）、ＩｇＤ（δ）、ＩｇＭ（μ）及びＩｇＥ（ε）であり、そのうち前の三種ＩｇのＨ鎖内には、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣ３で構成された３個の不変領域がある。後の二種（ＩｇＭ及びＩｇＥ）のＨ鎖には、１つのＶＨ部位と、４つの不変領域、すなわち、ＣＨ１ないしＣＨ４とがある。該不変領域は、免疫グロブリン分子の骨格でもあり、免疫反応を活性化させる部位のうち一つでもある。
本発明中の不変領域は、少なくとも、第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖との相互作用領域を含み、前記領域は、ＩｇＧの場合、ＣＨ３領域の一部分アミノ酸に位置するものであり、少なくとも、ＧＬＮ３４７、ＴＹＲ３４９、ＴＨＲ３５０、ＬＥＵ３５１、ＳＥＲ３５４、ＡＲＧ３５５、ＡＳＰ３５６、ＧＬＵ３５７、ＬＹＳ３６０、ＳＥＲ３６４、ＴＨＲ３６６、ＬＥＵ３６８、ＬＹＳ３７０、ＡＳＮ３９０、ＬＹＳ３９２、ＴＨＲ３９４、ＰＲＯ３９５、ＶＡＬ３９７、ＡＳＰ３９９、ＳＥＲ４００、ＰＨＥ４０５、ＴＹＲ４０７、ＬＹＳ４０９、ＬＹＳ４３９を含む。
第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖がそれぞれ共有結合またはリンカーを介し、１つの抗原結合部位にも連結され、前記抗原結合部位は、第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖がそれぞれ共有結合またはリンカーを介し、１つの抗体の抗原結合断片に連結されるか、抗原の一本鎖抗体を識別することができるか、リガンドの受容体を識別することができるか、あるいは受容体のリガンドを識別することができる部位を言う。そのうち、前記共有結合は、化学的結合の一種であり、２または多数の原子が共同で外層電子を使用し、理想的な状況で電子飽和状態に逹し、比較的安定した化学的構造を構成するものを共有結合と言う。または、該共有結合は、原子間に電子対を共有することによって形成される相互作用である。同一元素の原、子または異なる元素の原子は、いずれも共有結合を介しても結合される。本発明の第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖の共有結合の場合、分子アミノ酸のアミノ基が、他分子アミノ酸のカルボン酸基と脱水反応を起こして形成されたペプチド結合、あるいはエチレングリコール、ポリエチレングリコール、その他化合物またはその重合基のアルデヒド基が分子アミノ酸のアミノ基とペプチド結合またはイミン結合を形成することを含むが、それらに制限されるものではない。そのうち、リンカーは、二本鎖ポリペプチド鎖を、共有結合を介して連結することができる一団のアミノ酸配列、あるいは一種の化合物または一種の化合物の重合基であり、そのうち一団アミノ酸配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのような小さいペプチドを含むが、それに制限されるものではなく、ペプチド結合を介し、第１Ｆｃ鎖または第２Ｆｃ鎖、及び抗原を識別することができる一本鎖抗体、または抗原を識別することができるその他抗体の断片構造変異体を連結する。
第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖は、ヘテロダイマーを形成する傾向がさらに強く、それぞれホモダイマーを形成する傾向を有さないことは、第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖とのうち、互いに同じポリペプチド鎖間には、相互排斥作用が存在し、異なるポリペプチド鎖間には、吸引作用が存在するので、細胞内で共同発現されるとき、第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、または第１Ｆｃ鎖、第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結される抗原結合部位は、ヘテロダイマーを形成する傾向がさらに強いということを意味する。第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、または第１Ｆｃ鎖、第２Ｆｃ鎖、及びそれと互いに連結された抗原結合部位がそれぞれ２つの宿主細胞内で発現されるとき、第１Ｆｃ鎖、または第１Ｆｃ鎖、及びそれと連結された抗原結合部位は、ホモダイマーを形成する傾向を有さず、第２Ｆｃ鎖、または第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結された抗原結合部位も、ホモダイマーを形成する傾向を有さない。
Kabat ＥＵ索引番号体系は、Kabatが１つの番号を抗体配列の全アミノ酸に指定することを意味し、そのように、各残基の番号を指定する方法は、本分野においては、すでに標準的な方法である。Kabat方法は、その研究がなされていないその他抗体にも適用され、保守的なアミノ酸に基づき、標的抗体と、Kabat鑑定された共有配列のうち一つとについて比較を行う。
Ｆｃ断片は、結晶可能断片（Ｆｃ：fragmentcry stallizable）、ＩｇのＣＨ２とＣＨ３との結合区域に該当し、Ｉｇと、作動体分子または細胞とが相互作用を行う部位を意味する。
ＩｇＧは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ：immunoglobulin Ｇ）の略語であり、血清の主な抗体成分であり、ＩｇＧ分子中のｒ鎖抗原性差により、ヒトＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の四種類亜型を有する。
半抗体分子は、抗体の重鎖と軽鎖とが形成した構造であり、重鎖と軽鎖とが共有結合を介しても連結され、共有結合なしも連結される、抗原を識別する単一クローン抗体構造である。
Ｆａｂ断片は、分子識別配列であり、抗原結合断片（Ｆａｂ：fragment of antigen binding）であり、抗体分子の両アームに該当し、完全な軽鎖と重鎖とのＶＨ及びＣＨ１構造領域によって構成される。ｓｃＦｖは、分子識別配列であり、抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域との遺伝子操作を介して得られた抗体断片の構造異性体である。細胞膜受容体の細胞外部位は、分子識別配列であり、細胞膜受容体は、一般的に、細胞外部に位置し、相応する抗原またはリガンドを識別及び結合することができる細胞外部位、受容体を細胞表面に固定させることができる膜貫通領域、及び細胞内の酵素刺激活性を有するか、あるいは信号を伝達することができるチャネルを有する細胞内領域を含む。細胞膜受容体のリガンドは、細胞膜受容体細胞外領域によっても識別及び結合されるタンパク質、ポリペプチドまたは化合物を意味する。サイトカインは、免疫源、分裂促進因子、またはその他刺戟剤が誘導した多様な細胞によって生産される低分子量の可溶性タンパク質であり、固有免疫及び適応性免疫、血液細胞生成、細胞生長、ＡＰＳＣ多機能細胞調節、及び損傷組織修復のような多様な機能を有する。サイトカインは、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍懐死因子上科（superfamily）、コロニー刺激因子、ケモカイン、成長因子などにも区分される。タンパク質発現タグとは、標的タンパク質のＮ末端またはＣ末端に加入される一団のアミノ酸配列を意味し、小さいペプチドまたは長いアミノ酸でもある。タグの添加、はタンパク質の正確なフォールディングに有利でもあり、細胞内タンパク質の分解減少に有利でもある。折々使用されるタグにおいては、ＨＡ、ＳＵＭＯ、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、ＧＦＰ、Ｆｌａｇを含むが、それらに制限されるものではない。
本発明のヘテロダイマー系二重特異性抗体に応用されうる抗体には、いかなる制限もない。望ましくは、従来技術ですでに疾病の治療及び／または予防に使用される抗体は、いずれも本発明にも応用される。
本発明のヘテロダイマー系二重特異性抗体は、１または多数の代替、欠失、添加及び／または挿入を有することができる。例えば、一部アミノ酸がタンパク質構造中のその他アミノ酸を代替しても、その他ポリペプチド（例えば、抗原）または細胞と結合する能力が明らかに損失されるものではない。結合能と、タンパク質の性質とがタンパク質の生物機能的活性を決定するので、タンパク質配列上において、一部アミノ酸配列の代替を行っても、それらに係わる生物学的効用または活性を明らかに損失させない。
さまざまな場合において、ポリペプチド変異体は、１または多数の保存的置換を含んでもよい。「保存的置換」とは、そのうちのアミノ酸が類似性質を有した他のアミノ酸で置換されることを意味するので、ペプチド化学分野の当業者らは、ペプチドの二次構造と親水性とには、基本的な変化が発生しないことを予測することができる。
アミノ酸置換は、一般的に、疎水性、親水性、電荷、大きさのようなアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に基づく。前述の多様な特徴を考慮した例示的置換は、本分野の当業者らがすでに公知しており、アルギニン及びリシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸、セリン及びトレオニン、グルタミン及びアスパラギン、及びバリン、ロイシン及びイソロイシンを含む。
本発明で使用された用語である「同一性」は、本分野の公知含意を有し、本分野の当業者も、異なる配列間の同一性を測定する規則と標準とが、配列比較及びギャップの導入（必要な場合、最大％の相同性を獲得するためである）後、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列変異体の残基と、非変異体配列との相同性百分率を意味することを熟知している。本発明において、同一性限定を満足する状況において、獲得された変異体配列は、母体配列が有する生物的活性を有さなければならない。本分野の当業者らは、前記活性を利用し、変異体配列を選別する方法及び手段を周知している。本分野の当業者らは、本出願で公開された内容の教示下で、そのような変異体配列を容易に獲得することができる。具体的な実施例において、ポリヌクレオチドとポリペプチッドとの変異体は、本文で説明されたポリヌクレオチドまたはポリペプチッドと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％のポリヌクレオチドまたはポリペプチッドの同一性を有する。遺伝暗号の重複性のために、互いに同一配列を暗号化するそのような配列の変異体が存在するであろう。
本発明の実施例においては、中間ないし高度の厳格な条件下において、本発明が提供するポリヌクレオチドの配列、その断片、またはその相互補完的配列と交雑されたポリヌクレオチド組成物を提供する。該交雑技術は、分子生物学分野においては、公知の技術である。説明目的のために、本発明のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドの交雑をテストするのに適する中間厳格条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍ ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液で前洗浄すること、５０〜６５℃、５×ＳＳＣに一晩置く条件下で交雑させる、次に６５℃で２０分間、０．１％のＳＤＳを含む２×，０．５×及び０．２×のＳＳＣでそれぞれ２回ずつ洗浄することを含む。本分野の当業者らは、例えば、交雑溶液の塩含量、及び／または交雑を行う温度を変更することにより、交雑の厳格性を容易に操作することができるということを理解するであろう。例えば、他の実施例において、適する高厳格交雑条件は、前述の条件を含むが、差異は、交雑温度が上昇し、例えば、６０〜６５℃または６５〜７０℃に達するのである。
本発明の宿主細胞は、外来遺伝子発現に使用される全ての細胞でもあり、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞を含むが、それらに制限されるものではない。
本発明のベクターは、いかなる類型の細胞または生物体においても、複製を行うことができるベクターであり、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド及びミニ染色体を含む。一部実施例において、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、ポリヌクレオチドの繁殖または複製に適するベクターであるか、あるいは本発明のポリペプチド発現に適するベクターである。そのようなベクターは、本分野において周知されているだけではなく、購入も可能である。
「ベクター」は、シャトルベクターと発現ベクターとを含む。一般的に、プラスミド構造体は、それぞれ細菌中のプラスミドの複製と選択とのための複製基点（例えば、ＣｏｌＥ１複製基点）及び選択標識（例えば、アンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性）を含む。「発現ベクター」とは、細菌内または真核細胞内において、抗体断片を含む本発明の抗体発現に必要な制御配列または調節要素を含むベクターを意味する。
本発明のベクターは、外来遺伝子発現に使用される全てのベクターであり、プラスミドベクターを含むが、それに制限されるものではない。このとき、プラスミドベクターは、少なくとも複製開始サイト、促進子、標的遺伝子、多重クローンサイト、選抜標識遺伝子を含み、望ましくは、本発明の前記ベクターは、Ｘ０ＧＣベクターのように、ｐＣＤＮＡを基に改変して得られたプラスミドベクターを含むが、それに制限されるものではない。
本発明の個体は、家擒類動物、爬虫類類動物、哺乳類動物などを含む。望ましくは、哺乳類動物は、齧歯類動物、霊長類動物を含み、望ましくは、霊長類動物は、ヒトを含む。
本発明に係わる疾病の範囲は、腫瘍を含むがそれに制限されるものではなく、望ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平細胞癌、非小細胞性肺癌、鼻咽頭癌腫、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、腎臓癌、黒色腫瘍のような疾病を含む。
薬理学的に許容される担体は、希釈剤、賦形剤及び水のような薬理学分野で一般的に使用される薬理学的担体；澱粉、ショ糖、ラクトース、微結晶セルロースのような充填剤；セルロース誘導体、アルギネート、ゼラチン及びポリビニルピロリドンのような結合剤；グリセリンのような湿潤剤；カルボキシメチル澱粉、ヒドロキシプロピルセルロース、クロスカルメロース、寒天、炭酸カルシウム及び炭酸水素ナトリウムのような崩壊剤；四次アンモニウム化合物のような吸収増進剤；セチルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウムのような界面活性剤；高嶺土及びソープクレイのような吸着担体；タルク、カルシウム及びステアリン酸マグネシウム、微粉シリカゲル及びポリエチレングリコールのような潤滑剤を言う。また、香味剤、甘味剤のような他の補助剤を組成物に添加することができる。
以下においては、後述される非制限的実施例を介し、本発明についてさらに詳細に説明する。本分野の当業者らは、本発明の思想を外れずに、本発明について多様な補正を施すことができ、そのような補正も、本発明の範囲に該当するものである。
後述される実験方法は、特別に説明されない限り、いずれも一般的な方法であり、使用された実験材料も、特別に説明されない限り、商社や企業から容易に購入することができるものである。本発明の後述実施例において使用される各種抗体は、いずれも商業的ルートから求めた標準抗体である。
実施例１．抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子のベクター構造構築
それぞれヒトＰＤ−１に抵抗する抗体の重鎖と軽鎖とを含むＸ０ＧＣ発現ベクターを構築する。そのうち、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列番号９で示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号１０で示されている通りであり、軽鎖不変領域のヌクレオチド配列は、配列番号３で示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号４で示されている通りであり、重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列番号１１で示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号１２で示されている通りであり、重鎖不変領域のヌクレオチド配列は、配列番号１３で示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号１４で示されている通りである。ＰＣＲ方法により、軽鎖可変領域及び軽鎖不変領域、重鎖可変領域及び重鎖不変領域をそれぞれ拡張させた。本発明の全てのＰＣＲ反応においては、ＮＥＢ社のPhusion超適合度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆ−５３０Ｌ）を使用した。
ＰＣＲプライマーは、相補的塩基配列原則及び制限酵素サイトの必要性に基づき、一般的な設計を行う。反応体系は、いずれもＨ２Ｏ ８．９μｌ、５×Phusion超適合度ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液４μｌ、１ｍＭ ｄＮＴＰ ４μｌ、フォワードプライマー１μｌ、リバースプライマー１μｌ、Phusion超適合度ＤＮＡポリメラーゼ０．１μｌ、テンプレート１μｌで構成される。可変領域と不変領域とのＰＣＲ産物を、１．５％のアガロースゲルを介して電気移動させた、ＤＮＡ回収キット（Promega、Ａ９２８２、以下同一）を使用し、相応する断片を回収した。回収された可変領域断片及び不変領域断片をテンプレートにし、可変領域のフォワードプライマー及び不変領域のリバースプライマーを使用し、ＰＣＲ反応をさらに１回行った後、相応する断片をさらに回収し、重鎖と軽鎖との全体長断片を得た。Ｘ０ＧＣベクター及び全体長断片を、ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、製品コードＲ３１０１Ｌ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ、製品コードＲ３１０４Ｌ）を使用して酵素制限し、酵素制限反応体系は、１０×緩衝液３２μｌ、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩそれぞれ０．５μｌ、ゲル回収で得た全体長断片３μｌ、Ｈ２Ｏ １４．５μｌである。制限酵素体系を、３７℃条件下で３時間反応させた。制限酵素産物を、Ｔ４ ＤＮＡ連結酵素（ＮＥＢ、製品コードＭ０２０２Ｖ）を利用して連結し、反応体系は、１０×連結酵素緩衝液２μｌ、連結酵素０．５μｌ、ゲル回収で得た全体長断片３μｌ、ゲル回収で得たＸ０ＧＣベクター３μｌ、Ｈ２Ｏ １１．５μｌであった。それを室温で連結し、１２時間反応させた。連結産物を、大腸菌コンピテント細胞ＤＨ５α（Tiangen、製品コードＣＢ１０４）に転換し、真核細胞において、抗体の重鎖と軽鎖とを発現させるための抗体重鎖と抗体軽鎖とのＸ０ＧＣ発現ベクターをそれぞれ獲得した。
抗ヒトＨＥＲ２を含む抗体の重鎖と軽鎖とのＸ０ＧＣ発現ベクターをそれぞれ構築した。そのうち、抗体可変領域の配列は、http://www.drugbank.ca/drugs/DB00072をその出処にする。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列番号１で示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号２で示されている通りであり、軽鎖不変領域のヌクレオチド配列は、配列番号３で示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号４で示されている通りであり、重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列番号５で示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号６で示されている通りであり、重鎖不変領域のヌクレオチド配列は、配列番号７で示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号８で示されている通りである。前述の内容のような方法により、真核細胞において、抗体の重鎖と軽鎖とを発現させるところに利用される抗体重鎖と抗体軽鎖とのＸ０ＧＣ発現ベクターをそれぞれ獲得することができる。
実施例２．抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の発現
抗ヒトＰＤ−１を含む抗体の重鎖と軽鎖との発現ベクターそれぞれを２９３Ｆ細胞に形質注入させ（FreeStyleＴＭ ２９３−Ｆ Cells、製品コードＲ７９００７、Invitrogen）、また抗ヒトＨＥＲ２を含む抗体の重鎖と軽鎖との発現ベクターも、それぞれ２９３Ｆ細胞に形質注入させた。形質注入前日に細胞を注入し、形質注入当日には、細胞を遠心収集し、細胞を新鮮なFreeStyleＴＭ ２９３発現培地（FreeStyleＴＭ ２９３ Expression Medium、製品コード１２３３８００１、Gibco）に再懸濁させ、細胞密度は、２００＊１０５細胞／ｍＬであった。形質注入体積によってプラスミドを投入し、最終濃度が３６．６７μｇ／ｍＬになれば、軽く均一混合し、次に、線形ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、線形、Ｍ．Ｗ．２５０００、製品コード４３８９６、Alfa Aesar）を投入し、最終濃度が５５μｇ／ｍＬになれば、軽く均一混合した。その後、細胞培養器に投入し、１２０ｒｐｍ速度の振盪器で３７℃で１時間培養した。その後、１９倍の形質注入体積を有する新鮮な培地を添加した。次に、１２０ｒｐｍ速度の振盪器で３７℃で培養した。５〜６日間形質注入した細胞培養上澄み液を遠心収集した。
ＥＬＩＳＡ方法で発現量を測定した。クロマトグラフィ適用前、０．２μｍの濾過膜で濾過し、沈殿物を除去した。該段階は、４℃の温度で行われた。
実施例３．抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体発現物の精製
ＡＫＴＡ explorer１００型タンパク質精製システム（ＧＥ Healthcare）及び親和性クロマトグラフィｒProtein Ａ Sepharose Fast Flow（１６ｍｍ Ｉ．Ｄ．、２２ｍｌ、ＧＥ Healthcare）を使用し、４℃で精製を行った。まず、移動相のＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）でもって、クロマトグラフィの平衡化を行い、基線が安定した後、前述の処理過程を経た細胞上澄み液にサンプルをローディングし、流速は、５ｍｌ／ｍｉであり、サンプルをローディングした後には、移動相Ａでもって平衡化を行った。サンプルは、それぞれ抗ＰＤ−１発現物及び抗ＨＥＲ２発現物である。その後、まず、移動相のＢ１でもって（０．５Ｍアルギニンを含む移動相のＡ）、５個カラムの体積を溶出し、移動相のＢ２でもって（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０）、５個カラムの体積を溶出し、抽出最大値、すなわち、目的タンパク質の最大値を収集し、前記溶出段階の流速は、いずれも５ｍｌ／ｍｉｎであった。抗ＰＤ−１発現物の抽出最大値クロマトグラフィは、図１に図示されている通りであり、抗ＨＥＲ２発現物の抽出最大値は、それと類似している（結果を含まない）。表示された溶出ピーク（灰色領域で表示）を収集し、１Ｍの酢酸ナトリウム溶液を滴下し、ｐＨを５．０に調節した。
実施例４．抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の製造及び精製
抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の構造は、図２に図示されている通りである。
前述のｒProtein Ａ Sepharose Fast Flow（１６ｍｍ Ｉ．Ｄ．、２２ｍｌ、ＧＥ Healthcare）方法によって精製して得られた抗ＰＤ−１発現物及び抗ＨＥＲ２発現物に体外組み換えを行い、ヘテロダイマーを獲得した。まず、前述の精製して収集したタンパク質溶液を、超濾過濃縮管を介して超濾過濃縮し（標準カットオフ分子量１０ＫＤａ）、溶液をリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ：phosphate buffer saline）（ｐＨ＝７．４）に置き換えた。獲得した抗ＰＤ−１及び抗ＨＥＲ２の精製発現物溶液に、それぞれ前記ＰＢＳを添加し、１ｍｇ／ｍｌに調節し、１／２００倍の最終体積を有する１Ｍ ＤＴＴを添加し、ＤＴＴの最終濃度は、それぞれ５ｍＭである。４℃条件下で還元を行い（３〜８時間）、還元過程を介して二硫化結合が開放され、抗ＰＤ−１発現物及び抗ＨＥＲ２発現物に含有された少量の抗体ホモダイマー分子ヒンジ領域の二硫化結合も開放され、一本鎖重鎖と一本鎖軽鎖とを含む半抗体分子を形成し、その構造は、図３に図示されている通りである。還元されたサンプルは、移動相緩衝液において、１ｍＭのＤＴＴ還元剤を含むＳＥＣ−ＨＰＬＣ（ＴＯＳＯＨ、ＴＳＫｇｅｌ superＳＷ３０００）によって分析され、その結果は、図４のＡとＢとに図示されている通りである。抗ＰＤ−１半抗体分子の比率が１００％であり、抗ＨＥＲ２半抗体分子の比率が８９．３％であり、残り１０．７％は、集合体であるが、二硫化結合が開放されていないホモダイマーは、存在しない。
還元された抗ＰＤ−１半抗体分子及び抗ＨＥＲ２半抗体分子などを、モル比率によって混合し、４℃の条件下で２４時間組み換え反応を行った。組み換え過程において、抗ＰＤ−１半抗体分子及び抗ＨＥＲ２半抗体分子は、ＣＨ２とＣＨ３との非共有相互作用を介し、同時に抗ＰＤ−１半抗体分子及び抗ＨＥＲ２半抗体分子を含むヘテロダイマー系二重特異性抗体を形成した。その後、タンパク質溶液を、超濾過濃縮パイプで超濾過濃縮（標準カットオフ分子量１０ＫＤａ）し、溶液をリン酸塩溶液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）に置き換えて還元を終了し、空気または酸化剤で酸化反応を行い、ヘテロダイマー系二重特異性抗体の二硫化結合がさらに形成されるようにした。酸化反応の条件は、酸化剤１００ｍＭ Ｌ−ジヒドロアスコルビン酸を添加し、タンパク質最終濃度が１ｍｇ／ｍｌ、酸化剤最終濃度が１ｍＭになれば、４℃条件下で酸化を進め、２４時間反応を行うのである。前述の酸化反応で得られたサンプルにＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を行い、結果は、図５に図示されている通りであった。
前述の抗ＰＤ−１半抗体分子及び抗ＨＥＲ２半抗体分子の還元酸化を経て得られたヘテロダイマー抗体分子を、超濾過濃縮パイプを介して超濾過濃縮させ（標準カットオフ分子量１０ＫＤａ）、溶液を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液に置き換え、ｐＨは、５．８であった。ＡＫＴＡ explorerｅ１００型タンパク質精製システム（ＧＥ Healthcare）、イオンクロマトグラフィSource １５Ｓ（１６ｍｍ Ｉ．Ｄ．、１７ｍｌ、ＧＥ Healthcare）を使用し、４℃下で精製を行った。まず、移動相Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を使用してクロマトグラフィを平衡化させ、基線が安定した後、前述の処理を経たタンパク質溶液にサンプルをローディングし、流速は、３ｍｌ／ｍｉｎであり、サンプルローディング後、移動相Ａを使用して平衡化を行い、その後、Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８）を使用し、Ｂ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８）まで、段階的に２０個のカラム体積（０％Ｂ〜１００％Ｂ、１７０ｍｉｎ、流速２ｍｌ／ｍｉｎ）を洗浄し、溶出最大値を収集し、収集されたタンパク質溶液は、超濾過濃縮パイプを介して超濾過濃縮され（標準カットオフ分子量１０ＫＤａ）、溶液をリン酸塩溶液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）に置き換えて濾過殺菌し、４℃の温度で保存した。精製物にＳＥＣ−ＨＰＬＣ方法で純度分析を行い、結果は、図６に図示されている通りであり、純度は、９９．９６％であった。
実施例５．抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の安定性
十分に密封された１ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマーサンプルを、４０℃の温度維持装置（BINDER ＫＢＦ２４０）に放置し、相応する時間ポイントで（基線（初日）、第２週、第４週）２０μｇのサンプルを取り、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を行って分離された。前記ＳＥＣ−ＨＰＬＣの条件は、次の通りである：（１）排除クロマトグラフィ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌ（Tosoh Bioscience）、５μｍ、７．８ｍｍ×３０ｃｍ；（２）移動相：５ｍＭ ＰＢＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７；（３）流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ；（４）紫外線探知波長：２８０ｎｍ；（５）収集時間：３０分。使用した測定器は、Agilent １２００ Infinityクロマトグラフィ装置であり、Agilent ChemStationを利用して記録し、余剰モノマーの比率を計算した。下記表１に図示されている通り、４０℃の実験条件下、前記二量体は、明らかな凝集を起こさず、従って、前記抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマーは、比較的優秀な熱安定性を有すると判断される。
Figure 2021513366
実施例６．抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体の体外標的結合活性
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用し、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体と、１つの抗原との結合能を測定した。
ＥＬＩＳＡの具体的な実施過程は、次の通りである：ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝溶液（０．０５Ｍ）で、９６ウェル高吸着ＥＬＩＳＡプレート（Costar、製品コード４２５９２）上で組み換えられたヒトＰＤ−１（Beijing Yiqiao Shenzhou、製品コード１０３７７−Ｈ０８Ｈ）またはヒトＨＥＲ２（Beijing Yiqiao Shenzhou、製品コード１０００４−Ｈ０８Ｈ）にコーティングを行い、該コーティング濃度は、１μｇ／ｍＬであり、コーティング量は、ウェル当たり１００μＬであり、コーティングは、４℃で一晩行われた。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴを利用し、ウェル当たり３００μＬになったときに密封し、２５℃で１時間培養した。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで配列希釈したヘテロダイマー抗体サンプル及び対照群を、ウェル当たり１００μＬずつ添加し、２５℃で１時間培養した。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。その後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：２，０００に希釈したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識の抗ヒトＩｇＧ抗体（Chemicon、製品コードＡＰ３０９Ｐ）を添加し、ウェル当たり１００μＬ添加し、２５℃で１時間培養した。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。表色基質ＴＭＢをウェル当たり１００μＬずつ添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を、ウェル当たり１００μＬずつ添加し、発色を終了させた。マイクロプレート読取り機で、４５０ｎｍ地点での吸光度を判読した。
その結果、図７のＡとＢとに図示されている通り、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体は、ＰＤ−１とＨＥＲ２ろに対して高い親和力を有することにより、二価単一クローン抗体の抗原親和的活性を維持した。
実施例７．抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体の二重標的の同時結合活性
酵素結合免疫吸着測定法を使用し、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体が、２つの異なる抗原と同時に結合する能力を測定した。
酵素結合免疫吸着測定法の具体的な実施過程は、次の通りである：ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用し、９６ウェル高吸着ＥＬＩＳＡプレート上で組み換えられたヒトＨＥＲ２（Beijing Yiqiao Shenzhou、製品番号１０００４−Ｈ０８Ｈ）にコーティングを行い、該コーティング濃度は、１μｇ／ｍＬであり、ウェル当たり１００μＬであり、コーティングは、４℃で一晩行われた。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴを利用し、ウェル当たり３００μＬになったときに密封し、２５℃で１時間培養させた。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで希釈したヘテロダイマー抗体サンプル及び対照群を、ウェル当たり１００μＬずつ添加し、２５℃で１時間培養させた。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。その後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで希釈されたビオチン標識のＰＤ−１−Ｆｃ（北京韓米薬品）を０．５μｇ／ｍＬ添加し、ウェル当たり１００μＬずつ添加し、２５℃で１時間培養させた。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１，０００に希釈したストレプトアビジン・ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ共役物（ＢＤ Pharmingen、製品コード５５４０６６）を添加し、ウェル当たり１００μＬずつ添加し、２５℃で１時間培養した。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。表色基質ＴＭＢを、ウェル当たり１００μＬずつ添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を、ウェル当たり１００μＬずつ添加して発色を終了させた。マイクロプレート読取り機で４５０ｎｍの吸光度を判読した。
その結果、図８に図示されている通り、ＰＤ−１単一クローン抗体（該重鎖可変領域配列及び該軽鎖可変領域配列は、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体中のＰＤ−１結合部位中の相応する配列と同一である）とＨＥＲ２単一クローン抗体（トラスツズマブ）との組み合わせは、ＰＤ−１、ＨＥＲ２と同時に結合することができず、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体だけが、同時に２つの抗原と結合する活性を有する。
流細胞分析器（ＦＣＭ、ＦＡＣＳ Calibur、ＢＤ Biosicencesから購入）を使用し、高発現ＰＤ−１のＣＨＯ／ＰＤ−１（GenScript、製品番号Ｍ００５２９）細胞と、高発現ＨＥＲ２のＳＫ−ＢＲ−３細胞との上で、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体と二重標的抗原との同時結合能を測定した。
ＰＫＨ２６試薬キット（Sigma、製品コードＳＬＢＨ４５６８Ｖ）の使用説明書を参照し、ＣＨＯ／ＰＤ−１細胞を染色した。要約すれば、ＣＨＯ／ＰＤ−１細胞を収集し、無血清培地で１回洗浄した後、ＰＫＨ２６試薬キットのDiluent Ｃを利用し、ＣＨＯ／ＰＤ−１を、それぞれ２×１０７／ｍＬの細胞浮遊液に製造し、ＰＫＨ２６染料を４μＭまで希釈した後、１：１で混合した。本混合浮遊液の細胞密度は、１×１０７／ｍＬであり、ＰＫＨ２６の濃度は、２μＭであり、室温で１時間培養させた後、同等な体積を有するＦＢＳを利用して１分間培養させた後、染色を終了させた。４００ｇで１０分間の遠心分離後、正常培地を利用して２回洗浄し、完全培地にさらに浮遊させて準備した。ＣＦＳＥ試薬キット（Life technology、製品コードＣ３４５５４）の使用説明書を参照し、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を染色した。要約すれば、ＰＢＳで、ＣＦＳＥを作業濃度０．５まで希釈して３７℃で予熱し、１，０００ｒｐｍの速度で５分間遠心分離し、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を収集し、予熱されたＣＦＳＥ作業溶液を、ＳＫ−ＢＲ−３に再浮遊させ、３７℃で１５分間培養させ、１，０００ｒｐｍ速度で５分間遠心分離して細胞を収集した後、さらに完全培地に再浮遊させ、３０分間培養させ、完全培地を利用して１回洗浄した後、完全培地に浮遊させて準備した。前記染色された細胞を遠心収集し、２％のＦＢＳを含む冷たいＰＢＳで１回洗浄した。２％のＦＢＳを含む冷たいＰＢＳに細胞を再浮遊させれば、細胞密度は、５×１０６／ｍＬになる。ＳＫ−ＢＲ−３及びＣＨＯ／ＰＤ−１を１：１で混合した後、各フローパイプから１００μＬずつ取り（すなわち、２．５×１０５のＳＫ−ＢＲ−３と、２．５×１０５のＣＨＯ／ＰＤ−１とである）、さらに２％のＦＢＳを含む冷たいＰＢＳに希釈させたヘテロダイマー抗体サンプル１００μＬ、対照群及び同型対照群（ヒト免疫グロブリン、Jiangxi Boya生物制約有限責任会社、国家医薬品許可番号Ｓ１９９９３０１２）を添加し、最終濃度は、５ｎＭである。フローパイプは、氷上で３０分間培養させた。２％のＦＢＳを含むＰＢＳで２回洗浄した。さらに、５００μＬの冷たいＰＢＳに再浮遊させ、前記細胞を流細胞分析器上に浮遊させて測定分析を行った。
その結果、図９に図示されている通り、ヘテロダイマー抗体が、同時に、高発現ＰＤ−１のＣＨＯ／ＰＤ−１細胞と高発現ＨＥＲ２のＳＫ−ＢＲ−３細胞とと結合することにより、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体が、ＳＫ−ＢＲ−３細胞とＣＨＯ／ＰＤ−１細胞との相互接近を誘発するのである。
実施例８．抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体が、ＰＤ−１とリガンドＰＤ−Ｌ１，ＰＤ−Ｌ２との結合に対して有する遮断活性
酵素結合免疫吸着測定法を使用し、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の結合、及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２の結合に対して有する遮断活性を測定した。
ｐＨ９．６のリン酸塩緩衝溶液を利用し、９６ウェル高吸着ＥＬＩＳＡプレート上で、組み換えヒトＰＤ−１−Ｆｃにコーティングを行い、コーティング濃度は、１μｇ／ｍＬであり、コーティング量は、ウェル当たり１００μＬであり、コーティングは、４℃で一晩行われた。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴを利用し、ウェル当たり３００μＬになったときに密封し、２５℃で１時間培養させた。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで希釈したヘテロダイマーサンプル及び対照群を添加し、同時に、最終濃度１μｇ／ｍＬであるビオチン標識のＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ、または最終濃度４μｇ／ｍＬであるビオチン標識のＰＤ−Ｌ２をウェル当たり１００μＬずつ添加し、２５℃で１時間培養した。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。その後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで、１：１，０００に希釈したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識のストレプトアビジン（ＢＤ、製品コード５５４０６６）を、ウェル当たり１００μＬ添加し、２５℃で１時間培養した。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。表色基質ＴＭＢを、ウェル当たり１００μＬずつ添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を、ウェル当たり１００μＬずつ添加し、発色を終了させた。マイクロプレート読取り機で、４５０ｎｍの吸光度を判読した。
その結果、図１０のＡとＢとに図示されている通り、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２結合を遮断し、二価単一クローン抗体の遮断活性を比較的良好に保存した。
実施例９．抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子のＴ細胞調節活性
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を利用し、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体が、Ｔ細胞免疫反応に対して有する調節活性を測定した。
ヒト樹状細胞（ＤＣ）の獲得：ヒトＰＢＭＣ細胞（Lonza、製品コードＣＣ−２７０２）を蘇生させて収集した。ヒトＰＢＭＣ細胞を、細胞密度５×１０６／ｍＬで、無血清のＲＰＭＩ １６４０培地に再浮遊させ、細胞培養フラスコに接種し、３７℃の二酸化炭素培養器で９０分間培養させた。培養液の上澄み液と再浮遊細胞とを捨て、付着依存性細胞を完全培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）で培養させ、１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Beijing Yiqiao Shenzhou、製品コード１００１６−ＨＮＡＨ）と、１００ｎｇ／ｍＬＩＬ−４（Beijing Yiqiao Shenzhou、製品コード１１８４６−ＨＮＡＥ）とを添加した。それを３日間培養させ、溶液を交換した後、さらに３日間培養させた。その後、培地を１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４、及び２０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αを含む完全培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）に交換し、１日培養させた。それにより、ＤＣ細胞を獲得した。
ヒトＴ細胞獲得：ヒトＰＢＭＣ細胞（Lonza、製品コードＣＣ−２７０２）を蘇生させて収集し、該ＰＢＭＣと、ＤＣ細胞を誘導するＰＢＭＣとが異なる個体に由来するようにした。ＰａｎＴの細胞分離キット（Miltenyi Biotech、製品コード５１５０４１４８２０）使用説明書を参照し、ヒトＴ細胞を分離した。要約すれば、まず、ＰＢＳでＰＢＭＣを１回洗浄した後、ＰＢＭＣを、分離緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＢＳＡを含むｐＨ７．２のＰＢＳ）に、４０μＬ当たり１０７個の細胞で再浮遊させ、１０μＬのＰａｎ Ｔ cell Biotin Antibody Cocktailを添加し、４℃で５分間培養させた。その後、３０μＬの分離緩衝液と、２０μＬのＰａｎ Ｔ cell MicroBead Cocktailを添加し、４℃で１０分間培養した。ＭＡＣＳ分離カラムを介し、Ｔ細胞を獲得した。
収集したヒトＤＣ細胞とヒトＴ細胞を完全培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ）に再浮遊させ、９６ウェルプレートに接種した。接種したＤＣ細胞とＴ細胞は、それぞれ１×１０４／ウェル、１×１０５／ウェルでもって混合培養された。そして、完全培地を利用して配列希釈したヘテロダイマー抗体サンプル及び対照群を添加した。培養平板を、３７℃の二酸化炭素培養器に配置し、５日間培養した。培養が完了した後には、ウェル内の上澄み液を取り、キット説明書により、サイトカインＩＦＮ−γを探知した（RayBiotech、製品コードＥＬＨ−ＩＦＮｇ）。
図１１に図示されている通り、ヒトＴ細胞は、同種異形ＤＣ細胞の刺激下において、ＩＦＮ−γの分泌を活性化させる。ＰＤ−１単一クローン抗体を添加すれば、Ｔ細胞の活性化を強化させ、サイトカインの分泌を促進させる。しかし、ＨＥＲ２単一クローン抗体は、そのような活性を有さない。抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体は、ＰＤ−１単一クローン抗体に匹敵するＴ細胞制御活性を示し、サイトカインＩＦＮ−γの分泌を顕著に促進させる。
実施例１０．抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の腫瘍細胞抑制活性
ヒトＰＢＭＣの存在下、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体が、ヒト乳癌細胞ＳＫ−ＢＲ−３に対して有する殺傷活性を検査した。
ＳＫ−ＢＲ−３細胞は、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地（すなわち、完全培地）で培養された。ＳＫ−ＢＲ−３細胞を収集し、完全培地に再浮遊させ、細胞密度は、５×１０４／ｍＬであり、ウェル当たり１００μＬを９６ウェル細胞培養プレートに接種した。すなわち、ウェル当たり５，０００個の細胞が接種された。ヒトＰＢＭＣ細胞（Lonza、製品コードＣＣ−２７０２）を蘇生させて収集し、ヒトＰＢＭＣ細胞を、細胞密度５×１０５／ｍＬで、ＲＰＭＩ １６４０完全培地に再浮遊させ、９６ウェル細胞培養プレートに、ウェル当たり５０μＬずつ接種した。すなわち、ウェル当たり２５，０００個の細胞を接種し、有効標的細胞の比率は、５：１である。完全培地を利用し、配列希釈したヘテロダイマー抗体サンプル及び対照群を、ウェル当たり５０μＬずつ添加した。培養プレートを、３７℃、５％のＣＯ２培養器に入れて３日間培養した。培養終了時、培地を利用し、細胞培養プレート内のＰＢＭＣを洗浄除去した後、完全培地１００μＬとＭＴＳ（CellTiter９６ Aqueous One Solution、Promega、製品コード：Ｇ３５８Ｂ）２０μＬを添加し、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を探知する。該細胞培養プレートを、培養器内において、３〜４時間続けて培養させた後、マイクロプレート読取り機上において、４９０ｎｍ地点での吸光度を判読した。
図１２に図示されている通り、ＨＥＲ２単一クローン抗体を添加すれば、ＳＫ−ＢＲ−３を殺傷して抑制することができるが、ＰＤ−１単一クローン抗体は、in vitroにおいては、そのような活性を有さない。抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体も、ＨＥＲ２単一クローン抗体と匹敵する、腫瘍細胞殺傷の抑制活性を示した。
実施例１１．抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子が動物体内で有する抗腫瘍薬効に係わる研究
実験材料としては、メスであり、６〜８週の、免疫欠乏ＮＣＧマウス（南京生物医薬研究院）を選択して使用した。マウスが環境に適応してから１週後、各マウスの右側背側皮下に、５ｘ１０６個のヒト乳癌細胞を接種した。腫瘍体積の嵩が約１００ｍｍ３になったとき、腫瘍体積によってグループ分けを行い、各グループの腫瘍保有マウスは、８匹である。まず、ヒトＰＢＭＣを投与し、マウスの免疫系統部分をヒト化させ、各マウスに５ｘ１０６個の細胞を静脈注射で接種した。その後、それぞれ溶媒（ＰＢＳ）、ＰＤ−１単一クローン抗体３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（５ｍｇ／ｋｇ）、ＨＥＲ２単一クローン抗体３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（５ｍｇ／ｋｇ）、ＰＤ−１単一クローン抗体３５ｎｍｏｌ／ｋｇに、ＨＥＲ２単一クローン抗体３５ｎｍｏｌ／ｋｇを追加した組み合わせ、及び抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（５ｍｇ／ｋｇ）を毎週２回２週間腹腔内に注射した。投薬開開始日から、毎週３回腫瘍体積を測定するが、その長直（ａ）と短径（ｂ）とを測定し、腫瘍体積計算公式は、次の通りである：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ａｘｂ２）／２。腫瘍体積測定持続期間は、３週であり、すなわち、投薬中止後、１週さらに観察した。
その結果、図１３に図示されている通り、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体は、ＰＤ−１単一クローン抗体、ＨＥＲ２単一クローン抗体よりさらに強い抗腫瘍薬効を有しており、投薬中止後にも、良好な腫瘍抑制作用を示した。
一部実施例において、それぞれの前記第１Ｆｃ鎖は、ＰＤ−１抗原結合部位と共有結合で連結され、前記第２Ｆｃ鎖は、ＨＥＲ２抗原結合部位と共有結合で連結される場合、あるいはそれぞれの前記第１Ｆｃ鎖は、ＨＥＲ２抗原結合部位と共有結合で連結され、前記第２Ｆｃ鎖は、ＰＤ−１抗原結合部位と共有結合で連結される場合、抗原剤存在下で単独に存在し、ホモダイマーを形成する重量比率がいずれも５０％未満である。

Claims (28)

  1. ヘテロダイマー系の二重特異性抗体であり、ＰＤ−１と特異性結合可能な第１抗原結合部位、及びＨＥＲ２と特異性結合可能な第２抗原結合部位を含み、そのうち、前記ヘテロダイマーは、１または多数の二硫化結合を介して鎖連結された第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖を含み、前記第１Ｆｃ鎖及び前記第２Ｆｃ鎖は、共有結合またはリンカーを介し、それぞれＰＤ−１抗原結合部位及びＨＥＲ２抗原結合部位に連結されるか、あるいは前記第１Ｆｃ鎖及び前記第２Ｆｃ鎖は、共有結合またはリンカーを介し、それぞれＨＥＲ２抗原結合部位及びＰＤ−１抗原結合部位に連結され、そのうち、ＰＤ−１抗原結合部位内の免疫グロブリン軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１０で示されている通りであり、ＰＤ−１抗原結合部位中の免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１２で示されている通りであり、第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖は、下記のような位置で５個アミノ酸の置換を含み、
    第１Ｆｃ鎖においては、３６６番目及び３９９番目アミノ酸が置換され、第２Ｆｃ鎖においては、３５１番目、４０７番目及び４０９番目アミノ酸が置換され、
    前記アミノ酸置換を含む第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖は、それぞれホモダイマーを形成する傾向なしに、共にヘテロダイマーを形成する傾向がさらに強く、
    そのうち、アミノ酸位置は、Kabat ＥＵ索引番号体系によって番号が付される、ヘテロダイマー系二重特異性抗体。
  2. 前記第１Ｆｃ鎖及び前記第２Ｆｃ鎖のアミノ酸は、
    ａ）Ｌ３５１Ｇ、Ｌ３５１Ｙ、Ｌ３５１Ｖ、Ｌ３５１Ｐ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｅ、Ｌ３５１ＫまたはＬ３５１Ｗ；
    ｂ）Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｐ、Ｔ３６６ＷまたはＴ３６６Ｖ；
    ｃ）Ｄ３９９Ｃ、Ｄ３９９Ｎ、Ｄ３９９Ｉ、Ｄ３９９Ｇ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９ＴまたはＤ３９９Ａ；
    ｄ）Ｙ４０７Ｌ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｐ、Ｙ４０７Ｆ、Ｙ４０７ＴまたはＹ４０７Ｈ；及び
    ｅ）Ｋ４０９Ｃ、Ｋ４０９Ｐ、Ｋ４０９Ｓ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｖ、Ｋ４０９ＱまたはＫ４０９Ｒと共に置換される、請求項１に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
  3. 前記アミノ酸置換は、
    ａ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒの置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｅ、Ｙ４０７及びＫ４０９Ｖの置換；
    ｂ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃの置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｇ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｃの置換；
    ｃ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃの置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ及びＫ４０９Ｐの置換；
    ｄ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｎの置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｖ、Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓの置換；
    ｅ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｗ及びＤ３９９Ｇの置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｄ、Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓの置換；
    ｆ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｉの置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｐ、Ｙ４０７Ｆ及びＫ４０９Ｆの置換；
    ｇ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｖ及びＤ３９９Ｔの置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｋ、Ｙ４０７Ｔ及びＫ４０９Ｑの置換；及び
    ｈ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ａの置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｗ、Ｙ４０７Ｈ及びＫ４０９Ｒの置換；を含む、請求項１または２に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
  4. 前記第１Ｆｃ鎖のアミノ酸は、Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒで置換され、第２Ｆｃ鎖のアミノ酸は、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖで置換される、請求項１に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
  5. Ｆｃ鎖は、ＩｇＧから始まる、請求項１ないし４のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
  6. 前記ＰＤ−１抗原結合部位及び前記ＨＥＲ２抗原結合部位は、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ断片である、請求項１ないし５のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
  7. 前記ＰＤ−１抗原結合部位及び前記ＨＥＲ２抗原結合部位は、いずれもＦａｂである、請求項１ないし６のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
  8. 前記ＰＤ−１抗原結合部位及び前記ＨＥＲ２抗原結合部位のうち一つは、Ｆａｂ断片であり、他の一つは、ｓｃＦｖ断片である、請求項１ないし６のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
  9. 前記Ｆａｂ断片は、異なる第１重鎖可変領域及び第２重鎖可変領域、及び異なる第１軽鎖可変領域及び第２軽鎖可変領域を含む、請求項６ないし８のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
  10. 前記第１Ｆｃ鎖、及びそれと連結されるＰＤ−１抗原結合部位、並びに前記第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結されるＨＥＲ２抗原結合部位、または第１Ｆｃ鎖、及びそれと連結されるＨＥＲ２抗原結合部位、並びに第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結されるＰＤ−１抗原結合部位は、単独で存在するか、あるいは還元剤と同時に存在する場合、ホモダイマーを形成する重量比率がいずれも５０％未満である、請求項１ないし９のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
  11. 前記二重特異性抗体のアミノ酸配列は、配列番号２，４，６，８，１０，１２及び１４から選択される、請求項１ないし１０のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
  12. 請求項１ないし１１のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体をコーディングする分離されたポリヌクレオチド。
  13. 配列番号１，３，５，７，９，１１及び１３から選択される、請求項１２に記載の分離されたポリヌクレオチド。
  14. 請求項１２または１３に記載の分離されたポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクター。
  15. 前記発現ベクターは、ｐＣＤＮＡに基づいて得られたプラスミドベクターＸ０ＧＣである、請求項１４に記載の組み換え発現ベクター。
  16. 請求項１２または１３に記載の ポリヌクレオチド、あるいは請求項１４または１５に記載の組み換え発現ベクターを含む宿主細胞。
  17. ヒト胚芽腎臓細胞ＨＥＫ２９３、またはＨＥＫ２９３細胞を基に改変して得られたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ、またはＣＨＯ細胞を基に改変して得られたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯから選択される、請求項１６に記載の宿主細胞。
  18. 請求項１ないし１１のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、請求項１１ないし１３のうちいずれか１項に記載の分離されたポリヌクレオチド、請求項１４または１５に記載の組み換え発現ベクター、あるいは請求項１６または１７に記載の宿主細胞、及び薬理学的に受容可能なベクターを含むことを特徴とする組成物。
  19. 請求項１ないし１１のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体を生産する方法であり、
    １）請求項１２または１３に記載の分離されたポリヌクレオチド、あるいは請求項１４または１５に記載の組み換え発現ベクターをそれぞれ宿主細胞内で発現させる段階と、
    ２）宿主細胞内でそれぞれ発現されるタンパク質を還元させる段階と、
    ３）還元されたタンパク質を混合した後、混合物を酸化させる段階と、を含むことを特徴とする方法。
  20. 前記宿主細胞は、ヒト胚芽腎臓細胞ＨＥＫ２９３、またはＨＥＫ２９３細胞を基に改変して得られたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ、またはＣＨＯ細胞を基に改変して得られたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥＸｐｉＣＨＯを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記還元段階は、１）還元反応を行い、前記還元剤は、２−メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、またはその他化合物またはその組み合わせを含む段階と、２）還元剤を除去する段階と、を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. 前記酸化段階は、空気中で酸化する段階であり、酸化剤が存在する状況で行われる酸化反応も含み、前記酸化剤は、Ｌ−ジヒドロアスコルビン酸、またはその他化学的誘導体から選択される、請求項１９ないし２１のうちいずれか１項に記載の方法。
  23. 分離精製段階をさらに含む、請求項１９ないし２２のうちいずれか１項に記載の方法。
  24. 請求項１ないし１１のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、及び／または請求項１２または１３に記載の分離されたポリヌクレオチド、及び／または請求項１４または１５に記載の組み換え発現ベクター、及び／または請求項１６またはに記載の宿主細胞、及び／または請求項１８に記載の組成物として、個体の疾病を予防及び／または治療する薬物に使用される用途。
  25. 請求項１ないし１１のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、及び／または請求項１２または１３に記載の分離されたポリヌクレオチド、及び／または請求項１４または１５に記載の組み換え発現ベクター、及び／または請求項１６または１７に記載の宿主細胞、及び／または請求項１８に記載の組成物として、個体疾病の予防及び／または治療に使用される薬物に使用される。
  26. 疾病を予防及び／または治療する方法であり、請求項１ないし１１のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、及び／または請求項１２または１３に記載の分離されたヌクレオチド、及び／または請求項１４または１５に記載の組み換え発現ベクター、及び／または請求項１６または１７に記載の宿主細胞、及び／または請求項１８に記載の組成物を、それを必要とする個体に投与する方法。
  27. 請求項２４に記載の用途、請求項に記載のヘテロダイマー系二重特異性分子、分離されたヌクレオチド、組み換え発現ベクター、宿主細胞または組成物、あるいは請求項２６に記載の方法において、個体は、哺乳動物であり、望ましくは、ヒトである。
  28. 請求項２４に記載の用途、請求項２５に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、分離されたポリヌクレオチド、組み換え発現ベクター、宿主細胞または組成物、あるいは請求項２６に記載の方法において、前記疾病は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平細胞癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌腫、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、黒色腫瘍を含む疾病から選択される。
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