CN116670289A - 抗pd-l1/抗cd47天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 - Google Patents
抗pd-l1/抗cd47天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种抗PD‑L1/抗CD47双特异抗体及其制备方法。该抗体具有天然IgG特点、并且是没有重轻链错配的高度稳定的异源二聚体形式。该双特异抗体能同时结合两种靶分子并且副作用更小。
Description
本发明涉及抗PD-L1/抗CD47天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备。具体而言，本发明提供了一种具有天然IgG特点、并且没有重轻链错配的高度稳定的异源二聚体形式的抗PD-L1/抗CD47双特异抗体及其制备方法。
程序性死亡配体-1(programmed death ligand 1,PD-L1)是免疫检查点程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)的配体，属于B7家族，诱导性表达于多种免疫细胞表面，包括T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、DC细胞以及内皮细胞、表皮细胞等。PD-L1与PD-1结合后，主要参与T细胞活化的负调控，可以调节免疫应答的强弱程度和持续时间。PD-L1除了作为PD-1的配体以外，还能作为CD80的配体，向T细胞传递负调控信号，诱导T细胞免疫耐受(Autoimmun Rev,2013,12(11):1091-1100.Front Immunol,2013,4:481.Nat Rev Cancer,2012,12(4):252-264.Trends Mol Med.2015 Jan；21(1):24-33.Clin Cancer Res.2012 Dec 15；18(24):6580-7.)。在正常情况下，PD-L1和PD-1可以介导和维持机体组织的自身免疫耐受，防止在炎症反应过程中免疫系统过度活化伤害自身组织，对避免自身免疫性疾病的发生具有积极作用；在病理情况下，其参与肿瘤免疫以及多种自身免疫病的发生发展过程。多项研究报道，PD-L1在多种肿瘤组织中高表达，PD-1在肿瘤浸润淋巴细胞中高表达，且PD-L1和PD-1的过表达与肿瘤不良临床预后密切相关(Anticancer Agents Med Chem.2015；15(3):307-13.Hematol Oncol Stem Cell Ther.2014 Mar；7(1):1-17.Trends Mol Med.2015 Jan；21(1):24-33.Immunity.2013 Jul 25；39(1):61-73.J Clin Oncol.2015 Jun 10；33(17):1974-82.)。利用PD-L1单克隆抗体阻断PD-L1/PD-1以及CD80/PD-L1的相互作用，在临床前实验研究和临床中都显示出了良好的抗肿瘤效果。目前PD-L1单克隆抗体已经被批准用于治疗非小细胞肺癌和尿路上皮癌等多种肿瘤。但是，只有一小部分肿瘤病人能受益于此类单抗疗法，多数病人对此类单抗没有应答(Expert Opin Ther Targets.2014 Dec；18(12):1407-20.Oncology(Williston Park).2014 Nov；28 Suppl 3:15-28.)。
CD47，又叫整合素相关蛋白，是一种大小为50Kd的跨膜蛋白，属于免疫球蛋白 超家族。广泛表达于多种细胞上，但在多种肿瘤细胞上表达明显增强(Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109(17):6662-6667)。CD47的配体为信号调节蛋白α(signal-regulatory proteinα,SIRPα)，主要表达于巨噬细胞，与CD47结合后传递“不要吃我”的信号，抑制巨噬细胞的吞噬作用(Curr Opin Immunol,2009,21(1):47-52)。通过使用抗CD47抗体可以阻断CD47-SIRPα信号通路，从而发挥抗肿瘤作用。目前已有多种抗CD47单克隆抗体进入了临床研究阶段，用于治疗多种血液肿瘤和实体瘤。但由于红细胞等表面也表达CD47，这些抗CD47治疗可能会导致较严重的贫血和血小板减少等不良反应，并且生物利用度较低。
因此，本领域仍然有必要研究一种同时阻断PD-L1和CD47信号通路的新型治疗药物。
发明内容
本发明提供了一种新的具有天然IgG结构特点、并且没有重轻链错配的高度稳定的异源二聚体形式的能同时阻断PD-L1和CD47的双特异抗体及其制备方法，该双特异抗体倾向于选择性结合同时高表达PD-L1和CD47的肿瘤细胞，从而发挥高效、特异的杀伤效果，同时具有较低的毒副作用。
本发明的第一方面涉及一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含特异性结合PD-L1的第一抗原结合功能区和特异性结合CD47的第二抗原结合功能区，其中
所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合功能区包含：
(A)重链可变区，所述重链可变区包含
(a)HCDR1，其包含SEQ ID NO.37所示的氨基酸序列，
(b)HCDR2，其包含SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列，和
(c)HCDR3，其包含SEQ ID NO.39所示的氨基酸序列；以及
(B)轻链可变区，所述轻链可变区包含
(a)LCDR1，其包含SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列，
(b)LCDR2，其包含SEQ ID NO.41所示的氨基酸序列，和
(c)LCDR3，其包含SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述双特异抗体的所述特异性结合CD47的第二抗原结合功能区包含：
(A)重链可变区，所述重链可变区包含
(a)HCDR1，其包含SEQ ID NO.43所示的氨基酸序列，
(b)HCDR2，其包含SEQ ID NO.44所示的氨基酸序列，和
(c)HCDR3，其包含SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列；以及
(B)轻链可变区，所述轻链可变区包含
(a)LCDR1，其包含SEQ ID NO.46所示的氨基酸序列，
(b)LCDR2，其包含SEQ ID NO.47所示的氨基酸序列，和
(c)LCDR3，其包含SEQ ID NO.48所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述双特异抗体的所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合功能区包含
(A)重链可变区，所述重链可变区包含
(a)HCDR1，其包含SEQ ID NO.37所示的氨基酸序列，
(b)HCDR2，其包含SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列，和
(c)HCDR3，其包含SEQ ID NO.39所示的氨基酸序列；以及
(B)轻链可变区，所述轻链可变区包含
(a)LCDR1，其包含SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列，
(b)LCDR2，其包含SEQ ID NO.41所示的氨基酸序列，和
(c)LCDR3，其包含SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列；并且
所述特异性结合CD47的第二抗原结合功能区包含
(A)重链可变区，所述重链可变区包含
(a)HCDR1，其包含SEQ ID NO.43所示的氨基酸序列，
(b)HCDR2，其包含SEQ ID NO.44所示的氨基酸序列，和
(c)HCDR3，其包含SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列；以及
(B)轻链可变区，所述轻链可变区包含
(a)LCDR1，其包含SEQ ID NO.46所示的氨基酸序列，
(b)LCDR2，其包含SEQ ID NO.47所示的氨基酸序列，和
(c)LCDR3，其包含SEQ ID NO.48所示的氨基酸序列。
如SEQ ID NO.37-42所示的特异性结合PD-L1的第一抗原结合功能区的6个CDR序列和如SEQ ID NO.43-48所示的特异性结合CD47的第二抗原结合功能区的6个CDR序列分别是本发明人以人PD-L1和CD47为抗原，利用杂交瘤技术获得的单克隆抗体的重轻链可变区的CDR，所述单克隆抗体不同于现有技术已知的PD-L1抗体和CD47抗体 且具有更高的生物活性，如更高的结合特异性、抗肿瘤活性等。
在一些实施方案中，特异性结合PD-L1的第一抗原结合功能区的6个CDR序列分别与SEQ ID NO.37-42所示序列具有至少70％的同一性且保留相应母体序列生物活性，例如至少75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性；或者分别为SEQ ID NO：37-42所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，例如1个、2个、3个或更多个；
在一些实施方案中，特异性结合CD47的第二抗原结合功能区的6个CDR序列分别与SEQ ID NO.43-48所示序列具有至少70％的同一性且保留相应母体序列生物活性，例如至少75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性；或者分别为SEQ ID NO：43-48所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，例如1个、2个、3个或更多个。
在一些实施方案中，所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合功能区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；或与SEQ ID No.6所示序列具有至少70％的同一性且保留相应母体序列生物活性，例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性；或为SEQ ID NO.6所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或更多个。所述轻链可变区包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或与SEQ ID No.2所示序列具有至少70％的同一性且保留相应母体序列生物活性，例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性；或为SEQ ID NO.2所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或更多个。
在一些实施方案中，所述特异性结合CD47的第二抗原结合功能区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO.14、20、24、28、32或36的氨基酸序列；或与SEQ ID NO.14、20、24、28、32或36所示序列具有至少70％的同一性且保留相应母体序列生物活性，例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性；或为SEQ ID NO.6所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或更多个；所述轻链可变区包含SEQ ID NO.12、18、22、26、30或34所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO.12、18、22、26、30或34所示序列具有至少70％的同一性且保留相应母体序列生物活性，例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性；或为SEQ ID NO.6所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或更多个。
在一些实施方案中，所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合功能区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；并且
所述特异性结合CD47的第二抗原结合功能区包含选自以下的重链可变区和轻链可变区：
a)包含SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列的重链可变区，包含SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列的轻链可变区；
b)包含SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列的重链可变区，包含SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列的轻链可变区；
c)包含SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列的重链可变区，包含SEQ ID NO.22所示的氨基酸序列的轻链可变区；
d)包含SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列的重链可变区，包含SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列的轻链可变区；
e)包含SEQ ID NO.32所示的氨基酸序列的重链可变区，包含SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
f)包含SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列的重链可变区，包含SEQ ID NO.34所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述双特异抗体的第一抗原结合功能区和第二抗原结合功能区选自Fab片段、scFv片段或可变结构域片段Fv。
在进一步的实施方案中，所述双特异抗体的第一抗原结合功能区和第二抗原结合功能区都是Fab片段。
在一些实施方案中，所述双特异抗体的Fab片段包含不同的第一重链可变区及第二重链可变区，以及不同的第一轻链可变区及第二轻链可变区。
在一些实施方案中，所述双特异抗体的第一抗原结合功能区和第二抗原结合功能区 中一个是Fab片段，另一个是scFv。
在一些实施方案中，所述双特异抗体包含第一Fc链和第二Fc链，
其中所述第一Fc链和第二Fc链均为包含氨基酸替换的免疫球蛋白G Fc片段，并且所述第一Fc链及第二Fc链共同构成可以与Fc受体结合的异源二聚体；
其中所述第一Fc链和第二Fc链通过共价键或连接体分别连接到所述第一抗原结合功能区和第二抗原结合功能区；
并且其中所述第一Fc链和第二Fc链中的任意一条在366位及399位上包含T366L和D399R氨基酸替换，另一条在351位、407位及409位上包含L351E、Y407L和K409V氨基酸替换，其中氨基酸位置根据Kabat EU指数编号系统编号。
在本文中，如无特殊说明，抗体的氨基酸位置均根据Kabat EU指数编号系统编号。
在一些实施方案中，所述双特异抗体的第一Fc链及与其共价相连的第一抗原结合功能区，和第二Fc链及与其共价相连的第二抗原结合功能区，在存在还原剂的溶液中且所述溶液中除所述第一Fc链及与其共价相连的第一抗原结合功能区和第二Fc链及与其共价相连的第二抗原结合功能区以外不含其它多肽时，其形成同源二聚体的基于所有多肽链的重量比例均低于50％，如均低于45％、40％、35％、30％、25％、20％或更低。
在一些实施方案中，所述双特异抗体的第一抗原结合功能区包含SEQ ID NO：2和6的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述双特异抗体的第二抗原结合功能区包含SEQ ID NO：12、14、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36的氨基酸序列。本领域技术人员知晓，对于所述氨基酸序列的组合方式应符合生物学规律，即，轻重链或轻重链的可变区、抗原结合片段要相互匹配，如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14相互匹配，SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：14相互匹配。
在一些实施方案中，所述双特异抗体的第一轻链和第二轻链均包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述双特异抗体的第一重链和第二重链中的任意一条包含SEQ ID NO：8或10的氨基酸序列，另一条包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述的双特异性抗体包含特异性结合PD-L1的第一重链及第一轻链对，其中所述第一重链具有包含SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO.8或10所示氨基酸序列的重链恒定区，所述第一轻链具有包含SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的轻链可变区，以及包含SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的轻链恒定 区。
在一些实施方案中，所述的双特异性抗体包含特异性结合CD47的第二重链及第二轻链对，其中所述第二重链具有包含SEQ ID NO.14、20、24、28、32或36所示氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的重链恒定区，所述第二轻链具有包含SEQ ID NO.12、18、22、26、30或34所示氨基酸序列的轻链可变区，以及包含SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的轻链恒定区。
本发明的第二方面涉及一种分离的多核苷酸，其编码如上所述的双特异抗体。
在一些实施方案中，编码第一抗原结合功能区氨基酸的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1和5的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码第二抗原结合功能区氨基酸的核苷酸序列包含SEQ ID NO：11、13、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35的核苷酸序列。如上所述，所述核苷酸序列的组合应符合生物学规律，即，轻重链或其可变区、抗原结合片段的编码核苷酸序列要相互匹配，如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13相互匹配，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：13相互匹配。
在一些实施方案中，编码第一轻链和第二轻链氨基酸的核苷酸序列均包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码第一重链和第二重链中的任意一条氨基酸的核苷酸序列包含SEQ ID NO：7或9的核苷酸序列，编码另一条的核苷酸序列包含SEQ ID NO：15的核苷酸序列。
本发明的第三方面涉及一种重组表达载体，其包含如上所述的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，表达载体为基于pCDNA改造得到的质粒载体X0GC。
本发明的第四方面涉及一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的多核苷酸，或如上所述的重组表达载体。
在一些实施方案中，所述的宿主细胞选自人胚肾细胞HEK293或以HEK293细胞为基础改造而得到的HEK293T、HEK293E、HEK293F；仓鼠卵巢细胞CHO或以CHO细胞为基础改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr
-、CHO/DG44、ExpiCHO；大肠杆菌或以大肠杆菌为基础改造得到的大肠杆菌BL21、BL21(DE3)、Rosetta、Origami；酵母菌或以酵母为基础改造得到的毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维亚酵母、多形汉逊酵母；昆虫细胞或以昆虫细胞为基础改造得到的细胞High5、SF9；植物细胞；哺乳动物乳腺细胞、体细胞。
本发明的第五方面涉及一种组合物，其包含如上所述的双特异抗体或如上所述的分离的多核苷酸或如上所述的重组表达载体或如上所述的宿主细胞，及药学上可接受的载体。
本发明的第六方面涉及一种生产如上所述的双特异抗体的方法，其包括步骤：
1)将如上所述的分离的多核苷酸或如上所述的重组表达载体分别在宿主细胞中进行表达；
2)将在宿主细胞中分别表达的蛋白进行还原；以及
3)将还原的蛋白混合，然后将混合物进行氧化。
在一些实施方案中，还原步骤包括1)在还原剂存在下进行还原反应，所述还原剂选自：2-巯基乙胺、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或其他化学衍生物；2)去除还原剂。在一些实施方案中，还原剂为0.1mM或更高浓度二硫苏糖醇，反应条件为4℃下反应至少3小时，如0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM或更高，如3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时，或更长。
在一些实施方案中，氧化步骤为在空气中氧化，也包括在氧化剂存在下进行氧化反应，所述氧化剂选自：L-脱氢抗坏血酸或其化学衍生物。在一些实施方案中，氧化剂为0.5mM或更高浓度L-脱氢抗坏血酸，反应条件为4℃下反应至少5小时，如0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.2mM、1.5mM或更高，如5小时、6小时、7小时、8小时、9小时，或更长。
在一些实施方案中，所述的方法还包括分离纯化的步骤。在一些实施方案中，所述分离纯化包括阳离子树脂交换、阴离子树脂交换、反相层析、亲和层析、尺寸排阻层析及其组合。
本发明的第七方面涉及如上所述的双特异抗体和/或如上所述的分离的多核苷酸和/或如上所述的重组表达载体和/或如上所述的宿主细胞和/或如上所述的组合物在制备用于预防和/或治疗受试者疾病的药物中的用途。
本发明的第八方面涉及如上所述的双特异抗体和/或如上所述的分离的多核苷酸和/或如上所述的重组表达载体和/或如上所述的宿主细胞和/或如上所述的组合物，其用做用于预防和/或治疗受试者疾病的药物。
本发明的第九方面涉及一种预防和/或治疗疾病的方法，包括将如上所述的双特异抗体和/或如上所述的分离的多核苷酸和/或如上所述的重组表达载体和/或如上所述的宿主细胞和/或如上所述的组合物施予有需求的受试者。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，优选地，人类受试者。
在一些实施方案中，所述疾病选自如下肿瘤：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤、小细胞肺癌、骨癌，优选地，所述疾病选自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤。
换言之，本发明设计了一种全新的抗PD-L1/抗CD47天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体，其具有天然IgG特点，并且没有重轻链错配，是高度稳定的异源二聚体形式的抗PD-L1/抗CD47双特异抗体。本发明制备的双特异抗体能同时结合两种靶分子PD-L1和CD47，将其应用于复杂疾病治疗时可发挥比单一治疗剂更好的效果且副作用更小。同时，相对于多个药物的组合治疗，该双特异抗体作为单一治疗分子不仅方便了患者和医疗工作者的使用，也简化了复杂的新药开发流程。
图1：示出了抗PD-L1表达产物的洗脱峰色谱图。
图2：示出了抗CD47表达产物的洗脱峰色谱图。
图3：示出了抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体分子的结构。
图4.示出了含一条重链和一条轻链的半抗体分子结构。
图5.示出了含一条重链和一条轻链的半抗体分子的SEC-HPLC分析结果。其中A图和B图分别表示抗PD-L1半抗体分子和抗CD47半抗体分子的结果。
图6.示出了抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体分子的SEC-HPLC分析结果。
图7.示出了抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体分子的CE分析结果。
图8.A图示出了多种抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体对PD-L1的亲和力，B图示出了多种抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体对CD47的亲和力。
图9.A图示出了多种抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体阻断PD-L1/PD-1结合的活性，B图示出了多种抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体阻断PD-L1/CD80结合的活性，C图示出了多种抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体阻断CD47/SIRPα结合的活性。
图10.A图示出了抗CD47单抗与HCC827和RBC的结合活性，B图和C图示出了抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体与HCC827和RBC的结合活性。
图11.示出了抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体的T细胞调控活性。
图12.示出了抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体介导的巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性。
图13.示出了抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体在异种移植肿瘤模型中的抗肿瘤药效。
图14.示出了抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体在基因敲入小鼠同源肿瘤模型中的抗肿瘤药效。
图15.示出了抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体BH3012h具有比相应抗PD-L1双价单抗和抗CD47双价单抗更强的抗肿瘤药效。
定义：
在本文中，术语“抗体”以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于完整抗体和抗体的抗原结合片段。
在本文中，术语“双特异抗体”包含与两种不同生物分子上的表位特异性结合的抗原结合结构域。除非另外说明，否则列出的双特异性抗体名称中双特异性抗体结合的抗原的顺序是任意的。即，在一些实施方案中，术语“抗PD-L1/CD47双特异抗体”和“抗CD47/PD-L1双特异抗体”可以互换使用。在一些实施方案中，双特异抗体包含两个半抗体，其中每个半抗体包含单个重链可变区和任选地重链恒定区的至少一部分以及单个轻链可变区和任选地轻链恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，双特异抗体包含两个半抗体，其中每个半抗体包含单个重链可变区和单个轻链可变区并且不包含多于一个单个重链可变区且不包含多于一个单个轻链可变区。在一些实施方案中，双特异抗体包含两个半抗体，其中每个半抗体包含单个重链可变区和单个轻链可变区，并且其中第一半抗体与第一抗原结合且不与第二抗原结合并且第二半抗体与第二抗原结合且不与第一抗原结合。
术语“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”(在本文中与超变区“HVR”可以互换使用)指抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。在本文中，重链的三个CDR称为HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链的三个CDR称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。
应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所 差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。共价连接是指异源二聚体形式的双特异抗体中，两个Fc链之间，任一个Fc链及与其相连接的抗原结合功能区之间，是通过共价键而连接成为一个分子。其中Fc链包含通过一个或多个通过共价连接(如二硫键链)而连接的第一抗原结合功能区及第二抗原结合功能区；该第一Fc链及第二Fc链分别通过共价连接(如亚胺键或酰胺键)而连接到一个抗原结合功能区上；
抗原结合功能区是指可以与目标分子如抗原发生特异性相互作用的区域，其作用具有高度选择性，识别一种目标分子的序列通常不能识别其他分子序列。代表性的抗原结合功能区包括：抗体的可变区、抗体可变区的结构变构体、受体的结合域、配体结合域或酶结合域。
一个或多个二硫键链间连接是指第一Fc链及第二Fc链通过一个或多个二硫键链间连接，形成异源二聚体片段。在本发明中，一个或多个二硫键的形成可以是第一Fc链及第二Fc链或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区在同一个细胞内合成时形成，也可以是第一Fc链及第二Fc链或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区在不同细胞内分别合成，之后通过体外还原氧化的方法形成。
第一Fc链及第二Fc链是指通过共价连接而组成结合片段，共价连接包括二硫键，每条链至少包含免疫球蛋白重链恒定区的一部分；并且该第一Fc链及第二Fc链在氨基酸序列上是不同的，至少包括了一位氨基酸的不同。在此发明中的第一Fc链及第二Fc链，相同链之间存在强烈的相互排斥作用，而不同链之间存在吸引作用，因此当在细胞内共同表达时，第一Fc链及第二Fc链，或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区，更倾向于形成异源二聚体。将第一Fc链及第二Fc链，或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区分别在两个宿主细胞内表达时，第一Fc链或者第一Fc链及其相连接的抗原结合功能区不倾向于形成同源二聚体，第二Fc链或者第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区不倾向于形成同源二聚体。在本发明中，当第一Fc链及第二Fc链，或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区分别在两个宿主细胞内表达时，并且在存在还原剂时，同源二聚体的比例低于50％，即单体(一条Fc链或者一条Fc链及其相连接的抗原结合功能区)比例大于50％。
免疫球蛋白是具有四条多肽链的对称结构，其中两条较长、相对分子量较大的相同的重链，含450～550个氨基酸残基，相对分子质量在55000～70000Da之间；两条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)，含约210个氨基酸残基，相对分子质量约24000Da。不同的免疫球蛋白重链和轻链在靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，称为可变区(variable region，V区)，而靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，称为恒定区(constant region，C区)。抗体的每条重链由重链可变区(本文中简称为VH)和重链恒定区(本文中简称为CH)构成，每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区(本文中缩写为CL)组成。重链中可变区约占重链长度的1/4，恒定区约占重链长度的3/4。对于已知五种Ig来说，IgG(γ)、IgA(α)、IgD(δ)、IgM(μ)和IgE(ε)，其中前三类Ig的H链内有三个恒定区，即CH1、CH2和CH3组成。后两类(IgM和IgE)的H链中有一个VH区和四个恒定区，即CH1至CH4。恒定区既是免疫球蛋白分子的骨架，又是激活免疫反应的部位之一。虽然本发明实施例涉及IgG，但本领域技术人员知晓，如果希望的话，可以通过已知方法转换本发明的抗体的类别。例如，最初是IgM的本发明抗体可以类别转换为本发明的IgG抗体。此外，类别转换技术可以用来将一个IgG亚类转化成另一亚类，例如从IgGl转换到IgG2。因此，本发明的抗体的效应子功能可以通过同种型切换变为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体，用于各种治疗用途。在一个实施例中，本发明的抗体是IgG1抗体，例如IgG1,κ。
本发明中的恒定区一部分至少包括了第一Fc链和第二Fc链相互作用的区域，该区域对于IgG来说，是位于CH3区域的一部分氨基酸，至少包括GLN347、TYR349、THR 350、LEU 351、SER 354、ARG 355、ASP 356、GLU 357、LYS 360、SER 364、THR 366、LEU 368、LYS 370、ASN390、LYS392、THR394、PRO395、VAL 397、ASP399、SER400、PHE405、TYR407、LYS409、LYS439。
第一Fc链及第二Fc链分别通过共价键或连接体连接到一个抗原结合功能区上是指第一Fc链及第二Fc链分别通过共价键或连接体连接到一个抗体的抗原结合片段，或可以识别抗原的单链抗体，或可以识别抗原的其他抗体片段变构体，或可以识别配体的受体，或可以识别受体的配体，其中所述共价键是指是化学键的一种，两个或多个原子共同使用它们的外层电子，在理想情况下达到电子饱和的状态，由此组成比较稳定的化学结构叫做共价键，或者说共价键是原子间通过共用电子对所形成的相互作用。同一种的元素的原子或不同元素的都可以通过共价键结合，对于本发明的第一Fc链及第二Fc链间的共价键，包括但不限于一分子氨基酸的氨基与另一分子氨基酸的羧基脱水反应形 成的酰胺键，或者乙二醇或聚乙二醇或其他化合物或其多聚物的醛基与一分子氨基酸的氨基形成酰胺键或亚胺键，其中连接体是可以将两条多肽链通过共价键连接起来的一段氨基酸序列或者一种化合物或者一种化合物的多聚体，其中一段氨基酸序列包括但不限于一段小肽，如GGGGSGGGGSGGGGS，通过酰胺键将第一Fc链或第二Fc链，以及可以识别抗原的单链抗体，或可以识别抗原的其他抗体片段结构变构体连接起来
第一Fc链与第二Fc链更倾向于形成异源二聚体而不倾向于各自形成同源二聚体是指，由于在第一Fc链与第二Fc链中，相同的多肽链间存在互相排斥的作用，而不同的多肽链间存在吸引作用，因此当在细胞内共同表达时，第一Fc链及第二Fc链，或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区，更倾向于形成异源二聚体。将第一Fc链及第二Fc链，或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区分别在两个宿主细胞内表达时，第一Fc链或者第一Fc链及其相连接的抗原结合功能区不倾向于形成同源二聚体，第二Fc链或者第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区不倾向于形成同源二聚体。
Kabat EU指数编号系统是指，Kabat利用一种方法将一个编号指定给抗体序列的每个氨基酸并且这种指定每个残基的编号的方法已经成为本领域的标准方法。Kabat方案可以延伸到不存在于他的研究中的其它抗体，基于保守的氨基酸，将目标抗体与Kabat鉴定的共有序列之一进行比对。
Fc结构域是指可结晶段(fragment crystallizable，Fc)，相当于Ig的CH2和CH3结构域，是Ig与效应分子或者细胞相互作用的部位。
IgG是免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)的缩写，是血清主要的抗体成分，根据IgG分子中的r链抗原性差异，人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
半抗体分子是指抗体的一条重链与一条轻链形成的结构，其中重链与轻链间可以通过共价键连接，也可以不通过共价键连接，是一种识别抗原的单价抗体结构。
Fab片段是一种分子识别序列，是抗原结合片段(fragment of antigen binding,Fab)，相当于抗体分子的两个臂，由一个完整的轻链和重链的VH和CH1结构域组成。scFv是一种分子识别序列，是一种由抗体的轻链可变区与重链可变区通过基因工程改造而得到的抗体片段的结构异构体。膜受体的细胞外区是一种分子识别序列，膜受体通常包括位于细胞外部的可以识别并结合相应抗原或者配体的细胞外区域，将受体锚定在细胞表面的跨膜区，以及在胞内的具有激酶活性或者可以传递信号通路的胞内区。细胞膜受体的配体是指能被膜受体胞外区识别并结合的蛋白质，小肽或化合物。细胞因子是免疫原、 丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。蛋白表达标签指在目标蛋白的N端或C端加入的一段氨基酸序列，可以是小肽也可以是长的氨基酸，标签的加入可以有利于蛋白质的正确折叠，可以有利于蛋白质的分离纯化，可以有利于降低蛋白质在胞内的降解，常用的标签包括但不限于HA、SUMO、His、GST、GFP、Flag。
本发明的异源二聚体形式的双特性抗体可具有一个或多个替换、缺失、添加和/或插入。例如，某些氨基酸可以替换在蛋白质结构中的其它氨基酸而没有明显损失与其它多肽(如抗原)或细胞结合的能力。由于结合能力和蛋白性质决定了蛋白的生物功能活性，可以在蛋白序列上进行某些氨基酸序列的替换而不会明显损失它们的生物效用或活性。
在许多情况中，多肽变体含有一个或多个保守替换。“保守替换”是指其中氨基酸被其它具有类似性质的氨基酸所替换，使得肽化学领域中技术人员可预期多肽的二级结构和亲水性质基本上不发生变化。
氨基酸替换通常是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑了各种前述特征的示例性替换是本领域技术人员公知的并包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
本发明使用的术语“同一性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同一性的规则、标准，是指在序列比对和引入缺口(如果必要的话，以获得最大百分比同源性)后，多核苷酸或多肽序列变体的残基与非变体序列的相同的百分比。。在本发明中，在满足同一性限定的情况下，还需要所获得的变体序列具有母体序列所具有的生物活性。本领域技术人员公知如何利用上述活性筛选变体序列的方法和手段。本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下容易地获得这样的变体序列。在具体实施方式中，多核苷酸和多肽变体与本文所述的多核苷酸或多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或至少约99％，或至少约99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的多核苷酸或多肽同一性。由于遗传密码的冗余性，将存在编码相同氨基酸序列的这些序列的变体。
本发明的另一个实施方式中，提供了能够在中度至高度严格条件下与本发明提供的 多核苷酸序列或其片段或其互补序列相杂交的多核苷酸组合物。杂交技术是分子生物学领域公知的。为了说明的目的，用于测试本发明的多核苷酸与其他多核苷酸杂交的合适中等严格条件包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗；在50-60℃、5×SSC、过夜的条件下杂交；再于65℃下20分钟用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×的SSC各洗涤两次。本领域技术人员理解，可容易地操纵杂交的严格性，例如通过改变杂交溶液的盐含量和/或进行杂交的温度。例如，在另一个实施方式中，合适的高严格杂交条件包括上述的条件，所不同的是杂交温度升高了，例如达到60-65℃或65-70℃。
本发明的宿主细胞可以是用于外源基因表达的所有细胞，包括但不限于大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，植物细胞，哺乳动物细胞。
本发明的载体包括可以在任何类型的细胞或生物体中进行复制的载体，包括如质粒、噬菌体、粘粒和迷你染色体。在一些实施方式中，包括本发明多核苷酸的载体是适合于多核苷酸繁殖或复制的载体，或者是适合于表达本发明多肽的载体。这样的载体是本领域已知并可以购买的。
“载体”包括穿梭载体和表达载体。通常，质粒构建体也包括分别用于细菌中质粒复制和选择的复制起点(如复制的ColE1起点)和选择标记(如氨苄青霉素或四环素抗性)。“表达载体”是指包含用于在细菌或真核细胞中表达本发明的抗体包括抗体片段所需要的控制序列或调控元件的载体。
本发明的载体可以是用于外源基因表达的所有载体，包括但不限于质粒载体，其中质粒载体至少包含复制起始位点、启动子、目的基因、多克隆位点、筛选标记基因，优选地，本发明所述载体包括但不限于基于pCDNA改造得到的质粒载体，比如X0GC载体。
本发明的受试者包括禽类、爬行动物、哺乳动物等。优选地，哺乳动物包括啮齿类动物、灵长类动物，优选地，灵长类动物包括人。
本发明所涉及的疾病的范围包括但不限于肿瘤，优选的，所述肿瘤包括：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤、小细胞肺癌、骨癌。
药学上可接受的载体是指是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂和水等，填充剂如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、 明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠，羟丙纤维素，交联羧甲基纤维素，琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇，十二烷基硫酸钠；吸附载体如高龄土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本发明下述实施例中使用的各种抗体均来源于商业途径的标准抗体。
实施例
实施例1抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体分子的载体构建
构建分别含抗人PD-L1抗体的轻链和重链的X0GC表达载体(来源于专利WO2008/048037)。轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；轻链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；重链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10所示。在金唯智公司合成包含酶切位点、信号肽序列及抗体PD-L1轻链可变区序列的片段，对合成的含有目的片段的载体及连接有轻链恒定区序列的X0GC载体用BamHI(Thermo，货号FD0054)及Pfl23II(Thermo，货号FD0854)进行双酶切，酶切反应体系为：10×缓冲液6μl，BamHI和Pfl23II各2μl，载体40μl，H
2O 10μl，酶切体系于37℃条件下反应1小时。将酶切产物用T4DNA连接酶(Thermo，货号EL0011)连接，反应体系为：10×连接酶缓冲液1μl，连接酶0.5μl，胶回收获得的轻链可变区片段7.5μl，胶回收获得的连接有轻链恒定区序列的X0GC载体1μl，连接于22℃反应30min。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(天根，CB104，下同)。在金唯智公司合成包含酶切位点、信号肽序列及抗体PD-L1重链可变区序列的片段，对合成的含有目的片段的载体及连有重链恒定区序列的X0GC载体用HindIII(Thermo，货号FD0505)及NheI(Thermo，货号FD0973)进行双酶切，酶切反应体系为：10×缓冲液6μl，，HindIII和NheI各2μl，载体40μl，H
2O 10μl，酶切体系于37℃条件下反应1小时。将酶切产物用T4DNA连接酶(Thermo，货号EL0011)连接，反应体系为：10×连接酶缓冲液1μl，连接酶0.5μl， 胶回收获得的重链可变区片段7.5μl，胶回收获得的连有重链恒定区的X0GC载体1μl，连接于22℃反应30min。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(天根，CB104)。获得抗人PD-L1抗体重链和轻链的X0GC表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗人PD-L1抗体的重链和轻链。
本发明同时构建了分别含抗人CD47鼠源抗体CD47-18-5的重链和轻链可变区序列的X0GC表达载体。轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；轻链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；重链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。获得抗人CD47抗体重链和轻链的X0GC表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗人CD47抗体CD47-18-5的重链和轻链。
本发明还同时构建了分别含抗人CD47鼠源抗体CD47-18-10的重链和轻链可变区序列的X0GC表达载体。轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；轻链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；重链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。获得抗人CD47抗体重链和轻链的X0GC表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗人CD47抗体CD47-18-10的重链和轻链。
本发明同时构建了分别含抗人CD47的抗体CD47-18-5的人源化序列z3的重链和轻链可变区的X0GC表达载体。轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；轻链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示；重链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。获得抗人CD47抗体重链和轻链的X0GC表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗人CD47抗体CD47-18-5的人源化序列z3的重链和轻链。
本发明同时构建了分别含抗人CD47的抗体CD47-18-5的人源化序列z4的重链和轻链可变区的X0GC表达载体。轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示；轻链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示；重链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。 获得抗人CD47抗体重链和轻链的X0GC表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗人CD47抗体CD47-18-5的人源化序列z4的重链和轻链。
本发明同时构建了分别含抗人CD47的抗体CD47-18-5的人源化序列z7的重链和轻链可变区的X0GC表达载体。轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示；轻链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示；重链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。获得抗人CD47抗体重链和轻链的X0GC表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗人CD47抗体CD47-18-5的人源化序列z7的重链和轻链。
本发明同时构建了分别含抗人CD47的抗体CD47-18-5的人源化序列z11的重链和轻链可变区的X0GC表达载体。轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示；轻链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示；重链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。获得抗人CD47抗体重链和轻链的X0GC表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗人CD47抗体CD47-18-5的人源化序列z11的重链和轻链。
实施例2抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体分子的表达
分别将含抗人PD-L1抗体的重链和轻链的表达载体共转染ExpiCHO细胞(ExpiCHOTM Cells，货号A29127，invitrogen)。另外分别将各种含抗人CD47的抗体的重链和轻链的表达载体也共转染ExpiCHO细胞。
转染前一天接种细胞，接种密度为3.5*10^6细胞/mL。转染当天用新鲜的ExpiCHO表达培养基(ExpiCHOTM Expression Medium,货号A29100-01，invitrogen)将细胞稀释，稀释密度为6*10^6细胞/mL。按照转染体积取出质粒，质粒的终浓度为0.5ug/ml，用OptiPROTMSFM培养基(OptiPROTMSFM，货号12309-019，invitrogen)将质粒稀释至转染体积的4％，颠倒混匀。取出6.4倍质粒量的ExpiFectamineTM转染试剂(ExpiFectamineTMCHO Transfection Kit，货号A29129，invitrogen),用OptiPROTMSFM培养基将转染试剂稀释至转染体积的4％，颠倒混匀。将稀释后的转染试剂加入到稀释的质粒中，轻轻混匀，室温静置1～5min，慢慢滴加到细胞中。之后放入细胞培养箱(CO2浓度为8％)，120rpm摇床37℃培养20小时。向细胞中慢慢滴加0.006倍转染体积的 ExpiCHOTMEnhancer(ExpiFectamineTMCHO Transfection Kit，货号A29129，invitrogen)和0.24倍转染体积的ExpiCHOTMFeed(ExpiCHOTMFeed,货号A29101-02，invitrogen)。放入120rpm摇床32℃培养。离心收集转染10天的细胞培养上清。
通过ELISA的方法测定表达量。在应用层析柱纯化之前，以0.2μm滤膜过滤以去除沉淀物。此步骤在4℃下进行。
实施例3抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体分子表达产物的纯化
采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(GE Healthcare)以及亲和色谱柱MabSelect SuRe(16mm I.D.，22ml，GE Healthcare)于4℃下进行纯化。首先以流动相A(20mM磷酸钠缓冲液，pH 7.4)平衡色谱柱，在基线稳定后将经过上述处理的细胞上清液进行上样，并在上样后以流动相A进行平衡。样品分别为抗PD-L1表达产物和抗CD47表达产物。之后，首先以流动相B(含有1M氯化钠的流动相A)冲洗5个柱体积；然后再以流动相A冲洗2个柱体积，然后以流动相C(100mM甘氨酸，pH 3.3)洗脱5个柱体积，收集洗脱峰即为目的蛋白峰；以上洗脱步骤流速都为5ml/min。抗PD-L1表达产物的洗脱峰色谱图如图1所示，抗CD47表达产物(由抗体CD47-18-5的人源化序列z11的重链和轻链序列组成)的洗脱峰如图2所示。其它抗CD47表达产物的洗脱峰与之类似。收集标示的洗脱峰(图示灰色区域)，并通过滴加1M Tris碱溶液将pH调至7.2，无菌过滤后放2～8℃储存。
实施例4抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体分子的制备和纯化
抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体分子的结构如图3所示。
将上述MabSelect SuRe(16mm I.D.，22ml，GE Healthcare)方法纯化获得的产物进行体外重组以获得异源二聚体。首先将上述纯化收集的蛋白溶液通过DTT还原的过程，二硫键被打开，抗PD-L1以及抗CD47产物中含有的抗体同源二聚体分子铰链区二硫键也打开，形成了含有一条重链和一条轻链的半抗体分子，结构如图4所示。还原的样品经流动相缓冲液中包含1mM DTT还原剂的SEC-HPLC(TOSOH，TSKgel superSW3000)分析，结果分别如图5的A和B图所示，抗PD-L1和抗CD47的同源二聚体分子比例均小于20％，半抗体分子比例均大于80％。
然后将还原的抗PD-L1以及抗CD47半抗体分子等摩尔比例混合，在4℃条件下进行重组反应24小时，在重组的过程中，抗PD-L1及抗CD47半抗体分子通过CH2以及 CH3间的非共价作用力形成了同时含有抗PD-L1以及抗CD47半抗体分子的异源二聚体的双特异抗体，之后将蛋白溶液通过超滤浓缩管超滤浓缩(标称截留分子量10KDa)，将溶液置换为磷酸盐溶液(PBS，pH＝7.4)终止还原，通过空气或者氧化剂进行氧化反应，使异源二聚体的双特异抗体的二硫键重新形成。
上述抗PD-L1以及抗CD47表达产物经还原氧化得到的抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体分子通过超滤浓缩管超滤浓缩(标称截留分子量10KDa)，将溶液置换为10mM磷酸钠缓冲液，pH 6.0。采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(GE Healthcare)以及离子色谱柱Source 15S(16mm I.D.，22ml，GE Healthcare)于室温下进行纯化。首先以流动相A(10mM磷酸钠，pH 7.0)平衡色谱柱，在基线稳定后将经过上述处理的蛋白溶液进行上样，流速为5ml/min，并在上样后以流动相A进行平衡，之后以A(10mM磷酸钠，pH 5.8)到B(10mM磷酸钠，pH 5.8)梯度冲洗20个柱体积(0％B-100％B，170min，流速2ml/min),收集洗脱主峰，收集的蛋白溶液通过超滤浓缩管超滤浓缩(标称截留分子量10KDa)，将溶液置换为磷酸盐溶液(PBS，pH＝7.4)，过滤除菌4℃保存。将纯化得到的抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体分子BH3012h(其中抗CD47部分包含抗体CD47-18-5的人源化序列z11的重链和轻链可变区序列)通过SEC-HPLC进行纯度分析，结果如图6所示，纯度为97.3％；进行CE分析，结果如图7所示，纯度为95.3％。其它抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体分子如BH3014(其中抗CD47部分包含抗体CD47-18-5的人源化序列z3的重链和轻链可变区序列)，BH3015(其中抗CD47部分包含抗体CD47-18-5的人源化序列z4的重链和轻链可变区序列)，BH3016(其中抗CD47部分包含抗体CD47-18-5的人源化序列z7的重链和轻链可变区序列)，抗PD-L1/抗CD47异源二聚体双抗18-5(其中抗CD47部分包含鼠源抗体CD47-18-5的重链和轻链可变区序列)和抗PD-L1/抗CD47异源二聚体双抗18-10(其中抗CD47部分包含鼠源抗体CD47-18-10的重链和轻链可变区序列)的结果均与之类似。
实施例5抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体的靶点结合活性
用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体与单个抗原的结合能力。具体实施过程如下：用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板(Costar，货号42592)上包被重组人PD-L1(北京义翘神州，货号10084-H08H)或者人CD47(北京百普赛斯，货号CD7-H5227)，包被浓度为1μg/mL，每孔100μL，包被在4℃过夜进行。PBST洗涤5次。用含1％BSA的PBST按300μL/孔封闭，25℃孵育1小时。PBST 洗涤5次。加入序列稀释在含1％BSA的PBST里的异源二聚体抗体样品以及对照，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。然后加入1:10000稀释在含1％BSA的PBST里的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Chemicon，货号AP309P)，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10分钟。加入1M H2SO4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。
结果如图8的A图所示，抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体BH3012h、BH3014、BH3015、BH3016均具有对PD-L1的高亲和力，活性相当，略弱于PD-L1双价单抗的抗原结合活性；如图8的B图所示，抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体BH3012h、BH3014、BH3015、BH3016具有不同的CD47亲和力，BH3012h最强，BH3016次之，BH3015再次之，BH3014的结合活性最弱。
实施例6抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体的配体-受体结合阻断活性
PD-L1与PD-1，CD80结合的阻断活性检测实施过程如下：用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人PD-L1-Fc(北京百普赛斯，货号PD1-H5258)，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST洗涤5次。用含1％BSA的PBST按300μL/孔封闭，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入序列稀释在含1％BSA的PBST里的异源二聚体抗体样品以及对照，每孔加入50μL，并加入50μL生物素标记的PD-1-Fc(北京韩美药品)，浓度为40nM(终浓度20nM)，或者加入50μL生物素标记的CD80-Fc(北京百普赛斯，货号B71-H82F2)，浓度为100nM(终浓度50nM)，25℃孵育90分钟。PBST洗涤5次。然后加入1:1000稀释在含1％BSA的PBST里的Streptavidin-HRP(BD Pharmingen，货号554066)，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10分钟。加入1M H
2SO
4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。
CD47与SIRPα结合的阻断活性检测实施过程如下：用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人CD47-Fc(北京百普赛斯，CD7-H52A5)，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST洗涤5次。用含1％BSA的PBST按300μL/孔封闭，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入序列稀释在含1％BSA的PBST里的异源二聚体抗体样品以及对照，每孔加入50μL，并加入生物素标记的 SIRPα(北京百普赛斯，CDA-H82F2)，浓度为4nM(终浓度2nM)，每孔加入50μL，25℃孵育90分钟。PBST洗涤5次。然后加入1:1000稀释在含1％BSA的PBST里的Streptavidin-HRP(BD Pharmingen，货号554066)，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10分钟。加入1M H
2SO
4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。
结果如图9的A图所示，抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体BH3012h、BH3014、BH3015、BH3016均能够阻断PD-L1与PD-1的结合，活性相当，略弱于PD-L1双价单抗；如图9的B图所示，抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体BH3012h、BH3014、BH3015、BH3016均能够阻断PD-L1与CD80的结合，活性相当；如图9的C图所示，抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体BH3012h、BH3014、BH3015、BH3016具有不同的CD47与SIRPα结合阻断活性，BH3012h最强，BH3016次之，BH3015再次之，BH3014的活性最弱。
实施例7抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体与肿瘤细胞/红细胞的结合
HCC827肿瘤细胞表达PD-L1和CD47，红细胞(RBC)仅表达CD47。将HCC827和RBC混合在一起，用流式细胞术(FCM)检测异源二聚体对混合细胞中两种细胞的结合是否存在选择性。
该方法具体实施过程如下：收集HCC827细胞(购自ATCC)、RBC细胞(采自健康人群)。用含2％FBS(Hyclone，货号SH30084.03)的冷PBS(GIBCO，货号14190-235)洗涤一次。将HCC827按每管1×10
6个细胞，RBC按每管10×10
6个细胞混合在一起，重悬于200μL含2％FBS的冷DPBS(GIBCO，货号14190-136)中，且加入序列稀释的异源二聚体抗体样品以及对照。流式管于冰上孵育30分钟。用含2％FBS的PBS洗涤两次。再重悬于200μL含2％FBS以及1:1000稀释的FITC标记的抗人IgG抗体(北京中杉金桥，货号ZF0306)的冷PBS中。冰上避光孵育30分钟。用含2％FBS的PBS洗涤两次。再重悬于500μL冷PBS中，该细胞悬液于流式细胞仪(BD,FACS Calibur)上进行检测分析，读取混合细胞中两种细胞各自的荧光强度。
结果如图10所示，CD47单抗(包含抗体CD47-18-5的人源化序列z11的重链和轻链的可变区序列以及人IgG4恒定区序列)与混合在一起的HCC827和RBC的结合基本没有什么差异(A图)；而抗PD-L1/抗CD47异源二聚体倾向与共表达PD-L1和CD47的HCC827细胞结合，而与仅表达CD47的RBC结合较弱甚至不结合，显示出了结合的选 择性(B图和C图)。
实施例8抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体的T细胞调控活性
用混合淋巴细胞反应(MLR)测定抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体对T细胞免疫反应的调控活性。
人树突状细胞(DC)的获取：复苏收集人PBMC细胞(Lonza，货号CC-2702)。将人PBMC细胞按细胞密度为5×10
6/mL重悬于无血清的RPMI 1640培养基(GIBCO，货号22400-089)并接种在细胞培养瓶中，在37℃二氧化碳培养箱中孵育90分钟。弃除培养上清及悬浮细胞，贴壁细胞在完全培养基(RPMI 1640含10％FBS)中培养，并加入100ng/ml GM-CSF(北京义翘神州,货号10015-HNAH)和100ng/ml IL-4(北京义翘神州,货号11846-HNAE)。孵育3天，换液，再孵育3天。然后将培养基更换为完全培养基(RPMI1640含10％FBS)中含100ng/ml GM-CSF、100ng/ml IL-4以及20ng/ml TNF-α，孵育1天。即得DC细胞。
人T细胞的获取：复苏收集人PBMC细胞，保证此PBMC与诱导DC细胞的PBMC来自不同个体。参照Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech，货号5150414820)使用说明书分离人T细胞。简要的说，先用PBS洗涤PBMC一次，再将PBMC按10
7细胞每40μL分离缓冲液(PBS含2mM EDTA,0.5％BSA,pH＝7.2)重悬(以下使用量均按10
7细胞计)，并加入10μL Pan T cell Biotin Antibody Cocktail(Pan T细胞生物素抗体混合物)，在4℃孵育5分钟。再加入30μL分离缓冲液和20μL Pan T cell MicroBead Cocktail(Pan T细胞微珠混合物)，在4℃孵育10分钟。过MACS分离柱，即得T细胞。
将收集到的人DC细胞和人T细胞重悬于完全培养基(RPMI 1640含10％FBS)中，接种于96孔板，接种的DC细胞和T细胞分别为1×10
4/孔，1×10
5/孔，混合培养。并加入用完全培养基序列稀释的异源二聚体抗体样品以及对照。将培养板置于37℃二氧化碳培养箱中孵育5天。孵育结束之后，取出孔内上清，按照试剂盒使用手册检测细胞因子IFN-γ(RayBiotech,货号ELH-IFNg)。
如图11所示，人T细胞在同种异体DC细胞的刺激下，会活化分泌IFN-γ。加入PD-L1抗体会增强T细胞的活化，促进细胞因子的分泌。抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体也显示了很强的T细胞调控活性，显著地促进细胞因子IFN-γ的分泌。
实施例9抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体介导的巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性
成熟人巨噬细胞的制备：复苏收集人PBMC细胞(Lonza，货号CC-2702)。将人PBMC细胞按细胞密度为5×10
6/mL重悬于无血清的RPMI 1640培养基并接种在细胞培养瓶中，在37℃二氧化碳培养箱中孵育90分钟。弃除培养上清及悬浮细胞，贴壁细胞在完全培养基(RPMI 1640含10％FBS)中培养，并加入25ng/ml M-CSF(北京义翘神州,货号11792-HNAN)，孵育7天。然后收取巨噬细胞，重悬于含25ng/ml M-CSF和50ng/ml IFN-γ(北京义翘神州，货号11725-HNAS)的完全培养基(RPMI 1640含10％FBS)中。将此细胞悬液接种到48孔细胞培养板中，每孔50000个细胞，孵育1天使巨噬细胞成熟，备用。
参照CFSE试剂盒(Life technology，货号C34554)使用说明书染色Raji肿瘤细胞。简要的说，用PBS稀释CFSE到工作浓度5μM并在37℃预热,1000rpm离心5分钟收集Raji细胞，用预热的CFSE工作溶液重悬Raji，在37℃孵育15分钟。用完全培养基洗涤1次，再重悬于完全培养基中，孵育30分钟，再用完全培养基洗涤2次，再重悬于完全培养基备用。
将48孔板用完全培养基洗涤3次。将CFSE染色后的Raji细胞与待测的异源二聚体样品以及对照预先孵育15分钟，然后加入48孔培养板中，在37℃二氧化碳培养箱中孵育2小时。孵育结束后，将48孔板用完全培养基洗涤3次，加入稀释在完全培养基中的wheat germ agglutinin,alexa fluor 555(Life technologies，货号W32464)，10μg/ml，避光孵育15分钟。将48孔板再用完全培养基洗涤3次，加入4％多聚甲醛固定15分钟。将48孔板再用完全培养基洗涤3次，加入完全培养基。荧光显微镜拍照，计细胞数。吞噬指数(％)的计算方法为：被吞噬的绿色标记的Raji细胞的数目/存在的红色标记的巨噬细胞数目×100。
如图12所示，CD47单抗(包含抗体CD47-18-5的人源化序列z11的重链和轻链的可变区序列和人IgG4恒定区序列)能够介导巨噬细胞吞噬Raji肿瘤细胞，抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体BH3012h、BH3015、BH3016也能介导巨噬细胞吞噬Raji肿瘤细胞。
实施例10抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体在人源化小鼠体内的抗A375肿瘤药效研究
实验材料选用免疫缺陷的NCG小鼠(南京生物医药研究院)，雌性，6-8周龄。小鼠适应环境一周后，先给予人PBMC将小鼠免疫系统部分人源化，每只小鼠接种5 x 10
6个 细胞，静脉注射。每只小鼠于右侧背部皮下接种5 x 10
6个A375人黑色素瘤细胞。待肿瘤体积长至约100mm
3时，根据肿瘤体积进行分组，每组6只荷瘤小鼠。分别给予溶媒(PBS)，PD-L1单抗35nmol/kg，CD47单抗35nmol/kg，以及抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体70nmol/kg(考虑单抗为双价抗体，双特异抗体的抗PD-L1，抗CD47均为单价)，每周给药2次，连续给药2周，给药方式为腹腔注射。自给药之日起，每周测量3次肿瘤体积，测量其长径a，短径b，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm3)＝(a x b
2)/2。肿瘤体积测量持续时间为3周，即停药后，再观察一周。
结果如图13所示，在异种移植肿瘤模型中，抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体具有比PD-L1单抗和CD47单抗更强的抗肿瘤药效。
实施例11抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体在基因敲入小鼠体内的抗MC38肿瘤药效研究
实验材料选用B-hPD-L1/hSIRPα/hCD47三人源化小鼠(百奥赛图江苏基因生物技术有限公司)，雌性，6-8周龄。小鼠适应环境一周后，每只小鼠于右侧背部皮下接种5 x 10
5个B-hPD-L1/hCD47MC38小鼠结肠瘤细胞(敲除了鼠源的PD-L1和CD47，过表达人源的PD-L1和CD47，MC38细胞来源于舜冉上海生物科技有限公司)。待肿瘤体积长至约100mm
3时，根据肿瘤体积进行分组，每组6只荷瘤小鼠。分别给予溶媒(PBS)、PD-L1单抗1mg/kg、CD47单抗1mg/kg以及抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体2mg/kg(考虑单抗为双价抗体，双特异抗体的抗PD-L1、抗CD47均为单价)，每周给药2次，连续给药3周，给药方式为腹腔注射。自给药之日起，每周测量2次肿瘤体积，测量其长径a，短径b，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm3)＝(a x b
2)/2。肿瘤体积测量持续时间为3周，即停药后，再观察一周。
结果如图14所示，在同源肿瘤模型中，抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体具有比PD-L1单抗和CD47单抗更强的抗肿瘤药效。
实施例12抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体在野生小鼠体内的抗CT26肿瘤药效研究
实验材料选用野生型Balb/c小鼠(购自北京维通利华)，雌性，6-8周龄。小鼠适应环境一周后，每只小鼠于右侧背部皮下接种5 x 10
5个CT26/hPD-L1/hCD47小鼠结肠瘤细胞(购自江苏集萃)。待肿瘤体积长至约100mm
3时，根据肿瘤体积进行分组，每组8只 荷瘤小鼠。分别给予溶媒(DPBS，GIBCO，货号14190-136)、抗PD-L1单抗17.5nmol/kg(抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体中抗PD-L1部分对应的单抗)、抗CD47单抗17.5nmol/kg(抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体中抗CD47部分对应的单抗)以及抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体35nmol/kg(考虑单抗为双价抗体，双特异抗体的抗PD-L1、抗CD47均为单价)，每周给药2次，连续给药3周，给药方式为腹腔注射。自给药之日起至给药结束，每周测量2次肿瘤体积，给药结束后测量1次肿瘤体积，每次测量其长径a，短径b，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm3)＝(a x b
2)/2。肿瘤体积测量持续时间为4周，即停药后，再观察1周。
结果如图15所示，在同源肿瘤模型中，抗PD-L1/抗CD47异源二聚体抗体BH3012h具有比相应抗PD-L1双价单抗和抗CD47双价单抗更强的抗肿瘤药效。
Claims (28)
- 一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含特异性结合PD-L1的第一抗原结合功能区和特异性结合CD47的第二抗原结合功能区，其中所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合功能区包含：(A)重链可变区，所述重链可变区包含(a)HCDR1，其包含SEQ ID NO.37所示的氨基酸序列，(b)HCDR2，其包含SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列，和(c)HCDR3，其包含SEQ ID NO.39所示的氨基酸序列；以及(B)轻链可变区，所述轻链可变区包含(a)LCDR1，其包含SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列，(b)LCDR2，其包含SEQ ID NO.41所示的氨基酸序列，和(c)LCDR3，其包含SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述特异性结合CD47的第二抗原结合功能区包含：(A)重链可变区，所述重链可变区包含(a)HCDR1，其包含SEQ ID NO.43所示的氨基酸序列，(b)HCDR2，其包含SEQ ID NO.44所示的氨基酸序列，和(c)HCDR3，其包含SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列；以及(B)轻链可变区，所述轻链可变区包含(a)LCDR1，其包含SEQ ID NO.46所示的氨基酸序列，(b)LCDR2，其包含SEQ ID NO.47所示的氨基酸序列，和(c)LCDR3，其包含SEQ ID NO.48所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1或权利要求2所述的双特异性抗体，其中所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合功能区包含(A)重链可变区，所述重链可变区包含(a)HCDR1，其包含SEQ ID NO.37所示的氨基酸序列，(b)HCDR2，其包含SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列，和(c)HCDR3，其包含SEQ ID NO.39所示的氨基酸序列；以及(B)轻链可变区，所述轻链可变区包含(a)LCDR1，其包含SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列，(b)LCDR2，其包含SEQ ID NO.41所示的氨基酸序列，和(c)LCDR3，其包含SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列；并且所述特异性结合CD47的第二抗原结合功能区包含(A)重链可变区，所述重链可变区包含(a)HCDR1，其包含SEQ ID NO.43所示的氨基酸序列，(b)HCDR2，其包含SEQ ID NO.44所示的氨基酸序列，和(c)HCDR3，其包含SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列；以及(B)轻链可变区，所述轻链可变区包含(a)LCDR1，其包含SEQ ID NO.46所示的氨基酸序列，(b)LCDR2，其包含SEQ ID NO.47所示的氨基酸序列，和(c)LCDR3，其包含SEQ ID NO.48所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-3任一项所述的双特异性抗体，其中所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合功能区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-4任一项的双特异性抗体，其中所述特异性结合CD47的第二抗原结合功能区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO.14、20、24、28、32或36的氨基酸序列；所述轻链可变区包含SEQ ID NO.12、18、22、26、30或34所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-5任一项所述的双特异性抗体，其中所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合功能区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；并且所述特异性结合CD47的第二抗原结合功能区包含选自以下的重链可变区和轻链可变区：a)包含SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列的重链可变区，包含SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列的轻链可变区；b)包含SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列的重链可变区，包含SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列的轻链可变区；c)包含SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列的重链可变区，包含SEQ ID NO.22所示的 氨基酸序列的轻链可变区；d)包含SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列的重链可变区，包含SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列的轻链可变区；e)包含SEQ ID NO.32所示的氨基酸序列的重链可变区，包含SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列的轻链可变区；或f)包含SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列的重链可变区，包含SEQ ID NO.34所示的氨基酸序列的轻链可变区。
- 根据权利要求1-6任一项所述的双特异抗体，其中第一抗原结合功能区和第二抗原结合功能区选自Fab片段、scFv片段、可变结构域片段Fv。
- 根据权利要求1-7任一项所述的双特异抗体，其中第一抗原结合功能区和第二抗原结合功能区都是Fab片段。
- 根据权利要求8所述的双特异抗体，其中Fab片段包含不同的第一重链可变区及第二重链可变区，以及不同的第一轻链可变区及第二轻链可变区。
- 根据权利要求1-7任一项所述的双特异抗体，其中第一抗原结合功能区和第二抗原结合功能区中一个是Fab片段，另一个是scFv。
- 根据权利要求1-7任一项所述的双特异性抗体，其包含第一Fc链和第二Fc链，其中所述第一Fc链和第二Fc链均为包含氨基酸替换的免疫球蛋白G Fc片段，并且所述第一Fc链及第二Fc链共同构成可以与Fc受体结合的异源二聚体；其中所述第一Fc链和第二Fc链通过共价键或连接体分别连接到所述第一抗原结合功能区和第二抗原结合功能区；并且其中所述第一Fc链和第二Fc链中的任意一条在366位及399位上包含T366L和D399R氨基酸替换，另一条在351位、407位及409位上包含L351E、Y407L和K409V氨基酸替换，其中氨基酸位置根据Kabat EU指数编号系统编号。
- 根据权利要求11所述的双特异抗体，其中第一Fc链及与其共价相连的第一抗原结合功能区，和第二Fc链及与其共价相连的第二抗原结合功能区，在存在还原剂的溶液中且所述溶液中除所述第一Fc链及与其共价相连的第一抗原结合功能区和第二Fc链及与其共价相连的第二抗原结合功能区以外不含其它多肽时，其形成同源二聚体的基于所有多肽链的重量比例均低于50％。
- 根据权利要求1-12任一项所述的双特异性抗体，其包含特异性结合PD-L1的第一重链及第一轻链对，其中所述第一重链具有包含SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的重链 可变区，以及包含SEQ ID NO.8或10所示氨基酸序列的重链恒定区，所述第一轻链具有包含SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的轻链可变区，以及包含SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的轻链恒定区。
- 根据权利要求1-13任一项所述的双特异性抗体，其包含特异性结合CD47的第二重链及第二轻链对，其中所述第二重链具有包含SEQ ID NO.14、20、24、28、32或36所示氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的重链恒定区，所述第二轻链具有包含SEQ ID NO.12、18、22、26、30或34所示氨基酸序列的轻链可变区，以及包含SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的轻链恒定区。
- 一种分离的多核苷酸，其编码如权利要求1-14任一项所述的双特异抗体。
- 一种重组表达载体，其包含权利要求15所述的分离的多核苷酸。
- 一种宿主细胞，其包含权利要求15所述的分离的多核苷酸，或权利要求16所述的重组表达载体。
- 根据权利要求17所述的宿主细胞，其选自人胚肾细胞HEK293或以HEK293细胞为基础改造而得到的HEK293T、HEK293E、HEK293F；仓鼠卵巢细胞CHO或以CHO细胞为基础改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr -、CHO/DG44、ExpiCHO；大肠杆菌或以大肠杆菌为基础改造得到的大肠杆菌BL21、BL21(DE3)、Rosetta、Origami；酵母菌或以酵母为基础改造得到的毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维亚酵母、多形汉逊酵母；昆虫细胞或以昆虫细胞为基础改造得到的细胞High5、SF9；植物细胞；哺乳动物乳腺细胞、体细胞。
- 一种组合物，其包含权利要求1-14任一项所述的双特异抗体或权利要求15-所述的分离的多核苷酸或权利要求16所述的重组表达载体或权利要求17或18所述的宿主细胞，及药学上可接受的载体。
- 一种生产如权利要求1-14任一项所述的双特异抗体的方法，其包括步骤：1)将权利要求15所述的分离的多核苷酸或权利要求16所述的重组表达载体分别在宿主细胞中进行表达；2)将在宿主细胞中分别表达的蛋白进行还原；以及3)将还原的蛋白混合，然后将混合物进行氧化。
- 根据权利要求19或20所述的方法，其中还原步骤包括1)在还原剂存在下进行还原反应，所述还原剂选自：2-巯基乙胺、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或其他化学衍生物；2)去除还原剂。
- 根据权利要求19-21任一项所述的方法，其中氧化步骤为在空气中氧化，也包括在氧化剂存在下进行氧化反应，所述氧化剂选自：L-脱氢抗坏血酸或其化学衍生物。
- 根据权利要求19-22任一项所述的方法，其还包括分离纯化的步骤。
- 权利要求1-14任一项所述的双特异抗体和/或权利要求15所述的分离的多核苷酸和/或权利要求16所述的重组表达载体和/或权利要求17或18所述的宿主细胞和/或权利要求19所述的组合物在制备用于预防和/或治疗受试者疾病的药物中的用途。
- 根据权利要求1-14任一项所述的双特异抗体和/或权利要求15所述的分离的多核苷酸和/或权利要求16所述的重组表达载体和/或权利要求17或18所述的宿主细胞和/或权利要求19所述的组合物，其用做用于预防和/或治疗受试者疾病的药物。
- 一种预防和/或治疗疾病的方法，包括将权利要求1-14任一项所述的双特异抗体和/或权利要求15所述的分离的多核苷酸和/或权利要求16所述的重组表达载体和/或权利要求17或18所述的宿主细胞和/或权利要求19所述的组合物施予有需求的受试者。
- 根据权利要求24所述的用途，权利要求25所述的异源二聚体形式的双特异抗体、分离的多核苷酸、重组表达载体、宿主细胞或组合物，或权利要求26所述的方法，其中受试者是哺乳动物，优选地，人类受试者。
- 如权利要求24所述的用途，权利要求25所述的异源二聚体形式的双特异抗体、分离的多核苷酸、重组表达载体、宿主细胞或组合物，或权利要求26所述的方法，其中所述疾病选自如下肿瘤：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤、小细胞肺癌、骨癌。
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