JP2024502365A - 抗pd-l1/抗cd47天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体及びその製造方法 - Google Patents
抗pd-l1/抗cd47天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体及びその製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024502365A JP2024502365A JP2023541810A JP2023541810A JP2024502365A JP 2024502365 A JP2024502365 A JP 2024502365A JP 2023541810 A JP2023541810 A JP 2023541810A JP 2023541810 A JP2023541810 A JP 2023541810A JP 2024502365 A JP2024502365 A JP 2024502365A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- acid sequence
- chain variable
- sequence shown
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 title claims description 56
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 147
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 101
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 95
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 95
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 95
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 90
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 claims description 63
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 claims description 61
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims description 55
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 claims description 55
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 35
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 28
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 28
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 11
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 10
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 4
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 4
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 claims description 3
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 3
- SBJKKFFYIZUCET-JLAZNSOCSA-N Dehydro-L-ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(=O)C1=O SBJKKFFYIZUCET-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 3
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 claims description 3
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 claims description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 3
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037965 uterine sarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims description 2
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 claims description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 2
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 claims description 2
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 2
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 claims description 2
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 37
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 37
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 20
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 19
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 16
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 11
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 11
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 11
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 101000863873 Homo sapiens Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Proteins 0.000 description 6
- 102100029948 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Human genes 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 4
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 4
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- -1 their hydrophobicity Chemical class 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Chemical compound C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 210000001142 back Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000003198 gene knock in Methods 0.000 description 2
- 102000048776 human CD274 Human genes 0.000 description 2
- 102000044459 human CD47 Human genes 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 2
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 2
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 208000015347 renal cell adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 229920002785 Croscarmellose sodium Polymers 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008116 calcium stearate Substances 0.000 description 1
- 235000013539 calcium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- FPAFDBFIGPHWGO-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxomagnesium;hydrate Chemical compound O.[Mg]=O.[Mg]=O.[Mg]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O FPAFDBFIGPHWGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012362 drug development process Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N hexadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCO BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYPPCCJJKNISFK-UHFFFAOYSA-J kaolinite Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3].[Al+3].[O-][Si](=O)O[Si]([O-])=O CYPPCCJJKNISFK-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229910052622 kaolinite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 229910002055 micronized silica Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007896 negative regulation of T cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本発明は、抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体及びその製造方法を提供する。この抗体は、天然IgGの特徴を有し、且つ重鎖-軽鎖のミスマッチがない、非常に安定なヘテロダイマー型のものである。この二重特異性抗体は、2種類のターゲット分子と同時に結合することができ、且つ副作用がより小さい。
Description
本発明は、抗PD-L1/抗CD47天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体及びその製造方法に関する。具体的には、本発明は、天然IgGの特徴を有し、且つ重鎖-軽鎖のミスマッチがない、非常に安定なヘテロダイマー抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体及びその製造方法を提供する。
プログラム細胞死リガンド-1(programmed death ligand 1、PD-L1)は、免疫チェックポイントであるプログラム細胞死-1(programmed death-1、PD-1)のリガンドであり、B7ファミリーに属しており、T細胞、B細胞、単核細胞、マクロファージ、DC細胞、内皮細胞、表皮細胞などを含む多種の免疫細胞の表面に誘導的に発現する。PD-L1は、PD-1と結合すると、主にT細胞の活性化の負の調節に関与し、免疫応答の強弱及び持続時間を調節することができる。PD-L1は、PD-1のリガンドに加えて、CD80のリガンドとして、T細胞へ負の調節のシグナルを伝達し、T細胞の免疫寛容を誘導することができる(Autoimmun Rev,2013,12(11):1091-1100.Front Immunol,2013,4:481.Nat Rev Cancer,2012,12(4):252-264.Trends Mol Med.2015 Jan;21(1):24-33.Clin Cancer Res.2012 Dec 15;18(24):6580-7.)。通常の場合、PD-L1及びPD-1は、生体組織の自己免疫寛容を誘導及び維持し、炎症反応の過程において免疫系が過度に活性化して自己組織を傷つけることを防止し、自己免疫疾患の発生を避けるのに積極的な作用を有することができる。病理的状況では、それは、腫瘍免疫及び多種の自己免疫疾患の発生及び発展過程に関与する。多くの研究によると、PD-L1は多種の腫瘍組織で高発現し、PD-1は腫瘍浸潤リンパ球で高発現し、且つPD-L1及びPD-1の過剰な発現は臨床的な腫瘍の予後不良と密接に関連することが報告された(Anticancer Agents Med Chem.2015;15(3):307-13.Hematol Oncol Stem Cell Ther.2014 Mar;7(1):1-17.Trends Mol Med.2015 Jan;21(1):24-33.Immunity.2013 Jul 25;39(1):61-73.J Clin Oncol.2015 Jun 10;33(17):1974-82.)。PD-L1モノクローナル抗体による、PD-L1/PD-1及びCD80/PD-L1の相互作用へのブロッキングは、臨床前の実験研究及び臨床において良好な抗腫瘍効果を示した。現在、PD-L1モノクローナル抗体は、既に非小細胞肺癌や尿路上皮癌などの多くの腫瘍の治療に用いられることが承認されている。しかし、一部の腫瘍の患者のみは、このようなモノクローナル抗体による療法から利点を得ることができるが、多くの患者はこのようなモノクローナル抗体に応答していない(Expert Opin Ther Targets.2014 Dec;18(12):1407-20.Oncoloy(Williston Park).2014 Nov;28 Suppl 3:15-28.)。
CD47は、インテグリン関連タンパク質とも呼ばれ、大きさが50Kdの膜貫通型タンパク質であり、免疫グロブリンのスーパーファミリーに属する。多種の細胞に広く発現しているが、多種の腫瘍細胞では発現が明らかに増強されている(Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(17):6662-6667)。CD47のリガンドは、シグナル調節タンパク質α(signal-regulatory protein α、SIRPα)であり、主にマクロファージに発現し、CD47と結合して「私を食べないで」というシグナルを伝達し、マクロファージの貪食作用を阻害する(Curr Opin Immunol,2009,21(1):47-52)。抗CD47抗体を使用してCD47-SIRPαシグナル経路をブロッキングすることにより、抗腫瘍作用を発揮させることができる。現在、多種の抗CD47モノクローナル抗体は、臨床研究段階に入っており、多種の血液腫瘍及び固形腫瘍の治療に用いられる。しかし、赤血球などの表面にもCD47が発現しているので、これらの抗CD47治療は、重度の貧血や血小板の減少などの副作用を引き起こし、バイオアベイラビリティが低い可能性がある。
そこで、当分野ではPD-L1及びCD47のシグナル経路を同時にブロッキングできる新規治療薬を研究する必要がある。
本発明は、天然IgGの構造特徴を有し、且つ重鎖-軽鎖のミスマッチがない、PD-L1及びCD47を同時にブロッキングすることができる、非常に安定な新規ヘテロダイマー二重特異性抗体及びその製造方法を提供し、この二重特異性抗体は、PD-L1及びCD47を同時に高発現させる腫瘍細胞と選択的に結合する傾向があり、これにより、効率的且つ特異的な殺傷効果を発揮するとともに、毒性の低い副作用を有する。
本発明の第1の態様は、PD-L1と特異的に結合する第1の抗原結合機能領域及びCD47と特異的に結合する第2の抗原結合機能領域を含む二重特異性抗体に関し、ここで、前記PD-L1と特異的に結合する第1の抗原結合機能領域は、
(A)重鎖可変領域と、
(B)軽鎖可変領域と、を含み、
前記重鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.37に示すアミノ酸配列を含むHCDR1と、
(b)SEQ ID NO.38に示すアミノ酸配列を含むHCDR2と、
(c)SEQ ID NO.39に示すアミノ酸配列を含むHCDR3と、を含み、
前記軽鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.40に示すアミノ酸配列を含むLCDR1と、
(b)SEQ ID NO.41に示すアミノ酸配列を含むLCDR2と、
(c)SEQ ID NO.42に示すアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む。
(A)重鎖可変領域と、
(B)軽鎖可変領域と、を含み、
前記重鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.37に示すアミノ酸配列を含むHCDR1と、
(b)SEQ ID NO.38に示すアミノ酸配列を含むHCDR2と、
(c)SEQ ID NO.39に示すアミノ酸配列を含むHCDR3と、を含み、
前記軽鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.40に示すアミノ酸配列を含むLCDR1と、
(b)SEQ ID NO.41に示すアミノ酸配列を含むLCDR2と、
(c)SEQ ID NO.42に示すアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体のCD47と特異的に結合する前記第2の抗原結合機能領域は、
(A)重鎖可変領域と、
(B)軽鎖可変領域と、を含み、
前記重鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.43に示すアミノ酸配列を含むHCDR1と、
(b)SEQ ID NO.44に示すアミノ酸配列を含むHCDR2と、
(c)SEQ ID NO.45に示すアミノ酸配列を含むHCDR3と、を含み、
前記軽鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.46に示すアミノ酸配列を含むLCDR1と、
(b)SEQ ID NO.47に示すアミノ酸配列を含むLCDR2と、
(c)SEQ ID NO.48に示すアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む。
(A)重鎖可変領域と、
(B)軽鎖可変領域と、を含み、
前記重鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.43に示すアミノ酸配列を含むHCDR1と、
(b)SEQ ID NO.44に示すアミノ酸配列を含むHCDR2と、
(c)SEQ ID NO.45に示すアミノ酸配列を含むHCDR3と、を含み、
前記軽鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.46に示すアミノ酸配列を含むLCDR1と、
(b)SEQ ID NO.47に示すアミノ酸配列を含むLCDR2と、
(c)SEQ ID NO.48に示すアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体のPD-L1と特異的に結合する前記第1の抗原結合機能領域は、
(A)重鎖可変領域と、
(B)軽鎖可変領域と、を含み
前記重鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.37に示すアミノ酸配列を含むHCDR1と、
(b)SEQ ID NO.38に示すアミノ酸配列を含むHCDR2と、
(c)SEQ ID NO.39に示すアミノ酸配列を含むHCDR3と、を含み、
前記軽鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.40に示すアミノ酸配列を含むLCDR1と、
(b)SEQ ID NO.41に示すアミノ酸配列を含むLCDR2と、
(c)SEQ ID NO.42に示すアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含み、
前記CD47と特異的に結合する第2の抗原結合機能領域は、
(A)重鎖可変領域と、
(B)軽鎖可変領域と、を含み、
前記重鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.43に示すアミノ酸配列を含むHCDR1と、
(b)SEQ ID NO.44に示すアミノ酸配列を含むHCDR2と、
(c)SEQ ID NO.45に示すアミノ酸配列を含むHCDR3と、を含み、
前記軽鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.46に示すアミノ酸配列を含むLCDR1と、
(b)SEQ ID NO.47に示すアミノ酸配列を含むLCDR2と、
(c)SEQ ID NO.48に示すアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む。
(A)重鎖可変領域と、
(B)軽鎖可変領域と、を含み
前記重鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.37に示すアミノ酸配列を含むHCDR1と、
(b)SEQ ID NO.38に示すアミノ酸配列を含むHCDR2と、
(c)SEQ ID NO.39に示すアミノ酸配列を含むHCDR3と、を含み、
前記軽鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.40に示すアミノ酸配列を含むLCDR1と、
(b)SEQ ID NO.41に示すアミノ酸配列を含むLCDR2と、
(c)SEQ ID NO.42に示すアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含み、
前記CD47と特異的に結合する第2の抗原結合機能領域は、
(A)重鎖可変領域と、
(B)軽鎖可変領域と、を含み、
前記重鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.43に示すアミノ酸配列を含むHCDR1と、
(b)SEQ ID NO.44に示すアミノ酸配列を含むHCDR2と、
(c)SEQ ID NO.45に示すアミノ酸配列を含むHCDR3と、を含み、
前記軽鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.46に示すアミノ酸配列を含むLCDR1と、
(b)SEQ ID NO.47に示すアミノ酸配列を含むLCDR2と、
(c)SEQ ID NO.48に示すアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む。
SEQ ID NO.37-42に示すPD-L1と特異的に結合する第1の抗原結合機能領域の6つのCDR配列及びSEQ ID NO.43-48に示すCD47と特異的に結合する第2の抗原結合機能領域の6つのCDR配列は、それぞれ本発明者がヒトPD-L1とCD47を抗原として、ハイブリドーマ技術を用いて得られたモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のCDRであり、前記モノクローナル抗体は、従来技術で知られているPD-L1抗体及びCD47抗体と異なり、且つ、例えばより高い結合特異性、抗腫瘍活性などのより高い生物学的活性を有する。
いくつかの実施形態において、PD-L1と特異的に結合する第1の抗原結合機能領域の6つのCDR配列は、それぞれSEQ ID NO.37-42に示す配列と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、95%又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持し、又は、それぞれSEQ ID NO.37-42に示す配列に対して、1つ又は複数、例えば1個、2個、3個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び/又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
いくつかの実施形態において、CD47と特異的に結合する第2の抗原結合機能領域の6つのCDR配列は、それぞれSEQ ID NO.43-48に示す配列と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、95%又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持し、又は、それぞれSEQ ID NO.43-48に示す配列に対して、1つ又は複数、例えば1個、2個、3個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び/又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
いくつかの実施形態において、PD-L1と特異的に結合する前記第1の抗原結合機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列を含むものであるか、又は、SEQ ID No.6に示す配列と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、SEQ ID NO.6に示す配列に対して、1つ又は複数、例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び/又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を含むものであるか、又は、SEQ ID No.2に示す配列と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、SEQ ID NO.2に示す配列に対して、1つ又は複数、例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び/又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
いくつかの実施形態において、CD47と特異的に結合する前記第2の抗原結合機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO.14、20、24、28、32又は36から選ばれるアミノ酸配列を含むものであるか、又は、SEQ ID NO.14、20、24、28、32又は36に示す配列と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、SEQ ID NO.6に示す配列に対して、1つ又は複数、例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び/又は添加して、得られた対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.12、18、22、26、30又は34に示すアミノ酸配列を含むものであるか、又は、SEQ ID NO.12、18、22、26、30又は34に示す配列と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、SEQ ID NO.6に示す配列に対して、1つ又は複数、例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び/又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
いくつかの実施形態において、PD-L1と特異的に結合する前記第1の抗原結合機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO.6に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.2に示すアミノ酸配列を含み、
且つ、
CD47と特異的に結合する前記第2の抗原結合機能領域は、以下の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域から選ばれるものを含む:
a)SEQ ID NO.14に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.12に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
b)SEQ ID NO.20に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.18に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
c)SEQ ID NO.24に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.22に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
d)SEQ ID NO.28に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.26に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
e)SEQ ID NO.32に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.30に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;又は
f)SEQ ID NO.36に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.34に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
且つ、
CD47と特異的に結合する前記第2の抗原結合機能領域は、以下の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域から選ばれるものを含む:
a)SEQ ID NO.14に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.12に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
b)SEQ ID NO.20に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.18に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
c)SEQ ID NO.24に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.22に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
d)SEQ ID NO.28に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.26に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
e)SEQ ID NO.32に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.30に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;又は
f)SEQ ID NO.36に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.34に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の第1の抗原結合機能領域及び第2の抗原結合機能領域は、Fabフラグメント、scFvフラグメント及び可変ドメインフラグメントFvから選ばれる。
更なる実施形態において、前記二重特異性抗体の第1の抗原結合機能領域及び第2の抗原結合機能領域は、いずれもFabフラグメントである。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体のFabフラグメントは、異なる第1の重鎖可変領域及び第2の重鎖可変領域と、異なる第1の軽鎖可変領域及び第2の軽鎖可変領域と、を含む。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の第1の抗原結合機能領域及び第2の抗原結合機能領域の一方は、Fabフラグメントであり、他方は、scFvである。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、第1のFc鎖及び第2のFc鎖を含む。
ここで、前記第1のFc鎖及び第2のFc鎖は、いずれもアミノ酸の置換を含む免疫グロブリンGのFcフラグメントであり、且つ、前記第1のFc鎖と第2のFc鎖は、共に、Fc受容体と結合できるヘテロダイマーを構成する。
ここで、前記第1のFc鎖と第2のFc鎖は、共有結合又はリンカーを介して前記第1の抗原結合機能領域と第2の抗原結合機能領域にそれぞれ連結されている。
且つ、前記第1のFc鎖及び第2のFc鎖のいずれか一方は、位置366及び位置399でのT366L及びD399Rのアミノ酸置換を含み、他方は、位置351、位置407及び位置409でのL351E、Y407L及びK409Vのアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸の位置は、Kabat EUインデックスナンバリングシステムに従って番号付けされる。
本明細書において、特に断りがない限り、抗体のアミノ酸の位置は、いずれもKabat EUインデックスナンバリングシステムに従って番号付けされる。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の第1のFc鎖及び共有結合を介してそれに連結された第1の抗原結合機能領域並びに第2のFc鎖及び共有結合を介してそれに連結された第2の抗原結合機能領域は、還元剤が存在する溶液中において、且つ、前記溶液中に前記第1のFc鎖及び共有結合を介してそれに連結された第1の抗原結合機能領域と第2のFc鎖及び共有結合を介してそれに連結された第2の抗原結合機能領域以外のポリペプチドが含まれていない場合、形成されたホモダイマーのすべてのポリペプチド鎖に基づく重量割合が、50%未満、例えば45%未満、40%未満、35%未満、30%未満、25%未満、20%未満又はそれ以下である。
いくつかの実施形態において,前記二重特異性抗体の第1の抗原結合機能領域は、SEQ ID NO:2及び6のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において,前記二重特異性抗体の第2の抗原結合機能領域は、SEQ ID NO:12、14、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36のアミノ酸配列を含む。前記アミノ酸配列の組み合わせ方式は、生物学的法則に従うべきであり、即ち、軽鎖及び重鎖又は軽鎖及び重鎖の可変領域と抗原結合フラグメントが互いに合致すべきであり、例えばSEQ ID NO:12とSEQ ID NO:14とが互いに合致し、SEQ ID NO:18とSEQ ID NO:14とが互いに合致することは当業者に明らかである。
いくつかの実施形態において,前記二重特異性抗体の第1の軽鎖及び第2の軽鎖は、いずれもSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の第1の重鎖及び第2の重鎖のいずれか一方は、SEQ ID NO:8又は10のアミノ酸配列を含み、他方は、SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、PD-L1と特異的に結合する第1の重鎖及び第1の軽鎖のペアを含み、ここで、前記第1の重鎖は、SEQ ID NO.6に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO.8又は10に示すアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、を有する。前記第1の軽鎖は、SEQ ID NO.2に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、SEQ ID NO.4に示すアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域と、を有する。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、CD47と特異的に結合する第2の重鎖及び第2の軽鎖のペアを含み、ここで、前記第2の重鎖は、SEQ ID NO.14、20、24、28、32又は36に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO.16に示すアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、を有する。前記第2の軽鎖は、SEQ ID NO.12、18、22、26、30又は34に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、SEQ ID NO.4に示すアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域と、を有する。
本発明の第2の態様は、前述したような二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
いくつかの実施形態において、第1の抗原結合機能領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1及び5のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第2の抗原結合機能領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:11、13、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35のヌクレオチド配列を含む。上記のように、前記アミノ酸配列の組み合わせ方式は、生物学的法則に従うべきであり、即ち、軽鎖及び重鎖又はその可変領域と抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列が互いに合致すべきであり、例えばSEQ ID NO:11とSEQ ID NO:13とが互いに合致し、SEQ ID NO:17とSEQ ID NO:13とが互いに合致する。
いくつかの実施形態において、第1の軽鎖及び第2の軽鎖のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、いずれもSEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第1の重鎖及び第2の重鎖のいずれか一方のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:7又は9のヌクレオチド配列を含み、他方のものをコードするヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:15のヌクレオチド配列を含む。
本発明の第3の態様は、前述したような単離されたポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターに関する。
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、pCDNAに基づく改変により得られるプラスミドベクターX0GCである。
本発明の第4の態様は、前述したような単離されたポリヌクレオチド又は前述したような組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ヒト胚性腎臓細胞HEK293又はHEK293細胞に基づく改変により得られるHEK293T、HEK293E、HEK293F、ハムスター卵巣細胞CHO又はCHO細胞に基づく改変により得られるCHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44、ExpiCHO、大腸菌又は大腸菌に基づく改変により得られる大腸菌BL21、BL21(DE3)、Rosetta、Origami、酵母菌又は酵母に基づく改変により得られるピキア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ、昆虫細胞又は昆虫細胞に基づく改変により得られる細胞High5、SF9、植物細胞、哺乳動物の乳腺細胞、体細胞から選ばれる。
本発明の第5の態様は、前述したような二重特異性抗体又は前述したような単離されたポリヌクレオチド又は前述したような組換え発現ベクター又は前述したような宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。
本発明の第6の態様は、以下のステップを含む前述したような二重特異性抗体を生産する方法に関する。
1)宿主細胞において前述したような単離されたポリヌクレオチド又は前述したような組換え発現ベクターをそれぞれ発現させるステップと、
2)宿主細胞においてそれぞれ発現されたタンパク質を還元するステップと、
3)還元されたタンパク質を混合した後、混合物を酸化するステップと、を含む。
2)宿主細胞においてそれぞれ発現されたタンパク質を還元するステップと、
3)還元されたタンパク質を混合した後、混合物を酸化するステップと、を含む。
いくつかの実施形態において、還元ステップは、1)2-メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン又はその他の化学誘導体から選ばれる還元剤の存在下で還元反応を行うステップと、2)還元剤を除去するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、還元剤は、0.1mM又はそれ以上の濃度、例えば0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM又はそれ以上のジチオスレイトールであり、反応条件として、4℃で少なくとも3時間、例えば3.5時間、4時間、4.5時間、5時間、5.5時間、6時間又はそれ以上反応させる。
いくつかの実施形態において、酸化ステップは、空気中での酸化であるが、L-デヒドロアスコルビン酸又はその化学誘導体から選ばれる酸化剤の存在下で酸化反応を行うステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、酸化剤は、0.5mM又はそれ以上の濃度、例えば0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.2mM、1.5mM又はそれ以上のL-デヒドロアスコルビン酸であり、反応条件として、4℃で少なくとも5時間、例えば5時間、6時間、7時間、8時間、9時間又はそれ以上反応させる。
いくつかの実施形態において、前記方法は、単離及び精製のステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記単離及び精製は、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びそれらの組み合わせによるものを含む。
本発明の第7の態様は、被験者の疾患を予防及び/又は治療するための薬剤の製造における、前述したような二重特異性抗体、及び/又は前述したような単離されたポリヌクレオチド、及び/又は前述したような組換え発現ベクター、及び/又は前述したような宿主細胞、及び/又は前述したような組成物の使用に関する。
本発明の第8の態様は、被験者の疾患を予防及び/又は治療するための薬剤として使用する、前述したような二重特異性抗体、及び/又は前述したような単離されたポリヌクレオチド、及び/又は前述したような組換え発現ベクター、及び/又は前述したような宿主細胞、及び/又は前述したような組成物に関する。
本発明の第9の態様は、必要とする被験者に、前述したような二重特異性抗体、及び/又は前述したような単離されたポリヌクレオチド、及び/又は前述したような組換え発現ベクター、及び/又は前述したような宿主細胞、及び/又は前述したような組成物を投与するステップを含む、疾患を予防及び/又は治療する方法に関する。
いくつかの実施形態において、被験者は、哺乳動物であり、好ましくは、ヒトである。
いくつかの実施形態において、前記疾患は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫、小細胞肺癌、骨癌から選ばれ、好ましくは、前記疾患は、白血病、リンパ腫、骨髄腫から選ばれる。
言い換えれば、本発明は、天然IgGの特徴を有し、且つ重鎖-軽鎖のミスマッチがない、非常に安定な新規抗PD-L1/抗CD47天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体を設計した。本発明で製造された二重特異性抗体は、2種類のターゲット分子PD-L1及びCD47と同時に結合することができ、複雑な疾患の治療に応用される場合、単一の治療剤よりも優れた効果を発揮することができ、且つ副作用がより小さい。また、複数の薬剤の併用療法に対して、この二重特異性抗体は、単一の治療分子であるので、患者や医療従事者にとって使用が容易となるだけでなく、複雑な新薬開発プロセスを簡略化している。
定義:
本明細書において、用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、抗原結合部位を含むタンパク質を指し、様々な構造を有する天然抗体及び人工抗体を含み、完全抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
本明細書において、用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、抗原結合部位を含むタンパク質を指し、様々な構造を有する天然抗体及び人工抗体を含み、完全抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
本明細書において、用語「二重特異性抗体」は、2種類の異なる生物分子上のエピトープと特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。特別な説明がない限り、記載されている二重特異性抗体の名称における二重特異性抗体が結合する抗原の順序は任意である。即ち、いくつかの実施形態において、用語「抗PD-L1/CD47二重特異性抗体」と「抗CD47/PD-L1二重特異性抗体」は互換的に使用されてもよい。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、2つの半抗体を含み、ここで、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び任意の重鎖定常領域の少なくとも一部と、単一の軽鎖可変領域及び任意の軽鎖定常領域の少なくとも一部と、を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、2つの半抗体を含み、ここで、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、且つ、1個超えの単一の重鎖可変領域を含まず、1個超えの単一の軽鎖可変領域を含まない。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、2つの半抗体を含み、ここで、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、且つ、第1の半抗体は、第1の抗原と結合するが第2の抗原と結合せず、第2の半抗体は、第2の抗原と結合するが第1の抗原と結合しない。
用語「相補性決定領域」又は「CDR領域」又は「CDR」(本明細書において超可変領域「HVR」とは互換的に使用されてもよい)とは、抗体可変ドメインのうち、配列的に高度に変異し且つ構造的に決定されたループ(「超可変ループ」)を形成し及び/又は抗原接触残基(「抗原接触点」)を含有する領域を指す。CDRは、主に抗原エピトープとの結合を担当する。本明細書において、重鎖の3つのCDRは、HCDR1、HCDR2及びHCDR3と呼ばれ、軽鎖的3つのCDRは、LCDR1、LCDR2及びLCDR3と呼ばれる。
異なるナンバリングスキームに基づいて得られた同一の抗体の可変領域のCDRの境界は異なる可能性があることに留意されたい。即ち、異なるナンバリングスキームで定義される同一の抗体可変領域のCDR配列は異なる。このため、本発明で定義される特定のCDR配列を用いて抗体を限定する場合、前記抗体の範囲は、可変領域配列が前記特定のCDR配列を含むが、異なるスキーム(例えば、異なるナンバリングスキームの規則又は組み合わせ)を適用することによって、いわゆるCDRの境界が、本発明で定義される特定のCDRの境界と異なる抗体をさらに含む。「共有結合」とは、ヘテロダイマー二重特異性抗体において、2つのFc鎖の間やいずれか1つのFc鎖とそれに連結された抗原結合機能領域との間を、共有結合により連結させて1つの分子を形成することを指す。ここで、Fc鎖は、1つ又は複数の共有結合(例えば、ジスルフィド結合)により連結された第1の抗原結合機能領域と第2の抗原結合機能領域とを含み、この第1のFc鎖及び第2のFc鎖は、それぞれ共有結合(例えば、イミン結合又はアミド結合)を介して抗原結合機能領域に連結されている。
抗原結合機能領域とは、抗原などの標的分子と特異的に相互作用することができる領域を指す。その作用は、高度な選択性がある。通常、1つの標的分子を認識する配列は、他の分子の配列を認識することができない。代表的な抗原結合機能領域は、抗体可変領域、抗体可変領域の構造変異体、受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、又は酵素結合ドメインを含む。
1つ又は複数のジスルフィド結合による鎖間結合とは、1つ又は複数のジスルフィド結合により第1のFc鎖と第2のFc鎖とを連結させてヘテロダイマーフラグメントを形成することを意味する。本発明において、1つ又は複数のジスルフィド結合は、第1のFc鎖及び第2のFc鎖、又は第1のFc鎖及び第2のFc鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域が同じ細胞において合成される場合に形成することができるか、又は第1のFc鎖及び第2のFc鎖、又は第1のFc鎖及び第2のFc鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域が異なる細胞において別々に合成された後にインビトロ還元-酸化プロセスにより形成することができる。
第1のFc鎖及び第2のFc鎖とは、ジスルフィド結合を含む共有結合により形成された結合フラグメントを指し、各鎖は、少なくとも、免疫グロブリンの重鎖定常領域の一部を含む。また、前記第1のFc鎖と第2のFc鎖は、アミノ酸配列が異なり、少なくとも1つのアミノ酸が異なる。本発明の第1のFc鎖及び第2のFc鎖において、同じ鎖間に強力な反発力が存在する一方で、異なる鎖間に引力が存在するので、第1のFc鎖及び第2のFc鎖、又は第1のFc鎖及び第2のFc鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域は、共に細胞において発現されている場合、ヘテロダイマーを形成する傾向がある。第1のFc鎖及び第2のFc鎖、又は第1のFc鎖及び第2のFc鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域が2つの宿主細胞において別々に発現される場合、第1のFc鎖又は第1のFc鎖及びそれに連結された抗原結合機能領域は、ホモダイマーを形成する傾向がなく、第2のFc鎖又は第2のFc鎖及びそれに連結された抗原結合機能領域は、ホモダイマーを形成する傾向がない。本発明において、第1のFc鎖及び第2のFc鎖、又は第1のFc鎖及び第2のFc鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域は、還元剤の存在下で2つの宿主細胞において別々に発現される場合、ホモダイマーの割合は、50%未満、即ち、モノマー(1つのFc鎖又は1つのFc鎖及びそれに連結された抗原結合機能領域)の割合は、50%を超える。
免疫グロブリンは、比較的長く、比較的大きい相対分子量を有し、450~550個のアミノ酸残基を含み、55000Da~70000Daの間の相対分子量を有する2つの同じ重鎖と、比較的短く、比較的小さい相対分子量を有し、約210個のアミノ酸残基を含み、約24000Daの相対分子量を有する2つの同じ軽鎖(L鎖)とを含む4つのポリペプチド鎖を有する対称構造を有する。N末端付近の約110個のアミノ酸の配列は、異なる免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖において大きく変化しており、可変領域(variable region、V領域)と呼ばれる。これに対して、C末端付近の残りのアミノ酸配列は、比較的安定であり、定常領域(constant region、C領域)と呼ばれる。抗体の各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書においてVHと略記する)及び重鎖定常領域(本明細書においてCHと略記する)から構成され、各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書においてVLと略記する)及び軽鎖定常領域(本明細書においてCLと略記する)から構成される。重鎖において、可変領域は、重鎖の長さの約1/4を占めるが、定常領域は、重鎖の長さの約3/4を占める。既知の五つのクラスのIg、即ちIgG(γ)、IgA(α)、IgD(δ)、IgM(μ)及びIgE(ε)に関しては、最初の3つのIgのH鎖には、3つの定常領域があり、即ち、CH1、CH2及びCH3からなる。最後の2つのタイプ(IgM及びIgE)のH鎖には、1つのVH領域及び4つの定常領域、即ち、CH1~CH4がある。定常領域は、免疫グロブリン分子のフレームワークでもあり、免疫反応を活性化する領域の1つでもある。本発明の実施例は、IgGに関するが、公知の方法により本発明の抗体のクラスを変換できることは当業者に明らかである。例えば、本発明の最初のIgM抗体は、クラスを本発明のIgG抗体に変換することができる。なお、クラス変換技術によりIgGサブクラスを別のサブクラスに変換することができ、例えば、IgGlをIgG2に変換することができる。このため、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療用途のために、アイソタイプ切り替えにより例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE又はIgM抗体に変換することができる。一実施例において、本発明の抗体は、IgG1抗体、例えば、IgG1,κである。
本発明において、定常領域の一部は、少なくとも第1のFc鎖及び第2のFc鎖が相互に作用する領域を含む。IgGについて、前記領域は、少なくともGLN347、TYR349、THR350、LEU351、SER354、ARG355、ASP356、GLU357、LYS360、SER364、THR366、LEU368、LYS370、ASN390、LYS392、THR394、PR0395、VAL397、ASP399、SER400、PHE405、TYR407、LYS409、LYS439を含む、CH3領域に位置する一部のアミノ酸である。
「第1のFc鎖及び第2のFc鎖がそれぞれ共有結合又はリンカーを介して1つの抗原結合機能領域に連結されること」とは、第1のFc鎖及び第2のFc鎖がそれぞれ共有結合又はリンカーを介して1つの抗体の抗原結合フラグメント、又は抗原を認識できる単鎖抗体、又は抗原を認識できる他の抗体フラグメントの構造変異体、又はリガンドを認識できる受容体、又は受容体を認識できるリガンドに連結されることを指す。ここで、前記共有結合とは、化学結合の1種であり、2つ又は複数の原子がそれらの外側の電子を共有して、理想的には電子的飽和状態に達することにより、共有結合と呼ばれる比較的安定な化学構造を構成する。言い換えれば、共有結合とは、電子対を共有することにより原子間に形成される相互作用である。同じ元素又は異なる元素の原子は、いずれも共有結合を介して結合されてもよい。本発明の第1のFc鎖と第2のFc鎖との間の共有結合として、1つのアミノ酸分子のアミノ基と別のアミノ酸分子のカルボキシル基との間の脱水反応により形成されるアミド結合、エチレングリコール若しくはポリエチレングリコール、又は他の化合物、又はそのポリマーのアルデヒド基と1つのアミノ酸分子のアミノ基とから形成されるアミド結合若しくはイミン結合を含むが、これらに限定されない。ここで、リンカーは、共有結合により2つのポリペプチド鎖を連結することができるアミノ酸の配列又は化合物若しくは化合物のポリマーであり、ここで、アミノ酸の配列は、GGGGSGGGGSGGGGSなどの小さなペプチドセグメントを含むが、これに限定されない。アミド結合を介して第1のFc鎖又は第2のFc鎖、及び抗原を認識できる単鎖抗体、又は抗原を認識できる他の抗体フラグメントの構造変異体を連結させることができる。
第1のFc鎖及び第2のFc鎖が各々のホモダイマーを形成するものではなくヘテロダイマーを形成する傾向があることとは、第1のFc鎖及び第2のFc鎖において、同じポリペプチド鎖間に反発力が存在する一方で、異なるポリペプチド鎖間に引力が存在するので、細胞において同時発現される場合、第1のFc鎖及び第2のFc鎖、又は第1のFc鎖及び第2のFc鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域がヘテロダイマーを形成する傾向があることを指す。第1のFc鎖及び第2のFc鎖、又は第1のFc鎖及び第2のFc鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域が2つの宿主細胞において別々に発現される場合、第1のFc鎖又は第1のFc鎖及びそれらに連結された抗原結合機能領域は、ホモダイマーを形成する傾向がなく、第2のFc鎖又は第2のFc鎖及びそれらに連結された抗原結合機能領域は、ホモダイマーを形成する傾向がない。
Kabat EUインデックスナンバリングシステムとは、Kabatによる方法に基づいて抗体配列の各アミノ酸に番号を割り当てることを指し、このような各残基に番号を割り当てる方法は、当該技術分野における標準的な方法になっている。Kabatのスキームは、彼の研究を越えて、他の抗体に拡張することができる。保存されたアミノ酸に基づいて、目的抗体をKabatにより同定されたコンセンサス配列のうちの1つと照合させる。
Fcドメインとは、エフェクター分子又は細胞と相互作用するIgの部分である、IgのCH2及びCH3ドメインに対応するフラグメント結晶化可能な領域(fragment crystallizable、Fc)を指す。
免疫グロブリンG(Immunoglobulin G、IgG)の略号であるIgGは、血清中の主な抗体成分である。ヒトIgGは、IgG分子のr鎖における抗原性の相違に基づいて、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4の4つのサブクラスに分類される。
半抗体分子とは、抗体の1つの重鎖と1つの軽鎖により形成される構造であって、重鎖及び軽鎖が、共有結合を介して連結されてもされなくてもよいものを指し、抗原を認識する一価抗体構造である。
Fabフラグメントは、抗原結合フラグメント(fragment of antigen binding、Fab)であり、インタクトな軽鎖と重鎖のVH及びCHIドメインとから構成される、抗体分子の2つのアームに対応する分子認識配列である。scFvは、分子認識配列であり、抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を遺伝子工学的に改変して得られる抗体フラグメントの構造変異体である。膜受容体の細胞外領域は、分子認識配列である。膜受容体は、通常、対応する抗原又はリガンドを認識し結合することができる細胞の外部に位置する細胞外領域と、受容体を細胞の表面に固定する膜貫通領域と、キナーゼ活性を有するか又はシグナルを伝達することができる細胞の内部に位置する細胞内領域とを含む。細胞膜受容体のリガンドとは、膜受容体の細胞外領域によって認識し結合されるタンパク質、小さなペプチド又は化合物を指す。サイトカインは、免疫原、マイトジェン、又は他の刺激物により誘導される様々な細胞により生産される低分子量可溶性タンパク質であり、自然免疫、適応免疫、血球生成、細胞成長及び成人多能性幹細胞(APSC)の調整、及び損傷組織の修復などの様々な機能を有する。サイトカインは、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子スーパーファミリー、コロニー刺激因子、ケモカイン、成長因子などに分類される。タンパク質発現タグとは、目的タンパク質のN末端又はC末端に付加される、小さなペプチド又は長いアミノ酸のいずれかであるアミノ酸配列を指す。タグの付加は、タンパク質の正しいフォールディング、タンパク質の単離及び精製、並びにタンパク質の細胞内分解の減少に有利であり得る。通常使用されるタグとして、HA、SUMO、His、GST、GFP、及びFlagを含むが、これらに限定されない。
本発明のヘテロダイマー二重特異性抗体は、1つ又は複数の置換、欠失、付加、及び/又は挿入を有してもよい。例えば、いくつかのアミノ酸は、他のポリペプチド(例えば抗原)又は細胞への結合能力を著しく失うことなく、タンパク質構造中の他のアミノ酸と置換することができる。タンパク質の生物学的機能活性は、結合能力及びタンパク質の特徴によって決定されるので、タンパク質配列に対して、それらの生物学的効果又は活性を著しく失うことなく、いくつかのアミノ酸配列の置換を行うことができる。
多くの場合、ポリペプチド変異体は、1つ又は複数の保存的置換を含む。保存的置換とは、ペプチド化学の分野での当業者がポリペプチドの二次構造及び親水性が実質的に変化しないと予想できるような、類似の特徴を有する他のアミノ酸でのアミノ酸の置換を指す。
アミノ酸の置換は、通常、アミノ酸の側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づくものである。様々な前記特徴を考慮すると、例示的な置換は、当業者にとって公知のものであり、アルギニン及びリジン、グルタミン酸及びアスパラギン酸、セリン及びスレオニン、グルタミン及びアスパラギン、並びにバリン、ロイシン、及びイソロイシンを含む。
本発明で使用される用語「同一性」は、当該分野で通常知られている意味を有し、異なる配列間の同一性を測定するための規則及び基準も当業者に知られており、(必要に応じて、最大相同性%を達成するために)配列を整列させて間隙を導入した後のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列変異体と非変異体配列との間の同じ残基のパーセンテージを指す。本発明において、同一性の限定が満足される場合、得られた変異体配列は、親配列が保有する生物学的活性を有することも必要とされる。上記の活性によって変異体配列をスクリーニングする方法及び手段は、当業者に公知のものである。当業者は、本明細書中で開示される教示から、このような変異体配列を容易に得ることができる。具体的な実施形態において、ポリヌクレオチド及びポリペプチド変異体は、本明細書中で記載されるポリヌクレオチド又はポリペプチドと、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%、又は少なくとも約99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は99.9%のポリヌクレオチド若しくはポリペプチド同一性を有する。遺伝子コードの冗長性のために、これらの配列と同じアミノ酸配列をコードする変異体が存在する。
本発明の別の実施形態において、中程度から高度にストリンジェントな条件下で、本発明により提供されるポリヌクレオチド配列、又はそのフラグメント、又はその相補配列とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド組成物を提供する。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野で公知である。説明の目的で、本発明のポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのテストに好適な中程度にストリンジェントな条件は、5×SSC、0.5%SDS、1.0mMのEDTA(pH8.0)の溶液で予備洗浄し、50℃~60℃にて5×SSCの条件下で一晩ハイブリダイズし、そして0.1%SDSを含む2×、0.5×及び0.2×SSCで65℃にて2回20分間洗浄することを含む。当業者は、例えばハイブリダイゼーション溶液の塩含有量及び/又はハイブリダイゼーション温度を変えることによって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを容易に操作し得ることを理解している。例えば、別の実施形態において、好適な高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として、上記の条件が含まれるが、ハイブリダイゼーション温度を、例えば60~65℃又は65~70℃まで上昇させることが異なる。
本発明の宿主細胞は、外来遺伝子を発現させるためのすべての細胞であってもよく、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない。
本発明のベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド及びミニ染色体を含む、任意の種類の細胞又は生体中で複製できるベクターを含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、ポリヌクレオチドの増殖(propagation)若しくは複製に適したベクター、又は本発明のポリペプチドの発現に適したベクターである。このようなベクターは、当該技術分野で知られており、市販されている。
「ベクター」は、シャトルベクター及び発現ベクターを含む。通常、プラスミド構築物は、細菌におけるプラスミド複製及び選択のための複製起点(例えば、CoEl複製起点)並びに選択マーカー(例えば、アンピシリン又はテトラサイクリン耐性)をさらに含む。「発現ベクター」とは、細菌又は真核細胞において抗体フラグメントを含む本発明の抗体を発現するために必要な制御配列又は調節要素を含むベクターを指す。
本発明のベクターは、外来遺伝子を発現させるためのすべてのベクターであってもよく、プラスミドベクターを含むが、これに限定されない。ここで、プラスミドベクターは、少なくとも複製起点、プロモーター、目的遺伝子、マルチクローニングサイト、選択マーカー遺伝子を含み、好ましくは、本発明に係るベクターは、例えばX0GCベクターなどの、pCDNAに基づく改変により得られるプラスミドベクターを含むが、これらに限定されない。
本発明の被験者は、鳥類、爬行動物、哺乳動物などを含む。好ましくは、哺乳動物は、げっ歯類の動物、霊長類動物を含み、より好ましくは、霊長類動物は、ヒトを含む。
本発明に係る疾患の範囲は、腫瘍を含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫、小細胞肺癌、骨癌を含む。
薬学的に許容される担体とは、薬学分野における一般的な医薬担体、例えば、希釈剤、賦形剤、水など、デンプン、ショ糖、乳糖、微晶セルロースなどの充填剤、セルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニルピロリドンなどの結合剤、グリセリンなどの湿潤剤、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロース、寒天、炭酸カルシウム及び炭酸水素ナトリウムなどの崩壊剤、四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ヘキサデカノール、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤、カオリナイト、ベントナイトなどの吸着担体、タルク粉末、ステアリン酸カルシウム及びステアリン酸マグネシウム、微粉化シリカゲル及びポリエチレングリコールなどの潤滑剤を指す。さらに、例えば香味料や甘味料などの他のアジュバントを組成物に添加してもよい。
以下、下記の非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。本発明の要旨から逸脱することなく本発明に対して様々な修正を行うことができることは、当業者に知られている。このような修正も本発明の範囲内に含まれる。
以下の実験方法は、特に説明しない限り、いずれも通常の方法である。使用された実験材料は、特に説明しない限り、商業的企業から容易に入手することができる。本発明の以下の実施例で使用される各抗体は、いずれも市販の標準的抗体である。
実施例
実施例1 抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体分子のベクターの構築
それぞれ抗ヒトPD-L1抗体の軽鎖及び重鎖を含むX0GC発現ベクターを構築した(特許WO2008/048037に由来する)。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.2に示される。軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:3に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.4に示される。重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:5に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.6に示される。重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.7又はSEQ ID.9に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.8又はSEQ ID NO.10に示される。蘇州金唯智(GENEWIZ)社で酵素切断部位、シグナルペプチド配列及び抗体PD-L1軽鎖可変領域配列を含むフラグメントを合成し、合成した目的フラグメントを含有するベクター及び軽鎖定常領域配列をライゲーションしたX0GCベクターに対してBamHI(Thermo、カタログ番号FD0054)及びPfl23II(Thermo、カタログ番号FD0854)で二重酵素切断(Double Digests)を行った。酵素切断反応系は、6μLの10×緩衝液と、それぞれ2μLのBamHI及びPfl23IIと、40μLのベクターと、10μLのH2Oであり、酵素切断反応系を37℃で1時間反応させた。酵素切断産物をT4 DNAリガーゼ(Thermo、カタログ番号EL0011)でライゲーションした反応系は、1μLの10×リガーゼ緩衝液と、0.5μLのリガーゼと、ゲルから回収された軽鎖可変領域フラグメント7.5μLと、ゲルから回収された軽鎖定常領域配列をライゲーションしたX0GCベクター1μLであり、ライゲーションを22℃で30min反応させた。ライゲーション産物でE.coli DH5αコンピテントセル(Tiangen、CB104、以下は同様)の形質転換を行った。金唯智社で酵素切断部位、シグナルペプチド配列及び抗体PD-L1重鎖可変領域配列を含むフラグメントを合成し、合成した目的フラグメントを含有するベクター及び重鎖定常領域配列をライゲーションしたX0GCベクターに対してHindIII(Thermo、カタログ番号FD0505)及びNheI(Thermo、カタログ番号FD0973)で二重酵素切断を行った。酵素切断反応系は、6μLの10×緩衝液と、それぞれ2μLのHindIII及びNheIと、40μLのベクターと、10μLのH2Oであり、酵素切断反応系を37℃で1時間反応させた。酵素切断産物をT4 DNAリガーゼ(Thermo、カタログ番号EL0011)でライゲーションした反応系は、1μLの10×リガーゼ緩衝液と、0.5μLのリガーゼと、ゲルから回収された重鎖可変領域フラグメント7.5μLと、ゲルから回収された重鎖定常領域をライゲーションしたX0GCベクター1μLであり、ライゲーションを22℃で30min反応させた。ライゲーション産物でE.coli DH5αコンピテントセル(Tiangen、CB104)の形質転換を行った。それぞれ真核細胞において抗ヒトPD-L1抗体の重鎖及び軽鎖を発現させるために、抗ヒトPD-L1抗体の重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターを得た。
実施例1 抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体分子のベクターの構築
それぞれ抗ヒトPD-L1抗体の軽鎖及び重鎖を含むX0GC発現ベクターを構築した(特許WO2008/048037に由来する)。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.2に示される。軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:3に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.4に示される。重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:5に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.6に示される。重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.7又はSEQ ID.9に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.8又はSEQ ID NO.10に示される。蘇州金唯智(GENEWIZ)社で酵素切断部位、シグナルペプチド配列及び抗体PD-L1軽鎖可変領域配列を含むフラグメントを合成し、合成した目的フラグメントを含有するベクター及び軽鎖定常領域配列をライゲーションしたX0GCベクターに対してBamHI(Thermo、カタログ番号FD0054)及びPfl23II(Thermo、カタログ番号FD0854)で二重酵素切断(Double Digests)を行った。酵素切断反応系は、6μLの10×緩衝液と、それぞれ2μLのBamHI及びPfl23IIと、40μLのベクターと、10μLのH2Oであり、酵素切断反応系を37℃で1時間反応させた。酵素切断産物をT4 DNAリガーゼ(Thermo、カタログ番号EL0011)でライゲーションした反応系は、1μLの10×リガーゼ緩衝液と、0.5μLのリガーゼと、ゲルから回収された軽鎖可変領域フラグメント7.5μLと、ゲルから回収された軽鎖定常領域配列をライゲーションしたX0GCベクター1μLであり、ライゲーションを22℃で30min反応させた。ライゲーション産物でE.coli DH5αコンピテントセル(Tiangen、CB104、以下は同様)の形質転換を行った。金唯智社で酵素切断部位、シグナルペプチド配列及び抗体PD-L1重鎖可変領域配列を含むフラグメントを合成し、合成した目的フラグメントを含有するベクター及び重鎖定常領域配列をライゲーションしたX0GCベクターに対してHindIII(Thermo、カタログ番号FD0505)及びNheI(Thermo、カタログ番号FD0973)で二重酵素切断を行った。酵素切断反応系は、6μLの10×緩衝液と、それぞれ2μLのHindIII及びNheIと、40μLのベクターと、10μLのH2Oであり、酵素切断反応系を37℃で1時間反応させた。酵素切断産物をT4 DNAリガーゼ(Thermo、カタログ番号EL0011)でライゲーションした反応系は、1μLの10×リガーゼ緩衝液と、0.5μLのリガーゼと、ゲルから回収された重鎖可変領域フラグメント7.5μLと、ゲルから回収された重鎖定常領域をライゲーションしたX0GCベクター1μLであり、ライゲーションを22℃で30min反応させた。ライゲーション産物でE.coli DH5αコンピテントセル(Tiangen、CB104)の形質転換を行った。それぞれ真核細胞において抗ヒトPD-L1抗体の重鎖及び軽鎖を発現させるために、抗ヒトPD-L1抗体の重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターを得た。
本発明は、抗ヒトCD47マウス由来抗体CD47-18-5の重鎖及び軽鎖の可変領域配列をそれぞれ含むX0GC発現ベクターを同時に構築した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.11に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.12に示される。軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.3に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.4に示される。重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.13に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO:14に示される。重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.15に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO:16に示される。それぞれ真核細胞において抗ヒトCD47抗体CD47-18-5の重鎖及び軽鎖を発現させるために、抗ヒトCD47抗体の重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターを得た。
本発明は、抗ヒトCD47マウス由来抗体CD47-18-10の重鎖及び軽鎖の可変領域配列をそれぞれ含むX0GC発現ベクターをさらに同時に構築した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.17に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.18に示される。軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:3に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.4に示される。重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.19に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.20に示される。重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.15に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.16に示される。それぞれ真核細胞において抗ヒトCD47抗体CD47-18-10の重鎖及び軽鎖を発現させるために、抗ヒトCD47抗体の重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターを得た。
本発明は、抗ヒトCD47の抗体CD47-18-5のヒト化配列z3の重鎖及び軽鎖の可変領域をそれぞれ含むX0GC発現ベクターを同時に構築した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.21に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.22に示される。軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:3に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.4に示され、重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.23に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.24に示される。重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.15に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.16に示される。それぞれ真核細胞において抗ヒトCD47抗体CD47-18-5のヒト化配列z3の重鎖及び軽鎖を発現させるために、抗ヒトCD47抗体の重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターを得た。
本発明は、抗ヒトCD47の抗体CD47-18-5のヒト化配列z4の重鎖及び軽鎖の可変領域をそれぞれ含むX0GC発現ベクターを同時に構築した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.25に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.26に示される。軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:3に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.4に示される。重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.27に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.28に示される。重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.15に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.16に示される。それぞれ真核細胞において抗ヒトCD47抗体CD47-18-5のヒト化配列z4の重鎖及び軽鎖を発現させるために、抗ヒトCD47抗体の重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターを得た。
本発明は、抗ヒトCD47の抗体CD47-18-5のヒト化配列z7の重鎖及び軽鎖の可変領域をそれぞれ含むX0GC発現ベクターを同時に構築した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.29に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.30に示される。軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:3に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.4に示される。重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.31に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.32に示される。重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.15に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.16に示される。それぞれ真核細胞において抗ヒトCD47抗体CD47-18-5のヒト化配列z7の重鎖及び軽鎖を発現させるために、抗ヒトCD47抗体の重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターを得た。
本発明は、それぞれ抗ヒトCD47の抗体CD47-18-5のヒト化配列z11の重鎖及び軽鎖可変領域を含むX0GC発現ベクターを同時に構築した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.33に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.34に示される。軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:3に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.4に示される。重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.35に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.36に示される。重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.15に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO.16に示される。それぞれ真核細胞において抗ヒトCD47抗体CD47-18-5のヒト化配列z11の重鎖及び軽鎖を発現させるために、抗ヒトCD47抗体の重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターを得た。
実施例2 抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体分子の発現
抗ヒトPD-L1抗体の重鎖及び軽鎖を含む発現ベクターをExpiCHO細胞(ExpiCHOTM細胞、カタログ番号A29127、invitrogen)にそれぞれコトランスフェクションした。また、抗ヒトCD47抗体の重鎖及び軽鎖を含む様々な発現ベクターをExpiCHO細胞にもそれぞれコトランスフェクションした。
抗ヒトPD-L1抗体の重鎖及び軽鎖を含む発現ベクターをExpiCHO細胞(ExpiCHOTM細胞、カタログ番号A29127、invitrogen)にそれぞれコトランスフェクションした。また、抗ヒトCD47抗体の重鎖及び軽鎖を含む様々な発現ベクターをExpiCHO細胞にもそれぞれコトランスフェクションした。
トランスフェクションの前日に、細胞を3.5×106細胞/mLの接種密度で接種した。トランスフェクションの当日に、新鮮なExpiCHO発現培地(ExpiCHOTM Expression Medium、カタログ番号A29100-01、invitrogen)で細胞を6×106細胞/mLの希釈密度で希釈した。トランスフェクション体積に従ってプラスミドを取り出し、プラスミドの最終濃度を0.5μg/mLとし、OptiPROTMSFM培地(OptiPROTMSFM、カタログ番号12309-019、invitrogen)でプラスミドをトランスフェクション体積の4%になるように希釈し、転倒混和した。6.4倍のプラスミドの量のExpiFectamineTMトランスフェクション試薬(ExpiFectamineTMCHO Transfection Kit、カタログ番号A29129、invitrogen)を取り出し、OptiPROTMSFM培地でトランスフェクション試薬をトランスフェクション体積の4%になるように希釈し、転倒混和した。希釈後のトランスフェクション試薬を希釈されたプラスミドに加えて、穏やかに混合し、室温で1~5min静置し、細胞に徐々に滴下した。その後、細胞インキュベータ(CO2濃度は8%)に入れ、シェーカーで120rpm、37℃にて20時間インキュベートした。0.006倍のトランスフェクション体積のExpiCHOTMエンハンサー(ExpiFectamineTMCHO Transfection Kit、カタログ番号A29129、invitrogen)及び0.24倍のトランスフェクション体積のExpiCHOTMFeed(ExpiCHOTMFeed、カタログ番号A29101-02、invitrogen)を細胞に徐々に滴下した。120rpmのシェーカーに入れて32℃でインキュベートした。遠心により10日間トランスフェクションした細胞培養上清を収集した。
ELISAの方法により発現量を測定した。クロマトグラフィーカラムによる精製の前に、0.2μmのろ過膜によるろ過により沈殿を除去した。このステップを4℃で行った。
実施例3 抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体分子発現産物の精製
AKTA explorer 100型タンパク質精製システム(GE Healthcare)及びアフィニティークロマトグラフィーカラムMabSelect SuRe(16mmI.D.,22mL,GE Healthcare)により4℃で精製を行った。まず、クロマトグラフィーカラムを移動相A(20mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4)で平衡化し、ベースラインを安定化させた後、上記のように処理した細胞の上清をロードし、ロードした後、移動相Aを平衡化のために使用した。サンプルは、それぞれ抗PD-L1発現産物及び抗CD47発現産物であった。その後、5カラム容積の移動相B(1M塩化ナトリウムを含む移動相A)でカラムを洗浄してから、2カラム容積の移動相Aで洗浄し、その後、5カラム容積の移動相C(100mMのグリシン、pH3.3)で溶出させ、溶出ピーク、即ち目的タンパク質のピークを収集した。以上の溶出ステップにおける流速は、いずれも5mL/minであった。抗PD-L1発現産物の溶出ピークのクロマトグラムを図1に示し、抗CD47発現産物(抗体CD47-18-5のヒト化配列z11の重鎖及び軽鎖の配列からなる)の溶出ピークを図2に示す。他の抗CD47発現産物の溶出ピークはそれと類似している。示された溶出ピーク(図示した灰色領域)を収集し、且つ、1MのTrisアルカリ溶液を滴下することにより、pHを7.2に調整し、無菌化濾過した後、2~8℃で貯蔵した。
AKTA explorer 100型タンパク質精製システム(GE Healthcare)及びアフィニティークロマトグラフィーカラムMabSelect SuRe(16mmI.D.,22mL,GE Healthcare)により4℃で精製を行った。まず、クロマトグラフィーカラムを移動相A(20mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4)で平衡化し、ベースラインを安定化させた後、上記のように処理した細胞の上清をロードし、ロードした後、移動相Aを平衡化のために使用した。サンプルは、それぞれ抗PD-L1発現産物及び抗CD47発現産物であった。その後、5カラム容積の移動相B(1M塩化ナトリウムを含む移動相A)でカラムを洗浄してから、2カラム容積の移動相Aで洗浄し、その後、5カラム容積の移動相C(100mMのグリシン、pH3.3)で溶出させ、溶出ピーク、即ち目的タンパク質のピークを収集した。以上の溶出ステップにおける流速は、いずれも5mL/minであった。抗PD-L1発現産物の溶出ピークのクロマトグラムを図1に示し、抗CD47発現産物(抗体CD47-18-5のヒト化配列z11の重鎖及び軽鎖の配列からなる)の溶出ピークを図2に示す。他の抗CD47発現産物の溶出ピークはそれと類似している。示された溶出ピーク(図示した灰色領域)を収集し、且つ、1MのTrisアルカリ溶液を滴下することにより、pHを7.2に調整し、無菌化濾過した後、2~8℃で貯蔵した。
実施例4 抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体分子の製造及び精製
抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体分子の構造を図3に示す。
抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体分子の構造を図3に示す。
上記のMabSelect SuRe(16mmI.D.,22mL,GE Healthcare)による方法により精製された産物に対してインビトロ組換えを行うことにより、ヘテロダイマーを得た。まず、上述のようにして精製して収集したタンパク質溶液をDTTで還元する過程において、ジスルフィド結合が切断され、抗PD-L1及び抗CD47産物中に含まれるホモダイマー抗体分子のヒンジ領域中のジスルフィド結合も切断されて、1つの重鎖及び1つの軽鎖を含む半抗体分子を形成し、構造を図4に示す。還元サンプルを、移動相の緩衝液に1mMのDTT還元剤が含まれるSEC-HPLC(TOSOH、TSKgel superSW3000)で分析し、結果を図5のA及びBにそれぞれ示し、抗PD-L1及び抗CD47のホモダイマー分子の割合は、いずれも20%未満であり、半抗体分子の割合は、いずれも80%超であった。
その後、還元された抗PD-L1及び抗CD47半抗体分子を等モル比で混合し、4℃で24時間組換え反応を行い、組換えの過程において、抗PD-L1及び抗CD47半抗体分子の両方を含むヘテロダイマー二重特異性抗体を、抗PD-L1及び抗CD47半抗体分子からCH2-CH3間の非共有結合性相互作用を介して形成し、次いで、タンパク質溶液を限外ろ過濃縮管を通した限外ろ過により濃縮し(10kDaの公称カットオフ分子量)、溶液をリン酸塩溶液(PBS、pH=7.4)に置換して還元を停止させ、空気又は酸化剤により酸化反応を行い、ヘテロダイマー二重特異性抗体のジスルフィド結合を再形成させた。
上記の抗PD-L1及び抗CD47発現産物を還元酸化して得られた抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体分子を限外ろ過濃縮管を通した限外ろ過により濃縮し(10kDaの公称カットオフ分子量)、溶液を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)に置換した。AKTA explorer 100型タンパク質精製システム(GE Healthcare)及びイオンクロマトグラフィーカラムSource 15S(16mmI.D.、22mL、GE Healthcare)により精製を室温で行った。まず、クロマトグラフィーカラムを移動相A(10mMのリン酸ナトリウム、pH7.0)で平衡化し、ベースラインを安定化させた後、上述のように処理したタンパク質溶液を5mL/minの流速でロードし、ロードした後、移動相Aを平衡化のために使用した。その後、カラムを20カラム容積でA(10mMのリン酸ナトリウム、pH5.8)からB(10mMのリン酸ナトリウム、pH5.8)(0%B~100%B、170min、流速2mL/min)の勾配にて洗浄した。主な溶出ピークを収集し、収集したタンパク質溶液を限外ろ過濃縮管を通した限外ろ過により濃縮し(10kDaの公称カットオフ分子量)、溶液をリン酸塩溶液(PBS、pH=7.4)に置換し、ろ過して滅菌し、4℃で保存した。精製された抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体分子BH3012h(その中、抗CD47部分は、抗体CD47-18-5のヒト化配列z11の重鎖及び軽鎖の可変領域配列を含む)に対してSEC-HPLCによる純度分析を行い、結果を図6に示し、純度は、97.3%であった。CE分析を行ったところ、結果を図7に示し、純度は、95.3%であった。他の抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体分子、例えばBH3014(その中、抗CD47部分は、抗体CD47-18-5のヒト化配列z3の重鎖及び軽鎖の可変領域配列を含む)、BH3015(その中、抗CD47部分は、抗体CD47-18-5のヒト化配列z4の重鎖及び軽鎖の可変領域配列を含む)、BH3016(その中、抗CD47部分は、抗体CD47-18-5のヒト化配列z7の重鎖及び軽鎖の可変領域配列を含む)、抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー二重抗体18-5(その中、抗CD47部分は、マウス由来抗体CD47-18-5の重鎖及び軽鎖の可変領域配列を含む)及び抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー二重抗体18-10(その中、抗CD47部分は、マウス由来抗体CD47-18-10の重鎖及び軽鎖の可変領域配列を含む)の結果は、いずれもそれと類似している。
実施例5 抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体の標的結合活性
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体と単一の抗原との結合能力を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルで1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート(Costar、カタログ番号42592)に組換えヒトPD-L1(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10084-H08H)又はヒトCD47(株式会社アクロバイオシステムズ(北京)、カタログ番号CD7-H5227)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBSTで5回洗浄した。1%のBSAを含むPBSTで300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。1%のBSAを含むPBSTで段階希釈したヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBSTで1:10000にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG抗体(Chemicon、カタログ番号AP309P)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体と単一の抗原との結合能力を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルで1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート(Costar、カタログ番号42592)に組換えヒトPD-L1(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10084-H08H)又はヒトCD47(株式会社アクロバイオシステムズ(北京)、カタログ番号CD7-H5227)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBSTで5回洗浄した。1%のBSAを含むPBSTで300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。1%のBSAを含むPBSTで段階希釈したヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBSTで1:10000にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG抗体(Chemicon、カタログ番号AP309P)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果を図8のAに示し、抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体BH3012h、BH3014、BH3015、BH3016は、いずれもPD-L1に対して高い親和性を有し、活性が相当しており、PD-L1二価モノクローナル抗体の抗原結合活性よりやや弱い。図8のBに示すように、抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体BH3012h、BH3014、BH3015、BH3016は、CD47に対して異なる親和性を有し、BH3012hが最も強く、BH3016がそれに続き、BH3015がさらに続き、BH3014の結合活性が最も弱い。
実施例6 抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体のリガンド-受容体結合へのブロッキング活性
PD-L1とPD-1やCD80との結合へのブロッキング活性に対する検出の実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒトPD-L1-Fc(株式会社アクロバイオシステムズ(北京)、カタログ番号PD1-H5258)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBSTで5回洗浄した。1%のBSAを含むPBSTで300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。1%のBSAを含むPBSTで段階希釈したヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を50μL/ウェルで添加し、且つ、ビオチンで標識したPD-1-Fc(Beijing Hanmi Pharm社)を50μL加え、濃度を40nMとし(最終濃度は20nM)、又は、ビオチンで標識したCD80-Fc(株式会社アクロバイオシステムズ(北京)、カタログ番号B71-H82F2)を50μL加え、濃度を100nMとし(最終濃度は50nM)、25℃で90分間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBSTで1:1000にて希釈した、Streptavidin-HRP(BD Pharmingen、カタログ番号554066)を100μL/ウェルで加え、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
PD-L1とPD-1やCD80との結合へのブロッキング活性に対する検出の実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒトPD-L1-Fc(株式会社アクロバイオシステムズ(北京)、カタログ番号PD1-H5258)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBSTで5回洗浄した。1%のBSAを含むPBSTで300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。1%のBSAを含むPBSTで段階希釈したヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を50μL/ウェルで添加し、且つ、ビオチンで標識したPD-1-Fc(Beijing Hanmi Pharm社)を50μL加え、濃度を40nMとし(最終濃度は20nM)、又は、ビオチンで標識したCD80-Fc(株式会社アクロバイオシステムズ(北京)、カタログ番号B71-H82F2)を50μL加え、濃度を100nMとし(最終濃度は50nM)、25℃で90分間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBSTで1:1000にて希釈した、Streptavidin-HRP(BD Pharmingen、カタログ番号554066)を100μL/ウェルで加え、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
CD47とSIRPαとの結合へのブロッキング活性に対する検出の実施過程は、以下の通りである。pH=9.6の炭酸塩緩衝溶液を使用して、100μL/ウェルのコーティング量で1μg/mLのコーティング濃度にて、96ウェル高吸着型ELISAプレート上に組換えヒトCD47-Fc(株式会社アクロバイオシステムズ(北京)、CD7-H52A5)をコーティングした。コーティングを4℃で一晩行った。PBSTで5回洗浄した。1%のBSAを含むPBSTで300μL/ウェルにてブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。1%のBSAを含むPBSTで段階希釈したヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を50μL/ウェルで添加し、且つビオチンで標識したSIRPα(株式会社アクロバイオシステムズ(北京)、CDA-H82F2)を50μL/ウェルで加え、濃度が4nM(最終濃度は2nM)であり、25℃で90分間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。次いで、1%のBSAを含むPBSTで1:1000にて希釈した、Streptavidin-HRP(BD Pharmingen、カタログ番号554066)を100μL/ウェルで添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。発色基質TMBを100μL/ウェルで添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を100μL/ウェルで添加することにより、発色を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果を図9のAに示し、抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体BH3012h、BH3014、BH3015、BH3016は、いずれもPD-L1とPD-1との結合をブロッキングすることができ、活性が相当しており、PD-L1二価モノクローナル抗体よりやや弱い。図9のBに示すように、抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体BH3012h、BH3014、BH3015、BH3016は、いずれもPD-L1とCD80との結合をブロッキングすることができ、活性が相当している。図9のCに示すように、抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体BH3012h、BH3014、BH3015、BH3016は、CD47とSIRPαとの結合に対して異なるブロッキング活性を有し、BH3012hが最も強く、BH3016がそれに続き、BH3015がさらに続き、BH3014の活性が最も弱い。
実施例7 抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体と腫瘍細胞/赤血球との結合
HCC827腫瘍細胞にPD-L1及びCD47が発現し、赤血球(RBC)にCD47のみが発現している。HCC827及びRBCを混合し、フローサイトメーター(FCM)により、ヘテロダイマーの混合細胞における2種類の細胞への結合に選択性が存在するか否かを検出した。
HCC827腫瘍細胞にPD-L1及びCD47が発現し、赤血球(RBC)にCD47のみが発現している。HCC827及びRBCを混合し、フローサイトメーター(FCM)により、ヘテロダイマーの混合細胞における2種類の細胞への結合に選択性が存在するか否かを検出した。
この方法の具体的な実施過程は、以下の通りである。HCC827細胞(ATCCから購入)、RBC細胞(健常者から採取した)を収集した。2%のFBS(Hyclone、カタログ番号SH30084.03)を含む冷たいPBS(GIBCO、カタログ番号14190-235)で一回洗浄した。チューブ毎に1×106個のHCC827細胞と、チューブ毎に10×106個のRBC細胞とを混合し、2%のFBSを含む冷たいDPBS(GIBCO、カタログ番号14190-136)200μLに再懸濁させ、且つ、段階希釈されたヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を加えた。フローサイトメトリー用チューブを氷上で30分間インキュベートした。2%のFBSを含むPBSで2回洗浄した。2%のFBS及び1:1000にて希釈した、FITCで標識した抗ヒトIgG抗体(北京中杉金橋、カタログ番号ZF0306)を含む冷たいPBS200μLに再懸濁させた。氷上で、遮光で30分間インキュベートした。2%のFBSを含むPBSで2回洗浄した。500μLの冷たいPBSに再懸濁させ、この細胞懸濁液をフローサイトメトリー(BD、FACS Calibur)で検出分析し、混合細胞中の2種類の細胞のそれぞれの蛍光強度を読み取った。
結果を図10に示し、CD47モノクローナル抗体(抗体CD47-18-5のヒト化配列z11の重鎖及び軽鎖の可変領域配列及びヒトIgG4定常領域配列を含む)と混合したHCC827及びRBCとの結合にほとんど違いがない(図A)。一方、抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマーは、PD-L1及びCD47が共発現したHCC827細胞と結合したが、CD47のみが発現したRBCとの結合が弱く乃至は結合しない傾向があり、結合の選択性を示した(図B及び図C)。
実施例8 抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体のT細胞への調節活性
混合リンパ球反応(MLR)により抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体のT細胞免疫反応への調節活性を測定した。
混合リンパ球反応(MLR)により抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体のT細胞免疫反応への調節活性を測定した。
ヒト樹状細胞(DC)の取得:ヒトPBMC細胞(Lonza、カタログ番号CC-2702)を蘇生して収集した。ヒトPBMC細胞を5×106/mLの細胞密度で無血清RPMI 1640培地(GIBCO、カタログ番号22400-089)に再懸濁させて、細胞培養瓶に接種し、37℃で、二酸化炭素インキュベータで90分間インキュベートした。培養上清及び懸濁細胞を捨て、接着細胞を完全培地(10%FBSを含むRPMI 1640)でインキュベートし、且つ100ng/mLのGM-CSF(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号10015-HNAH)及び100ng/mLのIL-4(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号11846-HNAE)を加えた。3日間インキュベートし、培養液を交換し、さらに3日間インキュベートした。その後、培地を100ng/mLのGM-CSF、100ng/mLのIL-4及び20ng/mLのTNF-αを含む完全培地(10%FBSを含むRPMI 1640)に交換し、1日間インキュベートして、DC細胞を得た。
ヒトT細胞の取得:ヒトPBMC細胞を蘇生して収集し、このPBMCと、DC細胞を誘導するPBMCが異なる個体に由来することを保証した。Pan T細胞単離キット(Miltenyi Biotech、カタログ番号5150414820)の取扱説明書を参照してヒトT細胞を単離した。簡単に言えば、まず、PBSでPBMCを一回洗浄してから、PBMCを107細胞当たり40μLの単離用緩衝液(PBSは2mMのEDTA及び0.5%のBSAを含み、pH=7.2)で再懸濁させ(以下の使用量は、いずれも107細胞で計算される)、且つ、10μLのPan T cell Biotin Antibody Cocktail(Pan T細胞ビオチン標識抗体の混合物)を加え、4℃で5分間インキュベートした。さらに30μLの単離用緩衝液及び20μLのPan T cell MicroBead Cocktail(Pan T細胞マイクロビーズ混合物)を加え、4℃で10分間インキュベートした。MACS単離カラムを通過させて、T細胞を得た。
収集したヒトDC細胞及びヒトT細胞を完全培地(10%FBSを含むRPMI 1640)に再懸濁させ、96ウェルプレートに接種した。接種されたDC細胞及びT細胞をそれぞれ1×104/ウェル、1×105/ウェルとし、混合してインキュベートした。さらに、完全培地で段階希釈されたヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を加えた。培養プレートを37℃で二酸化炭素インキュベータに置いて5日間インキュベートした。インキュベート終了後、ウェル内の上清を取り出し、キットのマニュアルに従ってサイトカインIFN-γ(RayBiotech、カタログ番号ELH-IFNg)を検出した。
図11に示すように、ヒトT細胞は、同種異体DC細胞からの刺激によって、活性化されてIFN-γを分泌した。PD-L1抗体を加えることにより、T細胞への活性化を増強させ、サイトカインの分泌を促進させた。抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体も強いT細胞への調節活性を示し、サイトカインIFN-γの分泌を著しく促進させた。
実施例9 抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体を介したマクロファージによる腫瘍細胞の貪食活性
成熟したヒトマクロファージの製造:ヒトPBMC細胞(Lonza、カタログ番号CC-2702)を蘇生して収集した。ヒトPBMC細胞を5×106/mLの細胞密度で無血清RPMI 1640培地に再懸濁させて、細胞培養瓶に接種し、37℃で、二酸化炭素インキュベータで90分間インキュベートした。培養上清及び懸濁細胞を捨て、その後、接着細胞を完全培地(10%FBSを含むRPMI 1640)でインキュベートし、且つ25ng/mLのM-CSF(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号11792-HNAN)を加え、7日間インキュベートした。その後、マクロファージを収集し、25ng/mLのM-CSF及び50ng/mLのIFN-γ(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号11725-HNAS)を含む完全培地(10%FBSを含むRPMI 1640)に再懸濁させた。この細胞懸濁液を48ウェル細胞培養プレートに50000個の細胞/ウェルで接種し、1日間インキュベートして、マクロファージを成熟させて準備した。
成熟したヒトマクロファージの製造:ヒトPBMC細胞(Lonza、カタログ番号CC-2702)を蘇生して収集した。ヒトPBMC細胞を5×106/mLの細胞密度で無血清RPMI 1640培地に再懸濁させて、細胞培養瓶に接種し、37℃で、二酸化炭素インキュベータで90分間インキュベートした。培養上清及び懸濁細胞を捨て、その後、接着細胞を完全培地(10%FBSを含むRPMI 1640)でインキュベートし、且つ25ng/mLのM-CSF(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号11792-HNAN)を加え、7日間インキュベートした。その後、マクロファージを収集し、25ng/mLのM-CSF及び50ng/mLのIFN-γ(北京シノバイオロジカル社、カタログ番号11725-HNAS)を含む完全培地(10%FBSを含むRPMI 1640)に再懸濁させた。この細胞懸濁液を48ウェル細胞培養プレートに50000個の細胞/ウェルで接種し、1日間インキュベートして、マクロファージを成熟させて準備した。
CFSEキット(Life technology、カタログ番号C34554)の取扱説明書を参照してRaji腫瘍細胞を染色した。簡単に言えば、作用濃度が5μMになるようにPBSでCFSEを希釈し、且つ37℃で予備加熱を行い、1000rpmで5分間遠心し、Raji細胞を収集し、予備加熱を行ったCFSE作用溶液でRajiを再懸濁させ、37℃で15分間インキュベートした。完全培地で一回洗浄し、完全培地に再懸濁させ、30分間インキュベートし、さらに完全培地で2回洗浄し、完全培地に再懸濁させて準備した。
48ウェルプレートを完全培地で3回洗浄した。CFSEで染色した後のRaji細胞及び被験ヘテロダイマーサンプル及び対照を予め15分間インキュベートし、その後、48ウェル培養プレートに加え、37℃で、二酸化炭素インキュベータで2時間インキュベートした。インキュベート終了後、48ウェルプレートを完全培地で3回洗浄し、完全培地にて希釈した10μg/mLの小麦胚芽凝集素(wheat germ agglutinin)、alexa fluor 555(Life technologies、カタログ番号W32464)を加え、遮光で15分間インキュベートした。さらに48ウェルプレートを完全培地で3回洗浄し、4%のパラホルムアルデヒドを加えて15分間固定した。さらに48ウェルプレートを完全培地で3回洗浄し、完全培地を加えた。蛍光顕微鏡により撮影し、細胞を計数した。貪食指数(%)の計算方法は、以下の通りである:貪食された緑色で標識されたRaji細胞の数/存在する赤色で標識されたマクロファージの数×100。
図12に示すように、CD47モノクローナル抗体(抗体CD47-18-5のヒト化配列z11の重鎖及び軽鎖の可変領域配列及びヒトIgG4定常領域配列を含む)は、マクロファージによるRaji腫瘍細胞の貪食を媒介することができ、抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体BH3012h、BH3015、BH3016は、マクロファージによるRaji腫瘍細胞の貪食を媒介することもできる。
実施例10 抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体のヒト化マウスでの抗A375腫瘍薬力学的研究
6~8週齢の雌の免疫不全NCGマウス(南京生物医薬研究院)を実験材料として使用した。マウスを環境に1週間適応させた後、まず、ヒトPBMCを投与してマウス免疫系の一部をヒト化し、マウス1匹につき、静脈内投与により5×106個の細胞を接種した。マウス1匹につき、5×106個のA375ヒト黒色腫細胞を右側の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約100mm3まで達した場合、腫瘍体積によって担癌マウスを6匹ずつ群分けた。それぞれ溶媒(PBS)、35nmol/kgのPD-L1モノクローナル抗体、35nmol/kgのCD47モノクローナル抗体及び70nmol/kgの抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体(モノクローナル抗体が二価抗体であることを考慮したところ、二重特異性抗体の抗PD-L1、抗CD47がいずれも一価である)を週2回、2週連続投与し、投与方式は、腹腔内投与であった。投与日から腫瘍体積を週に3回測量し、その長径a、短径bを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積(mm3)=(a×b2)/2であった。腫瘍体積の測量の持続時間は3週間であり、即ち、投与を中止した後、さらに1週間観察した。
6~8週齢の雌の免疫不全NCGマウス(南京生物医薬研究院)を実験材料として使用した。マウスを環境に1週間適応させた後、まず、ヒトPBMCを投与してマウス免疫系の一部をヒト化し、マウス1匹につき、静脈内投与により5×106個の細胞を接種した。マウス1匹につき、5×106個のA375ヒト黒色腫細胞を右側の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約100mm3まで達した場合、腫瘍体積によって担癌マウスを6匹ずつ群分けた。それぞれ溶媒(PBS)、35nmol/kgのPD-L1モノクローナル抗体、35nmol/kgのCD47モノクローナル抗体及び70nmol/kgの抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体(モノクローナル抗体が二価抗体であることを考慮したところ、二重特異性抗体の抗PD-L1、抗CD47がいずれも一価である)を週2回、2週連続投与し、投与方式は、腹腔内投与であった。投与日から腫瘍体積を週に3回測量し、その長径a、短径bを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積(mm3)=(a×b2)/2であった。腫瘍体積の測量の持続時間は3週間であり、即ち、投与を中止した後、さらに1週間観察した。
結果を図13に示す。異種移植腫瘍モデルにおいて、抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体は、PD-L1モノクローナル抗体及びCD47モノクローナル抗体よりも強い抗腫瘍効果を有する。
実施例11 抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体の遺伝子ノックインマウスでの抗MC38腫瘍薬力学的研究
6~8週齢の雌B-hPD-L1/hSIRPα/hCD47三重ヒト化マウス(江蘇バイオサイトジェン社)を実験材料として使用した。マウスを環境に1週間適応させた後、マウス1匹につき、5×105個のB-hPD-L1/hCD47 MC38マウス結腸腫瘍細胞(マウス由来のPD-L1及びCD47がノックアウトされ、ヒト由来のPD-L1及びCD47が過剰発現し、MC38細胞がShanghai Shunran biotech Co.,Ltdに由来する)を右側の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約100mm3まで達した場合、腫瘍体積によって担癌マウスを6匹ずつ群分けた。それぞれ溶媒(PBS)、1mg/kgのPD-L1モノクローナル抗体、1mg/kgのCD47モノクローナル抗体及び2mg/kgの抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体(モノクローナル抗体が二価抗体であることを考慮したところ、二重特異性抗体の抗PD-L1、抗CD47がいずれも一価である)を週2回、3週連続投与し、投与方式は、腹腔内投与であった。投与日から腫瘍体積を週に2回測量し、その長径a、短径bを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積(mm3)=(a×b2)/2であった。腫瘍体積の測量の持続時間は3週間であり、即ち、投与を中止した後、さらに1週間観察した。
6~8週齢の雌B-hPD-L1/hSIRPα/hCD47三重ヒト化マウス(江蘇バイオサイトジェン社)を実験材料として使用した。マウスを環境に1週間適応させた後、マウス1匹につき、5×105個のB-hPD-L1/hCD47 MC38マウス結腸腫瘍細胞(マウス由来のPD-L1及びCD47がノックアウトされ、ヒト由来のPD-L1及びCD47が過剰発現し、MC38細胞がShanghai Shunran biotech Co.,Ltdに由来する)を右側の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約100mm3まで達した場合、腫瘍体積によって担癌マウスを6匹ずつ群分けた。それぞれ溶媒(PBS)、1mg/kgのPD-L1モノクローナル抗体、1mg/kgのCD47モノクローナル抗体及び2mg/kgの抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体(モノクローナル抗体が二価抗体であることを考慮したところ、二重特異性抗体の抗PD-L1、抗CD47がいずれも一価である)を週2回、3週連続投与し、投与方式は、腹腔内投与であった。投与日から腫瘍体積を週に2回測量し、その長径a、短径bを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積(mm3)=(a×b2)/2であった。腫瘍体積の測量の持続時間は3週間であり、即ち、投与を中止した後、さらに1週間観察した。
結果を図14に示す。同種腫瘍モデルにおいて、抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体は、PD-L1モノクローナル抗体及びCD47モノクローナル抗体よりも強い抗腫瘍効果を有する。
実施例12 抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体の野生マウスでの抗CT26腫瘍薬力学的研究
6~8週齢の雌の野生型Balb/cマウス(北京維通利華から購入)を実験材料として使用した。マウスを環境に1週間適応させた後、マウス1匹につき、5×105個のCT26/hPD-L1/hCD47マウス結腸腫瘍細胞(江蘇集萃から購入)を右側の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約100mm3まで達した場合、腫瘍体積によって担癌マウスを8匹ずつ群分けた。それぞれ溶媒(DPBS、GIBCO、カタログ番号14190-136)、17.5nmol/kgの抗PD-L1モノクローナル抗体(抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体における抗PD-L1部分に対応するモノクローナル抗体)、17.5nmol/kgの抗CD47モノクローナル抗体(抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体における抗CD47部分に対応するモノクローナル抗体)及び35nmol/kgの抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体(モノクローナル抗体が二価抗体であることを考慮したところ、二重特異性抗体の抗PD-L1、抗CD47がいずれも一価である)を週2回、3週連続投与し、投与方式は、腹腔内投与であった。投与日から投与終了まで、腫瘍体積を週に2回測量し、投与終了後、腫瘍体積を1回測量し、毎回にその長径a、短径bを測量し、腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積(mm3)=(a×b2)/2であった。腫瘍体積の測量の持続時間は4週間であり、即ち、投与を中止した後、さらに1週間観察した。
6~8週齢の雌の野生型Balb/cマウス(北京維通利華から購入)を実験材料として使用した。マウスを環境に1週間適応させた後、マウス1匹につき、5×105個のCT26/hPD-L1/hCD47マウス結腸腫瘍細胞(江蘇集萃から購入)を右側の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約100mm3まで達した場合、腫瘍体積によって担癌マウスを8匹ずつ群分けた。それぞれ溶媒(DPBS、GIBCO、カタログ番号14190-136)、17.5nmol/kgの抗PD-L1モノクローナル抗体(抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体における抗PD-L1部分に対応するモノクローナル抗体)、17.5nmol/kgの抗CD47モノクローナル抗体(抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体における抗CD47部分に対応するモノクローナル抗体)及び35nmol/kgの抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体(モノクローナル抗体が二価抗体であることを考慮したところ、二重特異性抗体の抗PD-L1、抗CD47がいずれも一価である)を週2回、3週連続投与し、投与方式は、腹腔内投与であった。投与日から投与終了まで、腫瘍体積を週に2回測量し、投与終了後、腫瘍体積を1回測量し、毎回にその長径a、短径bを測量し、腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積(mm3)=(a×b2)/2であった。腫瘍体積の測量の持続時間は4週間であり、即ち、投与を中止した後、さらに1週間観察した。
結果を図15に示し、同種腫瘍モデルにおいて、抗PD-L1/抗CD47ヘテロダイマー抗体BH3012hは、対応する抗PD-L1二価モノクローナル抗体及び抗CD47二価モノクローナル抗体よりも強い抗腫瘍効果を有する。
Claims (28)
- PD-L1と特異的に結合する第1の抗原結合機能領域及びCD47と特異的に結合する第2の抗原結合機能領域を含む二重特異性抗体であって、
前記PD-L1と特異的に結合する第1の抗原結合機能領域は、
(A)重鎖可変領域と、
(B)軽鎖可変領域と、を含み、
前記重鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.37に示すアミノ酸配列を含むHCDR1と、
(b)SEQ ID NO.38に示すアミノ酸配列を含むHCDR2と、
(c)SEQ ID NO.39に示すアミノ酸配列を含むHCDR3とを含み、
前記軽鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.40に示すアミノ酸配列を含むLCDR1と、
(b)SEQ ID NO.41に示すアミノ酸配列を含むLCDR2と、
(c)SEQ ID NO.42に示すアミノ酸配列を含むLCDR3とを含む、
二重特異性抗体。 - 前記CD47と特異的に結合する第2の抗原結合機能領域は、
(A)重鎖可変領域と、
(B)軽鎖可変領域と、を含み、
前記重鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.43に示すアミノ酸配列を含むHCDR1と、
(b)SEQ ID NO.44に示すアミノ酸配列を含むHCDR2と、
(c)SEQ ID NO.45に示すアミノ酸配列を含むHCDR3とを含み、
前記軽鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.46に示すアミノ酸配列を含むLCDR1と、
(b)SEQ ID NO.47に示すアミノ酸配列を含むLCDR2と、
(c)SEQ ID NO.48に示すアミノ酸配列を含むLCDR3とを含む、
請求項1に記載の二重特異性抗体。 - 前記PD-L1と特異的に結合する第1の抗原結合機能領域は、
(A)重鎖可変領域と、
(B)軽鎖可変領域と、を含み、
前記重鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.37に示すアミノ酸配列を含むHCDR1と、
(b)SEQ ID NO.38に示すアミノ酸配列を含むHCDR2と、
(c)SEQ ID NO.39に示すアミノ酸配列を含むHCDR3とを含み、
前記軽鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.40に示すアミノ酸配列を含むLCDR1と、
(b)SEQ ID NO.41に示すアミノ酸配列を含むLCDR2と、
(c)SEQ ID NO.42に示すアミノ酸配列を含むLCDR3とを含み、
前記CD47と特異的に結合する第2の抗原結合機能領域は、
(A)重鎖可変領域と、
(B)軽鎖可変領域と、を含み、
前記重鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.43に示すアミノ酸配列を含むHCDR1と、
(b)SEQ ID NO.44に示すアミノ酸配列を含むHCDR2と、
(c)SEQ ID NO.45に示すアミノ酸配列を含むHCDR3とを含み、
前記軽鎖可変領域は、
(a)SEQ ID NO.46に示すアミノ酸配列を含むLCDR1と、
(b)SEQ ID NO.47に示すアミノ酸配列を含むLCDR2と、
(c)SEQ ID NO.48に示すアミノ酸配列を含むLCDR3とを含む、
請求項1又は2に記載の二重特異性抗体。 - 前記PD-L1と特異的に結合する第1の抗原結合機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO.6に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.2に示すアミノ酸配列を含む、請求項1から請求項3のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記CD47と特異的に結合する第2の抗原結合機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO.14、20、24、28、32又は36から選ばれるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.12、18、22、26、30又は34に示すアミノ酸配列を含む、請求項1から請求項4のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記PD-L1と特異的に結合する第1の抗原結合機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO.6に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO.2に示すアミノ酸配列を含み、
且つ、
前記CD47と特異的に結合する第2の抗原結合機能領域は、以下の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域から選ばれるものを含む、
請求項1から請求項5のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
a)SEQ ID NO.14に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.12に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
b)SEQ ID NO.20に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.18に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
c)SEQ ID NO.24に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.22に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
d)SEQ ID NO.28に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.26に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
e)SEQ ID NO.32に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.30に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
f)SEQ ID NO.36に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、SEQ ID NO.34に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域 - 第1の抗原結合機能領域及び第2の抗原結合機能領域は、Fabフラグメント、scFvフラグメント及び可変ドメインフラグメントFvから選ばれる、請求項1から請求項6のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 第1の抗原結合機能領域及び第2の抗原結合機能領域は、いずれもFabフラグメントである、請求項1から請求項7のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- Fabフラグメントは、異なる第1の重鎖可変領域及び第2の重鎖可変領域と、異なる第1の軽鎖可変領域及び第2の軽鎖可変領域と、を含む、請求項8に記載の二重特異性抗体。
- 第1の抗原結合機能領域及び第2の抗原結合機能領域の一方は、Fabフラグメントであり、他方は、scFvである、請求項1から請求項7のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 第1のFc鎖及び第2のFc鎖を含む二重特異性抗体であって、
前記第1のFc鎖及び第2のFc鎖は、いずれもアミノ酸の置換を含む免疫グロブリンGのFcフラグメントであり、且つ、前記第1のFc鎖と第2のFc鎖は、共に、Fc受容体と結合できるヘテロダイマーを構成し、
前記第1のFc鎖と第2のFc鎖は、共有結合又はリンカーを介して前記第1の抗原結合機能領域と第2の抗原結合機能領域にそれぞれ連結されており、
且つ、前記第1のFc鎖及び第2のFc鎖のいずれか一方は、位置366及び位置399でのT366L及びD399Rのアミノ酸置換を含み、他方は、位置351、位置407及び位置409でのL351E、Y407L及びK409Vのアミノ酸置換を含み、アミノ酸の位置は、Kabat EUインデックスナンバリングシステムに従って番号付けされる、
請求項1から請求項7のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。 - 第1のFc鎖及び共有結合を介してそれに連結された第1の抗原結合機能領域並びに第2のFc鎖及び共有結合を介してそれに連結された第2の抗原結合機能領域は、還元剤が存在する溶液中において、且つ、前記溶液中に前記第1のFc鎖及び共有結合を介してそれに連結された第1の抗原結合機能領域と第2のFc鎖及び共有結合を介してそれに連結された第2の抗原結合機能領域以外のポリペプチドが含まれていない場合、形成されたホモダイマーのすべてのポリペプチド鎖に基づく重量割合が、50%未満である、請求項11に記載の二重特異性抗体。
- PD-L1と特異的に結合する第1の重鎖及び第1の軽鎖のペアを含む二重特異性抗体であって、
前記第1の重鎖は、SEQ ID NO.6に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO.8又は10に示すアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、を有し、
前記第1の軽鎖は、SEQ ID NO.2に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、SEQ ID NO.4に示すアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域と、を有する、請求項1から請求項12のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。 - CD47と特異的に結合する第2の重鎖及び第2の軽鎖のペアを含む二重特異性抗体であって、
前記第2の重鎖は、SEQ ID NO.14、20、24、28、32又は36に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO.16に示すアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、を有し、
前記第2の軽鎖は、SEQ ID NO.12、18、22、26、30又は34に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、SEQ ID NO.4に示すアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域と、を有する、請求項1から請求項13のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。 - 請求項1から請求項14のいずれか1項に記載の二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項15に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
- 請求項15に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項16に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
- ヒト胚性腎臓細胞HEK293又はHEK293細胞に基づく改変により得られるHEK293T、HEK293E、HEK293F、ハムスター卵巣細胞CHO又はCHO細胞に基づく改変により得られるCHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44、ExpiCHO、大腸菌又は大腸菌に基づく改変により得られる大腸菌BL21、BL21(DE3)、Rosetta、Origami、酵母菌又は酵母に基づく改変により得られるピキア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ、昆虫細胞又は昆虫細胞に基づく改変により得られる細胞High5、SF9、植物細胞、哺乳動物の乳腺細胞、体細胞から選ばれる、請求項17に記載の宿主細胞。
- 請求項1から請求項14のいずれか1項に記載の二重特異性抗体又は請求項15に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項16に記載の組換え発現ベクター又は請求項17又は18に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
- 1)宿主細胞において請求項15に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項16に記載の組換え発現ベクターをそれぞれ発現させるステップと、
2)宿主細胞においてそれぞれ発現されたタンパク質を還元するステップと、
3)還元されたタンパク質を混合した後、混合物を酸化するステップと、を含む、
請求項1から請求項14のいずれか1項に記載の二重特異性抗体を生産する方法。 - 還元ステップは、1)2-メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン又はその他の化学誘導体から選ばれる還元剤の存在下で還元反応を行うステップと、2)還元剤を除去するステップと、を含む、請求項19又は20に記載の方法。
- 酸化ステップは、空気中での酸化であり、L-デヒドロアスコルビン酸又はその化学誘導体から選ばれる酸化剤の存在下で酸化反応を行うステップをさらに含む、請求項19から請求項21のいずれか1項に記載の方法。
- 単離及び精製のステップをさらに含む、請求項19から請求項22のいずれか1項に記載の方法。
- 被験者の疾患を予防及び/又は治療するための薬剤の製造における、請求項1から請求項14のいずれか1項に記載の二重特異性抗体、及び/又は請求項15に記載の単離されたポリヌクレオチド、及び/又は請求項16に記載の組換え発現ベクター、及び/又は請求項17又は18に記載の宿主細胞、及び/又は請求項19に記載の組成物の使用。
- 被験者の疾患を予防及び/又は治療するための薬剤として使用する、請求項1から請求項14のいずれか1項に記載の二重特異性抗体、及び/又は請求項15に記載の単離されたポリヌクレオチド、及び/又は請求項16に記載の組換え発現ベクター、及び/又は請求項17又は18に記載の宿主細胞、及び/又は請求項19に記載の組成物。
- 必要とする被験者に、請求項1から請求項14のいずれか1項に記載の二重特異性抗体、及び/又は請求項15に記載の単離されたポリヌクレオチド、及び/又は請求項16に記載の組換え発現ベクター、及び/又は請求項17又は18に記載の宿主細胞、及び/又は請求項19に記載の組成物を投与するステップを含む、疾患を予防及び/又は治療する方法。
- 被験者は、哺乳動物であり、好ましくは、ヒトである、
請求項24に記載の使用、請求項25に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、宿主細胞又は組成物、又は請求項26に記載の方法。 - 前記疾患は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫、小細胞肺癌、骨癌から選ばれる、請求項24に記載の使用、請求項25に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、宿主細胞又は組成物、又は請求項26に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110025240.7 | 2021-01-08 | ||
CN202110025240 | 2021-01-08 | ||
PCT/CN2022/070625 WO2022148411A1 (zh) | 2021-01-08 | 2022-01-07 | 抗pd-l1/抗cd47天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2024502365A true JP2024502365A (ja) | 2024-01-18 |
Family
ID=82357918
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023541810A Pending JP2024502365A (ja) | 2021-01-08 | 2022-01-07 | 抗pd-l1/抗cd47天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体及びその製造方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20240052037A1 (ja) |
EP (1) | EP4276115A1 (ja) |
JP (1) | JP2024502365A (ja) |
KR (1) | KR20230129482A (ja) |
CN (1) | CN116670289A (ja) |
WO (1) | WO2022148411A1 (ja) |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100880509B1 (ko) | 2006-10-16 | 2009-01-28 | 한미약품 주식회사 | 재조합 단백질의 대량 생산을 위한 신규한 벡터, 발현세포주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법 |
CN107459578B (zh) * | 2016-05-31 | 2021-11-26 | 泰州迈博太科药业有限公司 | 一种靶向cd47与pd-l1的双功能融合蛋白 |
WO2018205936A1 (zh) * | 2017-05-08 | 2018-11-15 | 上海津曼特生物科技有限公司 | 双特异性重组蛋白及其应用 |
US20200354458A1 (en) * | 2017-11-20 | 2020-11-12 | Taizhou Mabtech Pharmaceutical Co., Ltd. | Bifunctional Fusion Protein Targeting CD47 and PD-L1 |
SG11202005216XA (en) * | 2017-12-04 | 2020-07-29 | Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd | Anti-pd-l1/anti-cd47 bispecific antibody with structure like natural antibody and in form of heterodimer and preparation thereof |
WO2019109357A1 (zh) * | 2017-12-08 | 2019-06-13 | 杭州翰思生物医药有限公司 | 抗pd-1/cd47的双特异性抗体及其应用 |
WO2019179434A1 (en) * | 2018-03-20 | 2019-09-26 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. | Novel bispecific pd-1/cd47 antibody molecules |
WO2020233539A1 (en) * | 2019-05-17 | 2020-11-26 | Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. | Anti-cd47/anti-pd-l1 multiple antigen binding proteins and methods of use thereof |
-
2022
- 2022-01-07 EP EP22736573.1A patent/EP4276115A1/en active Pending
- 2022-01-07 US US18/260,682 patent/US20240052037A1/en active Pending
- 2022-01-07 WO PCT/CN2022/070625 patent/WO2022148411A1/zh active Application Filing
- 2022-01-07 KR KR1020237026756A patent/KR20230129482A/ko unknown
- 2022-01-07 JP JP2023541810A patent/JP2024502365A/ja active Pending
- 2022-01-07 CN CN202280009349.4A patent/CN116670289A/zh active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2022148411A1 (zh) | 2022-07-14 |
CN116670289A (zh) | 2023-08-29 |
EP4276115A1 (en) | 2023-11-15 |
US20240052037A1 (en) | 2024-02-15 |
KR20230129482A (ko) | 2023-09-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7231641B2 (ja) | 天然抗体様構造を有し、ヘテロ二量体形態の抗pd-l1/抗cd47二重特異性抗体、ならびにその製造方法 | |
US11591409B2 (en) | Anti-PD-L1/anti-PD-1 natural antibody structure-like heterodimeric bispecific antibody and preparation thereof | |
WO2019154349A1 (zh) | 抗pd-1/抗vegf天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 | |
CN109963876B (zh) | 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 | |
KR20220071263A (ko) | Cd3을 표적으로 하는 항체, 이중 특이성 항체 및 이의 용도 | |
JP7359784B2 (ja) | 抗pd-1/抗her2天然抗体構造ヘテロダイマー系の二重特異性抗体及びその製造方法 | |
JP2024502365A (ja) | 抗pd-l1/抗cd47天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体及びその製造方法 | |
JP2023550673A (ja) | ヘルパーT細胞TGF-βシグナルを特異的に中和する二重特異性抗体、その薬物組成物およびその使用 | |
WO2024094159A1 (zh) | 靶向人源ror1的单域抗体 | |
WO2023273913A1 (zh) | 抗b7-h3单克隆抗体及其用途 | |
TW202313699A (zh) | 新型抗sirpa抗體 | |
JP2023544140A (ja) | 新規の抗クローディン18抗体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230710 |