CN1913913A - Cab分子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及CAB分子、针对CEA的ADEPT构建物，以及它们在诊断和治疗中的用途。

Description

CAB分子

发明领域

[0001]本发明涉及CAB分子，针对CEA的ADEPT构建物，以及它们在诊断和治疗中的用途。

发明背景

[0002]传统的治疗性分子在患者的身体各处自由地循环，直到它们被肝脏或者其它清除机制从循环中去除。这些非靶向的分子，在广泛的细胞和组织中，无差别地产生其药理作用。这可能对患者引起严重的副作用。当该分子是用来杀死癌细胞的高毒性的化学治疗剂时，这个问题尤其突出，此时治疗窗(therapeutic window)可能很小，治疗窗为有效剂量(efficacious dose)和有害剂量(injurious dose)或者甚至致死剂量之间的差值。因此，近些年来，研究者已经试图开发特异性地影响患者的细胞、组织或器官的特定子集的化合物。通过优先结合于待治疗组织呈现的特定靶分子，多数此类化合物靶向特定的组织。通过优先地影响靶细胞、组织或器官，有效剂量和有害剂量之间的差额可以被增加，这同样也增加了治疗方案成功的机会并减少了副作用的出现。

[0003]利用优先结合的方法的一个形式是抗体导向酶-前体药物疗法(antibody-directed enzyme prodrug therapy，ADEPT)。参见例如，Xu等，2001，ClinCancer Res.7：3314-24.；Denny，2001，Eur J Med Chem.36：577-95。在ADEPT中，将抗体或抗体片断(antibody fragment)与能够将前体药物转化成活性的细胞毒素剂(cytotoxic agent)的酶连接。对患者运用ADEPT偶联物(ADEPT conjugate)，偶联物集中到靶组织中。随后，前体药物被给与患者。所述前体药物在患者整个体内循环，但由于它处在它的非活性的形式下，该前体药物引起很小的副作用或不引起副作用。所述前体药物由局部化的ADEPT偶联物酶转化成它的活性药物形式。因为ADEPT偶联物被局限于靶组织，所述前体药物只有在靶组织的附近才能被活化。因此，遍布身体各处的活性药物浓度相对较低，但在靶组织的附近产生出浓度相对较高的活性药物，这允许药物在希望的部位发挥它的疗效，增大了毒素的治疗窗(therapeutic window)。

[0004]癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，“CEA”)由Gold和Freedman在J.Exp.Med.，121，439-462，(1965)中首先描述。多数结肠直肠癌和许多其它肿瘤表达CEA。CEA在肿瘤组织中高表达，在正常的器官中，特别是消化道中则以较低浓度被发现。

发明简述

[0005]本发明涉及CAB分子，针对CEA的ADEPT构建物，以及它们在诊断和治疗中的用途。

[0006]本发明的第一个方面涉及包括修饰的氨基酸序列的CAB分子。在一个实施方案中，CAB分子具有SEQ ID NO：1中提出的未修饰序列。在一个实施方案中，CAB分子具有从SEQ ID NO：1中提出的氨基酸序列修饰得到的氨基酸序列，并且修饰发生在至少一个从下列位置中选出的位置：100，102，104，105，107，163，165，166，184和226，其中位置编号根据图1所示的SEQ ID NO：1。在优选的实施方案中，CAB分子包括发生在100位、184位和226位的修饰。在优选的实施方案中，CAB分子包括发生在100位、102位、104位、105位、107位、163位、165位、166位、184位和226位的修饰。在优选的实施方案中，CAB分子包括发生在100位、102位、104位、105位、107位、163位、165位、166位和226位的修饰。

[0007]在优选的实施方案中，修饰选自下列中的至少一个：T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、S163A、S165Y、Y166A、S184D和S226D，其中位置的编号是根据图1所示的SEQ ID NO：1。在优选的实施方案中，CAB分子包括CAB1.6分子，所述CAB1.6分子具有如下的修饰：T100L、S184D和S226D。在优选的实施方案中，CAB分子包括CAB1.7分子，所述CAB1.7分子具有如下的修饰：T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、S163A、S165Y、Y166A、S184D和S226D。在优选的实施方案中，CAB分子包括CAB1.13分子，所述CAB1.13分子具有如下的修饰：T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、S163A、S165Y、Y166A和S226D。

[0008]在优选的实施方案中，CAB分子包括如图25说明的CAB 1.2(SEQ ID NO：1)、CAB1.6(SEQ ID NO：5)、CAB1.7(SEQ ID NO：6)或CAB1.13的scFV部分。

[0009]在优选的实施方案中，CAB分子进一步包括β-内酰胺酶分子。在优选的实施方案中，CAB分子具有未修饰的氨基酸序列，或者具有从在SEQ ID NO：2中所说明的氨基酸修饰得到的氨基酸序列，并且修饰是在至少一个从下列位置中选出的位置上：3，13，16，37，100，102，104，105，107，146，163，165，166，181，184，226，265和568，其中位置编号根据图2所示的SEQ ID NO：2。在优选的实施方案中，修饰发生在3位、13位、16位、37位、100位、146位、181位、184位和226位。在优选的实施方案中，修饰发生在3位、13位、16位、37位、100位、102位、104位、105位、107位、146位、163位、165位、166位、181位、184位和226位。在优选的实施方式中，修饰发生在265位和568位。在优选的实施方式中，修饰发生在3位、13位、16位、37位、100位、102位、104位、105位、107位、146位、163位、165位、166位、181位、184位、226位、265位和568位。在优选的实施方式中，修饰发生在3位、13位、16位、37位、100位、102位、104位、105位、107位、146位、163位、165位、166位、181位、226位、265位和568位。

[0010]在优选的实施方案中，CAB分子具有这样的修饰，即所述修饰包含至少一个从下面选出的修饰：K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S184D、S226D、K265A和S568A，其中位置编号根据如图2所示的SEQ ID NO：2。在一优选的实施方案中，CAB分子包括CAB1.2i分子，所述CAB1.2i分子包含如下的修饰：K265A和S568A。在一优选的实施方案中，CAB分子包含CAB1.6分子，所述CAB1.6分子包含如下的修饰：K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、M146V、W181V、S184D和S226D。在一优选的实施方案中，CAB分子包括CAB1.6i分子，所述CAB1.6i分子包含如下的修饰：K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、M146V、W181V、S184D、S226D、K265A和S568A。在一优选的实施方案中，CAB分子包括CAB1.7分子，所述CAB1.7分子包含如下的修饰：K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S184D和S226D。在一优选的实施方案中，CAB包括CAB1.7i分子，所述CAB1.7i分子包括如下的修饰：K30、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S184D、S226D、K265A和S568A。在一优选的实施方案中，CAB分子包括CAB1.13分子，所述CAB1.13分子包含如下的修饰：K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V和S226D。在一优选的实施方案中，CAB包括CAB1.13i分子，所述CAB1.13i分子包含如下修饰：K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S226D、K265A和S568A。

[0011]在优选的实施方案中，CAB分子包括如图25中阐明的CAB1.2(SEQ ID NO：2)或CAB1.2i，CAB1.6(SEQ ID NO：7)，CAB1.6i(SEQ ID NO：8)，CAB1.7(SEQ IDNO：9)，CAB1.7i(SEQ ID NO：10)，如图25中阐明的CAB1.13，或者如图25中提出的CAB1.13i。

[0012]本发明的第二个方面涉及编码在此阐明的CAB分子的核酸。本发明的第三个方面涉及对需要的对象进行治疗，包括对对象施用如在此提供的CAB分子，以及作为CAB分子的底物的前体药物。本发明的第四个方面涉及包含CAB分子的药物组合物。

附图简述

[0013]图1表示了一个未修饰CAB分子的6个CDR的氨基酸序列。位置编号从H1的第一个位置开始，如图2A中所示的SEQ ID NO：2中所列示的。6个CDR的位置编号根据如图1所示的SEQ ID NO：1，是如以下所述：H1：26-35；H2，50-65；H3，99-109；L1，159-168；L2，184-190和L3，223-231。

[0014]图2提出CAB1分子(2A)的氨基酸序列和BLA(2B)的氨基酸序列。

[0015]图3提出了CAB1.6CDR(3A)和CAB1.7CDR(3B)的氨基酸。

[0016]图4提出了CAB1.6(4A)和CAB1.6i(4B)分子的氨基酸序列。

[0017]图5提出了CAB1.7(5A)和CAB1.7i(5B)分子的氨基酸序列。

[0018]图6呈示了涉及质粒pME27.1的详图。图6A提出了质粒pME27.1的示意图。P lac＝lac启动子，Pel B前导序列＝信号序列，CAB1 scFv＝单链抗体，BLA＝β-内酰胺酶基因，CAT＝氯霉素乙酰转移酶抗性基因，T7终止子＝终止子。图6B显示CAB1-scFv的序列、互补决定区(CDRs)和选择用来进行组合诱变的突变。图6C显示pME27.1的核苷酸序列。图6D显示CAB1的氨基酸序列，其显示了例如重链的序列、接头的序列、轻链的序列和BLA的序列。

[0019]图7显示结合作用检测和SDS PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)的结果。具体而言，图7A显示来自文库NA05的变异体的结合作用；图7B展示NA05文库的稳定性CAB1-BLA变异体的SDS PAGE；图7C显示来自NA06的多个分离物(isolates)与CEA的结合作用。

[0020]图8显示CAB1-scFv的vH和vL序列与公开的人抗体频率分析进行的比较。具体而言，图8A显示：在与人重链序列比对中，所测得的五种最丰富氨基酸的频率。图8B显示：在与人轻链序列比对中，所测得的五种最丰富氨基酸的频率。

[0021]图9显示NA08文库的筛选结果。X轴显示pH7.4下的结合作用，Y轴显示pH6.5下的结合作用。被选择用来进行进一步分析的克隆用方块表示。

[0022]图10显示是一个三维模型，具有被选择出来用于进行组合诱变的位点。

[0023]图11显示NA08变异体与固定化CEA的依赖于pH的结合。X轴显示BLA活性，Y轴显示CEA结合活性。变异体的名称显示在左上角。

[0024]图12提出CAB工程的概要。左边的一列是蛋白质的名称。中间的一列详述了从前一行而来的累积性变化。右面的列提供每个突变的推定理由，如本文件的内容所提供的。例如，做出了从CAB1到CAB1.1的改变，用以增加蛋白质的总体稳定性，如在此提供的。如可从本列中看到的，其中做出改变也用以：除了其他事项而外，增加分子的依赖于pH的结合作用，增加亲和力和去除T-细胞表位。

[0025]图13显示多种CAB1变异体与固定化CEA的结合。与CEA的结合(X轴)和BLA活性(Y轴)显示，例如不同结合pH下的不同特性。

[0026]图14提出多种CAB1变异体与LS174T细胞的结合。显示了针对LS174T的结合特性，实验方案如在此描述的。同样，在不同的pH下，可以观察到不同的结合特性。

[0027]图15公开了相关序列如下：图15A公开了SW149.5蛋白的氨基酸序列；图15B公开了CAB1.1蛋白的氨基酸序列；图15C公开了CAB1基因的核苷酸序列；图15D公开了CAB1.2蛋白的氨基酸序列；图15E公开了CAB1.4CDRs的氨基酸序列；图15F公开了CAB1.4CDRs的核苷酸序列；图15G公开了整个CAB1.4基因的核苷酸序列，包括BLA等；图15H公开了CAB1.4蛋白的氨基酸序列；图15I公开了CAB1.6CDRs的核苷酸序列；图15J公开了整个CAB1.6基因的核苷酸序列，包括BLA等；图15K公开了整个CAB1.6i基因的核苷酸序列，包括BLA等；图15L公开了CAB1.7CDRs的核苷酸序列；图15M公开了整个CAB1.7基因的核苷酸序列，包括BLA等；图15N公开了整个CAB1.7i基因的核苷酸序列，包括BLA等；图15O公开了CAB1CDRs的核苷酸序列；图15P公开了整个CAB1.2基因的核苷酸序列，包括BLA等；图15Q公开了SW149.5CDRs的氨基酸序列；图15R公开了SW149.5CDRs的核苷酸序列；图15S公开了整个SW149.5的核苷酸序列，包括BLA等；图15T公开了BLA的核苷酸序列；图15U公开了CAB1.1的核苷酸序列。

[0028]图16显示CAB1.1i和CAB1.13i在T1918荷瘤无胸腺小鼠(tumorbearingathymic mice)中的药动学和组织分布。X轴显示以小时为单位的时间；Y轴显示BLA活性。

[0029]图17显示的是，如实施例10中所述，在LS174T SCID模型中，当C-Mel或戊二酰-C-Mel在晚于CAB1.224小时施用时，其抗肿瘤活性，其中x轴是以天为单位的时间，y轴是肿瘤体积，以mm³为单位测量。

[0030]图18显示的是，在LS174T SCID模型中，在CAB1.2给药24小时后给予具有抗肿瘤活性的C-Mel和戊二酰C-Mel时的毒性-存活，如实施例10中所述的。x轴表示以天为单位的时间，y轴表示活着的小鼠的数目。

[0031]图19显示的是，在LS174T SCID模型中，在CAB1.2给药24小时后给予C-Mel和戊二酰C-Mel时的毒性-体重，如实施例10中所述的。x轴表示以天为单位的时间，y轴表示体重百分数。

[0032]图20显示的是，与对照相比，联合给予CAB1.2/前体药物之后的动物体重的影响，如实施例12所述。x轴表示以天为单位的时间，y轴表示以克为单位的治疗组重量。

[0033]图21图示的是，与对照相比，联合给予CAB1.2/前体药物的存活情况。x轴表示以天为单位的时间，y轴表示存活动物的数目。

[0034]图22显示的是与对照相比，联合给予CAB1.2/前体药物的功效，如实施例12所述。x轴表示的是以天为单位的时间，y轴表示以mm³为单位测量的肿瘤体积。各组如下：第1组：CAB1.2/C-Mel(2.5mg/kg，18hr)；第2组：CAB1.2/C-Mel(2.5mg/kg，36hr)；第3组：CAB1.2/C-Mel(1mg/kg，24hr)；第4组：未治疗的对照；第5组：只给予CAB1.2(2.5mg/kg)；第6组：只给予C-Mel；第7组：梅尔法兰(10mg/kg)；第8组：P97ADEPT/C-Mel(2.5mg/kg，18hr)；第9组：BLA/C-Mel(1.5mg/kg，18hr)。

[0035]图23显示功效，其中x轴是天数，y轴表示以mm³为单位测量的肿瘤体积。

[0036]图24公开相关的序列如下：图24A公开CAB1.2i的氨基酸序列；图24B公开CAB1.2i的核苷酸序列；图24C公开CAB1.13i的氨基酸序列；图24D公开CAB1.13i的核苷酸序列。

[0037]图25A和25B分别提出了CAB1.11i的氨基酸和核苷酸序列。

[0038]如26显示IHC(免疫组织化学)染色的结果，如实施例15所述。第1列表示案例的编号；第4列表示样品病理学；第5列表示样品诊断；第6列表示组织来源/发现部位；第7列表示H&E染色的结果，如实施例中所述；第8列表示针对对照，人细胞角蛋白的染色结果；第9-12列表示针对相关CAB的染色结果；第13列显示无抗体染色结果。

[0039]图27显示平均肿瘤体积(27A)和平均体重(27B)，如实施例16所述。x轴显示时间，以天为单位计量，y轴分别表示以mm³为单位计量的肿瘤体积，以及体重变化的百分数。

[0040]图28显示在不同的时间点上GC-Mel的血浆浓度。x轴表示以分钟计量的时间，y轴表示浓度。

[0041]图29显示肿瘤暴露于Mel的暴露比率。图29A显示肿瘤/血浆CG-Mel暴露比率，以x轴表示时间并以y轴表示肿瘤/血浆暴露比率。图29B显示的是肿瘤暴露于苯丙氨酸氮芥(也称美法仑或梅尔法兰(Melphalan))，柱指明了时间，y轴表示标准化剂量(normalized dose)，如实施例中描述的。图29C显示GC-Mel给药后苯丙氨酸氮芥肿瘤血浆比率，如在此描述的，柱表示时间，y轴表示肿瘤/血浆暴露比率。

发明详述

[0042]除非另外定义，在此所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常了解的含义相同的含义。尽管与在此描述的方法和材料相似或等价的任何方法和材料可以用于本发明的实践或试验中，还是对优选的方法和材料进行了描述。出于本发明的目的，下列术语的使用如下文所述。

[0043]“CAB”分子应该是指与CEA靶或微靶(microtarget)结合的靶向剂(targetedagent)，其具有未修饰的或修饰的序列，并且它们的未修饰的序列包含SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2中阐明的氨基酸序列。SEQ ID NO：1提出本发明CAB分子的未修饰CDR部分的氨基酸序列，如图1所示。SEQ ID NO：2提出包括BLA的CAB分子，如图2所示，并且位置编号分别根据图1和图2中提出的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。CAB名称的后面可跟随数字，用以对本发明的修饰的特定组合进行命名。例如，如上面提出的，并且贯穿本申请余下的部分，CAB1.6指的是具有如下修饰的CAB分子：T100L、S184D和S226D，其中位置编号根据SEQ IDNO：1；或者，具有如下突变的CAB分子：K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、M146V、W181V、S184D和S226D，其中位置编号根据SEQ ID NO：2。同样，例如，CAB1.7i指的是具有如下修饰的CAB分子：K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S184D、S226D、K265A和S568A，其中位置编号根据如图2所示的SEQ ID NO：2。

[0044]“靶向剂(targeted agent)”是选择性地与感兴趣的微靶结合的化学实体(chemical entity)。靶向剂的例子是抗体、肽和抑制剂。感兴趣的是具有期望的催化活性的靶向酶(targeted enzyme)，它可以，以高亲和性和选择性，与一个或多个靶结构结合。当结合于靶标的时候，靶向酶保留其至少大部分活性。

[0045]“结合部分(binding moiety)”是靶向剂(或ADEPT构建物，例如CAB分子)的一部分，其与微靶结合。结合部分可以包括CAB的一个以上的相邻或不相邻的区域。

[0046]“活性部分(active moiety)”是靶向剂(或者ADEPT构建物，例如CAB分子)的一部分，其赋予试剂功能性。活性部分可以包括例如CAB分子的一个以上的相邻或不相邻的区域。特别地，活性部分可为β-内酰胺酶。

[0047]在此，术语“蛋白质(protein)”和术语“肽(peptide)”和“多肽(polypeptide)”可被替换使用，指的是包含两个或更多个由肽键连接的氨基酸残基的分子。

[0048]术语“细胞(cell)”、“细胞系(cell line)”和“细胞培养物(cell culture)”可以替换地使用，所有这些名称都包括子代。词汇“转化体(transformants)”或“转化细胞(transformed cells)”包括原代的转化细胞和得自该细胞的培养物，无论传代数是多少。由于有意的或无意的突变，所有的子代在DNA内容(DNA content)上可能不是严格地一致。这样的突变型子代被包括在转化体的定义中：该突变型子代具有的功能与在最初的转化细胞中筛选的功能相同。细胞可为原核的或真核的。

[0049]术语“寡核苷酸(oligonucleotide)”，如此处所用，被定义为包含两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。确切的大小将取决于许多因素，这些因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以通过任何合适的方法制备，包括例如对适当的序列进行克隆和限制，和直接化学合成，进行直接化学合成的方法诸如Narang等，1979，Meth.Enzymol.68：90-99的磷酸三酯法(phosphotriestermethod)；Brown等，1979，Meth.Enzymol.68：109-151的磷酸二酯法(phosphodiestermethod)；Beaucage等，1981，TetrahedronLett.22：1859-1862的二乙基亚磷酰胺法(diethylphosphoramidite method)；和美国专利号4,458,066的固相支持法(solid support method)，在此引入每种方法作为参考。Goodchild，1990，Bioconjugate Chemistry 1(3)：165-187中提供了合成方法的综述，在此引入作为参考。

[0050]术语“引物(primer)”，如此处所用，指的是当其被置于引发引物延伸的条件下时，能够充当合成的起始点的寡核苷酸。引物延伸产物与核酸链互补，其合成在必需的四种不同的核苷三磷酸和DNA聚合酶的存在下，在合适的缓冲液中，在适宜的温度下被引发。“缓冲液(buffer)”包括缓冲剂(buffer)、辅因子(诸如二价金属离子)和盐(用以提供适宜的离子强度)，其被调节为期望的pH值。

[0051]杂交到基因序列的非编码链(等价地，非编码链的子序列(subsequence))上的引物在此称为“上游(upstream)”或“正向(forward)”引物。与基因序列的编码链杂交的引物在此称为“下游(downstream)”或“反向(reverse)”引物。

[0052]在本领域，具有相似侧链的氨基酸残基家族已被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甘氨酸)，具有β-分支的侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在此使用通常的三字母或单字母氨基酸缩写。等价的替换包括在权利要求的范围中。

[0053]本发明的肽、多肽和蛋白质可以包含一种或更多种的非典型氨基酸。非典型氨基酸包括但不限于普通氨基酸的D-异构体，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸(4-Abu)，2-氨基丁酸(2-Abu)，6-氨基己酸(Ahx)，2-氨基异丁酸(2-Aib)，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，半胱磺酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，丙氨酸环己酯(cyclohexylalanine)，β-丙氨酸，氟代氨基酸，设计型氨基酸(designer amino acid)，诸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸，以及通常的氨基酸类似物。

[0054]术语“Ab”或“抗体(antibody)”指的是与目标抗原结合的多克隆和单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、免疫球蛋白或抗体，或者抗体的功能性片断。诸如此类的功能性实体的例子包括完整的抗体分子，抗体片段，诸如Fv、单链Fv、互补决定区(complementarity determining regions，CDRs)、V_L(轻链可变区)、V_H(重链可变区)以及它们的任意组合，或者免疫球蛋白肽的其它任何能够与目标抗原结合的功能部分(function portion)。在这些例子中，该构建物具有如下的次序：vL-(GGGGS)6-vH；然而，所述例子是非限制性的，所有vL和vH的次序都意图被包括在本发明的范围中。

[0055]术语“前体药物(前药(prodrug))”指的是这样的化合物：它经由一个或多个酶学催化步骤转化成活性化合物，该活性化合物具有相比前药而增加的药理学活性。前药可以包括前原部分(pro-part)或非活性部分，以及药物或活性药物或可检测部分(detectable moiety)。任选地，前药也含有连接物(linker)。例如，前药可被酶切开以释放活性药物。可替换地，酶可以改变前药以释放出可检测部分。在一个更具体的例子中，靶向酶(targeted enzyme)对前药的切割将活性药物释放到靶向酶结合的标靶附近。“前原部分(pro-part)”和“非活性部分(inactive moiety)”指的是前药在被转化之后的的非活性部分。例如，如果前药包括由肽连接到活性药物上的PEG分子，前原部分指的就是带有肽连接体部分或不带有肽连接体部分的PEG部分。

[0056]如此处所用，“GC-Mel”指的是前药戊二酰-头孢菌素-苯丙氨酸氮芥(glutaryl-cephalosporin-melphalan)，例如Senter等，美国专利5,773,435中公开的，在此引入作为参考，包括任何的图。

[0057]术语“药物(drug)”和“活性药物(active drug)”和“可检测部分(detectablemoiety)”指的是前药的活性部分。靶向酶对前药进行切割以后，活性药物对目标肿瘤、细胞、传染物(infectious agent)或其它致病物(agent of disease)产生治疗性的作用。可检测部分充当诊断工具，这些可检测部分被意图包括在权利要求的范围内。活性药物可以是任何可以杀死细胞或抑制细胞增殖的化学实体。

[0058]如此处所用，“Mel”指的是苯丙氨酸氮芥(也称美法仑、马法兰、梅尔法兰(Melphalan))。Mel的结构已为本领域所熟知，也可以在美国专利5,773,435中找到。

[0059]在此，术语“％序列同源性(％sequence homology)”与术语“％同源性(％homology)”、“％序列同一性(％sequence identity)”和“％同一性(％identity)可以交换使用，指的是当使用序列比对程序进行比对的时候，两个或更多肽序列之间的氨基酸序列同一性水平。例如，如此处所用，80％同源性与80％序列同一性意义相同，其以确定的算法测定，并且因此，给定序列的同源物在该给定序列的一个长度段上具有大于80％的序列同一性。示范性的序列同一性水平包括但不限于与给定序列有60、70、80、85、90、95、98或99％或更多的序列同一性。

[0060]可以用来确定两个序列间的同一性的示范性的计算机程序包括但不限于BLAST程序集，例如BLASTN、BLASTX，和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，其为本领域技术人员和本领域所熟知。也参见Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-10和Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402。当评价给定的氨基酸序列相对于GenBank Protein Sequences(GenBank蛋白质序列)和其它公共数据文库中的氨基酸序列时，一般用BLASTP程序进行序列搜索。优选地，BLASTX程序将已按照所有阅读框(reading frame)被翻译的核酸序列针对GenBank ProteinSequences和其它公共数据文库的氨基酸序列进行搜索。BLASTP和BLASTX都以默认参数运行，开放空位罚分(open gap penalty)为11.0，延伸空位罚分(extended gappenalty)为1.0，使用BLOSUM-62矩阵。参见Altschul等，1997。

[0061]优选地，为了确定两个或更多个序列间的“％同一性”而对选定的序列进行的比对是使用例如MacVector 6.5版本下的CLUSTAL-W程序进行的，使用默认参数，包括开放空位罚分10.0，延伸空位罚分0.1和BLOSUM 30相似性矩阵(BLOSUM 30 similarity matrix)。

[0062]本发明的第一个方面涉及包含修饰的氨基酸序列的CAB分子。在一个实施方案中，CAB分子具有SEQ ID NO：1中提出的未修饰序列。在一个实施方案中，CAB分子具有从SEQ ID NO：1中提出的氨基酸序列修饰得来的氨基酸序列，并且所述修饰发生在至少一个选自下列位置的位置上：100、102、104、105、107、163、165、166、184和226位，其中位置编号根据图1所示的SEQ ID NO：1。在优选的实施方案中，CAB分子包括在100位、184位和226位上的修饰。在优选的实施方案中，CAB分子包括100位、102位、104位、105位、107位、163位、165位、166位、184位和226位上的修饰。在优选的实施方案中，CAB分子包括100位、102位、104位、105位、107位、163位、165位、166位和226位上的修饰。

[0063]在优选的实施方案中，修饰选自下面的至少一个：T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、S163A、S165Y、Y166A、S184D和S226D，其中位置编号根据图1所示的SEQ ID NO：1。在优选的实施方案中，CAB分子包括CAB1.6分子，所述CAB1.6分子具有如下的修饰：T100L、S184D和S226D。在优选的实施方案中，CAB分子包括CAB1.7分子，所述CAB1.7分子具有下面的修饰：T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、S163A、S165Y、Y166A、S184D和S226D。在优选的实施方案中，CAB分子包括CAB1.13分子，所述CAB1.13分子具有如下的修饰：T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、S163A、S165Y、Y166A和S226D。

[0064]在优选的实施方案中，CAB分子包括CAB1.2(SEQ ID NO：1)、CAB1.6(SEQ ID NO：5)、CAB1.7(SEQ ID NO：6)或CAB1.13的scFV部分，如图25中所阐述。

[0065]在优选的实施方案中，CAB分子进一步包括β-内酰胺酶分子。在一优选的实施方案中，CAB分子具有未修饰的SEQ ID NO：2提出的氨基酸序列，或者具有从SEQ ID NO：2提出的氨基酸序列修饰得来的氨基酸序列，并且修饰发生在选自下列位置的至少一个位置：3、13、16、37、100、102、104、105、107、146、163、165、166、181、184、226、265和568，其中位置编号根据图2所示的SEQID NO：2。在一优选的实施方案中，修饰发生在3位、13位、16位、37位、100位、146位、181位、184位和226位。在一优选的实施方案中，修饰发生在3位、13位、16位、37位、100位、102位、104位、105位、107位、146位、163位、165位、166位、181位、184位和226位。在一优选的实施方案中，修饰发生在3位、13位、16位、37位、100位、102位、104位、105位、107位、146位、163位、165位、166位、181位、184位、226位、268位和568位。在一优选的实施方案中，修饰发生在3位、13位、16位、37位、100位、102位、104位、105位、107位、146位、163位、165位、166位、181位、226位、265位和568位。

[0066]在优选的实施方案中，CAB分子进一步包括β-内酰胺酶分子。在一优选的实施方案中，CAB分子具有从SEQ ID NO：2中提出的氨基酸序列修饰得到的氨基酸序列，并且所述修饰发生在选自下列位置中的至少一个位置：3、13、16、37、100、102、104、105、107、146、163、165、166、181、184、226、265和568位，其中位置编号根据图2所示的SEQ ID NO：2。在一优选的实施方案中，修饰发生在3位、13位、16位、37位、100位、146位、181位、184位和226位。在一优选的实施方案中，修饰发生在3位、13位、16位、37位、100位、102位、104位、105位、107位、146位、163位、165位、166位、181位、184位和226位。在一优选的实施方案中，修饰发生在3位、13位、16位、37位、100位、102位、104位、105位、107位、146位、163位、165位、166位、181位、184位、226位、265位和568位。

[0067]在一优选的实施方案中，CAB分子具有这样的修饰，即所述修饰包含至少一个从下面选出的修饰：K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S184D、S226D、K265A和S568A，其中位置编号根据如图2所示的SEQ ID NO：2。在一优选的实施方案中，CAB分子包括CAB1.2i分子，所述CAB1.2i分子包含如下的修饰：K265A和S568A。在一优选的实施方案中，CAB分子包含CAB1.6分子，所述CAB1.6分子包含如下的修饰：K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、M146V、W181V、S184D和S226D。在一优选的实施方案中，CAB分子包括CAB1.6i分子，所述CAB1.6i分子包含如下的修饰：K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、M146V、W181V、S184D、S226D、K265A和S568A。在一优选的实施方案中，CAB分子包括CAB1.7分子，所述CAB1.7分子包含如下的修饰：K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S184D和S226D。在一优选的实施方案中，CAB包括CAB1.7i分子，所述CAB1.7i分子包含如下的修饰：K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S184D、S226D、K265A和S568A。在一优选的实施方案中，CAB分子包括CAB1.13分子，所述CAB1.13分子包含如下的修饰：K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V和S226D。在一优选的实施方案中，CAB包括CAB1.13i分子，所述CAB1.13i分子包含如下修饰：K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S226D、K265A和S568A。

[0068]在优选的实施方案中，CAB分子包括如图25中提出的CAB1.2(SEQ ID NO：2)或CAB1.2i，如图25中提出的CAB1.6(SEQ ID NO：7)、CAB1.6i(SEQ ID NO：8)、CAB1.7(SEQ ID NO：9)、CAB1.7i(SEQ ID NO：10)、CAB1.13，或者如图25中提出的CAB1.13i。

[0069]在另一实施方案中，CAB是MDTA，如2002年6月12日提交的PCT申请号US03/18200中描述的，在此以其整体引入作为参考。本发明的CAB分子中的一些显示出，相对于与非靶标的结合而言，其优先地结合于靶标上存在的微靶。所述结合上的差异可由靶标(target)和非靶标(non-target)之间的任何差异造成，靶标和非靶标之间的差异如pH、氧分压、溶质或分析物(例如乳酸、糖或其它有机或无机分子)的浓度、温度、光或离子强度的差异。本发明的CAB的优先结合可以用来在一组期望的条件下与微靶结合，在体外、离体、在原位或在体内(例如试验对象中的靶组织)鉴定标靶，杀死靶细胞或组织，在靶组织中或在靶组织附近将前体药物转化成活性药物。它也可以用作表面催化剂，例如，靶向漆酶(targetedlaccase)。其它的用途包括，例如定向生成化合物(例如从葡萄糖生成H₂O₂)和定向破坏化合物(例如来自特定组织的代谢物或信号分子)。

[0070]在一个实施方案中，使用亲和力成熟法(affinity maturation method)对CAB进行选择、制造或修饰，例如描述在2002年6月12日提交的PCT申请中，在此以其整体引入作为参考。

[0071]在另一实施方案中，使用环嫁接法(loop-grafting method)对CAB进行选择、制造或修饰，所述环嫁接法例如描述于2002年6月12日提交的美国专利申请序列号10/170,387中，在此以其整体引入作为参考。

[0072]在另一实施方案中，CAB为多功能多肽，如2002年6月12日提交的美国专利申请序列号10/170,729中描述的，在此以其整体引入作为参考。

[0073]在另一实施方案中，本发明的CABs被用于诊断或治疗应用中，例如以其整体在此引入作为参考的美国专利4,975,278中描述的那些应用，以及为本领域所熟知的方法。

[0074]在一个实施方案中，CAB分子进一步包括活性部分。所述活性部分可以是具有活性的分子或具有活性的分子的一部分。所述活性可为任何活性。活性部分可以具有的活性种类的例子包括，例如可检测活性(detectable activity)、酶活性、治疗活性(therapeutic activity)、诊断活性(diagnostic activity)、毒性活性(toxic activity)或结合活性(binding activity)。活性部分可以是CAB的分离部分，例如，与结合部分(binding moiety)融合或偶联的酶；或者它可以是CAB的一个必须部分，例如CAB与微靶的结合作用可以活化或抑制微靶或靶标的活性；或者CAB可以是下面所讨论的类型的靶向酶(targeted enzyme)，也在共同审查中的、以其整体在此引入作为参考的美国专利申请序列号10/022,073和10/022,097中予以讨论。

[0075]在另一实施方案中，活性部分显示出酶活性，例如，其为酶或酶的活性片断或衍生物。特别感兴趣的是可以用来在治疗环境下对前体药物进行活化的酶。大量的具有不同催化作用方式的酶已被用来对前体药物进行活化。参见，例如Melton & Knox  Enzyme-prodrug strategies for cancer therapy(1999)和Bagshawe等，Curr Poin Immunol 11：579(1999)。可以用来制造本发明的CAB的酶的类型的例子包括，但不限于：蛋白酶、羧肽酶、β-内酰胺酶、天冬酰胺酶、氧化酶、水解酶、裂合酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶、醛缩酶、磷酸酶、激酶、转移酶、聚合酶、核酸酶、核苷酸酶、漆酶、还原酶以及类似物。参见例如2001年9月12号提交的共同在审的美国专利申请序列号09/954,385，在此以其整体引入作为参考。同样地，本发明的CAB可以，例如展现出蛋白酶、羧肽酶、β-内酰胺酶、天冬酰胺酶、氧化酶、水解酶、裂合酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶、醛缩酶、磷酸酶、激酶、转移酶、聚合酶、核酸酶、核苷酸酶、漆酶或还原酶的活性以及类似活性。可使用的酶的例子是那些可以对前体药物进行活化的酶，如下面描述的，以及那些可以从代谢物制得毒性剂的那些酶，例如从葡萄糖中制得过氧化氢。参见Christofidou-Solomidou等，2000，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 278：L794。

[0076]在一个实施方案中，本发明提供了CAB，其进一步包括β-内酰胺酶(β-lactamase(“BLA”))。在另一个实施方案中，BLA为在此以其整体引入作为参考的、共同在审的美国专利申请序列号10/022,073和10/022,097描述的靶向酶。

[0077]BLA酶广泛分布于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中。BLA序列已经被熟知。图3描述了BLA序列的代表性例子。BLA酶的专一性不同，但相同的是它们水解β-内酰胺，产生出取代的β-氨基酸。因此，它们赋予针对含有β-内酰胺的抗生素的抗性。因为BLA酶对哺乳动物来说不是内源性的，所以它们经受的来自抑制剂、酶底物或内源酶系的干扰是最小的(不像蛋白酶)，因此特别适合于治疗性的施用。进一步地，BLA酶适合于本发明的治疗方法是因为它们尺寸小(来自阴沟肠杆菌(E.cloacae)的BLA是一个39kD的单体；来自大肠杆菌(E.coli)的BLA是30kD的单体)，以及因为它们具有针对其底物高度的专一性活性和在37℃下具有最适活性。参见Melton等， Enzyme-Prodrug Strategies for Cancer Therapy，KluwerAcademic/Plenum Publishers，New York(1999)。

[0078]可以用来制造本发明的CAB的具体BLA的例子包括，但不限于：A、B、C或D类的β-内酰胺酶(Class A，B，C or Dβ-lactamase)、β-半乳糖苷酶，参见Benito等，FEMS Microbiol.Lett.123：107(1994)，纤连蛋白、葡糖氧化酶、谷胱甘肽S-转移酶，参见Napolitano等，Chem.Biol.3：359(1996)，和组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator)，参见Smith等，J.Biol.Chem.270：30486(1995)。根据其序列，β-内酰胺酶被分成四类。参见Thomson等，2000，Microbes and Infection2：1225-35。丝氨酸β-内酰胺酶被再分成三类：A(青霉素酶)、C(头孢菌素酶)和D(苯唑青霉素酶(oxacillnase))。B类的β-内酰胺酶是含锌的或金属β-内酰胺酶。可以使用任何类别的BLA来制造本发明的CAB。

[0079]在本发明的一个实施方案中，BLA具有的针对头孢硝噻(nitrocefin)的比活力(specific activity)大于约0.01U/pmol，其中使用的是美国专利申请序列号10/022,097中描述的测定方法。在另一实施方案中，比活力大于约0.1U/pmol。在另一实施方案中，比活力大于约1U/pmol。优选地，这些比活力指的是BLA结合于微靶时的比活力。

[0080]在一个实施方案中，CAB中的BLA酶包括SEQ ID NO：3中提出的氨基酸序列。在另一实施方案中，CAB中的BLA酶与图2中描述的序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％或更多同一性。

[0081]在优选的实施方案中，CAB为CAB1.6、CAB1.6i、CAB1.7或CAB1.7i。

[0082]被CAB或者一个或多个结合部分所结合的靶标(target)可以是任何这样的物质或成分：对其，可以制成分子，用于结合CEA。在一个实施方案中，所述标靶是表面。在一个实施方案中，所述表面是生物表面。在另一个实施方案中，所述生物表面是器官的表面。在另一实施方案中，所述生物表面是组织的表面。在另一实施方案中，所述生物表面是细胞的表面。在另一实施方案中，所述生物表面是患病的器官、组织或细胞的表面。在另一实施方案中，所述生物表面是正常或健康的器官、组织或细胞的表面。在另一实施方案中，所述表面是组织的间隙空间中的大分子。在另一实施方案中，所述生物表面是病毒或病原体的表面。在另一实施方案中，所述表面是非生物表面。在另一实施方案中，所属非生物表面是医疗装置(medical device)的表面。在另一实施方案中，所述医疗装置是治疗装置。在另一实施方案中，所述治疗装置是植入的治疗装置。在另一实施方案中，所述的医疗装置是诊断装置。在另一实施方案中，所述诊断装置是孔(well)或盘(tray)。

[0083]细胞或组织的来源包括人、所有其它动物、细菌、真菌、病毒和植物。组织是复合的靶标，指的是单一的细胞类型、细胞类型的汇集或一般为特定种类的细胞的集合体。组织可以是原样的或经过改变的。人的组织的一般类型包括但不限于：上皮组织、结缔组织、神经组织和肌肉组织。

[0084]在另一实施方案中，靶标是这样的癌相关靶标：其表达CEA或者具有结合于其自身的CEA或者其附近有CEA。所述癌相关靶标(cancer-raleted target)可以是本发明的成分结合的任何靶标，其中本发明的成分的结合是作为对对象的癌症或与癌症相关的状态进行的诊断、检测或治疗的一部分，所述涉及癌症的靶标例如癌性细胞、组织或器官，与癌性细胞、组织或器官相关的分子，或者与癌性细胞、组织或器官相关的分子、细胞、组织或器官(例如结合于肿瘤的诊断性或治疗性分子，其被给予对象或给予得自对象的活组织(biopsy)；或者与癌性组织相关的健康组织，诸如脉管系统)。

[0085]本发明的第二个方面涉及编码在此提出的CAB分子的核酸。所述核酸可以是，例如DNA或RNA。本发明也提供了包含核酸的质粒，所述核酸编码包括CAB之全部或部分的多肽。质粒可以是例如表达质粒，其允许多肽在宿主细胞或有机体中表达，或在体外表达。表达载体可以允许多肽在例如细菌细胞中表达。所述细菌细胞可以是例如大肠杆菌(E.coli)细胞。

[0086]由于遗传密码的冗余性(redundancy)，一般来说，有大量的DNA序列编码任何给定氨基酸序列，从这个意义上说，它们是等价的。如下所述，可以期望选择一个或另一个等价的DNA序列用在表达载体中，这基于表达载体将要插入的宿主细胞的优先密码子选择。本发明意图包括编码期望CAB的所有DNA序列。

[0087]可以使用一个可操作的表达克隆，其构建是通过在表达载体中置放入与合适的控制序列可操作连接的编码序列。所述载体可以设计成在宿主细胞中自主复制或整合到宿主细胞的染色体DNA上。用得到的克隆来转化合适的宿主，并且在适合进行该编码序列表达的条件下对经转化的宿主进行培养。然后将表达出的CAB从培养基中或从细胞中分离，尽管在一些情况下CAB的回收(recovery)和纯化并不是必须的。

[0088]构建包含编码序列和合适的控制序列的适宜克隆是利用本领域所熟知的标准连接和限制技术(standard ligation and restriction techniques)。一般而言，分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸被以期望的形式切割、修饰和重新连接。如果没有通常可用的适宜的限制位点的话，可以在编码序列的末端加入适宜的限制位点，以使表达克隆的构建更加便利。

[0089]位点专一性的DNA切割是通过使用一种(或多种)合适的限制酶处理实现的，进行限制酶处理的条件是本领域通常所知的，并且商业上可得的限制酶的制造商对其也有具体说明。参见，例如Amersham(Arlington Heights，IL)、RocheMolecular Biochemicals(Indianapolis，IN)和New England Biolabs(Beverly，MA)的产品目录。典型的温育时间是在特定酶的最适温度下约一个到两个小时。每次温育过后，通过使用苯酚和氯仿抽提将蛋白质移出；所述的抽提之后可以进行醚类抽提，以及使用乙醇沉淀来将DNA从含水组分中回收。如果需要的话，可以通过使用标准技术，进行聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳来将切割的片断按大小分开。参见，例如Maxam等，1980，Methods in Enzymology 65：499-560。

[0090]连接可以以例如15-30μl的体积，在下面的标准条件和温度下进行：20mMTris-Cl，pH 7.5，10mM MgCl₂，10mM DTT，33μg/ml BSA，10-50mM NaCl，以及以下两组条件中的一组，即40μM ATP和0.01-0.02(Weiss)单位的T4DNA连接酶，在0℃下(用以连接具有互补单链末端的片断)，或者1mM ATP和0.3-0.6单位的T4DNA连接酶，在14℃下(用于“平末端(blunt end)”连接)。具有互补末端的片断的分子间连接，一般在总DNA浓度33-100μg/ml(总末端浓度5-100nM)下进行。平末端的分子间连接(任选地，一般使用20-30倍摩尔过量的接头)在1μM的总末端浓度下进行。

[0091]可以使用本领域已知的任何合适的方法，对质粒结构的正确连接进行确认。例如，对质粒结构的正确连接的确认可以通过首先使用连接混合物对合适的宿主进行转化，其中合适的宿主诸如是大肠杆菌(E.coli)菌株DG101(ATCC 47043)或大肠杆菌(E.coli)菌株DG116(ATCC 53606)。可以通过氨苄青霉素、四环素，或通过其它抗生素抗性或敏感性，或者通过使用其它的标记来对成功的转化体进行选择，这取决于质粒构建的方式，如本领域所理解的。然后根据Clewell等，1969，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 62：1159的方法制备来自转化体的质粒，任选地在此之前进行氯霉素法扩增(chloramphenicol amplification)。参见Clewell，1972，J.Bacteriol.110：667。可替代地，可以使用“碱-酸(Base-Acid)”抽提方法制备质粒DNA，所述方法在Bethesda Research Laboratories publication  Focus 5(2)的第11页，并且，以DNA的CsCl/溴化乙锭超速离心代替该实验方案的第12步到第17步可以得到非常纯的质粒DNA。作为另一个可替代的方案，可以按照卖主提供的实验方案、使用商业上可得的质粒DNA分离试剂盒，例如HISPEED^TM、QIAFILTER^TM和QIAGEN质粒DNA分离试剂盒(Qiagen，Valencia CA)。分离的DNA可以通过，例如限制酶消化进行分析；和/或通过Sanger等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463的双脱氧法进行测序，如Messing等，1981，Nuc.Acids Res.9：309进一步描述的；或通过Maxam等，1980，Methods in Enzymolgy 65：499中的方法进行测序。

[0092]控制序列、表达载体和转化方法取决于用来表达该基因的宿主细胞的类型。一般地说，原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞被用作宿主。一般来说，原核宿主用来生产重组蛋白质是最高效和最便利的，因此优选它来表达蛋白质。

[0093]最常用的表达重组蛋白质的原核生物是大肠杆菌(E.coli)。然而，也可以使用除了大肠杆菌(E.coli)以外的微生物菌株，诸如杆菌，例如枯草杆菌(Bacillussubtilis)，假单孢菌(Pseudomonas)和沙门氏菌(Salmonella)的各个种，以及其它细菌菌株。在诸如此类的原核生物系统中，一般使用含有如下所述复制位点和控制序列(control sequence)的质粒载体：所述复制位点和控制序列来自该宿主或与宿主相容的种。

[0094]关于在大多数细菌启动子的控制下对构建物(constructions)进行的表达，可以使用得自E.coli Genetic Stock Center的、列于GCSC#6135下的大肠杆菌(E.coli)K12菌株MM294作为宿主。至于具有P_LN_RBS或P_LT7_RBS控制序列的表达载体，可以使用大肠杆菌(E.coli)K12菌株MC1000λ溶原体，N₇N₅₃cI857SusP₈₀，ATCC39531。1987年4月7日存放在ATCC的大肠杆菌(E.coli)DG116(ATCC 53606)和1985年3月29日存放在ATCC的大肠杆菌(E.coli)KB2(ATCC 53075)也是有用处的宿主细胞。至于M13噬菌体重组体，使用易于被噬菌体感染的大肠杆菌(E.coli)菌株，诸如大肠杆菌(E.coli)K12菌株DG98(ATCC 39768)。所述DG98菌株在1984年7月13日被存放在ATCC。

[0095]例如，一般使用pBR322的衍生物对大肠杆菌(E.coli)进行转化，如Bolivar等，1977，Gene 2：95描述的。质粒pBR322含有氨苄青霉素和四环素抗性基因。构建期望的载体时可以保留或破坏这些药物抗性标记，这有助于检测期望的重组体的是否存在。通常使用的原核控制序列，即转录起始的启动子，其任选地具有操纵基因(operator)，随同具有核糖体结合位点序列，所述原核控制序列包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统，参见Chang等，1977，Nature 198：1056；色氨酸(trp)启动子系统，参见Goeddel等，1980，Nuc.Acids Res.8：4057；和源自λ的P_L启动子，参见Shimatake等，1981，Nature 292：128；和基因N核糖体结合位点(N_RBS)。颁发于1987年12月8日的美国专利号4,711,845提出了可移植控制系统盒(portable control system cassette)。这个盒包括P_L启动子，其可操作地连接N_RBS，依次位于第三个DNA序列的上游，所述第三个DNA序列具有至少一个限制位点，该限制位点允许在N_RBS序列3’端的六个碱基对之内进行切割。Chang等在1986年10月8日公开的欧洲专利公开号196,864中描述的磷酸酶A(pho A)系统也有用处。然而，与原核生物相容的任何可以利用的启动子系统都可以用来构建本发明的表达载体。

[0096]除细菌以外，真核微生物如酵母菌也可以被用作重组体宿主细胞。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的实验室株，面包酵母(Baker′s yeast)最常被使用，尽管许多其他的菌株也是可利用的。尽管利用2微米复制起点(two micron origin ofreplication)的载体是常用的，参见Broach，1983，Meth.Enz.101：307，其它适合酵母菌表达的质粒载体是已知的。参见，例如Stinchcomb等，1979，Nature 282：39；Tschempe等，1980，Gene 10：157；和Clarke等，1983，Meth.Enz.101：300。酵母载体的控制序列包括合成糖酵解酶的启动子。参见Hess等，1968，J.Adv.EnzymeReg.7：149；Holland等，1978，Biotechnology 17：4900；和Holland等，1981，J.Biol.Chem.256：1385。本领域已知其它启动子包括3-磷酸甘油酸激酶的启动子，参见Hitzeman等，1980，J.Biol.Chem.255：2073，以及其它糖酵解酶的启动子，诸如3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。具有生长条件控制转录的额外优点的其它启动子是下列蛋白的启动子区：醇脱氢酶2、异细胞色素C(isocytochrome C)、酸性磷酸酯酶、与氮代谢相关的降解酶和负责对麦芽糖和半乳糖进行利用的酶。

[0097]当置于编码序列的3端，终止序列也可被用来增强表达。诸如此类的终止子，在来自酵母的基因中、在跟随编码区域的3端非翻译区域中被发现。含有酵母相容启动子、复制起始点和其它控制序列的任何载体，都适合用于构建酵母表达载体。

[0098]编码序列也可以在源自多细胞生物的真核宿主细胞培养物中表达。参见，例如Tissue Culture，Academic Press，Cruz and Patterson，editors(1973)。有用处的宿主细胞系包括COS-7；COS-A2；CV-1；鼠类细胞，诸如鼠骨髓瘤细胞N51和VERO；HeLa细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。用于这些细胞的表达载体通常包括与哺乳动物细胞相容的启动子和控制序列，诸如常用的来自猿猴病毒(Simian Virus)40(SV40)的早期启动子和后期启动子，参见Fiers等，1978，Nature 273：113，或者其它病毒启动子诸如得自多瘤病毒、腺病毒2型、牛乳头状瘤病毒(BPV)或禽肉瘤病毒的病毒启动子，或者免疫球蛋白启动子和热激启动子。

[0099]增强子区在优化表达中也是重要的；这些一般是在启动子区上游所发现的序列。如果需要的话，可以从病毒来源获得复制起点。然而，整合进染色体中是真核细胞中DNA复制的通常机制。

[0100]植物细胞也可以用作宿主，可以获得与植物细胞具有相容性的控制序列，诸如胭脂氨酸合酶启动子和多腺苷酸化信号序列，参见Depicker等，1982，J.Mol.Appl.Gen.1：561。利用杆状病毒载体所提供的控制系统的、使用昆虫细胞的表达系统也得到了描述。参见Miller等，在Genetic Engineering(1986)，Setlow等编著，Plenum Publishing，Vol.8，pp.277-97中。基于昆虫细胞的表达可以在Spodopterafrugipeida中实现。这个系统也可以成功地生产重组酶。

[0101]根据所使用的宿主细胞，使用适合于这些细胞的标准技术完成转化。对原核细胞或其它含有坚实的细胞壁障碍的细胞使用氯化钙进行钙处理，如Cohen，1972，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：2110描述的。以根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)进行的转染用于某些植物细胞，参见Shaw等，1983，Gene 23：315。对于哺乳动物细胞，Graham等，1978，Virology 52：546的磷酸钙沉淀法为优选的。转化进入酵母菌是根据Van Solingen等，1977，J.Bact.130：946和Hsiao 1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：3829的方法进行的。

[0102]可以期望对这样的DNA序列进行修饰，即所述DNA编码多肽，该多肽包含本发明CAB的全部或部分，用以提供，例如，与宿主细胞的密码子选择更加相容的序列而不改变编码的蛋白质的氨基酸序列。对最初的5-6个密码子进行诸如此类的修饰可能改善表达效率。已被修饰以改善表达效率、但编码相同氨基酸序列的DNA序列被认为是等价的，包含在本发明中。

[0103]多种位点专一引物介导诱变方法是可以利用的并且在本领域是已知的。参见，例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，1989，second edition，chapter 15.51，″Oligonucleotide-mediated mutagenesis″，在此引入作为参考。聚合酶链反应(PCR)可以用来进行位点专一诱变(site-specificmutagenesis)。在本领域当前另一标准技术中，使用编码期望突变的合成寡核苷酸作为引物，以指导互补核酸序列的合成，所述互补核酸序列含在单链载体中，诸如pBSM13+衍生物，其作为诱变引物之延伸产物的构建模板。将经过诱变的DNA转化进入宿主细菌中，并将发生转化的细菌之培养物铺板并鉴定。对经过修饰的载体的鉴定可能需要将选定转化体的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或其它膜上，并且使“提升物(lifts)”与激酶处理的合成诱变引物杂交，其中进行杂交的温度是允许与修饰的序列精确相配的杂交、而同时防止与原始的未经诱变的链进行杂交的温度。然后，对含有可以与探针杂交的DNA的转化体进行培养(一般通过序列分析对DNA序列进行确认)，其作为修饰DNA的储存文库(reservoir)。

[0104]一旦多肽在重组宿主细胞中得到表达，对多肽进行纯化可以是期望的。可以使用多种纯化程序。

[0105]另一个实施方案中，在高严格度条件下，将编码CAB的核酸与这样的核酸杂交：所述核酸与编码在此公开的任何氨基酸序列的核酸互补。高严格度条件可以是，例如在65℃下，在0.5M NaHPO₄、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中，与结合在滤膜上的DNA杂交；以及在68℃下，在0.1xSSC/0.1％SDS中漂洗(Ausubel等，eds.，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.I，GreenPublishing Associates，Inc.，和John Wiley & Sons，Inc.，New York在p.2.10.3)。其它高严格度条件可以在，例如Current Protocols in Molecular Biology，pages2.10.1-16和Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.，Sambrook等(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pages 9.47-57中找到。在另一实施方案中，使用中严格度条件。中严格度条件可以是，例如在42℃下，在0.2xSSC/0.1％SDS中漂洗(Ausubel等，1989，前述)。其它中严格度条件可以在例如CurrentProtocols in Molecular Biology，Vol.I，Ausubel等(eds.)，Green Publishing Associates，Inc.，和John Wiley & Sons，Inc.，1989，pages 2.10.1-16和Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2d ed.，Sambrook等(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pages 9：47-57中找到。

[0106]本发明第三方面提供了对对象进行治疗的方法，其中对象需要这种治疗方法，该方法包括对对象施用CAB和前药，其中前药是CAB的底物。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗对象的方法，是通过对对象施用进一步包括BLA的CAB和前药，其中前药被BLA转化成活性药物。适合于这个实施方案的前药的例子，例如在Melton等， Enzyme-Prodrug Strategies for Cancer Therapy，KluwerAcademic/Plenum Publishers，New York(1999)，Bagshawe等，Current Opinion inImmunology 11：579-83(1999)和Kerr等，Bioconjugate Chem.9：255-59(1998)中提供的。在另一实施方案中，CAB特别地为CAB 1.6，CAB 1.7或CAB 1.7i。

[0107]酶/前药/活性药物联合使用的例子可以在，例如在Bagshawe等，CurrentOpinions in Immunology，11：579-83(1999)；Wilman，“Prodrugs In CancerChemotherapy，”Biochemical Society Transactions，14，pp.375-82(615th Meeting，Belfast 1986)和V.J.Stella等，″Prodrugs：A Chemical Approach To Targeted DrugDelivery，″Directed Drug Delivery，R.Borchardt等(ed)，pp.247-67(Humana Press1985)中找到。在一个实施方案中，前药是肽。作为前药的肽的例子可从Trouet等，Proc Natl Acad Sci USA 79：626(1982)，和Umemoto等，Int J Cancer43：677(1989)中找到。这些和其他报道显示：肽在血液中足够稳定。来自肽的前药的其它优点是可以对它们的氨基酸序列进行选择，以便赋予活性药物适宜的药理学性质，如半衰期、组织分布和低毒性。大多数报道的来自肽的前药依赖于由例如溶酶体酶类所进行的相对非特异性前药活化过程。

[0108]前药(prodrug)可以是经过一步以上的步骤被转化成活性药物的物质。例如，前药可以被CAB转变成活性药物的前体(precursor)。前体可被转变成活性药物，例如借助另外的一种或多种CAB的催化活性、施予该对象的一种或多种其它酶的催化活性、该对象中或对象的靶部位中天然存在的一种或多种酶(如蛋白酶、磷酸酶、激酶或聚合酶)的催化活性转变，被施予该对象的药物转变或被非酶催化的化学过程(如氧化、水解、异构化或差向异构化)转变。

[0109]大部分涉及前药的研究是在使用已有药物的计划被发现有问题以后进行的。具体而言，抗癌药物的特征一般是非常低的治疗指数。通过将这些药物转变成具有减少的毒性的前药，然后选择性地在患病组织将其活化，药物的治疗指数得到了显著增加。参见Melton等， Enzyme-prodrug strategies for cancer therapy(1999)，和Niculescu-Duvaz等，Anticancer Drug Des 14：517(1999)。

[0110]文献描述了许多通过蛋白质工程或定向进化改变酶的底物特异性的方法。因此，本领域技术人员能够发展酶的特异性，以适应均匀结构(even structure)，所述均匀结构对天然存在的酶来说是差底物。因此，可以设计前药，即使这些药物因另外方式不服从某种前药策略。

[0111]使用偶合于寻靶试剂(targeting agents)(通常是抗体或抗体片段)上的毒素已经进行了许多研究。参见，例如Torchilin，Eur J Pharm Sci 11 Suppl 2：S81(2000)和Frankel等，Clin Cancer Res 6：326(2000)。上述方案的可替代方案是将这些毒素转变成前药，然后选择性地将它们释放到患病组织中。

[0112]本发明的前药包括但不限于aurstatins、喜树碱、含磷酸酯(盐)的前药、含硫代磷酸酯(盐)的前药、含硫酸酯(盐)的前药、含肽的前药、D-氨基酸修饰的前药、糖基化的前药、含β-内酰胺的前药、含任选地取代的苯氧乙酰胺的前药或含任选地取代的苯乙酰胺的前药，5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前药，它们可被偶联物的酶转变成活性更高的细胞毒性自由药物。可被衍生化成为用于本发明的前药形式的细胞毒性药物包括，但不限于：依托泊苷、temposide、阿霉素(adriamycin)、道诺霉素、洋红霉素、氨基蝶呤、放线菌素D、丝裂霉素、顺铂和顺铂类似物、博来霉素、esperamicin(参见美国专利号4,675,187)、5-氟尿嘧啶、梅尔法兰，其它相关的氮芥以及它们的衍生物。参见例如美国专利号4,975,278。

[0113]在本发明的一个实施方案中，CAB包括碱性磷酸酶(AP)，它将表鬼臼毒素葡糖苷(epipodophyl-lotoxin glucosides)的4′-磷酸衍生物转变成活性的抗癌药物。诸如此类的衍生物包括依托泊苷-4′-磷酸、依托泊苷-4-′-硫代磷酸和鬼臼噻吩甙-4′-磷酸。本发明的其它实施方案可以包括这些葡糖苷的磷酸衍生物，其中磷酸部分被置于葡糖苷的其它羟基基团上。然而，根据另一实施方案，用作本发明的前药的磷酸衍生物是依托泊苷-4′-磷酸或依托泊苷-4′-硫代磷酸。定向AP将磷酸基团从前药中除去，释放出活性抗肿瘤剂。本实施方案的磷酸丝裂霉素前药(mitomycinphosphate drug)可以是丝裂霉素C或泊非霉素的N⁷-C_1-8烷基磷酸衍生物，或其药学上可接受的盐。N⁷指的是连接于母体药物米吐烷(mitosane)核的第7位上的氮原子。根据另一实施方案，使用的衍生物是7-(2′-氨基乙基磷酸)丝裂霉素(“MOP”)。可替代地，MOP化合物可以被称为9-甲氧基-7-[[(膦酰氧基)乙基]氨基]米吐烷二钠盐。本发明的其它实施方案可以包括将N⁷-烷基丝裂霉素硫代磷酸盐(N⁷-alkylmitomycin phosphorothioates)用作前药。

[0114]在本发明的另一实施方案中，CAB包括青霉素酰胺酶(penicillin amidaseenzyme)，它将新的阿霉素前药转变成活性抗肿瘤药物阿霉素。在另一实施方案中，青霉素酰胺酶为青霉素V酰胺酶(″PVA″)，它是从尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)中分离得到的，水解苯氧乙酰基酰胺键。利用的前药可以是N-(对羟基苯氧乙酰基)阿霉素(“APO”)，它被酰胺酶水解，释放出有效的抗肿瘤剂或者阿霉素。

[0115]本发明也包括，例如使用阿霉素前药N-(对羟基苯氧乙酰基)阿霉素和其它可以以实质上相同的方式衍生的相关阿霉素前药。例如，使用前药N-(苯氧乙酰基)阿霉素也在本发明的范围内。此外，应该理解本发明的阿霉素前药包括阿霉素的其它N-羟基苯氧乙酰基衍生物，如在苯环的不同位置取代，以及在苯环上含有除了在此描述的羟基基团以外的取代基的N-苯氧乙酰基衍生物。

[0116]更进一步地，本实施方案包括将其它酰胺酶，诸如青霉素G酰胺酶用作CAB的一部分，以及使用其它相应地衍生的前药，使得特定酰胺酶可以将该前药水解成活性抗肿瘤形式。例如，当CAB进一步包括青霉素G酰胺酶的时候，前药应该含有苯乙酰胺基团(与APO的苯氧乙酰胺基团不同)，因为青霉素G酰胺酶水解这种类型的酰胺键(参见例如A.L.Margolin等，Biochim.Biophys Acta.616，pp.283-89(1980))。从而，本发明其它的前药包括N-(对羟基苯乙酰基)阿霉素，N-(苯乙酰基)阿霉素和阿霉素的其它任选取代的N-苯乙酰衍生物。

[0117]应该理解，本发明包括任何这样的前药：所述前药是通过将母体药物的氨基基团和苯氧乙酸、苯乙酸或其它相关的酸的羰基反应而得到。因此，除了阿霉素，蒽环类抗生素前药能够以和在此描述的阿霉素前药基本上相同的方式被衍生和起作用，它也落入本发明的范围。例如，可以根据本发明被制造和使用的其他前药包括蒽环类抗生素的羟基苯氧乙酰胺衍生物、羟基苯乙酰胺衍生物、苯氧乙酰胺衍生物和苯乙酰胺衍生物，其中蒽环类抗生素诸如是道诺霉素和洋红霉素。其它含胺的药物诸如梅尔法兰、丝裂霉素、氨基蝶呤、博来霉素和放线菌素D也可以按此处所述被修饰，以便得到本发明的前药。

[0118]本发明的另一实施方案涉及的CAB形式的酶是胞嘧啶脱氨酶(″CD″)。脱氨酶催化5-氟胞嘧啶(″5-FC″)的转变成有效的抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶(″5-FU″)，其中5-氟胞嘧啶缺乏抗肿瘤活性。

[0119]本发明方法的另一实施方案提供一种联合化疗方法，其使用几种前药和单个CAB。根据这个实施方案，使用了多种前药，它们都是同一CAB的底物。从而，特定的CAB将多种前药转变成细胞毒性形式，在肿瘤部位引起增加的抗肿瘤活性。

[0120]经常会要求延长药物肽、蛋白或小分子的血液循环半衰期。一般地，短的半衰期——持续数分钟到数小时——不仅要求更频繁的给药，而且要求更高的剂量，以取得治疗效果——经常高到初始峰值剂量引起副作用。延长这种治疗剂的半衰期允许更低量、频率更低以及因此可能更安全的剂量，生产起来更低廉。此前，研究者增加了蛋白质的半衰期，是通过将蛋白共价融合在PEG上，参见美国专利5,711,944；人血清白蛋白，参见美国专利5,766,883；或Fc片断，参见WO00/24782。此外，药物针对人血清白蛋白的非特异性定向作用，已经通过体内化学偶联药物实现了。参见美国专利5,843,440。此外，在癌症药物的情况下，有人提出：由于增强的穿透性和保持力，高分子量药物可以集中在肿瘤中。从而，可以通过将药物与蛋白或其它高分子量聚合物连接来从而改善药物的治疗指数。

[0121]本发明的另一个实施方案中提供了一种治疗对象的一种状态的方法，其包括对对象施用具有β-内酰胺酶活性的CAB和前药。在另一实施方案中，CAB被定向于表达CEA的细胞、组织、肿瘤或器官。在另一实施方案中，前药被CAB转化成为活性药物。在另一实施方案中，活性药物是烷化剂。在另一实施方案中，前药是抗癌的氮芥前药。在另一实施方案中，活性药是梅尔法兰。在另一实施方案中，前药是戊二酰-C-Mel或戊二酰-C-Mel-L-Phe-NH2(参见，例如Senter等，美国专利5,773,435，在此引入作为参考，包括任何图在内；以及Kerr等，BioconjugateChem.9：255-59(1998))。在另一实施方案中，前药是C-Mel。参见Kerr等Bioconjugate Chem.9：255-59(1998)。在另一实施方案中，前药是长春药-头孢菌素(vinca-cephalosporin)或亚得里亚霉素头孢菌素(doxorubicin cephalosporin)。参见Bagshawe等，Current Opinion in Immunology，11：579-83(1999)。可以用于本发明的其它联合的前药/酶包括但不限于美国专利号4,975,278；和Melton等，Enzyme-Prodrug Strategies for Cancer Therapy Kluwer Academic/Plenum Publishers，New York(1999)中的那些前药。

[0122]在第四个方面，本发明涉及包括-CAB分子的药物组合物。在此描述的CAB，编码它们的核酸以及某些实施方案中的前药可以合并入适合给药的药物组合物。诸如此类的组合物一般包含活性化合物和药学上可接受的载体。如此处所用，专用语“药学上可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)”意图包括任何和所有的与药物施用可相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂以及类似物。诸如此类的介质和试剂用于药学上有活性的物质，是本领域已经熟知的。除了达到与活性化合物不相容程度的任何传统媒介或试剂之外，在组合物中使用传统的介质和试剂是预期的。辅助的活性化合物也可以合并进入组合物中。

[0123]本发明包括制备药物组合物的方法，所述药物组合物调制感兴趣的CAB、前药或核酸的表达或者活性。诸如此类的方法包括将药学上可接受的载体与调节感兴趣的活性化合物的表达或活性的试剂进行配制。诸如此类的组合物可以进一步包括另外活性剂。从而，本发明进一步包括这样的制备药物组合物的方法：所述方法：将药学上可接受的载体，与调节感兴趣的CAB、前药或核酸的表达或活性的试剂，和一种或多种另外的活性化合物配制在一起。

[0124]本发明的药物组合物被配制成与它的希望给药途径相适应。给药途径的例子包括肠胃外的给药，如静脉内、皮内、皮下、口腔(如吸入)、经皮(局部的)、经粘膜和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或混悬液可以包括下面的成分：无菌稀释剂，诸如用于注射的水，盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及调整张力的试剂，诸如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调节pH值，诸如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量瓶中。

[125]适合用于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(当溶于水时)或分散体系(dispersion)以及无菌粉末，用于即时制备无菌可注射的溶液或分散体系。用于静脉内给药时，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙基代蓖麻油(CremophorEL^TM)(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有的情况下，组合物必须是无菌的并且应该是流动的，达到容易通过针孔的程度。它在制造和贮藏条件下必须是稳定的，并且它必须防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇，以及类似物)以及它们的合适的混合物。适宜的流动性可以得以保持，通过例如使用诸如卵磷脂的覆层、在分散体系的情况下保持必要的颗粒大小、和通过使用表面活性剂。微生物行为的阻止可以通过多种抗细菌和抗真菌剂来实现，例如抗细菌和抗真菌剂是对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇(chlorobutanol)、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞以及类似物。在许多情况下，优选地在组合物中包括等渗剂(isotonicagent)，例如糖；多元醇，诸如甘露醇；山梨醇；氯化钠。通过在组合物中引入延缓吸收的药剂，诸如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。

[0126]无菌可注射溶液可以这样制备：将活性化合物以需要的量并入合适的溶剂中，所述溶剂带有按需要混入的上面列举出的成分的一种或组合，然后进行过滤除菌。一般地，分散体系这样制备：将活性化合物混入无菌载体(vehicle)，所述无菌载体含有基本分散介质和需要的其他成分，这些成分来自上面举出的那些成分。在无菌粉末用以制备无菌可注射溶液的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这些制备方法从其先前过滤除菌的溶液产生出活性成分加上任何另外需要成分的粉末。

[0127]口腔用组合物一般包含惰性的稀释剂或可食用载体。它们可以包在明胶胶囊中，或被压成片。为了经口腔治疗性给药的目的，活性化合物可以与赋形剂混在一起，以片剂、含片或胶囊剂的形式使用。口腔用组合物也可以用流体载体制备，用作漱口剂，其中流体载体中的化合物被应用于口腔，漱口(swished)并吐出或咽下。

[0128]药学上可相容的结合剂和/或佐剂材料可被包括进来，作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、含片和类似物可以含有下列任何的成分，或者具有类似性质的化合物：粘合剂，诸如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或芳香剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橘味香精(orange flavoring)。

[0129]对于通过吸入的给药，化合物以气溶胶喷发药的形式递送，所述气溶胶喷发药来自加压容器或分散器(dispenser)，其含有合适的喷射剂，如气体，诸如二氧化碳，或者来自喷雾器。

[0130]也可以通过经粘膜或经皮的手段进行全身用药。对于经粘膜或经皮给药，在制剂中使用穿透剂，该穿透剂适合于要穿透的屏障。诸如此类的穿透剂是本领域一般了解的，其包括，例如用作经粘膜给药时的去污剂、胆盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂来实现。对于经皮给药，可以将活性化合物配入软膏、药膏、凝胶或乳膏中，如本领域一般知晓的。

[0131]化合物也可以被制成栓剂(如使用传统的栓剂基质，诸如可可脂和其它甘油酯)或保留灌肠剂的形式，用以进行直肠递送。

[0132]在一个实施方案中，活性化合物与这样的载体制备到一起：所述载体将保护化合物不被身体快速排除，诸如控制释放制剂，包括埋植剂和微囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物可相容的聚合物，诸如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯类和聚乳酸。制备此类制剂的方法对本领域的技术人员而言是显然的。原料也可以通过商业途径从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.获得。脂质体混悬液(包括带有针对病毒抗原的多克隆抗体而定向于受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法进行制备，例如美国专利号4,522,811中描述的方法。

[0133]将经口腔或非经肠胃的组合物制成单位剂型特别便利，这方便给药和统一剂量。单位剂型(dosage unit form)，如此处所用，指的是物理地分散的单位，其作为单位的剂量，适合于要被治疗的对象；每个单位含有活性化合物的预先确定的量，其中活性化合物的量是计算好的，用以与需要的药学载体联用时产生期望的疗效。本发明的单位剂型的规格取决于并直接依赖于活性化合物的独特性质和所要取得的特定疗效，以及本领域中将此种活性化合物进行复配用以治疗个体的固有限制。

[0134]一般地，要递送给对象的CAB的量取决于许多因素，包括例如给药途径，CAB的活性，它特异性地定向于对象的期望细胞、组织或器官的程度，从对象中清除非特异性结合的CAB所需时间的长度，期望的疗效，对象的体重，对象的年龄，对象的一般健康状况，对象的性别，对象的饮食情况，对象对CAB的免疫应答，给予对象的其它药物或治疗，疾病的严重程度和先前或未来预期的治疗过程。

[0135]对于也给予前药的应用，其它对治疗有效量的确定有影响的因素将会包括，例如给予的前药的量、前药及其相对应活性药物的活性以及前药和活性药物的副作用或毒性。

[0136]CAB质量/对象质量的范围的例子包括，例如从约0.001到30mg/kg体重，从约0.01到25mg/kg体重，从约0.1到20mg/kg体重；和从约1到10mg/g，2到9mg/kg，3到8mg/kg，4到7mg/kg或5到6mg/kg体重。

[0137]在具体的实例中，采用范围在约0.1到20mg/kg体重之间的CAB对对象进行治疗，每周一次，持续约1到10周之间，优选为2到8周之间，优选为约3到7周之间，和优选为持续约4、5或6周。也应理解，在特定治疗过程中，CAB的有效量可能增加或减少，并且治疗将持续直到取得期望的结果或者直到治疗因其它原因而中断，其中所述治疗可以是变化的，也可以是不变的。根据诊断性化验的结果，剂量可以被改变，并且是显而易见的，其中诊断性化验如在此描述的。

[0138]在本发明的一个实施方案中，也将前药给予对象。应该理解，合适的前药剂量依赖于许多因素，这些因素包括在普通的有技术的医师、兽医或研究者的知识领域中。例如，前体药物的单次或多次剂量将依赖于与上述提供的影响CAB有效量的因素相同的因素。示范性的剂量包括：每千克对象或样本重量对应前药的毫克或微克数(如每千克约1微克到每千克约500毫克、每千克约100微克到每千克约5毫克、或每千克约1微克到每千克约50微克)。应进一步理解，前药的适宜剂量依赖于前药相应于期望疗效的效力。当这些前药中的一种或多种要被给予动物(如人)时，医师、兽医或研究者可以，例如在最开始时开相对低剂量的处方，随后增加剂量，直到取得适当的响应。

[0139]优选地，对对象施用CAB，然后施用前药。更优选地，给予CAB和给予前药之间的时间间隔，足以使CAB能够通过与它的靶标结合而聚集在其靶部位，并使未结合的CAB能够从对象身体的非靶部分中被清除。最优选地，当给予前药时，对象身体中与靶结合的CAB和未结合的CAB的比率为最大值或接近最大值。给予CAB之后达到这个程度所需要的时间，被称为“清除时间(clearing time)”。可以在实验系统中对清除时间进行确定或估计，例如通过给予对象可检测的CAB(如放射标记的或荧光标记的CAB)，并在定时的间隔同时测量靶部位和非靶对照部位的酶量。对一些前药，特别是它们所对应的活性药物为高毒性的前药来说，确保对象系统内的未结合CAB低于一定阈值更加重要。这也可以通过实验确定，正如上面所述。

[0140]在一个实施方案中，前药的施用是全身性的。在另一个实施方案中，前药施用于要被结合的标靶处或施用在要被结合的标靶附近。

[0141]药物组合物可以与给药的说明书一同包括在容器、包、分散器(dispenser)或药盒中。

实施例

                        实施例1：scFv的稳定

pME 27.1的构建

[0142]质粒pME 27.1的产生是将Bgl I-EcoRV片段插入表达载体pME25中，其中Bgl I-EcoRV片段编码一部分pelB前导序列、CAB1-scFv和一小部分BLA(参见图6)。编码CAB1-scFv的插入片段是由Aptagen(Herndon，VA)合成的，是基于scFv MFE-23的序列合成的，其中scFv MFE-23的序列在[Boehm，M.K.，A.L.Corper，T.Wan，M.K.Sohi，B.J.Sutton，J.D.Thornton，P.A.Keep，K.A.Chester，R.H.Begent和S.J.Perkins(2000)Biochem J 346 Pt 2，519-28，Crystal structure of theanti-(carcinoembryonic antigen)single-chain Fv antibody MFE-23 and a model forantigen binding based on intermolecular contacts]中有描述。含有合成基因(pPCR-GME1)和pME25的质粒被Bgl I和EcoRV消化，凝胶纯化，用Takara连接酶连接在一起。连接体被转化进入TOP10(Invitrogen，Carlsbad，CA)电感受态细胞，涂平板于含有5mg/l氯霉素和0.1mg/l头孢噻肟的LA培养基上。

质粒pME 27.1含有如下特征：

P lac：	4992-5113bp
		Pel B前导序列：	13-78
CAB 1 scFv：	79-810
		BLA：	811-1896
T7 term：	2076-2122
		CAT：	3253-3912

[0143]质粒pME27.1的示意图可以在图6A中找到。CAB1序列可以在图6B中找到，其中指明了重链和轻链区；氨基酸序列也可以在图6D中找到，具有接头(linker)和BLA。

选择用以进行诱变的突变

[0144]将CAB1-scFv的vH和vL序列的序列与公开的人抗体频率分析(BorisSteipe(1998)Sequenzdatenanalyse.(″Sequence Data Analysis，仅作为德文可得)在Bioanalytik eds.H.Zorbas und F.Lottspeich，Spektrum Akademischer Verlag.S.233-241中)进行了比较。作者将如Kabat数据文库中找到的人抗体的可变区片段的序列进行了比对，并计算每个位置上每种氨基酸出现的频率。这些比对见图8中。具体而言，图8A显示了人重链序列比对中的5种最丰富氨基酸的观察频率的比对情况。图8B显示的是人轻链序列比对中的5种最丰富氨基酸的观察频率的比对情况。

[0145]我们将这些频率与CAB1的实际氨基酸序列相比较，并鉴定出33个满足下面标准的位置：

●该位置不是如Kabat命名法所定义的CDR的一部分。

●在CAB1-scFv中出现的氨基酸在少于10％人抗体的同源位置上被观察到。

●该位置不是scFv的轻链中的最后6个氨基酸中的一个。

得到的33个位置被选择用来进行组合诱变(combinatorial mutagenesis)。

[0146]针对33个位置中的每一个，合成了诱变寡核苷酸，以便使得靶位点将从CAB1-scFv中的氨基酸变成人抗体同源位置的最丰富氨基酸。图6B显示了CAB1-scFv的序列，CDRs和选择用来进行组合诱变的突变。

文库NA05的构建

[0147]表1列出了33个诱变寡核苷酸的序列，其用于产生组合文库NA05：

表1：

pos.(pME27)MFE-23	(VH)	计算要被改变的残基	Quikchange多位点引物
				3K13R14S16T28N29I30K37L40G42E67K68A70F72T76S97N98E136E137N142S144A146M152E153K170F181W	QKPGTFSVAGRFIRKARQSPSVQTYV	nsa147.1fpnsa147.2fpnsa147.3fpnsa147.4fpnsa147.5fpnsa147.6fpnsa147.7fpnsa147.8fpnsa147.9fpnsa147.10fpnsa147.11fpnsa147.12fpnsa147.13fpnsa147.14fpnsa147.15fpnsa147.16fpnsa147.17fpnsa147.18fpnsa147.19fpnsa147.20fpnsa147.21fpnsa147.22fpnsa147.23fpnsa147.24fpnsa147.25fpnsa147.26fp	CGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCCTGGGGCAGAACTTGTGAAATCAGGGACCTCAGTCAAGGGCAGAACTTGTGAGGCCGGGGACCTCAGTCAAGTTAACTTGTGAGGTCAGGGGGCTCAGTCAAGTTGTCCTGGCACAGCTTCTGGCTTCACCATTAAAGACTCCTATATCAGCTTCTGGCTTCAACTTTAAAGACTCCTATATGCACTTCTGGCTTCAACATTAGCGACTCCTATATGCACTGACTCCTATATGCACTGGGTGAGGCAGGGGCCTGAACATGCACTGGTTGAGGCAGGCGCCTGAACAGGGCCTGGAGGTTGAGGCAGGGGCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCCCCGAAGTTCCAGGGCCGTGCCACTTTTACTACAGACGAAGTTCCAGGGCAAGTTCACTTTTACTACAGACACTCCAGGGCAAGGCCACTATTACTACAGACACATCCTCGCAAGGCCACTTTTACTCGCGACACATCCTCCAACACTTACTACAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCACTGCCGTCTATTATTGTGCGGAGGGGACTCCOACTGGCCGTCTATTATTGTAATCGCGGGACTCCGACTGGGCCCTGGCGGTGGCGGATCACAGAATGTGCTCACCCAGTCGCGGTGGCGGATCAGAAAGCGTGCTCACCCAGTCTCCGAAAATGTGCTCACCCAGCCGCCAGCAATCATGTCTGCTGCTCACCCAGTCTCCAAGCATCATGTCTGCATCTCCCCCAGTCTCCAGCAATCGTGTCTGCATCTCCAGGGGATGTCTGCATCTCCAGGGCAGAAGGTCACCATAACCTGCTGCATCTCCAGGGGAGACCGTCACCATAACCTGCAGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCACGCACTTCTCCCAAACTCGTGATTTATAGCACATCCAA

194A200G205Y212M217A219T234A

DKALEDG

nsa147.27fpnsa147.28fpnsa147.29fpnsa147.30fpnsa147.31fpnsa147.32fpnsa147.33fp

TGGCTTCTGGAGTCCCTGATCGCTTCAGTGGCAGTGGCTCGCTTCAGTGGCAGTAAATCTGGGACCTCTTACTCGTGGATCTGGGACCTCTGCGTCTCTCACAATCAGCCGCTCTCACAATCAGCCGACTGGAGGCTGAAGATGCTGCGAATGGAGGCTGAAGATGAAGCCACTTATTACTGCCAAGGCTGAAGATGCTGCCGATTATTACTGCCAGCAAAGACCCACTCACGTTCGGTGGCGGCACCAAGCTGGAGCT

[0148]采用33个诱变引物，使用Quik-Change多位点定向诱变试剂盒(QCMS；Stratagene Catalog #200514)，构建组合物文库NA05。根据模板质粒pME27.1，对引物进行设计，使得它们在感兴趣的密码子每侧侧翼具有17个碱基。运用大肠杆菌(E.coli)密码子选择表，对感兴趣的密码子作出改变，以编码合适的共有氨基酸。所有的引物都设计成与模板DNA的同一链退火(即，在这种情况下都是正向引物)。除了所使用的引物浓度以外，QCMS反应按照QCMS手册中的描述进行；QCMC手册推荐：在反应中每种引物使用50ng，而我们对每种引物使用3ng。也可以使用其它量的引物。具体而言，反应含有50-100ng的模板质粒(pME27.1；5178bp)，1μl引物混合物(10μM所有引物组合起来的储液，含有的每种引物是0.3μM)，1μldNTPs(QCMS试剂盒)，2.5μl 10x QCMS反应缓冲液，18.5μl去离子水(deoinizedwater)和1μl酶混合物(QCMS试剂盒)，总体积是25μl。热循环程序是：1个循环为95℃下持续1分钟；接下来是30个循环，每个循环95℃下1分钟、55℃下1分钟、然后65℃下10分钟。Dpn I消化是通过加入1μl Dpn I(QCMS试剂盒中提供)，在37℃下温育2小时，另外加入1μl Dpn I，并在37℃下再温育2小时。1μl的反应产物被转化入50μl来自Invitrogen的TOP10电感受态细胞(electrocompetent cell)中。电穿孔以后，加入250μl SOC，然后在37℃下进行1个小时的温育，温育过程伴随振荡。随后，10-50μl的转化混合物涂平板于具有5ppm氯霉素(CMP)的LA平板上或具有5ppm CMP和0.1ppm头孢噻肟(CTX)的LA平板上，以选择出活性BLA克隆。来自CMP+CTX平板的活性BLA克隆用于筛选，而来自CMP平板的随机文库克隆被测序，用以评估文库的质量。

[0149]16个随机选择的克隆被测序。这些克隆含有1到7个突变的不同组合。

对改进型表达的筛选

[0150]当TOP10/pME 27.1在LB培养基中、于37℃下被培养时，完好的融合蛋白在1天后达到峰值，大部分融合蛋白在培养三天之后被宿主蛋白酶降解。降解似乎主要发生于CAB1融合蛋白的scFv部分，这是因为培养物在3之后含有相当数量的自由BLA，这可以使用Western印迹法(Western blotting)或头孢硝噻(nitrocefin)(Oxoid，New York)活性试验来检测。从而，我们对文库NA05进行了筛选，该筛选能够检测CAB1-scFv的变异体，所述变异体可以在超过3天的37℃培养中对抗宿主蛋白酶的降解。

[0151]将文库NA05涂于LA培养基的琼脂平板上，该LA培养基含有5mg/l氯霉素和0.1mg/l头孢噻肟(Sigma)。将910个菌落转移进总共10个的96-孔板中，其含有100μl/孔的LA培养基，所述LA培养基含有5mg/l氯霉素和0.1mg/l头孢噻肟。每个板上有四个孔接种TOP10/pME 27.1作为对照，每个板有一个孔留为空白。在37℃下，将板培养过夜。第二天，培养物被用来接种新鲜平板(生产平板(productionplate))，其含有100μl的相同培养基，接种使用的是转移盖印工具，甘油被加入到主平板中，贮藏于-70℃下。生产平板在加湿摇床中、于37℃下培养3天。向生产平板的每孔中加入100μl BPER(Pierce，Rockford，IL)，用以将蛋白质从细胞中释放出来。将生产平板以PBST(含有0.125％Tween-20的PBS)稀释100倍，对BLA活性进行测量：是通过将20μl稀释的裂解产物转移到180μl头孢硝噻(nitrocephin)分析缓冲液中，(0.1mg/ml头孢硝噻(nitrocephin)，溶解在50mM PBS缓冲液中，其含有0.125％的辛基吡喃葡萄糖苷(octylglucopyranoside)(Sigma))，并使用Spectramax增强平板读数计(Spectramax plus plate reader)(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)，在490nm下对BLA活性进行测定。

[0152]使用如下程序，测量与CEA(癌胚抗原，Biodesign Intl.，Saco，Maine)的结合作用：将96孔板进行包被，每孔以100μl的含有5μg/ml CEA的50mM碳酸盐缓冲液pH9.6过夜包被。用PBST对板进行洗涤，以300μl的酪蛋白(Pierce，Rockford，IL)封闭1-2小时。从稀释100-1000倍的生产平板取出100μl样品，加入到CEA包被的平板上，并将平板在室温下放置2小时。随后，用PBST将板洗涤4次，并加入200μl头孢硝噻(nitrocefin)分析缓冲液，按照上面的描述测量BLA活性。

[0153]通过CEA结合作用分析，测定了BLA活性，并且对裂解产物平板中的总体BLA活性进行比较，并鉴定出显示高水平总体BLA活性和高水平CEA结合活性的变异体。

[0154]以四个重复实验，使用相似的实验方案，对优胜者进行确认：将优胜者在2ml含有5mg/l氯霉素和0.1mg/l头孢噻肟的LB中培养3天。使用BPER试剂将蛋白质从细胞中释放出来。如上面的叙述进行结合作用分析；但对每个变异体，测试培养物裂解物的不同稀释度。图7A显示了结合作用曲线。也通过SDS聚丙烯酰胺电泳对培养物上清液进行了分析。图7B显示来自NA05的7个变异体的电泳图。标出了变异体NA05.6的融合蛋白带。表2显示6个变异体的等级。对数据进行了标准化，并计算了性能指数(performance index)。数据清楚地显示出：相较于融合构建物pME27.1，NA05.6产生出数量显著较大的融合蛋白。

表2 显示在稳定性方面具有最大改进的6个变异体的序列

克隆	突变
		NA05.6	R13K，T16G，W181V
NA05.8	R13K，F170Y，A234G
		NA05.9	K3Q，S14P，L37V，E42G，E136Q，M146V，W181V，A234G
NA05.10	K3Q，L37V，P170Y，W181V
		NA05.12	K3Q，S14P，L37V，M146V
NA05.15	M146V，F170Y，A194D

文库NA06的构建

[0155]克隆NA05.6被选作最好的变异体，并被用作第二轮组合诱变的模板；克隆NA05.6被叫做CAB1.1。用来产生文库NA05，以便产生组合变异体的相同诱变引物的亚集合被予以使用，所述组合变异体具有下面突变：K3Q，L37V，E42G，E136Q，M146V，F170Y，A194D，A234G；所述突变在来自NA05的其它优胜者中已经被鉴定出来。编码突变S14P的引物并没有被使用，因为它的序列与NA05.6(CAB1.1)中出现的突变R13K和T16G重叠。如上所述，使用QuikChangeMultisite构建组合文库，并将其称为NA06。模板是pNA05.6，并使用1μl的引物混合物(10μM储液，由所有引物组合而成，每种引物为1.25μM)。

文库NA06的筛选

[0156]筛选按照上面的叙述进行，具有如下的修改：在3块96孔板上，筛选291个变异体。将来自裂解液平板的10μl样品加到180μl含有10μl/ml嗜热菌蛋白酶(Sigma)的50mM咪唑缓冲液中，所述缓冲液pH 7.0，含有0.005％Tween-20和10mM氯化钙。该混合物在37℃下温育1小时，以水解NA05.6(CAB 1.1)的不稳定变异体。该经过蛋白酶处理的样品被用来进行CEA结合实验，如上面所述。

[0157]在2ml培养基中，对有希望的变异体进行培养，如上面描述的，并取得了嗜热菌蛋白酶处理后的样品的结合曲线。图7C显示选定克隆的结合曲线。在嗜热菌蛋白酶温育以后，许多变异体保持了比母本NA05.6(CAB 1.1)大得多的结合能力。

表3 显示比NA05.6(CAB 1.1)抗蛋白酶能力显著较大的6个变异体：

克隆	突变
		NA06.2	R13K，T16G，W181V，L37V，E42G，A194D
NA06.4	R13K，T16G，W181V，L37V，M146V
		NA06.6	R13K，T16G，W181V，L37V，M146V，K3Q
NA06.10	R13K，T16G，W181V，L37V，M146V，A194D
		NA06.11	R13K，T16G，W181V，L37V，K3Q，A194D
NA06.12	R13K，T16G，W181V，L37V，E136Q

[0158]所有的6个变异体都具有突变L37V；该突变在从相同文库中随机选出的克隆中是少见的。进一步的测试显示，在所有变异体中，变异体NA06.6具有最高水平的总BLA活性和最高水平的抗蛋白酶抗性。选定NA06.6，并称为CAB1.2。

           实施例2：生成具有pH依赖性结合作用的scFv

选择诱变的位置

[0159]根据相近同源物MFE-23的公开的晶体结构[Boehm，M.K.，A.L.Corper，T.Wan，M.K.Sohi，B.J.Sutton，J.D.Thornton，P.A.Keep，K.A.Chester，R.H.Begent和S.J.Perkins(2000)Biochem J 346Pt 2，519-28，Crystal structure of theanti-(carcinoembryonic antigen)single-chain Fv antibody MFE-23 and a model forantigen binding based on intermolecular contacts]，构建了NA06.6(CAB 1.2)的scFv部分的3D结构模型，使用的是软件包MOE(Chemical Computing Group，Montreal，Canada)并且使用默认参数。结构的空间填充模型可以用肉眼检查。CDRs的侧链按下述评级：0＝掩埋的，1＝部分暴露的，和2＝完全暴露的。侧链与CDR3的距离按下述评级：0＝侧链是在CDR3内，1＝侧链离开CDR3的距离为1个氨基酸，和2＝侧链远离CDR3的距离为2个氨基酸。在少数情况下，如果CDR侧翼的残基满足距离和暴露标准的话，它们也被包括在内。

[0160]根据这个评级，下面的侧链被作为诱变的目标：

a)暴露＝2 并且 距离＝2或更小

b)暴露＝1 并且 距离＜2

CDR中40个位点符合这些标准。

[0161]图10显示了CDRs和被选择进行诱变的残基。

[0162]表4显示被选择进行诱变的40个位点的标准和位置。

文库NA08的构建

[0163]构建了组合文库，其中40个选定的部位被随机地以天冬氨酸或组氨酸替换。选择这个取代是因为已有报道，组氨酸侧链和羰基基团之间的离子相互作用形成IgG分子和Fc受体间相互作用的pH依赖性的结构基础[Vaughn，D.E.和P.J.Bjorkman(1998)Structure 6，63-73.，Structural basis of pH-dependent antibody bindingby the neonatal Fc receptor]。

[0164]使用QuickChange多位点定向诱变试剂盒(QCMS；Stratagene Catalog#200514)构建组合文库NA08，其中使用40种诱变引物。对引物进行设计，使得它们在感兴趣的密码子的每侧具有17个碱基，是根据模板质粒NA06.6(CAB 1.2)进行。感兴趣的密码子被变成简并密码子SAT，以编码天冬氨酸和组氨酸。所有的引物都被设计成与相同的模板DNA链退火(即这种情况下，均为正向引物)。除了所用的引物浓度以外，QCMS反应是按照QCMS手册的描述进行；手册推荐在反应中每种引物使用50-100ng，而在这个文库中使用的每种引物的量显著较低，因为这使得母体模板的背景较低。具体而言，所有引物合起来使用0.4μM。在最终反应中，单个简并引物浓度为0.01μM(约2.5ng)。

[0165]QCMS反应物含有50-100ng的模板质粒(NA06.6，5178bp)，1μl的引物混合物(所有引物的10μM储液，目的在于给出上述提到的期望引物浓度)，1μl dNTP(QCMS试剂盒)，2.5μl 10x QCMS反应缓冲液，18.5μl去离子水，1μl酶混合物(QCMS试剂盒)，总体积是25μl。热循环程序是1个循环为95℃下持续1分钟，接下来是30个循环，每个循环是95℃下1分钟、55℃下1分钟、65℃下10分钟。Dpn I的消化是通过加入1μl Dpn I(QCMS试剂盒中提供)，在37℃下温育2小时，另外加入0.5μl Dpn I并在37℃下再温育2小时。1μl的每种反应产物被转化进入50μl来自Invitrogen的TOP10电感受态细胞(electrocompetent cell)中。电穿孔以后，加入250μl SOC，然后进行1个小时的37℃下的温育，温育过程伴随振荡。随后，10-50μl的转化混合物涂于具有5ppm氯霉素(CMP)的LA平板上或具有5ppm CMP和0.1ppm头孢噻肟(CTX)的LA平板上，以选择活性BLA克隆。在两种平板类型上取得的菌落数目是相当的(以10μl转化混合物涂平板，CMP板上有652个菌落，CMP+CTX板上有596个菌落)。来自CMP+CTX平板的活性BLA克隆被用于筛选，而来自CMP平板的随机文库克隆被测序，用以评估文库的质量。

[0166]反应的引物如表4所示：

表4 CDRs的引物：

残基	CDRs	位置暴露	到CDR3的距离	引物序列
					KDSYHWDENDTEPKQEGTPTGPYSSVS	H1H1H1H1H2H2H2H2H2H2H2H2H2H2H3H3H3H3H3H3L1L1L1L1	3031323335505254555758596263659899100101102103104106162163164165	221212222212222112222222212	2 cttctggcttcaacattsatgactcctatatgcactg1 ctggcttcaacattaaasattcctatatgcactgggt1 gcttcaacattaaagacsattatatgcactgggtgag1 tcaacattaaagactccsatatgcactgggtgaggca1 ttaaagactcctatatgsattgggtgaggcaggggcc1 gcctggagtggattggasatattgatcctgagaatgg2 agtggattggatggattsatcctgagaatggtgatac2 ttggatggattgatcctsataatggtgatactgaata2 gatggattgatcctgagsatggtgatactgaatatgc1 ttgatcctgagaatggtsatactgaatatgccccgaa1 atcctgagaatggtgatsatgaatatgccccgaagtt1 ctgagaatggtgatactsattatgccccgaagttcca1 gtgatactgaatatgccsataagttccagggcaaggc3 atactgaatatgccccgsatttccagggcaaggccac2 aatatgccccgaagttcsatggcaaggccacttttac0 ccgtctattattgtaatsatgggactccgactgggcc0 tctattattgtaatgagsatactccgactgggccgta0 attattgtaatgaggggsatccgactgggccgtacta0 attgtaatgaggggactsatactgggccgtactactt0 gtaatgaggggactccgsatgggccgtactactttga0 atgaggggactccgactsatccgtactactttgacta0 aggggactccgactgggsattactactttgactactg0 ctccgactgggccgtacsattttgactactggggcca2 taacctgcagtgccagcsatagtgtaagttacatgca1 cctgcagtgccagctcasatgtaagttacatgcactg1 gcagtgccagctcaagtsatagttacatgcactggtt1 gtgccagctcaagtgtasattacatgcactggttcca

残基	CDRs	位置暴露	到CDR3的距离	引物序列
					YYSTSNASRSSYL	L1L2L2L2L2L2L2L3L3L3L3L3	166183184185186187189190225226227228230	2121221222111	1 ccagctcaagtgtaagtsatatgcactggttccagca0 ctcccaaactcgtgattsatagcacatccaacctggc0 ccaaactcgtgatttatsatacatccaacctggcttc1 aactcgtgatttatagcsattccaacctggcttctgg2 tcgtgatttatagcacasataacctggcttctggagt1 tgatttatagcacatccsatctggcttctggagtccc1 atagcacatccaacctgsattctggagtccctgctcg1 gcacatccaacctggctsatggagtccctgctcgctt2 cttattactgccagcaasattctagttacccactcac2 attactgccagcaaagasatagttacccactcacgt2 actgccagcaaagatctsattacccactcacgttcg2 gccagcaaagatctagtsatccactcacgttcggtg2 aaagatctagttacccasatacgttcggtgctggcac

变异体的测序

[0167]变异体在含有5ppm CMP的LA培养物中、在37℃下被摇动培养过夜。使用Qiagen试剂盒少量制备DNA，并且用M13反向引物和nsa 154f引物对每个克隆中的BLA基因进行测序。

M13反向：CAGGAAACAGCTATGAC

nsa 154f：GGACCACGGTCACCGTCTCCTC

筛选pH依赖的结合

[0168]将文库NA08涂于具有LA培养基的琼脂平板上，含有5mg/l氯霉素和0.1mg/l头孢噻肟(Sigma)。将552个菌落移进总共6个的96孔板中，其含有100μl/孔的LA培养基，所述LA培养基含有5mg/l氯霉素和0.1mg/l头孢噻肟。每个板上有四个孔接种TOP10/NA06.6作为参照。在37℃下将板培养过夜。第二天，培养物被用来接种新平板(生产平板)，其含有100μl的相同培养基，接种使用的是转移盖印工具(transfer stamping tool)，在主平板中加入甘油，贮藏于-70℃下。生产平板在加湿摇动器中，37℃下培养2天。向生产平板，以每孔加入100μl BPER(Pierce，Rockford，IL)，用以将蛋白质从细胞中释放出来。将生产平板用PBST(含有0.125％Tween-20的PBS)稀释100倍，BLA活性的测量如上所述。

[0169]使用如下方法测量与CEA(癌胚抗原，Biodesign Intl.，Saco，Maine)的结合：将96孔板以每孔100μl的含有5μg/ml CEA的50mM pH9.6的碳酸盐缓冲液包被过夜。以PBST对板进行冲洗，以300μl的酪蛋白(Pierce，Rockford，IL)进行1-2小时的封闭。将生产平板稀释100-1000倍，取出100μl样品加入CEA包被的平板中，并在室温下放置2小时。随后，用PBST将板洗涤4次，并加入200μl头孢硝噻(nitrocefin)分析缓冲液，如上所述测量BLA活性。在pH6.5的50mM磷酸缓冲液中对CEA结合作用进行测定；并在单独的实验中，在pH7.4的50mM磷酸缓冲液中对其进行测定。

[0170]通过CEA结合分析在pH 6.5和pH 7.4下测定BLA活性，然后将裂解物平板中发现的总BLA活性进行比较，并鉴定pH 6.5下显示出对CEA有良好结合性、但在pH 6.5下结合性显著变弱的变异体。对pH 6.5下和pH 7.4下的结合性进行比较，比较示于图9中。

[0171]对优胜者的确认是通过将它们在5ml的含有5mg/l氯霉素和0.1mg/l头孢噻肟(Sigma)的LB培养基中、在37℃下培养2天。随后，对培养物进行离心，将沉淀物悬浮于375μl的BPER试剂中，以释放融合蛋白。BLA活性按照上面的描述进行测定。1单位活性被定义为能够引起吸光度每分钟增加1mOD的BLA量。根据样品的BLA活性总量将其稀释，根据上面的叙述进行CEA结合分析，但在每个孔中加入不同的样品稀释液。

[0172]可以取得每个样品的结合曲线，反映出变异体与CEA的亲和力。图11显示pH 7.4和pH 6.5下测得的几个感兴趣的变异体的CEA结合曲线。所有的5个变异体显示出CEA结合的pH依赖性的增加。鉴于母本NA06.6在pH 6.5下结合性相比pH 7.4下仅仅好一点，一些变异体在pH 6.5下显示出比pH 7.4下强得多的CEA结合性。变异体NA08.15在pH 7.4下显示出非常弱的结合于CEA的能力，但在pH 6.5下结合性显著；该变异体被称为CAB 1.4。

[0173]下面的表5，显示具有最大结合改进的变异体中的突变。

              表5

克隆	突变
		NA08.1	W50H，Y166A
NA08.3	S190D，S226D
		NA08.4	S190D，T100D
NA08.9	Y166A
		NA08.12	T102H，Y166A，S226D
NA08.13	Q65H，S184D，S226D
		NA08.14	P101D

NA08.15	S184D，S226D
		NA08.17	S184D，W50H
NA08.24	T102D，S226D
		NA08.45	T102D，Y166A
NA08.51	P104H，Y166A
		NA08.64	Q65D，Y166A

实施例3：从CAB 1.4诱变得到CAB 1.6

[0174]对CAB 1.4重链的CDR3中的T100部位的密码子进行饱和诱变。对位点饱和诱变，设计了互补寡核苷酸(oligo)：

ME 239 F：ATTATTGTAATGAGGGGNNSCCGACTGGGCCGTACTA

ME 239 R：TAGTACGGCCCAGTCGGSNNCCCCTCATTACAATAAT，

使得简并密码子(NNS)对应于T100，它两侧各有17个与CAB1.4同源的碱基对。寡核苷酸对(oligo pair)被用来进行QuickChange(Stratagene)反应，使用CAB1.4DNA作为模板，根据生产厂商建议的实验方案进行。PCR循环之后，用Dpn I消化反应混合物，使用1μl转化50μl的Invitrogen TOP10电感受态细胞。将转化物涂在LA+5ppm CMP+0.1ppm CTX平板上，以选择携带选择性标记并在突变后仍然生产活性BLA的克隆。然后平板被用于挑出克隆，进行筛选。筛选过后，选出具有T100L突变(ACT-CTC)的克隆ME184.1(＝CAB1.6)，进行进一步的优化。

实施例4：诱变CAB1.6得到SW149.5

[0175]用常规的QuikChange诱变方案(Stratagene)，使用质粒pME 184.1作为模板，制得针对CAB1.6分子H3CDR的10个氨基酸残基(G99，P101-Y109)的10个个体位点饱和小型文库(mini-library)。对改进的亲和性进行筛选以后，分离来自小型文库SW129的克隆pSW129.5和来自小型文库SW134的克隆pSW134.1。克隆pSW129.5从引物ME270F和ME270R新得到了突变T102L，如下面显示的。克隆pSW134.1从ME275F和ME275R得到了新突变F107N，如下面显示的。克隆pSW129.5被用作进一步诱变的模板并用来分离克隆pSW149.5，如下所述。

[0176]在这个筛选中，也鉴定出P104和Y105部位的几个突变。为了将这些突变以及克隆pSW134.1的F107N突变组合到pSW129.5骨架中，使用引物SW133F和SW133R，使用pSW129.5作为模板建立一个有限随机化文库(limited randomizedlibrary)。随后，基于改进的表达和亲和力，选择了克隆pSW149.5。

[0177]使用了下面的引物，如上所述：

ME270F    GTAATGAGGGGCTGCCGNNSGGGCCGTACTACTTTGA

ME270R    TCAAAGTAGTACGGCCCSNNCGGCAGCCCCTCATTAC

ME275F    CGACTGGGCCGTACTACNNSGACTACTGGGGCCAAGG

ME275R    CCTTGGCCCCAGTAGTCSNNGTAGTACGGCCCAGTCG

SW133F    GAGGGGCTCCCGCTCGGGRVCNTTTACAACGACTACTGGGGCCAAGG

SW133R    CCTTGGCCCCAGTAGTCGTTGTAAANGBYCCCGAGCGGGAGCCCCTC

实施例5：诱变SW149.5得到CAB 1.7

[0178]利用几种简并引物，实现H2、L1和L2 CDR的几个氨基酸残基的有限随机化。选作靶标进行有限随机化的残基是：H2 CDR中的D57，T58，P62，Q65；L1 CDR中的S163，S165和S166；以及L2 CDR中的S186和S190。对这些变异体进行筛选，使得可以鉴定出蛋白上的、可能进一步改善蛋白与CEA的结合性的部位。使用引物SW134FP、SW135FP、SW136FP、SW137FP和SW138FP，使用QuikChange多位点诱变试剂盒(Stratagene)，按照制造商推荐的方法，制备了文库SW155。对得到的文库进行筛选，选出最佳的变异体，即克隆pSW155.17，这是因为它显示出了显著改善的结合CEA的能力；该克隆被命名为CAB1.7。

使用下面的引物制备文库SW155：

SW134FP    [Phosp]CTTCTGGCTTCAACATTACCGACTCCTATATGCACTG

SW135FP    [Phosp]GCCTGGAGTGGATTGGATTATTGATCCTGAGAATG

SW136FP    [Phosp]GATCCTGAGAATGGTSWTRCTGAATATGCCCBGAAGTTCRNCGGCAAGGCCACTTTTAC

SW137FP    [Phosp]CTGCAGTGCCAGCTCADCTGTAYMTDCCATGCACTGGTTCCAGC

SW138FP    [Phosp]CGTGATTTATGATACARVCAACCTGGCTRSTGGAGTCCCTGCTCGCTTC

实施例6：制备CAB1.6i和CAB1.7i

[0179]图12显示CAB1.6i和CAB1.7i的开发，并表明了在该过程中并入的突变。

[0180]为了对多种CAB1变异体的靶标结合性质进行比较，我们对如上提供的含有相应表达质粒的5ml TOP10F’培养物进行培养，所述培养是在含有5mg/l氯霉素LB培养基中、在25℃下、培养3天。将培养物进行离心，丢弃所得到的上清液。细胞沉淀物重新悬浮于500μL B-PER试剂中。将其温育30分钟。使用头孢硝噻(nitrocephin)作为底物，对每个样品中的内酰胺酶浓度进行测定，如上所提供的那样。

[0181]在50mM磷酸盐缓冲液中，在pH6.5和pH7.4下，研究了样品与包被有CEA的微量滴定板的结合，如上面所提供的那样。结合曲线在图13中示出。

[0182]在相似的实验中，对变异体结合LS174T细胞的能力进行了测定。将LS174T细胞接种于96孔聚苯乙烯板的培养基中，以1×10⁵细胞/孔进行接种，其中培养基含有70％ DMEM，30％ F12，非必需氨基酸，L-Glut和丙酮酸钠(SodiumPyruvate)(均来自Mediatech)。将板在加湿的CO2培养箱中，于37℃下，培养20小时。然后，以含有4％甲醛的PBS(Polysciences，Warrington，PA)固定细胞。以PBST对板进行洗涤，并在每孔中加入1mg/ml NaBH4(Sigma)，用以猝灭任何反应性基团。然后再用PBST对板进行洗涤。然后继续进行与CAB分子的结合，其方式和结合到CEA抗原上相同。

[0183]图14显示CAB1.2、CAB1.4、CAB1.6和CAB1.6结合LS174T细胞的结合曲线。CAB1.7在pH6.5下的结合亲和力与CAB1.2在相同pH下的结合曲线近似。不同的是，pH 7.4下的结合曲线显示出显著的差异。在pH 7.4下，CAB1.7显示出：相比CAB1.2，与肿瘤细胞的结合显著较弱。令人惊讶的是，CAB1.7结合曲线达到饱和水平，该饱和水平也是pH依赖的。这暗示着，相对于在pH 7.4下而言，饱和时，在pH 6.5下更多的CAB1.7分子可以结合到肿瘤细胞上。

实施例7：BLA的表位去除

[0184]在β-内酰胺酶的序列上进行i-mune分析(免疫鉴定分析)，按照(提交于4/15/98的美国专利申请序列号09/060,872)的描述进行。Human population-basedidentification of CD4+T-cell peptide epitope determinants(CD4+T-细胞肽表位决定簇的基于人群体的鉴定)(Journal of Immunological Methods，281：95-108)。使用69个社区供体外周血细胞样品(community donor peripheral blood cell samples)。鉴定出4个CD4+T细胞表位。对每个表位肽序列，进行关键残基检测(criticalresidue testing)。关键残基检测包括针对肽序列的丙氨酸扫描，以及由功能和结构限制指导的特定氨基酸修饰。将增殖水平减少到背景水平的肽表位序列，被选出并整合进入β-内酰胺酶的酶序列的DNA构建物中。修饰的酶蛋白变异体被表达和纯化，然后采用人外周血细胞，体外检测它们诱导细胞增殖的能力。诱导出最低水平的体外细胞增殖的变异体被选择出来，以便包括进CAB1.6和CAB1.7中。

实施例8：CAB1.6i和CAB1.7i的构建

[0185]如下所述，对质粒pME184(CAB1.6)和pSW155.17(CAB1.7)中的BLA基因进行突变，用以引入去免疫化的BLA(＝BLAi)基因，所述BLA基因含有去除K265A和S568A突变的表位。使用引物HR016F和HR017F，应用QuikChange Multisite诱变试剂盒(Stratagene)，按照厂商推荐的方法，将两个突变整合进入pME184.1(CAB1.6)中，得到质粒pSW175.3(CAB1.6i)。为了构建质粒pSW169.3(CAB1.7i)，将质粒pSW155.17中的BLA基因的0.9-kb Nru I片段与来自质粒pCD1.1的另一个0.9-kbNru I片段交换，其中来自pCD1.1的片段含有两个突变。

下面的引物被使用：

HR016F    [Phosp]GATTACCCCGCTGATGGCGGCCCAGTCTGTTCCAG

HR017F    [Phosp]CTACTGGCGGGTTTGGCGCGTACGTGGCCTTTATTCCTG

实施例9：CAB1.11i和CAB1.13i在带有T1918肿瘤的无胸腺小鼠中的药物动力学和组织分布

[0186]表6概括描述了研究方案设计。将来自Taconic Labs的50只雌性小鼠，18-22g，约6-8周龄，植入源自于肿瘤的T1918细胞；是以皮下注射悬于DMEM培养基中的5×10⁷细胞/mL的T1918细胞进行。通过吸入异氟烷麻醉动物，并通过皮下注射100μL细胞悬液植入细胞(约5×10⁶细胞/小鼠)。

                                   表6 研究设计

组别	数目(N)/性别	检测物	剂量(mg/kg)	浓度(Conc.)(mg/mL)	剂量体积(mL/kg)	时间点(小时)	组织
								1	3/F	无	0	--	--	0	血浆、肿瘤、肝和肾
2	12/F	CAB1.11i	0.25	0.05	5	6，12，24和48
							3	12/F	CAB1.11i	1	0.2	5
4	12/F	CAB1.13i	1	0.2	5

[0187]植入肿瘤以后，至少每天对动物进行观察，对濒死的和痛苦的动物实施无痛致死术。每周对肿瘤测量两次。

[0188]当肿瘤达到约≥250mm³时，根据肿瘤大小和生长速率选择出39个动物，并随机分成4组。对第1组的三只小鼠不进行给药，对第2组—第4组的每组12只动物，以单次IV推注给予CAB1.11i或CAB1.13i(1mg/kg)。用PBS将CAB1.11i和CAB1.13i分别配成0.05mg/mL和/或0.2mg/mL，并在60分钟内注射。注射量是约100μL/小鼠，经由尾静脉给药。

[0189]在剂量给药的那天称重小鼠；并且，剂量基于所有动物的平均重量。用热灯和加热垫温暖小鼠，并将其置于限制器(restrainer)中。用70％的酒精擦拭尾巴，并经由尾静脉、以快速静脉注射给予剂量。在剂量给药后的6小时、12小时、24小时和48小时时，用异氟烷(isoflourane)对每组中三个动物进行麻醉，并通过心脏穿刺将血液收集到EDTA中。对血液样本，在收集的20分钟之内进行离心，并收集血浆组分，冷冻在-70℃的冷冻器中。

[0190]在CAB给予后的6小时、12小时、24小时和48小时时，对来自每组的3个动物进行麻醉，以收集血浆、肿瘤、肝和肾，并分析CAB浓度。从所有的动物收集肝、肾和肿瘤，进行冲洗、吸干、称重并在液氮中速冻。对于来自对照组的血液和组织样本，仅在基线(baseline)处予以收集。组织样本在冰上的PBS中被匀浆化，PBS带有15μg/mL抑肽酶(2mL缓冲液：克组织)。将匀浆与B-PER混合(1∶1)，并予以离心。通过使用头孢硝噻(nitrocefin)分析测量BLA活性，从而对组织上清液和血浆样品中的CAB浓度予以确定，如上面所提供的。

[0191]结果如图16中所示。

实施例10：LS174T SCID模型中、在CAB1.2给药24小时后的时刻给予的C-Mel或戊二酰-C-Mel的抗肿瘤活性

[0192]对雌性CB17-SCID小鼠(7-9周龄，Taconic Labs)，使用悬于100微升体积的无血清DMEM中的2×10⁶个LS174T细胞，进行皮下激发(Medimmune ACUCprotocol#ACF 037)。当平均皮下(subcutaneous(SC))肿瘤体积约为100-150mm³时，将动物随机分配成治疗组。没有可检测肿瘤或肿瘤过大(体积＞300mm³)的动物被排除出去。根据研究方案设计(表7)，以剂量方式，将CAB1.2和/或前药给予动物。

A.表7研究方案设计
								组别	N/性别	ROA	CAB1.2剂量	前药	剂量	TOA前药	观察
1	10F	-	-	未治疗	-	-	体重：每周肿瘤测量2x/周笼边观察：每天，周末除外
								2	10F	IV	-	戊二酰-C-Mel	150mg/kg	24小时
								4	10F	IV	1mg/kgLot No.	C-Mel	150mg/kg	24小时
5	10F	IV	1mg/kgLot No.	戊二酰-C-Mel	150mg/kg	24小时
								6	10F	IV	1mg/kg	戊二酰-C-Mel	75mg/kg	24小时

                          1.剂量给药溶液的制备

[0193]C-Mel是如下配制的：将冷冻贮存于-70℃下的、100mg/mL的溶解在DMSO中的C-Mel储备溶液解冻，立即加到1.0M碳酸氢钠(Na bicarbonate)中，以C-Mel：1.0M NaHCO₃的比例(V/V)为3.5∶1进行添加，涡旋混合(vortexed)，在5％蔗糖水溶液中稀释至终浓度为15mg/ml，经由0.2微米过滤器装置过滤除菌，并置于冰浴中直至使用。

[0194]戊二酰-C-Mel是如下配制的：对药物进行称量并溶于3.0当量(eq)的1.0M NaHCO₃中。用涡旋混合器(vortex)将溶液混合均匀，并以5％蔗糖水溶液稀释到30mg/mL的终浓度。将溶液以PBS进一步稀释到20mg/mL，并置于冰袋上保存，直至施用。

[0195]荷瘤的动物被给予100微升的配制在PBS中的CAB1.2，剂量为1mg/kg，经由尾静脉单次IV快速注射。在CAB1.2给药后24小时时，根据研究方案设计，对动物通过单次IV快速注射给予C-Mel或戊二酰-C-Mel，给药量为75mg/kg或150mg/kg。

[0196]通过每天的观察和每周一次的体重测定，对毒性进行监测。每周两次对肿瘤进行测量。平均肿瘤体积超过2000mm³的治疗组被无痛处死，肿瘤过大和/或坏死的个体动物被无痛处死。如果研究中剩下的动物少于6个，将治疗组无痛处死，除非欲监测获得针对肿瘤再生长的完全响应(complete response)的个体动物。收集数据，所有治疗组的中值肿瘤体积被确定±SEM，并绘制成图，用以进行分析(肿瘤激发之后的天数对肿瘤体积)。

[0197]肿瘤应答如图17所示，其中x轴是以天为单位的时间，y轴是以mm³为单位测量的肿瘤体积。

[0198]图18显示毒性-存活。x轴显示以天为单位的时间，y轴显示活小鼠的整数数目。

[0199]图19显示毒性-体重。x轴显示以天为单位的时间，y轴显示体重百分数。

实施例11：在T-LS-174-T肿瘤荷瘤无胸腺小鼠中、给予CAB1.2之后的戊二酰-C-Mel-L-Phe-NH2的功效和毒性

[0200]研究方案设计如表8所示。来自Taconic Labs的40只18-22g的雌性Ncr小鼠，被植入源于肿瘤的TLS174T细胞，植入是通过皮下注射、以2×10⁷细胞/mL悬于DMEM中的细胞进行。动物通过异氟烷吸入法被麻醉，细胞的植入是通过皮下注射100μL细胞悬液(约2×10⁶个细胞/小鼠)进行。

                              表8.研究方案设计

组别	N/性别	CAB1.2i剂量(mg/kg)	戊二酰-C-Mel-L-Phe-NH2剂量(mg/kg)	给药CAB之后的时间	观察
						1	5/F	0	0	NA	体重：第1天，第～4天和第8天笼边观察：每天肿瘤测量：每周2次
2	5/F	1	50	24
					3	5/F	1	100	24
4	5/F	1	100	24和48

[0201]储备溶液是这样制备的：在带有螺旋帽的无菌聚苯乙烯试管中，将戊二酰-C-Mel-L-Phe-NH2溶解在DMSO中，浓度为100mg/mL。用无菌过滤的NaHCO₃(1M)对储备溶液进行稀释，达到碳酸氢盐比药物的摩尔比为3∶1，并用涡旋混合器(vortex mixer)混合均匀。以5％(w/v)无菌蔗糖溶液将溶液稀释到10mg/mL，得到10％的DMSO浓度。储备溶液的制备是在稀释的24小时之内，经过稀释的物质是在制备的60分钟之内予以施用。

[0202]当肿瘤达到约≥250mm³时，根据肿瘤大小和生长速率选择出20个动物，并编制成4组。每组5只小鼠，不进行给药；或者给予CAB1.2i(1mg/kg)，然后在CAB给药后24小时时给予单次剂量的戊二酰-C-Mel-L-Phe-NH2(50或100mg/kg)；或者在CAB给药后的24小时和48小时时给予两次剂量的戊二酰-C-Mel-L-Phe-NH2(100mg/kg)。CAB配制成0.2mg/mL，戊二酰-C-Mel-L-Phe-NH2配制成10mg/mL，如表9所规定。

                 表9 测试物的浓度和剂量体积

测试物	配制的浓度(mg/mL)	剂量体积(mg/kg)
			CAB1.2i	0.2	5
戊二酰-C-Mel-L-Phe-NH2	10	10

[0203]所有的测试物品都在稀释和配制的60分钟内注射。经由尾静脉给药，注射量为约100μL/小鼠(CAB1.2i)或200μL/小鼠(戊二酰-C-Mel-L-Phe-NH2)。

[0204]当肿瘤达到≥250mm³，将动物编制成组。在给药的那天(第1天)对小鼠进行称重，并且剂量以全部动物的平均体重为基础。用热灯和加热垫温暖小鼠，并将其置于限制器(restrainer)中。用70％的酒精擦拭尾巴，并经由尾静脉快速静脉注射给予剂量。

[0205]在第8天和中间的一天，对后来的体重进行测量，其中中间的一天取决于时间安排(第4天或第5天)。对动物进行笼边(cage side)观察，观察毒性体征和症状。处死濒死的或痛苦的小鼠，并对其尸体进行解剖。尸体解剖在任何动物被发现死亡的2小时内进行。在第8天，通过CO₂吸入对所有动物进行无痛处死，并进行尸体解剖。所有动物的肾和肿瘤，以及任何异常的组织或器官，都在尸体解剖的当时，用福尔马林进行固定，用于组织病理学。

[0206]每周对肿瘤测量2次，持续45天。平均肿瘤体积超过2000mm³的治疗组被无痛处死，肿瘤过大和/或坏死的个体动物被无痛处死。在第45天，所有剩下的动物通过吸入CO₂无痛处死。

实施例12：在SCID小鼠的LS184T人直肠结肠模型中的CAB1.2的抗肿瘤活性

[0207]用悬浮于体积为100微升的无血清DMEM中的2×10⁶ LS174T细胞，对雌性CB17-SCID小鼠(8-10周龄，Taconic Labs)，进行皮下(SC)激发(MedimmuneACUCprotocol#ACF 037)。当中值肿瘤体积约为100-150mm³时，将动物随机地分类成治疗组。无可检测肿瘤的动物和肿瘤过大(体积＞300mm³)的动物被排除。在这个研究中，在接种肿瘤细胞之后的第8天、第14天和第21天给予CAB1.2和p97-特异性的ADEPT构建物(P97ADEPT)，然后剂量给予C-Mel，其中p97-特异性的ADEPT构建物并不显著地结合到LS174T细胞上。

[0208]经静脉(IV)将溶解在PBS中的CAB1.2给予荷瘤动物，剂量为1或2.5mg/kg，注射体积以PBS计为100微升。C-Mel(其作为100mg/ml的DMSO中的冰冻溶液贮藏在-70℃下)被新鲜配制(15mg/ml，以0.1M碳酸氢钠：PBS的比例为5∶4)；并基于平均体重基准，以150mg/kg的剂量，对所有接受前药的治疗组进行给药，经由尾静脉IV推注，注射体积是200微升。新鲜配制梅尔法兰(2mg/ml，在20％DMSO/PBS中)并进行腹膜内给药，注射体积为100微升。治疗组在下面的表10中列出。简言之，被给予2.5mg/kg的CAB1.2的动物，在CAB1.2处理后的18小时或36小时时，被给予C-Mel。被给予1mg/kg的CAB1.2的动物，在CAB1.2处理后的24小时时，被给予C-Mel。对照组如下：未治疗者；单独给予2.5mg/kgCAB1.2；10mg/kg梅尔法兰；单独给予C-Mel；给予2.5mg/kg P97ADEPT，18小时之后再给予C-Mel；给予1.5mg/kgβ-内酰胺酶(BLA，1.5mg/kg，其与使用的2.5mg/kg CAB1.2BLA摩尔浓度相等)，18小时后给予C-Mel。每星期重复一次治疗，进行三个周期。每星期进行两次肿瘤测量(毫米为单位)；进行肿瘤测量的人员对治疗组不知情。

表10

组别	N/性别	CAB 1.2剂量或P97ADEPT剂量或BLA剂量	C-Mel剂量或梅尔法兰剂量	C-Mel给药时间
					1	10F	2.5mg/kg	150mg/kg	18小时
2	10F	2.5mg/kg	150mg/kg	36小时
					3	10F	1mg/kg	150mg/kg	24小时
4	10F	未治疗对照	-	-
					5	10F	2.5mg/kg	-	-
6	10F	-	150mg/kg	-a
					7	10F	-	10mg/kg梅尔法兰	-
8	10F	2.5mg/kg P97ADEPT	150mg/kg	18小时
					9	10F	1.5mg/kg BLA	150mg/kg	18小时

[0209]每天对动物的全身表现进行监视，每周对动物体重测量一次，每周进行两次肿瘤测量。收集数据，并且所有治疗组的中值肿瘤体积被确定为±SEM，绘制成图，用以进行分析(肿瘤攻击后的天数对肿瘤体积)。

[0210]图21-23描述了研究的功效结果。在第8天，当小鼠第一次接受CAB1.2蛋白时，治疗组的中值肿瘤体积约为177mm³。在研究的这个阶段，肿瘤倍增时间(Tumor doubling time)大约为24-26小时；当18-36小时后给予C-Mel时，CAB1.2和P97ADEPT治疗组中的肿瘤体积几乎倍增到约315mm³。一般地，相比于未治疗、梅尔法兰、C-Mel、BLA或CAB1.2对照组，接受CAB1.2、并在CAB1.2给药后的第18小时、第24小时或第36小时加上C-Mel的治疗组，在研究期间，显示出更高的肿瘤生长抑制作用。在肿瘤细胞攻击后的第24天，18、24或36小时后给予C-Mel的CAB1.2治疗组的肿瘤生长抑制比率，分别为未治疗对照组的70％、75％和68％(p＜0.05，双尾T检验(two-tailed T-Test)，假设每一个独自分析为异方差)。在第15-34天中，当剂量给予P97ADEPT之后的18小时给予C-Mel时，观察到了相似程度的肿瘤生长抑制(在第24天，相比未治疗组，存在～63％的生长抑制，p＜0.05)，这表明BLA融合蛋白的非特异性瘤内保留。在随后的时期里，CAB1.2/C-Mel治疗组相对P97ADEPT/C-Mel治疗组，在肿瘤生长抑制比率上出现了分离，具体而言，在第44天，24小时CAB1.2/C-Mel治疗组与P97ADEPT/C-Mel治疗组相比而言，在中值肿瘤体积上具有三倍的差距，这是显著性的(分别地，611mm³±176对1871mm³±379，p＜0.05)。在第44天，将C-Mel治疗组作为比较者，则24小时CAB1.2/C-Mel和18小时P97ADEPT/C-Mel治疗组给出的生长抑制率分别为89％和68％(p＜0.05，相比C-Mel治疗组)。在CAB1.2/C-Mel 18小时和36小时治疗组中的剩余动物也给出了与CAB1.2/C-Me124小时治疗组一致的结果(分别为87％和89％的生长抑制)。在24小时CAB1.2/C-Mel治疗组中，有两个动物的可测量肿瘤块在外观上完全消退(在第16天和第44天记录到)。在第34天，BLA/C-Mel治疗组具有显著的抗肿瘤活性(相比未治疗对照组，肿瘤生长抑制为65％，p＜0.05)。本研究在第44天结束。

[0211]在多个不同的治疗组中观察到了治疗相关的毒性，该毒性由体重减轻(图21)和动物死亡(图22)所表明，所述治疗组包括接受CAB1.2加上C-Mel的治疗组。在第9天，当给予第一次C-Mel剂量时，测出各个治疗组的平均体重，并被用作荷瘤动物的基线体重(baseline weight)，用以确定每个治疗组内的体重损失。接受CAB1.2之18小时后接受C-Mel的治疗组，在完成第三轮CAB1.2/C-Mel治疗之后，在第16天的体重减轻为13％，第24天为21％。在治疗中，由于程序上的错误，一个动物在第14天被丢失。所观察到的与毒性相关的死亡如下：第27天发现2个动物死亡，第30和34天发现各有3个动物死亡；在18小时CAB1.2/C-Mel治疗组的研究中，总计是8/9毒性相关致死。接受CAB1.236小时后再接受C-Mel的治疗组，在第16天体重减轻8％，第24天体重减轻20％。一个动物在第12天被处死，原因在于肿瘤部位的过度坏死。毒性相关的死亡如下：第16天发现1个动物死亡，第27天发现2个动物死亡，第30天、第34天和第37天各发现1个动物死亡；在36小时CAB1.2/C-Mel治疗组的研究中，总计是6/9毒性相关致死。接受CAB1.224小时后再接受C-Mel的治疗组，在第16天体重减轻为12％，在第24天体重减轻为19.7％。毒性相关的死亡如下：在第30天、第34天和第37天各发现1个动物死亡；在24小时CAB1.2/C-Mel治疗组的研究中，总共有3/10毒性相关致死。梅尔法兰治疗组，在第16天体重减轻11％，在第24天体重减轻12.5％。毒性相关的死亡如下：第24天、第34天和第37天发现各有一个动物死亡；在单独使用梅尔法兰的治疗组的研究中，总共有3/10毒性相关致死。相对于起作用的治疗组而言，剩下的治疗组没有一个表现出显著毒性，尽管BLA/C-Mel治疗组第24天被记录到确实具有的体重减轻为16.7％。

[0212]CAB1.2与C-Mel联用，在LS174T肿瘤模型中取得了显著的肿瘤生长抑制活性，具有＞80-90％的肿瘤生长抑制率，并且在个别动物中，观察到某种程度的肿瘤消退。在一些治疗组中使用的攻击性(aggressive)剂量和时间表产生毒性，这是意料之中的。三个周期的治疗是有毒性的，记录到显著性体重减轻和动物死亡；但在两个周期的疗法中，特别是在接受1mg/kg CAB1.2的CAB1.2/C-Me124小时治疗组中，观察到可接受的毒性。以最大耐受剂量(MTD)给予梅尔法兰，造成了30％动物死亡，这与在24小时CAB1.2/C-Mel治疗组中所观察到的死亡数目相近，但梅尔法兰具有比该24小时CAB1.2/C-Mel治疗组显著较小的功效；在第34天，抑制率分别为34％和86％(对于CAB1.2/C-Mel，p＜0.05；p＝并不显著，就梅尔法兰相对未治疗对照组而言)。并且，在梅尔法兰治疗组中，未发生肿瘤消退；而24小时CAB1.2/C-Mel治疗组中，2/10的动物具有可触摸肿瘤块的完全消退。在不引起过多动物死亡、在不进一步改进肿瘤响应的情况下，本研究中使用的梅尔法兰的MTD剂量和时间表不能被超越。P97ADEPT/C-Mel和BLA/C-Mel治疗组也具有显著的抗肿瘤活性，表明：这些分子在C-Mel给药18小时时间点上的非特异性肿瘤保留；但是，在研究期间不像24小时CAB1.2/C-Mel治疗组那么有效。

[0213]图20显示的是，与对照组相比，CAB1.2/前药组合起来联用之后的动物体重效应。x轴表示天为单位的时间，y轴表示以克为单位测量出的治疗组体重。

[0214]图21图示的是，相比对照组，CAB1.2/前药并用的存活情况。x-轴表示以天为单位的时间，y轴表示存活动物的数目。

[0215]图22显示的是，与对照组相比，CAB1.2/前药并用的功效。x轴表示以天为单位的时间，y轴表示以mm³为单位测量出的肿瘤体积。如实施例中叙述的，在第8天、第14天和第21天，动物接受CAB1.2和对照物。对于第3组(CAB1.2/C-Mel，24小时)，在第16天和第44天中的每一天，观察到有一个动物中存在完全响应(complete response)。在计算中值肿瘤体积的时候，这些动物的肿瘤体积值被记作0mm³。各组如下：第1组：CAB1.2/C-Mel(2.5mg/kg，18小时)；第2组：CAB1.2/C-Mel(2.5mg/kg，36小时)；第3组：CAB1.2/C-Mel(1mg/kg，24小时)；第4组：未治疗的对照组；第5组：单独CAB1.2(2.5mg/kg)；第6组：单独GCR9885；第7组：梅尔法兰(10mg/kg)；第8组：P97ADEPT/C-Mel(2.5mg/kg，18小时)；第9组BLA/C-Mel(1.5mg/kg，18小时)。

实施例13CAB1.13i和CAB1.11i在无胸腺小鼠上的源于肿瘤的TLS174T人结肠直肠肿瘤模型中的抗肿瘤活性

[0216]本研究，在源于肿瘤的T-LS174T荷瘤的雌性无胸腺小鼠中，对使用CAB1.13i和CAB1.11i并随后给予戊二酰-C-Mel的功效进行比较。

[0217]使用PBS，将CAB1.11i稀释到0.05mg/mL和0.2mg/mL，将CAB1.13i稀释到0.2mg/mL。在稀释的60分钟内给予剂量。

[0218]对戊二酰-C-Mel进行称量并溶解于3.0eq的1.0M NaHCO₃中。用涡旋混合器(vortex)将溶液混匀，并以5％蔗糖水溶液稀释到30mg/mL的终浓度。使用PBS将溶液进一步稀释到20mg/mL，并在冰袋上保存直到施用。

[0219]研究设计如表11中所概括。70只雌性小鼠被植入源于肿瘤的TLS174T细胞，所述植入是通过皮下注射悬于DMEM中的2×10⁷个细胞/mL的TLS174T细胞进行。通过异氟烷吸入法对动物进行麻醉，通过皮下注射100μL细胞悬液(约2×10⁶个细胞/小鼠)将细胞植入。

[0220]当肿瘤达到约≥250mm³，根据肿瘤尺寸和生长速率选择50只小鼠并分成5组。每组10只小鼠：不给予任何物质；或给予CAB1.11i(1或0.25mg/kg)；或给予CAB1.13i(1mg/kg)，随后在CAB给予后24小时给予戊二酰-C-Mel(150mg/kg)。将CAB配成0.05mg/mL和/或0.2mg/mL，戊二酰-C-Mel配制成30mg/mL。所有的测试物都在稀释和配制的60分钟内注射。注射约为100μL/小鼠，经由尾静脉给药。

                                   表11 研究设计

组别	N/性别	CAB	剂量(mg/kg)	前药1	剂量(mg/kg)	观察
							1	10F	未治疗	--	--	--	体重：每周笼边观察：每天肿瘤测量：每周两次
2	10F	CAB1.13i	1	戊二酰-C-Mel	150
						3	10F	CAB1.11i	0.25	戊二酰-C-Mel	150
4	10F	CAB1.11i	1	戊二酰-C-Mel	150
						5	10F	--	--	戊二酰-C-Mel	150

¹CAB给药后24小时进行给药

[0221]肿瘤植入以后，至少每天对动物进行观察，并对濒死的和痛苦的动物实施无痛处死。每周对肿瘤进行两次测量，每周记录体重。

[0222]当肿瘤达到≥250mm³时，将动物分成组。在给药的当天对小鼠进行称重，剂量是基于所有动物的平均重量。用热灯和加热垫温暖小鼠，并将其置于限制器中。用70％的酒精擦拭尾巴，并通过尾静脉的快速静脉注射给予剂量药物。

[0223]平均肿瘤体积超过2000mm³的治疗组被无痛处死，肿瘤过大和/或坏死的个体动物被无痛处死。如果研究中剩下的动物少于6个，将治疗组无痛处死，除非欲监测获得针对肿瘤再生长的完全响应(complete response)的个体动物。处死濒死的或痛苦的小鼠。

[0224]在第45天，剩下的小鼠通过CO2吸入被无痛处死，并对其进行尸体解剖。将异常的组织或者器官，以福尔马林进行固定，用于组织病理学。从所有的动物收集肿瘤，并置于福尔马林中，用以进行组织病理学研究。

[0225]计算了所有治疗组的体重和中值肿瘤体积±SD，并绘图以进行分析(体重减轻百分数和肿瘤攻击后天数对肿瘤体积)。

[0226]结果如图23中所示。

实施例14：Ropo2抗体的构建

[0227]BLA的一种特异性抗体，即Ropo2，其被按照如下所述予以构建。将BLA悬于PBS缓冲液(1mg/ml)中，通过与等体积的完全弗氏佐剂(Complete Freund′sAdjuvant)(总体积0.6ml)混合而被乳化，并且注射进入3到4个皮下背侧部位中，用以进行初次免疫。随后的免疫是使用不完全弗氏佐剂进行的，剂量为200μg/兔。收集时，从关节动脉对动物进行放血。使血液凝结，并通过离心收集血清。在-20℃下贮藏血清。

实施例15：肿瘤系列免疫组织化学法(tumor panel IHC)以评价靶抗原分布和结合特异性

[0228]本研究中使用的冷冻组织样品，是从Ardais’BIGR Library(Ardais)获得的。Genencor提供CAB以及兔多克隆的抗-BLA抗体Ropo2的制品。使用IHC分析，并使用细胞角蛋白抗体(Dako Cytomation)作为阳性对照。请参见表12。

                       表12

抗体	来源	浓度	种类
				具有15聚体的CAB1.2i		1.4mg/ml	N/A
CAB1.11i		1.0mg/ml	N/A
				具有30聚体的CAB1.2i		3.0mg/ml	N/A
CAB1.14i		1.8mg/ml	N/A
				Ropo 2αBLA		436μg/ml	兔
细胞角蛋白	Dako Cytomation	0.2mg/ml	鼠

[0229]将冷冻样品在-80℃下移出并在-20℃下放置2小时。恒冷切片机(cryostat)设置为-20℃，切片样品在被切成5μm的厚度。将切片置于Plus Slides上，并在切片时贮存在置于干冰上的显微镜载玻片盒中。在室温下将切片风干30分钟。将切片置于丙酮中，在室温下放置10分钟。在室温下，以洗涤缓冲液(WashBuffer)(DakoCytomation，编号#S3006，批次#044312)对切片进行2-3×5min的冲洗。

[0230]在Dako自动染色器上进行IHC。用抗体稀释剂(Antibody Diluent)(DakoCytomation，编号#S0809，批次#123113)将抗体稀释到如下的浓度：CAB抗体稀释到0.2μg/ml，Ropo 2抗体稀释到0.1μg/ml。在室温下以大约～200μl过氧化物酶封闭剂(Peroxidase Block)对样品进行5分钟的温育。以洗涤缓冲液对抗体进行2×5min的冲洗。在室温下将约～200μl蛋白封闭剂(Protein Block)(Dako Cytomation，编号#X0909，批次103183)与样品一同温育10分钟。加入～200μl CAB抗体，室温下持续30分钟。以洗涤缓冲液对样品进行2×5分钟的冲洗。室温下加入约～200μlRopo 2抗体，并室温下温育30分钟。以洗涤缓冲液(Wash Buffer)对样品进行2×5分钟的漂洗。加入～200μl来自检测系统(Detection System)的第二抗体(SecondaryAntibody)，温育30分钟。用冲洗缓冲液对样品进行2×5分钟的漂洗。将样品在～200μl Chromagen(Detection System(Envision+System，HRP(DAB)Rabbit)中提供的DAB+——Dako Cytomation，编号#K4011，批次#11367))中温育5分钟。用蒸馏水洗涤样品5分钟。用苏木素(Hematoxylin)(Richard Allen，编号#7211，批次#35053)对样品复染30秒钟，其中苏木素提供蓝色核染色。将样品漂洗5分钟。将样品在上蓝剂(Bluing Reagent)(Richard Allen，编号#7301，批次#19540)中浸两次。将样品用蒸馏水漂洗5分钟。用95％乙醇2×2分钟、100％乙醇2×2分钟对样品进行脱水，并在二甲苯中使其透明。带着培养基(Medium)(Richard Allen，编号#4111，批次#18071)将样品放在载玻片上，并加上盖玻片。

[0231]在这个免疫组织化学(IHC)研究中，四种CAB抗体CAB1.2i，15聚体接头；CAB1.2i，30聚体接头；CAB1.11i和CAB1.4i被针对组织系列进行分析，其中组织系列由5个肺肿瘤样品、3个结肠肿瘤样品和5个胰肿瘤样品组成。

[0232]图26显示本研究的全部结果。第一列详细说明病例诊断；第二列详细说明组织来源和发现部位；第四列显示以抗人细胞角蛋白AE1/AE3染色，第五列到第八列显示针对四种抗体：具有15聚体接头的CAB1.2i，具有30聚体接头的CAB1.2i，CAB1.11i和CAB1.14i的染色。

[0233]四种抗体在所有的被测肿瘤样品中显示出强免疫染色(强度为2-3+)，并且它们的染色图案非常相似，如果说不是相同的话。除了一个例外，即CI000005496-FF5以外，所有的样品显示：存在的肿瘤细胞中超过75％发生染色。在基质细胞中也观察到最小的、浅的(1-2+)染色，这在采用冰冻组织切片时有时会观察到，其中基质细胞包括成纤维细胞和偶尔混入的炎症细胞。坏死细胞和肺泡内巨噬细胞(在肺组织的样品中观测到)一致显示出阳性染色。

[0234]样品中存在的邻近正常组织主要是阴性的，在正常的肺组织或胰组织中没有观察到阳性染色。样品CI0000008475是一个结肠癌转移到肝中的病例，其中所见的正常肝组织显示出浅的染色，染色被局限在具有三种抗体(CAB1.2i15聚体接头，CAB1.11i，和CAB1.2i 30聚体接头)的窦状区域。第四种抗体(CAB1.14i)显示出更强的、更加弥散的染色，90％正常肝实质(parenchyma)被染色。

[0235]对四种被测抗体的染色特征进行了比较，只观察到了最小限度的变化性。在四种被测抗体中，CAB1.14i显示出稍微深一些的背景染色。

[0236]细胞角蛋白抗体，其被用于选定的样品，以确保组织抗原被适当地保存；对上皮细胞显示出强阳性染色。在“无-初次抗体(no-primary antibody)”的对照中，没有看到染色。

[0237]实施例16：在肿瘤源TLS174T荷瘤雌性无胸腺小鼠中合并随后施用GC-Mel时，CAB1.2i 15聚体，CAB1.2i 30聚体，CAB1.14i和CAB1.11i的抗肿瘤活性

配制

[0238]给药溶液在给药当天配制，在60分钟内给药。每个配制的给药溶液的等分试样，在分析前都保持和贮藏在-70℃下。对CAB，分析蛋白质浓度和BLA活性。对GC-Mel和Mel的化合物浓度进行分析。

GC-Mel的制备

[0239]对大块药进行称量，并溶解在3.0eq(当量)的1.0M NaHCO₃中。用涡旋混合器(vortex)将溶液混合均匀，并以5％的蔗糖水溶液将溶液稀释到30mg/mL的终浓度，如上所述。动物接受100μL配制的给药溶液。

Mel的制备

[0240]对大块药进行称量，并溶解在含有20％DMSO的酸化PBS(pH 4.0)中，形成终浓度为2mg/mL。每只动物接受100μL配制的给药溶液。

物种/品系/年龄/数量/来源

[0241]150只雌性Ncr无胸腺小鼠，18-22g，约6-8周龄，来自Taconic Labs，被植入TLS174T人结肠直肠肿瘤。基于肿瘤大小和生长速率，选择出100只动物用以剂量给药。

研究设计

[0242]表13中概括了研究设计。小鼠被植入TLS174T细胞(在研究的第0天)；当肿瘤达到约≥250mm³时，根据肿瘤大小和生长速率选择100只动物，并将其分成10组，使得组间的中值肿瘤大小相近。每组10只小鼠被给予CAB1.2i，15聚体，CAB1.14i或CAB1.11i(1或0.25mg/kg)或CAB1.2i，30聚体(0.25mg/ml)，然后在CAB给药后的24小时时给予GC-Mel(150mg/kg)。10只小鼠被给予载体(vehicle)，Mel(10mg/kg)或GC-Mel(150mg/kg)。

                                   表13

组别	N/性别	测试物	剂量(mg/kg)	GC-Mel剂量2(mg/kg)	观察
						1	10/F	载体1	-	-	体重：每周笼边观察：每天肿瘤测量：每周两次
2	10/F	Mel	10	-
					3	10/F	CAB1.2i	0.25	150
4	10/F	-	-	150
					5	10/F	CAB1.2i，15聚体	0.25	150
6	10/F	CAB1.2i，15	1	150

		聚体
						7	10/F	CAB1.11i	0.25	150
8	10/F	CAB1.11i	1	150
						9	10/F	CAB1.14i	0.25	150
10	10/F	CAB1.14i	1	150

¹五只动物将被给予：20mM柠檬酸钠，150mM NaCl的1∶10稀释度的PBS稀释液，pH6.0；五只动物被给予含有20％DMSO的酸化PBS(pH 4.0)

²CAB给药24小时后给予GC-Mel

肿瘤植入

[0243]将TLS174T细胞植入到150只雌性小鼠中，是通过皮下注射悬于DMEM中的、2×10⁷细胞/mL的TLS174T细胞进行。通过吸入异氟烷，将动物麻醉，通过皮下注射100μl细胞悬液(约2×10⁶细胞/小鼠)植入细胞。植入的当天被称作研究的第0天。

给药、观察和样品收集：

[0244]肿瘤植入以后，至少每天对动物进行观察；并对濒死的和痛苦的动物实施无痛致死术。每周对肿瘤进行两次测量，每周对体重进行记录。

[0245]当肿瘤达到≥250mm³时，将动物分成组。在给药的当天对小鼠进行称重，剂量是基于所有动物的平均重量。用热灯和加热垫温暖小鼠，并将其置于限制器中。用70％的酒精擦拭尾巴，并通过尾静脉的快速静脉注射给予剂量药物。

[0246]平均肿瘤体积超过1500mm³的治疗组被无痛处死，肿瘤过大和/或坏死的个体动物被无痛处死。如果研究中剩下的动物少于6个，将治疗组无痛处死，除非要监测达到针对肿瘤再生长完全响应(complete response)的个体动物。

[0247]在第45天，剩下的小鼠通过CO₂吸入被无痛处死并对其进行尸体解剖。将异常的组织或者器官以福尔马林进行固定，用于组织病理学。从所有的动物收集肿瘤并置于福尔马林中，用以进行组织病理学研究。

[0248]结果如图27所示。给予CAB，随后给予前药的，显示出肿瘤体积的下降。然而，该同一组显示出某种程度的体重减轻。

实施例17：在荷异种移植TLS174T的NCR裸鼠中，CAB1.14i或CAB1.2i，15聚体给药之后，GC-Mel的24小时间隔的药动学和组织分布

配制：

[0249]给药溶液在给药的当天配制，并在配制的两个小时内使用。剂量浓度基于所有小鼠的平均体重，并配制成以100μL/鼠递送。

物种/品系/年龄/数量/来源

[0250]Ncr无胸腺小鼠，年龄约为8-10周龄，来自Taconic Labs，它们被种植TLS174T人直肠结肠肿瘤。TLS174T是一种细胞系，是从通过小鼠传代的LS174T建立的。LS174T细胞系最初是从ATCC购买的。对TLS174T细胞进行例行的支原体污染检查，结果为阴性。根据肿瘤大小和生长速率，选择126只动物给予剂量。

研究设计：

[0251]表14中概括了研究设计。对动物不进行给药，或者通过静脉注射给予CAB1.14i(1mg/kg)或1.2i，15聚体(1mg/kg)。在CAB给药后的24小时、48小时、72小时或96小时时，动物接受单次推注剂量的GC-Mel(100mg/kg)。GC-Mel给药后的60分钟期间，收集血浆、肿瘤、肝和肾，用以分析GC-Mel浓度。

                                    表14 研究设计

组别	N/性别	测试物品	剂量(mg/kg)	GC-Mel剂量(mg/kg)	TOA1	时间点2(min)	样品收集
								1	3/F	无	--	--	--	0	血浆，肿瘤，肝和肾
2	15/F	CAB1.14i	1	100	24	2，5，15，30，60
							3	15/F	CAB1.14i	1	100	48
4	15/F	CAB1.14i	1	100	72
							5	15/F	CAB1.14i	1	100	96
6	3/F	无	--	--	--								0
						7	15/F	CAB1.2i，15聚体	1	100	24	2，5，15，30，60
8	15/F	CAB1.2i，15聚体	1	100	48
						9	15/F	CAB1.2i，15聚体	1	100	72
10	15/F	CAB1.2i，15聚体	1	100	96

¹CAB1.2i 15-聚体或CAB1.14i给药之后的给药时间

²GC-Mel给药后收集

肿瘤植入：

[0252]小鼠通过皮下注射植入TLS174T细胞，TLS174T细胞悬浮于DMEM中、为2×10⁷细胞/mL。通过吸入异氟烷对动物进行麻醉，通过注射100μL细胞悬液(约2×10⁶细胞/小鼠)植入细胞。

给药、观察和样品收集

[0253]肿瘤植入以后，至少每天对动物进行观察，濒死的和痛苦的动物被无痛处死。每周对肿瘤进行两次测量，每周记录体重。

[0254]当肿瘤达到约200-400mm³，将动物分成组。在给药的当天对小鼠进行称重，剂量是基于所有动物的平均重量。用热灯和加热垫温暖小鼠，将其置于限制中，并通过尾静脉的快速静脉注射给予剂量。

[0255]在收集样品之时，所有的小鼠通过异氟烷吸入法被麻醉。通过心脏穿刺将血液收集到装有EDTA的管中，并置于冰上。在13,000RPM下对管离心2分钟。将血浆部分移到事先标记的微量离心管中，并置于干冰上。进行分析之前，所有的血浆样品都贮藏在-70℃下。

[0256]用LC/MS/MS对血浆样品的血浆GC-Mel浓度进行检测。结果如图28-30所示。已经对本发明的优选实施方案进行了描述，对本领域普通技术人员显而易见的是：可以对已公开的实施方案进行各种各样的修改，这些修改被意图包括在本发明的范围之内。

[0257]本领域技术人员容易想到，本发明可以被充分调整以实现提到的目标和取得所提到的结果和益处，以及其固有的那些目标、结果和益处。在此描述的分子复合物和方法、过程、治疗、分子、具体的化合物是目前有代表性的优选实施方案，它们是示范性的，并不意图对本发明的范围进行限制。本领域技术人员会容易想到，可以对在此公开的本发明做出不同的替代和修改而不背离本发明的范围和精神。

[0258]在本说明书中提到的所有专利和公开代表了本发明所属领域技术人员的水平。在此引入所有的专利和公开作为参考，到达如此同一的程度：如同每个单独的公开被特别地和独立地引入作为参考。特别地，在此引入作为参考的AttorneyDocket Number(s)839et seq(如839-2P)，是以其完整形式引入，包括任何图。

[0259]在此示范性地适当描述的本发明，可以在缺乏任何未在此特别公开的一个或多个要素，一个或多个限制下而被实施。使用的术语和措辞是用于描述而不是用于限制，并不意图使用这些术语和措辞排除显示和描述的特征的任何等价特征，或者它们组成部分，但应该认识到在本发明所要求的范围内，多种修改是可能的。从而，应该理解，尽管通过优选实施方案和任选的特征具体地公开了本发明，本领域技术人员可以对在此公开的构思采取修改和变化，这些修改和变化被认为属于本发明的范围，其中本发明的范围由附带的权利要求书限定。

[0260]在此宽泛地和一般性地对本发明进行了描述。每个落入一般性公开的更窄的种类和亚类分组也是本发明的组成部分。这包括本发明的这样的一般性描述：其具有限制性条款或负限制，所述限制性条款或负限制从本类中除去任何对象物质，不管被去除的材料是否在此被特别地提出。

Claims (28)

1.CAB分子，其包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有SEQ ID NO：1中说明的序列。

2.CAB分子，其包括氨基酸序列，该氨基酸序列是从SEQ ID NO：1阐明的氨基酸序列修饰而来，其中所述修饰是从下述的位置中选出的至少一个位置：第100位、第102位、第104位、第105位、第107位、第163位、第165位、第166位、第184位和第226位，其中位置编号根据图1所示的SEQ ID NO：1。

3.根据权利要求2的CAB分子，其中所述修饰是在第100位、第184位和第226位。

4.根据权利要求2的CAB分子，其中所述修饰是在第100位、第102位、第104位、第105位、第107位、第163位、第165位、第166位、第184位和第226位。

5.根据权利要求2的CAB分子，其中所述修饰是从下面各项选出的至少一个修饰：T100L，T102L，P104A，Y105I，F107N，S163A，S165Y，Y166A，S184D和S226D。

6.根据权利要求5的CAB分子，其中所述CAB分子包括下面的修饰：T100L，S184D和S226D。

7.CAB分子，所述CAB分子包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有图2所示的SEQ ID NO：2中说明的序列。

8.根据权利要求7的CAB分子，进一步包括选自下面各项的至少一个修饰：3，13，16，37，100，102，104，105，107，146，163，165，166，181，184，226，265和568，其中位置编号根据图2所示的SEQ ID NO：2。

9.根据权利要求8的CAB分子，进一步包括选自下面各项的至少一个修饰：K3Q，R13K，T16G，L37V，T100L，T102L，P104A，Y105I，F107N，M146V，S163A，S165Y，Y166A，W181V，S184D，S226D，K265A和S568A。

10.根据权利要求9的CAB分子，进一步包括SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10。

11.根据权利要求9的CAB分子，进一步包括SEQ ID NO：7中说明的序列。

12.根据权利要求9的CAB分子，进一步包括SEQ ID NO：8中说明的序列。

13.根据权利要求9的CAB分子，进一步包括SEQ ID NO：9中说明的序列。

14.根据权利要求9的CAB分子，进一步包括SEQ ID NO：10中说明的序列。

15.编码CAB分子的核酸，其中所述CAB分子包括氨基酸序列，所述氨基酸序列含有SEQ ID NO：1中说明的序列。

16.编码CAB分子的核酸，其中所述CAB分子具有从SEQ ID NO：1中所说明的氨基酸序列修饰而来的氨基酸序列，其中所述修饰是在选自下面各项的至少一个位置上：第100位、第102位、第104位、第105位、第107位、第163位、第165位、第166位、第184位和第226位，其中位置编号根据图1所示的SEQ IDNO：1。

17.根据权利要求16的核酸，其中所述修饰是在第100位、第184位和第226位。

18.根据权利要求16的核酸，其中所述修饰是在第100位、第102位、第104位、第105位、第107位、第163位、第165位、第166位、第184位和第226位。

19.根据权利要求18的核酸，其中所述修饰是从下面各项选出的至少一个：T100L，T102L，P104A，Y105I，F107N，S163A，S165Y，Y166A，S184D和S226D。

20.根据权利要求19的核酸，其中所述CAB分子包括下面的修饰：T100L，S184D和S226D。

21.编码CAB分子的核酸，其中所述CAB分子包含氨基酸序列，该氨基酸序列具有SEQ ID NO：2中列出的序列。

22.根据权利要求21的核酸，进一步包括选自下面各项的至少一个修饰：3，13，16，37，100，102，104，105，107，146，163，165，166，181，184，226，265和568，其中位置编号根据SEQ ID NO：2，如图2中所示。

23.根据权利要求22的核酸，进一步包括选自下面各项的至少一个修饰：K3Q，R13K，T16G，L37V，T100L，T102L，P104A，Y105I，F107N，M146V，S163A，S165Y，Y166A，W181V，S184D，S226D，K265A和S568A。

24.根据权利要求23的核酸，进一步包括SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQID NO：9或SEQ ID NO：10。

25.根据权利要求23的核酸，进一步包括在SEQ ID NO：7中列出的序列。

26.根据权利要求23的核酸，进一步包括在SEQ ID NO：8中列出的序列。

27.根据权利要求23的核酸，进一步包括在SEQ ID NO：9中列出的序列。

28.根据权利要求23的核酸，进一步包括在SEQ ID NO：10中列出的序列。

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