CN114574194B

CN114574194B - 一种pH荧光探针、其合成方法及其应用

Info

Publication number: CN114574194B
Application number: CN202210213562.9A
Authority: CN
Inventors: 刘熠; 谭宝金; 汪京
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2022-03-04
Filing date: 2022-03-04
Publication date: 2023-09-26
Anticipated expiration: 2042-03-04
Also published as: CN114574194A

Abstract

本发明提供一种pH荧光探针、其合成方法及其应用，pH荧光探针的分结构式如下：。本发明的pH荧光探针水溶性好、对pH的选择性强、响应效果好、对活体安全无毒，且该探针具有的近红外吸收与荧光发射特性使其能在活体成像上有很好的应用前景。此外，本发明pH荧光探针的制备方法具有工艺简单、成本低和产率高的优点。

Description

一种pH荧光探针、其合成方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种pH荧光探针、其合成方法及其应用。

背景技术

癌症是现代社会严重威胁人类健康和生命的主要疾病。目前，对于癌症诊疗来说，早期的诊断十分重要，若能及时发现早期肿瘤，有助于提高肿瘤的治疗效果、改善患者的生活质量。大量的研究发现，绝大多数的早期的实体瘤内部呈现微酸性(pH6.5-6.8)，而正常组织呈弱碱性(pH7.2-7.4)。荧光探针因其具有高灵敏度、高选择性的特点，可对肿瘤和正常组织细微的pH差距进行放大、区分，达到肿瘤精确识别和定位成像效果，从而可以更好地指导肿瘤治疗。

传统检测pH的荧光探针多数都是由短波长激发，而短波长的光很难透过活体，并且存在很多自体荧光的干扰。此外，传统检测pH的荧光探针水溶性、生物相容性较差。因此，开发出近红外波长激发、水溶性好、选择性高、毒性低的探针，用来实现微酸环境活体组织成像，具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，从而提供一种具有良好的水溶性的检测pH的荧光探针及其应用，其能对pH进行快速荧光响应检测，并且细胞毒性低，具有广阔的应用场景。此外，本发明还公开了该荧光分子探针的合成方法，其工艺简单，成本低和产率高的优点。

为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种pH荧光探针，其结构式如下：

结构式中的PEG即聚乙二醇，不同的PEG，有不同的pKa，决定了荧光探针pH的测量范围。

作为技术方案的进一步改进，所述化学结构式中的PEG为PEG5000，可检测微酸性(pH6.5-6.8)环境。

本发明荧光分子的结构为NRhD-PEG。其中，NRh基为近红外荧光团，能吸收近红外的光并发出波长更长的荧光；NRhD为邻苯二胺与NRh通过酰胺连接，在不同pH溶液中具有“开环”和“关环”两种状态的转变，“关环”状态表现为无荧光，开环状态表现为强荧光。PEG为与邻苯二胺的伯氨基接枝的聚乙二醇，可以显著增加水溶性。本发明的探针原理如下式所示：在碱性溶液或中性溶液中NRhD-PEG为无荧光的“关环”状态；在酸性溶液中NRhD-PEG的苯并吲哚部分的N被质子化，NRhD-PEG转变为“开环”状态的NRhDH⁺-PEG，后者共轭结构相对于前者大幅度增加，从而导致紫外吸收和荧光发射的大幅度红移，

一种上述pH荧光探针的合成方法，包括如下步骤：

步骤一、在惰性气体保护下，将化合物1、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)和邻苯二胺溶解到二氯甲烷中，在室温下反应得到化合物2，所述化合物1的化学结构式见式1，所述化合物2的化学结构式见式2；

步骤二、在惰性气体保护和冰浴条件下，将化合物2、戊二酰氯和缚酸剂溶解到溶剂中，然后在室温下反应制得化合物3，所述化合物3的化学结构式见式3；缚酸剂用于中和生成的盐酸，可选用常见的有机碱例如三乙胺、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)等。

步骤三、在惰性气体保护下，将化合物3、PyBOP和甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH₂)加入到二氯甲烷中，室温下反应得到所述pH荧光探针；

所述化合物1的合成可参考文献：A Unique Class of Near-InfraredFunctional Fluorescent Dyes with Carboxyl ic-Acid-Modulated Fluorescence ON/OFF Switching:Rational Design,Synthesis,Optical Properties,TheoreticalCalculations,and Appl ications for Fluorescence Imaging in Living Animals。

步骤一至三中的惰性气体可以独立地为氮气或者零族元素气体，考虑易得性和成本，作为技术方案的进一步改进，步骤一至三中惰性气体为氮气。

步骤一至三中的溶剂为非质子有机溶剂，可选用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)、甲苯、乙醚等。

作为技术方案的进一步改进，为了提高反应转化率，步骤一中所述化合物1、邻苯二胺和PyBOP的摩尔比为1：(8-10)：(1-1.5)。

作为技术方案的进一步改进，为了提高反应转化率，所述化合物2、戊二酰氯和三乙胺的摩尔比为1：(10-15)：(20-30)。

作为技术方案的进一步改进，为了提高反应转化率，步骤三中所述化合物3、mPEG-NH₂与PyBOP的摩尔比为1：(1-1.2)：(1-1.5)。

本发明的荧光探针对于pH的选择性强、响应效果好，可用于pH检测，本发明还保护一种包含所述pH荧光探针的pH检测试剂。

作为技术方案的进一步改进，因pH荧光探针对细胞毒性小且抗干扰，所述pH检测试剂用于检测细胞或者活体组织的pH。

一种所述pH荧光探针在成像实体肿瘤的非医疗的用途。绝大多数的早期的实体瘤内部呈现微酸性(pH6.5-6.8)，而正常组织呈弱碱性(pH7.2-7.4)。本发明的荧光探针因其具有高灵敏度、高选择性、细胞毒性小且抗干扰的优点，可对早期肿瘤组织和正常组织细微的pH差距进行放大、区分，达到肿瘤精确识别和定位成像效果。

本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体的说，

第一、本发明的pH荧光探针易溶于水，且具有较小的生物毒性。

第二、本发明通过探针的“开-关环”策略来检测pH效果十分显著。

第三、本发明的pH荧光探针对pH具有十分良好的选择性，不受环境中其他物质干扰。

第四、本发明的pH荧光探针吸收和发射均在近红外区具有较强的生物体穿透性，还能减少生物体自发荧光的干扰。

第五、本发明的pH荧光探针具有较好的细胞成像效果。

第六、本发明的合成方法反应条件温和、工艺简单，成本低和产率高优点。

附图说明

图1为pH荧光探针在不同溶液中的荧光强度图。

图2为pH荧光探针在不同物质干扰下的荧光强度图。

图3为A549细胞在不同浓度pH荧光探针下的存活率结果图。

图4为pH荧光探针在细胞内不同pH的荧光强度图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

本发明中实验所用试剂、耗材等，若无特殊说明，都可以经商业途径购买获得。实验方法若无特殊说明都为常规方法。实施例中所选用的以下所有试剂皆为市售分析纯或化学纯。

六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)购买自TCI，甲氧基聚乙二醇胺5000(mPEG-NH₂)购买自Toyongbio，

尼日利亚霉素购买自GlpBio。

所用的分析仪器规格、型号如下：

紫外分光光度计(UV-2550，Shimadzu)，荧光分光光度(FS5，Edinburgh)激光共聚焦显微镜(LSM800，Leica)，酶标仪(EL×800，BioTek)、高效液相色谱仪(U3000，Thermo)。

实施例1 pH荧光探针的制备

在氮气保护条件下用二氯甲烷溶解化合物1(250.0mg,0.4mmol)、PyBOP(250.4mg,0.48mmol)和邻苯二胺(404mg,4.0mmol)，室温搅拌反应4小时获得化合物2。在氮气保护、冰浴条件下用二氯甲烷溶解化合物2(81.3mg,0.1mmol)、三乙胺(345.0μL,2.5mmol)和戊二酰氯(169.0mg,1mmol)，然后撤去冰浴，室温下继续搅拌。1小时之后向反应溶液中加入50mL蒸馏水，充分混匀之后，静置，待分液漏斗中溶液分层之后，取下层溶液用减压旋转蒸馏的方法将溶剂蒸干得化合物3。在氮气保护条件下用二氯甲烷溶解化合物3(283.0mg,0.4mmol)、PyBOP(250.4mg,0.48mmol)和mPEG-NH₂(2000mg，0.4mmol)，室温搅拌反应4小时获得最终目标化合物，mPEG-NH₂为甲氧基聚乙二醇胺5000。

HPLC检测各步骤产物纯度大于50％，化合物2纯度为68.5％，化合物3纯度为50.6％，探针纯度为76.1％。

HPLC检测条件为：

色谱柱(W22501K，Waters)：C₁₈ 5μm；3.9×150mm Column；流动相：甲醇/水(含1‰体积含量三氟乙酸)；检测波长：365nm；柱温箱：28℃；流速：1mL/min

梯度洗脱方式：

出峰时间：

步骤一：16.75min(化合物2)

步骤二：16.26min(化合物3)

步骤三：18.17min(探针)

所得探针经纯化处理后，经过核磁氢谱检测参数为：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ8.10–7.36(m，9H)，7.24–6.24(m，9H)，5.37(d，J＝13.3Hz，1H)，3.89–3.84(m，2H)，3.76–3.69(m，4H)，3.63(t，540H)，3.56–3.52(m，4H)，3.43–3.38(m，4H)，3.37(s，3H)，2.39–2.20(m，7H)，1.96(s，6H)，1.77–1.45(m，7H)，1.40(t，J＝7.3Hz，3H)，1.22(t，6H)。

实施例2 pH荧光探针与pH体外响应的荧光发射测量实验：

称取5.81mg探针溶于1mL蒸馏水溶液中，配置成1mM探针母液。准备12个5mL的离心管，依次在每个离心管加入5μL探针母液，再分别加入pH为3.5、4.0、4.5、5.0、5.4、5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(1mM)稀释至1mL，此时每个离心管探针浓度为5μM。待充分混匀后，依次加入比色皿中进行荧光发射的检测(激发光波长为680nm)，所得数据经Origin软件处理得图1，如图1所示，随着溶液pH逐渐降低，在760nm处的荧光信号逐渐增强，表明探针在溶液中与pH的响应效果好。

实施例3 pH荧光探针抗干扰能力测试

分别在在pH 7.4和pH4.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，通过与浓度为1mM的Co²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺；10mM的半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸(AA)、H₂O₂；100mM的Na⁺、K⁺共孵育来测试实例1中制备的探针(5μM)的抗干扰能力。用Origin软件进行数据处理得图2，无论在pH7.4还是pH4.5中，所测的荧光强度仅与溶液pH有关，与溶液中的其他物质无关。这充分证明本探针具有高度的选择性和抗干扰能力。

实施例4 pH荧光探针的细胞毒性测试

在96孔板的最外圈孔中加入100μL PBS溶液，在其余孔中铺满A549细胞，培养12小时。准备5个5mL的离心管，依次在离心管中加入0mg、3mg、6mg、9mg、12mg探针，然后加入DMEM高糖培养基(以下简称培养基)至1mL。将5个离心管中溶液分别吸取95μL，再分别加入到五个孔中，以同样的操作设置六组平行组。孵育24小时后，在每个孔中加入5μL MTT溶液。继续孵育4小时，倒掉液体中培养基，在每个孔中均加入150μL DMSO溶液。待充分溶解后，在酶标仪中进行紫外吸收检测(检测波长为490nm)。用Origin软件进行数据处理得图3，如图3所示，探针浓度为12mg/mL时，细胞存活率依旧高于85％。表明探针具有良好的生物相容性、极低的细胞毒性。

实施例5 pH荧光探针与pH响应的共聚焦显微镜细胞实验

称取10mg尼日利亚菌素溶于1mL细胞用DMSO，得到10mg/mL的尼日利亚菌素母液。取4个离心管，在每个离心管中加1μL的尼日利亚菌素母液，分别用pH为4.5、5.5、6.5、7.5的灭菌PBS溶液稀释至1mL，得到4种含10μg/mL尼日利亚菌素缓冲液。在4个共聚焦皿中铺约2×10³个A549细胞，培养24小时，将共聚焦皿中培养基吸取干净。称取5mg探针溶于5mL培养基并在每个共聚焦皿加入1mL继续孵育。12小时后，倒掉培养基，分别加入1mL上述4种含10μg/mL尼日利亚菌素缓冲液。继续孵育30分钟后，弃去缓冲液，加入多聚甲醛溶液继续固定保存。共聚焦显微镜拍摄图片如图4，随着细胞内pH降低，细胞的荧光信号逐渐增大，表明探针能够很好地区分细胞内pH。

最后应当说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims

1.一种pH荧光探针，其特征在于，其化学结构式如下：

所述结构式中的PEG为聚乙二醇5000。

2.根据权利要求1所述的pH荧光探针的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、在惰性气体保护下，将化合物1、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷PyBOP和邻苯二胺溶解到溶剂中，在室温下反应得到化合物2，所述化合物1的化学结构式见式1，所述化合物2的化学结构式见式2；

步骤二、在惰性气体保护和冰浴条件下，将化合物2、戊二酰氯、缚酸剂溶解到溶剂中，然后在室温下反应制得化合物3，所述化合物3的化学结构式见式3；

步骤三、在惰性气体保护下，将化合物3、PyBOP和甲氧基聚乙二醇胺mPEG-NH₂加入到溶剂中，室温下反应得到所述pH荧光探针；其中式1-3如下所示：

3.根据权利要求2所述的pH荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤一至三中的惰性气体为氮气。

4.根据权利要求2所述的pH荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤一中所述化合物1、邻苯二胺和PyBOP的摩尔比为1：(8-10)：(1-1.5)。

5.根据权利要求2所述的近红外荧光分子探针的合成方法，其特征在于，所述化合物2、戊二酰氯和三乙胺的摩尔比为1：(10-15)：(20-30)。

6.根据权利要求2所述的pH荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤三中所述化合物3、mPEG-NH₂与PyBOP的摩尔比：1：(1-1.2)：(1-1.5)。

7.一种包含权利要求1所述pH荧光探针的pH检测试剂。

8.根据权利要求7所述的pH检测试剂，其特征在于，它用于检测细胞或者活体组织的pH。