JPH09502195A - ヒト細胞への菌付着の遮断 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は作用物質として重合度≧２及びエステル化度＜２０％を有する１種以上のガラクツロニドを場合により薬学的に常用の担体、希釈剤、助剤及び充填剤とともに含有することを特徴とする医薬調剤並びに哺乳類細胞への菌の付着を遮断するための該医薬調剤の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト細胞への菌付着の遮断 本発明は、作用物質としてガラクツロニドを含有する医薬調剤、及び哺乳類細 胞への菌の付着を遮断するための該調剤の使用に関する。 ガラクツロン酸はハインリチョバ（Ｈｅｉｎｒｉｃ ｉａ、第４６巻、第１０８１〜１０８７頁、１９９１）に記載されているように 、広い適用範囲を有する。公知の適用範囲は例えばガラクツロナナーゼ（Ｇａｌ ａｋｔｕｒｏｎａｎａｓｅｎ）及びペクテートリアーゼ（Ｐｅｋｔａｔｌｙａｓ ｅｎ）の部門別化及び分類化のための適用又は選別生物親和性クロマトグラフィ ー用の配位子としての適用を包含する。公知作用には高等植物の防御機構の惹起 及び人胃腸管中の毒性カチオン、例えばＣＤ²⁺、Ｃｕ²⁺、Ｐｂ²⁺、の排除を挙げ ることができる。 種々の植物生産品からの水性エキス及び液汁は民間療法及び臨床医学において 、腸管及び泌尿生殖器官における病原菌に起因する疾患に対するその作用に関し て公知である。腸管におけるこの調剤の薬学的作用は従来植物生産品中に存在す るペクチンによる水収支の調節で説明された。 菌の付着、例えば細胞への細菌性微生物の付着が全ての感染の開始における第 １工程である。細胞表面の特異的レセプターに菌（例えばバクテリア又は／及び ビールス）が付着した時、このことにより菌は非特異的な身体自体の防御、例え ば蠕動、筋肉清掃率、分泌漏等をのがれ、初めて菌はそこで増殖し、身体中に侵 入し、毒性作用を展開し、こうして病気の症状が現れる。 ＥＰ−Ａ−００８０４４２号明細書はオリゴサッカライド、例えばペクチンも しくはポリガラクツロン酸からのオリゴガラクトシドの製造のための多工程化学 合成法を開示している。オリゴサッカライド及びそのアシル化誘導体の薬学的適 用は、一定のガラクトシド、もしくはそのメチル誘導体及びｐ−ニトロフェニル 誘導体の、ある一定の赤血球への尿病原菌大腸菌の付着に対する抑制作用を分か らせる報告から予見される。 従って、抗菌治療の優れた方法は、主な菌力機構としての菌の付着を無効とし 、これにより菌を細胞表面から洗い流すか、又はそこから排除することを身体に 可能にすることである。こうして、本発明の課題は哺乳類の細胞、特に上皮細胞 に菌が付着することを遮断する調剤を製造することである。 この課題は、作用物質として重合度≧２及びエステル化度＜２０％を有する１ 種以上のガラクツロニドを 場合により薬学的に常用の担体、希釈剤、助剤及び充填剤とともに含有すること を特徴とする医薬調剤により解決する。 本発明の更なる課題は重合度≧２を有するガラクツロニドを哺乳類細胞に菌が 付着することを遮断するための医薬調剤を製造するために使用することである。 モロ（ＭＯＲＯ）による古来の調剤中の人参スープ、膀胱茶（例えば、スギナ 、黄色セイヨウサクラソウ、イチゴの葉及びアイスランドゴケからの混合物）、 ココナッツミルク、コケモモ等により病原菌、例えば大腸菌が細胞、特に胃腸管 及び泌尿生殖器官の上皮細胞に付着することを著しく（９０％まで）減少させる ことができることが、意外にも見出された。この作用は植物生産品中に存在する ペクチンに帰せられ、このペクチンとは１，４−α−グリコシド様に結合したガ ラクツロニドの連鎖からなり、その酸基は２０〜８０％までメタノールでエステ ル化されており、かつガラクツロン酸のほかに場合により更に他の糖成分、例え ば、グルコース、ガラクトース、キシロース及びアラビノースを含有していてよ い。 従来ゼリーの製造のために、増粘剤として又は繊維質として使用された、ペク チンもしくはガラクツロニドが哺乳類の細胞、かつ特にヒトの細胞に菌が付着す ることを遮断することを確認したことは意外なことであった。 菌の付着を遮断するために有効なガラクツロニドは一定の重合度及び有利に一 定のエステル化度を示さなければならない。概念“重合度”とは、本発明におい ては１つのガラクツロニドが有する、ガラクツロン酸単位の数を表す。概念“エ ステル化度”とは、ガラクツロニドの（多くの場合メチル基により）エステル化 ガラクツロン酸単位のガラクツロン酸単位の総数に対するパーセンテージを表す 。哺乳類の細胞に菌が付着することを遮断するためには重合度≧２が必要である 、即ち、モノマーのガラクツロン酸は、多くの他のサッカライド（例えば、中性 サッカライド、グルクロン酸、アラビノガラクタン、ガラクトース−１−リン酸 、グルコース−１−リン酸）と同様に、菌の付着の遮断を全く示さない。 本発明による医薬調剤の有利な実施形においては、ガラクツロニドのエステル 化度は＜２０％、特に有利に＜１０％及び、更に有利には＜５％である。最も有 利であるのは、エステル基がほぼ存在しない（＜２％）。 エステル化度＜２０％のガラクツロニドは天然に存在するペクチンを完全に、 又は部分的に、例えばアルカリでの鹸化により、脱メチル化することにより得ら れる。 本発明による医薬調剤中のガラクツロニドの重合度は≧２であり、即ち、ガラ クツロニドは少なくともガ ラクツロン酸単位２を有する。ガラクツロニドの重合度が２〜７であるのが有利 であり、２〜４であるのが更に有利であり、特に２〜３であるのが有利であり、 ２であるのが最も有利である。即ち、ジガラクツロニド、トリガラクツロニド、 テトラガラクツロニド、ペンタガラクツロニド、ヘキサガラクツロニドヘプタガ ラクツロニド及びこれらの物質の混合物が本発明による調剤にとって有利なガラ クツロニドであり、この際ジガラクツロニドもしくはジガラクツロン酸が最も有 利である。しかしながら、もし作用からは最適である物質が医薬調剤の理由から 特別な適用にあまり有利でない場合、この物質を含有しない調剤も適用の種類に 依存して使用することができる。 重合度２〜４のガラクツロニドは天然に存在する高分子ペクチンを、例えばア スペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種又はペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌ ｌｉｕｍ）種のような菌から殆ど工業的に得られるペクチン切断酵素（例えば、 ペクチナーゼ）の使用下に酵素的に加水分解することにより得られる。他方、例 えばＨＣｌで酸性加水分解することによっても、高分子ペクチンを加水分解する ことができる。 本発明による医薬調剤は、菌、特にバクテリアの菌（例えば、大腸菌、ストレ プトコッケン（Ｓｔｒｅｐｔｏｋｏｋｋｅｎ）、ヘモフィルス・インフルエンザ エ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ 、プノイモコッケン（Ｐｎｅｕｍｏｋｏｋｋｅｎ）等）の哺乳類細胞への付着を 遮断し、もしくはすでに結合している菌を排除することができる。特に本発明に よる調剤は、胃腸管（下痢疾患における上部小腸の誤生息）、血液系（大腸菌０ １５７に起因する溶血性尿毒症候群）、気道（例えば、吸入集中治療患者におけ る上昇する感染）、泌尿生殖器（例えば、再発性尿管感染）又は／及び鼻咽腔の （ストレプトコッケン、Ｈ.インフルエンザエ、プノイモコッケンによる）感染 の治療のために好適である。 本発明による医薬調剤は一方ではすでに存在する疾患において、かつ他方では 予防のために投与することができる。例えば次の投与の可能性を考慮することが できる： ａ）胃腸管、尿管の治療のための、水分補給溶液のための添加物として、胃腸管 等中の誤生息に対する予防薬として、人工呼吸の集中治療患者の際の経口投与、 ｂ）鼻咽腔、泌尿生殖器等の治療のための局所適用、及び ｃ）腸管外適用。 ガラクツロニドは多糖類の部分構造として多数の食品及び食品補助物質中に存 在し、こうして経口的に摂取される、即ちこれらは毒性でなく、医薬適用に著し く適している。 本発明による医薬調剤のために使用したガラクツロ ニドの獲得は、植物中に存在する多糖類から獲得することができ、例えば、人参 、柑橘類の果実、リンゴ、マルメロ、サトウダイコン、ココナッツミルク及びそ の他の植物又は植物生産品から行われる。 ガラクツロニドの獲得のためには、有利に出発材料を小さく破砕し、熱湯で抽 出した。この抽出液を、はじめに凍結乾燥するか、又は直接更に加工することが できる。更なる加工は有利にガラクツロニドを抽出物の他の成分（例えば、他の サッカライド）から分離することを可能とするクロマトグラフ法で達せられる。 有利なクロマトグラフ分離法は、ゲルクロマトグラフィー（例えば、ビオゲル（ ＢｉｏＧｅｌ；登録商標）一分離剤、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ；登録 商標）−分離剤）及び／又はアニオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＤＥＡ Ｅ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ；商標）−分離剤）である。更に、得られた ペクチンはエステル化度を下げるために部分的に又は完全に鹸化し、又は／かつ 重合度を下げるために酸処理により、もしくは酵素的加水分解により加水分解す ることができる。 次に実施例につき、本発明を更に詳説する。実施例１： 新鮮な人参を洗浄し、皮をむき、かつおろす。沸騰水で抽出し、かつ引き続き 凍結乾燥することにより水溶性多糖類を獲得する。 次いで、１回目のゲルクロマトグラフィーによる分離工程をビオゲルＰ２を有 するカラムを介し、かつ蒸留水を溶離剤として実施する。このカラムの排出容量 で溶離された物質（ＳＦ Ａ）を合し、２回目のゲルクロマトグラフィーにより 分離する。分離剤としてはセファクリルＳ−３０００ＨＲを使用し、かつ溶離剤 としてはもう１度蒸留水を使用する。この時点で現れる２つの物質ピークのうち 後から溶離するものを集める。 第３の処理工程は溶離剤として傾斜緩衝液（リン酸塩緩衝液０.０１１Ｍ〜１ Ｍ、ｐＨ６.４）を用い、ＤＥＡＥ−セファセルを介して実施するイオン交換ク ロマトグラフィーである。高いモル濃度で溶離されるフラクション（ＳＦ ＩＩ ）をプールし、更に処理する。次いで、ＨＣｌでの加水分解（ｐＨ１．００）３ ７℃、４５分）を実施し、アルコール沈殿によりサッカライドを回収する。 この加水分解物をゲルクロマトグラフィー工程（セファクリルＳ−２０００Ｈ Ｒ、溶離剤：蒸留水）で３つの物質群に分離し、この際最も小さい分子量を有す る炭水化物（ＳＦ ２／３）を集める。 このフラクションの抗付着活性はその都度生じる副生成物の活性を上回り、こ れを用いて更に作業する。 個々の物質の抑制強度は処理の過程において、０．７％溶液（ＳＦ Ａ）にお ける５０％から、０.００５ ％溶液（ＳＦ ＩＩ）における８６.４％を越え、同様に０.００５％溶液（ＳＦ ２／３）における完全抑制に上昇する。 このことは、一定の効果を達成するために必要な濃度は純度が上昇すると共に 明らかに低下することを示す。このことは、同様な効果を達成するためには非常 に高濃度で使用しなければならない市販のペクチンとは対照的である。実施例２： 鹸化： 柑橘類ペクチン（Ｇｒｉｎｄｓｔｅｄｔ社；物質Ａ０）１１.３ｇを蒸留水１ ２００ｍｌ中に溶かし、０．５Ｎ ＮａＯＨ ４８０ｍｌと混合し、室温で１５ 分間鹸化する。この溶液を濃ギ酸でｐＨ４.０に調節する。この鹸化したペクチ ンを２倍容量メタノールで沈殿させ、水２００ｍｌ中に溶かし、かつ更にこの沈 殿を２回同じ方法で繰り返す。最後に得られた沈殿を５０℃で乾燥する（物質Ａ₁ ）。 秤量：７.１５ｇ。酵素による加水分解： 乾燥した沈殿を０.１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液１００ｍｌで溶かし、ギ酸（ １Ｍ）でｐＨ４.５に調節し、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ ｓ ｎｉｇｅｒ；Ｓｅｒｖａ社）からのペクチナーゼ５Ｓ ２１ｍｇと混合し、 かつ６０℃で６０分間恒温 保持する。この配合物を酵素活性化のために短時間８０℃に加熱し、冷却し、か つ前記の方法でメタノールで沈殿させる。遠心分離により（２０分，４０００Ｕ ／分）沈殿を獲得し、乾燥させる。 秤量：５ｇ（物質Ａ₂）。 薄層クロマトグラフィー検査により、加水分解が所望のオリゴガラクツロニド に関して十分な量で生じたかどうか、調べる。薄層クロマトグラフィー条件： 静止相：ＤＣ−完成プレート・キーゼルゲル（Ｆｅｒｔｉｇｐｌａｔｔｅｎ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ）６０（Ｍｅｒｃｋ社）１０ｃｍ×２０ｃｍ、 流動剤：エタノール：２５ｍＭ水性酢酸（１：１）、 展開：３５℃で、 噴霧試薬：メタノール５０ｍｌ＋Ｈ₂ＳＯ₄（２０％ｇ／ｇ）５０ｍｌ中のナフ タリン−１，３−ジオール２００ｍｇ、クロマトグラフィー： 加水分解生成物１.５ｇを蒸留水１５ｍｌ中に溶かし、かつクロマトグラフィ ー分割を行う。 カラム：ビオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社のガラス管（２.５／４０ｃｍ）、 床容量１５０ｍｌ 溶離剤：ギ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４.７、段階傾斜溶液０.２、０.３、０. ４、０.５、０.６、０.７ Ｍ各１８２ｍｌ 静止相：ビオラッド社ＡＧＭＰ１アニオン交換樹脂（溶離剤で平衡とする） 流速：３ｍｌ／分 フラクションの容量：２２ｍｌ 個々のフラクションを薄層クロマトグラフィーにより（条件は前記参照）その 組成に関し調べる。同じ組成のフラクションを合し、２倍容量のアセトンで沈殿 させる。このようにして得られたオリゴガラクツロニドを遠心分離により（４０ ００Ｕ／分）獲得し、蒸留水２０ｍｌ中に取り込む。 この溶液中に、ビオラッドＡＧ ５０ Ｗ Ｘ−８カチオン交換体（Ｈ⁺）を 混入撹拌し、ガラクツロニドを遊離酸の形にする。この樹脂を除去し、かつ濾液 を凍結乾燥するとフレーク状の白色粉末が得られる。 この抑制の結果は次の表１中に示す。 抑制効果の試験法： 付着テスト： １）ヒトＯ＋赤血球の血液凝集：赤血球と菌とを合することにより、強力な血 液凝集性菌株は２０秒以内に赤血球の凝集が生じ、この凝集は血液型非認容性の 強度に相応する。 赤血球の濃度：１〜１.５％ 菌懸濁液：４６２ｎｍにおいて混濁懸濁液ＯＤ１＝菌１０⁹／ｍｌ 凝集遮断の評価においては菌を赤血球に添加する前に２時間炭水化物溶液と共 にその都度所望の濃度で恒温保持し、次いで、血液凝集を目で、半定量的に評価 する。 ２）ヒト泌尿器上皮への付着：朝尿からの泌尿器上皮を遠心分離により単離す る。菌懸濁液を（上記と同様に）上皮細胞と合し、恒温保持し、その後８μのポ リカーボネートフィルターで濾過し、複数回洗浄する。フィルターを取り除き、 生理ＮａＣｌ−溶液中に導入し、かつ上皮細胞を揺すって落とす。このＮａＣｌ −懸濁液を再び遠心分離し、かつ沈積物をスライドガラス上に担持し、マイ・グ リューンヴァルド及びジムザ（Ｍａｙ Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ ｕｎｄ Ｇｉｅｍ ｓａ）により染色し、かつ上皮細胞５０個に付着する菌の数を数える（空試験値 ）。 対照：菌接触なしの上皮細胞。 付着遮断：同様の方法を行うが、上皮細胞懸濁液に添加する前に菌を１〜３時 間の間種々の炭水化物の溶液中（０.５、０.１、０.０５、０.００１％）に入れ る。 使用した菌：患者から単離した４種の大腸菌野生菌株及び２種の市販の菌株を 一様に入れた。結果： 微生物学的実験の範囲において、下に挙げた酸性オリゴサッカライド及び多糖 類のほかに、全く付着遮断作用を示さない中性サッカライド（例えば、イヌリン のようなフルクタン、ラクトース及びラクツロースのようなジサッカライド等） も使用した。 天然の、即ち抽出によって得られたペクチンは付着遮断作用を示すが、この作 用は更なる処理、例えば鹸化及び加水分解により上昇させることができた。 こうして、前記テスト配合物においてニンジンから 水抽出により得られたペクチンは１％溶液においてテスト配合物中で４６％の抑 制を示し、精製した製品は同じ配合物において０.１％の濃度で８０％の抑制を 示した。 次の第２表には微生物学的実験の更なる結果を記載している： 選択した物質による上皮細胞へのバクテリアの付着の遮断（％）： 第２表から明らかなように、効果の上昇はエステル化度及び分子の大きさ（重 合度）に依存して誘導することができる。 有利な結果は重合度２〜７で得られる。 鹸化（即ち、エステル基の除去）により、同様に遮断の改善が見られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ユーレニチュ，ヨハン オーストリア国 アー―1020 ヴィーン ウンテレ アウガルテンシュトラーセ ５ ／４／４／９ (72)発明者 デ ベッティッヒニース−ドゥッツ，アン ドレアス オーストリア国 アー―1130 ヴィーン ミューニヒライターシュトラーセ 52／７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．作用物質として重合度≧２及びエステル化度＜２０％を有する１種以上の ガラクツロニドを場合により薬学的に常用の担体、希釈剤、助剤及び充填剤とと もに含有することを特徴とする、哺乳類細胞への菌付着遮断用医薬調剤。 ２．ガラクツロニドのエステル化度が＜１０％である請求項１記載の医薬調剤 。 ３．ガラクツロニドのエステル化度が＜５％である請求項１又は２記載の医薬 調剤。 ４．ガラクツロニドの重合度が２〜７である請求項１から３までのいずれか１ 項記載の医薬調剤。 ５．ガラクツロニドの重合度が２〜６である請求項１から４までのいずれか１ 項記載の医薬調剤。 ６．ガラクツロニドの重合度が２〜５である請求項１から５までのいずれか１ 項記載の医薬調剤。 ７．ガラクツロニドの重合度が２〜４である請求項１から６までのいずれか１ 項記載の医薬調剤。 ８．ガラクツロニドの重合度が２〜３である請求項１から７までのいずれか１ 項記載の医薬調剤。 ９．ガラクツロニドの重合度が２である請求項１から８までのいずれか１項記 載の医薬調剤。 １０．咄乳類細胞への菌の付着遮断用医薬調剤の製造のために重合度≧２のガ ラクツロニドの使用。 １１．胃腸管、血液系、気道、泌尿生殖器官又は／及び鼻咽腔の感染治療用医 薬調剤を製造するための請求項１０記載の使用。 １２．細菌の付着を遮断するための請求項１０又は１１記載の使用。 １３．ガラクツロニドのエステル化度が＜２０％である請求項１０から１２ま でのいずれか１項記載の使用。 １４．ガラクツロニドの重合度が２〜４である請求項１０から１３までのいず れか１項記載の使用。 １５．作用物質として重合度≧２を有する１種以上のガラクツロニドを含有す る医薬調剤を投与することを特徴とする哺乳類細胞に菌が付着することを遮断す るための方法。