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Die Erfindung betrifft ein Medikament zur oralen Verabreichung zur Verwendung bei einem Verfahren zum Behandeln oder Verhindern von bakteriellen Infektionen des Magendarmtrakts. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Medikament zur oralen Verabreichung zur Verwendung bei einem Verfahren zum Behandeln oder Verhindern von Adipositas.
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Die intestinale Mikrobiota enthält über 1014 Bakterien und spielt bei Gesundheit und Erkrankung eine Rolle. Die Interaktion von Mikrobiota und Wirt spielt beim Aufrechterhalten von intestinaler Homöostase eine Schlüsselrolle. Änderungen entweder der Darm-Mikrobiota oder der Wirtsgenetik können zu Änderungen der normalen Darmflora führen, was als mikrobielle Dysbiose bezeichnet wird. In dem Versuch, die Darm-Mikrobiota zu steuern, hat sich der Einsatz von Antibiotika zu einem Routinevorgehen zum Behandeln sowohl von Menschen als auch von Nutztieren entwickelt. Untersuchungen haben gezeigt, dass die Antibiotikabehandlung von Hühnern, Rindern und Schweinen die Infektion mit Salmonellen und E. coli reduziert. Antibiotika vermehren aber nachweislich Proteobakterien, ein Stamm, der eine große Anzahl an pathogenen Bakterien enthält. Ferner trägt der Langzeiteinsatz von Antibiotika auch nachweislich zu der erhöhten Prävalenz von antibiotika-resistenten Bakterien bei. Ein zusätzliches Risiko liegt in der potentiellen Übertragung von Antibiotikaresistenzgenen auf die vorhandene Mikroflora, was zur Ausbreitung von antibiotikaresistenten Bakterien beiträgt. Nutzvieh dient insbesondere als Reservoir für Bakterien, die antibiotikaresistent sind. Diese resistenten Bakterien pflegen sich aus Dung, der häufig als Dünger verwendet wird, auf die Wasserversorgung und auf Pflanzen, die von anderen Tieren oder Menschen verzehrt werden, auszubreiten.
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Infolge der nachteiligen Wirkungen eines kontinuierlichen Antibiotikaeinsatzes haben Untersuchungen begonnen, alternative Verfahren zum Steuern und Aufrechterhalten der normalen Darm-Mikrobiota bei gleichzeitigem Verhindern von Infektion zu erforschen. In den letzten Jahren wurde die Aufmerksamkeit auf Nahrungsergänzungsmittel gerichtet. Lösliche diätetische Oligosaccharide, die aus verschiedenen Quellen gewonnen werden, fördern nachweislich die Proliferation von bestimmten nützlichen Bakteriengruppen und werden daher als Präbiotika bezeichnet. Beispiele für Präbiotika umfassen Fructooligosaccharide, Galactooligosaccharide, Arabinose, Galactose, Inulin, Raffinose, Mannose, Lactulose, Stachyose, Mannanoligosaccharide, Xylooligosaccharide, Palatinose, Laktosukrose, Glycooligosaccharide, Isomaltooligosaccharide und Sojabohnen-Oligosaccharide.
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Eine Nahrungsergänzungsmittelstrategie wird seit jeher für die Prävention und Behandlung von Durchfall verwendet. Ernst Moro, ein österreichischer Arzt und Pädiater, bewies 1908, dass eine Karottensuppe die Säuglingssterblichkeitsrate durch Durchfall in Deutschland drastisch senkte (Kunz C: Historical aspects of human milk oligosaccharides. Adv Nutr 2012;3:430S–439S). Später wurde angenommen, dass Oligo(2-7)-Galacturonsäure für die Antidurchfallwirkung der Karottensuppe verantwortlich ist. Es gibt bereits ein Medikament, das auf die Wirksamkeit von Substanzen bei der Behandlung von Durchfall setzt. Man meinte, dass die Aktivität darauf beruht, dass die Substanz das Andocken von Bakterien an die Darmwand behindert.
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In Abweichung von dieser Hypothese oder zumindest komplementär dazu haben die Erfinder hierin festgestellt, dass die Substanz durch Hindern des Wachstums bestimmter Mikrobiata in bestimmten Regionen des Magen-Darm-Trakts, einschließlich Hindern des Wachstums von Erregern, tatsächlich beim qualitativen und quantitativen Ändern der Darm-Mikrobiota wirksam ist. Dies war überraschend, da es bisher keinen Nachweis für eine solche Wirkungsweise gab. Von besonderem Interesse war unter anderem die Feststellung, dass das Wachstum solcher Bakterien, die die Resorption von Nährstoffen unterstützen, reduziert ist.
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Das Verstehen dieser Wirkungen legt alternative medizinische Nutzungen für die Substanz Oligo-(2-7)-Galacturonsäure nahe, die Gegenstand der vorliegenden, nachstehend beschriebenen Erfindung sind.
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Die Erfindung betrifft ein Medikament zur oralen Verabreichung, das Oligo-(2-7)-Galacturonsäure umfasst, zur Verwendung bei einem Verfahren zum Behandeln oder Verhindern von bakteriellen Infektionen des Magendarmtrakts. Das Medikament kann auch in Form eines Nahrungsergänzungsmittels vorliegen. Es kann bei Menschen oder Tieren eingesetzt werden. Besonders bevorzugt ist der Einsatz des Medikaments der Erfindung bei der Prävention von bakteriellen Infektionen des Magen-Darm-Trakts von Tieren, wie etwa Nutztieren (einschließlich Rinder, Schweine, Geflügel und Fische). Die Prävention oder Behandlung kann zum Beispiel durch Verabreichung in regelmäßigen Intervallen, z. B. einmal täglich, erfolgen. Bei der Behandlung von Tieren kann das Medikament dem Futter der Tiere zugegeben werden, z. B. ein- oder zweimal täglich. Das Medikament kann an Stelle von Antibiotika, die bei der medikamentösen Behandlung von Tieren besonders bevorzugt wären, oder zusätzlich zu Antibiotika verwendet werden. Der Einsatz ohne Antibiotika kann bei der präventiven Verabreichung des Medikaments der Erfindung besonders attraktiv sein.
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Die Erfindung betrifft ferner ein Medikament zur oralen Verabreichung, welches Oligo-(2-2)-Galacturonsäure umfasst, zur Verwendung bei einem Verfahren zum Behandeln oder Verhindern von Adipositas. Besonders bevorzugt ist der Einsatz des Medikaments der Erfindung bei der Behandlung von Adipositas bei Menschen. Die Prävention oder Behandlung kann zum Beispiel durch Verabreichung in regelmäßigen Intervallen, z. B. einmal täglich, erfolgen. Bei der Behandlung von Tieren kann das Medikament dem Futter der Tiere zugegeben werden, z. B. ein- oder zweimal täglich.
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Das saure Oligosaccharid Oligo-(2-7)-Galcturonsäure wird im Folgenden auch als Galursan HF 7K oder GHF7K bezeichnet. Vorzugsweise wird die Substanz in ihrer isolierten Form (Reinheit > 90% oder > 95%) oder synthetisierten Form verwendet. In einer Ausführungsform umfasst das Medikament keine weiteren aus Karotte isolierten Inhaltsstoffe.
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In einer Ausführungsform umfasst das Medikament mehr als 5 Gewichtsprozent isoliertes Galursan HF 7K. Bevorzugte Medikamente umfassen mehr als 10, 20 oder 40 Gewichtsprozent isoliertes Galursan HF 7K.
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In einer Ausführungsform umfasst das Medikament ferner pharmazeutisch zulässige Adjuvantien, wie etwa zum Beispiel Cellulose, Stärke, Lactose, Hydroxymethylstärkenatrium, Magnesiumstearat, Talkum oder Polyvinylpyrrolidon; und/oder umfasst ferner pharmazeutisch zulässige Zusatzstoffe, wie etwa Verdünnungsmittel, Klebstoffe, Auflösungsmittel, Schmierstoffe, Farbstoffe, Antioxidantien und/oder Aromastoffe.
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In einer Ausführungsform besteht das Medikament aus Galursan HF 7K und optional aus einem oder mehreren der vorstehend beschriebenen Zusatzstoffe.
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In einer Ausführungsform liegt das Medikament in der Form von Tabletten oder Pulver vor. Falls das Medikament in Form von Pulver vorliegt, können Packungen vorbestimmter Dosen für eine Einzelverabreichung vorgesehen werden.
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Weitere Einzelheiten der Erfindung gehen aus den Experimenten und Figuren hervor, die nachstehend beschrieben werden.
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Verfahren:
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Mäuse.
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Bei allen Experimenten wurden Mäuse mit einer Schwäche gegenüber Friend-Virus-B/NIH (FVB/N) WT verwendet. 6–8 Wochen nach Abstillen wurden die Mäuse entweder bei einer Kontrollmauskost (CT, 7922 NIH-07 Mauskost, Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) oder einer GFH7K-Kost (Richter Pharma AG; Wels, Österreich) gehalten, die aus 2% GFH7K besteht, das dem Kontrollkosffutter und Trinkwasser zugegeben wurde. Die CT-Kost bestand aus 22,5% Rohprotein, 5,2% Fett, 3,7% Rohfaser, 3,1 kcal/g Energiedichte, 29% Kalorien aus Protein, 15% Kalorien aus Fett und 56% Kalorien aus Kohlenhydraten. Die Kost wurde 14 Tage lang gefüttert und Wasser wurde täglich aufgefüllt. Dieses Experiment wurde zweimal getrennt wiederholt (1: CT n = 8, GHF7K n = 7, 2.: CT n = 6, GHF7K n = 4). An Tag 15 wurden von den mit CT- und GFH7K-Kost gefütterten Mäusen ~5 cm lange Segmente von Duodenum, Jejunum, terminalem Ileum (nachstehend als Ileum bezeichnet), Blinddarm und Colon (proximal und distal) entnommen. Die einzelnen Darmsegmente wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gespült und es wurden wie vorstehend beschrieben Schleimhautabstriche entnommen. Die Darmsegmente wurden kurz mit 500 μl PBS gespült. Dann wurden die Segmente der Länge nach geöffnet, sorgfältig mit PBS gewaschen und zum Abschaben der Epithelien- und Schleimhautschicht wurden Objektträger verwendet. Luminale Spülungen und Schleimhautabstriche wurden zu Gesamt-DNA verarbeitet, die bei –20°C gelagert wurde, bis die Proben durch quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) ausgewertet wurden.
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Bakterienstämme und Aufzuchtbedingungen.
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Es wurden reine Kulturen bakterieller Stämme verwendet, um Standardkurven zu erzeugen, um die Anzahl bakterieller Zellen mit qPCR-Zyklusschwellen(CT)-Werten zu korrelieren. Micrococcus luteus, Peptostreptococcus anaerobius, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Faecalibacterium prausnitzii und Burkoholdena cepacia waren ein Geschenk von Dr. Daniel J. Hassett. Lactobacillus acidophilus und Rhibozium legaminosarum wurden von Carolina Biological Supply Company (Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC), erworben, Bacteroidetes thetaiotaomicron ATCC 29741 und Prevotella melaninogenica ATCC 25845 wurden von Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) erworben und Ruminococcus productus ATCC 27340D-5 wurde von ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) erworben. E. coli. S. aureus, M. luteus, B. cepacia, L. acidophilus und R. legaminosarum wurden in Luria-Burtani-Medium (LB; Thermo Fisher Scientific) bei 37°C in einem Schüttelinkubaor gezüchtet. R. productus und F. prausnitzii wurden in Tryptonhefeextrat-Glucose-Medium (TYG; Thermo Fisher Scientific) gezüchtet, P. melaninogenica und B. thetaiotaomicron wurden in Trypton-Soja-Medium (TSB; Thermo Fisher Scientific) gezüchtet und Peptostreptococcus anaerobius wurde in Hirn-Herz-Infusions-Medium (BHI; Thermo Fisher Scientific) bei 37°C in einer Dualport-Anaerobenkammer (Coy Systems, Coy Lab Products, Grass Lake, MI) gezüchtet. Die Zahlen bakterieller Zellen wurden mittels einer Petroff-Hauser-Kammer (Hausser Scientific; Horsham, PA) und durch Kolonie bildende Einheiten (KBE) ermittelt.
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qPCR-Amplifizierung von bakteriellen 16S Genom-DNA-Sequenzen.
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Zum Extrahieren der Gesamt-DNA wurde ein QIAamp DNA Stool Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) entsprechend den Herstelleranweisungen und wie vorstehend beschrieben bei Zugabe von Lysozym (10 mg/ml, 37°C, 30 min. lang) und 95°C Lysetemperatur verwendet. qPCR wurde genutzt, um die Menge der gesamten Bakterien und Bakterien-Phyla, -Klasse, -Genus und -Spezies mit Hilfe einer Step One Real Time PCR-Maschine (Applied Biosystems, Carlsbad, California USA) mit SYBR Green PCR Master-Mix (Applied Biosystems) und bakterienspezifischen Primern zu 16S Genom-DNA (Tabelle 1) in einem Endvolumen von 20 μl zu analysieren. Die Standardkurven wurden aus reinen Bakterienkulturen erzeugt und verwendet, um die Bakterienzahl aus einem Zyklus von Schwellenwerten (CT) zu berechnen. Die Zusammensetzung der Bakterien-Phyla wurde mit Hilfe berechneter CFU-Werte für jede Bakterien-Phyla als Prozentsatz der gesamten Bakterien ermittelt. Die gesamten Bakterien wurden mit Hilfe des Universal-Bakterien-Primers berechnet und stellen die Gesamtzahl an Bakterien pro geprüftes Darmsegment dar.
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Ionenkonzentrationsmessungen.
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Es wurden mit 100 μl doppelt deionisiertem Wasser gespülte Darmsegmente verwendet, um die Ionenzusammensetzung des Darminhalts der wie vorstehend beschrieben mit CT- und GHF7K-Kost gefütterten Mäuse zu analysieren. An Darmsegmenten gleicher Länge, die verwendet wurden, um Bakterienbelastung zu entnehmen, wurden Spülungen vorgenommen. Die entnommenen Spülungsproben wurden gewogen und das Darmvolumen wurde aus dem Gesamtgewicht minus der 100 μl Spülwasser unter Annahme einer Dichte von 1 berechnet. GHF7K-Futter änderte das Darmfluidvolumen nicht (Daten nicht gezeigt). Die Spülungen wurden dann bei 1.400 g 10 min. lang bei 4°C zentrifugiert, um intestinale Feststoffe zu granulieren. Um die Konzentrationen von supernatantem Na+ und K+ zu ermitteln, wurde Flammenphotometrie verwendet (digitaler Flammenphotometer, Single-Channel Digital Flame Photometer Modell 02655-10; Cole-Parmer Instrument Company Vernon Hills, IL). Chloridometrie wurde verwendet, um die Cl-Ionen-Konzentration zu ermitteln (digitales Chloridometer, Modell 4425100, Labconco Kansas City, MO). Die berechnete Ionenkonzentration wurde auf intestinale Volumen normalisiert und als mM dargestellt. Ein elektronisches pH-Messgerät (Orion Mdel 720A, Thermo Fisher Scientific Waltham, MA) wurde verwendet, um den pH-Wert elektrochemisch zu messen.
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Statistik.
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Die Daten sind hierin als Mittel ± SEM dargestellt. Unterschiede zwischen Gruppen, die durch zwei Faktoren (Futter und Darmregion) bestimmt werden, wurden mit Hilfe der Zweiweg-Varianzanalyse (ANOVA) ermittelt. Der Post-Hoc-Test nach Holme-Sidak wurde mit Hilfe von SigmaPlot (Systat Software Inc, San Jose, CA) verwendet, um eine Signifikanz zwischen paarweisen Vergleichen zu ermitteln. P < 0,05 wurde als signifikant eingestuft, und n ist die Anzahl an Experimenten.
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Ergebnisse:
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WT-FVB/N-Mäuse wurden entweder mit einem Kontrollfutter (CT) oder einer Kost, die mit 2% GHF7K in Wasser und Futter supplementiert war, über einen Zeitraum von 2 Wochen gefüttert. Das Mausgewicht wurde zu Beginn und am Ende der Untersuchung geprüft. Während des Verlaufs der Untersuchung wurden keine signifikanten Gewichtsänderungen beobachtet (Tabelle 2). Ferner nahmen Mäuse, die mit GHF7K supplernentiert wurden, die gleiche Nahrungs- und Wassermenge zu sich, wie mit CT-Kost gefütterte Mäuse, was anzeigt, dass der Zucker selbst keinen erhöhten Nahrungs- oder Wasserverbrauch oder Gewichtszuwachs stimulierte. Um zu prüfen, ob die Gesamtzahl an Bakterien bei den mit GHF7K supplementierten Mäusen geändert war, wurde aus luminalen Spülungen und Schleimhautabstrichen DNA extrahiert und durch qPCR mit Hilfe eines Universal-16S-RNA-Primers analysiert. Bei der Gesamtzahl der luminalen Bakterien (gesamte Bakterienbelastung) wurden in keinem intestinalen Segment Änderungen festgestellt (1A). Wie bei der luminalen Bakterienpopulation wurden bei der der Schleimhaut zugeordneten Bakteriengesamtbelastung keine Änderungen festgestellt (1B). Dies weist darauf hin, dass bei der mit GHF7K supplementierten Kost keine allgemeine Überbesiedlung oder Abnahme von Bakterien auftrat. Dies ist vorteilhaft, da vermehrte Gesamtbakterien einer erhöhten bakteriellen Translokation, Sepsis und Entzündung zugeordnet werden. Dadurch sind minimale Änderungen der gesamten luminalen und schleimhautassoziierten Bakterienpopulationen wahrscheinlich vorteilhaft, da es potentiell schädliche Epithel-Immunreaktionsinteraktionen minimiert.
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Um zu ermitteln, ob GHF7K die Darm-Mikrobiota in ähnlicher Weise wie Antibiotika ändern konnte, wurde die bakterielle Zusammensetzung durch qPCR mit Hilfe von spezifischen Primern für Bakterien-Phyla analysiert. Untersuchungen haben gezeigt, dass der Magen-Darm-Trakt von Mäusen und Menschen durch Firmicutes und Bacteroidetes dominiert wird, während Actinobakterien, Proteobakterien, Fusobakterien und Verrucomicrobia-Phyla in geringerer Abundanz vorhanden sind. Die wesentlichen intestinalen Bakterien-Phyla von Mäusen wurden als Prozentsatz der Gesamtbakterien verglichen, wie in 2 gezeigt ist. Im Duodenum oder Blinddarm (2A) gab es aufgrund der GHF7K-Kost keine signifikanten Änderungen der luminalen Bakterienpopulation. Es lag aber eine Abnahme von Firmicutes (Δ23,1 ± 3,7% zwischen CT und GHF7K) und eine Zunahme von Bacteroidetes (22,3 ± 4,1%) im Jejunum von mit GHF7K-gefütterten Mäusen vor. Analog wies das Ileum der mit GHF7K gefütterten Mäuse eine Abnahme von Firmicutes (19,8 ± 2,4%) und eine Zunahme von Bacteroidetes (11,2 ± 2,3%) auf, während in dem proximalen Colon eine Abnahme von Bacteroidetes (15,8 ± 1,2%), aber keine signifikante Änderung von Firmicutes (0,9 ± 0,2%) vorlag. In dem distalen Colon lag in der Gruppe des Experiments eine Abnahme sowohl von Firmicutes (10,7 ± 2,2%) als auch von Bacteroidetes (14,0 ± 3,0%) vor. Actinobakterien wiesen keine Änderung in einem der intestinalen Segmente der mit GHF7K gefütterten Mäuse auf. Interessanterweise nahmen α-, β-, γ-Proteobakterien im Ileum (8,6 ± 1,8%), im proximalen (15,0 ± 2,8%) und distalen Colon (24,2 ± 4,7%) zu. Die Zunahme von Proteobakterien ähnelt der, die bei Einsatz von Antibiotika beobachtet wird. Bei den mit GHF7K gefütterten Mäusen war die Zunahme an Proteobakterien auf eine Zunahme von γ-Proteobakterien (Ileum: 8,46 ± 1,9%, proximaler Colon: 14,0 ± 2,5%, distaler Colon: 2,4 ± 0,8%) und α-Proteobakterien (distaler Colon: 21,1 ± 3,8%) zurückzuführen. Proteobakterien, insbesondere γ-Proteobakterien, umfassen eine Reihe von pathogenen Bakterien, wie etwa Escherichia coli, Salmonellen, Yersinia, Vibrio und Pseudomonas. Die vermehrten γ-Proteobakterien bei den mit GHF7K gefütterten Mäusen können das Wachstum von nicht residenten pathogenen Spezies und somit Infektion mittels Konkurrenz minimieren, da Mitglieder der gleichen Phyla die gleiche Nische besetzen.
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Bei der luminalen Bakterienpopulation wurden dagegen keine signifikanten Änderungen der mukosa-assozierten Bakterienpopulation in den unteren intestinalen Segmenten festgestellt (2B). Es wurden aber Änderungen der oberen intestinalen Segmente, des Duodenum und des Jejunum, festgestellt. Bei den mit GHF7K gefütterten Mäusen gab es im Duodenum eine Abnahme der α-, β-, γ-Proteobakterien (3,0 ± 1,5%) und eine mäßige Zunahme von Firmicutes (2,1 ± 0,7%). Im Jejunum gab es eine Zunahme von Actinobakterien (4,2 ± 1,1%) mit einer Abnahme bei anderen nicht spezifizierten bakteriellen Spezies (5,9 ± 1,1%). Dies zeigt, dass das GHF7K primär die luminale Bakterienpopulation beeinflusst und dass diese Wirkungen regionsspezifisch sind.
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Als Nächstes wurden Untergruppen der Hauptphyla aus der luminalen Bakterienpopulation durch qPCR mit Hilfe von subgruppenspezifischen Primern und Bakterienzellenzahlen geprüft, die durch Vergleich mit Standardkurven, die aus jeder einzelnen Spezies erzeugt wurden, berechnet wurden. Antibiotika verringern nachweislich die meisten der Clostridium-Gruppen, einschließlich C. coccoides Cluster XIVa und C. leptum Cluster IV. Ferner verringerten nachweislich bei früheren Experimenten Antibiotika Bacteroides, Prevotella, Lactobacillus, Bifidobacteria und Prevotella sowie intestinale Bacteroidetes von Mäusen (MIB). Diese Gruppen wurden in der luminalen Bakterienpopulation von mit GHF7K gefütterten Mäusen geprüft, um zu ermitteln, ob GHF7K diese Gruppen ähnlich wie Antibiotika reduziert. Bei der Firmicutes-Subgruppe Lactobacillus oder der Actinobakterien-Subgruppe Bifidobakterium wurden in keinem der intestinalen Segmente der mit GHF7K gefütterten Mäuse Änderungen festgestellt (3. Lactobacillus und Bifidobakterium werden wegen ihrer therapeutischen und prophylaktischen Eigenschaften häufig als Probiotika verwendet. Bekannte Untersuchungen haben gezeigt, dass probiotische Bakterien bei der Behandlung von Durchfall und Injektion mit Erregern vorteilhaft sein können. Daher ist es vorteilhaft, dass die GHF7K-Kost keine dieser wertvollen Bakterien reduziert.
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Bei Prüfung der Firmicutes-Subgruppe C. coccoides Cluster XIVa und C. leptum Cluster IV wurden bei der GHF7K-Kost Änderungen festgestellt (4). Beim Jejunum von mit GHF7K gefütterten Mäusen wurden verringerte C. Coccoides festgestellt, während im Blinddarm, dem proximalen und distalen Colon vermehrte C. coccoides auftraten. Sowohl im Duodenum als auch im Jejunum der mit GHF7K gefütterten Mäuse wurde signifikant verringerte C. leptum festgestellt. Die Bacteroidetes-Subgruppen Bacteroides, Prevotella und MIB wurden ebenfalls untersucht (5). In dem proximalen und distalen Colon war MIB verringert, und Prevotella war in dem Duodenum der mit GHF7K gefütterten Mäuse signifikant reduziert. In keinem intestinalen Segment wurden Änderungen bei den Bakterioden festgestellt. Mit Ausnahme der reduzierten MIB spiegelten die Änderungen der Firmicutes- und Bacteriodetes-Subgruppen keine bei Antibiotika festgestellten Änderungen direkt wieder. Zusammen legen diese Daten nahe, dass die GHF7K-Kost die Darm-Mikrobiota auf Ebene der Phyla und Subgruppen ändern kann.
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Bestimmte bakterielle Gruppen haben die Fähigkeit, Ionentransport zu ändern. Um zu ermitteln, ob GHF7K die luminale Ionenkonzentration entweder direkt oder indirekt beeinflusste, wurden Na+ und K+ Konzentrationen des intestinalen Inhalts durch Flammenphotometrie ermittelt, und die Cl-Konzentration wurde durch Chloridometrie ermittelt, wie in 6 dargestellt ist. Verglichen mit den mit CT-Kost gefütterten Mäusen wiesen mit GHF7K gefütterte Mäuse eine erhöhte luminale Konzentration von Na+ im Blinddarm auf, ohne Änderungen in einem anderen Segment (6A). Die K+ Konzentration war ebenfalls betroffen: K+ war im Blinddarm und im distalen Colon der experimentellen Gruppe verringert (6B). Die Cl-Konzentration war nur im Duodenum und Jejunum der mit GHF7K gefütterten Mäuse erhöht (6C). Die Unterschiede bei den Na+ und K+ Konzentrationen im Blinddarm und Cl-Konzentrationen in dem oberen Abschnitt des Dünndarms, die zwischen mit CT und GH7FK gefütterten Mäusen festgestellt wurden, könnten Änderungen der intestinalen Reabsorption darstellen. Diese Änderungen wurden aber wahrscheinlich von dem Colon behoben, da in diesem Segment keine Unterschiede der Konzentration von Na+ und Cl festgestellt wurden. Bei der Konzentration von K+ im distalen Colon wurden Abnahmen festgestellt, was eine verringerte Sekretion von K+ anzeigen kann. Es ist nicht klar, ob diese Wirkung durch den Wirt oder durch Bakterien vermittelt wird, stellt aber eine andere Ebene einer Interaktion zwischen Bakterien und Wirt dar. Änderungen der Ionenzusammensetzung können die Darm-Mikrobiota beeinflussen, und eine geänderte Ionenzusammensetzung kann einen Mechanismus darstellen, durch den sich neu stark vermehrende Bakterien eine Nische halten können. Diese Daten zeigen, dass die GHF7K-Nahrungsergänzung die luminale Ionenzusammensetzung zusammen mit der geänderten bakteriellen Zusammensetzung ändern kann. In keinem intestinalen Segment der mit GHF7K gefütterten Mäuse wurden Änderungen des intestinalen pH festgestellt (6D), ähnlich den bei mit Galacturonsäure gefütterten Hunden festgestellten Ergebnissen. Zusammen genommen demonstrieren diese Untersuchungen, dass eine mit GHF7K ergänzte Ernährung spezifische regionale Änderungen der Darm-Mikrobiota auf der Ebene von Phyla und Subgruppen und der Ionenzusammensetzung des intestinalen Inhalts induzieren kann, die Änderungen des Darmmilieus entsprechen.
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Diskussion
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Es ist gut belegt, dass Oligosaccharide in dem Darmtrakt von Säugetieren abgebaut werden und durch Modifizieren der Wirts-Mikrobiota in vorteilhafter Weise als Präbiotikum wirken können. Das Konzept des Modulierens von Darmgesundheit durch Ernährung wird seit jeher genutzt, doch jüngst haben wissenschaftliche Fortschritte begonnen, einen mechanistischen Einblick zu liefern, wie Nahrungsergänzung für den Wirt von Vorteil sein kann. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Beurteilung der präbiotischen Eigenschaften des sauren Oligosaccharids GHF7K. Unsere Daten beweisen, dass die GHF7K-Nahrungsergänzung die Proteobakterien des Phylums durch Vermehren von α- und γ-Proteobakterien vermehrt. Die GHF7K-Nahrungsergänzung ändert auch die Firmicutes- und Bacteriodetes-Subgruppen-Mitglieder in regionsspezifischer Weise. Diese Substanz ist für die Nutzviehindustrie, die derzeit für die Zwecke der Tiergesundheit auf Antibiotika setzt, von besonderem Interesse. Wenn GHF7K die bei Antibiotika festgestellten vorteilhaften Wirkungen reproduzieren kann, während es konstante Werte nützlicher Bakterien hält, dann könnte es als Antibiotikaalternative dienen. Dies wäre von großer Bedeutung, um die Ausbreitung von Antibiotikaresistenz in der Nahrungskette zu reduzieren. In dieser Arbeit demonstrieren wir in einem Mausmodell, dass GHF7K die Nutzung von Antibiotika nachahmt, indem es die Proteobakterien vermehrt, und dass es potentiell als Antibiotikaalternative verwendet werden könnte.
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Bacteroidetes und Firmicutes sind die zwei dominanten Phyla in allen Wirbeltieren. Untersuchungen haben nachgewiesen, dass Mäusen und Menschen auf hohen taxonomischen Ebenen (Phyla, Klasse, Ordnung) eine ähnliche Zusammensetzung zu eigen ist, sie sich aber auf den niedrigeren taxonomischen Ebenen (Genera, Spezies, Subspezies) stark unterscheiden. Trotz niedertaxonomischen Unterschieden bestehen auf der Phylumebene breite Trends. Ferner haben sich die Darm-Mikrobiota höherer Wirbeltiere (einschließlich Menschen, Mäuse und Nutztiere) in den Kernfunktionen ähnlich erwiesen, was zusätzlich den Wert der Verwendung von Mausmodellen zum Extrapolieren großer Trends in der Darm-Mikrobiota belegt. Interessanterweise wurden im Blinddarm von mit GHF7K gefütterten Mäusen keine Änderungen festgestellt. Der Blinddarm stellt einen ”Bioreaktor” dar und hat sich als relativ stabiles Milieu erwiesen. Es kann möglich sein, dass die Bedingungen im Blinddarm das Auftreten drastischer Änderungen verhindern, wodurch die Darm-Mikrobiota bewahrt wird. Der Blinddarm umfasst nachgewiesenermaßen eine komplexe Mikrobengemeinschaft, und auch wenn Änderungen der Phyla oder wesentlichen Subgruppen in diesem Bereich nicht festgestellt wurden, ist es möglich, dass auf der Ebene der Spezies Änderungen eintreten. Es wäre aber ein Sequenzieren erforderlich, um diese Änderungen vollständig anzugehen.
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Präbiotika stimulieren nachweislich das Wachstum und/oder die Aktivität von spezifischen Bakterien selektiv. Präklinische Untersuchungen zeigen, dass Präbiotika das Potential haben, bei der Behandlung von Krankheiten und bei der Prävention von Darminfektionen verwendet zu werden. In dieser Arbeit präsentierte Daten und Daten der Fachliteratur legen nahe, dass Präbiotika vorrangig die luminale Bakterienpopulation beeinflussen, wogegen die schleimhaut-assoziierten Bakterien scheinbar eher von Modifikationen auf Ebene der Wirtsepithelzellen beeinflusst werden. Zusätzlich zu Präbiotika und Probiotika werden auch Antibiotika verwendet, um die intestinale Darm-Mikrobiota zu modifizieren. Viele Antibiotika verringern nachweislich die nützlichen Bakterien Lactobacillus und Bifidobakterien. Es ist vorteilhaft, dass GHF7K diese beiden Gruppen nicht reduziert, da Lactobacillus und Bifidobakterien nachweislich den luminalen pH reduzieren, kurzkettige Fettsäuren erzeugen, antimikrobielle Verbindungen (Bakteriocine) ausscheiden, die Herstellung von antimikrobiellen Verbindungen (Defensinen) durch das Wirtsepithel induzieren, die Adhäsion von pathogenen Bakterien an Epithelzellen verhindern und aktiv um Nährstoffe konkurrieren, die von pathogenen Bakterien genutzt werden könnten. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Supplementierung mit sauren Oligosacchariden, wie etwa Galacturonsäuren, in der Babynahrung nicht die Werte von Bifidobakterien oder Lactobacillus beeinflusst. Dies steht im Einklang mit der vorliegenden Untersuchung, die bei mit GHF7K gefütterten Mäusen keine Änderung bei Bifidobakterien oder Lactobacillus demonstriert.
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Die GHF7K-Verabreichung führte auch zu regionsspezifischen Änderungen der Bacteroidetes und Firmicutes der Phyla und der Subgruppen C. coccoides, C. leptum, Prevotella und MIB. Ob diese Änderungen vorteilhaft, schädlich oder neutral sind, ist nicht eindeutig. Ernährungsumstellungen rufen nachweislich schnelle Änderungen in der intestinalen Metagenomik hervor, die alle mikrobiellen Gene von Wirt und Darm sowie entsprechende Funktionen repräsentiert. Solange aber die metagenomen Kernfunktionen in einem Wirt aufrechterhalten werden, werden die Änderungen bei der spezifischen Spezies aufgewogen und haben keine schädliche Wirkung. Zu diesem Zeitpunkt können wir spekulieren, dass GHF7K keine negative Auswirkung auf die Darm-Mikrobiota hat, da es nicht die grobe Morphologie des Darms änderte und auch nicht zu Änderungen in großem Maßstab, wie etwa Gewichtszunahme, bei den Mäusen führte. Es sind aber weitere Experimente erforderlich, um diese Frage umfassend anzugehen.
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Vancomycin, Metronidazol, Amoxicillin-Clavulansäure, Clindamycin, Ancomycin, Amipenem und Neomycin vermehren alle nachweislich die Phylum-Proteobakterien. Auch wenn Proteobakterien ein kleineres Taxon in der Darm-Mikrobiota darstellen, spielt diese Gruppe nachweislich eine signifikante, aktive Rolle beim Darmstoffwechsel und der Wirtsinteraktion insgesamt wieder. Diese Untersuchung hat demonstriert, dass GHF7K die Darm-Mikrobiota durch Heben der Werte von α- und γ-Proteobakterien ändert, was einen Nachweis seiner Verwendung als potentielle antibiotische Alternative liefert.
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Ein potentieller Nachteil der Verwendung von Antibiotika ist, dass Antibiotika zu vermehrter Anfälligkeit für weitere Infektionen mit Erregern führen können. Ob GHF7K die Erregeranfälligkeit steigert oder vor Besiedelung mit Erregern schützt, ist derzeit nicht bekannt. Künftig wäre es interessant, die mit GHF7K gefütterten Mäuse mit einem Pathogen, wie etwa Salmonella typhymurium, Escherichia coli oder Clostridium difficile, zu konfrontieren, um zu ermitteln, ob es tatsächlich einen Vorteil bietet. Auch wenn GHF7K Proteobakterien in der Tat vermehrt, spiegelt es die Antibiotikanutzung nicht vollständig wieder, was anzeigt, dass es ein gewisses Potential für einen Nutzen geben könnte. Ferner legen vorläufige Untersuchungen mit Oligo(2-7)-Galacturonsäuren bei Geflügelhaltung und bei der herkömmlichen Verwendung von Moros Karottensuppe nahe, dass GHF7K dem Wirt einen Nutzen bieten kann und eine Infektion mit Erregern verhindern und/oder beheben kann. Daher ist es plausibel, dass die Nahrungsergänzung mit GHF7K eine Infektion durch entweder (1) Hervorrufen der starken Vermehrung angesiedelter Proteobakterien, wodurch eine weitere Besiedelung durch andere pathogene Proteobakterien beschränkt wird, verhindern kann oder (2) dass die Zugabe von GHF7K ein bevorzugtes Bindungssubstrat von Proteobakterien-Mitgliedern ist und luminales GHF7K ein Binden von pathogenen γ-Proteobakterien an Oligosaccharide an der Mukosa des Wirts verhindern kann.
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Zusätzlich zu dem Potential der Verwendung von GHF7K als Antibiotikaalternative kann GHF7K für andere Krankheitsbilder von Nutzen sein, die mit einem veränderten Darmmilieu oder mikrobieller Dysbiose in Verbindung stehen. Ein Beispiel hierfür ist beim Menschen bei Magen-Bypassoperationen als Behandlung für adipöse Patienten erkennbar. Die Magen-Bypassoperation fördert nachweislich das vermehrte Wachstum von γ-Proteobakterien mit einer entsprechenden Abnahme von Firmicutes und Methanogenen, die für vermehrten Energieverbrauch bei adipösen Personen verantwortlich sind. Wir demonstrieren hierin, dass GHF7K in ähnlicher Weise wie eine Magen-Bypassoperation wirkt: Reduzieren von Firmicutes im Dünndarm und Vermehren von γ–Proteobakterien. Dies legt nahe, dass GHF7K auch als Nahrungsmittelzusatz bei adipösen Patienten verwendet werden könnte und ähnlich ”nützliche” Wirkungen wie nach der Magen-Bypassoperation beobachtet erzeugen kann. Auch wenn viele Oligosaccharide nachweislich die Darm-Mikrobiota ändern, ist es wichtig, darauf hinzuweisen, dass jedes Oligosaccharid seine eigenen Eigenschaften aufweist und nicht alle auf die gleichen Bakteriengruppen oder Spezies wirken. Die Daten dieser Untersuchung legen nahe, dass der Galursan HF7K Zucker potentiell verwendet werden könnte, um die Darm-Mikrobiota in vorteilhafter Weise mit festgelegten Änderungen der Populationen luminaler Bakterien zu ändern.
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Im Folgenden werden die Figuren besprochen:
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1. Mit GHF7K gefütterte Mäuse weisen verglichen mit Mäusen, die mit Kontrollkost gefüttert wurden, keine Änderungen bei den Gesamtbakterien auf. Die Gesamtbakterien wurden durch qPCR mit Hilfe von spezifischen Universal-Primern für die bakterielle 16S genomische DNA-Sequenz quantifiziert. Die Anzahl von Bakterienzellen wurde aus einer Standardkurve berechnet und auf intestinales Spülungsvolumen normalisiert. (A) In den luminalen Spülungen der mit Kontrollkost (n = 14, schwarze Balken) und GHF7K-Kost (n = 11, weiße Balken) gefütterten Mäuse enthaltene Bakterien. (B) Mukosa-assoziierter (anhaftender) Bakterienbestand zwischen Mäusen der Kontrollkost (n = 14, schwarze Balken) und der GHF7K-Kost (n = 11, weiße Balken). Wie erwartet ist die Anzahl der Gesamtbakterien im Colon signifikant größer als die Gesamtzahl im Dünndarm (P < 0,001). Die GHF7K-Kost änderte die Anzahl der Gesamtbakterien pro vorgegebenem Segment nicht signifikant (P = 0,665), was darauf hindeutet, dass die GHF7K-Kost die Gesamtbakterienlast im Mausdarm insgesamt nicht ändert. Analysiert durch Zweiwege-ANOVA mit Holme-Sidak-Post-Hoc-Test.
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2. Mit GHF7K gefütterte Mäuse weisen regionsspezifische Änderungen der luminalen und mukosa-assoziierten Darm-Mikrobiota auf. Die relative Abundanz wurde als Prozentsatz von Bakterienphyla verglichen mit Gesamtbakterien für luminale (A) und mukosa-assoziierte Bakterien (B) berechnet. Die Beschriftung ist in Fig. (C) gezeigt. Bei allen Bakterienpopulationen wurden Unterschiede auf der Segmentebene festgestellt (P < 0,001), was auf unterschiedliche Besiedelungsmuster abhängig von der Region hindeutet. Drastischere Änderungen fanden sich bei der luminalen Bakterienpopulation verglichen mit der mukosa-assoziierten Bakterienpopulation. Bei der luminalen Population wiesen Firmicutes signifikante Änderungen im Jejunum (P = 0,029), Ileum (P = 0,030) und im distalen Colon (P = 0,048) auf. Bakteroidetes wiesen signifikante Änderungen im Jejunum (P = 0,042), Ileum (P = 0,029), im proximalen (P < 0,001) und distalen Colon (P < 0,001) auf. Bei Actinobakterien wurden keine signifikanten Änderungen zwischen Kost und Segment festgestellt (P = 0,263). α-, β-, γ-Proteobakterien wiesen signifikante Zunahmen im Ileum (P = 0,031), im proximalen (P = 0,022) und distalen Colon (P < 0,001) auf. Bei der mukosa-assoziierten Bakterienpopulation wurden Änderungen bei Firmicutes (P = 0,033) und α-, β-, γ-Proteobakterien im Duodenum (P = 0,025) und Actinobakterien (P = 0,014) und unspezifischen Bakterien (P = 0,02) in dem Jejunum festgestellt. n = 14 bei mit Kontrollkost und n = 11 bei mit GHF7K-Kost gefütterten Mäusen. Analysiert durch Zweiwege-ANOVA mit Holme-Sidak-Post-Hoc-Test.
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3. Die GHF7K-Kost ändert nicht die nützlichen Bakteriengruppen Lactobacillus und Bifidobakterium. Die Bakterienanzahl wurde aus luminalen Spülungen von mit CT und GHF7K gefütterten Mäusen durch qPCR untersucht. Bei den Werten der nützlichen Bakteriengruppen Lactobacillus (A) und Bifidobakterium (B) wurden bei der luminalen Population von mit Kontrollkost (n = 14, schwarze Balken) oder mit GHF7K-Kost (n = 11, weiße Balken) gefütterten Mäuse keine Unterschiede festgestellt. Analysiert durch Zweiwege-ANOVA mit Holme-Sidak-Post-Hoc-Test.
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4. Die GHF7K-Kost ändert die Clostridiengruppen im Colon. Die Bakterienanzahl wurde aus luminalen Spülungen von mit CT und GHF7K gefütterten Mäusen durch qPCR untersucht. Es wurden regionale Änderungen bei den Werten der Firmicutes-Mitglieder C. coccoides (in 4 gezeigt) und C. leptum festgestellt. C. coccoides nahmen im Jejunum ab, nahmen aber im Blinddarm und Colon der mit GHF7K-Kost gefütterten Mäuse zu (n = 11, weiße Balken). Verglichen mit Kontrollmäusen (n = 14, schwarze Balken) nahmen C. leptum nur im Duodenum und Jejunum der mit GHF7K-Kost gefütterten Mäuse (n = 11, weiße Balken) ab. *P < 0,05 durch Zweiwege-ANOVA mit Holme-Sidak-Post-Hoc-Test.
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5. Die GHF7K-Kost ändert MIB und Prevotella, ändert aber nicht Bakteroides. Die Bakterienanzahl wurde aus luminalen Spülungen von mit CT und GHF7K gefütterten Mäusen durch qPCR untersucht. Bei dem Bakteroidetes-Mitglied Bacteroides (B) wurden keine Änderungen festgestellt, doch wurden bei den Werten von (C) Prevotella und (A) MIB regionale Änderungen festgestellt. GHF7K (n = 11, weiße Balken), Kontrolle (n = 14, schwarze Balken). *P < 0,05 durch Zweiwege-ANOVA mit Holme-Sidak-Post-Hoc-Test.
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6. Die GHF7K-Kost ändert das Darmmilieu mit regionalen Änderungen der Konzentrationen von Na+, K+ und Cl, ändert aber nicht den pH-Wert. Die Ionenkonzentrationen in luminalem Fluid aus intestinalen Segmenten von Mäusen die mit Kontrollkost (schwarze Balken) und GHF7K-Kost (weiße Balken) gefüttert wurden. (A) Die durch Flammenphotometrie ermittelte Na+ Konzentration nahm nur im Blinddarm der mit GHF7K gefütterten Mäuse zu. (B) Die durch Flammenphotometrie ermittelte K+ Konzentration nahm nur im Blinddarm und distalen Colon von mit GHF7K gefütterten Mäusen signifikant ab. C) Die durch Chloridometrie ermittelte Cl-Konzentration nahm im Duodenum und Jejunum der mit GHF7K gefütterten Mäuse signifikant zu. D) Entlang der Länge des Darmtrakts wurden zwischen mit GHF7K- und Kontrollkost gefütterten Mäusen keine Änderungen des pH-Werts festgestellt. GHF7K (n = 11, weiße Balken), Kontrolle (n = 14, schwarze Balken). *P < 0,05 durch Zweiwege-ANOVA mit Holme-Sidak-Post-Hoc-Test.
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Zusammenfassend wurde festgestellt, dass die Nahrungsergänzung mit GHF7K nicht das Mäusegewicht oder den täglichen Nahrungsmittelverzehr änderte. Zudem wurden bei den mit GHF7K gefütterten Mäusen keine Änderungen bei der Gesamtzahl von luminalen oder mukosa-assoziierten Bakterienpopulationen festgestellt. Die GHF7K-Supplementierung änderte die Zusammensetzung der luminalen und – in geringerem Umfang – der mukosa-assoziierten Bakterienpopulationen auf der Ebene der Phyla mit regionsspezifischen Unterschieden signifikant. Ähnlich wie bei Antibiotikanutzung war die Anzahl von Proteobakterien im Ileum und Colon von mit GHF7K gefütterten Mäusen erhöht, ohne Änderungen der Anzahl nützlicher Lactobacillus- und Bifidobakterium-Gattungen des Phylums Firmicutes. Entsprechend der geänderten Darm-Mikrobiota wurden Änderungen der Ionenzusammensetzung des intestinalen Fluids festgestellt. Es wurde eine erhöhte Cl-Konzentration im Duodenum und Jejunum festgestellt, während die Na+ Konzentration im Blinddarm von mit GHF7K gefütterten Mäusen erhöht war. Abnahmen wurden bei der K+ Konzentration im Blinddarm und distalen Colon festgestellt. Es wird somit angenommen, dass eine Nahrungsergänzung mit GHF7K die Darm-Mikrobiota ändern kann, was mit Änderungen des Darmmilieus korreliert. Diese Daten legen nahe, dass eine GHF7K-Nahrungsergänzung zielgerichtet verwendet werden kann, um die Darm-Mikrobiota zu ändern, und somit potentiell eine alternative Vorgehensweise zur prophylaktischen Antibiotikanutzung darstellen könnte.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Kunz C: Historical aspects of human milk oligosaccharides. Adv Nutr 2012;3:430S–439S [0004]
