CZ288050B6

CZ288050B6 - Farmaceutický prostředek a jeho použití

Info

Publication number: CZ288050B6
Application number: CZ1996708A
Authority: CZ
Inventors: Josef Peter Guggenbichler; Peter Meissner; Johann Jurenitsch; Andreas Bettingnies-Dutz
Original assignee: Laevosan-Gesellschaft M. B. H.
Priority date: 1993-09-10
Filing date: 1994-09-08
Publication date: 2001-04-11
Also published as: SK32996A3; EP0716605B1; CZ70896A3; DE59407457D1; AU679262B2; JPH09502195A; RU96107098A; PL313393A1; SK282305B6; ATE174222T1; DE4330773A1; DK0716605T3; AU7695694A; US5683991A; EP0716605A1; HUT74431A; GR3029619T3; JP3798425B2; HU9600602D0; HU223043B1

Abstract

Vynález se týká farmaceutického prostředku, který jako účinnou látku obsahuje jeden nebo více galakturonidů se stupněm polymerace 2 až 7 a se stupněm esterifikace méně než 20 %, popřípadě spolu s farmaceuticky obvyklými nosnými, zřeďovacími, pomocnými a plnicími látkami, a použití těchto prostředků k blokování ukládání zárodků na savčích buňkách.ŕ

Description

Farmaceutický prostředek a jeho použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká farmaceutického prostředku, který obsahuje jako účinnou látku galakturonid, a použití tohoto prostředku k zabránění ukládání choroboplodných zárodků na savčích buňkách.

Dosavadní stav techniky

Kyseliny galakturonové mají širokou oblast použití, jak je popsáno například v: Heinrichova a Simon (Biologia, díl 46, str. 1081 - 1087, 1991). Známá použití zahrnují například použití ke kategorizaci a klasifikaci galakturonáz a pektátlyáz nebo jako ligandů pro selektivní bioafinitní chromatografii. Ke známým účinkům se počítá spouštění obranných mechanismů vyšších rostlin a odstraňování toxických kationtů, jako jsou Cd²⁺, Cu²⁺ a Pb²⁺ v gastrointestinálním traktu člověka.

Pro své účinky proti onemocněním intestinálního a urogenitálního traktu, vyvolaným patogenními mikroorganismy, jsou v lidovém léčitelství i v klinické medicíně známy vodné výtažky a šťávy z různých rostlinných produktů. Farmaceutický účinek těchto preparátů byl dosud vysvětlován regulací hospodaření s vodou v intestinálním traktu pektiny, obsaženými v rostlinných produktech.

Adheze zárodků, jako jsou bakteriální mikroorganismy, na buňky je prvním krokem při začátku každé infekce. Teprve když se zárodky (například bakterie a/nebo viry) přichytí na specifické receptory buněčných povrchů a tím uniknou nespecifické tělesné obraně, jako peristaltika, hlenová sekrece, tok sekretu atd., mohou se tam pomnožit, proniknout do těla, rozvinout toxické účinky a tím vytvořit obraz nemoci.

EP-A-0 080 442 popisuje vícestupňový postup chemické syntézy pro výrobu oligosacharidů, jako jsou oligogalaktosidy z pektinu, popřípadě kyseliny polygalakturonové. Předpokládá se farmaceutické použití oligosacharidů a jejich acylovaných derivátů vycházeje ze zpráv, které se zabývají inhibičním účinkem určitých galaktosidů, popřípadě jejich methyl- a p-nitrofenylderivátů, na adhezi uropatogenních koliformních bakterií na určité červené krvinky.

Bylo by elegantním krokem antimikrobiální terapie, kdyby se podařilo vyřadit adhezi zárodků jako významný mechanismus virulence a tím bylo umožněno tělu odplavit, popřípadě vytlačit zárodky z povrchu buněk. Základní úkol předkládaného vynálezu tedy spočíval v tom, připravit prostředek, který blokuje adhezi zárodků na savčí buňky, zvláště na buňky epiteliální.

Podstata vynálezu

Úloha je řešena farmaceutickým prostředkem, který se vyznačuje tím, že jako účinnou látku obsahuje jeden nebo více galakturonidů se stupněm polymerace 2 až 7 a stupněm esterifikace < 20 %, popřípadě spolu s obvyklými farmaceutickými nosnými, zřeďovacími, pomocnými a plnicími prostředky.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je použití těchto farmaceutických prostředků pro zabránění ukládání zárodků na savčích buňkách.

Překvapivě bylo nalezeno, že adheze patogenních zárodků, jako E. coli, na buňky, zvláště epiteliální buňky gastrointestinálního a urogenitálního traktu, může být podstatně (tj. až z 90 %),

- 1 CZ 288050 B6 redukována karotkovou polévkou v klasickém přípravku podle MORO, urologickým čajem (například směsí přesličky, žlutého petrklíče, listů jahodníku a islandského mechu), kokosovým mlékem, jeřabinami atd. Účinek je třeba připisovat pektinům, přítomným v rostlinných produktech, které se v podstatě skládají z řetězců 1,4-a-glykosidicky vázaných galakturonidů, jejichž kyselé skupiny jsou z 20 až 30 % esterifikovány methanolem, a které kromě kyseliny galakturonové popřípadě mohou obsahovat ještě jiné cukerné stavební kameny, například glukózu, galaktózu, xylózu a arabinózu.

Překvapivě bylo zjištěno, že pektiny, popřípadě galakturonidy, které byly dosud používány pro přípravu gelů, jako zahušťovací prostředek nebo jako vlákniny, blokují ukládání zárodků na savčí buňky, a zvláště na buňky lidské.

Galakturonid, účinný pro blokování ukládání zárodků, musí mít určitý stupeň polymerace as výhodou určitý stupeň esterifikace. Pojem „stupeň polymerace“ ve smyslu předkládaného vynálezu označuje počet jednotek kyseliny galakturonové, které galakturonid obsahuje. Pojem „stupeň esterifikace“ označuje procento esterifikovaných (většinou methylem) jednotek kyseliny galakturonové galakturonidu, vztažený na celkový počet jednotek kyseliny galakturonové. Bylo zjištěno, že pro blokování adheze zárodků na savčí buňky je nutný stupeň polymerace > 2, to znamená, že monomemí kyselina galakturonová nevykazuje - stejně jako množství jiných sacharidů (například neutrální sacharidy, kyselina glukuronová, arabinogalaktan, galaktózo-1fosfát, glukózo-l-fosfát) - žádné blokování adheze zárodků.

Ve výhodném provedení farmaceutického prostředku podle vynálezu je stupeň esterifikace galakturonidu < 20 %, zvláště výhodně < 10 % a ještě výhodněji < 5 %. Nej výhodnější je, když už nejsou obsaženy v podstatě žádné (< 2 %) esterové skupiny.

Galakturonidy se stupněm esterifikace < 20 % je možno získat z přirozeně se vyskytujících pektinů úplnou nebo částečnou demethylací, například zmýdelněním alkáliemi.

Stupeň polymerace galakturonidů ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu je > 2, to znamená, že galakturonid má alespoň 2 jednotky kyseliny galakturonové. S výhodou je stupeň polymerace 2 až 7, ještě výhodněji 2 až 4, zvláště výhodně 2 až 3 a nejvýhodněji 2. To znamená, že pro prostředky podle vynálezu jsou výhodné digalakturonid, trigalakturonid, tetragalakturonid, pentagalakturonid, hexagalakturonid, heptagalakturonid a směsi více těchto látek, přičemž nejvýhodnější je digalakturonid, popřípadě kyselina digalakturonová. V závislosti na druhu použití je však možno používat také prostředky, které neobsahují z hlediska účinku nej lepší látku, pokud je tato látka pro speciální použití méně výhodná z důvodů farmaceutických.

Galakturonidy s polymerizačním stupněm 2 až 4 je možno získat z přirozeně se vyskytujících vysokomolekulámích pektinů enzymatickou hydrolýzou za použití pektin štěpících enzymů (například pektináz), které se získávají většinou z hub druhů Aspergillus a Penicillium. Jinak se může hydrolýza vysokomolekulámích pektinů provádět také kyselou hydrolýzou, například pomocí HC1.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou blokovat ukládání zárodků, zvláště zárodků bakterií (jako jsou například E. coli, streptokoky, Haemophilus influenzae, pneumokoky atd.) na savčí buňky, popřípadě vytlačovat již navázané zárodky. Zvláště se hodí prostředky podle vynálezu k léčení infekcí gastrointestinálního traktu (například nesprávná mikroflóra vrchního úseku tenkého střeva při průjmových onemocněních), krevního systému (syndrom hemolytické uremie, způsobený E. coli 0157), dýchacích cest (například stoupající infekce u pacientů se zavedeným umělým dýcháním na jednotce intenzivní péče), urogenitálního traktu (například recidivující infekce močového traktu) nebo/a nosohltanu (například streptokoky, H. influenzae, pneumokoky).

-2CZ 288050 B6

Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou být podávány jednak u již existující nemoci, jednak také profylakticky. V úvahu mohou přicházet například následující možnosti podávání:

a) orální podávání například k léčení gastrointestinálního traktu, močového traktu, jako přísada k rehydratačním roztokům, jako profylaktikum proti osídlení žaludečné - střevního traktu nevhodnými mikroorganismy atd., u pacientů se zavedeným umělým dýcháním na jednotce intenzivní péče,

b) místní použití například k léčení nosohltanu, urogenitálního traktu apod.,

c) parenterální použití.

Galakturonidy se vyskytují jako součásti polysacharidů ve velkém počtu potravin a potravinářských pomocných látek, a tak jsou přijímány ústy; to znamená, že jsou netoxické a výborně se hodí pro farmaceutická použití.

Galakturonidy, používané pro farmaceutické prostředky podle vynálezu, je možno získávat z polysacharidů, které se vyskytují v rostlinách, například z karotky, citrusových plodů, jablek, kdoulí, cukrové řepy, kokosového mléka a dalších rostlin nebo rostlinných produktů.

Pro získávání galakturonidů se výchozí materiály s výhodou rozdrtí a extrahují horkou vodou. Extrakty je možno nejdříve lyofilizovat nebo také přímo zpracovávat. Další zpracování s výhodou začíná chromatografickými metodami, kterými je možno oddělit s galakturonidy od jiných součástí extraktů (například jiných sacharidů). Výhodné chromatografické dělicí metody jsou gelová chromatografie (například přes náplň BioGel®, Sephacryl®) nebo/a aniontové výměnná chromatografie (například přes náplň DEAE-Sephacel®). Získané pektiny mohou být dále částečně nebo úplně zmýdelněny pro snížení stupně esterifikace nebo/a kysele, popřípadě enzymaticky hydrolyzovány pro snížení stupně polymerace.

Vynález bude dále osvětlen následujícími příklady:

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Čerstvá karotka byla omyta, oloupána a rozstrouhána. Extrakcí vařící vodou a následnou lyofilizací byly získány ve vodě rozpustné polysacharidy.

Následuje první stupeň chromatografického dělení přes kolonu BioGel P2 s elucí destilovanou vodou. Látky, které přecházejí do eluátu (SF A) z této kolony, se čistí a podruhé dělí gelovou chromatografií. Jako stacionární fáze slouží Sephacryl S-3000HR a jako eluent znovu destilovaná voda. Ze dvou píků, které se objeví, se jímá ten, který se eluuje později.

Třetím stupněm přípravy je iontově výměnná chromatografie přes DEAE-Sephacel s elucí gradientem pufru (0,011M až 1M fosfátovým pufrem pH 6,4). Jímá se frakce, která se eluuje při vyšší molaritě (SF II), která se dále zpracovává. Potom následuje hydrolýza HC1 (pH 1,00, 37 °C, 45 min) a oddělení sacharidu srážením alkoholem.

Hydrolyzát se chromatografickou cestou (Sephacryl S-2000HR, eluent destilovaná voda) rozdělí na tři skupiny látek, přičemž se jímají uhlohydráty s nejnižší molekulovou hmotností (SF 2/3).

Antiadhezivní aktivita frakcí, se kterými se pracuje dále, převyšuje aktivitu dosavadních vedlejších produktů.

-3CZ 288050 B6

Inhibiční aktivita jednotlivých látek stoupá během přípravy od 50 % u 0,7% roztoku (u SF A) přes 86,4 % u 0,005% roztoku (u SF II) na plnou inhibici rovněž 0,005% roztoku (u SF 2/3).

To ukazuje na to, že se stoupající čistotou je dávka, potřebná k dosažení určitého účinku, výrazně nižší. To je v protikladu k obchodním pektinům, které se musí používat ve velmi vysokých koncentracích, aby bylo možno dosáhnout podobných účinků.

Příklad 2

Zmýdelnění:

11,3 g citrusového pektinu (Grindstedt) (látka Ao) bylo rozpuštěno v 1200 ml destilované vody, smíseno se 480 ml 0,5N NaOH a zmýdelňováno 15 minut při pokojové teplotě. pH roztoku se upraví kyselinou mravenčí na 4,0. Zmýdelněný pektin se sráží dvojnásobným objemem methanolu, rozpustí ve 200 ml vody a srážení se stejným způsobem ještě dvakrát opakuje. Naposledy získaná sraženina se suší při 50 °C (látka AQ.

Výtěžek: 7,15 g.

Enzymatická hydrolýza:

Vysušená sraženina se rozpustí ve 100 ml 0,lM roztoku hydrogenuhličitanu sodného, pH se upraví kyselinou mravenčí na 4,5, přidá se 21 mg Pektinázy 5S z Aspergillus niger (Serva) a inkubuje 60 minut při 60 °C. Roztok se pro aktivaci enzymu krátkodobě ohřeje na 80 °C, ochladí a sráží se methanolem výše popsaným postupem. Sraženina se oddělí centrifugací (20 minut, 4000 ot/min) a usuší.

Výtěžek: 5 g (látka A₂)

Podmínky tenkovrstvé chromatografie (DC):

Stacionární fáze: DC hotové destičky Kieselgel 60 (Měrek) 10 x 20 cm. Mobilní fáze: ethanol: vodný roztok kys. octové 25mM 1:1.

Vyvíjení: při 35 °C.

Postřik, reagencie: 200 mg naftalen-1,3-diol v 50 ml methanolu plus 50 ml H₂SO₄ (20% hmotnostních).

Chromatografie:

1,5 g produktu hydrolýzy bylo rozpuštěno v 15 ml destilované vody a podrobeno chromatografické frakcionaci.

Kolona: skleněná kolona (Bio-Rad) (2,5/40 cm), objem lože 150 ml.

Eluent: Na-formiátový pufr pH 4,7, stupňovitý gradient po 182 ml 0,2, 0,3, 0,4, 0,5,

0,6,0,7M.

Stacionární fáze: Bio-Rad AGMP aniontové výměnná pryskyřice (ekvilibrovaná eluentem). Průtok: 3 ml/min.

Objem frakce: 22 ml.

Složení jednotlivých frakcí bylo zkoumáno pomocí DC (podmínky viz výše). Frakce stejného složení byly sjednoceny a sráženy dvojnásobným objemem acetonu. Tímto způsobem získané oligogalakturonidy byly odděleny centrifugací (4000 ot/min) a převedeny do 20 ml destilované vody.

-4CZ 288050 B6

Do roztoku se vmíchá kationtový iontoměnič Bio-Rad AG 50 W X-8 (řT), aby se galakturonidy převedly do formy volné kyseliny. Po odstranění pryskyřice a lyofílizaci filtrátu se získá vločkovitý, bílý prášek.

Výsledky inhibice uvádí následující tabulka 1.

Tabulka 1

Označení látky	Charakterizace	Koncentrace %	Blokování %
Ao	pektin USP¹’	0,7	15,3
Ai	zmýdelněný pektin	0,2	10,0
a₂	částečně hydrolyzovaný A_t	0,05	30,2
Fi	neutrální di- a trisacharid	0,005	0,0
f₂	neutrální trisacharid	0,005	0,0
f₃	neutrální tetrasacharid	0,005	0,00
f₄	trigalakturonid	0,005	84,6
f₅	tetragalakturonid se stopami trigaíakturonidu	0,005	58,6
f₆	tetragalakturonid	0,005	52,7
f₇	penta-hexagalakturonid	0,005	23,9

citrusový pektin (Grindstedt)

Metody zkoušení inhibičního účinku

Testy adheze:

1) Hemaglutinace lidských 0+ erytrocytů: Po přivedení erytrocytů do styku se zárodky dochází u silně hemaglutinujících kmenů během 20 sekund k aglutinaci erytrocytů, která odpovídá síle nesnášenlivosti krevních skupin.

Koncentrace erytrocytů: 1 až 1,5 %

Suspenze zárodků: kalná suspenze OD 1 při 462 nm =10⁹ zárodků/ml

Při vyhodnocování blokování aglutinace jsou zárodky před přídavkem k erytrocytům vždy po dobu 2 hodin inkubovány s roztokem uhlohydrátu žádané koncentrace a hemaglutinace se potom vizuálně semikvantitativně vyhodnotí.

2) Adheze na lidské uroepitelie: Uroepitelie z ranní moči se izolují centrifugací. Suspenze zárodků (jako výše) jsou spojeny s epiteliálními buňkami a inkubovány, potom filtrovány přes 8pm polykarbonátový filtr a vícekrát proprány. Filtry se odstraní, převedou do fyziologického roztoku NaCl a epiteliální buňky se převedou do roztoku. Suspenze NaCl je znovu zcentrifugována, sediment převeden na podložku, obarven podle May Griinwald a Giemsou a počítány zárodky, uložené na 50 epiteliálních buňkách (referenční hodnota).

Kontroly: Epiteliální buňky bez kontaktu se zárodky.

Blokování adheze: Stejná metoda, pouze jsou zárodky před přídavkem k suspenzi epiteliálních buněk po dobu 1 až 3 hodin vneseny do roztoku (0,5, 0,1, 0,05, 0,001 %) různých sacharidů.

Použité zárodky: ve stejné míře byly nasazeny 4 standardní kmeny E. coli, které byly izolovány z pacientů, a 2 obchodní kmeny.

-5CZ 288050 B6

Výsledky:

V rámci mikrobiologických pokusů byly vedle níže taxativně vypočítaných kyselých oligoa polysacharidů použity také neutrální sacharidy, které neměly na blokování adheze žádné účinky (například fruktany jako inulin, disacharidy jako laktóza a laktulóza a další).

Přirozené, to znamená extrakcí získané pektiny, vykazují adhezi blokující účinky, které by však bylo možno zvýšit dalším zpracováním, například zmýdelněním a hydrolýzou.

Ve výše popsaných testech vykázal pektin, získaný extrakcí vodou z karotky, v 1% roztoku v testu 46% inhibici, vyčištěné produkty ve stejném testu v koncentraci 0,1% vykázaly 80% inhibici.

V následující tabulce 2 jsou shrnuty další výsledky mikrobiologických vyšetření:

Blokování adheze bakterií na epiteliální buňky vybranými látkami v %:

Tabulka 2

Označení látky	Koncentrace %	Blokování %
Vodný extrakt karotky¹'	1	46,0
SF A (viz příklad 1)	0,7	50,0
SFII (viz příklad 1)	0,005	86,4
SF 2/3 (viz příklad 1)	0,005	113,5
Kys. polygalakturonová z pomerančů	0,2	99,0
Kys. polygalakturonová z pomerančů	0,05	72,0
Kys. monogalakturonová	1	žádná inhibice
Trigalakturonid²'	0,005	91,7
T etragalakturonid²'	0,005	52,7
Penta-hexagalakturonid	0,005	23,9
Arabinogalaktan	0,005	žádná inhibice
Jablečný pektin	0,05	20,5
Kyselina pektinová z jablek	0,05	64,8
Galaktózo-l-fosfát	0,005	3,4
Glukózo-l-fosfát	0,005	žádná inhibice
Kys. glukuronová	0,005	žádná inhibice

'' Analogicky k příkladu 1 ²⁾ Získán analogicky k příkladu 2

Jak je zřejmé z tabulky 2, dá se odvodit přírůstek účinku ze stupně esterifikace a velikosti molekuly (stupně polymerace).

Příznivé výsledky je možno získat u stupně polymerace 2 až 7.

Zmýdelněním (tj. odstraněním esterových skupin) se rovněž dosáhne zlepšení blokování.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický prostředek pro blokování ukládání zárodků na savčích buňkách, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje jeden nebo více galakturonidů se stupněm polymerace v rozmezí 2 až 7 a stupněm esterifikace méně než 20 %, popřípadě spolu s farmaceuticky obvyklými nosnými, zřeďovacími, pomocnými a plnicími látkami.
2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že stupeň esterifikace galakturonidu je menší než 10 %.
3. Prostředek podle nároku 1 nebo 2, vy galakturonidu je menší než 5 %.
4. Prostředek podle některého z nároků polymerace galakturonidu je od 2 do 6.
5. Prostředek podle některého z nároků polymerace galakturonidu je od 2 do 5.
6. Prostředek podle některého z nároků polymerace galakturonidu je od 2 do 4.
7. Prostředek podle některého z nároků polymerace galakturonidu je od 2 do 3.
8. Prostředek podle některého z nároků polymerace galakturonidu je 2.

znač u j ící se tím, že stupeň esterifikace až 3, vyznačuj ící se tím, že stupeň až 4, vyznačující s e tím, že stupeň až 5, vyznačující s e tím, že stupeň až 6, vyznačující se tím, že stupeň až 7, vyznačující se tím, že stupeň
9. Použití farmaceutického prostředku podle některého z nároků 1 až 8 pro přípravu léčiva k blokování ukládání zárodků na savčí buňky.
10. Použití podle nároku 9 pro přípravu léčiva pro léčení infekcí gastrointestinálního traktu, krevního systému, dýchacích cest, urogenitálního traktu nebo/a nosohltanu.
11. Použití podle nároku 9 nebo 10 pro přípravu léčiva pro blokování ukládání zárodků bakterií.
12. Použití podle některého z nároků 9 až 11, kde stupeň esterifikace galakturonidu je menší než 20 %.
13. Použití podle některého z nároků 9 až 12, kde stupeň polymerace galakturonidu je 2 až 4.