TW202410907A - Cs-4發酵菌絲體雜聚多醣及其製備方法與用途 - Google Patents

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王紅敏
高雯
王偉
金嘉麗
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大陸商江西濟民可信集團有限公司
大陸商江西濟民可信藥業有限公司
大陸商江西金水寶製藥有限公司
大陸商上海濟煜醫藥科技有限公司
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本發明公開了一種Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖及其製備方法與用途，該多糖結構如下所示，n選自6-104，該多糖能用於預防或治療慢性腎衰、抑制免疫排斥反應、預防或治療高血脂、預防或治療急性腎損傷。

Description

Cs-4發酵菌絲體雜聚多醣及其製備方法與用途
本發明屬中藥製藥領域，具體涉及一種以蝙蝠蛾擬青黴(Cs-4)菌絲體為原料製備的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖及其製備方法與用途。
本申請要求申請日為2022/9/7的中國專利申請2022110915891的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌 Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲屍體的複合體，是名貴中藥材（以下簡稱蟲草）。由於天然蟲草生長環境特殊，且價格較高，不能滿足市場的需求。因此，人們利用現代生物發酵技術培育出蟲草菌絲體來代替天然蟲草。中國中醫科學院中藥研究所於1982年從雲南迪慶藏族自治州採集的冬蟲夏草樣品上分離獲得十幾個菌株，並對其中4個菌株進行了培養和形態學的研究，經鑒定命名為蝙蝠蛾擬青黴（ Paecilonyces hepialidchen&Dai）。中國醫學科學院藥物研究所1982年從青海化隆縣採集的新鮮冬蟲夏草中分離得到Cs-4菌株，經鑒定也是蝙蝠蛾擬青黴。發酵蟲草菌粉(Cs-4)，以下簡稱Cs-4，即是通過分離的蝙蝠蛾擬青黴Cs-4菌株發酵而得的菌絲體的乾燥粉末，並作為原料製成藥品成功上市，藥品名稱為金水寶膠囊和金水寶片。
金水寶作為人工蟲草代表品種，具有補益肺腎、秘精益氣功效，臨床上已廣泛應用於治療腎臟系統疾病、呼吸系統疾病、代謝疾病、心腦血管系統疾病、內分泌系統疾病和腫瘤輔助治療，但其藥效物質基礎並不明確。
蟲草多糖作為蟲草中主要的活性成分之一，備受國內外眾多研究學者的關注，但是目前的研究偏重於蟲草粗多糖的活性篩選，多糖結構研究尚處於初級階段，多是只涵蓋單糖組成和分子量信息，或對多糖只通過簡單分級，未進行完全純化從而無法準確對蟲草多糖的化學結構進行深入的挖掘，嚴重限制了活性蟲草多糖的質量控制和後續臨床轉化。
現有技術中關於Cs-4發酵菌絲體多糖的研究很少，現有技術中提取的Cs-4發酵菌絲體多糖純度低，對多糖精細結構研究較少，基於此，本發明對Cs-4發酵菌絲體多糖進行了深入的研究，提取出的多糖純度高，且深入研究了多糖的具體單糖組成、相對分子質量、糖苷鍵連接方式等，並將其與發酵蟲草菌粉在動物模型上開展了對比試驗，可以看出本發明的多糖相對於發酵蟲草菌粉，以更低的劑量取得了更佳的效果。
在本發明的第一方面，本發明提出了一種Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖。根據本發明的實施例，結構式如下所示： ， 其中，Man p為吡喃型甘露糖、Gal p為吡喃型半乳糖、Glc p為吡喃型葡萄糖，n選自6-104。發明人首次提取並鑒定出該多糖，該多糖具有較優的預防或治療慢性腎衰、抑制免疫排斥反應、預防或治療高血脂、預防或治療急性腎損傷的效果，相對於發酵蟲草菌粉而言，以更低的劑量獲得更優的效果。
根據本發明的實施例，上述多糖還可以進一步包括如下附加技術特徵之一：
根據本發明的實施例，Man p為吡喃型甘露糖、Gal p為吡喃型半乳糖、Glc p為吡喃型葡萄糖，n選自6-68。根據本發明的實施例，n選自15-21。
根據本發明的實施例，n選自15-104。
根據本發明的實施例，n選自21-104。
根據本發明的實施例，n選自6-15。
根據本發明的實施例，n選自6-21。
根據本發明的實施例，n選自15-68。
根據本發明的實施例，n選自21-68。
根據本發明的實施例，n選自6-104之間的任意整數。
根據本發明的實施例，n選自6-68之間的任意整數。
根據本發明的實施例，n選自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、100、101、102、103、104、105、106、107。
根據本發明的實施例，所述多糖的相對分子量選自10-152 kDa。需要說明的是，本發明所採用的相對分子量是指重均分子量，所述重均分子量是指重量的平均值，即分子量對分子的重量加權平均。
根據本發明的實施例，所述多糖的相對分子量選自10-100 kDa。
根據本發明的實施例，所述多糖的相對分子量選自10-23.25kDa。
根據本發明的實施例，所述多糖的相對分子量選自10-30.12kDa。
根據本發明的實施例，所述多糖的相對分子量選自10-151.15kDa。
根據本發明的實施例，所述多糖的相對分子量選自23.25-30.12kDa。
根據本發明的實施例，所述多糖的相對分子量選自23.25-100kDa。
根據本發明的實施例，所述多糖的相對分子量選自30.12-100 kDa。
根據本發明的實施例，所述多糖的相對分子量選自23.25-151.15kDa。
根據本發明的實施例，所述多糖的相對分子量選自30.12-151.15kDa。
根據本發明的實施例，所述多糖的相對分子量選自23.15 kDa或30.12 kDa 或151.15 kDa。
根據本發明的實施例，所述多糖組成包括：葡萄糖、半乳糖和甘露糖，所述葡萄糖、半乳糖和甘露糖的莫耳比為1：(1.0-2.0):(1.5-2.5)。
根據本發明的實施例，所述多糖組成包括：葡萄糖、半乳糖和甘露糖，所述葡萄糖、半乳糖和甘露糖的莫耳比為1：(1.5-1.8):(2.0-2.5)。
根據本發明的實施例，所述多糖組成包括：葡萄糖、半乳糖和甘露糖，所述葡萄糖、半乳糖和甘露糖的莫耳比為1：（1.71-1.74）：（2.09-2.44）。
在本發明的第二方面，本發明提出了一種提取前面所述Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括：1）將Cs-4菌粉用乙醇進行脫脂處理，捨去乙醇提液，獲得脫脂殘渣，2）將所述殘渣在水中進行提取處理，獲得水提液，3）將所述水提液進行醇沉處理，所述醇沉處理的溶劑為乙醇，4）將步驟3）中醇沉處理後的沉澱進行純化處理，獲得發酵菌絲體雜聚多糖。根據本發明的實施例的方法操作簡單，提取效率高，提取的多糖的純度高，能達到94%以上。
根據本發明的實施例，所述方法還可以進一步包括如下附加技術特徵至少之一：
根據本發明的實施例，所述脫脂處理是在溫度為100℃的條件下進行的。
根據本發明的實施例，所述脫脂處理進行三次，每次時間為1小時。
根據本發明的實施例，所述脫脂取處理中乙醇是Cs-4的10倍量。
根據本發明的實施例，所述脫脂取處理的乙醇為85%-100%乙醇。
根據本發明的實施例，所述提取處理是在溫度為75℃-78℃的條件下進行的。
根據本發明的實施例，所述提取處理進行三次，每次時間為1小時。
根據本發明的實施例，所述提取處理中水是殘渣的10倍量。
根據本發明的實施例，所述醇沉處理的乙醇為80%乙醇。
在本發明的再一方面，本發明提出了一種提取前面所述Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括：1）將Cs-4在10倍量的85%乙醇加熱提取3次，每次1小時，捨去乙醇提液，獲得殘渣；2）將所述殘渣在10倍量水加熱提取3次，每次1小時，合併水提液；3）將所述水提液經80%乙醇醇沉，獲得沉澱Cs-4-P；4）將所述沉澱Cs-4-P進行純化處理，獲得發酵菌絲體雜聚多糖Cs-4-P1，繼續純化得3個均一多糖，命名為Cs-4-P1-1，Cs-4-P1-2，Cs-4-P1-3。
根據本發明的實施例，所述方法還可以進一步包括如下附加技術特徵至少之一：
根據本發明的實施例，所述純化處理包括去蛋白處理、脫色處理、柱純化處理。需要說明的是，可以去蛋白處理、脫色處理、柱純化處理為常規的處理方法，可以根據具體需要，選擇合適的操作方法。
在本發明的再一方面，本發明還提出了一種藥物組合物。根據本發明的實施例，所述藥物組合物包含前面所述的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖或根據前面所述的方法獲得的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖Cs-4-P1，及其繼續純化所得的3個均一多糖（Cs-4-P1-1，Cs-4-P1-2，Cs-4-P1-3）。
在本發明的再一方面，本發明還提出了前面所述的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖或根據前面所述的方法獲得的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖或前面所述的藥物組合物在製備藥物中的用途，所述藥物用於預防或治療慢性腎衰、抑制免疫排斥反應、預防或治療高血脂、預防或治療急性腎損傷。發明人發現該多糖具有較優的預防或治療慢性腎衰、抑制免疫排斥反應、預防或治療高血脂的效果、預防或治療急性腎損傷，相對於金水寶而言，以更低的劑量獲得更優的效果。
在本發明的一個方案中，所述急性腎損傷選自順鉑所致急性腎損傷和/或LPS所致急性腎損傷。根據本發明藥物組合物包含前面所述的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖或根據前面所述的方法獲得的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖。發明人發現，該多糖具有較優的預防或治療急性腎損傷的效果，效果與陽性藥氨磷汀、地塞米松相當。
在本發明的再一方面，本發明還提出了一種預防或治療高血脂的藥物組合物。根據本發明的實施例，所述藥物組合物包含1.0-10.0 µg/mL前面所述的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖或根據前面所述的方法獲得的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖。發明人發現，該多糖具有較優的預防或治療高血脂的效果，相對於金水寶而言，以更低的劑量獲得更優的效果。
根據本發明的實施例，上述藥物組合物還可以進一步包括如下附加技術特徵至少之一：
根據本發明的實施例，所述多糖的濃度為3.0 µg/mL。發明人發現，在多糖的濃度為3.0 µg/mL，其的預防或治療高血脂的效果更佳，且顯著高於金水寶的功效和經典老藥阿托伐他汀鈣。
在本發明的另一方面，本發明至少提出了如下技術效果至少之一： 1）本發明首次提取並鑒定出具有重複結構單元的多糖（簡稱Cs-4-P1-1、Cs-4-P1-2、Cs-4-P1-3）； 2）本發明的提取方法操作簡單； 3）本發明的雜聚多糖的純度高，能達到94%以上； 4）本發明的雜聚多糖在預防或治療慢性腎衰時，能在低劑量（16mg/kg/天）比發酵蟲草菌粉Cs-4（1600mg/kg/天）、黃葵膠囊(1000 mg/kg/天)的效果更優，且與臨床經典老藥地塞米松相比，效果相當或更優，本發明旨在提供一種新的可供選擇的預防或治療慢性腎衰的藥物； 5）本發明的雜聚多糖在抑制免疫排斥反應時，效果比發酵蟲草菌粉Cs-4更優，且和臨床經典老藥環孢素相比，效果相當或更優，安全性更佳，本發明旨在提供一種新的可供選擇的抑制免疫排斥反應的藥物； 6）本發明的雜聚多糖在預防或治療高血脂時，能在低劑量（1.0-10.0µg/mL）降甘油三酯、降總膽固醇功效效果比金水寶更優，且和經典老藥阿托伐他汀鈣相比，效果相當或更優，本發明旨在提供一種新的可供選擇的預防或治療高血脂的藥物。
需要說明的是，在本發明的上下文中，當使用或者無論是否使用「大約」或「約」等字眼時，表示在給定的值或範圍的10%以內，適當地在5%以內，特別是在1%以內。或者，對於本發明所屬技術領域具有通常知識者而言，術語「大約」或「約」表示在平均值的可接受的標準誤差範圍內。每當公開一個具有N值的數字時，任何具有N+/-1%，N+/-2%，N+/-3%，N+/-5%，N+/-7%，N+/-8%或N+/-10%值以內的數字會被明確地公開，其中「+/-」是指加或減。
下面通過實施例對本申請進行詳細描述，但並不意味著存在對本申請而言任何不利的限制。本文已經詳細地描述了本申請，其中也公開了其具體實施例方式，對本發明所屬技術領域具有通常知識者而言，在不脫離本申請精神和範圍的情況下針對本申請具體實施方式進行各種變化和改進將是顯而易見的。
本發明所使用的原料如無特殊說明，均來自市售。
醋酸地塞米松片(批號：015200406，上海上藥信誼藥廠有限公司)，黃葵(批號：20110210，江蘇蘇中藥業集團股份有限公司)，發酵蟲草菌粉(批號：190800810-1，江西國藥有限公司)，新賽斯平環孢素軟膠囊（批號：200825，杭州中美華東製藥有限公司）。
本發明所採用的縮寫如下所示：
Glc p代表吡喃型葡萄糖，Gal p代表吡喃型半乳糖，Man p代表吡喃型甘露糖，h代表小時，min 代表分鐘，W代表周，rpm 代表設備每分鐘旋轉次數，DEAE代表二乙氨乙基纖維素，Seph代表葡聚糖凝膠，HPGPC代表高效凝膠色譜法，Mw代表重均分子量，Mp代表峰值分子量，t R代表保留時間，BUN代表血檢測尿素氮，CREA代表血肌酐，UA代表尿酸，CsA代表環孢素，MTC代表最小中毒濃度，LPS代表脂多糖。
實施例1 Cs-4-P、Cs-4-P1、Cs-4-P1-1、Cs-4-P1-2、Cs-4-P1-3的製備方法
1、脫脂：發酵蟲草菌粉Cs-4經10倍量85%乙醇加熱至沸騰（78℃），保持微沸提取3次，每次1小時，捨去醇提液.
2、水提醇沉：剩餘殘渣經10倍量水加熱至沸騰（100℃），保持微沸提取3次，每次1小時。合併水提液，70℃減壓濃縮成清膏(密度1.05~1.07)。清膏加95%乙醇至含醇量為85%，攪拌30分鐘，靜置24h，上清液抽濾/濃縮，收集沉澱，65℃減壓乾燥、粉碎，即得粗多糖Cs-4-P(得率21%)。
3、脫蛋白脫色：2%水提粗多糖水溶液，等量Sevage試劑，每次劇烈震盪10分鐘，4000rpm，10min，反復脫色3~4次，至無明顯白色層出現，合併上層溶液。
4、脫色：脫單白多糖溶液中，加入2%活性炭粉，50℃保溫30min，雙層濾紙抽濾兩次，過0.45微米膜，濃縮至無有機試劑味，備下一步純化。
5、DEAE-52柱層析：純水洗脫，得中性多糖Cs-4-P1；
6、Seph G-100柱層析分離純化：純水洗脫，獲得三個均一多糖，命名為Cs-4-P1-1、Cs-4-P1-2、Cs-4-P1-3，其中Cs-4-P1-1得率低。
實施例2 Cs-4-P1-1、Cs-4-P1-2、Cs-4-P1-3的含量、分子量和單糖組成
多糖含量測定：
參考《出口植物源食品中粗多糖的測定 苯酚-硫酸法》SN/T 4260-2015中多糖測定方法。本方法利用多糖在濃酸的作用下水解成單糖，經脫水縮合形成糖醛衍生物，再與苯酚結合顯色，通過測定顯色後的吸光度值大小來計算總糖含量的方法。採用該方法測定多糖含量需選擇一種單糖作為對照品繪製標準曲線。
標準曲線繪製：稱取葡萄糖5.417mg，精密稱定，置於50mL容量瓶中，加水溶解並定容，得0.1mg/mL的葡萄糖標準溶液。分別吸取標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL於20mL具塞試管，用蒸餾水補至1.0mL，加入現配的5%苯酚溶液1.0mL及濃硫酸5.0mL，搖勻，室溫放置10min後用渦旋振盪器使反應液充分混合，然後將試管置於30℃水浴中反應20min，於490nm測吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，進行線性回歸得到標準曲線方程。
供試品檢測：稱取Cs-4-P1 50mg，精密稱定，置於10mL量瓶中，超聲溶解，加水定容至刻度，搖勻，即得。取上述配製溶液各0.2mL於20mL具塞試管，加水補至1.0mL。用蒸餾水補至1.0mL，加入現配的5%苯酚溶液1.0mL及濃硫酸5.0mL，搖勻，室溫放置10min後用渦旋振盪器使反應液充分混合，然後將試管置於30℃水浴中反應20min，於490nm測吸光度。
測定多糖含量，Cs-4-P1-1、Cs-4-P1-2、Cs-4-P1-3多糖含量為：94.61%、98.61%、99.52%。
2. 分子量測定
高效凝膠色譜法(HPGPC)可用於測定大分子物質的相對分子質量及其分佈，是多糖相對分子量的首選方法。其原理為根據在凝膠柱上不同相對分子質量的多糖與洗脫保留時間（t R）成一定關係的特性，先用已知相對分子質量的標樣製成標準曲線，然後由樣品的t R從曲線中求得相對分子質量。峰值分子量Mp表示最高峰保留時間對應的分子量，峰起始和峰結束分子量分別表示峰起始時間和峰結束時間對應分子量。重均分子量Mw為按分子重量統計平均而得，代表兩側分佈有同等重量的分子。
2.1 試劑配製
0.71%硫酸鈉配製：稱取硫酸鈉14.20g於2L 燒杯中，加純化水2000ml溶解並稀釋，過0.22um微孔濾膜，超聲脫氣約10min即得。
供試品溶液配製：取各樣品50mg至10ml量瓶，精密稱定，加適量上述過濾所得流動相，超聲10min後，定容至刻度，搖勻即得供試品溶液。將供試品溶液置於4 ℃條件下保存。
對照品溶液配製：稱取右旋糖酐D0、D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8、D2000、右旋糖酐410000各10mg於各1.5ml一次性離心管中，精密稱定，精密移取1ml 0.71%硫酸鈉溶液1ml於各離心管，搖勻即得。
2.2 色譜條件
色譜柱：ZRD-LC-53  TOSOH      TSKgel guardcolumn PWXL(6*40mm, 12um); ZRD-LC-54 TOSOH    TSKgel G3000 PWXL(7.8*300mm, 7um); ZRD-LC-55  TOSOH    TSKgel G4000 PWXL(7.8*300mm, 10um); ZRD-LC-62       TOSOH      TSKgel G5000 PWXL(7.8*300mm, 10um).
洗脫條件：0.71%硫酸鈉溶液，等度洗脫.
RID檢測器，柱溫為35℃，流速為0.8mL/min，進樣量為20ul.
以保留時間為橫坐標，對應分子量對數值為縱坐標，繪製標準曲線，根據回歸方程計算樣品Cs-4-P1、Cs-4-P1-1、Cs-4-P1-2、Cs-4-P1-3相對分子量。結果如圖1和表1所示，Cs-4-P1、Cs-4-P1-1、Cs-4-P1-2、Cs-4-P1-3的重均分子量Mw分佈在23.25-151.15kDa。 表1
樣品名稱 峰起點時間min 峰起始Mw(kDa) 峰頂點時間min 峰值分子量Mp(kDa) 峰結束時間min 峰結束Mw(kDa) 重均分子量Mw(kDa)
Cs-4-P1 27.16 159.64 31.79 22.49 36.45 1.92 23.25
Cs-4-P1-1 22.58 2679.84 29.02 70.47 33.30 11.41 151.15
Cs-4-P1-2 27.17 159.51 31.80 22.33 36.00 2.58 23.25
Cs-4-P1-3 26.83 186.92 31.52 25.21 35.12 4.42 30.12
3、單糖組成測定
稱取2 mg樣品於反應瓶中，加3 mL 2mol/L三氟乙酸（TFA），110℃油浴加熱3 h，冷卻至室溫，用氮氣在40℃下吹乾，加入3 mL甲醇，吹乾，重複4~5次以完全除去TFA。用超純水將反應瓶中的樣品溶解，並定容至100 mL，取部分溶液12000 g 離心20 min，取上清液，運用高效陰離子色譜法(HPAEC)檢測其單糖組成， 以單糖混合標品對照。由表2結果，可見Cs-4-P1-1、Cs-4-P1-2、Cs-4-P1-3的單糖組成一致，具有相同的組成單元。 表2
樣品 Glc p Gal p Man p
Cs-4-P1-1 1.00 1.71 2.44
Cs-4-P1-2 1.00 1.73 2.34
Cs-4-P1-3 1.00 1.74 2.09
實施例3 Cs-4-P1-2的結構解析
1、多糖甲基化
多糖經過甲基化後，測定其紅外圖譜，在3100-3600 cm -1間的羥基吸收峰消失表明多糖已經完全甲基化（圖1）。完全甲基化的樣品經過水解、還原和乙醯化處理，進行GC-MS分析，其中Cs-4-P1-2多糖甲基化分析的總離子流圖譜見圖2，甲基化分析結果見表3。 表3
甲基化糖 連接方式 莫耳比
2,3,4,6-Me 4-Glc p Terminal Glc p 1.77
2,3,4,6- Me 4-Gal p Terminal Gal p 1.00
2,3,6- Me 3-Gal p 1,4-Linked Gal p 2.04
2,3,4- Me 3-Man p 1,6-Linked Man p 2.33
2,3- Me 2-Man p 1,4,6-Linked Man p 2.96
2、波譜解析
從 1H NMR（圖3）中可以看出，異頭氫區域有5個共振信號峰，結合異頭氫峰面積比例確定共有9個糖殘基信號峰，分別在 δ4.92 ppm（3個H）、 δ4.89 ppm（2個H）、 δ4.58 ppm、 δ4.46 ppm（2個H）、 δ4.40 ppm處出現，說明糖殘基是β構型，根據異頭氫的化學位移遞減順序，設定各糖殘基的編號為A、B、C、D、E。在 13C NMR（圖4）圖譜中，異頭碳信號區域的信號為 δ102.1 ppm~ δ107.1 ppm，進一步說明葡萄糖殘基為 β構型。
為了進一步闡明多糖的化學結構，對其進行了二維核磁譜（COSY、TOCSY、HMQC、HMBC）的分析，並歸屬了各糖殘基對應的化學位移。
糖殘基A：根據 1H NMR確定的糖殘基A的1位氫（H-1）化學位移，通過COSY譜（圖5）明確了H-2和H-3信號，糖殘基A的H-2和H-3化學位移分別歸屬為 δ3.53 ppm和 δ3.72 ppm，結合COSY和TOSCY譜（圖6）對H-4（ δ3.92 ppm）、H-5（ δ3.65 ppm）和H-6（ δ3.95 ppm， δ3.75 ppm）信號的化學位移進行了歸屬。在歸屬完H的化學位移後，可通過HSQC譜（圖7）歸屬該糖環上各C的化學位移。根據中C和H的化學位移，可確定糖殘基A是→4,6)-β-D-Manp-(1→。 表4中C和H的化學位移，可確定糖殘基A是→4,6)- β-D-Man p-(1→。 表4
糖殘基 1H/ 13C（δ，ppm）
1 2 3 4 5 6a 6b
A →4,6)-β-D-Man p-(1→ H 4.92 3.53 3.72 3.92 3.65 3.95 3.75
C 103.1 74.57 75.5 79.2 75.69 68.7
B →4)- β-D-Gal p-(1→ H 4.89 4.05 3.93 4.02 3.81 3.90 3.83
C 102.1 72.5 72.5 80.0 73.8 63.3
C β-D-Gal p-(1→ H 4.58 3.67 3.74 4.13 3.76 3.69 3.61
C 107.1 77.36 69.5 80.4 78.4 65.6
D β-D-Glc p-(1→ H 4.46 3.56 3.71 3.92 3.65 3.83 3.76
C 106.3 73.8 78.3 71.7 74.7 63.6
E →6)-β-D-Man p-(1→ H 4.40 3.52 3.65 3.42 3.77 3.85 4.01
C 106.0 73.8 74.6 72.5 75.1 69.0
根據上述方法，依次對糖殘基B、C、D、E中的碳（C）、氫（H）信號化學位移進行歸屬，全歸屬結果見中C和H的化學位移，可確定糖殘基A是→4,6)-β-D-Manp-(1→。 表4。通過比對，確定了糖殘基B、C、D、E的連接方式分別為→4)-β-D-Gal p-(1→、β-D-Gal p-(1→、β-D-Glc p-(1→、→6)-β-D-Man p-(1→。
在完成歸屬後，進一步利用HMBC譜（圖9）明確各糖殘基間連接的位點及順序。從HMBC信號可知，殘基A的H-1和殘基B的C-4和殘基E的C-6有明顯相關信號，殘基B的H-1和殘基A的C-6有相關信號，殘基C的H-1和殘基B的C-4有相關信號，殘基D的H-1和殘基A的C-4有相關信號，殘基E的H-1和殘基A的C-4有相關信號，各糖殘基的遠程相關數據見表5。 表5
糖殘基 氫質子 關聯
A: →4,6)-β-D-Man p-(1→ H-1 80.4(B; C-4) , 68.9(E; C-6)
B: →4)- β-D-Gal p-(1→ H-1 68.7(A; C-6)
C: β-D-Gal p-(1→ H-1 80.4(B; C-4)
D: β-D-Glc p-(1→ H-1 79.7(A; C-4)
E: →6)-β-D-Man p-(1→ H-1 79.3(A: C-4)
之後根據NOESY譜（圖10）和HMBC譜相互驗證，從NOESY譜也可看出殘基A的H-1和殘基B的H-4和殘基D的H-6有相關點，殘基B的H-1和殘基A的H-6有相關點，殘基D的H-1和殘基A的H-4有相關點，殘基E的H-1和殘基A的H-4有相關點，NOE數據見表6。 表6
糖殘基 氫質子 NOE 關聯
A: →4,6)-β-D-Man p-(1→ H-1 4.02(B; H-4), 3.87(E; H-6)
B: →4)- β-D-Gal p-(1→ H-1 3.75(A; H-6)
D: β-D-Glc p-(1→ H-1 3.90(A; H-4)
E: →6)-β-D-Man p-(1→ H-1 3.92(A; H-4)
根據HMBC和NOESY譜相互驗證的結果，可以判斷糖殘基之間的連接方式，可以推斷殘基A的1位與殘基B的4位和E的6位相連接，殘基B的1位與殘基A的6位相連接，殘基C的1位與殘基B的4位相連，殘基D與殘基E的1位分別與殘基A的4位相連接，結合甲基化結果中各糖殘基的比例為A:B:C:D:E=3:2:1:2:1，據此確認多糖組分的重複單元為： 。
該多糖是以β-(1→4)-D-甘露糖、β-(1→6)-D-甘露糖和β-(1→4)-D-半乳糖交替連接為主鏈，在甘露糖的6位和4位分別連接β-D-半乳糖和β-D-葡萄糖支鏈的雜多糖。該重複片段為9糖，據此根據表1中Cs-4-P1-1、Cs-4-P1-2、Cs-4-P1-3的重均分子量(Mw)計算其n值分別約為：104、21、16。
實施例4 對腺嘌呤誘導的大鼠慢性腎衰的作用研究
試驗方法：70只SD大鼠，雌雄各半，按體重隨機分組，每組10只：正常對照組、模型組、Cs-4-P1-2組、發酵蟲草菌粉組、黃葵膠囊組、地塞米松組。試驗前，大鼠放入代謝籠，禁食24h（照常進水），記錄24h的尿量，檢測尿蛋白和尿肌酐。大鼠稱重後眼眶取血1mL，置於1.5mL離心管中，以3000轉/min離心10min，取血檢測尿素氮（BUN），肌酐（Scr）和尿酸，作為基礎值。除正常對照組外，其餘組別大鼠灌胃給予腺嘌呤（生理鹽水溶解）200mg/kg，每天一次，連續4周，最後一周不造模只給藥。分別於7、14、21、28天、35天大鼠眼眶取血，以3000轉/min離心10min，取血清檢驗尿素氮（BUN），肌酐（Scr）和尿酸值，記錄24h的尿量，檢測尿蛋白和尿肌酐，計算肌酐清除率。實驗終點解剖大鼠取出腎臟，在冰上將腎皮脂分離，稱重，計算臟器指數。然後4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡檢查，讀片。
試驗結果：1）動物體重變化如下所示。 表7所示。 表7
組別 體重（g）
0d 4d 7d 11d 14d 18d 21d 25d 28d 32d
正常對照組 239.68±25.42 240.32±15.73 270.52±37.85 * 283.40±45.18 * 300.27±56.75 * 311.56±63.49 ** 320.77±69.22 ** 327.74±71.38 *** 325.47±82.97 ** 339.16±73.25 ***
模型組 241.38±25.34 236.60±32.48 237.56±42.70 239.31±52.44 247.40±57.23 242.34±61.43 247.50±35.73 241.41±52.32 251.11±50.68 250.33±55.98
地塞米松 (0.1mg/kg) 244.50±22.06 238.82±24.53 242.10±37.97 223.18±29.76 222.30±28.50 194.71±33.21 * 211.92±26.28 200.78±7.93 189.98±20.96 * 197.30±15.92
黃葵 (1g/kg/天) 245.42±25.92 237.40±29.13 245.32±37.05 240.67±40.52 259.19±41.36 254.39±52.25 267.50±44.70 259.84±44.01 266.94±53.52 255.48±55.10
Cs-4-P1-2 (16mg/kg/天) 239.67±25.96 232.17±29.84 240.18±32.36 252.12±37.28 264.73±40.71 263.62±41.68 266.67±45.70 262.42±51.64 243.16±42.64 244.62±45.16
Cs-4-P (448mg/kg/天) 240.80±22.30 229.68±26.38 237.36±34.46 239.95±36.60 248.43±40.74 233.36±55.09 252.38±50.87 234.72±53.94 237.23±43.96 247.46±38.43
發酵蟲草菌粉 (1600mg/kg/天) 245.26±22.12 237.68±23.38 243.23±30.42 252.92±36.06 265.34±42.94 262.13±50.19 277.71±49.00 259.67±43.32 259.69±49.34 247.16±48.11
注：大鼠數量0d為10只/組，雌雄各半，與模型組比較 * P≤0.05 ， ** P≤0.01 ， *** P≤0.001
由所示。 表7可知：試驗第7d、11d、14d與模型組比較，正常對照組的大鼠體重明顯增加，第18d、21d和28d正常對照組的大鼠體重顯著增加，第25d和32d正常對照組的大鼠體重非常顯著地增加( P≤0.001)；地塞米松組從第11d開始體重較模型組有所減輕，其中第18d和28d顯著減輕，提示與激素副作用有關； Cs-4-P1-2組、Cs-4-P組、發酵蟲草菌粉組未見對體重有顯著影響。
2）大鼠腎重及臟器係數如下表8所示。 表8
組別 5w體重 5w腎重 5w臟器係數
正常對照組 333.55±88.76 *** 2.40±0.74 *** 0.72±0.09 ***
模型組 229.44±62.94 9.24±3.37 3.98±0.90
地塞米松(0.1mg/kg/天) 175.08±14.54 5.72±0.68 * 3.29±0.51
黃葵 (1g/kg/天) 266.80±45.23 9.89±4.33 3.66±1.52
Cs-4-P1-2 (16mg/kg/天) 230.99±52.21 6.99±3.43 2.94±0.92 *
Cs-4-P (448mg/kg/天) 261.16±57.00 8.69±2.69 3.35±0.92
發酵蟲草菌粉 (1600mg/kg/天) 233.04±57.48 7.02±2.54 2.97±0.60 *
注：雌雄大鼠合併統計，與模型組比較， * P≤0.05, ** P≤0.01, ***P≤0.001
由上表8可知，模型組體重低於正常對照組，腎重和腎臟器係數高於正常對照組，均有極顯著差異( P≤0.001)；與模型組比較，地塞米松組的大鼠腎重明顯下降( P≤0.05)，Cs-4-P1-2、Cs-4-P和發酵蟲草菌粉組大鼠腎重有下降趨勢；與模型組比較，正常對照組、Cs-4-P1-2和發酵蟲草菌粉組腎臟係數明顯降低( P≤0.05)，Cs-4-P組有下降趨勢。
3）實驗期間大鼠血清BUN的變化如下表9所示。 表9
組別 BUN mmol/L
0W 1W 2W 3W 4W 5w
正常對照組 4.50±0.84 5.22±1.16 *** 5.39±0.74 *** 5.43±0.55 *** 5.16±0.60 *** 4.81±1.06 ***
模型組 5.78±1.56 14.94±4.10 28.00±9.87 47.73±16.59 75.00±22.95 55.43±25.10
地塞米松 (0.1mg/kg/天) 6.01±1.25 13.99±2.95 20.96±8.23 45.93±21.11 60.68±31.88 28.68±12.56 *
黃葵 (1g/kg/天) 5.90±1.11 14.49±3.42 19.26±3.50 * 34.03±13.66 52.06±20.87 * 40.81±23.22
Cs-4-P1-2 (16mg/kg/天) 6.83±1.75 15.41±3.24 19.61±7.34 * 34.70±12.45 44.33±20.94 * 28.52±13.02 *
Cs-4-P (448mg/kg/天) 6.11±1.44 17.00±6.31 22.18±8.73 35.42±12.96 58.92±12.85 40.18±15.98
發酵蟲草菌粉 (1600mg/kg/天) 6.16±1.04 14.31±3.32 21.99±6.80 35.83±9.18 48.27±17.07 * 45.80±35.18
注：雌雄大鼠合併統計。與模型組比較， * P≤0.05, ** P≤0.01, ***P≤0.001
血清中的尿素氮(BUN)是臨床中反應腎小球濾過功能的重要指標，灌胃腺嘌呤可導致大鼠血清BUN升高。由表9可知，與模型組比較，造模1周正常對照組BUN水平為5.22±1.16 mmol/L，造模組BUN水平在13.99±2.95mmol/L和17.00±6.31mmol/L之間，兩組間有非常顯著的差別(P≤0.001)；實驗2W即給藥一周，黃葵組、Cs-4-P1組BUN水平明顯降低(P≤0.05)；實驗4W即給藥三周，黃葵組、Cs-4-P1-2和發酵蟲草菌粉組BUN水平明顯降低(P≤0.05)；實驗5W即給藥四周，地塞米松組和Cs-4-P1-2組BUN水平明顯降低(P≤0.05)；給藥期間，Cs-4-P組和發酵蟲草菌粉組BUN水平有下降趨勢。由此可知，Cs-4-P1-2具有改善慢性腎衰大鼠血清BUN的作用，對慢性腎衰竭具有明顯治療作用。
4）實驗期間血清CREA的變化如下表10所示。 表10
組別 CREA μmol/L
0W 1W 2W 3W 4W 5w
正常對照組 23.60±4.27 27.20±5.73 *** 29.00±6.27 *** 29.60±2.55 *** 29.40±3.86 *** 27.90±3.25 ***
模型組 26.88±3.36 63.25±17.50 128.62±58.17 243.71±63.93 309.00±57.06 250.00±94.80
地塞米松 (0.1mg/kg) 29.12±5.19 62.25±16.64 66.50±20.26 *** 134.17±40.46 ** 212.40±65.76 110.50±31.22 **
黃葵 (1g/kg/天) 27.75±4.71 62.25±15.98 90.25±32.90 * 207.57±87.40 267.43±88.95 207.43±88.14
Cs-4-P1-2 (16mg/kg/天) 28.71±5.82 61.43±10.45 80.71±35.33 * 187.00±107.80 241.00±134.18 157.17±121.38
Cs-4-P 29.00±5.42 62.38±14.36 110.25±48.09 173.00±58.84 320.17±54.24 224.00±80.64
發酵蟲草菌粉 (1600mg/kg/天) 28.57±4.72 61.43±10.63 99.86±36.15 192.57±57.34 264.17±99.93 195.17±113.18
注：雌雄大鼠合併統計。與模型組比較， * P≤0.05, ** P≤0.01, ***P≤0.001
血清肌酐(CREA)是腎臟功能的重要指標，CREA升高意味著腎功能的損害。由表10可知，與模型組比較，造模1周正常對照組CREA水平為27.20±5.73μmol/L，造模組在58.28±13.40μmol/L和65.86±11.13μmol/L之間，兩組間有非常顯著的差別(P≤0.001)；實驗2W即給藥一周，地塞米松組CREA水平非常顯著降低(P≤0.001)，黃葵組和Cs-4-P1-2組CREA水平明顯降低(P≤0.05)；實驗3W即給藥兩周，地塞米松組CREA水平顯著降低(P≤0.01)，其餘各組有降低趨勢；實驗4W即給藥三周，各組CREA水平有降低趨勢；實驗5W即給藥四周，地塞米松組CREA水平非常顯著降低，其餘各組有降低趨勢。由此可知，Cs-4-P1-2具有改善慢性腎衰大鼠血清CREA的作用，對慢性腎衰竭具有明顯治療作用。
5）實驗期間UA的變化如下表11所示 表11
組別 UA μmol/L
0W 1W 2W 3W 4W 5w
正常對照組 90.60±16.66 91.00±12.51 *** 102.20±22.62 *** 100.60±14.55 * 78.00±13.79 ** 88.80±16.28
模型組 85.38±18.42 130.38±21.90 148.38±22.95 121.86±19.49 101.33±19.05 93.17±25.01
地塞米松 (0.1mg/kg) 80.62±10.10 113.75±24.84 106.50±13.07 *** 128.50±25.25 94.80±20.40 139.75±37.35 ***
黃葵 (1g/kg/天) 85.25±9.56 126.88±19.77 126.75±13.90 * 121.57±17.67 96.57±14.50 107.14±24.09
Cs-4-P1-2 (16mg/kg/天) 82.86±14.82 114.00±21.92 116.71±20.97 ** 125.57±20.06 86.57±27.23 121.33±20.06 *
Cs-4-P 95.62±17.96 133.25±44.37 124.75±29.42* 136.75±24.40 91.50±20.76 108.83±23.21
發酵蟲草菌粉 (1600mg/kg/天) 85.00±9.09 121.14±18.52 112.86±23.03 ** 118.57±22.32 75.86±8.91 ** 103.50±19.58
注：雌雄大鼠合併統計。與模型組比較， * P≤0.05, ** P≤0.01, ***P≤0.001
由表11可知，與模型組比較，造模1周正常對照組UA水平為91.00±12.51μmol/L，造模組在113.75±24.84μmol/L和133.29±18.50μmol/L之間，兩組間有非常顯著的差別(P≤0.001)；實驗2W即給藥一周，正常對照組顯著較低，地塞米松組UA水平非常顯著降低(P≤0.001)，黃葵組和Cs-4-P組明顯降低(P≤0.05)，Cs-4-P1-2和發酵蟲草菌粉組UA水平顯著降低(P≤0.01)；實驗3W即給藥兩周，地塞米松組UA水平顯著降低，其餘各組有降低趨勢；實驗4W即給藥三周，發酵蟲草菌粉組UA水平顯著趨勢，其餘各組有降低趨勢；實驗5W即給藥四周，地塞米松組UA水平顯著升高，Cs-4-P1-2明顯升高，其餘各組有升高趨勢。
6）腎臟病理。
腺嘌呤致慢性腎衰能能引起嚴重的腎臟組織病變，模擬腎衰終末期狀態。通過對腎臟進行HE染色病理切片，在光鏡下觀察，其結果見。正常對照組大鼠腎臟組織結構正常，腎小球血管袢薄而清晰，內皮細胞和系膜細胞數碼正常，周圍腎小管正常。與正常對照組相比，模型組大鼠腎組織發現腎小球纖維化，腎小管萎縮或擴張，腎小管腎小球內見異物充塞，間質內大量纖維組織增生及炎細胞浸潤。與模型組相比， Cs-4-P1-2給藥組殘存腎小球單位增加，病理評分顯著降低(P≤0.01)，黃葵和發酵蟲草菌粉組病理評分明顯降低(P≤0.05)。說明Cs-4-P1-2、發酵蟲草菌粉對長期腺嘌呤灌胃導致的腎臟病理變化有所改善和恢復作用，其中Cs-4-P1-2最優。 表12
組別 病理評分
正常對照組 0.00±0.00 ***
模型組 9.00±0.00
地塞米松(0.1mg/kg) 8.60±0.55
黃葵 (1g/kg/天) 8.43±0.45 *
Cs-4-P1-2(16mg/kg/天) 8.31±0.37 **
Cs-4-P 8.58±0.49
發酵蟲草菌粉組 (1600mg/kg/天) 8.31±0.88 *
注:與模型組比較 * P≤0.05 ， ** P≤0.01 ， *** P≤0.001
從殘存的腎小球和腎單位來判斷Cs-4-P1對腎臟的作用。由表12可知，與模型組比較，正常對照組病理評分為0，黃葵組、發酵蟲草菌粉組大鼠病理評分有所降低，Cs-4-P組有降低趨勢，Cs-4-P1-2組大鼠病理評分明顯降低。
7）試驗終點大鼠死亡率如下表13所示。 表13
組別 原有只數 存活只數 死亡率(%)
正常對照組 10 10 0.00
模型組 10 7 30.00
地塞米松(0.1mg/kg) 10 5 50.00
黃葵 (1g/kg/天) 10 7 30.00
Cs-4-P1-2(16mg/kg/天) 10 8 20.00
Cs-4-P 10 6 30.00
發酵蟲草菌粉組 (1600mg/kg/天) 10 8 20.00
由表13可知，試驗期間造模組均有死亡，其中地塞米松組死亡率最高為50%，分析與激素副作用有關。Cs-4-P1-2組和發酵蟲草菌粉組死亡率均為20%，較模型組降低。
綜上，本試驗條件下，從大鼠試驗期間觀察、體重、血清生化指標和病理總分等幾個方面進行發酵蟲草菌粉組分對腺嘌呤致慢性腎衰的作用研究，試驗結果顯示模型組造模成功，與模型組比較，Cs-4-P1-2組血清生化指標檢測相對有效，死亡率降低，能減輕腺嘌呤所致的慢性腎衰的作用。且可以看出本發明的Cs-4-P1-2對腺嘌呤致慢性腎衰的效果顯著優於地塞米松、黃葵和發酵蟲草菌粉和其粗多糖（Cs-4-P）。
實施例5 抑制免疫排斥反應的藥效學研究
試驗方法：
（1）皮膚移植模型的建立
根據參考文獻（蔡春曉，馬春梅, 等. 小鼠異種皮膚移植模型的建立及對免疫抑制藥物的藥效評價. 中國藥理學通報，2016，32( 11) : 1613-1619.），BALB/c小鼠和C57/BL6小鼠經戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉後，用70%酒精對供體小鼠的耳朵和受體小鼠的背部皮膚進行消毒。將供體小鼠的耳朵從根部取下，置於冰冷的無菌PBS中備用。將受體小鼠背部一側皮膚的表皮剪下（直徑約1cm），將供體小鼠的耳朵內外側皮膚分離，取內側皮膚，分離面朝下，貼合到受體小鼠背部，用剪刀將未完全吻合的皮膚進行剔除修理後，用無菌創口貼包紮，用絲線將創口貼縫合固定。待2天後，將創口貼輕輕剪下，暴露移植部位，對移植排斥反應進行評價。在本實驗中異種皮膚移植（Allograft）將C57/BL6小鼠皮膚移植到BALB/c小鼠身上，同種皮膚移植（Isograft）將BALB/c小鼠皮膚移植到BALB/c小鼠身上。
（2）移植排斥評分（Graft Rejection Score）
根據文獻，將移植後皮膚的排斥反應分為0-5級（如表14所示）。 表14
級別 移植排斥反應
0 皮膚完好，無排斥反應
1 剛剛出現排斥現象
2 ＞25%的皮膚壞死
3 ＞50%的皮膚壞死
4 ＞75%的皮膚壞死
5 皮膚完全壞死（＞95%）
注：移植排斥以壞死皮膚占總皮膚的百分比表示，因縫合、縫合材料、皮膚移位以及其他外傷等引起的皮膚損傷不計入統計。
當皮膚移植排斥級別達到5級時，可定義為移植的皮膚死亡。
（3）劑量設計及依據
臨床人用環孢素作為免疫抑制劑的劑量為15mg/kg/天，小鼠劑量為150mg/kg，發酵蟲草菌粉人體給藥劑量為人體3g~6g/天，發酵蟲草菌粉劑量設置為小鼠3000mg/kg/天，根據得率設置Cs-4-P1-2劑量為小鼠30mg/kg/天。 表15
日 空白 模型 環孢素(150mg/kg) 發酵蟲草菌粉 (3g/kg) Cs-4-P1-2 (30mg/kg)
0 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
4 0.20±0.42 0.90±0.32## 0.70±0.67 0.70±0.48 0.80±0.79
5 0.30±0.48 1.50±0.71## 1.10±0.88 1.10±0.74 1.40±0.52
6 0.50±0.53 3.20±0.63 ## 1.60±0.97 ** 2.00±1.05 ** 1.50±0.71 **
7 0.80±0.79 3.40±0.70 ## 2.00±0.82 ** 2.30±0.82 ** 1.90±0.74 **
8 0.40±0.52 3.40±0.70 ## 2.10±0.99 ** 2.60±0.52 ** 2.50±0.53 **
9 0.60±0.52 3.50±0.71 ## 2.00±0.94 ** 2.60±0.70 * 2.30±0.48 **
10 0.40±0.52 3.90±0.88 ## 2.40±0.84 ** 2.60±0.52 ** 2.50±0.53 **
11 0.40±0.52 4.50±0.53 ## 2.60±0.70 ** 2.80±0.42 ** 2.80±0.42 **
12 0.60±0.70 4.60±0.52 ## 3.30±0.67 ** 3.00±0.47 ** 3.50±0.53 **
13 0.60±0.84 4.80±0.42 ## 3.70±1.25 * 4.20±1.14 4.10±0.88 *
14 0.60±0.84 4.80±0.42 ## 3.90±1.37 4.30±1.16 4.70±0.48
** P＜0.01 vs 模型  * P＜0.05vs 模型 ## P＜0.01 vs 空白  # P＜0.05vs 空白
從第四天起對皮膚進行評分，從表15可以看到，移植後，空白（同種皮膚移植）組和模型組相比評分較低，14天後和模型組有極顯著差異(P＜0.01)；環孢素組的評分在6-13天內始終低於模型組，有極顯著差異(P＜0.01)，第十四天後移植皮膚開始大面積焦枯，和模型沒有差異；發酵蟲草菌粉組的評分在6-12天內始終低於模型組，有極顯著差異，第十三天後移植皮膚開始大面積焦枯，和模型沒有差異；Cs-4-P1-2組在10-13天內低於模型組，有極顯著差異(P＜0.01)，第十四天後移植皮膚開始大面積焦枯，和模型沒有差異。表明環孢素、Cs-4-P1-2和發酵蟲草菌粉對小鼠皮膚移植的免疫排斥反應有明顯抑制作用，其中 Cs-4-P1-2具有劑量優勢。
2）各組體重比較 表16
日 空白 模型 環孢素(150mg/kg) 發酵蟲草菌粉 (3g/kg) Cs-4-P1 (30mg/kg)
0 19.09±1.88 19.6±1.45 19.99±1.21 19.93±0.86 19.70±1.25
4 20.83±0.88 21.06±0.59 19.34±1.62 ** 20.60±0.74 20.69±1.06
5 21.07±0.97 22.04±0.65 18.38±1.31 ** 20.93±1.55 21.74±1.33
6 22.15±0.85 22.26±0.82 18.98±1.13 ** 21.53±1.56 22.10±1.21
7 22.46±0.99 22.62±0.70 19.35±1.50 ** 21.58±1.33 * 22.26±1.37
8 22.64±0.87 22.58±0.74 19.65±1.43 ** 21.59±1.41 22.48±1.33
9 22.43±0.73 22.74±0.66 20.33±0.64 ** 21.76±1.14 * 22.56±1.37
10 22.78±0.88 22.72±0.85 20.23±0.64 ** 21.97±0.96 22.83±1.19
11 22.92±1.01 22.82±0.79 20.15±0.55 ** 21.72±1.06 * 22.77±1.09
12 23.03±0.72 23.28±0.96 20.08±0.59 ** 22.04±0.75 ** 23.01±1.11
13 23.14±0.75 23.12±1.09 20.23±0.74 ** 21.69±0.83 ** 22.64±1.23
14 23.66±0.88 22.14±1.26 19.80±1.22 ** 22.9±3.45 22.94±1.26
** P＜0.01 vs 模型  * P＜0.05vs 模型 ## P＜0.01 vs 空白  # P＜0.05vs 空白
從表16可以看到，移植後，空白（同種皮膚移植）組、Cs-4-P1-2和模型組相比體重始終沒有差異；環孢素組的小鼠移植給藥後體重增長較緩，始終低於模型組，有極顯著差異(P＜0.01)；發酵蟲草菌粉組的小鼠體重在7-12天內低於模型組，有顯著差異。提示相比環孢素，Cs-4-P1-2副作用小，安全性高。
實施例6對高血脂斑馬魚作用研究
試驗方法： (1) 實驗動物 斑馬魚均飼養於28 ℃的養魚用水中（水質：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為450~550 μS/cm；pH為6.5~8.5；硬度為50~100 mg/L CaCO 3），由本公司養魚中心繁殖提供，實驗動物使用許可證號為：SYXK（浙）2012-0171，飼養管理符合國際AAALAC認證（認證編號：001458）的要求。 黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為受精後7天（7 dpf）的斑馬魚用於降血脂功效最大檢測濃度（MTC）測定。 黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為5 dpf的斑馬魚用於降血脂功效評價。 (2) 檢測方法 a. MTC測定 隨機選取7 dpf黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚於6孔板中，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚。分別水溶給予樣品（濃度見表17），同時設置正常對照組，每孔容量為3 mL。28 ℃處理48 h後，測定樣品對正常斑馬魚的MTC。 b. 降血脂功效評價 隨機選取5 dpf黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚，水溶給予蛋黃粉建立斑馬魚高血脂模型。餵飼16 h後將斑馬魚隨機分配至6孔板中，每孔均處理30尾斑馬魚。分別水溶給予樣品（濃度見表17-18），陽性對照阿托伐他汀鈣0.240 µg/mL濃度，同時設置正常對照組和模型對照組，每孔容量為3 mL。28 ℃處理48 h後，將斑馬魚勻漿取上清，用甘油三酯和總膽固醇試劑盒進行反應，應用多功能酶標儀分別測定各實驗組甘油三酯和總膽固醇OD值，分析甘油三酯含量（C1）和總膽固醇含量（C2），以上述指標的統計學分析結果評價樣品降血脂功效。統計學處理結果採用mean ± SE表示。降血脂功效計算公式如下： 1）降甘油三酯功效： 2）降總膽固醇功效： 用SPSS 26.0軟體進行統計學分析，p ＜ 0.05表明差異具有統計學意義。
檢測結果 在本實驗條件下，發酵蟲草菌粉、 Cs-4-P1-2對正常斑馬魚的MTC(最小中毒濃度)分別為300和10.0 μg/mL。詳見表17。 表17
組別 濃度（µg/mL） 死亡數（尾） 死亡率（%） 表型
正常對照組 - 0 0.00 未見明顯異常
發酵蟲草菌粉 100 0 0.00 與正常對照組狀態相似
300 0 0.00 與正常對照組狀態相似
1000 30 100 /
2500 30 100 /
5000 20 66.7 剩餘斑馬魚瀕死
Cs-4-P1-2 1.00 0 0.00 與正常對照組狀態相似
3.00 0 0.00 與正常對照組狀態相似
10.0 0 0.00 與正常對照組狀態相似
25.0 0 0.00 較正常對照組狀態差
50.0 0 0.00 較正常對照組狀態差
降血脂功效評價 在本實驗條件下，發酵蟲草菌粉、Cs-4-P1-2具有降甘油三酯功效； Cs-4-P1-2具有降總膽固醇功效，詳見表18。 表18
組別 濃度（µg/mL） 甘油三酯含量 （mmol/L，mean ± SE） 降甘油三酯功效（%）
正常對照組 - 0.121 ± 0.021** -
模型對照組 - 0.280 ± 0.002 -
阿托伐他汀鈣 0.240 0.240 ± 0.004*** 14
發酵蟲草菌粉 100 0.242 ± 0.013* 14
300 0.294 ± 0.026 -5
與模型對照組比較，*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01，***p ＜ 0.001 表19
組別 濃度（µg/mL） 甘油三酯含量 （mmol/L，mean ± SE） 降甘油三酯功效（%）
正常對照組 - 0.145 ± 0.010*** -
模型對照組 - 0.318 ± 0.001 -
阿托伐他汀鈣 0.240 0.273 ± 0.003*** 14
Cs-4-P1-2 1.00 0.281 ± 0.022 12
3.00 0.189 ± 0.046* 41
10.0 0.278 ± 0.040 13
與模型對照組比較，*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01，***p ＜ 0.001
由上表19可知，Cs-4-P1-2濃度在1.0-10.0µg/mL時，其具有較優降甘油三酯功效，且在3.00µg/mL時，降甘油三酯功效最優，降甘油三脂活性優於阿托伐他汀鈣。 表20
組別 濃度（µg/mL） 總膽固醇含量 （mmol/L，mean ± SE） 降總膽固醇功效（%）
正常對照組 - 0.144 ± 0.016* -
模型對照組 - 0.244 ± 0.019 -
阿托伐他汀鈣 0.240 0.185 ± 0.002* 24
發酵蟲草菌粉 100 0.221 ± 0.008 9
300 0.285 ± 0.021 -17
與模型對照組比較，*p ＜ 0.05 表21
組別 濃度（µg/mL） 總膽固醇含量 （mmol/L，mean ± SE） 降總膽固醇功效（%）
正常對照組 - 0.088 ± 0.009** -
模型對照組 - 0.191 ± 0.010 -
阿托伐他汀鈣 0.240 0.155 ± 0.007* 19
Cs-4-P1-2 1.00 0.145 ± 0.005* 24
3.00 0.134 ± 0.006** 30
10.0 0.187 ± 0.016 2
與模型對照組比較，*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01
由上表21可知，Cs-4-P1-2濃度在1.0-10.0µg/mL時，其具有較優總膽固醇功效，且在1.00-3.00µg/mL時，降總膽固醇功效最優，顯著優於發酵蟲草菌粉和阿托伐他汀鈣。
實施例7 對順鉑所致急性腎損傷小鼠作用研究
試驗方法： 小鼠術前禁食12h，自由飲水。除對照組外，其餘各組腹腔單次注射劑量為10 mg/kg的順鉑溶液，對照組注射等體積的生理鹽水。15min後分別按分組給予氨磷汀，Cs-4-P1和Cs-4-P1-2。分別於給藥後第1，3和5天采血，測血清中尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）。
試驗結果：結果如表22所示，對照組血清尿素氮和肌酐第1，3和5天均趨於平穩，模型組血清尿素氮和肌酐於第3開始升高並在第5天保持高水平，與對照組比較，模型組第3和5天的血清尿素氮和肌酐均表現出統計學差異（p＜0.05，p＜0.01）。陽性藥氨磷汀300mg/kg組給藥後第3和5天，小鼠血清尿素氮和肌酐含量明顯下降，與模型組比較，表現出統計學差異（p＜0.05，p＜0.01）；給予受試物Cs-4-P1（160mg/kg）第3和5天，小鼠血清尿素氮和肌酐含量明顯下降，與模型組比較，表現出統計學差異（p＜0.05，p＜0.01）；分別給予Cs-4-P1-2(160mg/kg和80mg/kg)後，第3天和5天小鼠血清尿素氮和肌酐含量明顯下降，與模型組比較均表現出統計學差異（p＜0.05，p＜0.01）。可見，Cs-4-P1-2在160mg/kg劑量下對血清尿素氮和肌酐的改善作用與陽性藥氨磷汀（300mg/kg）一致。可見Cs-4-P1-2對小鼠急性腎損傷有治療和改善作用。 表22
組別 劑量（mg/kg） 血清尿素氮（mmol/L） 血清肌酐（μmol/L）
第一天 第三天 第五天 第一天 第三天 第五天
對照組 - 2.13±0.23 1.99±0.07 2.23±0.23 19.51±4.83 27.71±7.62 22.28±4.10
模型組 - 2.17±0.37 4.56±1.58 # 4.35±0.34 ## 18.76±2.03 44.25±10.21 # 44.34±10.21 #
氨磷汀組 300 2.22±0.20 1.96±0.04 * 0.92±0.13e 20.91±3.22 24.88±3.65E 15.19±1.78 **
Cs-4-P1組 160 1.73±0.19 1.81±0.08 * 1.20±0.26 ** 25.91±1.64 25.59±2.32 * 23.01±3.66 *
Cs-4-P1-2組 160 1.70±0.36 1.78±0.02 * 0.92±0.10 ** 24.63±4.13 23.03±2.83 ** 13.50±1.93 **
Cs-4-P1-2組 80 1.68±0.35 1.82±0.15 * 1.14±0.52 ** 24.88±2.63 24.58±3.71 * 22.90±2.89 *
與對照組比較， ##p＜0.01；與模型組比較，* p＜0.05, ** p＜0.01
實施例8 對LPS所致急性腎損傷小鼠作用研究
試驗方法： 小鼠術前禁食12h，自由飲水。除對照組外，其餘各組腹腔單次注射劑量為20 mg/kg的LPS溶液，對照組注射等體積的生理鹽水。15min後分別按分組給予地塞米松和Cs-4-P1-2。36小時後處死動物，取血測血清肌酐和尿素氮。
試驗結果： 結果如表23所示，與對照比較，模型組小鼠的血清尿素氮和肌酐水平分別為17.69±1.13 mmol/L和45.35±5.85 μmol/L，並表現出統計學差異（p＜0.01）。分別給予10mg/kg劑量的陽性藥地塞米松，陽性藥組小鼠的血清尿素氮和肌酐水平分別為12.29±4.42 mmol/L和24.03±13.81 μmol/L，與模型組比較均表現出顯著性差異（p＜0.05）；Cs-4-P1-2低、中、高劑量組小鼠的血清尿素氮水平分別下降至 14.41±1.73、13.20±1.72和12.72±0.55 mmol/L；血清肌酐水平分別下降至35.15±26.22、26.34±2.75、24.33±9.65 μmol/L，與模型組比較，Cs-4-P1-2中和高劑量組小鼠血清尿素氮和肌酐均表現出統計學差異（p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001）。可見，Cs-4-P1-2高劑量組對LPS誘導的急性腎損傷小鼠血清尿素氮和肌酐的影響與陽性藥地塞米松效果相當。可見Cs-4-P1-2對小鼠急性腎損傷有治療和改善作用。 表23
組別 劑量（mg/kg） 動物數 尿素氮（mmol/L） 血清肌酐（μmol/L）
對照組 - 5 4.39±0.88 12.53±1.25
模型組 - 5 17.69±1.13## 45.35±5.85##
陽性藥組 10 5 12.29±4.42* 24.03±13.81*
Cs-4-P1-2組 100 5 12.72±0.55*** 24.33±9.65*
Cs-4-P1-2組 10 5 13.20±1.72** 26.34±2.75*
Cs-4-P1-2組 1 5 14.41±1.73* 35.15±26.22
圖8是根據本發明實施例的 1H- 13C HSQC圖譜。圖11是根據本發明實施例的病理切片圖。
無
圖1是根據本發明實施例的HPGPC圖譜。 圖2是根據本發明實施例的甲基化後樣品紅外圖譜。 圖3是根據本發明實施例的Cs-4-P1-2衍生物的總離子流圖譜。 圖4是根據本發明實施例的Cs-4-P1-2的 1H NMR圖譜。 圖5是根據本發明實施例的Cs-4-P1-2的 13C NMR圖譜。 圖6是根據本發明實施例的Cs-4-P1-2的 1H- 1H COSY圖譜。 圖7是根據本發明實施例的Cs-4-P1-2的 1H- 1H TOCSY圖譜。 圖8是根據本發明實施例的 1H- 13C HSQC圖譜。 圖9是根據本發明實施例的 1H- 13C HMBC圖譜。 圖10是根據本發明實施例的 1H - 1H NOESY圖譜。 圖11是根據本發明實施例的病理切片圖。

Claims (11)

  1. 一種Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖，結構式如下所示： ， 其中，Man p為吡喃型甘露糖、Galp為吡喃型半乳糖、Glc p為吡喃型葡萄糖，n選自6-104。
  2. 根據請求項1所述的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖，其中所述多糖的相對分子量選自-10-152kDa。
  3. 根據請求項1或2所述的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖，其中所述多糖組成包括：葡萄糖、半乳糖和甘露糖，所述葡萄糖、半乳糖和甘露糖的莫耳比為1：(1.0-2.0)：(1.5-2.5)。
  4. 一種提取請求項1-3任一項所述Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖的方法，其中 1）將Cs-4菌粉用乙醇進行脫脂處理，捨去乙醇提液，獲得脫脂殘渣， 2）將所述殘渣在水中進行提取處理，獲得水提液， 3）將所述水提液進行醇沉處理，所述醇沉處理的溶劑為乙醇， 4）將步驟3）中醇沉處理後的沉澱進行純化處理，獲得發酵菌絲體雜聚多糖。
  5. 根據請求項4所述的方法，其中所述脫脂處理是在溫度為100℃的條件下進行的； 任選地，所述脫脂處理進行三次，每次時間為1小時； 任選地，所述脫脂處理中乙醇是Cs-4的10倍量； 任選地，所述脫脂處理的乙醇為85%-100%乙醇； 任選地，所述提取處理是在溫度為75℃-78℃的條件下進行的； 任選地，所述提取處理進行三次，每次時間為1小時； 任選地，所述提取處理中水是殘渣的10倍量； 任選地，所述醇沉處理的乙醇為80%乙醇。
  6. 一種提取請求項1-3任一項所述Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖的方法，其中 1）將Cs-4在10倍量的85%乙醇加熱提取3次，每次1小時，捨去乙醇提液，獲得殘渣； 2）將所述殘渣在10倍量水加熱提取3次，每次1小時，合併水提液； 3）將所述水提液經80%乙醇醇沉，獲得沉澱； 4）將所述沉澱進行純化處理，獲得發酵菌絲體雜聚多糖。
  7. 根據請求項4-6任一項所述的提取方法，其中所述純化處理包括去蛋白處理、脫色處理、柱純化處理。
  8. 一種藥物組合物，其中包含請求項1-3任一項所述的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖或根據請求項4-7任一項所述的方法獲得的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖。
  9. 請求項1-3任一項所述的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖或根據請求項4-7任一項所述的方法獲得的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖或請求項8所述的藥物組合物在製備藥物中的用途，所述藥物用於預防或治療慢性腎衰、抑制免疫排斥反應、預防或治療高血脂和/或預防或治療急性腎損傷。
  10. 一種預防或治療高血脂的藥物組合物，其中包含1.0-10.0 µg/mL請求項1-3任一項所述的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖或根據請求項4-7任一項所述的方法獲得的Cs-4發酵菌絲體雜聚多糖。
  11. 根據請求項10所述的藥物組合物，其中所述多糖的濃度為3.0 µg/mL。
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