KR20080050568A

KR20080050568A - 비피도박테리움 속의 미생물이 생산하는 다당

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Publication number: KR20080050568A
Application number: KR1020087003190A
Authority: KR
Inventors: 마사노리 아사다; 마미코 고우노; 다다시 가나야; 도모에 요시노; 유이치 마쓰우라; 유조 가와하라; 신이치 기타무라
Original assignee: 모리시타 진탄 가부시키가이샤; 고리츠다이가쿠호징 오사카후리츠다이가쿠; 아이피이 인코포레이티드
Priority date: 2005-07-08
Filing date: 2006-06-23
Publication date: 2008-06-09
Also published as: JP5192808B2; EP1908819A4; CN101218340A; KR101280276B1; RU2008104770A; JPWO2007007562A1; AU2006267690B2; EP1908819A1; AU2006267690A1; CA2621359C; RU2418857C2; WO2007007562A1; US8022049B2; EP1908819B1; CA2621359A1; CN101218340B; US20100174063A1

Abstract

본 발명은 구성 성분으로서 갈락토스, 글루코스, 람노스 및 피루브산을 함유하는 다당으로서, 당해 갈락토스, 글루코스 및 람노스를 4:2:1의 몰 비로 포함하며, 4 내지 7중량%의 피루브산을 포함하는 다당에 관한 것이다. 당해 다당은 비피도박테리움 롱검 JBL05 균주 (NITE BP-82)를 혐기적으로 배양함으로써 수득된다.

비피도박테리움, 다당 제조 방법, 면역 부활제, 보습제

Description

비피도박테리움 속의 미생물이 생산하는 다당 {Polysaccharide produced by microorganism belonging to genus Bifidobacterium}

본 발명은 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium 속)의 미생물이 생산하는 신규한 다당 및 이를 포함하는 식품, 화장품, 의약품 등의 조성물에 관한 것이다.

비피도박테리움 속의 미생물은 장내 세균총에 있어서의 가장 우세한 세균의 하나이다. 당해 미생물은 락트산균과 동일하게 균체 그 자체가 섭취될 수 있다. 그리고 당해 미생물을 섭취함으로써 장내 세균총의 균형을 갖추는 정장 작용, 혈청 콜레스테롤 수치의 개선 효과 및 면역 부활 작용 등이 수득되는 것이 보고되어 있다. 이 중에서도, 면역 기능의 증강에 관해서는, 락트산균이나 비피도박테리움 속 미생물을 유효성분으로 하는 항종양제 [일본 공개특허공보 제(평)7-82158호] 및 사이토카인 생산 촉진제 [일본 공개특허공보 제(평)8-92112호], 락토바실러스 속(Lactobacillus 속)의 미생물을 유효성분으로 하는 염증성 장 질환 예방 치료제 [일본 공개특허공보 2003-73286호], 비피도박테리움 속 미생물의 세포벽 및/또는 세포벽 파쇄물을 유효성분으로 하는 과립구 유도제 [일본 공개특허공보 제(평)7- 330806호] 및 비피도박테리움 속 미생물을 유효성분으로 하는 수용성 면역 부활 물질 [일본 공개특허공보 제(평)9-241179호] 등이 보고되어 있다. 그러나, 이들은 모두 균체 그 자체 또는 세포벽 용해 효소 처리나 초음파에 의한 균체 파쇄에 의해 수득되는 다당 분획을 유효성분으로 하고 있는 것이다.

한편, 균체 외부 다당의 면역 기능 부활 작용에 관해서, 스트렙토코커스 락티스 (Streptococcus lactis) 또는 스트렙토코커스 크레모리스 (Streptococcus cremoris)가 생산하는 다당을 유효성분으로 함유하는 항종양제 [일본 특허 제2678673호] 락토코커스 락티스 아종 크레모리스 (Lactococcus lactis subsp . cremoris)나 락토코커스 락티스 아종 락티스 (Lactococcus lactis subsp . lactis)의 점착성 협막 다당류의 항종양 활성 [일본 공개특허공보 제(평)1-277484호], 락토바실러스속 미생물의 배양액으로부터 수득되는 다당을 유효성분으로 함유하는 항염증제 또는 골수 세포 증식 촉진제 [일본 공개특허공보 제(평)7-70209호], 락토바실러스 델브루엑키 아종 불가리쿠스 (Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus)가 생산하는 인 함유 다당류의 자기 면역 질환 예방 효과 [참조: 일본 특허 제3017493호] 등이 보고되어 있다. 그러나, 이들은 모두 요구르트나 발효유로부터 분리된 락트산균이 생산하는 다당에 관한 것이다.

원래, 인간의 장내 세균총에 있어서, 비피도박테리움 속 미생물의 존재 균수는 락트산균의 존재 균수보다 많으며, 장내에 존재하는 비피도박테리움 속 미생물이 생산하는 다당은 어떤 생체 방어 기능을 갖는다고 생각된다. 그러나, 이러한 비피도박테리움 속 미생물이 생산하는 다당에 관해서는, 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum)이 생산하는 글루코스만으로 이루어진 다당류 [참조: 일본 공개특허공보 제(평)7-255465호], 비피도박테리움 롱검이 생산하는 글루코스, 갈락토스 및 우론산 등으로 이루어진 다당류 [참조: Appl. Microbiol. Biotechnol. vol.43, p.995-1000] 등이 보고되어 있을 뿐이며, 또한 이들의 기능에 관해서는 명확하지 않다.

따라서, 새로운 기능을 갖는 비피도박테리움에서 유래하는 다당이 요구되고 있다.

본 발명자들은, 인간의 장내에 존재하는 고점성 물질을 생산하는 비피도박테리움 속 미생물에 관해서 예의 연구한 결과, 비피도박테리움 롱검 JBL05 균주 (NITE BP-82)가 배양액 중에 다량의 점성 물질을 생산하고, 이 점성 물질이 신규 다당이고, 당해 신규 다당이 보습 작용 및 면역 부활 작용 등의 기능을 갖는 것을 밝혀내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 신규 다당을 제공하고, 이 다당은 구성 성분으로서 갈락토스, 글루코스, 람노스 및 피루브산을 함유하며, 이때, 당해 갈락토스, 글루코스 및 람노스는 4:2:1의 몰 비로 포함되며, 피루브산은 4 내지 7중량%로 포함된다.

일 양태에서, 본 발명의 다당은 이하의 화학식 I의 구조를 갖는다.

또한, 본 발명은 상기 다당의 제조방법으로서, 당해 다당을 생산하는 능력을 갖는 비피도박테리움 속에 속하는 미생물을 배양하는 공정, 및 당해 미생물에 의해 생산된 다당을 회수하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다.

일 양태에서, 상기 미생물은 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) JBL05 균주 (NITE BP-82)이다.

또한, 본 발명은 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) JBL05 균주 (NITE BP-82)를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 다당을 함유하는 조성물을 제공하고, 하나의 실시형태에서, 상기 조성물은 식품 조성물 및 화장품 조성물 또는 의약품 조성물이다.

다른 실시형태에서, 상기 식품 조성물 또는 의약품 조성물이 면역 부활제이고, 상기 화장품 조성물이 보습제이다.

또한, 다른 본 발명의 양태는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) JBL05 균주 (NITE BP-82)를 포함하는 제형을 제공한다.

본 발명은 보습 작용 및 면역 부활 작용을 갖는 신규 다당이 제공된다. 당해 다당은 식품 조성물, 화장품 조성물 및 의약품 조성물 등의 원료로서 사용된다. 또한, 비피도박테리움 롱검 JBL05 균주 (NITE BP-82) 및 당해 미생물을 포함하는 배양액도 제형화되어, 면역 부활제 등의 의약품 또는 면역 부활 활성을 갖는 식품 등으로서 이용된다. 또한, 비피도박테리움 롱검 JBL05 균주 (NITE BP-82) 및 당해 균체 파쇄물 (파쇄액)도 제형화되어, 화장품 조성물 등으로서 이용된다.

도 1은 비피도박테리움 롱검 JBL05 균주 (NITE BP-82)의 배양 시간과 배양액의 점도 사이의 관계를 도시한 그래프이다.

도 2는 본 발명의 다당의 TNF-α생산 촉진 효과를 도시한 그래프이다.

도 3은 본 발명의 다당의 아질산염 (Nitrite) 생산 촉진 효과를 도시한 그래프이다.

도 4는 본 발명의 다당의 TNF-α생산 촉진 효과를 도시한 그래프이다.

도 5는 본 발명의 다당의 아질산염 (Nitrite) 생산 촉진 효과를 도시한 그래프이다.

도 6은 본 발명의 다당의 보습 효과를 도시한 그래프이다.

본 발명을 수행하기 위한 최선의 양태

본 발명의 다당은 구성 성분으로서, 갈락토스, 글루코스, 람노스 및 피루브산을 함유하고, 이때, 갈락토스, 글루코스 및 람노스는 4:2:1의 몰 비로 포함되며, 피루브산은 4 내지 7중량%로 포함된다. 그리고, 당해 다당은 이하의 화학식 I의 반복 구조를 포함하고 있다.

화학식 I

이러한 구조를 갖는 다당은 인간의 장내에서 분리된 비피도박테리움 롱검 JBL05 균주 (NITE BP-82)로부터 생산된다.

본 발명에 사용하는 미생물로서 비피도박테리움 롱검 JBL05 균주 (NITE BP-82)가 예시되지만, 이 미생물 이외의 미생물도 사용할 수 있다. 예를 들면, 장내 세균을 분리하여, 미생물의 주위에 협막상의 다당을 생산하는 균주를 선택하여, 다당을 분석함으로써 수득된다. 이러한 스크리닝 방법으로 수득된 비피도박테리움 롱검 JBL05 균주 (NITE BP-82)의 세균학적 성질은 이하의 표 1과 같다.

[표 1]

A. 형태적 성상

(1) 형상 0.6 내지 0.8 X 1.0 내지 4.0㎛, 곤봉상, Y자상, 완곡상 그램 양성 바실러스 (Bacillus)

(2) 운동성 -

(3) 포자 -

B. 배양 성상^*1

(1) 형상 정원, 표면 및 주변 모두 매끄러움

(2) 크기 직경 0.5 내지 2.5mm

(3) 융기 반구상의 융기

(4) 색조 황갈색 또는 유백색

(5) 특징 약간 점성

*1 BL 한천 배지 (닛스이세야쿠가부시키가이샤)에 도포후, 37℃의 아네로팩 (이츠비시가스가가쿠가부 시키가이샤)을 포함하는 밀폐 용기 내에서 혐기 조 건하에서 48시간 배양한 후의 콜로니 성상

C. 생리학적 성질

(1) 질산염 환원 -

(2) 인돌 생성 -

(3) 카탈라제 -

(4) 최적 생육 온도 37℃

(5) 최적 pH pH 6.5 내지 7.0

(6) 혐기도 편성 혐기성

(7) 가스 생산 -

(8)당동화성

아라비노스 +

자일로스 +

리보스 +

글루코스 +

갈락토스 +

만노스 +

프럭토스 +

사카로스 +

말토스 +

셀로비노스 -

락토스 +

트레할로스 -

멜리비오스 +

라피노스 +

멜레지토스 +

전분 ±

글리세린 -

만니톨 -

솔비톨 -

이노시톨 -

(+: 양성, -:음성, ±:약양성)

이러한 표현형에 의한 분류학적 성질에 기초하여, 문헌 [Bergey's manual of Systematic Bacteriology Vol.2(1984)]에 의해 JBL05 균주는 비피도박테리움 롱검인 것으로 나타났다. 당해 신규한 미생물은 2005년 3월 3일(원기탁일)에 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터 (NPMD) (주소: 우편 292-0818 일본 치바켄 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8)에 비피도박테리움 롱검 JBLO5 균주 (NITE BP-82)로서 기탁되어 있다.

본 발명의 다당은 비피도박테리움 롱검 JBL05 균주 (NITE BP-82)를 적절한 배지에서 배양함으로써 수득된다. 배지로서, 비피도박테리움 속의 미생물이 이용할 수 있는 탄소원 및 질소원 및 필요에 따라, 시스테인염산염, 아스코르브산나트륨, 미량의 무기염 등을 포함하는 배지가 사용된다. 특히, 다량의 다당 생산을 위해 탈지유 또는 젖 성분을 포함하는 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우, 탈지유를 프로테아제 등의 효소로 분해한 효소 분해 탈지유에, 컬티베이터 [참조: 야이즈스이산가가쿠고교 가부시키가이샤 제조], 락토스, 아스코르브산나트륨 등을 첨가한 배지를 바람직하게 사용할 수 있다.

상기 배지를 사용하여, 비피도박테리움 롱검 JBL05 균주 (NITE BP-82)를, 배양 온도 20 내지 40℃에서 혐기 조건하에서 교반 또는 정치하여 16 내지 60시간 동안 pH를 4 내지 7, 바람직하게는 5 내지 6으로 조정하면서 배양을 실시하면 배양액 중에 점성 물질이 생산된다.

수득된 배양액으로부터의 다당의 회수에는 가열, 효소 처리, 원심 및 여과 등의 당업자가 통상적으로 배양액으로부터 목적 물질을 회수하는 방법이 사용된다. 예를 들면, 점성 물질(다당) 및 미생물 균체를 포함하는 배양액을 원심하여, 균체 를 제거한다. 배양액의 점도가 높은 경우는, 예를 들면, 물로 희석한 후 원심함으로써 균체를 제거할 수 있다. 이어서, 수득된 상청에 적절한 유기용매를 가하여 단백질을 석출시키고, 예를 들면 원심분리에 의해서 침전을 제거하고, 추가로 유기용매를 첨가하여 다당을 침전시키고, 그리고 원심분리 등에 의해 다당을 회수한다. 상세하게는, 균체를 제거한 상청에, 최종 농도가 20용적%가 되도록 에탄올을 첨가하고, 원심분리를 실시하여 단백질을 포함하는 침전물을 제거하고, 또한 최종 농도가 50용적%가 되도록 에탄올을 첨가하고, 원심분리를 실시하여 침전물을 회수함으로써, 조정제 다당이 수득된다.

또는, 유기 용제와 양이온을 배합하여 다당을 회수하는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 1가의 양이온과 유기 용매를 사용하는 회수 방법, 2가의 양이온과 유기 용매를 사용하는 회수 방법 [참조: 일본 공개특허공보 제(소)58-5301호], 3가의 양이온과 유기 용매를 사용하는 회수 방법 [일본 공개특허공보 제(소)59-196099호] 등과 동일한 방법을 사용할 수도 있다. 양이온은 다당의 회수율을 높이기 위해 사용되는 것이 바람직하다. 1가 양이온으로서, 나트륨 이온 및 칼륨 이온 등이 사용된다. 2가 양이온으로서, 마그네슘 이온 및 칼슘 이온 등이 사용된다. 3가 양이온으로서, 알루미늄 이온 등이 사용된다. 이러한 양이온을 에탄올 등의 유기 용매와 함께 다당을 포함하는 점성 용액에 첨가함으로써, 보다 많은 다당을 회수할 수 있다. 2가 또는 3가의 양이온을 사용하는 것이 1가의 양이온을 사용한 경우보다 다당의 회수율을 높일 수 있다.

수득된 조정제 다당으로부터의 다당의 정제는, 당업자가 통상 실시하는 방 법, 예를 들면, 이온 교환 수지를 사용하는 분획 및 겔 여과에 의한 분획 등을 단독 또는 병용하여 이루어진다. 이온 교환 수지를 사용하는 방법에 특별히 제한은 없으며, 예를 들면, 음이온 교환 수지 (예를 들면, DEAE 세파덱스 (Sephadex) A-50 [제조원: 파마시아사] 등)에 다당을 흡착시켜, 염화나트륨의 농도구배를 가하여 다당을 용출시키고, 이어서, 토요펄 (TOYOPEARL) HW65S [제조원: 토소 가부시키가이샤] 등을 사용하여 겔 여과하는 방법 등을 들 수 있다. 겔 여과에 의한 정제에서는, 분자량도 측정할 수 있다.

다당의 구조는 이하와 같은 방법으로 결정된다. 우선, 정제한 다당을, 예를 들면, 포름산, 묽은 염산 또는 트리플루오로아세트산 등으로 산가수분해하고, 이러한 가수분해물을 HPLC로 분석함으로써, 다당을 구성하는 당 (단당)이 결정된다. 이어서, 당해 산가수분해물을 통상적인 방법에 의해 아세틸화하여, 기체 크로마토그래피로 분석 (GC 분석)함으로써, 구성 당의 조성 (구성 당의 비율)이 측정된다. 또한, 산가수분해물을 통상적인 방법에 의해 메틸화하여 GC-MS (질량) 등으로 분석함으로써, 다당의 결합 양식이 결정된다. 또한, NMR 분석에 의해, 각 단당끼리의 결합 상태가 밝혀지고 아세틸기의 존재도 검출된다. 다당에 결합하고 있는 피루브산은 NADH의 존재하에서 락트산 데하이드로게나제에 의한 피루브산의 락트산으로의 환원을 측정함으로써, 정성적이고 정량적으로 측정할 수 있다.

비피도박테리움 롱검 JBL05 균주 (NITE BP-82)가 생산하는 다당은 이하의 특징을 갖는다.

(1) 다당의 구성 성분으로서, 갈락토스, 글루코스, 람노스 및 피루브산을 함 유하며, 이때, 갈락토스, 글루코스 및 람노스를 4:2:1의 몰 비로 포함한다.

(2) 다당중의 피루브산 함유율은, 4 내지 7중량%이다.

(3) 토요펄 HW65S를 이용하는 겔 여과로 측정된 분자량은 약 20만 내지 250만이다.

(4) 비선광도는 약 +130°이다.

(5) 아세틸기를 함유한다.

(6) 다당은 이하의 화학식 I의 반복 구조를 포함한다.

화학식 I

또한, 본 발명의 다당의 분자량은 배양 조건 및 회수 및 정제 조건에 의해 변화된다. 배양 조건 등에 의해 분자량을 조정하는 것도 가능하다.

수득된 다당은 우수한 면역 부활 활성 및 보습능을 갖기 때문에, 식품 조성물, 의약품 조성물 및 화장품 조성물 등의 조성물로서 사용할 수 있다. 의약품 조성물로서, 본 발명의 다당을 함유하는 의약 부외품 조성물, 첩부제, 상처 보호제 및 구급반창고 등의 위생 재료도 포함된다.

또한, 본 발명의 비피도박테리움 롱검 JBL05 균주 (NITE BP-82) 및 당해 미생물을 포함하는 배양액 자체도 제형화하여 사용할 수 있다. 당해 제형이 장내에 전달되면, 미생물이 본 발명의 다당을 생산하기 때문에 당해 제형은 면역 부활제 등의 의약품 또는 면역 부활 활성을 갖는 식품 등으로서 이용된다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 제한되지는 않는다.

(실시예 1: 미생물의 분리)

(배지의 제조)

비피더스균을 분리하는 배지로서, BL 한천 배지 [참조: 닛스이세야쿠 가부시키가이샤 제조] 및 BS 한천 배지를 사용하였다. BL 한천 배지를 오토클레이브로 115℃에서 20분간 멸균하고, 5% 말 혈액을 무균적으로 첨가한 후, 페트리 디쉬에 분주하여 평판으로서 사용하였다. BS 한천 배지는 이하와 같이 제조하였다. 우선, 프로피온산나트륨 30g, 황산팔로모마이신 100mg, 황산네오마이신 400mg 및 염화리튬 6g을 정제수에 용해시키고 총량을 100ml로 하여 BS 한천 배지용 첨가액을 제조하였다. 당해 BS 한천 배지용 첨가액 50ml을 BL 한천 배지 1000ml에 가하여, BS 한천 배지를 수득하였다. 당해 BS 한천 배지는, 페트리 디쉬에 분주하여 평판으로서 사용하였다.

(미생물의 스크리닝)

인간 분변을 멸균수에 용해시켜 상기 BL 한천 배지 및 BS 한천 배지에 넣고, 37℃에서 48시간 동안 혐기적으로 배양하였다. 평판상에서 증식한 세균의 콜로니 성상 및 그램 염색 표본의 세균 형태를 관찰하여, 비피더스균이라고 생각되는 콜로니를 2개의 BL 한천 배지에 각각 분리하였다. 하나를 37℃에서 48시간 동안 혐기적으로 배양하고, 나머지 하나를 37℃에서 48시간 동안 호기적으로 배양하였다. 혐기적으로 증식한 콜로니 중, 점성 물질을 생산하는 콜로니 (미생물들)를 분리하였다. 수득된 미생물의 생리학적 및 형태학적 특징은 상기와 같으며, 비피도박테리움 롱검 JBL05 균주 (NITE BP-82)인 것으로 동정되었다.

(실시예 2: 다당의 구조 해석)

(배지의 제조)

9중량%의 탈지유 용액에 판크레아틴 [제조원: 아마노엔자임 가부시키가이샤] 및 실리콘을 각각 최종 농도가 0.36중량% 및 0.01중량%가 되도록 가하였다. 이어서, 10N NaOH로 용액의 pH를 8로 조정하고, 55℃에서 4시간 동안 반응시켜, 효소 분해 탈지유를 수득하였다. 여기에, 컬티베이터 [제조원: 야이즈스이산가가쿠고교 가부시키가이샤], 락토스 및 아스코르브산나트륨을 각각 최종 농도로 3.0중량%, 2.5중량%, 및 0.2중량%가 되도록 첨가하고, 121℃에서 15분 동안 오토클레이브에서 멸균하여, 액체 배지로 사용하였다.

(다당의 정제)

상기에서 제조한 액체 배지를 사용하여 전배양한 비피도박테리움 롱검 JBL05 균주 (NITE BP-82)를 1%(v/v)가 되도록 동일한 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 40시간 동안 정치 혐기 배양을 실시하여, 점성 물질을 생산시켰다. 배양액을 원심분리하여, 균체를 제거한 후, 에탄올을 최종 농도 20%가 되도록 상청액에 첨가하고, 4℃에서 정치 보존하였다. 밤새 정치후, 원심에 의해 단백질을 포함하는 침전물을 제거하고, 에탄올을 최종 농도 50%가 되도록 상청액에 첨가하고, 4℃에서 정치 보존하였다. 밤새 정치후, 원심에 의해 침전물을 회수하여, 조정제 다당 분획을 수득하고 동결 건조시켜 보존하였다.

당해 조정제 다당 분획을 DEAE 세파덱스 A-50 충전 컬럼을 사용하여 추가로 분획하여, 0.07 내지 0.5M의 NaCl로 용출된 분획을 정제 다당 분획으로 하였다.

(분자량의 측정)

토요펄 HW65S 충전 컬럼을 사용하여, 당해 정제 다당 분획을 겔 여과를 실시한 결과, 다당의 분자량은 약 80만이었다. 또한, 당해 분자량은 배양 조건, 회수 조건 및 정제 조건에 의해 변화되며, 수회의 반복 실험으로, 약 20 내지 250만 사이의 분자량을 갖는 다당이 수득되었다. 이로부터, 배양 조건, 회수 조건 및 정제 조건 등에 의해 분자량을 조정하는 것도 가능하다고 생각된다.

(비선광도의 측정)

일본 분광 DIP-360형 디지털 선광계를 사용하여 측정한 당해 다당의 비선광도는 약 +130°이었다.

(성분 분석)

다음에, 수득된 다당에 포름산을 가하여 가수분해하였다. 이러한 가수분해액을 감압하에서 건조시킨 후, 추가로 트리플루오로아세트산을 첨가하여 가수분해하고, 가수분해 생성물을 수득하였다. ION-300 컬럼 [제조원: 도쿄카세고교 가부시키가이샤]을 사용한 HPLC 분석에 의해, 당해 다당이 갈락토스, 글루코스, 람노스 및 피루브산으로 구성되는 것을 알 수 있었다.

당해 가수분해 생성물을 통상적인 방법에 의해 수소화붕소나트륨으로 환원시키고, 무수 아세트산과 피리딘을 첨가하여 아세틸화한 것을 R-225 컬럼 [제조원: J & W Scientific]을 사용하여 GC 분석하였다. 그 결과, 이러한 다당을 구성하는 갈락토스, 글루코스 및 람노스의 몰 비가 4:2:1인 것을 알 수 있었다.

NADH의 존재하에서, 상기 가수분해 생성물에 락트산 데하이드로게나제를 첨가한 결과 락트산이 생성되었다. 따라서, 당해 다당 분획에 피루브산이 존재하는 것이 확인되었다. 또한, 다당중의 피루브산 함유율은 4 내지 7중량%이었다.

(구조 해석)

다당의 결합 양식을 밝히기 위해서, 메틸화하여 분석을 실시하였다. 상기 가수분해 생성물을 통상적인 방법에 의해 메틸화하였다. 각 메틸화 단당을 GC-MS(질량) 분석에 의해 해석하였다. 그 결과, 1,5-디-O-아세틸-2,3,4,6-테트라-O-메틸-글루시톨, 1,5-디-O-아세틸-2,3,4,6-테트라-O-메틸-갈락티톨, 1,3,4,5-테트라 -O-아세틸-2,6-디-O-메틸-람니톨, 1,3,5-트리-O-아세틸-2,4,6-트리-O-메틸-갈락티톨, 1,4,5-트리-O-아세틸-2,3,6-트리-O-메틸-글루시톨, 1,4,5-트리-O-아세틸-2,3,6-트리-O-메틸-갈락티톨 및 1,4,5,6-테트라-O-아세틸-2,3-디-0-메틸-갈락티톨의 메틸화된 당들이 수득되었다.

또한, NMR 분석에 의해 결합 상태를 검토하였다. 이러한 데이터로부터, 본 발명의 다당은 이하의 구조 I (반복 구조)을 갖는 것을 알 수 있었다.

화학식 I

또한, NMR 해석에 의해 아세틸기가 검출되었다.

(실시예 3: 다당의 배양 생산)

실시예 2에서 제조한 효소 분해 탈지유에 아스코르브산나트륨을 최종 농도가 0.2중량%이 되도록 첨가하고, 121℃에서 15분간 오토클레이브에서 멸균하고, 액체 배지를 제조하였다. 이것과 동일한 액체 배지에서 전배양한 비피도박테리움 롱검 JBL05 균주 (NITE BP-82)의 배양액을 1%(v/v)이 되도록 상기 제조한 액체 배지에 접종하고, 저속 교반하에서 pH 6.0으로 제어하면서, 37℃에서 40시간 동안 혐기적으로 배양을 실시하였다. pH의 제어하기 위해, 10N NaOH를 사용하였다. 또한, 정 치 혐기 배양을 실시한 경우를 비교예로 하였다.

도 1에 배양 시간과 배양액의 점도의 관계를 도시한다. 정치 혐기 배양을 실시한 경우와 비교하면, pH를 조정하면서 배양한 경우, 점도는 20시간 이후부터 급격히 증가하여, 본 발명의 다당이 효율적으로 생산되었다. 또한, 점도는 TVB-10형 점도계 [제조원: 토기산교 가부시키가이샤] 및 회전계 THM1를 사용하여, 15℃에서 회전수 50rpm으로 측정하였을 때의 값이다.

(실시예 4: 조정제 다당 분획의 면역 부활 마크로파지 활성화 작용)

실시예 2에서 제조한 조정제 다당 분획의 면역 부활 작용을 이하와 같이 하여 측정하였다. 12주령의 ddY계 수컷 마우스 [제조원: 키와실험동물연구소]의 복강내에 4%(w/v) TGC 배지 [제조원: 닛스이세야쿠 가부시키가이샤]를 2ml 주입하고, 4일후, 12ml의 냉 PBS를 사용하여 복강내를 세정하고, 세정액을 회수하였다. 당해 액을 4℃에서 10000rpm으로 10분간 원심하여, 상청을 제거하여 복강 삼출 세포를 수득하였다. 상기 세포를 10% FCS[참조: 인비트로겐 가부시키가이샤 제조], 페니실린 G 및 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640 배지[참조: SIGMA-ALDRICH 제조]에 현탁하여, 96웰 플레이트에 5×10⁵세포/웰이 되도록 분취하고, 5% CO₂의 존재하에서 37℃에서 배양하였다. 배양 개시 1시간 후, 배지를 제거하고, 이어서, 실시예 2에서 수득된 조정제 다당 분획을 각각 0㎍/ml, 3㎍/ml, 10㎍/ml, 30㎍/ml 및 100㎍/ml 포함하는 RPMI1640 배지 200㎕에 첨가하고, 5% CO₂의 존재하에서, 37℃에서 4시 간 또는 20시간 동안 배양하였다. 4시간 배양 후의 배양 상청액은 마크로파지 활성화의 지표로서 하기한 TNF-α의 농도 측정에 사용하며, 20시간 배양후의 배양 상청액은 하기의 아질산염(Nitrite)의 농도 측정에 사용하였다.

TNF-α농도의 측정은 TNF-α감수성 마우스 섬유아세포 (L929 세포, 제조원: 다이닛폰세야쿠 가부시키가이샤)를 사용하여 다음과 같이 실시하였다. 96웰 플레이트의 각 웰에 L929 세포를 4.0×10⁴세포/웰이 되도록 분취하여, 5% CO₂의 존재하에서 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고, 이어서 1.5㎍/ml 악티노마이신 D를 포함하는 RPMI1640 배지 50㎕를 각 웰에 첨가하고, 또한 상기 4시간 배양 후의 배양 상청액을 100㎕씩 가하였다. 또한, TNF-α표준으로서, 이러한 배양 상청액을 대신하여, RPMI1640 배지에 TNF-α[제조원: SIGMA-ALDRICH]를 다양한 농도로 용해시킨 용액을 100㎕/웰의 비율로 첨가하였다. 이어서, 5% CO₂의 존재하에서 37℃에서 20시간 동안 배양하고, 추가로, 최종 농도가 0.5mg/ml가 되도록 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H 테트라졸륨 브로마이드[제조원: 와코쥰야쿠고교 가부시키가이샤]를 첨가하여, 5% CO₂의 존재하에서 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 0.04N 염산을 포함하는 이소프로판올을 100㎕ 첨가하고, 약 10분 동안 진탕시키면서 포르마잔을 용해시킨 후, 562nm(참조 파장 660nm)에서 흡광도를 측정하였다. TNF-α표준으로부터 수득된 검량선을 사용하여 TNF-α농도를 산출하였다. 유의차 검정은 듀넷 (Dunnett's) 다중 비교 검정을 사용하며, 유의 수준을 p<0.05 및 p<0.01로서 실시하였다. 결과를 도 2에 도시한다.

아질산염 농도의 측정은 상기 20시간 배양 후의 배양 상청액을 96웰 플레이트에 50㎕씩 넣고, 여기에 그리스 (Griess) 시약을 50㎕씩 첨가하여, 실온의 암실에서 10분간 반응시킨 후, 562nm(참조 파장 660nm)에서 흡광도를 측정함으로써 실시하였다. 또한, 검량선은 배양 상청을 대신하여 RPMI1640 배지에 아질산나트륨 [제조원: 와코쥰야쿠고교 가부시키가이샤]을 다양한 농도로 용해시킨 용액을 사용한 것 이외는, 상기와 동일하게 조작하여 흡광도를 측정함으로써 작성하였다. 이러한 검량선을 사용하여 아질산염의 농도를 산출하였다. 유의차 검정은 듀넷 다중 비교 검정을 사용하여 유의 수준을 p<0.01로 하여 실시하였다. 결과를 도 3에 도시한다.

도 2 및 도 3에 도시한 바와 같이, 실시예 2에서 수득된 조정제 다당 분획에 관해서 마크로파지의 활성화 작용이 확인되었다.

(실시예 5: 정제 다당 분획의 면역 부활 마크로파지 활성화 작용)

동결 건조 조정제 다당 분획 대신에, 실시예 2의 컬럼으로 정제한 정제 다당 분획의 동결 건조물을 사용한 것 이외에는, 실시예 4와 동일하게, TNF-α농도 및 아질산염 농도를 측정하였다. 그 결과, 당해 정제 다당 분획에서도 마크로파지의 활성화 작용이 확인되었다. 결과를 도 4 및 5에 도시한다.

(실시예 6: 다당의 보습 작용)

실시예 2에서 제조한 동결 건조 조정제 다당 분획을 1mg/ml의 농도로 제조하고, 이의 보습 능력을 20대 여성 10명의 상완 내측의 수분 증산량 변화에 의해 확인하였다. 피험 부위에 2cm 간격으로 2×2cm 크기의 표시를 하고, 샘플 도포전의 수분 증산량(TEWL)을 측정하였다. 상기 조정제 다당 분획 및 대조군으로서의 증류수를 각 20㎕씩 유리막대로 펼쳐 도포하고, 45, 90, 150, 210분 후의 TEWL을 측정하였다. 측정에는 수분증산량 측정장치(모바일 테바미터 MSC100)를 사용하였다. 210분 후의 각각의 수분 증산량을 도 6에 도시한다. 조정제 다당 분획의 수분 증산량은 증류수에 비해 적어 보습 효과가 확인되었다.

본 발명의 다당은 보습 작용 및 면역 부활 작용을 갖는 신규 다당이다. 당해 다당은 인간의 장내에 서식하는 미생물로부터 분리된 비피도박테리움 롱검으로부터 생산되고, 식품 조성물, 화장품 조성물 및 의약품 조성물 등의 원료로서 산업상 유용하다.

Claims

구성 성분으로서 갈락토스, 글루코스, 람노스 및 피루브산을 함유하는 다당으로서, 당해 갈락토스, 글루코스 및 람노스를 4:2:1의 몰 비로 포함하며, 4 내지 7중량%의 피루브산을 포함하는 다당.
제1항에 있어서, 화학식 I의 구조를 포함하는 다당.

화학식 I
다당을 생산하는 능력을 갖는 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속에 속하는 미생물을 배양하는 공정 및 당해 미생물에 의해 생산된 다당을 회수하는 공정을 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따르는 다당의 제조 방법.
제3항에 있어서, 미생물이 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) JBL05 균주 (NITE BP-82)인 방법.
비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) JBLO5 균주 (NITE BP-82).
제1항 또는 제2항에 따르는 다당을 함유하는 조성물.
제6항에 있어서, 식품 조성물, 화장품 조성물 또는 의약품 조성물인 조성물.
제7항에 있어서, 식품 조성물 또는 의약품 조성물이 면역 부활제인 조성물.
제7항에 있어서, 화장품 조성물이 보습제인 조성물.
비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) JBL05 균주 (NITE BP-82)를 포함하는 제형.