WO2011118552A1 - 抗アレルギー剤 - Google Patents

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WO2011118552A1
WO2011118552A1 PCT/JP2011/056733 JP2011056733W WO2011118552A1 WO 2011118552 A1 WO2011118552 A1 WO 2011118552A1 JP 2011056733 W JP2011056733 W JP 2011056733W WO 2011118552 A1 WO2011118552 A1 WO 2011118552A1
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polysaccharide
bifidobacteria
antiallergic agent
producing
agent according
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PCT/JP2011/056733
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麻実子 河野
進一 北村
愛子 庄條
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森下仁丹株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to an antiallergic agent.
  • Bifidobacterium A microorganism belonging to the genus Bifidobacterium (hereinafter also referred to as “Bifidobacterium”) is one of the dominant bacteria in the intestine, and a large number of intestinal regulating and immunomodulating effects have been reported.
  • Patent Documents 1 and 2 Some bifidobacteria have been reported to produce polysaccharides outside the cells, many of which have been reported on the characteristic components and structures of polysaccharides. There are reports on immunostimulants regarding the function of polysaccharides produced by bifidobacteria (Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Document 3 describes an anti-inflammatory agent containing a polysaccharide obtained from a culture solution of Lactobacillus microorganisms as an active ingredient, and Patent Document 4 effectively uses a polysaccharide produced by Lactobacillus fermentum. Immunomodulating agents including anti-inflammatory action, anti-allergic action, and tumor growth-suppressing action as components are described.
  • Patent Document 5 describes an allergy-suppressing composition containing a polysaccharide levan produced by Bacillus natto as an active ingredient.
  • Natto bacteria are not microorganisms that exist as intestinal resident bacteria, and bifidobacteria are overwhelmingly superior to lactic acid bacteria in a healthy intestine. Among the bifidobacteria that are the intestinal dominant bacteria, there are no reports on the antiallergic action of bifidobacteria that produce polysaccharides outside the cells.
  • An object of the present invention is to provide an antiallergic agent that is free from side effects.
  • the present invention provides an antiallergic agent comprising a polysaccharide containing galactose, glucose, and rhamnose as constituent components.
  • the polysaccharide comprises galactose, glucose, and rhamnose in a molar ratio of 3-5: 1 to 3: 1.
  • the polysaccharide comprises the following structure:
  • the polysaccharide is a polysaccharide obtained from a microorganism belonging to the genus Bifidobacterium.
  • the microorganism belonging to the genus Bifidobacterium is Bifidobacterium longum.
  • the Bifidobacterium longum is Bifidobacterium longum JBL05 strain (NITE BP-82).
  • the present invention also provides an antiallergic agent comprising a microorganism belonging to the genus Bifidobacterium and producing the above polysaccharide outside the cell.
  • the exopolysaccharide-producing bifidobacteria is Bifidobacterium longum JBL05 strain (NITE BP-82).
  • the present invention also provides an oral composition containing the antiallergic agent.
  • This antiallergic agent is an antiallergic agent containing the bifidobacteria-producing polysaccharide or an antiallergic agent containing the exopolysaccharide-producing bifidobacteria.
  • the present invention also provides an external preparation composition containing the antiallergic agent.
  • This antiallergic agent is an antiallergic agent containing the above Bifidobacterium-produced polysaccharide.
  • the oral composition or the external preparation composition is for suppressing atopic dermatitis or contact dermatitis.
  • an antiallergic agent exhibiting an excellent allergy suppressing effect without causing side effects.
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • A Bifidobacterium-produced polysaccharides on spleen cells
  • B production of interleukin-4
  • C production ratio
  • C a time-dependent change after the sensitization start of the ear skin thickness average value of the mouse
  • mouth which orally administered the bifidobacterium production polysaccharide.
  • mouth which orally administered the bifidobacterium production polysaccharide is shown. It is a graph which shows a time-dependent change after the sensitization start of the auricle skin thickness average value of the mouse
  • mouth which orally administered the exopolysaccharide production bifidobacteria is shown. It is a graph which shows a time-dependent change after the sensitization start of the ear skin thickness average value of the mouse
  • a polysaccharide containing galactose, glucose, and rhamnose as constituent components is used.
  • Galp represents galactopyranose
  • Glcp represents glucopyranose
  • Rhap represents rhamnopyranose, which means that galactose, glucose, and rhamnose have a pyranose structure.
  • the polysaccharide may further contain pyruvic acid, and the content of pyruvic acid in the polysaccharide may be 10% by mass or less. Identification of the constituent components of the polysaccharide, measurement of the content or content of the constituent components in the polysaccharide, and structural analysis of the polysaccharide are described in detail below.
  • the polysaccharide having such a structure is a microorganism belonging to the genus Bifidobacterium, in particular, Bifidobacterium longum, for example, Bifidobacterium longum JBL05 strain (NITE BP-isolated from the human intestine) 82). Therefore, in this specification, for convenience, this polysaccharide is also referred to as “bifidobacteria-producing polysaccharide”, but this expression does not limit microorganisms that produce the polysaccharide.
  • microorganisms belonging to the genus Bifidobacterium and producing the above polysaccharide outside the cells are also used. “Producing a polysaccharide outside a cell” means that a microorganism produces a capsular polysaccharide around it. In the present specification, this microorganism is also referred to as “extrapolysaccharide-producing bifidobacteria” for convenience.
  • Bifidobacterium longum JBL05 strain (NITE BP-82) is exemplified as a microorganism used for the preparation of a bifidobacteria-producing polysaccharide or as an exopolysaccharide-producing bifidobacteria.
  • the bacteriological properties of Bifidobacterium longum JBL05 strain (NITE BP-82) are shown in Table 1 below.
  • the JBL05 strain is Bifidobacterium longum according to Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol.2 (1984) Identified. And on March 3, 2005 (original deposit date), the National Institute of Technology and Evaluation Microorganisms (NPMD) (address: 2-5 Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818, Japan) 8) was deposited as NITE BP-82.
  • NPMD National Institute of Technology and Evaluation Microorganisms
  • Bifidobacterium longum JBL05 strain (NITE BP-82) can be cultured in an appropriate medium. Although the procedure of culture
  • the medium examples include a medium containing a carbon source and a nitrogen source that can be used by microorganisms belonging to the genus Bifidobacterium, and, if necessary, cysteine hydrochloride, sodium ascorbate, a trace amount of inorganic salt, and the like.
  • a skim milk or a medium containing milk components is preferable.
  • a medium in which skim milk is digested with an enzyme such as protease, and a cultivator (Yaizu Suisan Kagaku Kogyo Co., Ltd.), lactose, sodium ascorbate and the like, which are fish meat extracts, is preferably used.
  • Bifidobacterium longum JBL05 strain (NITE BP-82) is stirred or allowed to stand under anaerobic conditions at a culture temperature of 20 to 45 ° C. to a pH of 4 to 7, preferably 5
  • a viscous substance polysaccharide
  • methods for recovering the polysaccharide from the obtained culture broth are usually used by those skilled in the art, such as heating, enzyme treatment, centrifugation, filtration, membrane treatment, and filtration.
  • a culture solution containing a viscous substance (polysaccharide) and microbial cells is centrifuged to remove the cells.
  • the cells can be removed by, for example, diluting with water and then centrifuging.
  • an appropriate organic solvent is added to the obtained supernatant to precipitate the protein, and the precipitate is removed by, for example, centrifugation.
  • the organic solvent is added to the obtained supernatant to precipitate the polysaccharide, for example, to be centrifuged.
  • the organic solvent is added to the obtained supernatant to precipitate the polysaccharide, for example, to be centrifuged.
  • ethanol is added to the supernatant from which the bacterial cells have been removed so that the final concentration is 20% by volume, and centrifugation is performed to remove protein-containing precipitates.
  • Ethanol is added so that the concentration becomes 50% by volume, centrifugation is performed, and the precipitate is collected to obtain a crude purified polysaccharide.
  • a method of recovering a polysaccharide by combining an organic solvent and a cation may be used.
  • a recovery method using a monovalent cation and an organic solvent a recovery method using a divalent cation and an organic solvent (Japanese Patent Laid-Open No. 58-5301), and a recovery method using a trivalent cation and an organic solvent.
  • a method similar to that described in JP-A-59-196099 can also be used.
  • Cations are preferably used from the viewpoint of increasing the recovery rate of polysaccharides.
  • monovalent cations include sodium ions and potassium ions.
  • the divalent cation include magnesium ion and calcium ion.
  • Examples of the trivalent cation include aluminum ions. By adding these cations together with an organic solvent such as ethanol to a viscous solution containing polysaccharides, more polysaccharide can be recovered.
  • the use of a divalent or trivalent cation can increase the polysaccharide recovery rate compared to the case of using a monovalent cation.
  • Purification of the polysaccharide from the obtained crude purified polysaccharide is carried out by a method commonly used by those skilled in the art, for example, fractionation using an ion exchange resin, fractionation by gel filtration, or the like.
  • the method using an ion exchange resin is not particularly limited.
  • a polysaccharide is adsorbed on an anion exchange resin (for example, trade name DEAE Sephadex A-50 (Pharmacia), etc.), and the polysaccharide is eluted by applying a sodium chloride gradient.
  • anion exchange resin for example, trade name DEAE Sephadex A-50 (Pharmacia), etc.
  • Examples of the method by gel filtration include a method using a trade name TOYOPEARL HW65S (Tosoh Corporation).
  • the structure of the polysaccharide is determined by the following method.
  • the purified polysaccharide is acid hydrolyzed with, for example, formic acid, dilute hydrochloric acid, trifluoroacetic acid, etc., and the hydrolyzate is analyzed by HPLC to determine the sugar (monosaccharide) constituting the polysaccharide.
  • this acid hydrolyzate is acetylated by a conventional method and analyzed by gas chromatography (GC analysis), whereby the constituent sugar composition (constituent sugar ratio) is determined.
  • GC analysis gas chromatography
  • the purified polysaccharide is methylated by a conventional method and then acid hydrolyzed, and the product obtained by reducing and hydrolyzing the hydrolyzate is analyzed by GC-MS (gas chromatography / mass spectrometry) or the like.
  • the binding mode of the polysaccharide is determined.
  • NMR analysis reveals the binding state of each monosaccharide. Pyruvate bound to a polysaccharide can be measured qualitatively and quantitatively by measuring the reduction of pyruvate to lactic acid by lactate dehydrogenase in the presence of NADH.
  • Bifidobacterium longum strain JBL05 can produce a polysaccharide having the following characteristics: (1) Containing galactose, glucose, and rhamnose as a component of the polysaccharide. (2) The molar ratio of galactose, glucose and rhamnose is 3-5: 1-3: 1. (3) Pyruvic acid may be contained in the polysaccharide, and the content in that case may be 10% by mass or less. (4) The molecular weight is about 50,000 to 10 million, preferably about 200,000 to 2.5 million (gel permeation chromatography / multi-angle laser light scattering detection (GPC-MALLS) method). (5) The polysaccharide may contain a repeating structure represented by the following formula (I) when, for example, the molar ratio of galactose, glucose, and rhamnose is 4: 2: 1.
  • formula (I) when, for example, the molar ratio of galactose, glucose, and rhamnose is 4: 2:
  • the polysaccharide having the above characteristics can be contained in a purified polysaccharide fraction obtained according to the procedure described in Example 1 below.
  • the molecular weight of the polysaccharide varies depending on the culture conditions and recovery / purification conditions. It is also possible to adjust the molecular weight depending on the culture conditions.
  • Polysaccharides having such a structure can be produced from Bifidobacterium longum JBL05 strain (NITE BP-82) isolated from the human intestine, but other than this microorganism for the preparation of such polysaccharides.
  • Other microorganisms may be used.
  • Such microorganisms can be determined, for example, by isolating intestinal bacteria and analyzing the polysaccharides of strains that have been found to produce capsular polysaccharides around the bacteria; It can be performed according to the above.
  • Bifidobacterium longum JBL05 strain (NITE BP-82) is exemplified as an extracellular polysaccharide-producing bifidobacteria, but other bifidobacteria that produce bifidobacteria-producing polysaccharide outside the cell are also used in the present invention. Can be.
  • the exopolysaccharide-producing bifidobacteria used in the present invention only need to contain microbial cells obtained from the culture solution after completion of the culture for preparing the polysaccharide.
  • a bifidobacteria culture solution after completion of the culture can be used as it is, or a culture solution containing cells obtained by centrifugation, membrane treatment, filtration, or the like can be used.
  • Culture concentrates, dried products, crushed materials and the like can also be used. Examples of the drying method include vacuum drying, spray drying, freeze drying, and drum drying. A dispersing agent, a triturating agent, etc. may be included with the microbial cell.
  • It can be prepared as viable bacteria by a commonly used technique.
  • killed bacteria obtained by subjecting the obtained culture solution, concentrate, dried product and the like obtained to sterilization treatment such as heat sterilization and radiation sterilization, and crushing as necessary can also be used.
  • sterilization treatment such as heat sterilization and radiation sterilization, and crushing as necessary.
  • the technique used for the preparation of such bacterial cells follows the technique commonly used by those skilled in the art.
  • Antiallergic agent Bifidobacteria-producing polysaccharide and exopolysaccharide-producing Bifidobacteria exhibit antiallergic action. Antiallergic effects include, but are not limited to, Th1 / Th2 balance improvement, Th17 regulation action, inflammation inhibition action, IgE production inhibition action, chemical mediator release inhibition action such as histamine, lymphocyte activation action, etc. It is not a thing.
  • a bifidobacteria-producing polysaccharide or an extracellular polysaccharide-producing bifidobacteria can be used as an antiallergic agent, and an antiallergic agent comprising a bifidobacteria-producing polysaccharide or an extracellular polysaccharide-producing bifidobacteria is provided.
  • the bifidobacteria-producing polysaccharide or the exopolysaccharide-producing bifidobacteria can be contained in any composition as an antiallergic agent.
  • the effects of antiallergic agents include suppression of type I allergy, type IV allergy, atopic dermatitis, contact dermatitis, allergic dermatitis, hay fever, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, bronchial asthma, etc. However, it is not limited to these.
  • Such a composition is useful for the prevention or treatment of allergic symptoms.
  • atopic dermatitis or contact dermatitis can be suppressed.
  • Such a composition can be used for foods, pharmaceuticals and cosmetics.
  • the composition is not limited thereto, but can be prepared and used as, for example, powder, granule, tablet, capsule, paste, cream, jelly, or liquid. . If necessary, it can be used by mixing with inorganic substances and organic substances such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, solubilizing agents, suspending agents, and coating agents.
  • inorganic substances and organic substances such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, solubilizing agents, suspending agents, and coating agents.
  • methods well known to those skilled in the art for the production of foods, pharmaceuticals and cosmetics can be used.
  • the amount of the bifidobacteria-producing polysaccharide can be arbitrarily determined according to its purpose, use, form, dosage form, symptom, body weight, etc., but in the case of oral ingestion or administration, 1 mg to 10 g per day, more preferably It is preferably prepared so that 10 mg to 2 g can be ingested.
  • the compounding amount of the exopolysaccharide-producing bifidobacteria can also be arbitrarily determined according to the purpose, application, form, dosage form, symptom, body weight, etc., but the number of bifidobacteria is 10 6 to 10 12 per day. Preferably, it is determined so that 10 8 to 10 11 can be ingested.
  • composition containing the bifidobacteria-producing polysaccharide or the exopolysaccharide-producing bifidobacteria can be used as an oral composition.
  • an oral composition can be used as a food composition or a pharmaceutical composition for antiallergic effects by ingestion, and can be used as a pharmaceutical composition for oral administration, liquid food, sick food, infant food, nutritional function It can be added to foods and foods for specified health use.
  • composition containing the bifidobacteria-producing polysaccharide or the extracellular polysaccharide-producing bifidobacteria can also be blended in ordinary foods and drinks, for example, various drinks such as milk, soft drinks, jelly drinks, candy, gummi, chocolate, Examples include confectionery such as biscuits and crackers, and various foods such as rice, bread, udon, and dressings, but are not limited thereto.
  • milk or the like can be fermented using a composition containing viable bacteria of exopolysaccharide-producing bifidobacteria and ingested as yogurt or fermented milk.
  • the composition containing the bifidobacteria-producing polysaccharide can be used as an external preparation composition.
  • the external preparation composition can be used as a cosmetic composition or a pharmaceutical composition for antiallergic action by application or administration to the skin or mucous membrane.
  • cosmetics to which such a composition can be formulated include, but are not limited to, facial cleansers, lotions, cosmetic liquids, emulsions, sprays, pack sheets, creams, ointments, bathing agents, and the like. It is not a thing. Cosmetic compositions may also include those manufactured and sold as quasi drugs.
  • compositions for administration to the intranasal mucosa for example, nasal drops, sprays, etc.
  • compositions for administration to the ocular mucosa for example, eye drops, Eyewash, etc.
  • compositions for administration to the throat mucosa for example, mouthwash, mouthwash, spray, troche, etc.
  • Such pharmaceuticals also include hygiene materials such as patches, wound protectants, and emergency bandages.
  • Example 1 Cultivation of extracellular polysaccharide-producing bifidobacteria and preparation of bifidobacteria-producing polysaccharide
  • Example 2 Cultivation of extracellular polysaccharide-producing bifidobacteria and preparation of bifidobacteria-producing polysaccharide
  • Cultivation of Bifidobacterium longum strain JBL05 (NITE BP-82) and purification of the polysaccharide produced by the microorganism were in accordance with the description in Patent Document 1. More details are as follows.
  • Pancreatin (Amano Enzyme Co., Ltd.) and silicon were added to 9% by mass of skim milk solution so that final concentrations were 0.36% by mass and 0.01% by mass, respectively.
  • the pH of the solution was adjusted to 8 with 10N NaOH, and the enzyme was reacted at 55 ° C. for 4 hours to obtain enzymatically decomposed skim milk.
  • cultivator Yamazu Suisan Chemical Co., Ltd.
  • lactose, and sodium ascorbate were added at final concentrations of 3.0% by mass, 2.5% by mass, and 0.2% by mass, respectively. This was sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 15 minutes and used as a liquid medium.
  • Bifidobacterium longum JBL05 strain (NITE P BP-82) pre-cultured using the liquid medium prepared above was inoculated into 5 L of the same liquid medium so as to be 1% (v / v).
  • ethanol was added to the supernatant to a final concentration of 20%, and this was stored still at 4 ° C.
  • the precipitate containing the protein was removed by centrifugation, ethanol was added to the supernatant to a final concentration of 50%, and this was stored still at 4 ° C. After standing overnight, the precipitate was collected by centrifugation, and the resulting crude purified polysaccharide fraction was lyophilized and stored.
  • the crude purified polysaccharide fraction was further fractionated using a DEAE® Sephadex® A-50 packed column, and the fraction eluted with 0.07 M to 0.5 M NaCl was freeze-dried to obtain a purified polysaccharide fraction.
  • Example 2 Structural analysis of bifidobacteria polysaccharide
  • the purified polysaccharide fraction prepared in Example 1 was gel filtered using a TOYOPEARL HW65S packed column, and the molecular weight was examined by GPC-MALLS method.
  • the gel filtration fraction (polysaccharide) was methylated by a conventional method, hydrolyzed by adding formic acid, and the product obtained by acetylating this hydrolyzate after reduction was subjected to GC-MS measurement and analyzed.
  • 1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl-glucitol 1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl-glucitol
  • 1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O -Methyl-galactitol 1,3,4,5-tetra-O-acetyl-2,6-di-O-methyl-rhamnitol
  • Example 3 Th1 / Th2 balance improving action of bifidobacteria polysaccharide
  • the purified polysaccharide fraction prepared in Example 1 was dissolved in water and added to a final concentration of 20 ⁇ g / ml or 200 ⁇ g / ml.
  • Fetal bovine serum and antibiotics antioxidant-antifungal mixed solution, Nacalai Tesque
  • Spleen cells prepared from C3H / HeJ mice (8 weeks old, male, CLEA Japan) were cultured at 37 ° C. for 72 hours under 5% CO 2 .
  • the culture supernatant was collected, and the concentration of interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ), a Th1-type cytokine, and the concentration of interleukin-4 (IL-4), a Th2-type cytokine, were measured by ELISA (BIOSOURCE, Invitrogen).
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • IL-4 interleukin-4
  • FIGS. 1 (A) to (C) Results are shown in FIGS. 1 (A) to (C).
  • FIG. 1 (A) is a graph showing production of IFN- ⁇ by in vitro stimulation of a bifidobacteria-producing polysaccharide on spleen cells. The vertical axis represents IFN- ⁇ production (pg / ml), and the horizontal axis represents the test group.
  • FIG. 1 (B) is a graph showing IL-4 production by in vitro stimulation of Bifidobacterium-produced polysaccharides on spleen cells. The vertical axis represents IL-4 production (pg / ml), and the horizontal axis represents the test group.
  • FIG. 1 (A) is a graph showing production of IFN- ⁇ by in vitro stimulation of a bifidobacteria-producing polysaccharide on spleen cells. The vertical axis represents IFN- ⁇ production (pg / ml), and the horizontal
  • FIG. 1 (C) is a graph showing the production ratio of IFN- ⁇ and IL-4 by in vitro stimulation of a Bifidobacterium-produced polysaccharide with respect to spleen cells.
  • the vertical axis represents the ratio of IFN- ⁇ to IL-4 (IFN- ⁇ / IL-4), and the horizontal axis represents the test section.
  • polysaccharide fraction polysaccharide produced by Bifidobacterium
  • IFN- ⁇ production increased the IFN- ⁇ production and decreased the IL-4 production in a concentration-dependent manner compared to the control with the same amount of water. Admitted.
  • Example 4 Antiallergic action of Bifidobacteria polysaccharide
  • the purified polysaccharide fraction prepared in Example 1 was dissolved in a phosphate buffer solution (PBS), and 5 BALB / c mice (8 weeks old, male, Kiwa Laboratory Animal Research Institute) using a sonde.
  • PBS phosphate buffer solution
  • 5 BALB / c mice 8 weeks old, male, Kiwa Laboratory Animal Research Institute
  • Sonde was orally administered daily (20 mg / kg body weight / day).
  • PBS alone was orally administered to 5 animals daily.
  • prednisolone (Sigma) was orally administered to 5 animals daily (3 mg / kg body weight / day).
  • the histological observation of the pinna was performed 20 days after the start of sensitization. For histological observation, after dissection, sections were prepared from the pinna fixed with 10% neutral buffered formalin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and stained with hematoxylin and eosin (H & E) (Applied Medical Research Co., Ltd.). After consignment), it was observed with a microscope.
  • FIG. 2 is a graph showing the change over time (5 animals in each group) after the start of sensitization of the auricular skin thickness average value of mice orally administered with a bifidobacteria-producing polysaccharide.
  • the vertical axis represents auricular skin thickness (mm), and the horizontal axis represents the number of days elapsed after sensitization (days).
  • a black circle represents a control (PBS only) administration group
  • a white circle represents a positive control (prednisolone) administration group
  • a black triangle represents a bifidobacteria-producing polysaccharide administration group.
  • FIG. 3 shows a photomicrograph of an H & E-stained auricle section 20 days after the start of sensitization in mice orally administered with a bifidobacteria-producing polysaccharide.
  • a control (PBS only) administration group, a positive control (prednisolone) administration group, and a bifidobacteria-producing polysaccharide administration group are shown in order from the top.
  • Oral administration of the purified polysaccharide fraction significantly suppressed the increase in auricular thickness compared to oral administration of control PBS, as well as oral administration of positive control prednisolone.
  • FIG. 2 The results of histological observation of the pinna also showed that oral administration of the purified polysaccharide fraction (bifidobacteria-producing polysaccharide) suppressed inflammation induced by the pinna, similar to oral administration of the positive control prednisolone. It was shown that the increase in the thickness was suppressed (FIG. 3). That is, it showed an antiallergic action.
  • Example 5 Antiallergic action of exopolysaccharide-producing bifidobacteria
  • Bifidobacterium longum JBL05 producing exopolysaccharide suspended in PBS is orally administered daily to 5 BALB / c mice (8 weeks old, male, Kiwa Laboratory Animal Research Institute) using a sonde. Administration was performed (10 8 live cells / animal / day).
  • PBS alone was orally administered to 5 animals daily.
  • prednisolone (Sigma) was orally administered to 5 animals daily (3 mg / kg body weight / day).
  • the histological observation of the pinna was performed 20 days after the start of sensitization. For histological observation, after dissection, sections were prepared from the pinna fixed with 10% neutral buffered formalin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and stained with hematoxylin and eosin (H & E) (Applied Medical Research Co., Ltd.). After consignment), it was observed with a microscope.
  • FIG. 4 is a graph showing the change over time (5 animals in each group) after the start of sensitization of the auricle skin thickness average value of mice orally administered with exopolysaccharide-producing bifidobacteria.
  • the vertical axis represents auricular skin thickness (mm), and the horizontal axis represents the number of days elapsed after sensitization (days).
  • a black circle represents a control (PBS only) administration group
  • a white circle represents a positive control (prednisolone) administration group
  • a black square represents an extracellular polysaccharide-producing bifidobacteria administration group.
  • FIG. 5 shows a photomicrograph of an H & E-stained auricle section on the 20th day after the start of sensitization of mice orally administered with exopolysaccharide-producing bifidobacteria.
  • a control (PBS only) administration group, a positive control (prednisolone) administration group, and an exopolysaccharide-producing bifidobacteria administration group are shown in order from the top.
  • Example 6 Anti-allergic action by application of polysaccharide produced by Bifidobacterium
  • TNCB 2,4,6-trinitro-1-chlorobenzene
  • the groups were divided so that the auricular skin thickness was uniform (3 mice in each group). From day 9 after the start of sensitization, the purified polysaccharide fraction prepared in Example 1 was dissolved in water (1 mg / ml) in 3 animals, and 20 ⁇ l each was applied to the front and back of the auricle daily. Another 3 animals were similarly applied with water as a control, and another 3 animals were similarly applied with prednisolone (25 mg / ml) dissolved in water as a positive control. TNCB was applied once every two days, 30 minutes or more before applying the bifidobacteria-producing polysaccharide, water, or prednisolone. From the sensitization start date, the thickness of the auricle was measured with calipers for each application of TNCB. The measurement was performed by the same tester under the same conditions every time, and the average value was obtained (3 mice in each group).
  • FIG. 6 is a graph showing the change over time (3 mice in each group) after the start of sensitization of the average value of the auricle skin thickness of mice coated with a bifidobacteria-producing polysaccharide.
  • the vertical axis represents auricular skin thickness (mm), and the horizontal axis represents the number of days elapsed after sensitization (days).
  • a black circle represents a control (water only) application group
  • a white circle represents a positive control (prednisolone) application group
  • a black triangle represents a bifidobacteria-producing polysaccharide application group.
  • the application of the purified polysaccharide fraction suppressed the increase in the thickness of the auricle as compared to the control water-only application, as in the case of the positive control prednisolone (FIG. 6). That is, the antiallergic action was also exhibited by application.
  • an antiallergic effect can be achieved by utilizing bifidobacteria, which are bacteria that can predominantly live in the human intestine.
  • bifidobacteria-producing polysaccharide or extracellular polysaccharide-producing bifidobacteria in foods, cosmetics, pharmaceuticals, etc., the antiallergic action can be suitably used.

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Abstract

　本発明によれば抗アレルギー剤が提供され、この抗アレルギー剤は、ガラクトース、グルコース、およびラムノースを構成成分に含む多糖、または、ビフィドバクテリウム属に属しかつ該多糖を菌体外に産生する微生物を含む。本発明の抗アレルギー剤は、経口用組成物および外用剤組成物のいずれにも用いられ、食品、医薬品、化粧品などに好適に利用され得る。

Description

抗アレルギー剤
　本発明は、抗アレルギー剤に関する。
　ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する微生物（以下、「ビフィズス菌」ともいう）は、腸内優勢菌のひとつであり、その整腸作用および免疫調節作用が数多く報告されている。
　一部のビフィズス菌は、菌体外に多糖類を産生することが報告されているが、その多くは、多糖の特徴的な構成成分および構造についての報告であった。ビフィズス菌が産生する多糖の機能については、免疫賦活剤に関する報告がある（特許文献１および２）。
　ビフィズス菌とは異なる微生物が産生する多糖については、抗アレルギー作用に関するいくつかの報告がある。特許文献３には、ラクトバチルス属微生物の培養液から得られる多糖を有効成分とする抗炎症剤が記載され、特許文献４には、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）が産生する多糖を有効成分とする抗炎症作用、抗アレルギー作用、および腫瘍増殖抑制作用を含む免疫調節剤が記載されている。特許文献５には、納豆菌が産生する多糖類レバンを有効成分とするアレルギー抑制組成物が記載されている。
　納豆菌は、腸内常在菌として存在する微生物ではなく、また、健全な腸内においては、乳酸菌よりもビフィズス菌が圧倒的に優勢である。腸内優勢菌であるビフィズス菌のうち、菌体外に多糖を産生するビフィズス菌については、抗アレルギー作用に関する報告はこれまでない。
国際公開第０７／００７５６２号 特開昭５８－２０３９１３号公報 特開平７－７０２０９号公報 特開２００８－２４５５７６号公報 特開２００６－１９２２号公報
　本発明の目的は、副作用の心配がない抗アレルギー剤を提供することである。
　本発明は、ガラクトース、グルコース、およびラムノースを構成成分に含む多糖を含む、抗アレルギー剤を提供する。
　１つの実施態様では、上記多糖は、ガラクトース、グルコース、およびラムノースを３～５：１～３：１のモル比で含む。
　１つの実施態様では、上記多糖は、以下の構造を含む：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　１つの実施態様では、上記多糖は、ビフィドバクテリウム属に属する微生物から得られる多糖である。
　さらなる実施態様では、上記ビフィドバクテリウム属に属する微生物は、ビフィドバクテリウム・ロンガムである。
　なおさらなる実施態様では、上記ビフィドバクテリウム・ロンガムは、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－８２）である。
　本発明はまた、ビフィドバクテリウム属に属しかつ上記多糖を菌体外に産生する微生物を含む、抗アレルギー剤を提供する。
　１つの実施態様では、上記菌体外多糖産生ビフィズス菌は、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－８２）である。
　本発明はまた、上記抗アレルギー剤を含有する経口用組成物を提供する。この抗アレルギー剤は、上記ビフィズス菌産生多糖を含む抗アレルギー剤または上記菌体外多糖産生ビフィズス菌を含む抗アレルギー剤である。
　本発明はまた、上記抗アレルギー剤を含有する外用剤組成物を提供する。この抗アレルギー剤は、上記ビフィズス菌産生多糖を含む抗アレルギー剤である。
　１つの実施態様では、上記経口用組成物または外用剤組成物は、アトピー性皮膚炎あるいは接触性皮膚炎を抑制するためのものである。
　本発明によれば、副作用の心配がない、優れたアレルギー抑制効果を示す抗アレルギー剤が提供される。
脾臓細胞に対するビフィズス菌産生多糖のインビトロ刺激によるインターフェロン-γ（IFN-γ）の産生（Ａ）、インターロイキン－４（IL-4）の産生（Ｂ）、およびIFN-γとIL-4との産生比（Ｃ）を示すグラフである。 ビフィズス菌産生多糖を経口投与したマウスの耳介皮膚厚平均値の感作開始後の経時変化を示すグラフである。 ビフィズス菌産生多糖を経口投与したマウスの感作開始後20日目のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色耳介切片の顕微鏡写真を示す。 菌体外多糖産生ビフィズス菌を経口投与したマウスの耳介皮膚厚平均値の感作開始後の経時変化を示すグラフである。 菌体外多糖産生ビフィズス菌を経口投与したマウスの感作開始後20日目のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色耳介切片の顕微鏡写真を示す。 ビフィズス菌産生多糖を塗布したマウスの耳介皮膚厚平均値の感作開始後の経時変化を示すグラフである。
　（ビフィズス菌産生多糖および菌体外多糖産生ビフィズス菌）
　本発明においては、ガラクトース、グルコース、およびラムノースを構成成分に含む多糖が用いられる。この多糖は、構成糖のモル比が、ガラクトース：グルコース：ラムノース＝３～５：１～３：１であり得る。この多糖は、例えば、ガラクトース：グルコース：ラムノース＝４：２：１の場合、以下の式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
で表される反復構造を含み得る。式（Ｉ）中のGalpはガラクトピラノース、Glcpはグルコピラノース、Rhapはラムノピラノースを表し、これらは、ガラクトース、グルコース、およびラムノースがピラノース構造をとることを意味する。上記多糖には、ピルビン酸がさらに含まれてもよく、多糖中のピルビン酸の含有率は、１０質量％以下であり得る。多糖の構成成分の同定、多糖中の構成成分の含有量もしくは含有率の測定、および多糖の構造分析は、以下に詳述する。このような構造を有する多糖は、ビフィドバクテリウム属に属する微生物、特に、ビフィドバクテリウム・ロンガム、例えば、ヒトの腸内から単離されたビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－８２）によって産生され得る。したがって、本明細書中では、便宜上、この多糖を「ビフィズス菌産生多糖」ともいうが、この表現によって多糖を産生する微生物を限定するものではない。
　本発明においては、ビフィドバクテリウム属に属しかつ上記多糖を菌体外に産生する微生物もまた用いられる。「多糖を菌体外に産生する」とは、微生物が周囲に夾膜状の多糖を産生することをいう。この微生物を、本明細書中では、便宜上、「菌体外多糖産生ビフィズス菌」ともいう。
　本発明においては、ビフィズス菌産生多糖の調製のために用いられる微生物として、または菌体外多糖産生ビフィズス菌として、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－８２）が例示される。ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－８２）の菌学的性質は以下の表１の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　これらの表現形質による分類学的性質に基づき、ＪＢＬ０５株は、バージーズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）Vol.2（1984）に従ってビフィドバクテリウム・ロンガムであると同定された。そして、２００５年３月３日（原寄託日）に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２－０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）にＮＩＴＥ ＢＰ－８２として寄託された。
　多糖の調製のために、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－８２）を適切な培地で培養し得る。培養の手順を、以下の例示によって説明するが、この例示に限定されない。
　培地としては、ビフィドバクテリウム属に属する微生物が利用できる炭素源および窒素源、ならびに、必要に応じて、システイン塩酸塩、アスコルビン酸ナトリウム、微量の無機塩などを含む培地が挙げられる。特に、多糖を多量に調製するためには、脱脂乳または乳成分を含む培地が好ましい。この場合、脱脂乳をプロテアーゼなどの酵素で分解した酵素分解脱脂乳に、魚肉エキスであるカルチベータ（焼津水産化学工業株式会社）、ラクトース、アスコルビン酸ナトリウムなどを加えた培地が好ましく用いられ得る。
　上記培地を用い、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－８２）を、培養温度２０～４５℃にて、嫌気条件下、撹拌あるいは静置して、ｐＨを４～７、好ましくは５～６に制御しながら１２～６０時間、好ましくは１５～５０時間培養を行うことにより、培養液中に粘性物質（多糖）が産生され得る。
　得られた培養液からの多糖の回収には、加熱、酵素処理、遠心、濾過、膜処理、濾別などの、当業者が通常、培養液から目的物質を回収する方法が用いられる。例えば、粘性物質（多糖）および微生物菌体を含む培養液を遠心し、菌体を除去する。培養液の粘度が高い場合は、例えば、水で希釈した後、遠心することにより、菌体を除去することができる。次いで、得られた上清に適切な有機溶媒を加えてタンパク質を析出させ、例えば遠心分離によって沈殿を除去し、さらに得られた上清に有機溶媒を添加して多糖を沈殿させ、例えば遠心分離によって、多糖を回収する。詳細には、菌体を除去した上清に、終濃度が２０容量％となるようにエタノールを添加し、遠心分離を行ってタンパク質を含む沈殿物を除去し、さらに得られた上清に終濃度が５０容量％となるようにエタノールを添加し、遠心分離を行って沈殿物を回収することにより、粗精製多糖が得られる。
　あるいは、有機溶剤とカチオンとを組み合わせて多糖を回収する方法を用いてもよい。例えば、１価のカチオンと有機溶剤とを用いる回収方法、２価のカチオンと有機溶剤とを用いる回収方法（特開昭５８－５３０１号公報）、３価のカチオンと有機溶剤とを用いる回収方法（特開昭５９－１９６０９９号公報）などと同様の方法を用いることもできる。カチオンは、多糖の回収率を高める点から、好ましく用いられる。１価カチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオンなどが挙げられる。２価カチオンとしては、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどが挙げられる。３価カチオンとしては、アルミニウムイオンなどが挙げられる。これらのカチオンをエタノールなどの有機溶剤とともに、多糖が含まれる粘性溶液に添加することにより、より多くの多糖を回収することができる。２価あるいは３価のカチオンを用いる方が、１価のカチオンを用いる場合よりも多糖の回収率を高めることが可能である。
　得られた粗精製多糖からの多糖の精製は、当業者が通常行う方法、例えば、イオン交換樹脂を用いる分画、ゲル濾過による分画などを単独あるいは組み合わせて行われる。イオン交換樹脂を用いる方法は特に制限されず、例えば、陰イオン交換樹脂（例えば、商品名ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０（ファルマシア社）など）に多糖を吸着させ、塩化ナトリウムのグラディエントをかけて多糖を溶出させる方法が挙げられる。ゲル濾過による方法としては、商品名ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ６５Ｓ（東ソー株式会社）などを用いる方法などが挙げられる。
　多糖の構造は以下のような方法で決定される。まず、精製した多糖を、例えば、蟻酸、希塩酸、トリフルオロ酢酸などで酸加水分解し、この加水分解物をＨＰＬＣで分析することにより、多糖を構成する糖（単糖）が決定される。次いで、この酸加水分解物を、常法によりアセチル化し、ガスクロマトグラフィーで分析（ＧＣ分析）することにより、構成糖の組成（構成糖の比率）が求められる。さらに、精製した多糖を常法によりメチル化した後に酸加水分解し、この加水分解物を還元後アセチル化して得られる生成物をＧＣ－ＭＳ（ガスクロマトグラフィー／質量分析）などで分析することにより、多糖の結合様式が決定される。また、ＮＭＲ分析により、各単糖どうしの結合状態が明らかにされる。多糖に結合しているピルビン酸は、ＮＡＤＨ存在下、乳酸デヒドロゲナーゼによるピルビン酸の乳酸への還元を測定することにより、定性的かつ定量的に測定できる。
　ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ ＢＰ－８２）は、以下の特徴を有する多糖を産生し得る：
（１）多糖の構成成分として、ガラクトース、グルコース、およびラムノースを含む。
（２）ガラクトースとグルコースとラムノースとのモル比は３～５：１～３：１である。
（３）多糖中にはピルビン酸が含まれてもよく、その場合の含有率は、１０質量％以下であり得る。
（４）分子量は、約５万～１０００万、好ましくは約２０万～２５０万である（ゲル浸透クロマトグラフィー／多角度レーザー光散乱検出（ＧＰＣ－ＭＡＬＬＳ）法）。
（５）多糖は、例えば、ガラクトースとグルコースとラムノースとのモル比が４：２：１である場合、以下の式（Ｉ）で示される反復構造を含み得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　上記の特徴を有する多糖は、以下の実施例１に記載の手順に従って得られる精製多糖画分に含まれ得る。
　なお、多糖の分子量は、培養条件および回収・精製条件により変化する。培養条件などにより分子量を調整することも可能である。
　このような構造を有する多糖は、ヒトの腸内から単離されたビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－８２）より産生され得るが、このような多糖の調製のためにこの微生物以外の微生物を利用してもよい。そのような微生物は、例えば、腸内細菌を分離し、菌の周囲に夾膜状の多糖を産生することが判明した株の多糖を分析することにより決定され得、多糖の回収および精製は、上記に準じて行われ得る。
　菌体外多糖産生ビフィズス菌として、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－８２）が例示されるが、ビフィズス菌産生多糖を菌体外に産生する他のビフィズス菌もまた本発明に用いられ得る。
　本発明において用いられる菌体外多糖産生ビフィズス菌は、多糖を調製するための培養終了後に、培養液から得られる菌体を含むものであればよい。菌体外多糖産生ビフィズス菌として、培養終了後のビフィズス菌培養液をそのまま、または、遠心分離、膜処理、濾別などにより得られた菌体を含む培養液が用いられ得る。培養液の濃縮物、乾燥物、破砕物などもまた用いられ得る。乾燥方法としては、例えば真空乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥などが挙げられる。菌体と共に分散剤、倍散剤などを含んでいてもよい。通常用いられる手法で生菌として調製し得る。また、得られた菌体を含む培養液、濃縮物、乾燥物などを加熱殺菌、放射線殺菌などの殺菌処理に供し、必要に応じて破砕して得られる死菌もまた用いられ得る。このような菌体の調製に用いられる手法は、当業者が通常用いる手法に従う。
　（抗アレルギー剤）
　ビフィズス菌産生多糖および菌体外多糖産生ビフィズス菌は、抗アレルギー作用を示す。抗アレルギー作用としては、Th1/Th2バランス改善、Th17調節作用、炎症抑制作用、IgE産生抑制作用、ヒスタミンなどのケミカルメディエーター遊離抑制作用、リンパ球活性化作用などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。したがって、本発明によれば、ビフィズス菌産生多糖または菌体外多糖産生ビフィズス菌を抗アレルギー剤として使用し得、そしてビフィズス菌産生多糖または菌体外多糖産生ビフィズス菌を含む抗アレルギー剤が提供される。
　ビフィズス菌産生多糖または菌体外多糖産生ビフィズス菌は、抗アレルギー剤として、任意の組成物に含有させることができる。抗アレルギー剤による効果としては、Ｉ型アレルギー、ＩＶ型アレルギー、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、気管支喘息などの抑制が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような組成物は、アレルギー症状の予防または治療に有用である。好ましくは、アトピー性皮膚炎あるいは接触性皮膚炎を抑制し得る。
　このような組成物は、食品、医薬品および化粧品の用途に使用することができる。組成物は、具体的には、これらに限定されるものではないが、例えば、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、ペースト状、クリーム状、ゼリー状、液体状として調製し、使用することができる。必要に応じて、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの無機物、有機物と混合して使用できる。組成物の製造は、食品、医薬品および化粧品の製造について当業者が周知の方法が用いられ得る。
　ビフィズス菌産生多糖の配合量は、その目的、用途、形態、剤型、症状、体重などに応じて任意に定めることができるが、経口摂取もしくは投与の場合、一日当たり1mg～10g、より好ましくは、10mg～2gを摂取できるように調製されることが好ましい。また、皮膚または粘膜への塗布により投与する場合、製品の全質量に対して0.001～10質量％含有したもの、より好ましくは0.01～1質量％含有したものが好ましい。
　菌体外多糖産生ビフィズス菌の配合量もまた、その目的、用途、形態、剤型、症状、体重などに応じて任意に定めることができるが、ビフィズス菌数として、一日当たり１０６～１０１２個、より好ましくは、１０８～１０１１個摂取できるように定められることが好ましい。
　ビフィズス菌産生多糖または菌体外多糖産生ビフィズス菌を含有する組成物は、経口用組成物として用いられ得る。例えば、経口用組成物は、経口摂取による抗アレルギー作用のために、食品組成物または医薬品組成物として用いられ得、そして経口投与用の医薬品、流動食、病者用食品、乳幼児食品、栄養機能食品、特定保健用食品などに添加することができる。ビフィズス菌産生多糖または菌体外多糖産生ビフィズス菌を含む組成物は、通常の飲食品に配合することもでき、例えば、牛乳、清涼飲料水、ゼリー飲料などの各種飲料、キャンディー、グミ、チョコレート、ビスケット、クラッカーなどの各種菓子類、ごはん、パン、うどん、ドレッシングなどの各種食品などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。菌体外多糖産生ビフィズス菌の生菌を含む組成物を用いて牛乳などを発酵させ、ヨーグルトや発酵乳として摂取することもできる。
　ビフィズス菌産生多糖を含有する組成物は、外用剤組成物として用いられ得る。例えば、外用剤組成物は、皮膚または粘膜への塗布もしくは投与による抗アレルギー作用のために、化粧品組成物または医薬品組成物として用いられ得る。このような組成物が配合され得る化粧品としては、例えば、洗顔料、化粧水、美容液、乳液、スプレー剤、パックシート、クリーム、軟膏剤、入浴剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。化粧品組成物は、医薬部外品として製造販売されるものも含み得る。このような組成物が配合され得る医薬品としては、鼻内粘膜への投与用の組成物（例えば、点鼻剤、噴霧剤など）、眼粘膜への投与用の組成物（例えば、点眼剤、洗眼剤など）、咽喉粘膜への投与用の組成物（例えば、うがい薬、洗口剤、スプレー、トローチなど）など挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような医薬品にはまた、貼布剤、傷保護剤、救急絆創膏などの衛生材料も含まれる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
　（実施例１：菌体外多糖産生ビフィズス菌の培養およびビフィズス菌産生多糖の調製）
　ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－８２）の培養および該微生物が産生する多糖の精製は、特許文献１の記載に従った。より詳細には以下の通りである。
　９質量％の脱脂乳溶液に、パンクレアチン（天野エンザイム株式会社）およびシリコンをそれぞれ終濃度が０．３６質量％および０．０１質量％となるように加えた。次いで、１０Ｎ ＮａＯＨで溶液のｐＨを８に調整し、５５℃にて４時間酵素を反応させて、酵素分解脱脂乳を得た。これに、カルチベータ（焼津水産化学工業株式会社）、ラクトース、およびアスコルビン酸ナトリウムを、それぞれ終濃度で、３．０質量％、２．５質量％、および０．２質量％となるように加え、これを１２１℃にて１５分間オートクレーブで滅菌し、液体培地として使用した。
　上記で調製した液体培地を用いて前培養したビフィドバクテリウム ロンガム ＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ ＢＰ－８２）を、１％（ｖ／ｖ）となるように、５Ｌの同じ液体培地に接種し、３７℃にて４０時間静置嫌気培養を行い、粘性物質を産生させた。培養液を遠心分離し、菌体を除去した後、上清に終濃度２０％となるようエタノールを加え、これを４℃に静置保存した。一晩静置後、遠心分離によりタンパク質を含む沈澱物を除去し、上清に終濃度５０％となるようエタノールを加え、これを４℃にて静置保存した。一晩静置後、遠心分離により沈澱物を回収し、得られた粗精製多糖画分を凍結乾燥して保存した。
　粗精製多糖画分を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０充填カラムを用いてさらに分画し、０．０７Ｍ～０．５ＭのＮａＣｌで溶出された画分を凍結乾燥し、精製多糖画分とした。
　（実施例２：ビフィズス菌産生多糖の構造解析）
　実施例１で調製した精製多糖画分をＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ６５Ｓ充填カラムを用いてゲル濾過し、ＧＰＣ－ＭＡＬＬＳ法により分子量を調べたところ、約５４万であった。
　次に、ゲル濾過画分（多糖）に蟻酸を加え、加水分解した。この加水分解液を減圧乾固後、さらにトリフルオロ酢酸を加えて加水分解し、加水分解生成物を得た。ＩＯＮ－３００カラム（東京化成工業株式会社）を用いたＨＰＬＣ分析により、この多糖が、ガラクトース、グルコース、およびラムノースから構成されることがわかった。
　この加水分解生成物を常法により水素化ホウ素ナトリウムで還元し、無水酢酸とピリジンを加えてアセチル化したものを、Ｒ－２２５カラム（Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＧＣ分析した。その結果、この多糖を構成するガラクトースと、グルコースと、ラムノースとのモル比は４：２：１であると判定した。
　上記加水分解生成物に、ＮＡＤＨの存在下、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させたところ、乳酸が生じた。従って、この多糖画分にピルビン酸が存在することが確認された。また、多糖中のピルビン酸含有率は、５質量％であると確認された。
　多糖の結合様式を明らかにするため、メチル化して分析を行った。ゲル濾過画分（多糖）を常法によりメチル化した後に蟻酸を加えて加水分解し、この加水分解物を還元後アセチル化して得られた生成物をＧＣ－ＭＳ測定にかけ、分析した。その結果、１，５－ジ－Ｏ－アセチル－２，３，４，６－テトラ－Ｏ－メチル－グルシトール、１，５－ジ－Ｏ－アセチル－２，３，４，６－テトラ－Ｏ－メチル－ガラクチトール、１，３，４，５－テトラ－Ｏ－アセチル－２，６－ジ－Ｏ－メチル－ラムニトール、１，３，５－トリ－Ｏ－アセチル－２，４，６－トリ－Ｏ－メチル－ガラクチトール、１，４，５－トリ－Ｏ－アセチル－２，３，６－トリ－Ｏ－メチル－グルシトール、１，４，５－トリ－Ｏ－アセチル－２，３，６－トリ－Ｏ－メチル－ガラクチトール、および１，４，５，６－テトラ－Ｏ－アセチル－２，３－ジ－Ｏ－メチル－ガラクチトールのメチル化された糖が得られた。
　また、ＮＭＲ分析により、結合状態を検討した。これらのデータから、多糖は、以下の構造Ｉ（反復構造）を有することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　（実施例３：ビフィズス菌産生多糖のTh1/Th2バランス改善作用）
　実施例１で調製した精製多糖画分を水に溶解し、終濃度20μg/mlまたは200μg/mlとなるように添加した、ウシ胎児血清および抗生物質（抗生物質－抗真菌剤混合溶液、ナカライテスク）を含むRPMI-1640培地中で、C3H/HeJマウス（8週齢、雄、日本クレア）より調製した脾臓細胞を、5%CO2下で37℃にて72時間培養した。培養上清を回収し、Th1型サイトカインであるインターフェロン－γ（IFN-γ）濃度およびTh2型サイトカインであるインターロイキン－４（IL-4）濃度をELISA法（BIOSOURCE、Invitrogen）で測定した。コントロールとして、同量の水を添加して培養し、同様に上記手順を行った。
　結果を図１（Ａ）～（Ｃ）に示す。図１（Ａ）は、脾臓細胞に対するビフィズス菌産生多糖のインビトロ刺激によるIFN-γの産生を示すグラフである。縦軸はIFN-γ産生量（pg/ml）を表し、横軸は試験区を表す。図１（Ｂ）は、脾臓細胞に対するビフィズス菌産生多糖のインビトロ刺激によるIL-4の産生を示すグラフである。縦軸はIL-4産生量（pg/ml）を表し、横軸は試験区を表す。図１（Ｃ）は、脾臓細胞に対するビフィズス菌産生多糖のインビトロ刺激によるIFN-γとIL-4との産生比を示すグラフである。縦軸はIL-4に対するIFN-γの割合（IFN-γ／IL-4）を表し、横軸は試験区を表す。
　この結果、精製多糖画分（ビフィズス菌産生多糖）の添加では、同量の水を添加したコントロールと比べて濃度依存的に、IFN-γ産生量の増加とIL-4産生量の減少とが認められた。
　したがって、ビフィズス菌産生多糖の添加により、Th1型サイトカインの増加が認められ、Th1/Th2バランスがTh1優位となることが示された。すなわち、抗アレルギー作用が示された。
　（実施例４：ビフィズス菌産生多糖の抗アレルギー作用）
　実施例１で調製した精製多糖画分をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、これをゾンデを用いて、BALB/cマウス（8週齢、雄、株式会社紀和実験動物研究所）5匹に毎日経口投与した（20mg/kg体重/日）。コントロールとして、ＰＢＳのみを5匹に毎日経口投与した。ポジティブコントロールとして、プレドニゾロン（Sigma）を5匹に毎日経口投与した（3mg/kg体重/日）。投与開始後4日目に、右耳介に、アセトン（ナカライテスク）に溶解した0.3%の2,4,6-トリニトロ-1-クロロベンゼン（ＴＮＣＢ）（東京化成工業株式会社）を10μl塗布し（感作）、そして左耳介に、アセトンのみを同量塗布した。さらにＴＮＣＢ塗布（感作）開始後4日目から1日おきに19日目まで本処置を繰り返した。感作開始後も、上記の経口投与は続けた。感作開始日から、ＴＮＣＢの塗布ごとに耳介の厚さをノギスで測定した。測定は、毎回同じ条件で、同一試験者が行い、平均値を求めた（各群5匹）。感作開始後20日目に耳介の組織学的観察を行った。組織学的観察については、解剖後、10%中性緩衝ホルマリン（和光純薬工業株式会社）で固定した耳介より切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した（株式会社アプライドメディカルリサーチ委託）後、顕微鏡観察した。
　図２は、ビフィズス菌産生多糖を経口投与したマウスの耳介皮膚厚平均値の感作開始後の経時変化（各群5匹）を示すグラフである。縦軸は耳介皮膚厚（mm）を表し、横軸は感作後経過日数（日）を表す。黒丸はコントロール（ＰＢＳのみ）投与群、白丸はポジティブコントロール（プレドニゾロン）投与群、黒三角はビフィズス菌産生多糖投与群を表す。
　図３は、ビフィズス菌産生多糖を経口投与したマウスの感作開始後20日目のＨ＆Ｅ染色耳介切片の顕微鏡写真を示す。上段から順に、コントロール（ＰＢＳのみ）投与群、ポジティブコントロール（プレドニゾロン）投与群、およびビフィズス菌産生多糖投与群を示す。
　精製多糖画分（ビフィズス菌産生多糖）の経口投与により、ポジティブコントロールのプレドニゾロンを経口投与したときと同様に、コントロールのＰＢＳを経口投与したときと比べて、耳介厚の増加を有意に抑制した（図２）。耳介の組織学的観察の結果もまた、精製多糖画分（ビフィズス菌産生多糖）の経口投与が、ポジティブコントロールのプレドニゾロンの経口投与と同様に、耳介に誘導される炎症を抑制し、耳介厚の増加を抑制することを示した（図３）。すなわち、抗アレルギー作用を示した。
　（実施例５：菌体外多糖産生ビフィズス菌の抗アレルギー作用）
　実施例４と同様の方法を用い、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（生菌体）の効果を検討した。
　ＰＢＳに懸濁した菌体外多糖産生ビフィズス菌ビフィドバクテリウム・ロンガムJBL05を、ゾンデを用いて、BALB/cマウス（8週齢、雄、株式会社紀和実験動物研究所）5匹に毎日経口投与した（生菌体108個/匹/日）。コントロールとしてＰＢＳのみを5匹に毎日経口投与した。ポジティブコントロールとして、プレドニゾロン（Sigma）を5匹に毎日経口投与した（3mg/kg体重/日）。投与開始後4日目に、右耳介に、アセトン（ナカライテスク株式会社）に溶解した0.3%の2,4,6-トリニトロ-1-クロロベンゼン（ＴＮＣＢ）（東京化成工業株式会社）を10μl塗布し（感作）、そして左耳介に、アセトンのみを同量塗布した。さらにＴＮＣＢ塗布（感作）開始後4日目から1日おきに19日目まで本処置を繰り返した。感作開始後も、上記の経口投与は続けた。感作開始日から、ＴＮＣＢの塗布ごとに耳介の厚さをノギスで測定した。測定は、毎回同じ条件で、同一試験者が行い、平均値を求めた（各群5匹）。感作開始後20日目に耳介の組織学的観察を行った。組織学的観察については、解剖後、10%中性緩衝ホルマリン（和光純薬工業株式会社）で固定した耳介より切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した（株式会社アプライドメディカルリサーチ委託）後、顕微鏡観察した。
　図４は、菌体外多糖産生ビフィズス菌を経口投与したマウスの耳介皮膚厚平均値の感作開始後の経時変化（各群5匹）を示すグラフである。縦軸は耳介皮膚厚（mm）を表し、横軸は感作後経過日数（日）を表す。黒丸はコントロール（ＰＢＳのみ）投与群、白丸はポジティブコントロール（プレドニゾロン）投与群、黒四角は菌体外多糖産生ビフィズス菌投与群を表す。
　図５は、菌体外多糖産生ビフィズス菌を経口投与したマウスの感作開始後20日目のＨ＆Ｅ染色耳介切片の顕微鏡写真を示す。上段から順に、コントロール（ＰＢＳのみ）投与群、ポジティブコントロール（プレドニゾロン）投与群、および菌体外多糖産生ビフィズス菌投与群を示す。
　ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株の生菌（菌体外多糖産生ビフィズス菌）の経口投与は、コントロールのＰＢＳのみ経口投与と比べて、耳介厚の増加を有意に抑制した（図４）。耳介の組織学的観察の結果もまた、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株の生菌体（菌体外多糖産生ビフィズス菌）の経口投与が、耳介に誘導される炎症を抑制し、耳介厚の増加を抑制することを示した（図５）。すなわち、抗アレルギー作用を示した。
　（実施例６：ビフィズス菌産生多糖の塗布による抗アレルギー作用）
　NC/Ngaマウス（7週齢、雄、日本エスエルシー）9匹の右耳介に、アセトン（ナカライテスク）に溶解した0.5%の2,4,6-トリニトロ-1-クロロベンゼン（ＴＮＣＢ）（東京化成工業株式会社）を10μl塗布し（感作）、そして左耳介に、アセトンのみを同量塗布した。さらにＴＮＣＢ塗布（感作）開始後4日目から1日おきに本処置を2回繰り返した。耳介皮膚厚が均等になるように群分けした（各群3匹）。感作開始後9日目から、3匹に、実施例１で調製した精製多糖画分を水に溶解（1mg/ml）し、耳介表裏に各20μlずつ、毎日塗布した。別の3匹にコントロールとして水を、さらに別の3匹にポジティブコントロールとして水に溶解したプレドニゾロン（25mg/ml）を同様に塗布した。ビフィズス菌産生多糖、水、またはプレドニゾロンを塗布する30分以上前に、2日に1回ＴＮＣＢを塗布した。感作開始日から、ＴＮＣＢの塗布ごとに耳介の厚さをノギスで測定した。測定は、毎回同じ条件で、同一試験者が行い、平均値を求めた（各群3匹）。
　図６は、ビフィズス菌産生多糖を塗布したマウスの耳介皮膚厚平均値の感作開始後の経時変化（各群3匹）を示すグラフである。縦軸は耳介皮膚厚（mm）を表し、横軸は感作後経過日数（日）を表す。黒丸はコントロール（水のみ）塗布群、白丸はポジティブコントロール（プレドニゾロン）塗布群、黒三角はビフィズス菌産生多糖塗布群を表す。
　精製多糖画分（ビフィズス菌産生多糖）の塗布は、ポジティブコントロールのプレドニゾロンと同様に、コントロールの水のみ塗布と比べて、耳介厚の増加を抑制した（図６）。すなわち、塗布によっても抗アレルギー作用を示した。
　本発明によれば、ヒトの腸内に優勢に生息し得る菌であるビフィズス菌を利用して、抗アレルギー効果を奏し得る。ビフィズス菌産生多糖または菌体外多糖産生ビフィズス菌を食品、化粧品、医薬品などに用いることで、その抗アレルギー作用を好適に利用し得る。

Claims (14)

  1. 　ガラクトース、グルコース、およびラムノースを構成成分に含む多糖を含む、抗アレルギー剤。
  2. 　前記多糖が、ガラクトース、グルコース、およびラムノースを３～５：１～３：１のモル比で含む、請求項１に記載の抗アレルギー剤。
  3. 　前記多糖が、以下の構造を含む、請求項２に記載の抗アレルギー剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  4. 　前記多糖が、ビフィドバクテリウム属に属する微生物から得られる多糖である、請求項１から３のいずれかに記載の抗アレルギー剤。
  5. 　前記ビフィドバクテリウム属に属する微生物が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである、請求項４に記載の抗アレルギー剤。
  6. 　前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－８２）である、請求項５に記載の抗アレルギー剤。
  7. 　微生物を含む抗アレルギー剤であって、
    　該微生物が、
    　ビフィドバクテリウム属に属し、かつ、
    　ガラクトース、グルコース、およびラムノースを構成成分に含む多糖を菌体外に産生する、
    　抗アレルギー剤。
  8. 　前記多糖が、ガラクトース、グルコース、およびラムノースを３～５：１～３：１のモル比で含む、請求項７に記載の抗アレルギー剤。
  9. 　前記多糖が、以下の構造を含む、請求項８に記載の抗アレルギー剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  10. 　前記微生物が、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－８２）である、請求項７から９のいずれかに記載の抗アレルギー剤。
  11. 　請求項１から１０のいずれかに記載の抗アレルギー剤を含有する経口用組成物。
  12. 　アトピー性皮膚炎あるいは接触性皮膚炎を抑制するための、請求項１１に記載の経口用組成物。
  13. 　請求項１から６のいずれかに記載の抗アレルギー剤を含有する外用剤組成物。
  14. 　アトピー性皮膚炎あるいは接触性皮膚炎を抑制するための、請求項１３に記載の外用剤組成物。
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