CN102812049B

CN102812049B - 抗过敏剂

Info

Publication number: CN102812049B
Application number: CN201180015091.0A
Authority: CN
Inventors: 河野麻实子; 北村进一; 庄条爱子
Original assignee: Morishita Jintan Co Ltd
Current assignee: Morishita Jintan Co Ltd
Priority date: 2010-03-24
Filing date: 2011-03-22
Publication date: 2016-11-30
Anticipated expiration: 2031-03-22

Abstract

本发明提供一种抗过敏剂，该抗过敏剂含有在构成成分中包含半乳糖、葡萄糖和鼠李糖的多糖，或属于双歧杆菌属且在菌体外产生该多糖的微生物。本发明的抗过敏剂在口服用组合物和外用剂组合物的任一种中都可以使用，能够在食品、医药品、化妆品等中合适地利用。

Description

抗过敏剂

技术领域

本发明涉及抗过敏剂。

背景技术

属于双歧杆菌（Bifidobacterium）属的微生物（以下也称为“双歧杆菌”）是肠内优势菌之一，大量报道了其整肠作用和免疫调节作用。

报道了一部分双歧杆菌在菌体外产生多糖类，其多数是关于多糖的特征性构成成分和结构的报告。关于双歧杆菌产生的多糖的功能，有关于免疫活化剂的报告（专利文献1和2）。

关于与双歧杆菌不同的微生物产生的多糖，有关于抗过敏作用的若干报告。在专利文献3中，记载了以从乳杆菌属微生物的培养液得到的多糖作为有效成分的抗炎症剂，在专利文献4中，记载了以发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）产生的多糖作为有效成分的包括抗炎症作用、抗过敏作用和肿瘤增殖抑制作用的免疫调节剂。在专利文献5中，记载了以纳豆菌产生的多糖类果聚糖作为有效成分的过敏抑制组合物。

纳豆菌不是作为肠道常驻内生菌存在的微生物，另外，在健康正常的肠内，双歧杆菌相对于乳酸菌具有压倒性的优势。对于作为肠内优势菌的双歧杆菌中在菌体外产生多糖的双歧杆菌，至今没有关于抗过敏作用的报告。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第07/007562号

专利文献2：日本特开昭58-203913号公报

专利文献3：日本特开平7-70209号公报

专利文献4：日本特开2008-245576号公报

专利文献5：日本特开2006-1922号公报

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供不用担心副作用的抗过敏剂。

用于解决课题的方法

本发明提供一种含有在构成成分中包含半乳糖、葡萄糖和鼠李糖的多糖的抗过敏剂。

在1个实施方式中，上述多糖以3～5∶1～3∶1的摩尔比包含半乳糖、葡萄糖和鼠李糖。

在1个实施方式中，上述多糖包含以下的结构。

在1个实施方式中，上述多糖是从属于双歧杆菌属微生物得到的多糖。

在进一步的实施方式中，属于上述双歧杆菌属的微生物是长双歧杆菌。

另外，在进一步的实施方式中，上述长双歧杆菌是长双歧杆菌JBL05株（NITE BP-82）。

另外，本发明提供含有属于双歧杆菌属且在菌体外产生上述多糖的微生物的抗过敏剂。

在1个实施方式中，上述菌体外多糖产生双歧杆菌是长双歧杆菌JBL05株（NITEBP-82）。

另外，本发明提供含有上述抗过敏剂的口服用组合物。该抗过敏剂是含有上述双歧杆菌产生多糖的抗过敏剂或含有上述菌体外多糖产生双歧杆菌的抗过敏剂。

另外，本发明提供含有上述抗过敏剂的外用剂组合物。该抗过敏剂是含有上述双歧杆菌产生多糖的抗过敏剂。

在1个实施方式中，上述口服用组合物或外用剂组合物是用于抑制特应性皮炎或接触性皮炎的组合物。

发明的效果

根据本发明，可以提供不担心副作用的、显示优异的过敏抑制效果的抗过敏剂。

附图说明

图1是表示由双歧杆菌产生多糖对脾脏细胞体外刺激引起的干扰素（IFN-γ）的产生（A）、白细胞介素-4（IL-4）的产生（B）和IFN-γ与IL-4的产生比（C）的图。

图2是表示口服给药了双歧杆菌产生多糖的大鼠的耳廓皮肤厚度平均值在开始致敏后的经时变化的图。

图3是表示口服给药了双歧杆菌产生多糖的大鼠开始致敏后第20天的苏木精·曙红（H&E）染色耳廓切片的显微镜照片。

图4是表示口服给药了菌体外多糖产生双歧杆菌的大鼠的耳廓皮肤厚度平均值在开始致敏后的经时变化的图。

图5是表示口服给药了菌体外多糖产生双歧杆菌的大鼠开始致敏后第20天的苏木精·曙红（H&E）染色耳廓切片的显微镜照片。

图6是表示涂布了双歧杆菌产生多糖的大鼠的耳廓皮肤厚度平均值在开始致敏后的经时变化的图。

具体实施方式

（双歧杆菌产生多糖和菌体外多糖产生双歧杆菌）

在本发明中，可以使用在构成成分中包含半乳糖、葡萄糖和鼠李糖的多糖。该多糖中，构成糖的摩尔比可以为半乳糖∶葡萄糖∶鼠李糖3～5∶1～3∶1。该多糖中，例如在半乳糖∶葡萄糖∶鼠李糖=4∶2∶1时，能够包含下式（Ⅰ）所示的重复结构：

式（Ⅰ）中的Galp表示吡喃半乳糖，Glcp表示吡喃葡萄糖，Rhap表示吡喃鼠李糖，这是指半乳糖、葡萄糖和鼠李糖采取吡喃糖结构。在上述多糖中，可以还包含丙酮酸，在多糖中的丙酮酸含有率可以为10质量%以下。在以下详细叙述多糖的构成成分的鉴定、多糖中的构成成分的含有率或含有率的测定、以及多糖的结构分析。具有这样结构的多糖能够由属于双歧杆菌属的微生物产生，特别是由长双歧杆菌、例如从人的肠内被单独分离的长双歧杆菌JBL05株（NITE BP-82）产生。因此，在本说明书中，为了方便，也将该多糖称为“双歧杆菌产生多糖”，但根据其表现，不限定产生多糖的微生物。

在本发明中，也可以使用属于双歧杆菌属且在菌体外产生上述多糖的微生物。“在菌体外产生多糖”是指微生物在周围产生荚膜状的多糖。在本说明书中，为了方便，也将该微生物称为“菌体外多糖产生双歧杆菌”。

在本发明中，作为可以用于双歧杆菌产生多糖的制备的微生物，或作为菌体外多糖产生双歧杆菌，例示长双歧杆菌JBL05株（NITEBP-82）。长双歧杆菌JBL05株（NITE BP-82）的菌学性质如以下的表1所示。

［表1］

A.形态性状

（1）形状 0.6～0.8×1.0×4.0μm，棍棒状，Y字形，弯曲状的革兰氏阳性杆菌

（2）运动性－

（3）胞子－

B.培养性状*1

（1）形状正圆形，表面、周边都圆滑

（2）大小直径0.5～2.5mm

（3）隆起隆起为半球状

（4）色调黄褐色或乳白色

（5）特征稍微粘稠

*1涂布于BL琼脂培养基（日水制药株式会社）后，在37℃加入Anaeropack（三

菱瓦斯化学株式会社），在密闭容器内且厌气条件下培养48小时后的菌落性状

C.生理学性质

（1）硝酸盐还原－

（2）吲哚生成－

（3）过氧化氢酶－

（4）最佳生长温度 37℃

（5）最佳pH pH6.5～7.0

（6）厌气度偏向厌气性

（7）气体产生－

（8）糖同化性

阿拉伯糖＋

木糖＋

核糖＋

葡萄糖＋

半乳糖＋

甘露糖＋

果糖＋

蔗糖＋

纤维素二糖－

乳糖＋

海藻糖 -

蜜二糖＋

棉子糖＋

松三糖＋

淀粉 ±

甘油 -

甘露糖醇 -

山梨糖醇 -

肌醇－

（＋：阳性、-：阴性、±：弱阳性）

基于由这些表现形质得到的分类学性质，根据伯杰氏系统细菌学手册（Bergey′sManual of Systematic Bacteriology）Vol.2（1984），JBL05株，鉴定为长双歧杆菌。而且，在2005年3月3日（原保藏日）作为NITE BP-82保藏于国家技术评估学会专利微生物保藏中心（NPMD）（地址：292-0818日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8）。

为了制备多糖，能够以适当的培养基培养长双歧杆菌JBL05株（NITE BP-82）。通过以下的例示说明培养的工序，但不受该例示限定。

作为培养基，可以列举含有属于双歧杆菌属的微生物能够利用的碳源和氮源以及根据需要的半胱氨酸盐酸盐、抗坏血酸钠、微量无机盐等的培养基。特别是在为了制备大量多糖时，优选含有脱脂乳或乳成分的培养基。此时，可以优选使用在以蛋白酶等酶解脱脂乳而得到的酶解脱脂乳中加入了作为鱼肉提取物的Cultivator（烧津水产化学工业株式会社）、乳糖、抗坏血酸钠等的培养基。

使用上述培养基，在培养温度20～45℃、厌气条件下，将长双歧杆菌JBL05株（NITEBP-82）搅拌或静置，边将pH控制在4～7、优选5～6，边进行12～60小时、优选15～50小时培养，由此，能够在培养液中产生粘性物质（多糖）。

为了从所得到的培养液回收多糖，可以使用加热、酶处理、离心、过滤、膜处理、过滤分离等本领域技术人员从培养液回收目的物质的通常方法。例如，对含有粘性物质（多糖）和微生物菌体的培养液进行离心，除去菌体。培养液的粘度高时，例如，能够用水稀释后，通过离心除去菌体。接着，在所得到的上清液中加入适当的有机溶剂，使蛋白质析出，例如通过离心分离除去沉淀，再在所得到的上清液中添加有机溶剂，使多糖沉淀，例如，通过离心分离回收多糖。详细而言，在除去了菌体的上清液中添加乙醇，使最终浓度为20容量%，进行离心分离、除去包含蛋白质的沉淀物，再在所得到的上清液中添加乙醇，使最终浓度为50容量%，进行离心分离、回收沉淀物，由此得到粗精制多糖。

或者，可以使用组合有机溶剂和阳离子回收多糖的方法。例如，也能够使用与利用1价阳离子和有机溶剂的回收方法、利用2价阳离子和有机溶剂的回收方法（日本特开昭58-5301号公报）、利用3价阳离子和有机溶剂的回收方法（日本特开昭59-196099号公报）等同样的方法。从提高多糖的回收率方面出发，优选使用阳离子。作为1价阳离子，可以列举钠离子、钾离子等。作为2价阳离子，可以列举镁离子、钙离子等。作为3价阳离子，可以列举铝离子等。通过将这些阳离子和乙醇等有机溶剂一起添加到含有多糖的粘性溶液中，能够回收更多的多糖。使用2价或3价的阳离子，能够比使用1价阳离子时更加提高多糖的回收率。

从所得到的粗精制多糖精制多糖，可以单独或组合进行本领域技术人员通常进行的方法，例如，使用离子交换树脂的组分分离、利用凝胶过滤的组分分离。使用离子交换树脂的方法没有特别限制，例如，可以列举使多糖吸附于阴离子交换树脂（例如，商品名DEAESephadexA-50（Pharmacia公司）等），外加氯化钠梯度液使多糖洗脱的方法。作为利用凝胶过滤的方法，可以列举使用商品名TOYOPEARL HW65S（TOSOH株式会社）等的方法等。

多糖的结构用以下的方法确定。首先，例如以甲酸、稀盐酸、三氟乙酸等酸水解精制得到的多糖，用HPLC分析该水解物，由此确定构成多糖的糖（单糖）。接着，通过通常方法将该酸水解物乙酰化，通过气体色谱进行分析（GC分析），求出构成糖的组成（构成糖的比例）。然后，通过通常方法将精制得到的多糖甲基化后，进行酸水解，将还原该水解物后乙酰化得到的生成物通过GC-MS（气体色谱/质量分析）等进行分析，确定多糖的结合形式。另外，通过NMR分析，明确各单糖之间的结合状态。通过在NADH存在下测定乳酸脱氢酶引起的丙酮酸向乳酸的还原，能够定性且定量地测定与多糖结合的丙酮酸。

长双歧杆菌JBL05株（NITE BP-82）能够产生具有以下特征的多糖：

（1）作为多糖的构成成分，包含半乳糖、葡萄糖和鼠李糖。

（2）半乳糖、葡萄糖和鼠李糖的摩尔比为3～5∶1～3∶1。

（3）在多糖中可以包含丙酮酸，此时的含有率为10质量%以下。

（4）分子量为约5～1000万、优选为约20～250万（凝胶渗透色谱/多角度激光光散射检测（GPC-MALLS）法）。

（5）多糖例如在半乳糖、葡萄糖和鼠李糖的摩尔比为4∶2∶1时，能够包含以下的式（Ⅰ）表示的重复结构：

具有上述特征的多糖，含有在按照以下实施例1中记载的工序得到的精制多糖组分中。

另外，多糖的分子量根据培养条件和回收、精制条件而变化。也能够通过培养条件等调整分子量。

具有这样结构的多糖，能够由从人体的肠内分离得到的长双歧杆菌JBL05株（NITEBP-82）产生得到，为了制备这样的多糖，也可以利用该微生物以外的微生物。这样的微生物，例如，能够通过分离肠内细菌、对判断为在菌的周围产生荚膜状的多糖的株的多糖进行分析来确定，多糖的回收和精制能够按照上述方法进行。

作为菌体外多糖产生双歧杆菌，例示长双歧杆菌JBL05株（NITEBP-82），但是，在本发明中也能够使用在菌体外产生双歧杆菌产生多糖的其它的双歧杆菌。

本发明中可以使用的菌体外多糖产生双歧杆菌，可以是含有在用于制备多糖的培养结束后从培养液得到的菌体的培养液。作为菌体外多糖产生双歧杆菌，能够将培养结束后的双歧杆菌培养液直接使用或使用含有通过离心分离、膜处理、过滤分离等得到的菌体的培养液。另外，也可以使用培养液的浓缩物、干燥物、破碎物等。作为干燥方法，例如，可以列举真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥、转鼓干燥等。也可以与菌体一起含有分散剂、研制剂等。能够以通常可以使用的方法作为活菌制备。另外，也能够使用将含有所得到的菌体的培养液、浓缩物、干燥物等提供给加热灭菌、放射线灭菌等的灭菌处理，根据需要进行破碎得到的死菌。在这样的菌体制备中可以使用的方法，按照本领域技术人员通常使用的方法进行。

（抗过敏剂）

双歧杆菌产生多糖或菌体外多糖产生双歧杆菌显示抗过敏作用。作为抗过敏作用，可以列举Th1/Th2平衡改善、Th17调节作用、炎症抑制作用、IgE产生抑制作用、组胺等化学递质游离抑制作用、淋巴细胞活性化作用等，但不受这些限定。因此，能够将双歧杆菌产生多糖或菌体外多糖产生双歧杆菌作为抗过敏剂使用，并且，提供含有双歧杆菌产生多糖或菌体外多糖产生双歧杆菌的抗过敏剂。

作为抗过敏剂，双歧杆菌产生多糖或菌体外多糖产生双歧杆菌能够在任意的组合物中含有。作为抗过敏剂产生的效果，可以列举Ⅰ型过敏症、Ⅳ型过敏症、特应性皮炎、接触性皮炎、过敏性皮炎、花粉症、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、支气管哮喘等的抑制，但不受这些限定。这样的组合物在过敏症状的预防或治疗中是有用的。优选能够抑制特应性皮炎或接触性皮炎。

这样的组合物能够在食品、医药品和化妆品的用途中使用。具体而言，组合物不受这些限定，例如，能够作为粉末、颗粒、片剂、胶囊剂、糊状、乳状、冻胶状、液体状制备、使用。根据需要，可以与赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味矫臭剂、助溶剂、悬浊剂、包覆剂等的无机物、有机物混合使用。关于食品、医药品和化妆品的制造，本领域技术人员能够使用众所周知的方法制造组合物。

双歧杆菌产生多糖的配合量能够根据其目的、用途、形态、剂型、症状、体重等任意确定，口服摄取或给药时，能够优选制备为每天摄取1mg～10g、更优选摄取10mg～2g。另外，通过向皮肤或粘膜涂布给药时，相对于制品的全部质量，优选含有0.001～10质量%、更优选含有0.01～1质量%。

另外，菌体外多糖产生双歧杆菌的配合量也能够根据其目的、用途、形态、剂型、症状、体重等任意确定，作为双歧杆菌数，优选设定为每天摄取10⁶～10¹²个、更优选设定为每天摄取10⁸～10¹¹个。

含有双歧杆菌产生多糖或菌体外多糖产生双歧杆菌的组合物能够作为口服用组合物使用。例如，口服用组合物通过口服摄取发挥抗过敏作用，因此，能够作为食品组合物或医药品组合物使用，并且，能够在口服给药用的医药品、流食、病人用食品、婴幼儿食品、营养功能食品、特定保健用食品等中添加。含有双歧杆菌产生多糖或菌体外多糖产生双歧杆菌的组合物，也能够在通常的饮料食品中配合，例如，可以列举牛奶、清凉饮料、果冻饮料等各种饮料、糖果、软糖、巧克力、饼干、薄脆饼干等各种糕点类、饭、面包、面条、调味汁等各种食品等，但不受这些限定。使用含有菌体外多糖产生双歧杆菌的活菌，使牛奶等发酵，也能够作为酸奶、发酵奶摄取。

含有双歧杆菌产生多糖的组合物能够作为外用剂组合物使用。例如，外用剂组合物通过对皮肤或粘膜涂布或给药发挥抗过敏作用，因此，能够作为化妆品组合物或医药品组合物使用。作为能够配合这样的组合物的化妆品，例如，可以列举洗颜料、化妆水、美容液、乳液、喷雾剂、面膜、面霜、软膏剂、入浴剂等，但不受这些限定。化妆品组合物也能够包括作为医药外用品制造销售的化妆品组合物。作为能够配合这样的组合物的医药品，可以列举向鼻内粘膜给药用的组合物（例如，滴鼻剂、喷雾剂等）、向眼内粘膜给药用的组合物（例如，滴眼剂、洗眼剂等）、向咽喉粘膜给药用的组合物（例如，含漱剂、漱口剂、喷雾剂、片剂等）等，但不受这些限定。另外，在这样的医药品中，也包括贴剂、外科敷料、急救创可贴等的卫生材料。

以下，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例限定。

实施例

（实施例1：菌体外多糖产生双歧杆菌的培养和双歧杆菌产生多糖的制备）

长双歧杆菌JBL05株（NITE BP-82）的培养和该微生物产生的多糖的精制，按照专利文献1的记载进行。更详细而言，如下所述。

在9质量%的脱脂乳溶液中，加入胰酶（天野酶制品株式会社）和硅，使最终浓度分别为0.36质量%和0.01质量%。接着，用10N NaOH将溶液的pH调整为8，在55℃使酶反应4小时，得到酶解脱脂乳。在其中，加入Cultivator（烧津水产化学工业株式会社）、乳糖和抗坏血酸钠，使最终浓度分别为3.0质量%、2.5质量%和0.2质量%，将其在121℃以高压釜灭菌15分钟，作为液体培养基使用。

使用上述制备得到的液体培养基，将先前培养得到的长双歧杆菌JBL05株（NITEBP-82）在5L相同的液体培养基中接种，使其为1%（v/v），在37℃进行40小时静置厌气培养，使粘性物质产生。将培养液离心分离、除去菌体后，在上清液中加入乙醇，使最终浓度为20%，将其在4℃静置保存。静置一晚后，通过离心分离除去包含蛋白质的沉淀物，在上清液中加入乙醇，使最终浓度为50%，将其在4℃静置保存。静置一晚后，通过离心分离回收沉淀物，将所得到的粗精制多糖组分冷冻干燥并保存。

使用DEAE Sephadex A-50填充柱，进一步分离粗精制多糖组分，将用0.07M～0.5M的NaCl洗脱得到的组分冷冻干燥，制成精制多糖组分。

（实施例2：双歧杆菌产生多糖的结构解析）

使用TOYOPEARL HW65S填充柱对实施例1中制备得到的精制多糖组分进行凝胶过滤，利用GPC-MALLS法研究分子量，结果为约54万。

接着，在凝胶过滤组分（多糖）中加入甲酸，进行水解。将该水解液减压干固后，再加入三氟乙酸进行水解，得到水解物。通过使用ION-300柱（东京化成工业株式会社生产）的HPLC分析可知，该多糖包含半乳糖、葡萄糖和鼠李糖。

通过通常方法，用硼氢化钠还原该水解生成物，使用R-225柱（J&W Scientific）GC分析加入乙酸酐和吡啶而乙酰化的产物。其结果判断为构成该多糖的半乳糖、葡萄糖和鼠李糖的摩尔比为4∶2∶1。

在上述水解生成物中，在NADH的存在下，使乳酸脱氢酶发挥作用，生成乳酸。因此，确认在该多糖组分中存在丙酮酸。另外，确认多糖中的丙酮酸含有率为5质量%。

为了明确多糖的结合形式，进行甲基化并进行分析。通过通常方法将凝胶过滤组分（多糖）甲基化后，加入甲酸，进行水解，对将该水解物还原后乙酰化得到的生成物进行GC-MS测定、分析。其结果为，得到1,5-二-O-乙酰基-2,3,4,6-四-O-甲基-葡糖醇、1,5-二-O-乙酰基-2,3,4,6-四-O-甲基-半乳糖醇、1,3,4,5-四-O-乙酰基-2,6-二-O-甲基-鼠李糖醇、1,3,5-三-O-乙酰基-2,4,6-三-O-甲基-半乳糖醇、1,4,5-三-O-乙酰基-2,3,6-三-O-甲基-葡糖醇、1,4,5-三-O-乙酰基-2,3,6-三-O-甲基-半乳糖醇和1,4,5,6-四-O-乙酰基-2,3-二-O-甲基-半乳糖醇的甲基化的糖。

另外，通过NMR分析，研究结合状态。从这些数据可知多糖具有以下结构Ⅰ（重复结构）。

（实施例3：双歧杆菌产生多糖的Th1/Th2平衡改善作用）

在水中溶解实施例1中制备得到的精制多糖组分，在包含以最终浓度为20μg/ml或200μg/ml的方式添加了牛胎儿血清和抗生物质（抗生物质－抗真菌剂混合溶液，Nacalaitesque）的RPMI-1640培养基中，在5%CO2下、在37℃将由C3H/HeJ大鼠（8周龄，雄性，CLEAJapan）制备得到的脾脏细胞培养72小时。回收培养上清液，用ELISA法（BIOSOURCE，Invitrogen）测定作为Th1型细胞因子的干扰素-γ（IFN-γ）浓度和作为Th2型细胞因子的白细胞介素-4（IL-4）浓度。作为对照，添加等量的水进行培养，同样地进行上述工序。

在图1（A）～（C）中表示结果。图1（A）是表示由双歧杆菌产生多糖对脾脏细胞体外刺激引起的IFN-γ产生的图。纵轴表示IFN-γ产生量（pg/ml），横轴表示试验区。图1（B）是表示由双歧杆菌产生多糖对脾脏细胞体外刺激引起的1L-4产生的图。纵轴表示1L-4产生量（pg/ml），横轴表示试验区。图1（C）是表示由双歧杆菌产生多糖对脾脏细胞体外刺激引起的IFN-γ与（IL-4）的产生比的图。纵轴表示IFN-γ相对于IL-4的比例（IFN-γ/IL-4），横轴表示试验区。

该结果确认了与添加了等量的水的对照相比，在精制多糖组分（双歧杆菌产生多糖）的添加时，浓度依存性的IFN-γ产生量的增加和IL-4产生量的减少。

因此，可以确认通过双歧杆菌产生多糖的添加，Th1型细胞因子的增加，显示Th1/Th2平衡中Th1成为优势。即，显示抗过敏作用。

（实施例4：双歧杆菌产生多糖的抗过敏作用）

在磷酸缓冲液（PBS）中溶解实施例1中制备得到的精制多糖组分，使用探针，将其对5只BALB/c大鼠（8周龄，雄性，株式会社纪和实验动物研究所）每天口服给药（20mg/kg体重/天）。作为对照，对5只每天只口服给药PBS。作为阳性对照，对5只每天口服给药（3mg/kg体重/天）脱氢可的松（Sigma）。在开始给药后第4天，在右耳廓涂布10μl在丙酮中溶解的0.3%的2,4,6-三硝基-1-氯苯（TNCB）（东京化成工业株式会社生产）（致敏），然后，在左耳廓只等量涂布丙酮。再从开始涂布TNCB（致敏）后第4天起，每隔1天，到第19天重复本处理。开始致敏后也继续上述的口服给药。从开始致敏日起，每次涂布TNCB，以游标卡尺测定耳廓的厚度。测定以每次相同的条件、由同一试验者进行，求出平均值（每组5只）。在开始致敏后第20天，进行耳廓的组织学观察。关于组织学观察，解剖后，由用10%中性缓冲甲醛（和光纯药工业株式会社）固定的耳廓制作切片，以苏木精·曙红（H&E）染色（委托株式会社AppliedMedical Reseach）后，以显微镜观察。

图2是表示口服给药了双歧杆菌产生多糖的大鼠的耳廓皮肤厚度平均值在开始致敏后的经时变化（每组5只）的图。纵轴表示耳廓皮肤厚度（mm），横轴表示致敏后经过天数（天）。黑点表示对照（仅PBS）涂布组，白点表示阳性对照（脱氢可的松）涂布组，黑三角表示双歧杆菌产生多糖涂布组。

图3是表示口服给药了双歧杆菌产生多糖的大鼠开始致敏后第20天的H&E染色耳廓切片的显微镜照片。从上段顺次表示对照（仅PBS）给药组、阳性对照（脱氢可的松）给药组和双歧杆菌产生多糖给药组。

与对照的口服给药PBS时相比，通过精制多糖组分（双歧杆菌产生多糖）的口服给药，与口服给药阳性对照的脱氢可的松时同样地，显著地抑制了耳廓厚度的增加（图2）。另外，耳廓的组织学观察结果显示，精制多糖组分（双歧杆菌产生多糖）的口服给药与口服给药阳性对照的脱氢可的松时同样地抑制耳廓中所诱导的炎症，抑制耳廓厚度的增加（图3）。即，显示抗过敏作用。

（实施例5：菌体外多糖产生双歧杆菌的抗过敏作用）

使用与实施例4同样的方法，研究长双歧杆菌JBL05株（活菌体）的效果。

使用探针，对5只BALB/c大鼠（8周龄，雄性，株式会社纪和实验动物研究所）每天口服给药（活菌体10⁸个/只/天）在PBS中悬浊的菌体外多糖产生双歧杆菌的长双歧杆菌JBL05株。作为对照，对5只每天只口服给药PBS。作为阳性对照，对5只每天口服给药（3mg/kg体重/天）脱氢可的松（Sigma）。在开始给药后第4天，在右耳廓涂布10μl在丙酮（Nacalai tesque株式会社）中溶解的0.3%的2,4,6-三硝基-1-氯苯（TNCB）（东京化成工业株式会社生产）（致敏），然后，在左耳廓只等量涂布丙酮。再从开始涂布TNCB（致敏）后第4天起，每隔1天，到第19天重复本处理。开始致敏后也继续上述的口服给药。从开始致敏日起，每次涂布TNCB，以游标卡尺测定耳廓的厚度。测定以每次相同的条件、由同一试验者进行，求出平均值（每组5只）。在开始致敏后第20天，进行耳廓的组织学观察。关于组织学观察，解剖后，由用10%中性缓冲甲醛（和光纯药工业株式会社）固定的耳廓制作切片，以苏木精·曙红（H&E）染色（委托株式会社Applied Medical Reseach）后，以显微镜观察。

图4是表示口服给药了菌体外多糖产生双歧杆菌的大鼠的耳廓皮肤厚度平均值在开始致敏后的经时变化（每组5只）的图。纵轴表示耳廓皮肤厚度（mm），横轴表示致敏后经过天数（天）。黑点表示对照（仅PBS）涂布组，白点表示阳性对照（脱氢可的松）涂布组，黑四方形表示菌体外多糖产生双歧杆菌涂布组。

图5表示口服给药了菌体外多糖产生双歧杆菌的大鼠在开始致敏后第20天的H&E染色耳廓切片的显微镜照片。从上段顺次表示对照组（仅PBS）给药组、阳性对照（脱氢可的松）给药组和菌体外多糖产生双歧杆菌给药组。

与对照的仅口服给药PBS时相比，长双歧杆菌JBL05株的活菌（菌体外多糖产生双歧杆菌）的口服给药显著地抑制了耳廓厚度的增加（图4）。另外，耳廓的组织学观察的结果也显示长双歧杆菌JBL05株的活菌体（菌体外多糖产生双歧杆菌）的口服给药抑制了耳廓中所诱导的炎症，抑制了耳廓厚度的增加（图5）。即，显示了抗过敏作用。

（实施例6：由双歧杆菌产生多糖涂布产生的抗过敏作用）

在9只NC/Nga大鼠（7周龄、雄性、日本SLC）的右耳廓，涂布10μl在丙酮（Nacalaitesque株式会社）中溶解的0.5%的2,4,6-三硝基-1-氯苯（TNCB）（东京化成工业株式会社生产）（致敏），然后，在左耳廓只等量涂布丙酮。再从开始涂布TNCB（致敏）后第4天起，每隔1天，重复2次本处理。以耳廓皮肤厚度均等的方式进行分组（每组3只）。从开始致敏后第9天起，对3只分别在耳廓表面和背面每天各涂布20μl在水中溶解（1mg/ml）的实施例1中制备得到的精制多糖组分。作为对照，对另外的3只同样地涂布水，作为阳性对照，再对另外的3只同样涂布在水中溶解的脱氢可的松（25mg/ml）。在涂布双歧杆菌产生多糖、水或脱氢可的松的30分钟以上前，2天涂布1次TNCB。从开始致敏日起，每次涂布TNCB，以游标卡尺测定耳廓的厚度。测定以每次相同的条件、由同一试验者进行，求出平均值（每组3只）。

图6是表示涂布了双歧杆菌产生多糖的大鼠的耳廓皮肤厚度在平均值开始致敏后的经时变化（每组3只）的图。纵轴表示耳廓皮肤厚度（mm），横轴表示致敏后经过天数（日）。黑点表示对照（只是水）涂布组，白点表示阳性对照（脱氢可的松）涂布组，黑三角表示双歧杆菌产生多糖涂布组。

与仅对照的涂布水时相比，精制多糖组分（双歧杆菌产生多糖）的涂布与阳性对照的脱氢可的松同样地抑制了耳廓厚度的增加（图6）。即，通过涂布也显示抗过敏效果。

工业上的可利用性

根据本发明，能够利用作为能够在人体的肠内优势地生存的菌双歧杆菌，发挥抗过敏效果。通过在食品、化妆品、医药品等中使用双歧杆菌产生多糖或菌体外多糖产生双歧杆菌，能够合适地利用该抗过敏作用。

Claims

1.从属于双歧杆菌属的微生物得到的多糖在抗过敏剂的制造中的使用，其特征在于：

所述属于双歧杆菌属的微生物是作为NITE BP-82保藏于国家技术评估学会专利微生物保藏中心的长双歧杆菌JBL05株，

所述多糖在构成成分中包含半乳糖、葡萄糖和鼠李糖，该多糖以3～5∶1～3∶1的摩尔比包含半乳糖、葡萄糖和鼠李糖，

并且，该多糖包含以下的结构，

2.属于双歧杆菌属的微生物在抗过敏剂的制造中的使用，其特征在于：

所述抗过敏剂含有微生物，

该微生物属于双歧杆菌属，是作为NITE BP-82保藏于国家技术评估学会专利微生物保藏中心的长双歧杆菌JBL05株，且在菌体外产生在构成成分中包含半乳糖、葡萄糖和鼠李糖的多糖，该多糖以3～5∶1～3∶1的摩尔比包含半乳糖、葡萄糖和鼠李糖，

并且，该多糖包含以下的结构，

3.如权利要求1所述的使用，其特征在于：

所述抗过敏剂是口服用组合物。

4.如权利要求1所述的使用，其特征在于：

所述抗过敏剂是外用剂组合物。

5.从属于双歧杆菌属的微生物得到的多糖在能够抑制特应性皮炎或接触性皮炎的药物的制造中的使用，其特征在于：

并且，该多糖包含以下的结构，

6.如权利要求5所述的使用，其特征在于：

所述能够抑制特应性皮炎或接触性皮炎的药物是外用剂组合物。