KR20130038845A

KR20130038845A - 항알레르기제

Info

Publication number: KR20130038845A
Application number: KR1020127027539A
Authority: KR
Inventors: 마미코 코노; 신이치 키타무라; 아이코 쇼조
Original assignee: 모리시타 진탄 가부시키가이샤
Priority date: 2010-03-24
Filing date: 2011-03-22
Publication date: 2013-04-18
Also published as: US20140154218A1; EP2551283A1; US20130005959A1; RU2012145123A; JP5737646B2; JP2011201781A; CN102812049A; AU2011230685B2; WO2011118552A1; RU2553354C2; AU2011230685A1; EP2551283A4; CA2793085A1

Abstract

본 발명에 의하면 항알레르기제가 제공되고, 이 항알레르기제는 갈락토스, 글루코스, 및 람노스를 구성 성분에 포함하는 다당, 또는 비피도박테리움속에 속하고 또한 당해 다당을 균체외에 산생하는 미생물을 포함한다. 본 발명의 항알레르기제는, 경구용 조성물 및 외용제 조성물 중 어느 것에도 사용되며, 식품, 의약품, 화장품 등에 적합하게 이용될 수 있다.

Description

항알레르기제{ANTI-ALLERGIC AGENT}

본 발명은 항알레르기제에 관한 것이다.

비피도박테리움(Bifidobacterium)속에 속하는 미생물(이하, 「비피더스균」이라고도 한다)은, 장내 우세균의 하나이며, 그 정장 작용 및 면역 조절 작용이 많이 보고되어 있다.

일부의 비피더스균은 균체외에 다당류를 산생(産生)하는 것이 보고되어 있지만, 그 대부분은, 다당의 특징적인 구성 성분 및 구조에 관한 보고였다. 비피더스균이 산생하는 다당의 기능에 관해서는, 면역 부활제에 관한 보고가 있다(특허문헌 1 및 2).

비피더스균과는 상이한 미생물이 산생하는 다당에 관해서는, 항알레르기 작용에 관한 몇개의 보고가 있다. 특허문헌 3에는, 락토바실러스속 미생물의 배양액으로부터 수득되는 다당을 유효 성분으로 하는 항염증제가 기재되어 있고, 특허문헌 4에는, 락토바실러스·퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)이 산생하는 다당을 유효 성분으로 하는 항염증 작용, 항알레르기 작용, 및 종양 증식 억제 작용을 포함하는 면역 조절제가 기재되어 있다. 특허문헌 5에는, 낫토균이 산생하는 다당류 레반을 유효 성분으로 하는 알레르기 억제 조성물이 기재되어 있다.

낫토균은 장내 상재균(常在菌)으로서 존재하는 미생물이 아니며, 또한, 건전한 장내에 있어서는, 유산균보다도 비피더스균이 압도적으로 우세하다. 장내 우세균인 비피더스균 중, 균체외에 다당을 산생하는 비피더스균에 관해서는, 항알레르기 작용에 관한 보고는 지금까지 없다.

국제공개 제07/007562호 일본 공개특허공보 제(소)58-203913호 일본 공개특허공보 제(평)7-70209호 일본 공개특허공보 2008-245576호 일본 공개특허공보 제2006-1922호

본 발명의 목적은 부작용의 우려가 없는 항알레르기제를 제공하는 것이다.

본 발명은 갈락토스, 글루코스, 및 람노스를 구성 성분에 포함하는 다당을 포함하는, 항알레르기제를 제공한다.

하나의 실시형태에서는, 상기 다당은 갈락토스, 글루코스, 및 람노스를 3 내지 5:1 내지 3:1의 몰비로 포함한다.

하나의 실시형태에서는, 상기 다당은 이하의 구조를 포함한다:

[화학식 I]

하나의 실시형태에서는, 상기 다당은 비피도박테리움속에 속하는 미생물로부터 수득되는 다당이다.

또 다른 실시형태에서는, 상기 비피도박테리움속에 속하는 미생물은, 비피도박테리움·롱검이다.

또 다른 실시형태에서는, 상기 비피도박테리움·롱검은, 비피도박테리움·롱검 JBL05주(NITE BP-82)이다.

본 발명은 또한 비피도박테리움속에 속하고 또한 상기 다당을 균체외에 산생하는 미생물을 포함하는, 항알레르기제를 제공한다.

하나의 실시형태에서는, 상기 균체외 다당 산생 비피더스균은, 비피도박테리움·롱검 JBL05주(NITE BP-82)이다.

본 발명은 또한, 상기 항알레르기제를 함유하는 경구용 조성물을 제공한다. 이 항알레르기제는 상기 비피더스균 산생 다당을 포함하는 항알레르기제 또는 상기 균체외 다당 산생 비피더스균을 포함하는 항알레르기제이다.

본 발명은 또한, 상기 항알레르기제를 함유하는 외용제 조성물을 제공한다. 이 항알레르기제는 상기 비피더스균 산생 다당을 포함하는 항알레르기제이다.

하나의 실시형태에서는, 상기 경구용 조성물 또는 외용제 조성물은, 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염을 억제하기 위한 것이다.

본 발명에 의하면, 부작용의 우려가 없는, 우수한 알레르기 억제 효과를 나타내는 항알레르기제가 제공된다.

도 1은 비장 세포에 대한 비피더스균 산생 다당의 인비트로 자극에 의한 인터페론-γ(IFN-γ)의 산생(A), 인터류킨-4(IL-4)의 산생(B), 및 IFN-γ와 IL-4의 산생비(C)를 도시하는 그래프이다.
도 2는 비피더스균 산생 다당을 경구 투여한 마우스의 귓바퀴 피부 두께 평균값의 감작 개시후의 경시 변화를 도시하는 그래프이다.
도 3은 비피더스균 산생 다당을 경구 투여한 마우스의 감작 개시후 20일째의 헤마톡실린·에오신(H&E) 염색 귓바퀴 절편의 현미경 사진을 도시한다.
도 4는 균체외 다당 산생 비피더스균을 경구 투여한 마우스의 귓바퀴 피부 두께 평균값의 감작 개시후의 경시 변화를 도시하는 그래프이다.
도 5는 균체외 다당 산생 비피더스균을 경구 투여한 마우스의 감작 개시후 20일째의 헤마톡실린·에오신(H&E) 염색 귓바퀴 절편의 현미경 사진을 도시한다.
도 6은 비피더스균 산생 다당을 도포한 마우스의 귓바퀴 피부 두께 평균값의 감작 개시후의 경시 변화를 도시하는 그래프이다.

(비피더스균 산생 다당 및 균체외 다당 산생 비피더스균)

본 발명에 있어서는, 갈락토스, 글루코스, 및 람노스를 구성 성분에 포함하는 다당이 사용된다. 이 다당은, 구성 당의 몰비가, 갈락토스:글루코스:람노스=3 내지 5:1 내지 3:1일 수 있다. 이 다당은, 예를 들면, 갈락토스:글루코스:람노스=4:2:1인 경우, 이하의 화학식 I로 나타내어지는 반복 구조를 포함할 수 있다.

[화학식 I]

화학식 I 중의 Galp는 갈락토피라노스, Glcp는 글루코피라노스, Rhap는 람노피라노스를 나타내고, 이들은 갈락토스, 글루코스, 및 람노스가 피라노스 구조를 취하는 것을 의미한다. 상기 다당에는, 피루브산이 추가로 포함되어도 좋고, 다당 중의 피루브산의 함유율은, 10질량% 이하일 수 있다. 다당의 구성 성분의 동정, 다당 중의 구성 성분의 함유량 또는 함유율의 측정, 및 다당의 구조 분석은, 이하에 상세하게 서술한다. 이러한 구조를 갖는 다당은, 비피도박테리움속에 속하는 미생물, 특히, 비피도박테리움·롱검, 예를 들면, 인간의 장내로부터 단리된 비피도박테리움·롱검 JBL05주(NITE BP-82)에 의해 산생될 수 있다. 따라서, 본 명세서 중에서는, 편의상, 이 다당을 「비피더스균 산생 다당」이라고도 하지만, 이 표현에 의해 다당을 산생하는 미생물을 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 있어서는, 비피도박테리움속에 속하고 또한 상기 다당을 균체외에 산생하는 미생물도 또한 사용된다. 「다당을 균체외에 산생한다」란, 미생물이 주위에 협막상(莢膜狀)의 다당을 산생하는 것을 말한다. 이 미생물을, 본 명세서 중에서는, 편의상, 「균체외 다당 산생 비피더스균」이라고도 한다.

본 발명에 있어서는, 비피더스균 산생 다당의 조제를 위해 사용되는 미생물로서, 또는 균체외 다당 산생 비피더스균으로서, 비피도박테리움·롱검 JBL05주(NITE BP-82)가 예시된다. 비피도박테리움·롱검 JBL05주(NITE BP-82)의 균학적 성질은 이하의 표 1과 같다.

이러한 표현 형질에 의한 분류학적 성질에 기초하여, JBL05주는, 버지즈·매뉴얼·오브·시스테마틱·박테리올로지(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology) Vol.2(1984)에 따라서 비피도박테리움·롱검이라고 동정되었다. 그리고, 2005년 3월 3일(원기탁일)에, 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터(NPMD)(주소: 우편번호 292-0818 일본국 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8)에 NITE BP-82로서 기탁되었다.

다당의 조제를 위해, 비피도박테리움·롱검 JBL05주(NITE BP-82)를 적절한 배지에서 배양할 수 있다. 배양의 순서를, 이하의 예시에 의해 설명하지만, 이 예시로 한정되지 않는다.

배지로서는, 비피도박테리움속에 속하는 미생물을 이용할 수 있는 탄소원 및 질소원, 및, 필요에 따라, 시스테인염산염, 아스코르빈산나트륨, 미량의 무기염 등을 포함하는 배지를 들 수 있다. 특히, 다당을 다량으로 조제하기 위해서는, 탈지유 또는 유(乳)성분을 포함하는 배지가 바람직하다. 이 경우, 탈지유를 프로테아제 등의 효소로 분해한 효소 분해 탈지유에, 어육 추출물인 컬티베이터(Cultivator)(야이즈 스이산가가쿠 고교 가부시키가이샤), 락토스, 아스코르빈산나트륨 등을 가한 배지가 바람직하게 사용될 수 있다.

상기 배지를 사용하여, 비피도박테리움·롱검 JBL05주(NITE BP-82)를, 배양 온도 20 내지 45℃에서, 혐기 조건하, 교반 또는 정치하고, pH를 4 내지 7, 바람직하게는 5 내지 6으로 제어하면서 12 내지 60시간, 바람직하게는 15 내지 50시간 배양을 실시함으로써, 배양액 중에 점성 물질(다당)이 산생될 수 있다.

수득된 배양액으로부터의 다당의 회수에는, 가열, 효소 처리, 원심, 여과, 막 처리, 여별 등의, 당업자가 통상, 배양액으로부터 목적 물질을 회수하는 방법이 사용된다. 예를 들면, 점성 물질(다당) 및 미생물 균체를 포함하는 배양액을 원심하고, 균체를 제거한다. 배양액의 점도가 높은 경우에는, 예를 들면, 물로 희석한 후, 원심함으로써, 균체를 제거할 수 있다. 이어서, 수득된 상청에 적절한 유기 용매를 가하여 단백질을 석출시키고, 예를 들면 원심 분리에 의해 침전을 제거하고, 또한 수득된 상청에 유기 용매를 첨가하여 다당을 침전시키고, 예를 들면 원심 분리에 의해, 다당을 회수한다. 상세하게는, 균체를 제거한 상청에, 최종 농도가 20용량%가 되도록 에탄올을 첨가하고, 원심 분리를 행하여 단백질을 포함하는 침전물을 제거하고, 또한 수득된 상청에 최종 농도가 50용량%가 되도록 에탄올을 첨가하고, 원심 분리를 행하여 침전물을 회수함으로써, 조(粗)정제 다당이 수득된다.

또는, 유기 용제와 양이온을 조합하여 다당을 회수하는 방법을 사용해도 좋다. 예를 들면, 1가의 양이온과 유기 용제를 사용하는 회수 방법, 2가의 양이온과 유기 용제를 사용하는 회수 방법(일본 공개특허공보 제(소)58-5301호), 3가의 양이온과 유기 용제를 사용하는 회수 방법(일본 공개특허공보 제(소)59-196099호) 등과 같은 방법을 사용할 수도 있다. 양이온은 다당의 회수율을 향상시키는 점에서, 바람직하게 사용된다. 1가 양이온으로서는, 나트륨 이온, 칼륨 이온 등을 들 수 있다. 2가 양이온으로서는, 마그네슘 이온, 칼슘 이온 등을 들 수 있다. 3가 양이온으로서는, 알루미늄 이온 등을 들 수 있다. 이들의 양이온을 에탄올 등의 유기 용제와 함께, 다당이 포함되는 점성 용액에 첨가함으로써, 보다 많은 다당을 회수할 수 있다. 2가 또는 3가의 양이온을 사용하는 편이, 1가의 양이온을 사용하는 경우보다도 다당의 회수율을 높이는 것이 가능하다.

수득된 조정제 다당으로부터의 다당의 정제는, 당업자가 통상 실시하는 방법, 예를 들면, 이온 교환 수지를 사용하는 분획, 겔 여과에 의한 분획 등을 단독 또는 조합하여 행한다. 이온 교환 수지를 사용하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 음이온 교환 수지(예를 들면, 상품명 DEAE Sephadex A-50(Pharmacia사) 등)에 다당을 흡착시켜 염화나트륨의 그래디언트에 걸쳐서 다당을 용출시키는 방법을 들 수 있다. 겔 여과에 의한 방법으로서는, 상품명 TOYOPEARL HW65S(토소 가부시키가이샤) 등을 사용하는 방법 등을 들 수 있다.

다당의 구조는 이하와 같은 방법으로 결정된다. 우선, 정제한 다당을, 예를 들면, 포름산, 희염산, 트리플루오로아세트산 등으로 산가수분해하고, 이 가수분해물을 HPLC로 분석함으로써, 다당을 구성하는 당(단당)이 결정된다. 이어서, 이 산가수분해물을, 통상적인 방법에 의해 아세틸화하고, 가스 크로마토그래피로 분석(GC 분석)함으로써, 구성 당의 조성(구성 당의 비율)이 구해진다. 또한, 정제한 다당을 통상적인 방법에 의해 메틸화한 후에 산가수분해하고, 이 가수분해물을 환원후 아세틸화하여 수득되는 생성물을 GC-MS(가스 크로마토그래피/질량 분석) 등으로 분석함으로써, 다당의 결합 양식이 결정된다. 또한, NMR 분석에 의해, 각 단당끼리의 결합 상태가 밝혀진다. 다당에 결합하고 있는 피루브산은, NADH 존재하, 락트산데하이드로게나제에 의한 피루브산의 락트산으로의 환원을 측정함으로써, 정성적 또한 정량적으로 측정할 수 있다.

비피도박테리움·롱검 JBL05주(NITE BP-82)는, 이하의 특징을 갖는 다당을 산생할 수 있다:

(1) 다당의 구성 성분으로서, 갈락토스, 글루코스, 및 람노스를 포함한다.

(2) 갈락토스와 글루코스와 람노스의 몰비는 3 내지 5:1 내지 3:1이다.

(3) 다당 중에는 피루브산이 포함되어도 좋고, 그 경우의 함유율은, 10질량%이하일 수 있다.

(4) 분자량은, 약 5만 내지 1000만, 바람직하게는 약 20만 내지 250만이다(겔 침투 크로마토그래피/다각도 레이저광 산란 검출(GPC-MALLS)법).

(5) 다당은, 예를 들면, 갈락토스와 글루코스와 람노스의 몰비가 4:2:1인 경우, 이하의 화학식 I로 나타내는 반복 구조를 포함할 수 있다.

[화학식 I]

상기의 특징을 갖는 다당은, 이하의 실시예 1에 기재된 순서에 따라서 수득되는 정제 다당 획분에 포함될 수 있다.

또한, 다당의 분자량은 배양 조건 및 회수·정제 조건에 의해 변화된다. 배양 조건 등에 의해 분자량을 조정하는 것도 가능하다.

이러한 구조를 갖는 다당은, 인간의 장내로부터 단리된 비피도박테리움·롱검 JBL05주(NITE BP-82)로부터 산생될 수 있지만, 이러한 다당의 조제를 위해 이 미생물 이외의 미생물을 이용해도 좋다. 그러한 미생물은, 예를 들면, 장내 세균을 분리하고, 균의 주위에 협막상의 다당을 산생하는 것이 판명된 주의 다당을 분석함으로써 결정될 수 있고, 다당의 회수 및 정제는, 상기에 준하여 행할 수 있다.

균체외 다당 산생 비피더스균으로서, 비피도박테리움·롱검 JBL05주(NITE BP-82)가 예시되지만, 비피더스균 산생 다당을 균체외에 산생하는 다른 비피더스균도 또한 본 발명에 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서 사용되는 균체외 다당 산생 비피더스균은, 다당을 조제하기 위한 배양 종료후에, 배양액으로부터 수득되는 균체를 포함하는 것이면 좋다. 균체외 다당 산생 비피더스균으로서, 배양 종료후의 비피더스균 배양액을 그대로, 또는, 원심 분리, 막 처리, 여별 등에 의해 수득된 균체를 포함하는 배양액이 사용될 수 있다. 배양액의 농축물, 건조물, 파쇄물 등도 또한 사용될 수 있다. 건조 방법으로서는, 예를 들면 진공 건조, 분무 건조, 동결 건조, 드럼 건조 등을 들 수 있다. 균체와 함께 분산제, 배산제(倍散劑) 등을 포함하고 있어도 좋다. 통상 사용되는 수법으로 생균으로서 조제할 수 있다. 또한, 수득된 균체를 포함하는 배양액, 농축물, 건조물 등을 가열 살균, 방사선 살균 등의 살균 처리에 제공하고, 필요에 따라 파쇄하여 수득되는 사균(死菌)도 또한 사용될 수 있다. 이러한 균체의 조제에 사용되는 수법은, 당업자가 통상 사용하는 수법에 따른다.

(항알레르기제)

비피더스균 산생 다당 및 균체외 다당 산생 비피더스균은, 항알레르기 작용을 나타낸다. 항알레르기 작용으로서는, Th1/Th2 밸런스 개선, Th17 조절 작용, 염증 억제 작용, IgE 산생 억제 작용, 히스타민 등의 케미칼 메디에이터 유리 억제 작용, 림프구 활성화 작용 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명에 의하면, 비피더스균 산생 다당 또는 균체외 다당 산생 비피더스균을 항알레르기제로서 사용할 수 있고, 그리고 비피더스균 산생 다당 또는 균체외 다당 산생 비피더스균을 포함하는 항알레르기제가 제공된다.

비피더스균 산생 다당 또는 균체외 다당 산생 비피더스균은, 항알레르기제로서, 임의의 조성물에 함유시킬 수 있다. 항알레르기제에 의한 효과로서는, I형 알레르기, IV형 알레르기, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 피부염, 화분증, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 기관지 천식 등의 억제를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 조성물은, 알레르기 증상의 예방 또는 치료에 유용하다. 바람직하게는, 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염을 억제할 수 있다.

이러한 조성물은 식품, 의약품 및 화장품의 용도에 사용할 수 있다. 조성물은, 구체적으로는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 페이스트상, 크림상, 젤리상, 액체상으로서 조제하고, 사용할 수 있다. 필요에 따라, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 교미 교취제, 용해 보조제, 현탁제, 코팅제 등의 무기물, 유기물과 혼합하여 사용할 수 있다. 조성물의 제조는 식품, 의약품 및 화장품의 제조에 관해서 당업자가 주지의 방법을 사용할 수 있다.

비피더스균 산생 다당의 배합량은, 그 목적, 용도, 형태, 제형, 증상, 체중 등에 따라 임의로 결정할 수 있지만, 경구 섭취 또는 투여의 경우, 1일당 1mg 내지 10g, 보다 바람직하게는, 10mg 내지 2g을 섭취할 수 있도록 조제되는 것이 바람직하다. 또한, 피부 또는 점막으로의 도포에 의해 투여하는 경우, 제품의 전질량에 대해 0.001 내지 10질량% 함유한 것, 보다 바람직하게는 0.01 내지 1질량% 함유한 것이 바람직하다.

균체외 다당 산생 비피더스균의 배합량도 또한, 그 목적, 용도, 형태, 제형, 증상, 체중 등에 따라 임의로 결정할 수 있지만, 비피더스균수로서, 1일당 10⁶ 내지 10¹²개, 보다 바람직하게는, 10⁸ 내지 10¹¹개 섭취할 수 있도록 정해지는 것이 바람직하다.

비피더스균 산생 다당 또는 균체외 다당 산생 비피더스균을 함유하는 조성물은, 경구용 조성물로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 경구용 조성물은, 경구 섭취에 의한 항알레르기 작용으로 인해, 식품 조성물 또는 의약품 조성물로서 사용될 수 있고, 그리고 경구 투여용의 의약품, 유동식, 환자용 식품, 유(乳)유아 식품, 영양 기능 식품, 특정 보건용 식품 등에 첨가할 수 있다. 비피더스균 산생 다당 또는 균체외 다당 산생 비피더스균을 포함하는 조성물은, 통상의 음식품에 배합할 수도 있고, 예를 들면, 우유, 청량 음료수, 젤리 음료 등의 각종 음료, 캔디, 구미, 초콜렛, 비스켓, 크래커 등의 각종 과자류, 밥, 빵, 우동, 드레싱 등의 각종 식품 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 균체외 다당 산생 비피더스균의 생균을 포함하는 조성물을 사용하여 우유 등을 발효시켜, 요구르트나 발효유로서 섭취할 수도 있다.

비피더스균 산생 다당을 함유하는 조성물은, 외용제 조성물로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 외용제 조성물은, 피부 또는 점막으로의 도포 또는 투여에 의한 항알레르기 작용으로 인해, 화장품 조성물 또는 의약품 조성물로서 사용될 수 있다. 이러한 조성물이 배합될 수 있는 화장품으로서는, 예를 들면, 세안료, 화장수, 미용액, 유액, 스프레이제, 팩 시트, 크림, 연고제, 입욕제 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 화장품 조성물은 의약 부외품으로서 제조 판매되는 것도 포함할 수 있다. 이러한 조성물이 배합될 수 있는 의약품으로서는, 코내 점막 투여용의 조성물(예를 들면, 점비제, 분무제 등), 눈 점막 투여용의 조성물(예를 들면, 점안제, 세안(洗眼)제 등), 인후 점막 투여용의 조성물(예를 들면, 가글제, 세구(洗口)제, 스프레이, 트로키 등) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 의약품에는 또한, 첩포제, 상처 보호제, 구급 반창고 등의 위생 재료도 포함된다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

(실시예 1: 균체외 다당 산생 비피더스균의 배양 및 비피더스균 산생 다당의 조제)

비피도박테리움·롱검 JBL05주(NITE BP-82)의 배양 및 당해 미생물이 산생하는 다당의 정제는, 특허문헌 1의 기재에 따랐다. 보다 상세하게는 이하와 같다.

9질량%의 탈지유 용액에, 판크레아틴(아마노 엔자임 가부시키가이샤) 및 실리콘을 각각 최종 농도가 0.36질량% 및 0.01질량%가 되도록 가하였다. 이어서, 10N NaOH로 용액의 pH를 8로 조정하고, 55℃에서 4시간 효소를 반응시켜 효소 분해 탈지유를 수득하였다. 여기에, 컬티베이터(야이즈 스이산가가쿠 고교 가부시키가이샤), 락토스, 및 아스코르빈산나트륨을, 각각 최종 농도로, 3.0질량%, 2.5질량%, 및 0.2질량%가 되도록 가하고, 이것을 121℃에서 15분간 오토클레이브에서 멸균하고, 액체 배지로서 사용하였다.

상기에서 조제한 액체 배지를 사용하여 전(前)배양한 비피도박테리움 롱검 JBL05주(NITE BP-82)를, 1%(v/v)가 되도록, 5L의 동일한 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 40시간 정치 혐기 배양을 행하여, 점성 물질을 산생시켰다. 배양액을 원심 분리하고, 균체를 제거한 후, 상청에 최종 농도 20%가 되도록 에탄올을 가하고, 이것을 4℃로 정치 보존하였다. 하룻밤 정치 후, 원심 분리에 의해 단백질을 포함하는 침전물을 제거하고, 상정에 최종 농도 50%가 되도록 에탄올을 가하고, 이것을 4℃에서 정치 보존하였다. 하룻밤 정치 후, 원심 분리에 의해 침전물을 회수하고, 수득된 조정제 다당 획분을 동결 건조시켜 보존하였다.

조정제 다당 획분을, DEAE Sephadex A-50 충전 컬럼을 사용하여 더욱 분획하고, 0.07M 내지 0.5M의 NaCl로 용출된 획분을 동결 건조시켜, 정제 다당 획분으로 하였다.

(실시예 2: 비피더스균 산생 다당의 구조 해석)

실시예 1에서 조제한 정제 다당 획분을 TOYOPEARL HW65S 충전 컬럼을 사용하여 겔 여과하고, GPC-MALLS법에 의해 분자량을 조사한 결과, 약 54만이었다.

다음에, 겔 여과 획분(다당)에 포름산을 가하고, 가수분해하였다. 이 가수분해액을 감압 건고후, 추가로 트리플루오로아세트산을 가하여 가수분해하고, 가수분해 생성물을 수득하였다. ION-300 컬럼(도쿄 가세이 고교 가부시키가이샤)을 사용한 HPLC 분석에 의해, 이 다당이, 갈락토스, 글루코스, 및 람노스로 구성되는 것을 알 수 있었다.

이 가수분해 생성물을 통상적인 방법에 의해 수소화붕소나트륨으로 환원하여, 무수아세트산과 피리딘을 가하여 아세틸화한 것을, R-225 컬럼(J&W Scientific)을 사용하여 GC 분석하였다. 그 결과, 이 다당을 구성하는 갈락토스와, 글루코스와, 람노스의 몰비는 4:2:1인 것으로 판정하였다.

상기 가수분해 생성물에, NADH의 존재하, 락트산데하이드로게나제를 작용시킨 결과, 락트산이 생성되었다. 따라서, 이 다당 획분에 피루브산이 존재하는 것이 확인되었다. 또한, 다당 중의 피루브산 함유율은, 5질량%인 것으로 확인되었다.

다당의 결합 양식을 밝히기 위해서, 메틸화하여 분석을 실시하였다. 겔 여과 획분(다당)을 통상적인 방법에 의해 메틸화한 후에 포름산을 가하여 가수분해 하고, 이 가수분해물을 환원후 아세틸화하여 수득된 생성물을 GC-MS 측정에 가하고, 분석하였다. 그 결과, 1,5-디-O-아세틸-2,3,4,6-테트라-O-메틸-글루시톨, 1,5-디-O-아세틸-2,3,4,6-테트라-O-메틸-갈락티톨, 1,3,4,5-테트라-O-아세틸-2,6-디-O-메틸-람니톨, 1,3,5-트리-O-아세틸-2,4,6-트리-O-메틸-갈락티톨, 1,4,5-트리-O-아세틸-2,3,6-트리-O-메틸-글루시톨, 1,4,5-트리-O-아세틸-2,3,6-트리-O-메틸-갈락티톨, 및 1,4,5,6-테트라-O-아세틸-2,3-디-O-메틸-갈락티톨의 메틸화된 당이 수득되었다.

또한, NMR 분석에 의해, 결합 상태를 검토하였다. 이들의 데이터로부터, 다당은, 이하의 구조 I(반복 구조)를 갖는 것을 알 수 있었다.

[화학식 I]

(실시예 3: 비피더스균 산생 다당의 Th1/Th2 밸런스 개선 작용)

실시예 1에서 조제한 정제 다당 획분을 물에 용해하고, 최종 농도 20㎍/ml 또는 200㎍/ml가 되도록 첨가한, 소 태아 혈청 및 항생 물질(항생 물질-항진균제 혼합 용액, 나카라이테스크)을 포함하는 RPMI-1640 배지 중에서, C3H/HeJ 마우스(8주령, 수컷, 니혼 클레아)로부터 조제한 비장 세포를, 5% C0₂하에서 37℃에서 72시간 배양하였다. 배양 상청을 회수하고, Th1형 사이토카인인 인터페론-γ(IFN-γ) 농도 및 Th2형 사이토카인인 인터류킨-4(IL-4) 농도를 ELISA법(BIOSOURCE, Invitrogen)으로 측정하였다. 컨트롤로서, 동량의 물을 첨가하여 배양하고, 마찬가지로 상기 순서를 실시하였다.

결과를 도 1a 내지 도 1c에 도시한다. 도 1a는, 비장 세포에 대한 비피더스균 산생 다당의 인비트로 자극에 의한 IFN-γ의 산생을 도시하는 그래프이다. 세로축은 IFN-γ 산생량(pg/ml)을 나타내고, 가로축은 시험구를 나타낸다. 도 1b는, 비장 세포에 대한 비피더스균 산생 다당의 인비트로 자극에 의한 IL-4의 산생을 도시하는 그래프이다. 세로축은 IL-4 산생량(pg/ml)을 나타내고, 가로축은 시험구를 나타낸다. 도 1c는, 비장 세포에 대한 비피더스균 산생 다당의 인비트로 자극에 의한 IFN-γ와 IL-4의 산생비를 도시하는 그래프이다. 세로축은 IL-4에 대한 IFN-γ의 비율(IFN-γ/IL-4)을 나타내고, 가로축은 시험구를 나타낸다.

이 결과, 정제 다당 획분(비피더스균 산생 다당)의 첨가에서는, 동량의 물을 첨가한 컨트롤과 비교하여 농도 의존적으로, IFN-γ 산생량의 증가와 IL-4 산생량의 감소가 확인되었다.

따라서, 비피더스균 산생 다당의 첨가에 의해, Th1형 사이토카인의 증가가 확인되고, Th1/Th2 밸런스가 Th1 우위가 되는 것이 나타났다. 즉, 항알레르기 작용이 나타났다.

(실시예 4: 비피더스균 산생 다당의 항알레르기 작용)

실시예 1에서 조제한 정제 다당 획분을 인산 완충액(PBS)에 용해하고, 이것을 존데를 사용하여, BALB/c 마우스(8주령, 수컷, 가부시키가이샤 키와 실험 동물 연구소) 5마리에게 매일 경구 투여하였다(20mg/kg체중/일). 컨트롤로서, PBS만을 5마리에게 매일 경구 투여하였다. 포지티브 컨트롤로서, 프레드니솔론(Sigma)을 5마리에게 매일 경구 투여하였다(3mg/kg체중/일). 투여 개시후 4일째에, 오른쪽 귓바퀴에, 아세톤(나카라이 테스크)에 용해한 0.3%의 2,4,6-트리니트로-1-클로로벤젠(TNCB)(도쿄 가세이 고교 가부시키가이샤)을 10㎕ 도포하고(감작), 그리고 왼쪽 귓바퀴에, 아세톤만을 동량 도포하였다. 또한, TNCB 도포(감작) 개시후 4일째부터 1일 간격으로 19일째까지 본 처치를 반복하였다. 감작 개시후에도, 상기의 경구 투여는 계속하였다. 감작 개시일부터, TNCB의 도포마다 귓바퀴의 두께를 노기스로 측정하였다. 측정은 매회 동일한 조건으로, 동일 시험자가 행하여, 평균값을 구하였다(각 군 5마리). 감작 개시후 20일째에 귓바퀴의 조직학적 관찰을 행하였다. 조직학적 관찰에 관해서는, 해부후, 10% 중성 완충 포르말린(와코 쥰야쿠 고교 가부시키가이샤)으로 고정시킨 귓바퀴로부터 절편을 제작하고, 헤마톡실린·에오신(H&E)으로 염색한(가부시키가이샤 어플라이드 메디칼 리서치 위탁) 후, 현미경 관찰하였다.

도 2는, 비피더스균 산생 다당을 경구 투여한 마우스의 귓바퀴 피부 두께 평균값의 감작 개시후의 경시 변화(각 군 5마리)를 도시하는 그래프이다. 세로축은 귓바퀴 피부 두께(mm)를 나타내고, 가로축은 감작후 경과 일수(일)를 나타낸다. 검은 동그라미 컨트롤(PBS만) 투여군, 흰 동그라미는 포지티브 컨트롤(프레드니솔론) 투여군, 검은 삼각은 비피더스균 산생 다당 투여군을 나타낸다.

도 3은, 비피더스균 산생 다당을 경구 투여한 마우스의 감작 개시후 20일째의 H&E 염색 귓바퀴 절편의 현미경 사진을 도시한다. 상단에서부터 순차적으로, 컨트롤(PBS만) 투여군, 포지티브 컨트롤(프레드니솔론) 투여군, 및 비피더스균 산생 다당 투여군을 나타낸다.

정제 다당 획분(비피더스균 산생 다당)의 경구 투여에 의해, 포지티브 컨트롤의 프레드니솔론을 경구 투여했을 때와 같이, 컨트롤의 PBS를 경구 투여했을 때와 비교하여, 귓바퀴 두께의 증가를 유의적으로 억제하였다(도 2). 귓바퀴의 조직학적 관찰의 결과도 또한, 정제 다당 획분(비피더스균 산생 다당)의 경구 투여가, 포지티브 컨트롤의 프레드니솔론의 경구 투여와 같이, 귓바퀴로 유도되는 염증을 억제하고, 귓바퀴 두께의 증가를 억제하는 것을 나타낸다(도 3). 즉, 항알레르기 작용을 나타내었다.

(실시예 5: 균체외 다당 산생 비피더스균의 항알레르기 작용)

실시예 4와 같은 방법을 사용하여, 비피도박테리움·롱검 JBL05주(생균체)의 효과를 검토하였다.

PBS에 현탁한 균체외 다당 산생 비피더스균 비피도박테리움·롱검 JBL05을, 존데를 사용하여, BALB/c 마우스(8주령, 수컷, 가부시키가이샤 키와 실험 동물 연구소) 5마리에게 매일 경구 투여하였다(생균체 10⁸개/마리/일). 컨트롤로서 PBS만을 5마리에게 매일 경구 투여하였다. 포지티브 컨트롤로서, 프레드니솔론(Sigma)을 5마리에게 매일 경구 투여하였다(3mg/kg체중/일). 투여 개시후 4일째에, 오른쪽 귓바퀴에, 아세톤(나카라이 테스크 가부시키가이샤)에 용해한 0.3%의 2,4,6-트리니트로-1-클로로벤젠(TNCB)(도쿄 가세이 고교 가부시키가이샤)을 10㎕ 도포하고(감작), 그리고 왼쪽 귓바퀴에, 아세톤만을 동량 도포하였다. 또한 TNCB 도포(감작) 개시후 4일째부터 1일 간격으로 19일째까지 본 처치를 반복하였다. 감작 개시후에도, 상기의 경구 투여는 계속하였다. 감작 개시일부터, TNCB의 도포마다 귓바퀴의 두께를 노기스로 측정하였다. 측정은, 매회 동일한 조건으로, 동일 시험자가 행하여, 평균값을 구하였다(각 군 5마리). 감작 개시후 20일째에 귓바퀴의 조직학적 관찰을 행하였다. 조직학적 관찰에 관해서는, 해부후, 10% 중성 완충 포르말린(와코 쥰야쿠 고교 가부시키가이샤)으로 고정시킨 귓바퀴로부터 절편을 제작하고, 헤마톡실린·에오신(H&E)으로 염색한(가부시키가이샤 어플라이드 메디칼 리서치 위탁) 후, 현미경 관찰하였다.

도 4는, 균체외 다당 산생 비피더스균을 경구 투여한 마우스의 귓바퀴 피부 두께 평균값의 감작 개시후의 경시 변화(각 군 5마리)를 도시하는 그래프이다. 세로축은 귓바퀴 피부 두께(mm)를 나타내고, 가로축은 감작후 경과 일수(일)를 나타낸다. 검은 동그라미는 컨트롤(PBS만) 투여군, 흰 동그라미는 포지티브 컨트롤(프레드니솔론) 투여군, 검은 사각은 균체외 다당 산생 비피더스균 투여군을 나타낸다.

도 5는, 균체외 다당 산생 비피더스균을 경구 투여한 마우스의 감작 개시후20일째의 H&E 염색 귓바퀴 절편의 현미경 사진을 도시한다. 상단에서부터 순차적으로, 컨트롤(PBS만) 투여군, 포지티브 컨트롤(프레드니솔론) 투여군, 및 균체외 다당 산생 비피더스균 투여군을 나타낸다.

비피도박테리움·롱검 JBL05주의 생균(균체외 다당 산생 비피더스균)의 경구 투여는, 컨트롤의 PBS만 경구 투여와 비교하여, 귓바퀴 두께의 증가를 유의적으로 억제하였다(도 4). 귓바퀴의 조직학적 관찰의 결과도 또한, 비피도박테리움·롱검 JBL05주의 생균체(균체외 다당 산생 비피더스균)의 경구 투여가, 귓바퀴로 유도되는 염증을 억제하고, 귓바퀴 두께의 증가를 억제하는 것을 나타낸다(도 5). 즉, 항알레르기 작용을 나타내었다.

(실시예 6: 비피더스균 산생 다당의 도포에 의한 항알레르기 작용)

NC/Nga 마우스(7주령, 수컷, 니혼 SLC) 9마리의 오른쪽 귓바퀴에, 아세톤(나카라이 테스크)에 용해한 0.5%의 2,4,6-트리니트로-1-클로로벤젠(TNCB)(도쿄 가세이 고교 가부시키가이샤)을 10㎕ 도포하고(감작), 그리고 왼쪽 귓바퀴에, 아세톤만을 동량 도포하였다. 또한, TNCB 도포(감작) 개시후 4일째부터 1일 간격으로 본 처치를 2회 반복하였다. 귓바퀴 피부 두께가 균등해지도록 군 분류하였다(각 군 3마리). 감작 개시후 9일째부터, 3마리에게, 실시예 1에서 조제한 정제 다당 획분을 물에 용해(1mg/ml)하여, 귓바퀴 안팎에 각 20㎕씩, 매일 도포하였다. 다른 3마리에게 컨트롤로서 물을, 또 다른 3마리에게 포지티브 컨트롤로서 물에 용해한 프레드니솔론(25mg/ml)을 마찬가지로 도포하였다. 비피더스균 산생 다당, 물, 또는 프레드니솔론을 도포하기 30분 이상 전에, 2일에 1회 TNCB를 도포하였다. 감작 개시일부터, TNCB의 도포마다 귓바퀴의 두께를 노기스로 측정하였다. 측정은, 매회 동일한 조건으로, 동일 시험자가 행하여, 평균값을 구하였다(각 군 3마리).

도 6은 비피더스균 산생 다당을 도포한 마우스의 귓바퀴 피부 두께 평균값의 감작 개시후의 경시 변화(각 군 3마리)를 도시하는 그래프이다. 세로축은 귓바퀴 피부 두께(mm)를 나타내고, 가로축은 감작후 경과 일수(일)를 나타낸다. 검은 동그라미는 컨트롤(물만) 도포군, 흰 동그라미는 포지티브 컨트롤(프레드니솔론) 도포군, 검은 삼각은 비피더스균 산생 다당 도포군을 나타낸다.

정제 다당 획분(비피더스균 산생 다당)의 도포는, 포지티브 컨트롤의 프레드니솔론과 같이, 컨트롤의 물만 도포와 비교하여, 귓바퀴 두께의 증가를 억제하였다(도 6). 즉, 도포에 의해서도 항알레르기 작용을 나타내었다.

본 발명에 의하면, 인간의 장내에 우세하게 생식할 수 있는 균인 비피더스균을 이용하여, 항알레르기 효과를 나타낼 수 있다. 비피더스균 산생 다당 또는 균체외 다당 산생 비피더스균을 식품, 화장품, 의약품 등에 사용함으로써, 그 항알레르기 작용을 적합하게 이용할 수 있다.

Claims

갈락토스, 글루코스, 및 람노스를 구성 성분에 포함하는 다당을 포함하는, 항알레르기제.
제1항에 있어서, 상기 다당이, 갈락토스, 글루코스, 및 람노스를 3 내지 5:1 내지 3:1의 몰비로 포함하는, 항알레르기제.
제2항에 있어서, 상기 다당이, 이하의 구조를 포함하는, 항알레르기제.
[화학식 I]
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 다당이, 비피도박테리움속에 속하는 미생물로부터 수득되는 다당인, 항알레르기제.
제4항에 있어서, 상기 비피도박테리움속에 속하는 미생물이, 비피도박테리움·롱검인, 항알레르기제.
제5항에 있어서, 상기 비피도박테리움·롱검이, 비피도박테리움·롱검 JBL05주(NITE BP-82)인, 항알레르기제.
미생물을 포함하는 항알레르기제로서,
당해 미생물이,
비피도박테리움속에 속하고, 또한,
갈락토스, 글루코스, 및 람노스를 구성 성분에 포함하는 다당을 균체외에 산생(産生)하는,
항알레르기제.
제7항에 있어서, 상기 다당이, 갈락토스, 글루코스, 및 람노스를 3 내지 5:1 내지 3:1의 몰비로 포함하는, 항알레르기제.
제8항에 있어서, 상기 다당이, 이하의 구조를 포함하는, 항알레르기제.
[화학식 I]
제7항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이, 비피도박테리움·롱검 JBL05주(NITE BP-82)인, 항알레르기제.
제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 기재된 항알레르기제를 함유하는, 경구용 조성물.
제11항에 있어서, 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염을 억제하기 위한, 경구용 조성물.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 기재된 항알레르기제를 함유하는, 외용제 조성물.
제13항에 있어서, 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염을 억제하기 위한, 외용제 조성물.