KR20100086321A - 폴리―ν―아세틸 글루코사민을 생성하는 스타필로코커스 사프로파이티커스 ｂｍｓｚ711 및 이로부터 폴리―ν―아세틸 글루코사민을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 토양으로부터 분리된, 폴리-Ν-아세틸글루코사민을 주성분으로 포함하는 엑소바이오폴리머를 생산하는 신규 균주인 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711 에 관한 것이다. 또한, 상기 균주로부터 폴리-Ν-아세틸글루코사민을 생산하는 방법 및 이로부터 생산된 폴리-Ν-아세틸글루코사민에 관한 것이다.

스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711, 폴리-Ν-아세틸글루코사민 생산균주, 글리세롤, 폴리-Ν-아세틸글루코사민, 글루코사민

Description

폴리―Ν―아세틸 글루코사민을 생성하는 스타필로코커스 사프로파이티커스 ＢＭＳＺ711 및 이로부터 폴리―Ν―아세틸 글루코사민을 생산하는 방법{Staphylococcus saprophyticus BMSZ711 producing poly-Ν-acetylglucosamine and method for producing poly―Ν―acetylglucosamine from Staphylococcus saprophyticus BMSZ711}

본 발명은 폴리-Ν-아세틸글루코사민을 주성분으로 포함하는 엑소바이오폴리머를 생산하는 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711, 상기 균주로부터 폴리-Ν-아세틸글루코사민을 생산하는 방법 및 이로부터 생산된 폴리-Ν-아세틸글루코사민에 관한 것이다.

Ν-아세틸 글루코사민의 기본 구조 유닛을 가지는 아미노당인 키틴 올리고당 (chitin oligosaccharides)으로 알려진 폴리-Ν-아세틸 글루코사민 (Poly-Ν-acetyl glucosamine: PNAG)은 항암제 활성과 유도작용 (elicitor action)와 같은 다양한 생물학적 활성으로 인하여 다각적 명성을 가지게 되었다. Ν-아세틸-글루코사민은 Ν-아세틸 아민기를 포함하는 아미노-당 또는 포도당 유사체 (analog) 이고, D-글루코사민은 아미노기만 포함하는 아미노-당 또는 포도당 유사체이다. 이 들 단위체 (monomer)가 선형으로 중합되었을 때, 폴리 Ν-아세틸-글루코사민 및 폴리-글루코사민을 각각 형성한다.

글루코사민 또는 그 유도체 (derivatives) Ν-아세틸-글루코사민은 동물과 인간 연골의 빌딩블럭 (building block)이고 또한 곰팡이(fungi)의 세포벽 및 곤충, 새우, 게의 외부 골격 (external skeleton)에서 발견되는 키틴 (chitin)의 빌딩블럭이다. 미생물은 포도당, 글루코사민 (키토산), 또는 Ν-아세틸글루코사민 (키틴)을 포함하는 엑소바이오폴리머를 생산한다. 글루코사민은 박테리아, 효모, 곰팡이, 식물 및 동물과 같은 모든 유기체에서 생산된다.

Ν-아세틸 글루코사민, 글루코사민 및 그것의 에피머 (epimer) 갈락토사민은 프로테오글리칸(proteoglycans)(단백질 코어에 당쇄가 결합된) 및 글리코단백질 (glycoproteins)(약간의 당이 결합된 단백질) 으로 불리는 거대 구조 분자에서 발견된다. 히아루론산(hyaluronic acid) (Ν-아세틸-D-글루코사민과 글루쿠론산의 아주 긴 중합체)으로 알려진 히아루로난 (Hyaluronan) 과 황산콘드로이틴(chondroitin sulphate)(Ν-아세틸갈락토사민과 글루쿠론산의 매우 긴 중합체)이 그러한 구조 분자이다.

프로테오글리칸과 글리코단백질은 세포 표면과 세포외부의 매트릭스 (extracellular matrix)에서 발견된다. 프로테오글리칸은 결합조직에서 윤활제 (lubricants) 와 지지요소로 기능한다. 세포 표면에서 프로테오글리칸은 세포외부의 매트릭스와 상호작용한다. 다량의 물을 흡수하여 점성과 탄성을 가지는 용액을 형성한다. 글리코단백질은 세포 집단행동(group behavior)의 결정자와 상피조 직의 윤활제로 역할을 하는 것으로 보인다. 세포 표면의 글리코단백질은 통신, 세포 구조 및 면역계에 의한 자기인식(self-recognition)에 대한 역할을 수행한다. 많은 펩타이드 호르몬은 글리코단백질이다. 예를 들어, FSH(follicle stimulating hormone)은 뇌하수체에서 분비되는 글리코단백질로, 생식선에서 기능을 한다. 글리코단백질의 당쇄에서 일반적인 당 유닛은 포도당, 갈락토즈, 만노즈, 프럭토즈, N-아세틸갈락토사민 및 N-아세틸-D-글루코사민 등을 포함한다. 프로테오글리칸의 기본 구조는 특정 세린 아미노산에 공유 결합된 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)으로 불리는 1 내지 백여개의 당쇄를 가지는 단백질 코어로 이루어져 있다. 글리코단백질과는 결합된 탄수화물에 근거하여 프로테오글리칸과는 구별 가능한다. 글리코사미노글리칸은 반복된 이당 서브유닛으로 이루어진 반면, 글리코단백질에 결합된 당은 일련의 반복 유닛이 없다. 우론산 (uronic acid)과 육탄당 (hexose), 가장 흔하게는 N-아세틸-D-글루코사민 또는 그의 에피머 N-아세틸갈락토사민이 이당 서브유닛을 구성한다.

히아루로난은 글리코사미노글리칸의 중요한 한 부류이며 히아루론산으로 알려져 있으며, 피부, 연골 및 관절의 활액, 눈의 유리체액 및 탯줄과 같은 대부분의 체액에 광범위하게 분포한다. 히아루론산 합성 공정에서 N-아세틸글루코사민은 반복 유닛의 구성 단위체이다.

황산콘드로이틴은 연골의 주요 글리코사미노글리칸이다. 건 (tendon), 인대 (ligament), 및 대동맥(aorta)의 주요 성분이며, 뇌, 신장 및 폐 조직에서 분리되었다. 콘드로이틴은 N-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)과 글루쿠론 산(glucuronic acid)의 공중합체이다. N-아세틸갈락토사민은 가역적인 이성질체화 반응 (epimerization reaction)에서 N-아세틸-D-글루코사민으로부터 획득된다.

인간의 경우, 글루코사민은 건강한 연골과 관절 기능을 복구 또는 유지하는데 필요한 글루코사민-글리칸 (히아루로산, 황산콘드로이틴, 및 황산케라틴과 같은) 이당류 유닛 (disaccharide units)의 전구체이다. 글루코사민은 프로테오글리칸 및 글리코사미노글리칸과 같은 중합체 쇄의 구성 요소로, 이들은 건강한 연골의 복구와 유지에 필요하나, 노화가 되면서 프로테오글리칸 생성에 대한 기능상실이 점차 나타나고 노년 골관절염이 생기게 된다. 골관절염 (osteoarthritis) 치료에 글루코사민을 이용하는 임상적 시도가 1980년 대 초에 시작하였다. 그 이후, 식이보충제(dietary supplement)로서 글루코사민의 사용은 증가하였다. 폴리-Ν-아세틸 글루코사민 또는 폴리 글루코사민은 준의약적, 또는 약학적 제제 또는 면역조절제와 같은 다양한 기능을 한다.

우선, PNAG/ PGA는 골관절염 및 관절 통증 경감제로 기능한다. 많은 연구자들은 골관점염과 관절 통증에 대한 통증경감성분으로서의 글루코사민의 효능을 살펴보았다. 연구 결과, 글루코사민은 프로스타글란딘(prostaglandin) 합성을 억제시키지 않고 동물 모델에서 항-염증활성을 조절할 뿐만 아니라, 프로테오글리칸의 합성을 촉진하였다. 뮬러-파벤더 (Muller- Fabbender) 등은 경구용 글루코사민에 대한 임상적 시도를 하였으며 무릎의 골관절염 치료에 있어서 이부프로펜과 동일하게 효과적인 것을 발견하였다. 이부프로펜이 글루코사민보다 빠르게 작용하였으나 부작용을 가졌다. 노아크 (Noack) 등은 글루코사민이 경구투여되었을 때 위 약 (placebo) 투여받은 경우보다, 무릎에 골관절염을 가지는 환자는 무릎의 퇴행성 관절염의 심각성에 대한 레스퀸 지표 (Lesquene index)와 같은 결과가 감소하는 것을 발견하였다. 약에 대한 반응은 무릎의 퇴행성 관절염에 대한 레스퀸 지표에서 3 포인트의 감소로 정의되며, 37% 환자가 플라시보에 대해서 반응한 것에 비하여 글루코사민에 대해서는 52% 환자가 반응하였다.

또한, PNAG / PGA는 백신 타겟으로 이용된다. 지난 25년 동안, 그람 양성 구균, 특히 S. aureus 와 S.epidermidis 는 병원내 감염에서 주로 분리되는 세균들이다. 이처럼 병원내에서 세균에 의한 감염이 증가하는 것은 세균들의 항생제 저항성 (antimicrobial resistance)의 증가에 의한 것이며, 이는 감염을 예방 및 조절하기 위하여 백신과 같은 대안적 전략에 대한 강한 관심을 가지게 하였다.

또한, PNAG는 면역 유도인자 (immunity inducer) 로 이용될 수 있다. 아주마 (Azuma) 등이 수행한 일련의 연구에 의하면, 일부 PNAG는 면역수준의 척도가 되는 대식세포 기능을 상향조절시킬 수 있으며 (TNF, IL-1 등으로 측정), 1 내지 10 μm PNAG 입자로 투여된 생쥐에서 선천성면역반응이 증가된 것으로 밝혀졌다. 또한, PNAG는 마이코박테리아의 항원 및 결핵 (tuberculosis)와 같은 감염에 대하여 대항하는 Th1 면역개발에 대하여 특이적 Th1 보조효과를 가지는 것으로 밝혀졌다.

키틴과 같은 일반적으로 유명한 PNAG 는 새우, 게, 오징어, 갑오징어에서 화학적 공정을 통하여 생산된다. 키틴 생산에서 기본 원리는 알카리 (새우 및 게의 경우 주로 단백질을 제거) 및 희석된 산 (주로 탄산칼슘인 미네랄을 제거) 처리를 견딜 수 없는 모든 물질을 제거하는 것이다. 반응하지 않은 화학물질을 세척한 후 에 남은 잔여물이 키틴이다. 키틴의 키토산으로의 전환은 알카리 50 %를 처리하여 달성된다. 일반적으로, GlcN은 게와 새우 껍데기 (shell) 로부터 추출한 키틴을 산 가수분해시켜 생산된다. 농축 염산은 중합체를 절단하고 GlcNAc를 탈아세틸화시켜 글루코사민 (glucosamin: GlcN)을 생산시킨다. GlcNAc은 아세트산무수물을 이용하여 GlcN을 아세틸화시켜서 생산된다. 그러나, 수요가 증가함에 따라, PNAG 또는 GlcNAc 생산은 원료 공급 변동에 의해 제한받을 수 있다. 또한, 갑각류 기원의 PNAG는 갑각류 알레르기를 가지는 사람에게 적합하지 않다. 또한, 화학 공정은 환경적으로 유해한 알카리와 산 폐기물의 생성, 낮은 수율 및 고비용과 같은 더 큰 문제점을 가진다.

따라서, 본 연구는 폴리-Ν-아세틸글루코사민 생산이 가능한 신규 균주를 분리하는 것이다. 토양으로부터 분리된 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711가 폴리-Ν-아세틸글루코사민를 효율적으로 생산할 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 폴리-Ν-아세틸글루코사민을 주성분으로 포함하는 엑소바이오폴리머를 생산하는 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711 (생물자원센터 기탁번호 KCTC 11407BP, 기탁일자 2008년 10월 24일)에 관한 것이다.

토양에서 채취하여 배양한 균주 증에서 글루코사민의 생성을 HPAEC (High Performance Anion Exchange Chromatography)로 체크하여 가장 높은 생산능을 보이 는 균주를 선별하고, 선발된 균주는 표 1에서 기재된 바와 같은 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 가지는 글루코사민 생산능을 가지는 새로운 균주임을 입증하였다. 이를 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711로 명명하고 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 11407BP로 기탁하였다.

본 발명의 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711 균주의 배지 배양액으로부터 정제된 글루코사민 풍부 엑소바이오폴리머의 분자 크기는 약 12 KDa으로 지금까지 문헌으로 밝혀진 바로는 가장 작은 크기이다. 또한, ¹³C CP/MAS NMR, FTIR 및 WXRD 분석 결과, 정제된 글루코사민 중합체는 N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc) 의 중합체인, 폴리-Ν-아세틸글루코사민 (PNAG) 이며 β 구조를 가진다는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명은 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711을 배지에서 배양하고 배지 배양액으로부터 폴리-Ν-아세틸글루코사민을 분리하는 단계를 포함하는 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711로부터 폴리-Ν-아세틸글루코사민를 생산하는 방법에 관한 것이다. 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711로부터 폴리-Ν-아세틸글루코사민을 생산하는 공정을 보다 자세히 살펴보면 하기와 같다.

폴리-N-아세틸글루코사민은 (i) 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711 을 배지에 접종하여 배양하는 공정; (ii) 배지 배양액을 원심분리하여 상등액을 회수하는 공정; 및 (iii) 회수한 상등액을 여과 및 농축하여 폴리-N-아세틸글루코사 민을 수득하는 공정으로 이루어진다.

상기 (i) 공정에서 균주 배양은 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711의 성장과 폴리-N-아세틸글루코사민의 생산능이 최적화시키는 적절한 조건하에서 통상적인 방법으로 수행된다.

배지는 액체 배지가 바람직하다. 또한, 영양배지 보다는 최소배지가 바람직하며, 본 발명에서는 M1 최소 배지를 사용하였다. 폴리-N-아세틸글루코사민을 생산에 적합한 탄소원은 포도당, 과당, 수크로즈, 글루코네이트 및 글리세롤이며, 바람직하게는 글리세롤 및 과당이며, 보다 바람직하게는 글리세롤이다. 폴리-N-아세틸글루코사민을 생산에 적합한 질소원은 염화암모늄 및 황산암모늄이며 바람직하게는 황산암모늄이다.

또한, 폴리-N-아세틸글루코사민 생산능을 증가시키기 위하여, 효모 추출물과 발린 (valine) 및 글루탐산 (glutamic acid) 등과 같은 일부 아미노산을 배지에 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711는 100 mM의 글리세롤, 0.3%의 황산암모늄, 1.5g/l의 효모 추출물, 및 2 mM의 발린을 포함하는 배지에서 배양하였을 때 최대의 폴리-N-아세틸글루코사민 생산능을 보인다.

폴리-N-아세틸글루코사민 생산에 적합한 배지 pH는 6 내지 8, 바람직하게는 7이며, 배지 온도 25 내지 37 ℃, 바람직하게는 30 ℃, 배양 시간은 60 내지 96 시간이며, 바람직하게는 72 시간이다.

상기 (iii) 공정의 여과 및 농축을 거쳐 수득된 시료는 추가의 정제, 농축 공정 등을 수행할 수 있다. 예를 들어, 프로테이나아제 K 처리 및 정용여과 등의 추가 공정을 1 회 내지 수회 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 생산된 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711 유래의 12 KDa 의 크기를 가지는 폴리-N-아세틸글루코사민에 관한 것이다.

스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711로부터 생산된 글루코사민 중합체는 그대로 또는 추가 공정으로 가공되어, 식품, 건강보조식품, 화장품, 의약품, 사료 등에 주성분, 보조제 또는 첨가제로 사용될 수 있다. 예를 들어, 수득된 글루코사민 중합체는 항고혈압제, 항지혈제, 항콜레스테롤제, 항암제, 항균제, 면역활성 증강제, 칼슘흡수촉진제에 사용될 수 있을 뿐만 아니라 생체 친화성 수술용 봉합사, 상처치유 촉진 인공피부, 약물 운반체 및 치과재료로 이용될 수도 있다. 또한, 식물생장조절제, 바이오비료 및 동물사료의 원료로 사용될 수 있다. 또한, 다양한 식품에 첨가될 수 있다.

본 발명의 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711를 적절한 조건에서 배양함으로써 폴리-N-아세틸글루코사민을 높은 수율로 생산할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재료 및 방법

1-1 균주 BMSZ711의 분리 및 특성 규명

토양 시료는 한국 사천시 근해에서 채취하고, 살균수로 현탁시키고 질소원으로 20mM 황산암모늄을 포함하고 탄소원으로 70mM 과당을 포함하는 M1 미네랄염 (M1 mineral salts) 배지 (Zamil, S.S. et al., (2008a) J. Biotechnol. V4-YP-058)에 접종하였다. 30℃, 180 rmp에서 2일동안 배양 후에 배양액을 10⁵ 배 희석시켰다. 희석된 배양액 100 μl를 LB 고체평판배지에 접종하고 30 ℃에서 24 시간 배양하였다. 많은 단일 콜로니를 무작위적으로 선택하여 M1 배지에서 생장하였으며 글루코사민의 생성을 HPAEC (High Performance Anion Exchange Chromatography)로 체크하였다. 이들 가운데, 가장 높은 글루코사민을 생성능을 보이는 박테리아를 발견하였다.

분리된 균주를 ID 32 STAPH 키트를 이용하여 특성을 규명하였으며 미생물 동정 시스템 (microbial identification system; Sherlock system software)에 의해 스타필로코커스 사프로파이티커스로 동정되었다 (% 동정 [%ID= 97]).

1-2 16s rRNA 유전자 시퀸싱 (sequencing)

분리된 균주를 16s rRNA 유전자 서열 상동성 분석으로 확증하였다. 게놈 DNA를 5ml LB 배지에서 30℃, 밤새 배양한 박테리아로부터 분리하였다. 게놈 DNA 　분리에는 마르뮤르 (Marmur) 공정을 적용하였다(Marmur, J. (1961) J. Mol. Biol. 3:208-218). 게놈 DNA 분리 후에, 16s rRNA 유전자 시퀸싱을 하였다. 서열 데이터를 이용하여 Blast 써치를 수행하였으며 S. saprophyticus subsp saprophytiucs ATCC 15305와 99 % 서열 상동성을 보였다.

1-3 배지 조건

본 연구에 S. 사프로파이티커스 BMSZ711을 사용하였으며 1% 효모 추출물, 1.5% 뉴트리언트 브로쓰, 0.2% 황산암모늄 및 1.8% 한천을 포함하는 NR (nutrient rich) 고체 배지에서 계대배양하였고, 4 ℃에서 유지하였다. 종균(seed) 배양으로 S. 사프로파이티커스 BMSZ711 단일 콜로니를 5 ml NR 브로쓰 배지에 접종하고 30 ℃, 180 rpm에서 8 시간 배양하였다. 2 ml의 종균 배양액을 이전의 보고 (Zamil, S.S. et al., (2008a) J. Biotechnol. V4-YP-058)와 동일 조성의 변화된 M1 최소 배지 (modified M1 minimal medium) 200 ml을 포함하는 1 l 플라스크로 옮겼다.

1-4 글루코사민 (glcN) 생성에 미치는 배양 배지, 탄소원, 및 질소원의 효과

S. 사프로파이티커스 BMSZ711을 LB, NR, Kings B 배지, 그리고 탄소원 및 질소원으로 과당 (70mM) 및 황산암모늄 (0.3%)을 포함하는 M1 최소 배지에서 배양하였다. 배지의 초기 pH를 7.0으로 조정하였다. glcN 생성에 미치는 다양한 탄소원과 질소원의 효과를 살피고자, 과당과 황산암모늄을 적절하게 교체하였다. 배양 배지 일정량을 적절한 시간 간격에서 채취하고 세포 성장을 600 nm (OD₆₀₀)에서 광학 밀도를 측정하여 모니터하였다. 별도 언급하지 않는다면, 모든 배양은 200ml 배지를 포함하는 1 l 플라스크를 30 ℃, 180 rpm의 회전식진탕배양기(rotary shaker incubator) 에서 배양하여 수행하였다.

1-5 글루코사민 (glcN) 생성에 미치는 온도 및 초기 pH의 효과

glcN 생성에 미치는 온도의 효과를 살펴보고자, S. 사프로파이티커스 BMSZ711을 4가지 다른 온도 (15, 20, 30 및 37 ℃)의 M1 최소 배지에서 배양하였다. PNAG 생성 효율을 측정하고자, 탄소 및 질소원으로 각각 글리세롤 (70mM) 및 황산암모늄 (0.3%)을 포함하는 M1 배지를 표준 배지로 사용되었다. 시간별로 glcN생성, 박테리아 성장률 (OD₆₀₀ 및 건조 무게) 및 pH를 측정하는 연구를 수행하였다.

glcN 생성에 미치는 pH의 효과를 탄소원과 질소원으로 각각 글리세롤 (70mM) 과 황산암모늄 (20mM)를 포함하는 M1 최소 배지를 이용하여 30 ℃에서 pH 2-8의 범위에서 수행하였다.

1-6 글루코사민 생성에 미치는 효모 추출물, 아미노산 및 몰삼투농도(osmolarity)의 효과

글리세롤 (100mM) 및 황산암모늄 (0.3%) 포함 M1 최소 배지에서, 글루코사민 (glcN) 생성에 미치는 효모 추출물, 아미노산 및 몰삼투농도의 효과를 측정하기 위 하여, 효모 추출물, 발린 (Val), 글리신 (Gly), 글루탐산 (GA) 과 같은 아미노산, 염화나트륨을 최종 농도가 각각 0.5 - 1.5 g/l, 1 - 3mM 및 2.5 - 10 g/l이 되도록 첨가하였다. 세포 성장을 600nm (OD₆₀₀)의 광학 밀도에서 측정하고 glcN 생성을 HPAEC (High Performance Anion Exchange Chromatography) 방법으로 측정하였다.

1-7 글루코사민 풍부 엑소바이오폴리머의 정제

글루코사민 포함된 중합체를 약간 변형된 조이스 등 (Joyce, J.G. (2003) Carbohyd. Res.338:903-922) 이 이전 기술한 방법으로 정제되었다. 72시간된 세포 배양액을 60℃에서 90 분간 가열하고 15000 rpm, 15 분에서 원심분리하였다. 세포가 없는 원심분리 상층액 (1L)를 수집하고, Suporcap-100 0.8/0.2 μm 카트리지(Pall corporation, Ann Arbor, MI)를 이용하여 여과하고 5-KDa 분자량 컷 오프 (molecular weight cut off: (MWCO) 할로우 섬유막 카트리지 (Pall corporation, Ann Arbor, MI)를 이용한 접선유동여과 (tangential flow filtration: TFF)로 60 ml까지 농축하였다. 농축된 시료는 1 부피의 탈이온증류수에 대하여 2번 정용여과하고 5 mM Tris-HCl, pH 8, 2 mM CaCl₂ 및 2 mM MgCl₂로 조정하였다. 시료를 프로테이나아제 K (4mg)로 20 ℃에서 16시간 동안 처리하였다. 시료를 1 부피의 2M NaCl, 1 부피의 낮은 pH 버퍼 (25mM 인산나트륨, pH 2.5, 0.1 M NaCl)에 대하여 1 번 및 1 부피의 탈이온증류수에 대하여 6번 정용여과하였다. 시료는 탈이온증류수를 적어도 3번 교환하면서 3.5 kDa MWCO 막으로 3일간 여과하였다. 시료를 동결건 조시키고 이후의 분석에 사용하였다.

1-8 글루코사민 엑소바이오폴리머의 구조 분석

(1) 겔침투크로마토그래피 (Gel permeation chromatography: GPC)

BMSZ711 중합체의 분자량을 세파덱스-200 컬럼이 장착된 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 이용한 겔침투크로마토그래피 (gel permeation chromatography: GPC)로 실온에서 측정하였다. 컬럼은 시료 로딩 전에 0.1M PBS 버퍼 pH 8.0에서 전-평형화시키고, GPC를 위하여 분자량 스탠다드 (molecular mass standards) 를 이용하여 조정하였다. 정제된 glcN 중합체 용액 (DW 1 ml에 100-500 μl)을 실온에서 GPC 분석하였다. 컬럼 표준화는 페리틴 (400 KDa), BSA (67 KDa) 및 시토크롬 (13.7 KDa)을 포함하는 분자량 스탠다드를 이용하여 수행하였다.

(2) ¹³C CP/MAS (Cross Polarization/Magic Angle Spinning) NMR 분석

고체 상태 ¹³C CP/MAS NMR 스펙트라는 시료 무게 약 150 mg에 대하여 7 KHz의 매직 앵글 (magic angle)에서 스핀하는 89 mm 보어 마그네트 (bore magnet)를 이용하는 Varian Unity NOVA 600 스펙트로미터, 14.1 T에서 획득하였다.

(3) FTIR 스펙트럼 분석

정제된 시료에 대한 고해상 (0.1 cm^-1) FTIR 분석을 진공에서 DTGS (KBr 윈도 우를 가지는) 디텍터가 장착된 VERTEX 80v (Bruker Optics) FTIR 분광광도계로 수행하였다. 동결-건조 시료를 KBr 파우더와 혼합하고, 실온에서 분말화시키고 얇은 펠렛으로 압축하였다.

(4) 광-각 X-선 회절 (Wide-angle X-ray diffraction: WAXD) 분석

동결-건조 시료의 WAXD 패턴은 0.05° 스텝랭쓰(step length)와 스텝당 29.8 s의 시간으로 0 - 100 (2θ) 범위에 걸쳐 co-source radiation (λ= 1.79Å)를 이용하여 2차원 면적검출 X-선회절분석기 (General Area Detector X-ray Diffraction System)(D8 DISCOVER with GADDS, Bruker AXS (Germany))에서 기록되었다.

1-9 HPAEC-PAD를 이용한 글루코사민과 다른 당들의 측정

정제되지 않은 시료와 정제된 시료의 글루코사민과 다른 당들의 조성을 산 가수분해 후에 측정하였다. 동결건조된 시료 10 mg을 6 N HCl 1ml로 100 ℃에서 4시간 동안 처리하였다. 방출된 당을 GP50 구배 펌프 (GP50 gradient pump) 와 ED40 전기화학적 검출기(ED40 electrochemical detector)로 되어 있는 Dionex DX-300 BioLC시스템을 이용한 HPAEC-PAD (high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection)로 분석하였다. 가수분해물 25 μl을 붕산염 트랩 (Dionex)이 앞에 있는 CarboPac PA1 가드 컬럼 (4.6 x 50 mm)이 장착된 CarboPac PA1 컬럼(4.6 x 250 mm)으로 주입하고, 16 mM NaOH을 이용하여 1 ml/min에서 등용매 용출 (isocratic elution)하여 당을 분리하였다.

1-10 전자현미경 분석

시료를 가시화시키기 위하여, 0.2 M 인산나트륨 버퍼 (pH 7.2)와 최종 농도가 2.5% 되게 희석된 글루타르알데하이드 (Electron Microscopy Sciences) 용액에 시료를 4℃에서 3시간 동안 고정시키고 다음, 글루타르알데하이드 고정된 시료를 인산염 버퍼로 2번 세척하고 1% 오스뮴-테트라-옥사이드 용액으로 4℃에서 2시간 동안 2차 고정하였다. 오스뮴-테트라-옥사이드 고정된 시료를 농도별 에탄올 시리즈 (graded ethanol series) (50, 60, 70, 80, 90 및 100%에서 각 5분)에서 탈수시켰다. 마지막으로 시료를 금 (fine coat sputter JFC-1100, JEOL) 으로 코팅하고 전계방출주사전자 현미경(field emission scanning electron microscope: FE-SEM) (Philips XL30 S FEG, Netherlands)을 이용하여 관찰하였다.

실시예 2: 분리된 균주의 특성

분리된 균주의 형태적, 생화학적 및 영양학적 특성을 표 1에 기재하였다. 균주의 세포 모양은 구균 (coccus)이며 그람 염색에 양성을 나타내었다. 옥시다제(oxidase)와 카탈라아제 (catalase)에 대한 활성이 존재한다. 에스쿨린(esculine)은 가수분해되지 않았다. 포도당 (glucose), 과당 (fructose), 말토즈 (maltose), 락토즈 (lactose), 트레할로즈 (trehalose), 만니톨 (mannitol), 라피노오즈 (raffinose), 리보즈 (ribose), 셀룰로즈 (cellulose), 사카로오즈 (saccharose), N-아세틸-글루코사민 (N-acetyl-glucosamine)이 박테리아 성장에 이 용되었다. 또한, 소듐 피루베이트 (sodium pyruvate), 피로글루타미크 β-나프틸아미드 (pyroglutamique β-naphtylamide) 및 노보바이오신 (novobiocine)에 대하여 양성 결과가 관찰되었다. 포타슘 니이트라이드 (potassium nitrate), 2-나프틸 포스페이트-β-D-갈락토피라노오즈 (2-naphtyl-β-D-galactopyranose), L-아르기닌-β-나프틸아미드 (L-arginine-β-naphtylamide), 2-나프틸 포스페이트 (2-naphtyl phosphate) 및 액시드 피로글루타미그 β-나프틸아미드 (acide pyroglutamique β-naphtylamide)에 대해서는 음성 결과가 관찰되었다. 따라서, ID32 STAPH 키트를 이용하여 얻은 결과로부터, 분리균은 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus)로 동정되었으며 (% 동정 [%ID= 97]), 균주를 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711로 명명하고 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures: KCTC)에 기탁번호 KCTC 11407BP로 2008년 10월 24일 기탁하였다. 균주는 16S rRNA 유전자 서열에 의해 또한 동정되었다 (도 1).

실시예 3: 글루코사민 (glcN) 생성에 미치는 배양 배지, 탄소원 및 질소원의 효과

바이오폴리머 생성에 배양 배지가 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. 연구자들은 서로 다른 박테리아에 의한 바이오폴리머 생성에 서로 다른 배양 배지가 적절한 것을 발견하였다. S. 오레우스 (S. aureus) 에 의해 생성된 PNAG에, 어떤 연구자들은 TSBG (typtic soy broth 1% glucose)를 이용하였고 (Cerca, N. et al. (2007) PNAS.104:7528-7533), Enterobacter sp. BL-2 에는 아세트산 포함된 배지가 사용되었다 (Son, M.K. et al. (2005) J. Microbiol. Biotechnol. 15:626-632). 본 연구에, 3종류 영양 배지로 LB (luria bertin), NR (nutrient rich) 및 Kings B 배지를, 1종류 최소 영양배지로 M1 배지를 사용하였다. FESEM 가시화 결과, M1 배지만이 PNAG을 생성할 수 있는 것을 발견하였으며, 영양배지는 PNAG를 분비하지 못하였다 (도 2). 따라서, M1 최소 배지를 본 연구에 사용하였다.

세포 성장과 EPS 생성은 일반적으로 EPS의 특성, 당 성분 및/또는 분자량에 영향을 주는 탄소원에 의존한다 (Wachenheim, D.E. et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58(1):385-391). 13개의 탄소원이 glcN 생성 체크에 사용되었다. 이들 중에서, BMSZ11은 5개의 탄소원 존재하에 글루코사민을 생성할 수 있었다 (도 3). 이들은 포도당, 과당, 수크로즈, 글루코네이트 및 글리세롤이다. 글루코사민 생성에 미치는 탄소원의 효과에 대한 결과, 글리세롤이 S. 사프로파이티커스 BMSZ711 (~53.17 mg/l)에서 가장 높은 생성을 나타내었다. 2번째 높은 생성은 과당이 탄소원으로 사용될 때이다.

또 다른 연구에서, 글리세롤이 가장 높은 EPS를 생성하였다 (Noghabi, K.A. et al. (2007) Process Biochem. 42:847-855). 그래서, 최적 농도를 찾기 위하여 여러 농도의 글리세롤 및 과당에 대하여 조사하였다 (도 4 및 도 5). BMSZ711 세포를 70mM, 100mM 및 140mM의 3가지 다른 농도의 글리세롤과 과당 포함 M1 배지에서 30 ℃, pH 7에서 성장하였다. 글리세롤 100mM 이 탄소원 (~ 189.31 mg/l) 으로 사용될 때 72 시간에서 가장 높은 glcN 이 생성되고 두 번째 가장 높은 생성은 글리세롤 140mM 이 탄소원 (~170mg/l) 으로 사용될 때이다. 과당 70mM 이 탄소원으로 사용될 때, 세포 성장 72 시간 후에 119 mg/l glcN 의 최대 생성이 관찰되었다. 본 실험으로부터 획득한 결과에 따르면, 글리세롤 100 mM 은 배양 시간 72 시간에서 가장 높은 glcN 생성을 하였다. 이전 연구에서, 글리세롤은 글루코사민의 증가된 생성에 중요한 역할을 할 수 있는 N-아세틸 글루코사민 6 포스페이트 (N-acetyl glucosamine 6 phosphate), 우리딘 5’-디포스페이트-N-아세틸 갈락토즈아민 (uridine 5'-diphosphate-N-acetyl galactoseamine) 및 우리딘 5’-디포스페이트-N-아세틸 글루코즈아민 (uridine 5'-diphosphate-N-acetyl glucoseamine)을 약 2 배 유도하는 것이 관찰되었다 (Filer, D. et al. (1977) J. Bacteriol. 131:751-758).

무기 또는 유기 질소 첨가는 세포 성장과 EPS 생성에 영향을 줄 수 있다. 6가지 질소원이 glcN 생성에 미치는 질소원의 효과를 테스트하기 위하여 사용되었다 (도 6). 무기 질소원이 유기 질소원보다 생성에 더 효과적인 것으로 관찰되었다. 황산암모늄이 질소원으로 사용될 때 가장 높은 glcN이 관찰되었다. 비슷한 결과는 또한 슈도모나스 플루오르센스 BM07 (P. fluorescens BM07)에 의한 엑소바이오폴리머 생성에서 관찰되었다 (Noghabi, K.A. et al. (2007) Process Biochem. 42:847-855). glcN 생성에 대한 황산암모늄 여러 농도를 조사하였다(도 7). 글루코사민 생성은 황산암모늄 증가와 함께 천천히 증가하는 것으로 밝혀졌으며, 가장 높은 생성은 0.9% 황산암모늄이 질소원으로 사용되었을 때 획득되었으나, 0.3% 와 0.9% 황산암모늄을 사용할 때 글루코사민 생성 사이에는 유의적인 차이가 관찰되지 않았다. 0.3% 황산암모늄을 사용하는 것이 보다 경제적이다. 이로부터, glcN 생성은 질소원보다는 탄소원에 더 의존하는 것을 알 수 있다. 프래써찬 등 (Prasertsan, P, et al. (2008) Carbohyd. Polym. 71:468-475)은 저농도의 질소가 EBP 생성에 더욱 유익하며, Lo 등은 배지의 질소 농도가 너무 높으면 잔탄 (xanthan) 생성이 나쁘게 된다고 보고하였다 (Lo, Y.M. et al. (1997) Appl. Microbiol. Biotechnol. 47:689-694).

실시예 4: 글루코사민 (glcN) 생성에 미치는 pH 및 온도의 효과

pH 및 온도 같은 배양 조건은 글루코사민 (glcN) 또는 PNAG 생성에 영향을 준다. 낮은 pH에서는 glcN 생성이 매우 낮거나 생성되지 않았다 (도 8). BMSZ711 은 pH 4에서 glcN을 분비하였으며 pH 7이 될 때까지 증가하였으나, 그리고 나서 감소하였다. 세포 성장은 낮은 pH에서는 매우 부진하였으나, 최대 성장은 pH 7에서 최대 성장하였으며, 알카리조건에서는 세포 성장뿐만 아니라 glcN 생성이 방해받는다. 이. 콜라이 (E. coil), S. 오레우스 (S. aureus) 및 S. 에피더미디스 (S. epidermidis)와 같은 다른 박테리아에 의한 glcN 생성에 대하여 초기 배지 pH는 또한 7로 유지되었다 (Maira-Litr, T. et al. (2002) Infect. Immun. 70:4433-4440; Cerca, N. et al. (2007) PNAS.104:7528-7533). 그러나, 엔터로박터균 BL-2 (Enterobacter sp. BL-2)에 의한 glcN 생성은 pH 8이 최적이었다 (Son, M.K. et al. (2005) J. Microbiol. Biotechnol. 15:626-632).

배양 온도는 glcN 생성에 대한 중요한 조건 중의 하나이다. 본 연구에서, BMSZ711 세포는 15, 20, 30 및 37 ℃ 와 같은 4 가지 다른 온도에서 성장하였다. 15 및 20 ℃에서 세포성장은 매우 부진하고 glcN 은 생성되지 않았으나, 세포가 글리세롤 70mM, 황산암모늄 0.3%, 효모추출물 0.1% 및 NaCl 1%를 포함하는 M1 배지, 30 ℃에서 성장할 때 세포배양 72 시간 후에 131.90 mg/l 의 glcN 최대 생산이 관찰되었다 (도 9). 세포 성장은 또한 매우 빠르고, 2.76 g/l의 최대 세포 건조량은 세포 배양 72 시간 후에 획득되었다. 세포가 37 ℃에서 성장할 때 GlcN도 생산되었다(도 10). 세포성장 60 시간 후에 54.16 mg/l의 최대 생산이 획득되었으나, 생산은 30 ℃보다 많이 낮았다 (절반 이하). 양 온도에서 glcN 은 정체기 (stationary phase)에서 생산된다. 엔터로박터균 BL-2 와 같은 많은 박테리아는 30 ℃에서 EPS를 생산하였다 (Son, M.K. et al. (2005) J. Microbiol. Biotechnol. 15:626-632).

실시예 5: 효모 추출물, 아미노산 및 몰삼투농도의 효과

효모 추출물은 많은 미생물의 EPS 생성에 유의성 있게 영향을 줄 수 있다. BMSZ711에서 glcN 생성에 미치는 효모 추출물의 효과를 조사하였다. 효모 추출물이 0.5 - 1.5 g/l 범위에서 첨가되었을 때, 효모 추출물은 glcN 생성에 유의성 있는 효과를 나타내고 세포성장에도 영향을 나타내었다(도 11). 대조구 배지 (효모 추출물이 첨가 안 된)와 비교하여, 효모 추출물이 1.5 g/l 로 첨가될 때, glcN 생성은 4배 정도 증가하였다. 또한, 세포 성장은 대조구 시료와 비교하여 약 7 배 정도 증가하였다. 효모 추출물은 폐렴구균 혈청형 23F (Streptococcus pneumoniae serotype 23F) 에서 캡슐모양의 다당류 (capsular polysaccharide) 생성을 약 2배 증가시켰다 (Goncalves, V.M. et al. (2002) Appl. Microbiol. Biotechnol. 59:713-717). 엔테로박터 클로아세 WD7 (Enterobacter cloace WD7)로부터 EPS 생성은 효모 추출물이 0.05% 비율로 첨가될 때 증가하였다 (Prasertsan, P, et al. (2008) Carbohyd. Polym. 71:468-475). 흑효모(Aureobasidium pullulans)와 클루베로마이세스 플라길리스 (kluyveromyces fragilis)혼합 배양에서 효모 추출물 농도 증가는 높은 풀루란(pullulan) 수율을 유도하였다 (Shin, Y.C. et al (1989) Biotechnol. Bioengin. 33:129-133).

도 12 및 도 13은 glcN 생성과 세포 성장에 영향을 주는 3가지 다른 아미노산의 효과를 각각 보여준다. 아미노산은 glcN 생성과 세포 성장에 영향을 준다. 2 mM 비율로 발린 (valine)이 삽입될 때 가장 높은 glcN가 생성되었다 (~277 mg/l). 그러나, 글리신 (glycine)은 glcN 생성에 음성 효과를 나타내었다. 글리신이 glcN 생성을 유의성있게 감소시키는 반면, 글루탐산 (glutamic acid)은 glcN 생성에 양성 효과를 가진다. 모든 경우에서, 최대 생성은 정체기 (stationary phase)에서 일어났다.

본 연구에서, 몰 삼투농도의 증가는 세포 성장과 glcN 생성을 감소시켰다 (도 14).

실시예 6: 글루코사민 풍부 엑소바이오폴리머의 정제

글루코사민 풍부 엑소바이오폴리머는 조이스 등이 기재한 방법을 약간 변형하여 정제하였다 (Joyce, J.G. et al. (2003) Carbohyd. Res. 338:903-922). 실시예 1-7에서 기재된 바이오폴리머 정제에서 가장 중요한 단계는 시료를 TFF（tangential flow filtration)를 이용하여 농축시키는 것이다. 이 단계 후에, 시료는 60% 이상의 글루코사민을 포함한다. 정제된 시료와 원 시료를 HPAEC-PAD를 이용하여 분석하였으며, 도 16과 도 17은 정제된 시료가 87% 이상의 글루코사민을 함유함을 보여준다. 정제된 시료를 하기의 기술을 이용하여 분석 및 특성을 규명하였다.

실시예 7: 글루코사민 중합체의 구조 분석

7-1 정제된 글루코사민 중합체의 분자 크기

정제된 중합체의 분자 크기를 겔침투크로마토그래피(gel permeation chromatography)로 측정하였다. 하나의 뚜렷한 피크가 획득되었다. 정제된 글루코사민 풍부 바이오폴리머의 분자 크기는 약 12 KDa (도 18) 인 것으로 측정되었다. 이는, S. aureus에서 획득한 글루코사민 중합체 크기가 300 KDa (Joyce, J.G. et al. (2003) Carbohyd. Res. 338:903-922)이고, S. 에피더미디스 (S. epidermidis)는 460 KDa, 100 KDa, 21 KDa (Maira-Litr, T. et al. (2002) Infect. Immun. 70:4433-4440)이며 Enterobater sp BL-2이 106 KDa (Son, M.K. et al. (2005) J. Microbiol. Biotechnol. 15:626-632)이었던 것과 같이 글루코사민 중합체 크기로 보고된 지금까지의 문헌들 중에서 가장 적은 크기의 글루코사민 바이오폴리머이다.

7-2 정제된 glcN 엑소바이오폴리머의 ¹³ C CP/MAS NMR 분석

고상 NMR (Solid state NMR)은 고체 기질의 특성을 밝히기 위한 매우 정교한 기술 중의 하나이다. 정제된 glcN 엑소바이오폴리머의 ¹³C CP/MAS NMR을 테너 등 (Tanner, S. et al. Macromolecules (1990) 23: 3576-3583) 및 카르데나스 등 (Crdenas, G. et al. (2004) J. Appl. Poly. Sci. 93:1876-1885)의 방법에 따라 수행하였다. 화학적 이동 (chemical shift)을 표 2에 요약하였다. 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 정제된 글루코사민 중합체와 β 키틴 (β chitin)의 스펙트럼은 서로 꽤 유사하였다. 키틴의 경우 174.5 및 23.8 ppm에서 아세틸 카본 (acetyl carbon)의 특징적 피크가 관찰되었다. C-3 및 C-5 탄소의 화학적 이동은 β 키틴과 동일하게 단일 피크로 관찰되었다. 유사한 화학적 이동은 glcN 중합체에 대하여 관찰되었으나, α-키틴에 대한 C3 및 C5의 화학적 이동은 상이하였다. 이는 수소결합을 형성하게 하는 C3 및 C5의 다른 배열 때문이다. 이처럼 키틴과 GlcNAc만에 대해서만 아세틸 탄소에 대한 특징적 피크가 174 및 24 ppm에서 관찰되고 글루코사민에 대해서는 이런 2개의 특징적 피크가 관찰되지 않는다는 점에서 (Webster, A. et al. (2006) Solid State NMR. 30:150-161), 글루코사민 중합체가 N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc) 의 중합체이라는 사실을 증명하는 것이다. 이런 결과는 중합체가 β 구조이며, 시료가 β 키틴과 매우 유사하기 때문에 β (1-4) 결합을 가질 가능성이 매우 높다는 것을 의미한다.

7-3 정제된 글루코사민 엑소바이오폴리머의 FTIR 분석

가장 널리 알리진 PNAG는 키틴이며 FTIR을 사용하여 특성이 분석된다. 따라서, BMSZ711 로부터 정제된 glcN 엑소바이오폴리머를 FTIR을 이용하여 특성을 분석하였으며, 스펙트럼을 도 19로 나타내었으며, 정제된 시료는 N-아세틸글루코사민의 중합체이며 β 구조를 가진다. PNAG의 α 및 β 구조는 상이한 수소 결합을 가지기 때문에 FTIR 스펙트로스코피로 구분이 가능하다. α PNAG (chitin)에서 아미드 Ⅰ 의 진동 모드 (vibration mode)에 대한 2개의 흡수 피크가 1660-1620 cm^-1 영역에서 관찰되었으나, β PNAG (키틴)은 이 역에서 1개의 피크만 관찰되었다. 아미드 I, II, III와 같은 특징적 피크는, 일부 피크가 β PNAG (키틴) 와 완전히 유사하지는 않지만, β PNAG (키틴) 과 매우 유사하였다. 이는 바이오폴리머의 크기 차이 때문일 수 있는데, BMSZ711 PNAG (12 KDa) 가 β PNAG (키틴)보다 크기가 매우 작기 때문에, 3600-3000 cm^-1 영역에서 더 단순한 FTIR 프로파일을 가지는 것으로 보인다.

7-4 정제된 glcN 엑소바이오폴리머는 광각 X-선 회절(wide angle X diffraction: WAXD) 분석

정제된 glcN 엑소바이오폴리머는 WAXD 분석으로 특성을 규명하였다 (도 20). 정제된 시료에 대하여 2θ = 20 위치에서 폭이 넓은 피크 (broad peak) 가 관찰되었다. 이는 오징어 키틴 또는 β PNAG (키틴) 에 대하여 2θ = 19 위치에서 관찰된 키틴 피크와 매우 비슷한 결과이다. 정제된 시료의 폭이 넓은 피크는 정제된 중합체가 무정형 (amorphous)임을 의미한다.

본 발명의 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711 및 이로부터 생산된 폴리-N-아세틸글루코사민 중합체는 식품, 건강보조식품, 화장품, 의약품 및 농업분야 등의 다양한 분야에 광범위하게 이용할 수 있다.

도 1은 PNAG 생산 분리균주인 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711의 16s rRNA 유전자 서열 결과이다.

도 2는 M1 배지에서 배양된 BMSZ711에서는 PNAG가 생성되나 LB 배지에서는 PNAG가 생성되지 않음을 보여주는 FE-SEM 결과이다.

도 3은 글루코사민의 생성에 영향을 주는 탄소원의 효과를 보여주는 결과이다. (1= 포도당(glucose) 70mM, 2 = 과당(fructose) 70mM, 3 = 수크로즈(sucrose) 70mM, 4 = 락토즈(lactose) 70mM, 5 = 갈락토즈(galactose) 70mM, 6 = 글리세롤(glycerol) 70mM, 7 = 글루코네이트(gluconate) 70mM, 8 = 만니톨(mannitol) 70mM, 9 = 초산 나트륨(sodium acetate) 70mM, 10 = 아라비노즈(arabinose) 70mM, 11 = 자일로즈(xylose) 70mM, 12 = 프로피온산 나트륨(sodium propionate), 13 = 만노즈(mannose) 70mM)

도 4는 황산암모늄 0.3%, 효모 추출물 0.1% 및 NaCl 1 %를 포함하는 M1 배지, 30℃, pH 7 조건에서 글루코사민 생성에 영향을 주는 글리세롤 농도에 따른 효과를 보여준다 (1 = 70mM, 2 = 100mM, 3 = 140 mM).

도 5는 황산암모늄 0.3%, 효모 추출물 0.1% 및 NaCl 1 %를 포함하는 M1 배지, 30℃, pH 7 조건에서 글루코사민 생성에 영향을 주는 과당 농도에 따른 효과를 보여준다 (1 = 70mM, 2 = 100mM, 3 = 140 mM)

도 6은 글루코사민 생성에 영향을 미치는 질소원의 효과를 보여준다 (1= 질산칼륨 (potassium nitrate) 0.3%, 2 = 염화암모늄 0.3%, 3 = 펩톤 (peptone) 0.3%, 4 = 효모 추출물 0.3%, 5 = 황산암모늄 0.3%, 6 = 요소 (urea) 0.3%).

도 7은 글리세롤 100mM, 효모 추출물 0.1% 및 NaCl 1%을 포함하는 M1 배지, 30℃, pH 7 조건에서 글루코사민 생성에 영향을 주는 황산암모늄 농도에 따른 효과를 보여준다(1 = 0.3%, 2 = 0.6%, 3 = 0.9%).

도 8은 글루코사민 생성에 영향을 주는 pH에 따른 효과를 보여준다 (M1 배지, 탄소원은 글리세롤 (Gly) 70mM, 질소원은 황산암모늄 20mM, 온도 30℃).

도 9는 Gly 70mM, 황산암모늄 0.3%, 효모 추출물 0.1% 및 NaCl 1%을 포함하는 M1 배지, 30℃, pH 7 조건에서 글루코사민 생성의 시간별 프로파일을 보여준다.

도 10은 Gly 70mM, 황산암모늄 0.3%, 효모 추출물 0.1% 및 NaCl 1%을 포함하는 M1 배지, 37℃, pH 7 조건에서 글루코사민 생성의 시간별 프로파일을 보여준다.

도 11은 글루코사민 생성에 영향을 미치는 효모 추출물의 농도에 따른 효과를 보여준다 (1= 대조구: 효모 추출물 무첨가, 2 = 효모 추출물 0.5g /l, 3 = 효모 추출물 1 g/l, 4 = 효모 추출물 1.5 g/l).

도 12는 글루코사민 생성에 영향을 주는 아미노산의 효과를 보여준다.

도 13은 세포성장에 영향을 주는 아미노산의 효과를 보여준다 (1= 발린 1mM, 2 = 발린 2mM, 3 = 발린 3 mM, 4= 글리신 1 mM, 5 = 글리신 2mM, 6 = 글리신 3mM, 7 = 글루탐산 1mM, 8= 글루탐산 2mM, 9 = 글루탐산 3 mM)

도 14는 글루코사민 생성과 세포성장에 영향을 주는 몰삼투농도(염화나트륨)의 효과를 보여준다 (1 = NaCl 2.5 g/l, 2 = NaCl 5 g/l, 3 = NaCl 10 g/l).

도 15는 원 시료의 당 조성을 보여주는 HPAEC-PAD 결과이다.

도 16은 정제된 시료의 당 조성을 보여주는 HPAEC-PAD 결과이다.

도 17은 세파덱스-200을 이용한 FPLC 로 측정한 정제된 글루코사민 (glcN) 바이오폴리머의 분자량을 보여준다. 컬럼은 0.1M PBS로 평형화시키고 동일 버퍼로 용출하였다.

도 18은 정제된 시료의 ¹³C CP/MAS 스펙트럼을 보여준다. 23.8 및 174.5 ppm에서의 피크는 (-NH(CO)CH₃) 및 CO의 특징적 피크이고, 75.4 에서의 단일 피크는 β 구조를 확인시켜주며 오징어 키틴과 많은 유사성을 보여준다.

도 19는 정제된 시료의 FTIR 분석 결과이며 오징어의 β 키틴과 매우 유사하다. 1652.89 cm^-1 에서의 단일 피크는 β 구조를 확인시켜 준다.

도 20은 정제된 시료의 WXRD 분석 결과이다.

Claims (11)

1. 폴리-N-아세틸글루코사민을 주성분으로 포함하는 엑소바이오폴리머를 생산하는 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711 (생물자원센터 기탁번호 KCTC 11407BP).
2. 제 1항의 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711을 배지에서 배양하고 배지 배양액으로부터 폴리-N-아세틸글루코사민을 분리하는 단계를 포함하는 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711로부터 폴리-N-아세틸글루코사민를 생산하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 배지는 액체 배지인 방법.
4. 제 2항에 있어서, 배지의 탄소원은 포도당, 과당, 수크로즈, 글루코네이트 및 글리세롤으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
5. 제 2항에 있어서, 배지의 질소원은 염화암모늄 및 황산암모늄으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
6. 제 2항에서 있어서, 배지의 pH는 6 내지 8인 방법.
7. 제 2항에서 있어서, 배지의 온도는 25 내지 37 ℃인 방법.
8. 제 2항에서 있어서, 배양 시간은 60 내지 96 시간인 방법.
9. 제 2항에서 있어서, 배지는 효모 추출물을 추가로 포함하는 방법.
10. 제 3항에서 있어서, 배지는 발린 및 글루탐산에서 선택되는 아미노산을 추가로 포함하는 방법.
11. 제 2항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 스타필로코커스 사프로파이티커스 BMSZ711 유래의 12 KDa 의 크기를 가지는 폴리-N-아세틸글루코사민.

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